JP2002504348A

JP2002504348A - ｍＲＮＡ分子を特徴付けする方法

Info

Publication number: JP2002504348A
Application number: JP2000532550A
Authority: JP
Inventors: ラルフホフマン; ヘルマンルベルト; ステファンツイリング
Original assignee: バイオフロンテラファーマシューティカルズアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2002-02-12
Anticipated expiration: 2019-02-16
Also published as: AU2834299A; EP1055003A1; DE19806431C1; JP3533373B2; US6670121B1; WO1999042610A1; CA2322068A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、特異的に発現したｍＲＮＡ分子の定性及び定量測定のための方法に関する。当該方法は、特には、可能であれば細胞又は組織に存在する全ｍＲＮＡ分子を測定し、それらを他の細胞又は組織又は他の状況（疾患又は発達の段階）またはそれらの治療の段階と比較するために使用される。従って、本発明で提供される方法により、例えば、一定のｍＲＮＡ集団に存在する異なるｍＲＮＡ分子の包括的マップを確立し、続いてこのようにして得られた好ましくはデジタル情報をデータベース分析で使用することが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、特異的に発現したmRNA分子の定性及び定量検出のための方法に関す
る。本発明の基礎となる技術は、本明細書中以下において略してDEPD(デジタル発現パターンディスプレー)と称する。

【０００２】最近の予測では高等動物のゲノムは約100,000の異なる遺伝子を含むと考えられ、その中でも比較的少数のみが生物の各々の細胞で発現し、ポリペプチドやタ
ンパク質へ転換されている。生材料の世界では、実質的に全ての工程及び代謝機
能は、何時どの組織でどの遺伝子が働き又は停止するかに依存していると考えら
れている。従って、細胞過程、例えば、ホメオスタシス、アレルギー反応、細胞
周期の制御、老化及びプログラムされた細胞死(アポトーシス)への細胞の移行は
特定の遺伝子の特異的な発現に基づくか、又はそれに関連していることが多くの
所見から示されている。正常な発達の進行、並びに例えば癌等の疾患を導く病理
学的発現は共に、本質的には遺伝子の発現の変化に基づいている。

【０００３】従って、適切な対照との比較により遺伝子の発現の相違を同定するためには異
なって又は特異的に発現したmRNA分子を検出するための特別の方法が必要である
。この種の方法は、診断学的にも、治療目的の評価においても大きな重要性を有
する。

【０００４】この新規方法は、特に、細胞又は組織内のできるだけ多くのmRNA分子を検出す
るために、そして、特に好ましくは定性及び定量的の両方の観点から、他の細胞
又は組織又は特別な条件(疾患又は発展の段階)又は治療段階とそれらを比較する
ために使用される。従って、この新規方法は、例えば、特定されたmRNA集団に存
在する様々なmRNA分子の包括図(comprehensive picture)の構築、及びデーターベース分析における好ましくはデジタルである得られた情報を引き続き使用する
ことを可能にする。近い将来、全ヒト遺伝子配列は適当なデータベースから入手
可能になると考えられる。従って、本方法は、ｍRNA集団のレベルでの特異的発現パターンにより反映される細胞過程の完全な検出及び特徴づけを可能にする。
そのため、例えば、特異的過程に含まれる個々の遺伝子の発現パターンにおける
変化を迅速かつ確実に識別することが可能である。活性薬学成分の本質作用の新
規標的を特定することをも可能である。得られた情報は、包括的な生化学的信号
及び合成経路を介した公知の標的遺伝子及び標的タンパク質の間の簡単な関連性
を作成するためにも使用することができる。

【０００５】上記目的は当業者にも知られている。上記した目的を達成するために、従来技
術において様々な方法が試みられている。

【０００６】例えば、P. LiangとA.B. Pardeeは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により個々の
mRNAを分離する方法を記載している(P. Liang & A.B.Pardee 1992 Science 257 、967-971)。この方法は、２種の関連した細胞型において発現するmRNA集団を比
較するために使用された。mRNA分子の複合混合物の、それぞれ50-100遺伝子の全
集団から成るフラクションへの分離は下記のようにして達成した。 1) 12の通称 T₁₁VN型 (T₁₁ = 11の連続したT、V=A、C、G；N=A、C、G、T)の3'
アンカープライマーを用いたmRNAの一本鎖cDNAへの逆転写； 2) 放射標識したデオキシリボヌクレオチドの存在下における、適当な3'アンカープライマー及び10ヌクレオチドを含む任意に選択した5'オリゴマーを用いた
各々のcDNAフラクションのPCR増幅。生成物は、シークエンシングゲル上で分画され、50-100バンドが100-500ヌクレオチドサイズ領域で観察された。バンドは、3'アンカープライマー及び任意に
選択した5'オリゴマーの相補鎖を含むmRNAの3'末端に対応するcDNAの増幅から得
られた。2つのcDNAsから増幅されたバンドのパターンは、それぞれのプライマー
対について類似しており、約80％のバンドの強度を分類することは不可能であっ
た。幾つかのバンドは、一方又は他方のPCR混合物においてより強く表れ、幾つかは、2つの混合物の内の片方においてのみ検出することができた。

【０００７】任意に選択された5'プライマー(任意プライマー)を用いて哺乳類で推定される
50,000-100,000の異なる全mRNAが検出可能であれば、これらのmRNAの約3分の2を
高確率で検出するためには、このような80-95種のオリゴヌクレオチド及び約100
0回のPCRが必要となる。近年様々な研究から、上記方法は偽陽性シグナルを高率
(90％にまで達する)で発生させることが明らかになった。

【０００８】 WO 95/13369は、特異的に発現したmRNAの同時同定及びそれらの相対濃度の測定のための方法(TOGA- 全遺伝子発現分析)を開示している。この方法は、オリゴ
(dT)プライマーの特異的セットを用いて、単離されたmRNAからの2本鎖ｃＤＮＡを構築することを基礎としている。この中で、下記構造を有する12のアンカープ
ライマーの混合物を使用している：5'末端から始まって、4-40塩基の「スタッフ
ァー(stuffer)」又は「ヒール(heel)」フラグメント、続いて、制限エンドヌクレアーゼ(典型的にはNotI)認識配列、7-40 dTヌクレオチド、そして最後にプライマーの3'末端に2つの「アンカー塩基」V、N。この場合、Vは、dA、 dC、又はd
G基のデオキシリボヌクレオチドであり、Nは、デオキシリボヌクレオチドdA、dC
、dG、及びdTを定義する。このように得られたcDNAは、続いて、切断部位の配列
として4塩基を認識する制限酵素(例えば、MspI)を用いて完全に消化され、NotI により切断され、適切に処理されたプラズミドベクターにクローニングされる。
この場合のインサートの配置は、ベクターにコードされたバクテリオファージ特
異的プロモーター(典型的にはT3)に対してアンチセンスである。連結物は大腸菌
株に形質転換され、cDNAバンクが生成される。これらのcDNAライブラリーのプラ
ズミドDNAは単離され、上記で使用した制限酵素とは異なる6つの制限酵素を組み
合わせて消化することにより線状化される。線状cDNAは、T3ポリメラーゼにより
cRNAへ翻訳され、その結果、1本鎖cDNAの16のサブフラクションへ転写される。これは、高温での熱耐性逆転写酵素の使用、並びに2つの3'ヌクレオチドが4つの
可能なデオキシリボヌクレオチド、dA、dC、dG、及びdTの完全な置換(permutati
on)からなる16の異なるcRNAプライマーの各々の1つの使用を必要とする。16 cDN
A分画の生成物は、インサートのクローニング部位に近いベクター配列に対応する3'オリゴヌクレオチド、及び4つの可能なデオキシリボヌクレオチドであるdA 、dC、 dG及びdTの完全な置換から成る2つの3'ヌクレオチドの付加を有する16 c
DNA合成プライマーの1つに対応する5'オリゴマーを使用するPCRの鋳型として使
用される。最大256の異なるプールはこのように生成され、それらの放射標識したバンド(³⁵S-dATP又は³²P-dCTP)はポリアクリルアミドゲル上で分析される。標
識されたバンドの8つの同定された塩基の長さ及び組成について得られた情報を基にしてクローニング及び配列決定工程なしに完全なデータベース中において関
連遺伝子の特徴を判断することが、理論的に可能であると言える。

【０００９】上記方法は、本発明において求められる高い特異性、選択性及び再現性に関し
て以下の問題を引き起こす： 1) NotI消化によるcDNA配列の潜在力喪失(potential loss)； 2) ベクターライゲーションによるcDNA配列の潜在力喪失； 3) 大腸菌への形質転換によるcDNA配列の潜在力喪失及び異なるcDNAインサート
の異なる増幅率； 4) プラズミド増幅及び大腸菌からの精製の後の細菌ゲノムDNAによるPCRの鋳型
の汚染； 5) インサートを含まないプラズミドDNAによるT3 RNAポリメラーゼ反応のためのテンプレートの汚染； 6) 6つの異なる制限エンドヌクレアーゼによる組み合わせた線状化消化におけc
DNAインサートの喪失； 7) cRNA合成増幅によるcDNA配列の喪失； 8) 第二cDNA合成増幅によるcDNA配列の喪失； 9) 塩基のミスペアリングの場合の逆転写酵素の選択性はTaqポリメラーゼの選択性よりも一般的に約10-1000倍(AMV RTの場合)少ないため(L.V.Mendelmanら、1
990、J. Biol. Chem. 265、2338-2346)、第二cDNA合成に使用される置換されたプライマーへの熱耐性逆転写酵素の不確実な特異性； 10) 塩基のミスペアリングが使用されるプライマーにより容認されてしまうことによる、記載された条件下でPCRに使用される置換5'オリゴマーに対するTaqポ
リメラーゼの不確実な選択性。従って、正確な分析情報は保証されない。

【００１０】 M.Matzらは、特異的に発現された遺伝子を同定するための別の方法を記載して
おり（ODD ？ordered differential display ？ 1997、Nucl. Acid. Res. 25、2
541-2542）、これはアダプター特異的オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅及びP
CR抑制効果に基づくものである。この場合、二本鎖cDNAは構造「ヒール-dT(13) 」を有するオリゴヌクレオチドを用いて生成される。ここで、「ヒール」は、12塩
基の配列である。cDNAは4塩基を含む認識配列を有する制限酵素(RasI)により完全に消化され、「偽二本鎖アダプター」にライゲーションされる。この分子は、適
切な条件下で一緒にハイブリダイズされるより長い(39塩基)及びより短い(長いものの3'末端に相補的な12塩基)オリゴマーからなる。オリゴヌクレオチドの5' 末端はこの場合リン酸化されていない。理論的には、cDNAの3'末端の特異的増幅
は、cDNA合成プライマー及びより長いアダプターオリゴマーの5'末端に対応する
プライマーを用いて、ＰＣＲ中で高いアニーリング温度(65°C)を使用した第一のPCRにおいてこのようにして可能である。異なる分画への複合cDNAの分画は、第二のPCRにおいて達成される。これには、4つの全デオキシリボヌクレオチド、
dA、 dC、 dG、及びdTの完全な置換から成る2つの3'ヌクレオチドが付加されたc
DNA合成プライマー、及び、４つの全デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG、及びdTの完全な置換から成る2つの3'ヌクレオチドが付加されたより長いアダプターオリゴマーの3'末端に対応するプライマーが使用される。アダプタープライマ
ーの特異性を増加させるために、人工的なミスペアリング(ミスマッチ)がプライ
マーの3'末端に対して−４の位置のオリゴヌクレオチドに導入されている。

【００１１】上記方法は、本発明において求められる高い特異性、選択性及び再現性に関連
して下記の問題を生ずる： 1) アンカー付けされていないcDNA合成プライマーの使用は、フラグメント長さ
の再現性を保証しない； 2) PCRにおいて高いアニーリング温度を有する構造「ヒール-dT(13)」のオリゴ
マーを用いたcDNAの3'末端の増幅は再現性がない； 3) 「偽二本鎖アダプター」の使用におけるcDNAの3'末端の選択的な増幅は保証
されない； 4) 1つの人工的なミスマッチ導入を介する置換された5'オリゴヌクレオチドのための第二のPCRにおける特異性の増加は不十分である； 5) 第二のPCRで使用される3'オリゴマーは人工的ミスマッチを含まず、従って、プライマー置換には選択性が不十分である； 6) PCRの特異的配置により、個々のDNAフラグメント(フラグメント長さ及び6つ
の公知ヌクレオチド)についてのゲル分析から得られる情報は、付加的なクローニング及び配列決定工程なしには十分ではない。

【００１２】 Y. PrasharとS. Weissman (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93、659-663)
は、二本鎖cDNAが以下の構造を有する12のオリゴヌクレオチドを用いて調製され
る方法を記載している：5'末端から始まって、「ヒール」構造に続いて、18 dT ヌクレオチド配列及びプライマーの3'末端に2つの「アンカー塩基」V、N。ここで、Vは、dA、 dC、又はdG基のデオキシリボヌクレオチドであり、Nは、デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG、及びdTを定義する。cDNA合成は温度50℃で行わ
れ、複合混合物を12の異なるプールへ分けることを可能にすることが意図される
。切断部位の配列として6ヌクレオチドを認識する様々な制限エンドヌクレアーゼによるcDNAの完全な消化後に、得られたDNAフラグメントに構造Yを有するアダ
プターを付与する。続くPCRにおいて、cDNAの「ヒール」構造へ結合する3'プライマーが使用される。使用される5'プライマーは、結合部位がYアダプターの外領域に位置し、この領域の相補鎖が第一合成において形成される場合にのみ生成
されるオリゴヌクレオチドである。Yアダプターを両側に有する全てのフラグメントは増幅することができない。

【００１３】筆者により主張される異なる画分へのcDNA生成物の分画は、3'末端において置
換されているcDNA合成プライマーを使用しているために再現することができない
。更に、特異的アダプター構造の使用に起因して、置換PCR5'プライマーは使用することができない。

【００１４】 WO 97/29211は、二本鎖cDNAが12オリゴヌクレオチドを用いて調製される「制限ディスプレイ(RD-PCR)」技術を説明している。これらのプライマーは、下記構
造を有している：5'末端から始まって、「ヒール」構造に続いて、4つの全デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG及びdTの完全な置換から成る2つのデオデオキシリボヌクレオチド、17 dTヌクレオチドの配列、及びプライマーの3'末端の2つ
の「アンカー塩基」V、N 。ここで、Vは、dA、 dC、又はdG基のデオキシリボヌクレオチドであり、Nは、デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG、及びdTを定義する。1以上の制限エンドヌクレアーゼによるcDNAの完全な消化後に、アダプター分子はcDNAフラグメントへライゲーションされる。続くPCRでは、cDNAの「ヒ
ール」構造へ選択的に結合し、2つの3'ヌクレオチドV、Nをプライマーの3'末端に付加的に有する3'プライマーが使用される。ここで、Vは、dA、 dC、又はdG基
のデオキシリボヌクレオチドであり、Nは、デオキシリボヌクレオチドdA、dC、d
G、及びdTを定義する。使用される5'プライマーは、アダプタープライマーの3' 配列に対応し、また4つの全デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG及びdTの完全な置換を有する１つの3'ヌクレオチド又は2つの3'ヌクレオチド又は3つの3'ヌク
レオチドを付加的に有する、オリゴヌクレオチドである。PCRはこの場合、様々な置換の組み合わせを用いて行い、第一PCR(又は最初の10-25のPCRサイクル)では、1つの置換のみを有する5'プライマーを使用し、続いて、第二のPCR(又は残りのPCRサイクル)では、2つ又は3つの置換のみを有する5'プライマーが使用され
る。これは、様々な5'プライマー置換に対する選択性を顕著に増加することを意
図している。

【００１５】上記方法は、本発明において求められる高い特異性、選択性及び再現性に関し
て、下記の問題を生じる： 1) 3'置換を有する様々なcDNA合成プライマーの使用は選択的ではなく、そのた
め方法の再現性を保証することができない； 2) 異なる数の3'置換を有する5'プライマーによる複数のPCRサイクルへの増幅
工程の分割は、用いられる技術、例えば、データベース本位の遺伝子発現分析に
おいて、それ自体十分には配列選択的でない。

【００１６】 Katoは、クラスIIS制限エンドヌクレアーゼによる二本鎖cDNAの消化に基づく方法("molecular indexing" ？1995、Nucl. Acids Res.、Vol. 23, 3685-90及び
1996、Nucl. Acids Res.、Vol. 24, 394-95)を記載している。これらは、未知の
配列のcDNAの5'突出を生成する。続いて、5'突出のヌクレオチド2-4(5'末端に対
して)が各場合に完全なcDNAプールの６４分の１と相補的である、６４種のビオチン化アダプターを、大腸菌からのDNAリガーゼによりライゲーションさせる。アダプター突出の特異的な5'ヌクレオチドは未特定のままである。この場合にラ
イゲーションされたcDNAフラグメントは、ストレプトアビジンに結合した磁気粒
子への結合により精製される。続くPCRでは、cDNAのアダプターライゲーションされた3'末端は、低いアニーリング温度で、アダプターオリゴヌクレオチド、及
び3つのヌクレオチドdA、dC、又はdGのうちの1つにより3'末端を伸長したオリゴ
-(dT)オリゴマーを用いて増幅される。cDNAは、このようにして192の異なる集合
へ分画される。この方法は更に、本発明において求められる高い特異性、選択性
及び再現性に関連して下記の問題も生じる： 1) 5'突出としての4つのヌクレオチドとのアダプターのライゲーションは、更なる後処理なしでは、cDNAインサートの最初の3又は４塩基を確実に決定することができるほど十分には置換特異的ではない； 2) 最大ライゲーション特異性に達するためには、ライゲーションにおいて極少
量のアダプター分子のみが使用されるが、これはライゲーション効率を明白に低
減させてしまう。その結果、方法全体の感度が低下する； 3) アンカー付けされたオリゴ-(dT)プライマーを用いたcDNAのプールへの分割は、PCRにおいて低いアニーリング温度を用いる場合に上手く実施できない。

【００１７】上記した従来技術の欠点の概要、特に、cDNAの3'末端のPCR増幅中の再現性および配列性がないこと又は低いことのために、公知方法と比較して、特異性、選
択性、感度及び信頼できる再現性に関して、更に、得られる結果の間違いの頻度
を低減することに関して顕著に優れている方法を開発及び確立することが必要で
ある。これらの規準は、例えば、デジタルディスプレイを用いた特異的遺伝子発
現のためにデータベースを使用した分析を行う場合に特に必要である。

【００１８】従って、本発明は、下記の工程、 (a)組織試料からのポリA⁺ RNAの単離及び精製； (b)mRNA分子からの二本鎖cDNAの合成； (c)制限エンドヌクレアーゼを用いた酵素的消化によるcDNAの切断； (d)切断されたcDNAへのアダプター分子のハイブリダイゼイション及びライゲーション；及び、第一の選択肢としては、 (e)デオキシリボヌクレオチド及びKlenow DNAポリメラーゼを用いたcDNA 5'突出
の埋め込み; (f)cDNAの3'末端の選択的な精製; (g)制限エンドヌクレアーゼを用いた酵素的消化によるcDNAからの3'-ポリ-dAヌクレオチドの除去; (h)切断されたcDNAへのアダプター分子のハイブリダイゼイション及びライゲーション; (i)PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によるcDNAフラグメントの増幅; (j)それぞれの長さに応じた増幅生成物の分画; (k)増幅生成物の分析; 又は、第二の選択肢としては、 (e)cDNA の3'末端の選択的精製; (f)制限エンドヌクレアーゼを用いた酵素的消化によるcDNAからの3'-ポリ-dAヌクレオチドの除去; (g)切断されたcDNAへのアダプター分子のハイブリダイゼイション及びライゲーション; (h)２又は３つの置換を3'末端に有し、かつ、アダプター分子により特定される相補鎖と比較して１又は２の人工的ミスマッチを含む5'プライマーを用いたPCR(
ポリメラーゼ連鎖反応)によるcDNAフラグメントの増幅; (i)それぞれの長さに応じた増幅生成物の分画; (j)増幅生成物の分析; 又は、第三の選択肢としては、 (e)２又は３つの置換を3'末端に有し、かつ、アダプター分子により特定される相補鎖と比較して１又は２の人工的なミスマッチを含む5'プライマーを用いたPC
R（ポリメラーゼ連鎖反応）によるcDNAフラグメントの増幅; (f)それぞれの長さに応じた増幅生成物の分画; (g)増幅生成物の分析; のいずれかの工程を含み、第一及び第二選択肢の工程(b)においては、第一鎖cDNA分子の合成は、第一塩基がdA、dC、又はdGであり、第二塩基がdA、dC、dG、又はdTである2塩基の3'伸
長を有し、かつ、5-15、好ましくは6-15塩基の5'伸長を有し、これが、認識配列
の16／14下流の切断特徴を有する制限エンドヌクレアーゼの切断部位をコードし
ている、アンカー付けされたオリゴ-dTヌクレオチドを用いた逆転写により行われ; 又は、第三の選択肢の工程(b)においては、第一鎖cDNA分子の合成は、第一塩基がdA 、 dC、又はdGであり、かつ、第二塩基が、dA、 dC、dG又はdTである、2塩基の3
'伸長を有し、かつ任意の配列の5-15塩基の5'伸長を有する、アンカー付けされたオリゴ-dTヌクレオチドを用いた逆転写により行われる、mRNA分子を同定及び特徴付けするための方法が提供される。

【００１９】認識配列の16／14下流の切断特徴を有する酵素は、当業者に知られている。Ec
o571及びBsg1は、[sic]の例である (例えば、A. Janulaitisら、Nucleic Acids
Res. 20 (1992)、pp. 6042-6049; Petrusyteら、Gene 74 (1988)、pp. 89-91参照)。

【００２０】この新規方法においては、オリゴ-dTヌクレオチドは、2'-O-メチル化リボヌク
レオチドにより完全に置換されていることが好ましい。あるいは、オリゴ-dTヌクレオチドは標準デオキシリボヌクレオチドからなることができる。

【００２１】更にこの新規方法においては、オリゴ-dTヌクレオチドは、遊離5'末端及び／又は内部dTヌクレオチド上に、C9スぺーサーを介してビオチン残基を付与するこ
とが好ましい。

【００２２】好ましい態様は、第二選択肢の工程(h)又は第三選択肢の工程(e)において、ア
ダプター分子により特定される相補鎖と比較して、ミスマッチが位置-3、又は-3
及び-4、又は-4及び-5に位置する本新規方法に関する。

【００２３】本新規方法の更に好ましい態様は、工程(c)において、認識配列として5ヌクレ
オチドを有し、切断されるcDNAフラグメントの認識配列の部分ではない2-4、特に4ヌクレオチドからなる突出を生成するクラスIIS制限酵素を使用することを特
徴とする。

【００２４】本新規方法の更に好ましい態様は、第一選択肢の工程(f)又は第二選択肢の工程(e)において、cDNAの3'末端の選択的な精製が、ビオチン結合分子ストレプトアビジンと結合した常磁気ビーズを用いて行われることを特徴とする。

【００２５】クラスIIS制限酵素は、本新規方法の第一選択肢の工程(g)又は第二選択肢の工
程(f)において好ましくは使用される。本新規方法の第一選択肢の工程(d)若しくは工程(h)、又は、第二選択肢の工程
(g)から得られる生成物を、工程(I)の増幅の前に、T4エンドヌクレアーゼVII、S
Iヌクレアーゼ、及び文豆（mung bean）ヌクレアーゼから成る群から選ばれるヌ
クレアーゼと共にインキュベートすることが更に好ましい。

【００２６】本新規方法は更に好ましくは、第一選択肢の工程(I)、又は、第二選択肢の工程(h)、又は、第三選択肢の工程(e)において、cDNAフラグメント増幅を、ライゲ
ーションされたアダプター分子のセンスオリゴマーの相補鎖へハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを用いて行うことを特徴とする。本新規方法は更に好ましくは、第一選択肢の工程(k)、又は、第二選択肢の工程(j)、又は、第三選択肢の工程(g)において、分析を、生成物の長さの違いに基
づき、そして操作を通して既知の9又は10ヌクレオチドの塩基配列の知識を用いて行うことを特徴とする。

【００２７】更に好ましい態様は、新規遺伝子の、所望によりコンピューターを使用した同
定及び単離、並びに分析のための前記請求項［sic］のいずれかの新規方法の使用に関連する。

【００２８】本新規DEPD法は、cDNAフラグメント中の幾つかのヌクレオチドの同定における
エラーの発生率を顕著に低減し、適切なデータベース内のコードされた遺伝子の
同定を可能にするために開発された。本新規方法の改善された効率は、置換特異
的ミスマッチPCRと適切に組み合わせた特異的ライゲーション技術の使用に由来する。これは、cDNAsの3'末端の選択的精製後に、フラグメントの5'末端及び3' 末端へのアダブター分子のライゲーションを引き起こす。続くPCRにおいて使用されるプライマーは各々、好ましくは、置換として2つの塩基を有する。PCRプラ
イマーの置換特異性は、高いアニーリング温度、そして好ましくは、選択的オリ
ゴヌクレオチド部位における人工的鋳型ミスマッチの同時導入により顕著に増加
する。

【００２９】 PCRによりヌクレオチド配列を決定するために用いられる複数の個々の工程の新規な組み合わせに起因して、技術の特異性に関する相乗作用効果が現れる。結
果は、個々の手順の制御機構の型であり、これは、例えば、ライゲーションでは
、発生するエラーはミスマッチプライマーを用いた選択的PCRにより訂正することができる。PCRの置換選択性は、特定された鋳型ミスマッチの好ましい導入により明らかに増加する。

【００３０】別の好ましい態様では、cDNAテンプレートの両部位における置換プライマーの
使用はエラー訂正効果を示す。これは、反対のプライマーが正しい置換のみを増
幅する場合には、第一のPCRサイクルの一つにおける1つのオリゴマーにより間違
って生成した増幅産物が、それらのさらなる複製を抑制してしまうからである。
別の好ましい態様では、DEPD法においてライゲーション及びPCR置換技術を適切に組み合わせて使用することにより、9又は10ヌクレオチド及び増幅したフラグメントの長さを特定することが可能である。cDNAフラグメントの塩基配列の決定
の際にエラーが生じるとしても、この情報は、好ましくはデータベース分析によ
り遺伝子の信用性の高い同定を行うのに十分なはずである。

【００３１】本新規DEPD法の使用により、mRNA発現パターンのレベルにおいて、特定された
系及び／又は特定された状況に含まれる全遺伝子の相互作用を包括的に分析する
ことが特に可能となり、少量の組織又は細胞が、特異的及び再現可能な結果に必
要とされる。本方法は、多数の応用において使用することが可能である。これら
としては、器官、組織、組織片又は疾患組織又は組織片とそれに対応する健康な
材料との比較が挙げられ、適当な場合には、活性成分を投与しない対応する対照
に対する、活性薬学成分を用いた比較研究の計画も範囲内である。本新規方法は
更に、動物モデル内の特定された条件を比較することも可能にし、ここで器官、
組織、組織片、又は疾患組織又は疾患組織片と対応する健康な材料との比較分析
が特に好ましい。更なる応用としては、通称ノックアウト動物も含むトランスジ
ェニック動物の分析、抗体、アンチセンス及びリボザイムオリゴヌクレオチドの
使用についての表現型評価、及び、特定遺伝子の関連を明らかにするための機能
的研究計画で使用される比較手段が挙げられる。

【００３２】特異的に発現される遺伝子の単離及びそれに続くクローニング及び配列決定が
不必要であるため、そのような技術の使用により、研究材料のスクリーニングの
速度を顕著に増加させることができる。従って、更に多数の試料又は1試料のさらに多くの異なる段階（例えば、数時間／数日間にわたる遺伝子発現の経時的変
化）を研究することが可能になる。これは、新規な薬剤標的の候補の発見との関
連で重要なだけでなく、特に、治療候補物質の作用機構を明らかにすることとの
関連においても重要である。この場合、特に大量の試料材料が詳細な研究から得
られることがあるためである。

【００３３】本発明の更なる側面は、データベース本位の遺伝子発現分析法の機構内で好ま
しく使用することである。近年構築された同様の高効率を有する方法、例えば、
チップハイブリダイゼイションの分析技術、及び、自動化データ分析を介したチ
ップ生成によるチップハイブリダイゼイション技術（例えばAffymetrix、USA）などの非常に複雑な技術と比較して、本新規方法は、冒頭に記載したタイプの公
知方法に比べ性能的に明らかに優れている驚くほど単純で安価な代替方法を提供
する。

【００３４】本新規方法及びその好ましい態様は、以下に詳細に記載する。確立した標準法
に関する詳細情報については、例えば、J. Sambrookら 1989: Molecular Clonin
g: A Laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring
Harbor、New Yorkを参照することができる。

【００３５】実施例1) mRNAの単離研究すべき組織、組織片、バイオプシー試料、細胞等からの完全RNAの単離及び精製は、記載された標準方法により行う。ゲノムDNAによる単離されたRNAへの
汚染の可能性を完全に除去するために、DNaseI（Boehringer Mannheim、Germany
）による酵素消化を行う。続いてオリゴ（dT）結合磁気粒子（オリゴ（dT）磁気
ビーズPromega、WI、USA）を用いて全RNAからのポリA⁺ mRNAの精製を行う。

【００３６】2) cDNAの合成二本鎖cDNAは、下記の構造を有する12のアンカープライマーの混合物を用いて
mRNAから合成される： 5'末端から開始して、5-15塩基、例えば、5又は6塩基の「ヒール」フラグメント(5'伸長)、続いて、制限酵素BsgI又はEco57Iの片方の認
識配列。これに14 dTヌクレオチド配列、プライマーの3'末端に2つのアンカーヌ
クレオチドV、Nが続く。ここで、Vは、dA、 dC、又はdG基のデオキシリボヌクレ
オチドであり、Nは、デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG、及びdTを定義する。dT配列及び適当な場合には「ヒール」フラグメントのデオキシリボヌクレオチ
ドは、この場合、2'-O-メチル化リボヌクレオチドにより完全に置換される。cDN
A合成プライマーには、5'末端及び/又は1以上の内部dTヌクレオチドにビオチン残基を付与する（C9スぺーサー）。

【００３７】あるいは、2'-O-メチル化リボヌクレオチドの代わりに12の未修飾の（即ちデオキシリボヌクレオチドからなる）アンカープライマーの混合物を用いて、cDNA
合成を行うこともできる。

【００３８】3)制限エンドヌクレアーゼによるcDNAの第一の消化切断部位の配列として5塩基を認識し(例えば: FokI、Bsm AI、Bsm FI又はBbv
I)、cDNAの突出として2つ又は4つの未知のヌクレオチドを生成するIIS型制限酵素によるcDNAの完全な消化。以下の実施例において記載されている酵素は、4塩基のヌクレオチド突出を生成する。より短い突出を使用する場合には、ライゲー
ションされるアダプターを適切に短くすることが必要である。

【００３９】4) 第一のアダプターライゲーション a) 酵素的消化は、cDNAにおいて4つの未知のヌクレオチドからなる5'突出を生
成する。2つのオリゴマーからなる16のアダプター分子（5'-リン酸化されていな
い「偽二本鎖」アダプター）を制限酵素消化後に、cDNAへライゲーションする。
アダプターは典型的には異なる長さの2つのオリゴヌクレオチドからなり、長いものは25-35からなり、短いもの（長いものの3'末端と相補である）は8-25塩基、特に8-12塩基からなる。アダプターは適切な条件下で2つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼイションにより生成され、4ヌクレオチド突出を形成する。ヌクレオチド3又は4（アンチセンスオリゴマーの5'末端に対して、「内部」ヌクレオチド）は、4つの可能なデオキシリボヌクレオチドdA、 dC、 dG、及びdT
の内の1つとなる可能性があり、「外部」ヌクレオチド1及び2は（アンチセンス
オリゴマーの5'末端に対して）は未特定のままであり、通常、4つの全デオキシリボヌクレオチドの完全な組み合わせの混合物からなる。これは16の置換アダプ
ターを生成し、その２つの「内部」ヌクレオチドはライゲーションの特異性を決
定する。正確なアダプターライゲーションを確実にするために、ライゲーション
混合物は、続いて、T4エンドヌクレアーゼVII、S1ヌクレアーゼ、及び文豆ヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼと共にインキュベートする。

【００４０】 16の置換アダプター分子のライゲーションは、4-37℃で1-16時間0-150 mM酢酸
Na、1-5単位のT4 DNAリガーゼ（又はTaq DNAリガーゼ又は大腸菌DNAリガーゼ）を含む適切な緩衝液中で行う。16ライゲーション混合物の各々は、精製後、PCR における鋳型として使用される((8a)参照)。

【００４１】 b) 4ヌクレオチド突出を形成する16の代りに64の異なる「偽二本鎖」アダプターを最終的にcDNAへライゲーションする。この場合、64のアダプター突出が塩基
2-4（アンチセンスオリゴマーの5'末端に対して）の全デオキシリボヌクレオチドの組み合わせからなり、「外部」ヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーの5'
末端に対して）は、4つの全ヌクレオチドの混合物として使用される。これは、3
つの「内部」ヌクレオチドがライゲーションの特異性を決定することを意味する
。この方法は、大腸菌からのDNAリガーゼはライゲーションにおいてアダプター突出の最初の３塩基を識別できるという理解に基づいている。これは既に上記し
た条件下で行うことができる。正確なアダプターライゲーションを確実にするた
めに、ライゲーション混合物は続いて、T4エンドヌクレアーゼVII、S1ヌクレアーゼ、及び文豆ヌクレアーゼからなる群から選ばれるヌクレアーゼと共にインキ
ュベートされる。

【００４２】 c) あるいは、16又は64の異なる「偽二本鎖」アダプターのライゲーションの代
りに、cDNAの5-突出がKlenow DNAポリメラーゼを用いてデオキシリボヌクレオチ
ドにより埋め込まれる。これは、ジデオキシリボヌクレオチド（ddNTP）及び競合的アダプター分子の使用により可能になる。さらに、cDNAの3'末端は、それぞ
れの工程の後に使用したヌクレオチドを除去できるようにするために磁気粒子か
ら抽出されない。例えば、5'-GGTT-3'の塩基突出が埋め込まれた場合、cDNAは、
dGで始まる全ての突出をブロックするためにddCヌクレオチドにより先ずインキュベートされる。ジデオキシリボヌクレオチド[sic]の除去後に、cDNAをdAヌクレオチドと共にインキュベートする。その後に、ここで使用されるまでに埋め込
み5'突出を有するcDNAs[sic]に対する平滑及び粘着末端を有するアダプター分子
がライゲーションされる。同じ工程では、2つの競合アダプター分子がライゲーションされる。これは同様に、粘着末端、及び1つのdC又は3つのdC分子からなる
5'突出を有する。これらは、それぞれcDNAの5'突出5'GTTT-3'及び5'GGGT3'をブロックする。これに続いて、ストレプトアビジン結合cDNAフラグメントの精製を
行い、これをdCヌクレオチドと共にインキュベートする。続いて、完全かつ正確
に埋め込まれたcDANにのみライゲーションできる平滑末端を有するアダプター分
子のライゲーションを行う。このようにして、256の可能なcDNA 5'突出は各々、
DNAポリメラーゼを用いて完全に埋め込まれ、PCRに使用される。

【００４３】5) cDNAの3'末端の選択的精製 cDNAの3'末端の選択的増幅を確実にするため、これらのフラグメントを複合体
cDNAの完全なプールから特異的に精製する。cDNAの3'末端は、好ましくは、スト
レプトアビジンと結合している磁気粒子（磁気ビーズ）により、cDNA混合物から
選択的に精製することができる(Biomagnetic Techniques in Molecular Biology
、Dynal、N-0212 Oslo、Norwayも参照)。この種の精製は、その後のPCRにおいて
、内部（即ち、3'末端ではない）cDNAフラグメントの非特異的増幅が生じないこ
とを保証する。磁気粒子からのcDNAの抽出は、高温（65℃）での有機溶媒による
抽出、又は制限エンドヌクレアーゼBsgI又はEco57I (下記参照)の片方を用いた酵素的消化のいずれかを用いて行う。

【００４４】6) 選択肢(4b)のための制限エンドヌクレアーゼを用いたcDNAの第二の消化制限酵素BsgI又はEco57Iの片方によるライゲーションされたcDNAの完全な消化
。この場合、cDNAの3'末端のオリゴdTヌクレオチドは完全に除去され、mRNAのポ
リ-dA伸長に対して5'に位置するcDNAの最後の2つの3'塩基（V、N）から成る２ヌ
クレオチド突出が生成される。

【００４５】7) 選択肢(4b)のための第二のアダプターライゲーション (4b) それぞれの場合、2つのオリゴマーからなる4つのアダプター分子は、制限酵素
消化を行った後、（4b）からの1つのライゲーション混合物にライゲーションされる。アダプターは典型的には、異なる長さを有する2つのオリゴヌクレオチドからなり、長いものは25-35からなり、短いもの（5'-リン酸化された、長いもの
の3'末端に相補的である）は22-30塩基からなる。アダプターは適切な条件下で2
つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼイションにより生成し、2-ヌクレオチ
ド突出を形成する。「外部」3'ヌクレオチドは、4つのデオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG又はdTの1つとなることができ、「内部」ヌクレオチドは3つの塩基
dA、dC又はdGの混合物から特定することができる。従って、アダプター突出の「
外部」3'ヌクレオチドがライゲーションの特異性を決定する。ライゲーション条
件は、上記のとおりである。256ライゲーション混合物の各々は、精製後、PCRの
テンプレートとして使用する（(8b)参照）。

【００４６】8a) 選択肢(4a)のためのPCR 全部で256-1024 PCRにおいて、使用される3'プライマーは、2'-O-メチル化リボヌクレオチドにより完全に置換されたcDNA合成プライマー(12アンカープライマーの混合物)である。この場合、オリゴヌクレオチドの修飾塩基の解離温度の上昇に起因して、置換されていないプライマーを用いた場合に比べ、PCRにおいて明らかに高いアニーリング温度(40%まで、例えば、L.L. Cummins 1995、Nucl.
Acids Res.、23, 2019-2024参照)を使用することが可能になる。

【００４７】 (4a)で生成したライゲーション混合物の一部をPCRで使用する。5'プライマーは第一PCRサイクルでは、4つ全デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG及びdTの完
全な置換から成る２又は３つの3'ヌクレオチドの付加を有するセンスアダプター
オリゴヌクレオチドの3'末端に対応する長さ18-27塩基の16-64オリゴマーの何れ
かである。この場合に使用するプライマー置換は、アダプター突出の(4a)でのラ
イゲーション混合物において特定された塩基3-4又は2-4に対応している。第二に
、次のPCRサイクルでは、同じ3'プライマー、そしてそれぞれの場合において、第一のPCRの5'プライマーと対応するが、4つ全デオキシリボヌクレオチドdA、dC
、dG及びdTの完全な置換から成る2又は3つの5'ヌクレオチドにより伸長されてい
る、長さ18-27塩基の16の5'オリゴヌクレオチドを用いて、更に16又は64のPCRが
最初のPCR毎に行う。

【００４８】 PCRにおける様々な置換の増幅の特異性を確実にするために、選択的PCRプライ
マーを使用し、鋳型DNAと関連して人工的に導入したミスマッチを複数含むことができる。これらのミスマッチは、オリゴマーのどの部分に位置してもよく、好
ましくは、プライマーの3'末端(位置0)に対して位置-2及び-3に2つのミスマッチ
を配置したり、位置-1に1つのミスマッチを配置することが好ましい。

【００４９】 PCRプロファイルは典型的には：95℃で３分間、続いて95℃で45秒、65℃で45 秒、72℃で60秒を20-40サイクル、そして最終伸長が72℃で60秒であり、放射標識又は蛍光標識されたPCRプライマーを使用して行う。

【００５０】8b) 選択肢(4a)のためのPCRの更なる可能性代替として、標準デオキシリボヌクレオチドからなる未修飾のcDNA合成プライ
マー(12アンカープライマーの混合物)を用いる以外は、PCRを8a)で説明したよう
に行う。

【００５１】8c) 選択肢(4b)のためのPCR 全部で256 回のPCRにおいて、4つ全デオキシリボヌクレオチドdA、dC、dG及び
dTの完全な置換から成る3つの3'ヌクレオチドを付加した、第一のライゲーションされたアダプター分子((4b)を参照)のセンスオリゴヌクレオチドの3'末端に対
応する18-27塩基の長さを有する64種の5'プライマーを使用する。この場合に用いられるプライマー置換は、アダプター突出の、(4b)でのライゲーション混合物
において特定された塩基2-4に対応している。使用される3'プライマーは、第二のライゲーションされたアダプター分子((7)参照)のセンスオリゴヌクレオチドの3'末端に対応する長さ18-27塩基を有する4つのオリゴヌクレオチドである。

【００５２】 PCRプロファイルは典型的には：95℃で3分間、続いて95℃で45秒で、65℃で45
秒、72℃で60秒を20-40サイクル、及び、最終伸長が72℃で60秒で行い、放射標識又は蛍光標識したPCRプライマーを使用して行う。

【００５３】8d) 選択肢(4c)のためのPCR 全部で256回の PCR(1回のPCRは各々の「埋め込み反応」のためである)において、ライゲーションされたアダプター分子のセンスオリゴヌクレオチドの3'末端
に対応する、18-27塩基の長さを有する5'プライマーを使用する。cDNA合成オリゴヌクレオチドを3'プライマーとして使用する。PCRプロファイルは典型的には：95℃で3分間、続いて95℃で45秒で、65℃で45秒、72℃で60秒を20-40サイクル
、そして最終伸長が72℃で60秒で行い、放射標識されたヌクレオチドの存在下で
行う。

【００５４】9) PCR分析 PCRフラグメント分析は、典型的には7-8Mの尿素を含む6％ポリアクリルアミド
ゲル(PAAゲル)上で行うか、又は、キャピラリー電気泳動により行う。

【００５５】結果から、cDNAの正確な5'ヌクレオチドの増幅の選択性は、TOGA法の5'プライ
マー、特に、結果についてコンピューター支援データベース分析を行う場合には
適当ではないことが分かる。5'プライマーの新規使用におけるエラーの発生率は
、≦5%である。エラーの発生率は、上記ライゲーション法により、更に約0％まで低減することができる。この非常に低いエラー発生率の観点から、自動化デー
タ分析の構築も可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ツイリングステファンドイツ連邦国、シュレブッシュ 51375 ミュンスターガッシェン 20 Ｆターム(参考） 4B063 QA05 QA18 QA19 QQ02 QQ08 QQ53 QR08 QR14 QR20 QR31 QR42 QR62 QS02 QS10 QS16 QS20 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の工程、 (a)組織試料からのポリA⁺ RNAの単離及び精製； (b)mRNA分子からの二本鎖cDNAの合成； (c)制限エンドヌクレアーゼを用いた酵素的消化によるcDNAの切断； (d)切断されたcDNAへのアダプター分子のハイブリダイゼイション及びライゲーション；及び、第一の選択肢としては、 (e)デオキシリボヌクレオチド及びKlenow DNAポリメラーゼを用いたcDNA 5'突出
の埋め込み; (f)cDNAの3'末端の選択的な精製; (g)制限エンドヌクレアーゼを用いた酵素的消化によるcDNAからの3'-ポリ-dAヌクレオチドの除去; (h)切断されたcDNAへのアダプター分子のハイブリダイゼイション及びライゲーション; (i)PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によるcDNAフラグメントの増幅; (j)それぞれの長さに応じた増幅生成物の分画; (k)増幅生成物の分析; 又は、第二の選択肢としては、 (e)cDNA の3'末端の選択的精製; (f)制限エンドヌクレアーゼを用いた酵素的消化によるcDNAからの3'-ポリ-dAヌクレオチドの除去; (g)切断されたcDNAへのアダプター分子のハイブリダイゼイション及びライゲーション; (h)２又は３つの置換を3'末端に有し、かつ、アダプター分子により特定される相補鎖と比較して１又は２の人工的ミスマッチを含む5'プライマーを用いたPCR(
ポリメラーゼ連鎖反応)によるcDNAフラグメントの増幅; (i)それぞれの長さに応じた増幅生成物の分画; (j)増幅生成物の分析; 又は、第三の選択肢としては、 (e)２又は３つの置換を3'末端に有し、かつ、アダプター分子により特定される相補鎖と比較して１又は２の人工的なミスマッチを含む5'プライマーを用いたPC
R（ポリメラーゼ連鎖反応）によるcDNAフラグメントの増幅; (f)それぞれの長さに応じた増幅生成物の分画; (g)増幅生成物の分析; のいずれかの工程を含み、第一及び第二選択肢の工程(b)においては、第一鎖cDNA分子の合成は、第一塩基がdA、dC、又はdGであり、第二塩基がdA、dC、dG、又はdTである2塩基の3'伸長を有し、かつ、5-15塩基の5'伸長を有し、これが、認識配列の16／14下流の切
断特徴を有する制限エンドヌクレアーゼの切断部位をコードしている、アンカー
付けされたオリゴ-dTヌクレオチドを用いた逆転写により行われ; 又は、第三の選択肢の工程(b)においては、第一鎖cDNA分子の合成は、第一塩基がdA 、 dC、又はdGであり、かつ、第二塩基が、dA、 dC、dG又はdTである、2塩基の3
'伸長を有し、かつ任意の配列の5-15塩基の5'伸長を有する、アンカー付けされたオリゴ-dTヌクレオチドを用いた逆転写により行われる、mRNA分子を同定及び特徴付けするための方法。
【請求項２】オリゴ-dTヌクレオチドが、2'-O-メチル化リボヌクレオチド
により完全に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】オリゴ-dTヌクレオチドが、C9スぺーサーを介してビオチン残基をその遊離5'末端及び/又は内部dTヌクレオチドに有していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】第二選択肢の工程(h)又は第三選択肢の工程(e)において、ミ
スマッチが、アダプター分子により特定される相補鎖と比較して、位置-3、又は
-3と-4、又は、-4と-5に位置する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】工程（ｃ）において、認識配列として5ヌクレオチドを有し、切断されるcDNAフラグメントの、認識配列の一部ではない、2-4ヌクレオチドからなる突出を生成する、クラスIIS制限酵素を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】第一選択肢の工程(f)、又は、第二選択肢の工程(e)において
、cDNAの3'末端の選択的精製をビオチン結合分子ストレプトアビジンと結合した
常磁気ビーズを用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】第一選択肢の工程(g)又は第二選択肢の工程(f)において、ク
ラスIIS制限酵素を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】第一選択肢の工程(d)若しくは工程(h)、又は第二選択肢の工
程(g)から得られる生成物が、工程(i)の増幅の前に、T4エンドヌクレアーゼVII 、S1ヌクレアーゼ、及び文豆ヌクレアーゼからなる群から選ばれるヌクレアーゼ
と共にインキュベートされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】第一選択肢の工程(i)又は第二選択肢の工程(h)又は第三選択
肢の工程(e)において、cDNAフラグメントの増幅を、ライゲーションされたアダプター分子のセンスオリゴマーの相補鎖へハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドを用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】第一選択肢の工程(k)又は第二選択肢の工程(j)又は第三選
択肢の工程(g)において、生成物の長さの違いに基づき、そして操作を通して既知の9又は10ヌクレオチドの塩基配列の知識を用いて分析を行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】新規遺伝子の、所望によりコンピューターを使用した同定
及び単離、並びに分析のための前記請求項のいずれかに記載の方法の使用。