JPWO2003014345A1 - 肝星細胞活性化に関与する遺伝子パネル - Google Patents
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Abstract
肝星細胞で、正常時に比べて肝星細胞活性化時期に発現レベルが変動する遺伝子の群からなる遺伝子パネルを、以下のステップにより作成する：（ａ）正常時におけるモデル動物より分離した静止期肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、（ｂ）活性化時期に発現レベルが変動する遺伝子群を同定するステップ。
Description
技術分野
本発明は、肝星細胞中で正常時に比べて肝星細胞の活性化に伴い発現レベルが上昇する遺伝子の群からなる遺伝子パネル、その作成方法、同遺伝子パネルの利用に関するものである。これらの発明は、診断、医薬分野等で有用である。
背景技術
肝の結合組織の増生および蓄積は、肝の循環傷害を招来する。これが更に肝実質細胞障害原因になり、悪循環が形成され、更なる結合組織の増生および蓄積がおこり、肝硬変や肝線維化モデル動物の肝線維化をともなう肝疾患症を引き起こすと考えられている。肝臓は実質細胞（肝細胞）と非実質細胞（肝星細胞、クッパー細胞、類同内皮細胞、Ｐｉｔ細胞）から成り、肝臓の結合組織は細胞外基質とそこに局在する細胞から構成されている。結合組織中の基質産生担当細胞である肝星細胞が活性化され形質転換することにより結合組織の増生・蓄積が促進される。正常肝臓の肝星細胞（以下、静止期の星細胞と呼ぶ）は、細胞外基質の生産量が少なく、活性化にともない筋線維芽様細胞に形態を変化させ、細胞の増加と共に多量の細胞外基質を合成することが知られている。
したがって、肝硬変など肝線維化をともなう肝疾患患者の肝星細胞の活性化を抑制し、結合組織の増生・蓄積を軽減する医療が要求されており、肝星細胞の活性化を抑制させる薬剤のスクリーニングは重要であるといえる。このような要求があるにも関わらず、肝星細胞の活性化を抑制する薬物の効率的なスクリーニング法は知られていない。
肝疾患により肝細胞が壊死に陥るとそれまで静止期にあった肝星細胞は肝壊死細胞に由来する液性因子や、炎症局所の活性化クッパー細胞や浸潤した炎症細胞などがパラクライン分泌したサイトカインにより、更に、活性化された肝星細胞のオートクライン分泌によって活性化される。ここで、肝星細胞活性化は複数の因子の関与が考えられているが、いかなるタイミングで働いているのか全体像はわかっていない。そこで、肝星細胞の活性化の全体像をつかむためには、肝星細胞の活性化には複数の遺伝子が関与していると考えられることから、肝星細胞活性化に働く重要遺伝子を多数調べることが重要であると考えられる。これまで、肝星細胞活性化を抑制する薬剤のスクリーニングから生まれた薬剤は無い。肝星細胞活性化に発現変動が見られることを指標とした遺伝子スクリーニングの報告はあったが、せいぜい数種の遺伝子の発現変動を見たものに過ぎなかった。
発明の開示
本発明は、上記観点からなされたものであり、肝星細胞で、静止期に比べて肝星細胞が活性化した時に発現レベルが変動する遺伝子の群からなる遺伝子パネル、及びそれを利用して肝星細胞の活性化を抑制させる薬物をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
本発明者は、肝星細胞の活性化を抑制させるためには、肝星細胞の活性化に関与する遺伝子の挙動を、静止期の肝星細胞の遺伝子発現パターンに近づけてやればよいと考えた。そして、肝星細胞初代培養系での活性系モデルを用いて、肝星細胞の活性化における各種遺伝子の発現プロファイルを調べ、肝星細胞に関与する遺伝子に関する発現情報を取得した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）肝星細胞で、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子の名称及びそれらの遺伝子の発現プロファイルからなる遺伝子パネル。
（２）前記遺伝子の発現レベルの上昇が、モデル動物における正常時の発現レベルに対する、肝硬変・肝線維化モデル動物における発現レベルの差である（１）の遺伝子パネル。
（３）前記発現プロファイルが、肝星細胞における経時的な発現プロファイルを含む（１）又は（２）の遺伝子パネル。
（４）前記モデル動物がラットである（２）または（３）のいずれかの遺伝子パネル。
（５）表１〜４の番号１〜１０５に示す１０５種の遺伝子のうち、少なくとも５種類の各遺伝子の発現プロファイルを含む（１）〜（４）のいずれかの遺伝子パネル。
（６）肝星細胞中で、正常時に比べて肝星細胞活性化時期に発現レベルが変動する遺伝子の群からなる遺伝子パネルの作成方法であって、以下のステップを含む方法：
（ａ）静止期の肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期の肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）それぞれの発現レベルを比較するステップと、
（ｃ）活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子群を同定するステップ。
（７）前記ステップ（ａ）において、肝星細胞活性化時期における前記遺伝子の発現レベルを経時的に解析することを特徴とする（６）の方法。
（８）前記遺伝子発現レベルの解析を、遺伝子チップ法により行う（６）又は（７）の方法。
（９）モデル動物または肝臓の組織もしくは細胞に薬剤を投与し、（１）の遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロファイリングを行うことを特徴とする、肝星細胞活性化に関与する薬剤のスクニーニング方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の遺伝子パネル
本発明の遺伝子パネルは、肝星細胞で、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子の名称及びそれらの遺伝子発現プロファイルからなる遺伝子パネルである。
本発明の遺伝子パネルは、下記ステップにより作成することができる。
（ａ）静止期の肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期の肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）それぞれの発現レベルを比較するステップと、
（ｃ）活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子群を同定するステップ。
肝星細胞の機能は、ビタミンＡの代謝と貯蔵、細胞外基質の産生、サイトカインの産生、収縮運動、筋線維芽細胞への形質転換であり、これらの機能が肝線維化に密接に関係していると考えられている。活性化時期の肝星細胞（活性化した肝星細胞又は活性化型肝星細胞と同義である）とは、正常肝の静止期の肝星細胞が様々な刺激により、筋線維芽様細胞へ形質転換した状態の肝星細胞をいう。筋線維芽細胞へ形質転換した細胞は、増殖性が増し、ビタミンＡ含量が低下し、収縮性を増す。また、タイプＩ型コラーゲンを主とする細胞外基質を産生する。さらに、更にコラゲナーゼやゼラチナーゼなどの細胞外基質分解酵素の合成が低下するため、細胞外基質の増性・蓄積を促進する。
活性化された肝星細胞は、分離肝星細胞で同様な形質転換が起ることが知られている。肝疾患、例えば、肝炎（Ｊ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９６ Ｍａｒ ２４，（３）：３０１−７ Ｇｕｉｄｏ Ｍ ｌｉｖｅｒ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、肝硬変（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９０ Ｊｕｌｙ １３７（１）Ｓｔｅｆａｎｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴｙｐｅＩ，ＩＩＩ，ａｎｄ ＩＶ Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｔｉｃ Ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ）、ＮＡＳＨ（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ２０００ Ｊｕｌｙ ３１（７）８２２−８，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ．）などでは、肝臓の炎症の持続と共に肝に結合組織が増加、蓄積を起こし、活性化型肝星細胞増加が観察される。
遺伝子の発現レベルとは、遺伝子の発現量、発現強度又は発現頻度と同義であり、通常、遺伝子に対応する転写産物の生成量、又はその翻訳産物の活性等により解析される。
遺伝子の発現レベルは、通常遺伝子の発現解析に利用されている方法を用いて測定することができる。好ましい方法としては、例えば、遺伝子チップ法、遺伝子マイクロアレイ法、及び遺伝子マクロアレイ法等がある。いずれも、遺伝子断片を何等かの板の上（通常はスライドガラス）に、並べて張り付けたものが用いられる。このチップと蛍光ラベルしたｍＲＮＡをハイブリダイズさせて、ｍＲＮＡの種類と量を測定する。
その他、遺伝子発現解析法として、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ ２５，４６９４−４６９６（１９９７））Ｂｏｄｙ Ｍａｐ法（Ｇｅｎｅ，１７４，１５１−１５８（１９９６））、Ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）法（米国特許第５２７，１５４号、第５４４，８６１号、欧州特許公開第０７６１ ８２２号）、ＭＡＧＥ（Ｍｉｃｒｏ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（特開２０００−２３２８８８号）等が挙げられる。
ＡＴＡＣ−ＰＣＲ法の概略は、以下の通りである。まず、５’ビオチン化オリゴｄＴプライマーを用いて合成したｃＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成し、これを特定の制限酵素（ここではＭｂｏＩを用いた例について述べる）で切断する。次に、この制限酵素で切断された部位と共通の配列を末端に持つアダプター（長さの異なる６種類を用意する）と、制限酵素ＭｂｏＩで切断した二本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡライゲースにより連結する。尚、６種類のアダプターのうち、３種類をコントロールｃＤＮＡ（活性化時期の肝星細胞から調製したｃＤＮＡ）に結合し、１０：３：１の比率で混合する。残る３種類のアダプターに、非コートプラスチックシャーレで培養後４時間、３日、７日のラット肝星細胞から調製したｃＤＮＡを結合させる。
それぞれの連結反応物を混合した後、ストレプトアビジンコートされたビーズを用いて二本鎖ｃＤＮＡの３’断片を回収し、各アダプターに共通する配列を持つプライマーを用いて競合的ＲＴ−ＰＣＲを行う。このＰＣＲ産物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析する。この装置は、キャピラリー電気泳動により、断片の長さ毎に分離することができ、発現量に比例した蛍光強度を検出することができる。
Ｂｏｄｙ Ｍａｐ法の概略は以下の通りである。ｍＲＮＡをベクター上のポリＴ配列とｍＲＮＡの３’末端にあるポリＡテールを結合させ、ベクターポリＴ配列をプライマーとしてｃＤＮＡを合成する。更に、制限酵素ＭｂｏＩでｃＤＮＡを切断する。ＭｂｏＩサイトはｃＤＮＡ上で平均３００塩基対に一つあるため、ベクター上のｃＤＮＡは平均３００塩基対に分断される。このとき、最もポリＡテールよりのｃＤＮＡは、ベクターに結合したまま残る。このｃＤＮＡ断片を持つベクターを閉環させ、それを大腸菌に導入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。ライブラリーから約１０００クローンを任意に選択して、それぞれについて平均３００塩基対の塩基配列を決定する。それらの配列の中から同じ配列を含むクローン毎にまとめて、それぞれの配列の種類と出現頻度を算出して遺伝子発現プロファイルを得る。各ｃＤＮＡ配列はデータバンクとのホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、既知の遺伝子と同一の配列を有するクローンにはその遺伝子の名称を与える。配列がデータバンクに登録されていない場合は、その配列に該当する遺伝子は存在しないものとする。
ＢＬＡＳＴ検索によりホモロジー検索を行なうためには、最低１１塩基対の情報が必要である。１０塩基からなる配列の種類は約百万種であり、人で存在すると予想される遺伝子の種類１０万種を遙かに越える。すなわち、１１塩基対の情報があれば、その配列を持つ遺伝子は特定することができ、遺伝子発現プロファイル解析が可能である。したがって、多量のシークエンスを必要とするＢｏｄｙ Ｍａｐによる遺伝子発現プロファイル解析を効率化するために、Ｂｏｄｙ Ｍａｐにおける約３００塩基対のｃＤＮＡ断片を、更に１１塩基対以上の短い断片（「タグ（ｔａｇ）」と呼ばれる）とし、更にこの断片同士を多数連結してベクターに挿入することにより、連結タグのライブラリーを作製し、Ｂｏｄｙ Ｍａｐと同様に約１０００クローンを任意に選択して、連結タグのＤＮＡ配列を決定すれば、Ｂｏｄｙ Ｍａｐと同じ手数でより多くの遺伝子発現情報を得ることが期待できる。タグは遺伝子配列を代表し、タグの出現頻度はその遺伝子の発現頻度を現す。通常、１回のシークエンスで判読出来るＤＮＡ配列の長さは約６００塩基対であるから、１回のシークエンスで最大５０個程度のタグのＤＮＡ配列を判読出来る。すなわち、Ｂｏｄｙ Ｍａｐ法に比べて最大約５０倍の効率で、遺伝子発現プロファイル解析を行うことが可能になる。
ＳＡＧＥ法は、上記の考えに基づいた遺伝子発現プロファイル解析法である。ＳＡＧＥ法は、以下のようにして行われる。ビオチンが３’末端に結合したポリＴをプライマーとしてｃＤＮＡを作製し、Ｂｏｄｙ Ｍａｐと同様にＭｂｏＩ等の制限酵素（「アンカリング酵素（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」と呼ばれる）でｃＤＮＡを切断した後、ビオチンが結合した３’末端を含むｃＤＮＡ断片をアビジンビーズに吸着させ、ビーズを二分して、それぞれのビーズに吸着したｃＤＮＡ断片（約１３ｂｐ）に２種のリンカー（Ａ又はＢ）の一方づつを結合させる。各リンカーにはＢｓｍＦＩのようなＣｌａｓｓ ＩＩ制限酵素（「タグ化酵素（ｔａｇｇｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」と呼ばれる）のサイトを含ませておく。タグ化酵素でｃＤＮＡ断片をビーズから切り出し、切断部位を平滑化し、Ａリンカーに接続するタグとＢリンカーに接続するタグを連結させる。これは、ダイタグ（ｄｉｔａｇ）と称される。ＡリンカーとＢリンカーを認識するプライマーを用いてＰＣＲによりダイタグを増幅する。増幅されたダイタグ同士を多数連結させてベクターに組み込み、シークエンスする。１シークエンスで最大５０程度のタグシークエンスを得ることができる。このタグシークエンス情報を集計して、遺伝子発現頻度を導き出す。
ＭＡＧＥ法は、上記方法に対する改良法であり、ポリＴ配列を有するベクタープライマーを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、同ベクター上でｃＤＮＡ配列をタグ化し、得られたタグを、タグの末端が識別できるような配列を介在させて連結することによりコンカテマーを形成させ、このコンカテマーの塩基配列を解析することによって、効率よく、しかも高精度で遺伝子の発現頻度を解析することができる方法である。
本発明においては、遺伝子の発現レベルを解析することができる方法であれば特に制限されず、現在知られている方法、及び将来開発される方法のいずれも採用することができる。上記方法のうち、特に好ましいのは、遺伝子チップ法もしくは遺伝子マイクロアレイ法、及びＡＴＡＣ−ＰＣＲ法である。
本発明において、遺伝子の発現レベルの解析は、単独の方法で得られた結果に基づいて行ってもよく、複数の方法により得られた結果を組み合わせて行ってもよい。単独の方法でも解析は可能であるが、複数の方法を組み合わせると、より精度の高い解析を行うことができる。具体的には、複数の方法、例えば遺伝子チップ法により得られた結果と、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ法により得られた結果について相関係数を算出し、相関係数が一定以上の遺伝子について、発現レベルが変動したと評価する。
ヒトやマウス等の動物の遺伝子チップ、遺伝子マイクロアレイ及び遺伝子マクロアレイは各種市販されており、本発明においてはそれらを使用してもよい。
本発明においては、遺伝子の発現レベルの変動は、静止期の肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期の肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定し、それぞれの発現レベルを比較することによって、解析することができる。
静止期の肝星細胞における遺伝子の発現レベルは、正常肝から分離した直後の肝星細胞中の遺伝子の発現レベルを測定することによって解析することができる。
一方、活性化時期の肝星細胞における遺伝子の発現レベルは、例えば、正常肝から分離した肝星細胞を非コーティングのプラスチックシャーレで初代培養し、得られる細胞中の遺伝子の発現レベルを測定することによって解析することができる。正常肝から分離した肝星細胞を非コーティングのプラスチックシャーレで初代培養するだけで、自ら活性化して脂肪滴蓄積の減少、細胞外基質の産生など、肝硬変、肝炎など臨床サンプルの肝臓組織で観察される活性化型肝星細胞と類似した形質を示す。
肝星細胞をラットの正常肝から分離し、非コーティングしたプラスチックシャーレに播種すると、分離直後の肝星細胞は、ビタミンＡを貯蔵する脂肪滴が細胞質に多数観察され正常肝の静止期の肝星細胞と同様な形態を示す。肝星細胞分離後、非コーティングしたプラスチックシャーレ上で培養すると肝星細胞活性化のマーカーである、α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎが培養３日目から観察され、およそ一週間で、肝星細胞は活性化した肝星細胞として筋線維芽細胞様の形態を示す。７日目の活性化肝星細胞は、肝硬変や線維化肝などで観察される脂肪滴が減少した活性化肝星細胞と同様な形質を示す。
また、肝星細胞の活性化時期における遺伝子の発現レベルは、例えば、肝硬変・肝線維化モデル動物の肝臓から分離した直後の肝星細胞中における発現レベルを測定することによって解析される。一方、静止期の遺伝子の発現レベルは、正常モデル動物の肝から分離した肝星細胞分離直後に測定される。遺伝子の発現レベルの解析は、肝星細胞活性化にともない経時的に行うことが好ましい。
肝硬変・肝線維化モデル動物は、例えば、雄性ラットに、生理食塩水を溶解したチオアセトアミド（５０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを１週間に２回ずつ６週間にわたって腹腔内投与することにより取得することができる。この間、ラットは、自由摂食、自由飲水で飼育する。
上記のようにして、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが変動する遺伝子群が同定される。
本発明の遺伝子パネルは、上記のようにして測定される各種遺伝子の名称と、それぞれの遺伝子の発現プロファイル、すなわち発現レベルの変動に関する情報を少なくとも含む。遺伝子の名称は、他の遺伝子と区別することができる限り特に命名法は制限されないが、典型的には、その遺伝子によってコードする産物の名称、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース上のアクセッション番号や遺伝子名など、あるいは遺伝子チップ上のプローブセット名や遺伝子名等が用いられる。
本発明の遺伝子パネルの好ましい形態においては、各遺伝子は、肝星細胞分離後一定時間における発現レベルによって分類される。例えば、肝星細胞分離３日後（活性化初期）、７日後（活性化型肝星細胞）に増加するグループに分類される。ここでいう顕著とは、発現の増加が、肝星細胞の静止期のそれと比べ３倍以上差があるものとする。
＜２＞本発明のスクリーニング法
本発明の遺伝子パネルをもとにして、遺伝子パネルに含まれる遺伝子の発現を定量的、半定量的に測定するシステムを構築することにより、各種スクリーニングが可能となる。
例えば、肝炎、肝硬変、ＮＡＳＨモデル動物または活性化肝星細胞に薬剤を投与し、本発明の遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロファイリングを行うことにより、肝星細胞に関与する薬剤のスクリーニングを行うことができる。すなわち、薬剤の投与によって、各遺伝子の発現プロファイルが静止期の肝星細胞遺伝子パネルにおける発現プロファイルと類似するような薬剤は、肝星細胞活性化を阻害すると考えられる。
また、本遺伝子パネルの遺伝子の発現増加をさらに増加させる薬剤、もしくは発現減少をさらに減少させる薬剤をスクリーニングすることによっても、肝星細胞活性化抑制物質のスクリーニングが可能である。この場合、５種程度の遺伝子の発現変化に注目することにより、スクリーニングが可能である。
遺伝子の発現プロファイリングの方法としては、遺伝子パネルを構成する遺伝子の断片を固定したスライドガラス又はナイロンメンブレン等を用いたＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡマクロアレイ法、あるいはＡＴＡＣ−ＰＣＲ法、Ｔａｑｍａｎプローブを利用した方法、又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを利用した定量的ＰＣＲ法等が挙げられる。発現プロファイリングは、単独の方法で行ってもよく、複数の方法を組み合わせてもよい。
以下に、スクリーニングの具体的手順の一例を示す。
第一次スクリーニングとして、スクリーニング対象薬剤で分離活性化型肝星細胞、又は、株化された活性化型肝星細胞を処理し、一定時間後の細胞からＲＮＡを調製する。肝臓から分離した星細胞は時間と共に活性化するため、活性化の各ステージ、例えば活性化初期（分離直後から３日間培養まで）、中期（４日から６日培養まで）、後期（７日培養以降）の細胞をそれぞれ対象として、薬剤の作用を測定してもよい。薬剤処理前後の遺伝子発現レベルを測定し、その発現プロファイルが静止期の星細胞の遺伝子パネルに相似した薬剤、又は活性化とともに上昇する遺伝子発現を抑制する薬剤をスクリーニングする。薬剤処理後の肝星細胞における遺伝子発現パターンをグループ化し、遺伝子発現パネルの静止期のプロファイリングと相似した薬剤、又は活性化とともに上昇する遺伝子発現を抑制する薬剤をスクリーニングする。グループ化は、遺伝子パネルの作成と同様にして、一定時間における発現レベルによって分類することによって行われる。
細胞内で遺伝子発現産物である蛋白質は、互いに関連し、ネットワークを形成している。直接結合したり、酵素と基質の関係になったりする場合と、蛋白質がゲノムの特定部位と結合し特定遺伝子の転写を制御したりすることによりネットワークができている。肝星細胞活性化においてこれら一連のネットワークが作動し、この作動が次の一連のネットワークを作動するというネットワークのカスケードが考えられる。このカスケードの結果として肝星細胞が活性化し最終的に筋線維芽様細胞へ分化していく。このカスケードに関連するすべての遺伝子発現の変動を集合したものが本パネルである。肝星細胞活性化阻害剤に要求されることは、ネットワークの上流を阻害してネットワークを停止させるか、転写因子を介してカスケードを転写因子の周辺のシグナル伝達を阻害することによりカスケードを止めることが望まれる。これからして有望な阻害剤は本パネルのある遺伝子変動をまとまって生じさせると考えられる。このまとまりは、場合によるが１つのネットワークに関連する遺伝子が１０個程度本パネルに含まれていると予想されるので、少なくとも５個の遺伝子が一つの阻害剤で変動すると予想される。よって、少なくとも５個の遺伝子の変動をもって一次スクリーニングとして効果を判断する。
肝星細胞の培養条件としては、非コートプラスチックシャーレ上の培養、又は、ＴＧＦ−１β（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）など肝星細胞の活性化を促進する物質を加える、等の方法があり、肝星細胞活性化抑制物質、又は肝星細胞増殖を阻害する物質がスクリーニングされることが期待される。
第二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで肝星細胞の活性化抑制または、肝星細胞の増殖阻害を示すと予想される候補薬物を、肝炎誘導薬剤、肝硬変誘導薬剤、脂肪肝誘導薬剤などで作成した病態モデルラットに投与し、肝臓を摘出する。肝臓の結合組織量を測定するとともに、これからＲＮＡを抽出し遺伝子発現変化を測定する。これらのデータを、薬剤を投与しないラットの肝結合組織量を測定し遺伝子発現変化データと比較し、薬剤の肝結合組織増生や蓄積に対する効果を評価する。
上記スクリーニングは、ラット以外の実験動物を利用しても可能であり、その場合、ラット遺伝子に対応するホモログについて遺伝子パネルを作り直し、スクリーニングを実施することが好ましい。
以上のように、本発明の遺伝子パネルは、肝星細胞の活性化において有効な薬剤のスクリーニングに有用であると考えられ、その結果得られた薬剤を組み合わせることにより、より有効な肝線維化治療薬を創出することも可能であると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１
＜１＞肝星細胞の分離
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（体重３００〜３５０ｇ）をエーテル麻酔後、腹腔内にネンブタールを０．５ｍｌ注入し、クーパーにて開腹し、門脈を露出させた。サーフローを門脈のやや末梢側より挿入した。
潅流液（１リットルあたり８ｇ ＮａＣｌ、４００ｍｇ ＫＣｌ、８８．１７ｍｇ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１２０．４５ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、２３８０ｍｇ ＨＥＰＥＳ、３５０ｍｇ ＮａＨＣＯ３、５６０ｍｇ ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ）２００ｍｌ、７０ｍｇプロナーゼ潅流液１００ｍｌ、７０ｍｇコラゲナーゼ潅流液２５０ｍｌを流した。潅流後、肝を摘出し、細胞を分散させた。それらの細胞を、７０ｍｇプロナーゼ、７０ｍｇコラゲナーゼ、２ｍｇ ＤＮａｓｅＩ入りの潅流液中で、更に消化させた。
その後、上記細胞分散液をメッシュ装置で濾過した後、ファルコンチューブ２本に濾過液を分注し、２０００ｒｐｍで７分遠心した。上清を捨て、０．５ｍｇ ＤＮａｓｅＩを加え、更に攪拌溶液（１リットル当たり８ｇ ＮａＣｌ、３７０ｍｇ ＫＣｌ、２１０ｍｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７０ｍｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、９９１ｍｇグルコース、２２７ｍｇ ＮａＨＣＯ３、２２５ｍｇ ＣａＣｌ２）を加えピペッテングをした後、２０００ｒｐｍで７分遠心した。上清を捨て、６７．５ｍｌの攪拌溶液を加えて細胞を懸濁し、Ｎｉｃｏｄｅｎｚ溶液（１リットル当たり３７０ｍｇ ＫＣｌ、２１０ｍｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７０ｍｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、９９１ｍｇグルコース、２２７ｍｇ ＮａＨＣＯ３、２２５ｍｇ ＣａＣｌ２の溶液２５ｍｌに、７．７５ｇ Ｎｉｃｏｄｅｎｚを溶解）を加え、攪拌し、遠心チューブに分注した。各々のチューブに１ｍｌの攪拌用液を重層し、３２００ｒｐｍで１５分間遠心した。
最上層の下面に細胞層が得られ、この層を吸い取り遠心チューブに移した。攪拌溶液を加えて細胞を懸濁し、２０００ｒｐｍで７分遠心を行った。沈殿を、１０％ ＦＣＳを加えたＤＭＥＭに懸濁し、非コートプラスチックシャーレに播種した。４時間後に培養液を１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭと交換し、シャーレに接着している細胞を静止期の肝星細胞とした。また、シャーレに接着している細胞を３日間又は７日間培養した細胞をそれぞれ活性化初期の肝星細胞及び活性化した肝星細胞とした。
＜２＞全ＲＮＡの精製
細胞数１０７に対し、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を加え、ホモジェナイズした。得られたホモジネートを遠心し、上清を回収した。この上清に、加えたＩＳＯＧＥＮ １ｍｌにつき２００μｌのクロロホルムを加え、軽く撹拌した。室温に２分放置後、１５０００回転、４℃で１０分間遠心分離し、水層を新しい遠心チューブに移した。この水層に、それと等量の２−プロパノールを加え、室温に５分放置後、１５０００回転、４℃で１５分間遠心した。上清を捨て、沈殿したペレットに７０％エタノールを加え、１５０００回転、４℃で１５分間遠心後、７０％エタノールを除去することにより、ペレットをリンスした。リンスしたペレットを室温で５分間乾燥させ、これにＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水を加え、ペレットを溶解させた。こうして得られた全ＲＮＡ画分が精製されたことを、１％アガロースゲル電気泳動により確認した。
上記のようにして、分離直後の肝星細胞、培養３日後、７日後における肝星細胞からそれぞれ全ＲＮＡを精製し、各種遺伝子発現量の推移を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を利用して調べた。
＜３＞ＧｅｎｅＣｈｉｐによる遺伝子発現解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐによる遺伝子発現解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社が推奨するプロトコールに準拠して行った。以下に手順を示す。
（１）プローブ合成
（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡ合成
まず、＜２＞で調製した全ＲＮＡから、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用い、二本鎖ｃＤＮＡ合成を行った。全ＲＮＡ １５μｇ、Ｔ７−（ｄＴ）２４ｐｒｉｍｅｒ １００ｐｍｏｌをＤＥＰＣ処理水に溶解し、１１μｌとした。７０℃で１０分間反応後、氷冷し、５×１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）４μｌ、０．１×ＤＴＴ（ジチオスライトール、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）１μｌを加え、４２℃、２分間保温した。これに逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ）２μｇを加えた後、４２℃で１時間反応させた。
前記反応液に、ＤＥＰＣ処理水、５×２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ３μｌ、ＤＮＡリガーゼ１０Ｕ／μｌ １μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＩ １０Ｕ／μｌ ４μｌ、ＲＮａｓｅＨ ２Ｕ／μｌを加えて混合した後、１６℃で２時間反応させた。この後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ／μｌ ２μｌを加え、１６℃で５分反応させた。これに、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えた。この反応液に等量の（フェノール：クロロホルム＝１：１）溶液を加え、これらが入ったチューブを上下に振って混ぜ合わせた。この混合液を、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、水層を新しい遠心チューブに移した。この水層に、３Ｍの酢酸ナトリウムを１／１０量、１００％エタノールを３倍量加え、よく混合した。−８０℃で１０分放置したのち、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。沈殿したペレットを７０％エタノールで２回リンスし、室温で５分間乾燥した後、ＤＥＰＣ処理水を１２μｌ加えた。
（ｉｉ）ビオチン標識ｃＲＮＡプローブの合成
次に上記で合成した二本鎖ｃＤＮＡから、Ｅｎｚｏ社製Ｂｉｏ Ａｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、ビオチン標識ｃＲＮＡプローブを合成した。二本鎖ｃＤＮＡ ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１７μｌ、１０×ＨＹ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、１０×ビオチン標識リボヌクレオチド（Ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）４μｌ、１０×ＤＴＴ ４μｌ、１０×ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘ ４μｌ、２０×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ２μｌを混合し、３７℃で４時間反応させた。
次に、上記のようにして合成したビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液から、未反応のＢｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓを、Ｑｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙを使用して除いた。ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液に、ＤＥＰＣ処理水１６０μｌを加え、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ ７００μｌを混合し、ついで１００％エタノール５００μｌを加え、よく混合した。この溶液を、７００μｌずつＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００ｒｐｍで１５秒間遠心した。溶出液を、再度ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００ｒｐｍで１５秒間遠心した。次に、ＲＰＥ ｂｕｆｆｅｒ ５００μｌをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００ｒｐｍで１５秒間遠心した。再度ＲＰＥ ｂｕｆｆｅｒ ５００μｌをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、１５０００ｒｐｍで２分間遠心した。
上記のようにしてビオチン標識ｃＲＮＡプローブを吸着させ、洗浄したＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎを、新しい遠心チューブに移した。このＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎにＤＥＰＣ処理水３０μｌを加え、室温で１分間放置した。８０００ｒｐｍで１５秒間遠心し、精製されたビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液を溶出させた。
次に、精製されたビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液の断片化を行った。ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（最終溶液量の１／５量を加える）を混合して、ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ濃度が０．５μｇ／μｌとなるよう調整し、９４℃で３５分間反応させた。１％アガロースゲル電気泳動を行い、プローブがおおよそ１００塩基前後の長さに断片化されているのを確認した。
（２）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、まずテストチップ（ＴＥＳＴ２ Ｃｈｉｐ）で断片化ビオチン標識ｃＲＮＡプローブの出来を評価し、問題がないことを確認した後に本試験を行った。本試験には、ラットチップセット（ＲＧ−Ｕ３４Ａ，ＲＧ−Ｕ３４Ｂ，ＲＧ−Ｕ３４Ｃ）を用いた。これら３種のラットチップセットには、計７０００種のラット既知遺伝子と、１７０００種の未知遺伝子が含まれている。テストチップ、ラットチップセットのいずれも、以下の手順でハイブリダイゼーションを行った。
断片化ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ６０μｇ、コントロールｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｅｄ Ｂ２（５ｎＭ）１２μｌ、１００×ｃｏｎｔｒｏｌ ｃＲＮＡカクテル１２μｌ、ニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）１２μｌ、アセチル化ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｇ）１２μｌ、２×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファ６００μｌを加え、ＤＥＰＣ処理水で１２００μｌに調整した（以下、「ハイブリダイゼーションカクテル」と呼ぶ）。ハイブリダイゼーションカクテルを９９℃、５分加熱して熱変性を行い、４５℃に５分間置いた後、１５０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を、テストチップ（ＴＥＳＴ２ Ｃｈｉｐ）では８０μｌ、ラットチップセット（ＲＧ−Ｕ３４Ａ，ＲＧ−Ｕ３４Ｂ，ＲＧ−Ｕ３４Ｃ）では２００μｌ分取し、ハイブリダイゼーションに使用した。
Ｇｅｎｅｃｈｉｐを室温にもどし、１×ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｅｓｔ２ ｃｈｉｐは８０μｌ、ラットチップセットは２００μｌ）、４５℃で１０分、６０ｒｐｍでプレハイブリダイゼーションを行った。次に、プレハイブリダイゼーション液を除去し、前記の熱変性させたハイブリダイゼーションカクテルを添加し、４５℃、１６時間、６０ｒｐｍでハイブリダイゼーションを行った。
（３）洗浄、染色及びスキャニング
Ｇｅｎｅｃｈｉｐからハイブリダイゼーションカクテルを除去し、ｎｏｎ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを入れ、Ｆｌｕｉｄｉｃ ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄及び染色を行った。洗浄及び染色は、Ｔｅｓｔ２ ＣｈｉｐではＦｌｕｉｄｉｃ ｓｔａｔｉｏｎのＭｉｎｉ＿ｅｕｋ１プロトコールに従い、ラットチップセットではＥｕｋＧＥ−ＷＳ２プロトコールに従って行った。洗浄及び染色終了後、スキャナーにてチップのスキャニングを行い、画像データを取り込んだ。
（４）データ解析
ハイブリダイゼーションのデータ解析は、ＧｅｎｅＣｈｉｐアナリシススイートによって行った。結果を表１〜４に示す。各遺伝子の発現量は、全遺伝子の発現の平均値を１００とし、それに対する相対値（Ａｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）で表した。表中、ププローブセット（Ｐｒｏｂｅ ｓｅｔ）番号は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって命名された、各遺伝子に対応する管理用背番号である。ユニジーン（Ｕｎｉｇｅｎｅ）はＧｅｎＢａｎｋに登録されたＤＮＡ配列を、遺伝子（転写産物）種ごと、及び生物種ごとにまとめたものである。
表中の分離直後のカラムは、肝星細胞を分離し非コートプラスチックシャーレに肝星細胞を播種し、４時間後肝星細胞からＲＮＡを調製する。３日目、７日目のカラムは、肝星細胞を非コートプラスチックシャーレで３日間、７日間培養した活性化初期細胞、活性化型肝星細胞の遺伝子発現量である。
正常時の肝臓から分離直後の静止期肝星細胞における発現に比べ、非コートプラスチックシャーレ上で培養した活性化肝星細胞における発現増加が著しい（約３倍以上増加）既知遺伝子は１０５種であった。
実施例２
実施例１＜１＞で述べた方法により静止期肝星細胞を調製し、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で２４時間培養した。培地を新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地又は同培地に１０ｍＭシステインを含む培地で交換し、さらに４８時間培養した。シャーレの培地を抜き、ＰＢＳで洗浄後、シャーレに付着した細胞をＩｓｏｇｅｎで溶解し、実施例１＜２＞で述べた方法によりＲＮＡを調製し、実施例＜３＞で述べた方法でＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ測定し、データ解析した。この解析結果を活性化初期肝星細胞に対するシステインの作用と記する。
同様に、静止期肝星細胞を調製し、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で培養した。毎日培地を新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で交換しながら３日培養した。３日後に、新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地又は同培地に１０ｍＭシステインを含む培地で交換し、さらに２時間又は８時間培養した。シャーレの培地を抜き、ＰＢＳで洗浄後、シャーレに付着した細胞をＩｓｏｇｅｎで溶解し、ＲＮＡを調製し、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ測定、解析した。この解析結果を活性化中期肝星細胞に対するシステインの作用と記する。
同様に、静止期肝星細胞を調製し、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で培養した。３日後と５日後に培地を新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で交換しながら７日培養した。７日後に、新しい０．１％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で交換し、９日後に、新しい０．１％ＦＢＳ及び最終濃度２０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ（ヒト型リコンビナントｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｔｈ ｆａｃｔｏｒ，Ｓｉｇｍａ社製）を含む培地又は同培地に１０ｍＭシステインを含む培地で交換し、さらに６時間又は２４時間培養した。ＰＤＧＦは活性化して増殖能が低下した肝星細胞の増殖をさらに促す目的で添加した。シャーレの培地を抜き、ＰＢＳで洗浄後、シャーレに付着した細胞をＩｓｏｇｅｎで細胞を溶解し、ＲＮＡを調製し、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐで測定、解析した。この解析結果を活性化後期肝星細胞に対するシステインの作用と記する。
肝星細胞活性化初期、中期、後期の各時期において、システインが及ぼす遺伝子発現に対する影響を表５〜７に示す。表５〜７中、遺伝子番号は表１〜４と同様である。実施例１の表１〜４に示した肝星細胞活性化に伴い発現が上昇する遺伝子のうち、活性化初期、中期、後期のいずれかにおいてシステインが抑制効果を示した遺伝子を表５〜７に記載した。活性化初期、中期、後期に対する発現抑制効果があった場合はそれぞれ○印を付し、発現強度（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を表記した。
肝星細胞調製後２４時間培養した細胞を活性化初期肝星細胞として、この細胞の測定値を「イニシャル・初（２４ｈｒ）」、新しい培地で交換し４８時間培養した細胞の測定値を「培地のみ・初（＋４８ｈｒ）」、システインを添加した培地で４８時間培養した細胞の測定値を「システイン添加・初（＋４８ｈｒ）」とそれぞれ表記した。
また、肝星細胞調製後３日間培養した細胞を活性化中期肝星細胞として、この細胞の測定値を「イニシャル・中（ｄａｙ３）」、新しい培地で交換し２時間又は８時間培養した細胞の測定値を「培地のみ・中（＋２ｈｒ）」又は「培地のみ・中（＋８ｈｒ）」、システインを添加した培地で２時間又は８時間培養した細胞の測定値を「システイン添加・中（＋２ｈｒ）」又は「システイン添加・中（＋８ｈｒ）」とそれぞれ表記した。
また、肝星細胞調製後９日間培養した細胞を活性化後期肝星細胞として、この細胞の測定値を「イニシャル・後（ｄａｙ９）」、新しい培地で交換し６時間又は２４時間培養した細胞の測定値を「培地のみ・後（＋６ｈｒ）」又は「培地のみ・後（＋２４ｈｒ）」、システインを添加した培地で６時間又は２４時間培養した細胞の測定値を「システイン添加・後（＋６ｈｒ）」又は「システイン添加・後（＋２４ｈｒ）」とそれぞれ表記した。
表５〜７に示すように、システインは多くの遺伝子発現に影響を及ぼした。これより、システインは肝星細胞の活性化過程に影響を与え、従って、システインは肝の線維化を抑制することが予測される。実際に、システインが肝線維化を抑制することを以下に示す。
６週齢ＳＤ系雄性ラットに１０ｍｇ／ｋｇのジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）を週３回腹腔内に４週間投与して肝線維化を惹起した。被験物としてＬ−システイン（Ｃｙｓ）を、対照としてカゼイン（Ｃａｓｅｉｎ）を各々０．５％添加した実験食をＤＭＮ投与開始日より供餌した。ＤＭＮ投与開始２８日目に肝臓を採取し、肝線維化の指標として肝臓中ハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）量をアミノ酸分析機を用いて測定した。この結果を図１に示した。この図から明らかなように、ＤＭＮの投与により６倍に増加した肝臓中のＨｙｐはＣｙｓの経口投与により有意に増加が抑制されていた。
以上、本遺伝子パネルにより、肝星細胞活性化過程で必要な遺伝子変動を変化させる薬効を持つシステインは、肝線維化を抑制した。よって本遺伝子パネルを用いたスクリーニング法が有効であることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明より、肝星細胞に関与する遺伝子の発現情報が提供される。同発現情報を利用して、肝星細胞の活性化を抑制する薬物等をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
カゼイン又はＬ−システインを供餌したラット肝臓中のハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）量を示す図。
本発明は、肝星細胞中で正常時に比べて肝星細胞の活性化に伴い発現レベルが上昇する遺伝子の群からなる遺伝子パネル、その作成方法、同遺伝子パネルの利用に関するものである。これらの発明は、診断、医薬分野等で有用である。
背景技術
肝の結合組織の増生および蓄積は、肝の循環傷害を招来する。これが更に肝実質細胞障害原因になり、悪循環が形成され、更なる結合組織の増生および蓄積がおこり、肝硬変や肝線維化モデル動物の肝線維化をともなう肝疾患症を引き起こすと考えられている。肝臓は実質細胞（肝細胞）と非実質細胞（肝星細胞、クッパー細胞、類同内皮細胞、Ｐｉｔ細胞）から成り、肝臓の結合組織は細胞外基質とそこに局在する細胞から構成されている。結合組織中の基質産生担当細胞である肝星細胞が活性化され形質転換することにより結合組織の増生・蓄積が促進される。正常肝臓の肝星細胞（以下、静止期の星細胞と呼ぶ）は、細胞外基質の生産量が少なく、活性化にともない筋線維芽様細胞に形態を変化させ、細胞の増加と共に多量の細胞外基質を合成することが知られている。
したがって、肝硬変など肝線維化をともなう肝疾患患者の肝星細胞の活性化を抑制し、結合組織の増生・蓄積を軽減する医療が要求されており、肝星細胞の活性化を抑制させる薬剤のスクリーニングは重要であるといえる。このような要求があるにも関わらず、肝星細胞の活性化を抑制する薬物の効率的なスクリーニング法は知られていない。
肝疾患により肝細胞が壊死に陥るとそれまで静止期にあった肝星細胞は肝壊死細胞に由来する液性因子や、炎症局所の活性化クッパー細胞や浸潤した炎症細胞などがパラクライン分泌したサイトカインにより、更に、活性化された肝星細胞のオートクライン分泌によって活性化される。ここで、肝星細胞活性化は複数の因子の関与が考えられているが、いかなるタイミングで働いているのか全体像はわかっていない。そこで、肝星細胞の活性化の全体像をつかむためには、肝星細胞の活性化には複数の遺伝子が関与していると考えられることから、肝星細胞活性化に働く重要遺伝子を多数調べることが重要であると考えられる。これまで、肝星細胞活性化を抑制する薬剤のスクリーニングから生まれた薬剤は無い。肝星細胞活性化に発現変動が見られることを指標とした遺伝子スクリーニングの報告はあったが、せいぜい数種の遺伝子の発現変動を見たものに過ぎなかった。
発明の開示
本発明は、上記観点からなされたものであり、肝星細胞で、静止期に比べて肝星細胞が活性化した時に発現レベルが変動する遺伝子の群からなる遺伝子パネル、及びそれを利用して肝星細胞の活性化を抑制させる薬物をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
本発明者は、肝星細胞の活性化を抑制させるためには、肝星細胞の活性化に関与する遺伝子の挙動を、静止期の肝星細胞の遺伝子発現パターンに近づけてやればよいと考えた。そして、肝星細胞初代培養系での活性系モデルを用いて、肝星細胞の活性化における各種遺伝子の発現プロファイルを調べ、肝星細胞に関与する遺伝子に関する発現情報を取得した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）肝星細胞で、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子の名称及びそれらの遺伝子の発現プロファイルからなる遺伝子パネル。
（２）前記遺伝子の発現レベルの上昇が、モデル動物における正常時の発現レベルに対する、肝硬変・肝線維化モデル動物における発現レベルの差である（１）の遺伝子パネル。
（３）前記発現プロファイルが、肝星細胞における経時的な発現プロファイルを含む（１）又は（２）の遺伝子パネル。
（４）前記モデル動物がラットである（２）または（３）のいずれかの遺伝子パネル。
（５）表１〜４の番号１〜１０５に示す１０５種の遺伝子のうち、少なくとも５種類の各遺伝子の発現プロファイルを含む（１）〜（４）のいずれかの遺伝子パネル。
（６）肝星細胞中で、正常時に比べて肝星細胞活性化時期に発現レベルが変動する遺伝子の群からなる遺伝子パネルの作成方法であって、以下のステップを含む方法：
（ａ）静止期の肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期の肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）それぞれの発現レベルを比較するステップと、
（ｃ）活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子群を同定するステップ。
（７）前記ステップ（ａ）において、肝星細胞活性化時期における前記遺伝子の発現レベルを経時的に解析することを特徴とする（６）の方法。
（８）前記遺伝子発現レベルの解析を、遺伝子チップ法により行う（６）又は（７）の方法。
（９）モデル動物または肝臓の組織もしくは細胞に薬剤を投与し、（１）の遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロファイリングを行うことを特徴とする、肝星細胞活性化に関与する薬剤のスクニーニング方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の遺伝子パネル
本発明の遺伝子パネルは、肝星細胞で、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子の名称及びそれらの遺伝子発現プロファイルからなる遺伝子パネルである。
本発明の遺伝子パネルは、下記ステップにより作成することができる。
（ａ）静止期の肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期の肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）それぞれの発現レベルを比較するステップと、
（ｃ）活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子群を同定するステップ。
肝星細胞の機能は、ビタミンＡの代謝と貯蔵、細胞外基質の産生、サイトカインの産生、収縮運動、筋線維芽細胞への形質転換であり、これらの機能が肝線維化に密接に関係していると考えられている。活性化時期の肝星細胞（活性化した肝星細胞又は活性化型肝星細胞と同義である）とは、正常肝の静止期の肝星細胞が様々な刺激により、筋線維芽様細胞へ形質転換した状態の肝星細胞をいう。筋線維芽細胞へ形質転換した細胞は、増殖性が増し、ビタミンＡ含量が低下し、収縮性を増す。また、タイプＩ型コラーゲンを主とする細胞外基質を産生する。さらに、更にコラゲナーゼやゼラチナーゼなどの細胞外基質分解酵素の合成が低下するため、細胞外基質の増性・蓄積を促進する。
活性化された肝星細胞は、分離肝星細胞で同様な形質転換が起ることが知られている。肝疾患、例えば、肝炎（Ｊ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９６ Ｍａｒ ２４，（３）：３０１−７ Ｇｕｉｄｏ Ｍ ｌｉｖｅｒ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、肝硬変（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９０ Ｊｕｌｙ １３７（１）Ｓｔｅｆａｎｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴｙｐｅＩ，ＩＩＩ，ａｎｄ ＩＶ Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｔｉｃ Ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ）、ＮＡＳＨ（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ２０００ Ｊｕｌｙ ３１（７）８２２−８，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ．）などでは、肝臓の炎症の持続と共に肝に結合組織が増加、蓄積を起こし、活性化型肝星細胞増加が観察される。
遺伝子の発現レベルとは、遺伝子の発現量、発現強度又は発現頻度と同義であり、通常、遺伝子に対応する転写産物の生成量、又はその翻訳産物の活性等により解析される。
遺伝子の発現レベルは、通常遺伝子の発現解析に利用されている方法を用いて測定することができる。好ましい方法としては、例えば、遺伝子チップ法、遺伝子マイクロアレイ法、及び遺伝子マクロアレイ法等がある。いずれも、遺伝子断片を何等かの板の上（通常はスライドガラス）に、並べて張り付けたものが用いられる。このチップと蛍光ラベルしたｍＲＮＡをハイブリダイズさせて、ｍＲＮＡの種類と量を測定する。
その他、遺伝子発現解析法として、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ ２５，４６９４−４６９６（１９９７））Ｂｏｄｙ Ｍａｐ法（Ｇｅｎｅ，１７４，１５１−１５８（１９９６））、Ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）法（米国特許第５２７，１５４号、第５４４，８６１号、欧州特許公開第０７６１ ８２２号）、ＭＡＧＥ（Ｍｉｃｒｏ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（特開２０００−２３２８８８号）等が挙げられる。
ＡＴＡＣ−ＰＣＲ法の概略は、以下の通りである。まず、５’ビオチン化オリゴｄＴプライマーを用いて合成したｃＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成し、これを特定の制限酵素（ここではＭｂｏＩを用いた例について述べる）で切断する。次に、この制限酵素で切断された部位と共通の配列を末端に持つアダプター（長さの異なる６種類を用意する）と、制限酵素ＭｂｏＩで切断した二本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡライゲースにより連結する。尚、６種類のアダプターのうち、３種類をコントロールｃＤＮＡ（活性化時期の肝星細胞から調製したｃＤＮＡ）に結合し、１０：３：１の比率で混合する。残る３種類のアダプターに、非コートプラスチックシャーレで培養後４時間、３日、７日のラット肝星細胞から調製したｃＤＮＡを結合させる。
それぞれの連結反応物を混合した後、ストレプトアビジンコートされたビーズを用いて二本鎖ｃＤＮＡの３’断片を回収し、各アダプターに共通する配列を持つプライマーを用いて競合的ＲＴ−ＰＣＲを行う。このＰＣＲ産物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析する。この装置は、キャピラリー電気泳動により、断片の長さ毎に分離することができ、発現量に比例した蛍光強度を検出することができる。
Ｂｏｄｙ Ｍａｐ法の概略は以下の通りである。ｍＲＮＡをベクター上のポリＴ配列とｍＲＮＡの３’末端にあるポリＡテールを結合させ、ベクターポリＴ配列をプライマーとしてｃＤＮＡを合成する。更に、制限酵素ＭｂｏＩでｃＤＮＡを切断する。ＭｂｏＩサイトはｃＤＮＡ上で平均３００塩基対に一つあるため、ベクター上のｃＤＮＡは平均３００塩基対に分断される。このとき、最もポリＡテールよりのｃＤＮＡは、ベクターに結合したまま残る。このｃＤＮＡ断片を持つベクターを閉環させ、それを大腸菌に導入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。ライブラリーから約１０００クローンを任意に選択して、それぞれについて平均３００塩基対の塩基配列を決定する。それらの配列の中から同じ配列を含むクローン毎にまとめて、それぞれの配列の種類と出現頻度を算出して遺伝子発現プロファイルを得る。各ｃＤＮＡ配列はデータバンクとのホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、既知の遺伝子と同一の配列を有するクローンにはその遺伝子の名称を与える。配列がデータバンクに登録されていない場合は、その配列に該当する遺伝子は存在しないものとする。
ＢＬＡＳＴ検索によりホモロジー検索を行なうためには、最低１１塩基対の情報が必要である。１０塩基からなる配列の種類は約百万種であり、人で存在すると予想される遺伝子の種類１０万種を遙かに越える。すなわち、１１塩基対の情報があれば、その配列を持つ遺伝子は特定することができ、遺伝子発現プロファイル解析が可能である。したがって、多量のシークエンスを必要とするＢｏｄｙ Ｍａｐによる遺伝子発現プロファイル解析を効率化するために、Ｂｏｄｙ Ｍａｐにおける約３００塩基対のｃＤＮＡ断片を、更に１１塩基対以上の短い断片（「タグ（ｔａｇ）」と呼ばれる）とし、更にこの断片同士を多数連結してベクターに挿入することにより、連結タグのライブラリーを作製し、Ｂｏｄｙ Ｍａｐと同様に約１０００クローンを任意に選択して、連結タグのＤＮＡ配列を決定すれば、Ｂｏｄｙ Ｍａｐと同じ手数でより多くの遺伝子発現情報を得ることが期待できる。タグは遺伝子配列を代表し、タグの出現頻度はその遺伝子の発現頻度を現す。通常、１回のシークエンスで判読出来るＤＮＡ配列の長さは約６００塩基対であるから、１回のシークエンスで最大５０個程度のタグのＤＮＡ配列を判読出来る。すなわち、Ｂｏｄｙ Ｍａｐ法に比べて最大約５０倍の効率で、遺伝子発現プロファイル解析を行うことが可能になる。
ＳＡＧＥ法は、上記の考えに基づいた遺伝子発現プロファイル解析法である。ＳＡＧＥ法は、以下のようにして行われる。ビオチンが３’末端に結合したポリＴをプライマーとしてｃＤＮＡを作製し、Ｂｏｄｙ Ｍａｐと同様にＭｂｏＩ等の制限酵素（「アンカリング酵素（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」と呼ばれる）でｃＤＮＡを切断した後、ビオチンが結合した３’末端を含むｃＤＮＡ断片をアビジンビーズに吸着させ、ビーズを二分して、それぞれのビーズに吸着したｃＤＮＡ断片（約１３ｂｐ）に２種のリンカー（Ａ又はＢ）の一方づつを結合させる。各リンカーにはＢｓｍＦＩのようなＣｌａｓｓ ＩＩ制限酵素（「タグ化酵素（ｔａｇｇｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」と呼ばれる）のサイトを含ませておく。タグ化酵素でｃＤＮＡ断片をビーズから切り出し、切断部位を平滑化し、Ａリンカーに接続するタグとＢリンカーに接続するタグを連結させる。これは、ダイタグ（ｄｉｔａｇ）と称される。ＡリンカーとＢリンカーを認識するプライマーを用いてＰＣＲによりダイタグを増幅する。増幅されたダイタグ同士を多数連結させてベクターに組み込み、シークエンスする。１シークエンスで最大５０程度のタグシークエンスを得ることができる。このタグシークエンス情報を集計して、遺伝子発現頻度を導き出す。
ＭＡＧＥ法は、上記方法に対する改良法であり、ポリＴ配列を有するベクタープライマーを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、同ベクター上でｃＤＮＡ配列をタグ化し、得られたタグを、タグの末端が識別できるような配列を介在させて連結することによりコンカテマーを形成させ、このコンカテマーの塩基配列を解析することによって、効率よく、しかも高精度で遺伝子の発現頻度を解析することができる方法である。
本発明においては、遺伝子の発現レベルを解析することができる方法であれば特に制限されず、現在知られている方法、及び将来開発される方法のいずれも採用することができる。上記方法のうち、特に好ましいのは、遺伝子チップ法もしくは遺伝子マイクロアレイ法、及びＡＴＡＣ−ＰＣＲ法である。
本発明において、遺伝子の発現レベルの解析は、単独の方法で得られた結果に基づいて行ってもよく、複数の方法により得られた結果を組み合わせて行ってもよい。単独の方法でも解析は可能であるが、複数の方法を組み合わせると、より精度の高い解析を行うことができる。具体的には、複数の方法、例えば遺伝子チップ法により得られた結果と、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ法により得られた結果について相関係数を算出し、相関係数が一定以上の遺伝子について、発現レベルが変動したと評価する。
ヒトやマウス等の動物の遺伝子チップ、遺伝子マイクロアレイ及び遺伝子マクロアレイは各種市販されており、本発明においてはそれらを使用してもよい。
本発明においては、遺伝子の発現レベルの変動は、静止期の肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期の肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定し、それぞれの発現レベルを比較することによって、解析することができる。
静止期の肝星細胞における遺伝子の発現レベルは、正常肝から分離した直後の肝星細胞中の遺伝子の発現レベルを測定することによって解析することができる。
一方、活性化時期の肝星細胞における遺伝子の発現レベルは、例えば、正常肝から分離した肝星細胞を非コーティングのプラスチックシャーレで初代培養し、得られる細胞中の遺伝子の発現レベルを測定することによって解析することができる。正常肝から分離した肝星細胞を非コーティングのプラスチックシャーレで初代培養するだけで、自ら活性化して脂肪滴蓄積の減少、細胞外基質の産生など、肝硬変、肝炎など臨床サンプルの肝臓組織で観察される活性化型肝星細胞と類似した形質を示す。
肝星細胞をラットの正常肝から分離し、非コーティングしたプラスチックシャーレに播種すると、分離直後の肝星細胞は、ビタミンＡを貯蔵する脂肪滴が細胞質に多数観察され正常肝の静止期の肝星細胞と同様な形態を示す。肝星細胞分離後、非コーティングしたプラスチックシャーレ上で培養すると肝星細胞活性化のマーカーである、α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎが培養３日目から観察され、およそ一週間で、肝星細胞は活性化した肝星細胞として筋線維芽細胞様の形態を示す。７日目の活性化肝星細胞は、肝硬変や線維化肝などで観察される脂肪滴が減少した活性化肝星細胞と同様な形質を示す。
また、肝星細胞の活性化時期における遺伝子の発現レベルは、例えば、肝硬変・肝線維化モデル動物の肝臓から分離した直後の肝星細胞中における発現レベルを測定することによって解析される。一方、静止期の遺伝子の発現レベルは、正常モデル動物の肝から分離した肝星細胞分離直後に測定される。遺伝子の発現レベルの解析は、肝星細胞活性化にともない経時的に行うことが好ましい。
肝硬変・肝線維化モデル動物は、例えば、雄性ラットに、生理食塩水を溶解したチオアセトアミド（５０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを１週間に２回ずつ６週間にわたって腹腔内投与することにより取得することができる。この間、ラットは、自由摂食、自由飲水で飼育する。
上記のようにして、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが変動する遺伝子群が同定される。
本発明の遺伝子パネルは、上記のようにして測定される各種遺伝子の名称と、それぞれの遺伝子の発現プロファイル、すなわち発現レベルの変動に関する情報を少なくとも含む。遺伝子の名称は、他の遺伝子と区別することができる限り特に命名法は制限されないが、典型的には、その遺伝子によってコードする産物の名称、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース上のアクセッション番号や遺伝子名など、あるいは遺伝子チップ上のプローブセット名や遺伝子名等が用いられる。
本発明の遺伝子パネルの好ましい形態においては、各遺伝子は、肝星細胞分離後一定時間における発現レベルによって分類される。例えば、肝星細胞分離３日後（活性化初期）、７日後（活性化型肝星細胞）に増加するグループに分類される。ここでいう顕著とは、発現の増加が、肝星細胞の静止期のそれと比べ３倍以上差があるものとする。
＜２＞本発明のスクリーニング法
本発明の遺伝子パネルをもとにして、遺伝子パネルに含まれる遺伝子の発現を定量的、半定量的に測定するシステムを構築することにより、各種スクリーニングが可能となる。
例えば、肝炎、肝硬変、ＮＡＳＨモデル動物または活性化肝星細胞に薬剤を投与し、本発明の遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロファイリングを行うことにより、肝星細胞に関与する薬剤のスクリーニングを行うことができる。すなわち、薬剤の投与によって、各遺伝子の発現プロファイルが静止期の肝星細胞遺伝子パネルにおける発現プロファイルと類似するような薬剤は、肝星細胞活性化を阻害すると考えられる。
また、本遺伝子パネルの遺伝子の発現増加をさらに増加させる薬剤、もしくは発現減少をさらに減少させる薬剤をスクリーニングすることによっても、肝星細胞活性化抑制物質のスクリーニングが可能である。この場合、５種程度の遺伝子の発現変化に注目することにより、スクリーニングが可能である。
遺伝子の発現プロファイリングの方法としては、遺伝子パネルを構成する遺伝子の断片を固定したスライドガラス又はナイロンメンブレン等を用いたＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡマクロアレイ法、あるいはＡＴＡＣ−ＰＣＲ法、Ｔａｑｍａｎプローブを利用した方法、又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを利用した定量的ＰＣＲ法等が挙げられる。発現プロファイリングは、単独の方法で行ってもよく、複数の方法を組み合わせてもよい。
以下に、スクリーニングの具体的手順の一例を示す。
第一次スクリーニングとして、スクリーニング対象薬剤で分離活性化型肝星細胞、又は、株化された活性化型肝星細胞を処理し、一定時間後の細胞からＲＮＡを調製する。肝臓から分離した星細胞は時間と共に活性化するため、活性化の各ステージ、例えば活性化初期（分離直後から３日間培養まで）、中期（４日から６日培養まで）、後期（７日培養以降）の細胞をそれぞれ対象として、薬剤の作用を測定してもよい。薬剤処理前後の遺伝子発現レベルを測定し、その発現プロファイルが静止期の星細胞の遺伝子パネルに相似した薬剤、又は活性化とともに上昇する遺伝子発現を抑制する薬剤をスクリーニングする。薬剤処理後の肝星細胞における遺伝子発現パターンをグループ化し、遺伝子発現パネルの静止期のプロファイリングと相似した薬剤、又は活性化とともに上昇する遺伝子発現を抑制する薬剤をスクリーニングする。グループ化は、遺伝子パネルの作成と同様にして、一定時間における発現レベルによって分類することによって行われる。
細胞内で遺伝子発現産物である蛋白質は、互いに関連し、ネットワークを形成している。直接結合したり、酵素と基質の関係になったりする場合と、蛋白質がゲノムの特定部位と結合し特定遺伝子の転写を制御したりすることによりネットワークができている。肝星細胞活性化においてこれら一連のネットワークが作動し、この作動が次の一連のネットワークを作動するというネットワークのカスケードが考えられる。このカスケードの結果として肝星細胞が活性化し最終的に筋線維芽様細胞へ分化していく。このカスケードに関連するすべての遺伝子発現の変動を集合したものが本パネルである。肝星細胞活性化阻害剤に要求されることは、ネットワークの上流を阻害してネットワークを停止させるか、転写因子を介してカスケードを転写因子の周辺のシグナル伝達を阻害することによりカスケードを止めることが望まれる。これからして有望な阻害剤は本パネルのある遺伝子変動をまとまって生じさせると考えられる。このまとまりは、場合によるが１つのネットワークに関連する遺伝子が１０個程度本パネルに含まれていると予想されるので、少なくとも５個の遺伝子が一つの阻害剤で変動すると予想される。よって、少なくとも５個の遺伝子の変動をもって一次スクリーニングとして効果を判断する。
肝星細胞の培養条件としては、非コートプラスチックシャーレ上の培養、又は、ＴＧＦ−１β（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）など肝星細胞の活性化を促進する物質を加える、等の方法があり、肝星細胞活性化抑制物質、又は肝星細胞増殖を阻害する物質がスクリーニングされることが期待される。
第二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで肝星細胞の活性化抑制または、肝星細胞の増殖阻害を示すと予想される候補薬物を、肝炎誘導薬剤、肝硬変誘導薬剤、脂肪肝誘導薬剤などで作成した病態モデルラットに投与し、肝臓を摘出する。肝臓の結合組織量を測定するとともに、これからＲＮＡを抽出し遺伝子発現変化を測定する。これらのデータを、薬剤を投与しないラットの肝結合組織量を測定し遺伝子発現変化データと比較し、薬剤の肝結合組織増生や蓄積に対する効果を評価する。
上記スクリーニングは、ラット以外の実験動物を利用しても可能であり、その場合、ラット遺伝子に対応するホモログについて遺伝子パネルを作り直し、スクリーニングを実施することが好ましい。
以上のように、本発明の遺伝子パネルは、肝星細胞の活性化において有効な薬剤のスクリーニングに有用であると考えられ、その結果得られた薬剤を組み合わせることにより、より有効な肝線維化治療薬を創出することも可能であると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１
＜１＞肝星細胞の分離
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（体重３００〜３５０ｇ）をエーテル麻酔後、腹腔内にネンブタールを０．５ｍｌ注入し、クーパーにて開腹し、門脈を露出させた。サーフローを門脈のやや末梢側より挿入した。
潅流液（１リットルあたり８ｇ ＮａＣｌ、４００ｍｇ ＫＣｌ、８８．１７ｍｇ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１２０．４５ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、２３８０ｍｇ ＨＥＰＥＳ、３５０ｍｇ ＮａＨＣＯ３、５６０ｍｇ ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ）２００ｍｌ、７０ｍｇプロナーゼ潅流液１００ｍｌ、７０ｍｇコラゲナーゼ潅流液２５０ｍｌを流した。潅流後、肝を摘出し、細胞を分散させた。それらの細胞を、７０ｍｇプロナーゼ、７０ｍｇコラゲナーゼ、２ｍｇ ＤＮａｓｅＩ入りの潅流液中で、更に消化させた。
その後、上記細胞分散液をメッシュ装置で濾過した後、ファルコンチューブ２本に濾過液を分注し、２０００ｒｐｍで７分遠心した。上清を捨て、０．５ｍｇ ＤＮａｓｅＩを加え、更に攪拌溶液（１リットル当たり８ｇ ＮａＣｌ、３７０ｍｇ ＫＣｌ、２１０ｍｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７０ｍｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、９９１ｍｇグルコース、２２７ｍｇ ＮａＨＣＯ３、２２５ｍｇ ＣａＣｌ２）を加えピペッテングをした後、２０００ｒｐｍで７分遠心した。上清を捨て、６７．５ｍｌの攪拌溶液を加えて細胞を懸濁し、Ｎｉｃｏｄｅｎｚ溶液（１リットル当たり３７０ｍｇ ＫＣｌ、２１０ｍｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７０ｍｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、９９１ｍｇグルコース、２２７ｍｇ ＮａＨＣＯ３、２２５ｍｇ ＣａＣｌ２の溶液２５ｍｌに、７．７５ｇ Ｎｉｃｏｄｅｎｚを溶解）を加え、攪拌し、遠心チューブに分注した。各々のチューブに１ｍｌの攪拌用液を重層し、３２００ｒｐｍで１５分間遠心した。
最上層の下面に細胞層が得られ、この層を吸い取り遠心チューブに移した。攪拌溶液を加えて細胞を懸濁し、２０００ｒｐｍで７分遠心を行った。沈殿を、１０％ ＦＣＳを加えたＤＭＥＭに懸濁し、非コートプラスチックシャーレに播種した。４時間後に培養液を１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭと交換し、シャーレに接着している細胞を静止期の肝星細胞とした。また、シャーレに接着している細胞を３日間又は７日間培養した細胞をそれぞれ活性化初期の肝星細胞及び活性化した肝星細胞とした。
＜２＞全ＲＮＡの精製
細胞数１０７に対し、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を加え、ホモジェナイズした。得られたホモジネートを遠心し、上清を回収した。この上清に、加えたＩＳＯＧＥＮ １ｍｌにつき２００μｌのクロロホルムを加え、軽く撹拌した。室温に２分放置後、１５０００回転、４℃で１０分間遠心分離し、水層を新しい遠心チューブに移した。この水層に、それと等量の２−プロパノールを加え、室温に５分放置後、１５０００回転、４℃で１５分間遠心した。上清を捨て、沈殿したペレットに７０％エタノールを加え、１５０００回転、４℃で１５分間遠心後、７０％エタノールを除去することにより、ペレットをリンスした。リンスしたペレットを室温で５分間乾燥させ、これにＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水を加え、ペレットを溶解させた。こうして得られた全ＲＮＡ画分が精製されたことを、１％アガロースゲル電気泳動により確認した。
上記のようにして、分離直後の肝星細胞、培養３日後、７日後における肝星細胞からそれぞれ全ＲＮＡを精製し、各種遺伝子発現量の推移を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を利用して調べた。
＜３＞ＧｅｎｅＣｈｉｐによる遺伝子発現解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐによる遺伝子発現解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社が推奨するプロトコールに準拠して行った。以下に手順を示す。
（１）プローブ合成
（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡ合成
まず、＜２＞で調製した全ＲＮＡから、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用い、二本鎖ｃＤＮＡ合成を行った。全ＲＮＡ １５μｇ、Ｔ７−（ｄＴ）２４ｐｒｉｍｅｒ １００ｐｍｏｌをＤＥＰＣ処理水に溶解し、１１μｌとした。７０℃で１０分間反応後、氷冷し、５×１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）４μｌ、０．１×ＤＴＴ（ジチオスライトール、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）１μｌを加え、４２℃、２分間保温した。これに逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ）２μｇを加えた後、４２℃で１時間反応させた。
前記反応液に、ＤＥＰＣ処理水、５×２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ３μｌ、ＤＮＡリガーゼ１０Ｕ／μｌ １μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＩ １０Ｕ／μｌ ４μｌ、ＲＮａｓｅＨ ２Ｕ／μｌを加えて混合した後、１６℃で２時間反応させた。この後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ／μｌ ２μｌを加え、１６℃で５分反応させた。これに、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えた。この反応液に等量の（フェノール：クロロホルム＝１：１）溶液を加え、これらが入ったチューブを上下に振って混ぜ合わせた。この混合液を、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、水層を新しい遠心チューブに移した。この水層に、３Ｍの酢酸ナトリウムを１／１０量、１００％エタノールを３倍量加え、よく混合した。−８０℃で１０分放置したのち、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。沈殿したペレットを７０％エタノールで２回リンスし、室温で５分間乾燥した後、ＤＥＰＣ処理水を１２μｌ加えた。
（ｉｉ）ビオチン標識ｃＲＮＡプローブの合成
次に上記で合成した二本鎖ｃＤＮＡから、Ｅｎｚｏ社製Ｂｉｏ Ａｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、ビオチン標識ｃＲＮＡプローブを合成した。二本鎖ｃＤＮＡ ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１７μｌ、１０×ＨＹ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、１０×ビオチン標識リボヌクレオチド（Ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）４μｌ、１０×ＤＴＴ ４μｌ、１０×ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘ ４μｌ、２０×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ２μｌを混合し、３７℃で４時間反応させた。
次に、上記のようにして合成したビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液から、未反応のＢｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓを、Ｑｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙを使用して除いた。ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液に、ＤＥＰＣ処理水１６０μｌを加え、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ ７００μｌを混合し、ついで１００％エタノール５００μｌを加え、よく混合した。この溶液を、７００μｌずつＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００ｒｐｍで１５秒間遠心した。溶出液を、再度ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００ｒｐｍで１５秒間遠心した。次に、ＲＰＥ ｂｕｆｆｅｒ ５００μｌをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００ｒｐｍで１５秒間遠心した。再度ＲＰＥ ｂｕｆｆｅｒ ５００μｌをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加え、１５０００ｒｐｍで２分間遠心した。
上記のようにしてビオチン標識ｃＲＮＡプローブを吸着させ、洗浄したＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎを、新しい遠心チューブに移した。このＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎにＤＥＰＣ処理水３０μｌを加え、室温で１分間放置した。８０００ｒｐｍで１５秒間遠心し、精製されたビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液を溶出させた。
次に、精製されたビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液の断片化を行った。ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ溶液、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（最終溶液量の１／５量を加える）を混合して、ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ濃度が０．５μｇ／μｌとなるよう調整し、９４℃で３５分間反応させた。１％アガロースゲル電気泳動を行い、プローブがおおよそ１００塩基前後の長さに断片化されているのを確認した。
（２）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、まずテストチップ（ＴＥＳＴ２ Ｃｈｉｐ）で断片化ビオチン標識ｃＲＮＡプローブの出来を評価し、問題がないことを確認した後に本試験を行った。本試験には、ラットチップセット（ＲＧ−Ｕ３４Ａ，ＲＧ−Ｕ３４Ｂ，ＲＧ−Ｕ３４Ｃ）を用いた。これら３種のラットチップセットには、計７０００種のラット既知遺伝子と、１７０００種の未知遺伝子が含まれている。テストチップ、ラットチップセットのいずれも、以下の手順でハイブリダイゼーションを行った。
断片化ビオチン標識ｃＲＮＡプローブ６０μｇ、コントロールｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｅｄ Ｂ２（５ｎＭ）１２μｌ、１００×ｃｏｎｔｒｏｌ ｃＲＮＡカクテル１２μｌ、ニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）１２μｌ、アセチル化ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｇ）１２μｌ、２×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファ６００μｌを加え、ＤＥＰＣ処理水で１２００μｌに調整した（以下、「ハイブリダイゼーションカクテル」と呼ぶ）。ハイブリダイゼーションカクテルを９９℃、５分加熱して熱変性を行い、４５℃に５分間置いた後、１５０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を、テストチップ（ＴＥＳＴ２ Ｃｈｉｐ）では８０μｌ、ラットチップセット（ＲＧ−Ｕ３４Ａ，ＲＧ−Ｕ３４Ｂ，ＲＧ−Ｕ３４Ｃ）では２００μｌ分取し、ハイブリダイゼーションに使用した。
Ｇｅｎｅｃｈｉｐを室温にもどし、１×ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｅｓｔ２ ｃｈｉｐは８０μｌ、ラットチップセットは２００μｌ）、４５℃で１０分、６０ｒｐｍでプレハイブリダイゼーションを行った。次に、プレハイブリダイゼーション液を除去し、前記の熱変性させたハイブリダイゼーションカクテルを添加し、４５℃、１６時間、６０ｒｐｍでハイブリダイゼーションを行った。
（３）洗浄、染色及びスキャニング
Ｇｅｎｅｃｈｉｐからハイブリダイゼーションカクテルを除去し、ｎｏｎ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを入れ、Ｆｌｕｉｄｉｃ ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄及び染色を行った。洗浄及び染色は、Ｔｅｓｔ２ ＣｈｉｐではＦｌｕｉｄｉｃ ｓｔａｔｉｏｎのＭｉｎｉ＿ｅｕｋ１プロトコールに従い、ラットチップセットではＥｕｋＧＥ−ＷＳ２プロトコールに従って行った。洗浄及び染色終了後、スキャナーにてチップのスキャニングを行い、画像データを取り込んだ。
（４）データ解析
ハイブリダイゼーションのデータ解析は、ＧｅｎｅＣｈｉｐアナリシススイートによって行った。結果を表１〜４に示す。各遺伝子の発現量は、全遺伝子の発現の平均値を１００とし、それに対する相対値（Ａｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）で表した。表中、ププローブセット（Ｐｒｏｂｅ ｓｅｔ）番号は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって命名された、各遺伝子に対応する管理用背番号である。ユニジーン（Ｕｎｉｇｅｎｅ）はＧｅｎＢａｎｋに登録されたＤＮＡ配列を、遺伝子（転写産物）種ごと、及び生物種ごとにまとめたものである。
表中の分離直後のカラムは、肝星細胞を分離し非コートプラスチックシャーレに肝星細胞を播種し、４時間後肝星細胞からＲＮＡを調製する。３日目、７日目のカラムは、肝星細胞を非コートプラスチックシャーレで３日間、７日間培養した活性化初期細胞、活性化型肝星細胞の遺伝子発現量である。
正常時の肝臓から分離直後の静止期肝星細胞における発現に比べ、非コートプラスチックシャーレ上で培養した活性化肝星細胞における発現増加が著しい（約３倍以上増加）既知遺伝子は１０５種であった。
実施例１＜１＞で述べた方法により静止期肝星細胞を調製し、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で２４時間培養した。培地を新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地又は同培地に１０ｍＭシステインを含む培地で交換し、さらに４８時間培養した。シャーレの培地を抜き、ＰＢＳで洗浄後、シャーレに付着した細胞をＩｓｏｇｅｎで溶解し、実施例１＜２＞で述べた方法によりＲＮＡを調製し、実施例＜３＞で述べた方法でＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ測定し、データ解析した。この解析結果を活性化初期肝星細胞に対するシステインの作用と記する。
同様に、静止期肝星細胞を調製し、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で培養した。毎日培地を新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で交換しながら３日培養した。３日後に、新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地又は同培地に１０ｍＭシステインを含む培地で交換し、さらに２時間又は８時間培養した。シャーレの培地を抜き、ＰＢＳで洗浄後、シャーレに付着した細胞をＩｓｏｇｅｎで溶解し、ＲＮＡを調製し、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ測定、解析した。この解析結果を活性化中期肝星細胞に対するシステインの作用と記する。
同様に、静止期肝星細胞を調製し、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で培養した。３日後と５日後に培地を新しい５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で交換しながら７日培養した。７日後に、新しい０．１％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で交換し、９日後に、新しい０．１％ＦＢＳ及び最終濃度２０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ（ヒト型リコンビナントｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｔｈ ｆａｃｔｏｒ，Ｓｉｇｍａ社製）を含む培地又は同培地に１０ｍＭシステインを含む培地で交換し、さらに６時間又は２４時間培養した。ＰＤＧＦは活性化して増殖能が低下した肝星細胞の増殖をさらに促す目的で添加した。シャーレの培地を抜き、ＰＢＳで洗浄後、シャーレに付着した細胞をＩｓｏｇｅｎで細胞を溶解し、ＲＮＡを調製し、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐで測定、解析した。この解析結果を活性化後期肝星細胞に対するシステインの作用と記する。
肝星細胞活性化初期、中期、後期の各時期において、システインが及ぼす遺伝子発現に対する影響を表５〜７に示す。表５〜７中、遺伝子番号は表１〜４と同様である。実施例１の表１〜４に示した肝星細胞活性化に伴い発現が上昇する遺伝子のうち、活性化初期、中期、後期のいずれかにおいてシステインが抑制効果を示した遺伝子を表５〜７に記載した。活性化初期、中期、後期に対する発現抑制効果があった場合はそれぞれ○印を付し、発現強度（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を表記した。
肝星細胞調製後２４時間培養した細胞を活性化初期肝星細胞として、この細胞の測定値を「イニシャル・初（２４ｈｒ）」、新しい培地で交換し４８時間培養した細胞の測定値を「培地のみ・初（＋４８ｈｒ）」、システインを添加した培地で４８時間培養した細胞の測定値を「システイン添加・初（＋４８ｈｒ）」とそれぞれ表記した。
また、肝星細胞調製後３日間培養した細胞を活性化中期肝星細胞として、この細胞の測定値を「イニシャル・中（ｄａｙ３）」、新しい培地で交換し２時間又は８時間培養した細胞の測定値を「培地のみ・中（＋２ｈｒ）」又は「培地のみ・中（＋８ｈｒ）」、システインを添加した培地で２時間又は８時間培養した細胞の測定値を「システイン添加・中（＋２ｈｒ）」又は「システイン添加・中（＋８ｈｒ）」とそれぞれ表記した。
また、肝星細胞調製後９日間培養した細胞を活性化後期肝星細胞として、この細胞の測定値を「イニシャル・後（ｄａｙ９）」、新しい培地で交換し６時間又は２４時間培養した細胞の測定値を「培地のみ・後（＋６ｈｒ）」又は「培地のみ・後（＋２４ｈｒ）」、システインを添加した培地で６時間又は２４時間培養した細胞の測定値を「システイン添加・後（＋６ｈｒ）」又は「システイン添加・後（＋２４ｈｒ）」とそれぞれ表記した。
表５〜７に示すように、システインは多くの遺伝子発現に影響を及ぼした。これより、システインは肝星細胞の活性化過程に影響を与え、従って、システインは肝の線維化を抑制することが予測される。実際に、システインが肝線維化を抑制することを以下に示す。
６週齢ＳＤ系雄性ラットに１０ｍｇ／ｋｇのジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）を週３回腹腔内に４週間投与して肝線維化を惹起した。被験物としてＬ−システイン（Ｃｙｓ）を、対照としてカゼイン（Ｃａｓｅｉｎ）を各々０．５％添加した実験食をＤＭＮ投与開始日より供餌した。ＤＭＮ投与開始２８日目に肝臓を採取し、肝線維化の指標として肝臓中ハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）量をアミノ酸分析機を用いて測定した。この結果を図１に示した。この図から明らかなように、ＤＭＮの投与により６倍に増加した肝臓中のＨｙｐはＣｙｓの経口投与により有意に増加が抑制されていた。
以上、本遺伝子パネルにより、肝星細胞活性化過程で必要な遺伝子変動を変化させる薬効を持つシステインは、肝線維化を抑制した。よって本遺伝子パネルを用いたスクリーニング法が有効であることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明より、肝星細胞に関与する遺伝子の発現情報が提供される。同発現情報を利用して、肝星細胞の活性化を抑制する薬物等をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
カゼイン又はＬ−システインを供餌したラット肝臓中のハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）量を示す図。
Claims (9)
- 肝星細胞で、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子の名称及びそれらの遺伝子発現プロファイルからなる遺伝子パネル。
- 前記遺伝子の発現レベルの上昇が、モデル動物における正常時の発現レベルに対する、肝硬変・肝線維化動物モデルにおける発現レベルの差である請求項１記載の遺伝子パネル。
- 前記発現プロファイルが、活性化肝星細胞における経時的な発現プロファイルを含む請求項１又は２に記載の遺伝子パネル。
- 前記モデル動物がラットである請求項２または３に記載の遺伝子パネル。
- 表１〜４の番号１〜１０５に示す１０５種の遺伝子のうち、少なくとも５種類の各遺伝子の発現プロファイルを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子パネル。
- 肝星細胞中で、静止期に比べて活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子の群からなる遺伝子パネルの作成方法であって、以下のステップを含む方法：
（ａ）静止期の肝星細胞における各種遺伝子の発現レベルと、活性化時期の肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）それぞれの発現レベルを比較するステップと、
（ｃ）活性化時期に発現レベルが上昇する遺伝子群を同定するステップ。 - 前記ステップ（ａ）において、肝星細胞における前記遺伝子の発現レベルを経時的に解析することを特徴とする請求項６記載の方法。
- 前記遺伝子発現レベルの解析を、遺伝子チップ法により行う請求項６又は７に記載の方法。
- モデル動物もしくは肝臓の組織または細胞に薬剤を投与し、請求項１記載の遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロファイリングを行うことを特徴とする、肝星細胞活性化に関与する薬剤のスクニーニング方法。
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