JPWO2004092365A1 - 肝障害関連遺伝子群の抽出選択法およびそれを用いた肝障害もしくは肝機能評価・診断方法 - Google Patents

Abstract

この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、検体における肝障害に関連する肝障害関連遺伝子の発現パターンをマイクロアレイなどの遺伝子発現解析システムなどによって得、抽出し、所定の発現パターンを有する複数の該肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝子群を選択することから構成されている。この抽出選択法においては、肝障害の度合いを組織検査によって染色される面積比による肝線維化率などによって評価している。

Description

この発明は、肝障害関連遺伝子群の抽出選択法およびそれを用いた肝障害ならびに肝機能の評価・診断方法に関するものである。更に詳細には、この発明は、肝炎、肝硬変などの肝障害に関連する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法、それを用いた肝障害ならびに肝機能の評価・診断方法ならびに肝障害の治療方法およびかかる肝障害関連遺伝子群を効率的に集中させて配置している遺伝子発現解析システムに関するものである。

わが国の肝がん症例の約８割に慢性肝障害が併存しており、肝がん治療にはその併存肝疾患の重症度を正確に把握する必要がある。しかしながら、従来より汎用されている肝機能評価法であるＣｈｉｌｄ分類やＩＣＧ値などにはその精度に一定の限界がある。また、肝炎活動性や肝線維化を評価するためのより正確でかつ包括的な評価法もないのが現状である。
一方、近年目覚しい進展を遂げているゲノム構造解析の結果、数多くの遺伝子の構造が解明されてきている。同時に、かかる遺伝子の機能も少しずつではあるが明らかにされてきて、種々の疾患の病因や病変も遺伝子レベルで徐々に解明されてきている。
これまでは、疾患関連遺伝子の発現は、ノーザンブロッテイング法やサザンブロッテイング法などの従来法によって検出されてきた。このような手法は、少数の遺伝子を扱う場合には有効であり、有用であるけれども、多数の遺伝子を一度に取り扱う場合には時間も手間も費用もかかり、非常に非効率的である。更に、疾患に関連する遺伝子を個々に検出し、それらの遺伝子を解明したとしても、それらの遺伝子発現とその疾患全体との関係は必ずしも明確にならない。
一方、多数の疾患関連遺伝子の発現を一度に検出することができれば極めて便利であり有用である。このような目的を達成するために、ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイ法が急激に発展してきている。このようなＤＮＡマイクロアレイ法を使用すれば、同一検体から多数の遺伝子の発現を一括して検出することができ、そのなかから目的とする疾患に関連する疾患関連遺伝子の発現をプロファイリングすることができるようになってきた。このように、ある特定の疾患に関連する関連遺伝子全体の発現をプロフアイルすることは極めて有効であると考える。
ところで、Ｃ型慢性肝炎患者のインターフェロン治療適応決定のために、肝炎活動性や肝線維化の程度が従来より評価されているが、その目的のために肝生検が行われている。しかしながら、病理組織を用いた形態診断のためには、１４−１８Ｇという大きい針での肝生検が必要である。この検査は、生検後の出血や疼痛を管理するために入院が必要であり、また、病理診断は病理医の主観が入るため客観的な評価法とはなり難いという欠点がある。
更に、肝線維化を調べるための線維化マーカーとして血中ヒアルロン酸、ＩＶ型コラーゲンなどが臨床応用されているが、これらは軽度の肝線維化では変化せず、特異性も低い。したがって、いくつかのマーカーを組み合わせた評価法も検討されているが、それぞれのマーカーを選択する根拠に乏しく広く臨床応用されるには至ってはいないのが現状である。
これまで、肝障害をターゲットとした遺伝子発現プロファイリングについての報告は皆無といえる。したがって、各患者の病因遺伝子もしくは遺伝子群をその発現プロファイルして、簡便にかつ効率よく検出できる方法が要請されている。

上記のような先行技術を前提として、本発明者らは、肝障害をターゲットとした遺伝子発現プロファイリング（抽出）について鋭意研究をした結果、ＤＮＡマイクロアレイ法を用いることによって、従来の肝機能評価法に比べてより正確でかつ包括的な肝炎活動度や肝線維化を評価することができる新規な肝予備能評価法を見出すと共に、肝がん症例にかなり多くに認められる併存慢性肝障害の重症度をも正確に把握することができることを見出して、この発明を完成した。
したがって、この発明は、検体から肝障害に関連する機能を有する肝障害関連遺伝子の発現を抽出し、複数のかかる肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝子群を選択することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法を提供することを目的としている。
この発明は、各障害関連遺伝子を搭載したマイクロアレイなどの遺伝子発現解析手段を用いて上記肝障害関連遺伝子群を選択することからなる抽出選択方法を提供することを目的としている。
また、この発明は、所定の発現パターンを有する肝障害関連遺伝子から、肝障害関連要因に基づいて統計学的手法により上記肝障害関連遺伝子群を選択することからなる抽出選択方法を提供することを目的としている。
更に、この発明は、その好ましい態様において、肝障害関連遺伝子数が３個ないし約２００個からなる肝障害関連遺伝子群を選択する肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法を提供することを目的としている。
上記に加えて、この発明は、肝障害もしくは肝機能に関連する遺伝子の発現パターンを上記抽出選択方法によって、肝障害もしくは肝機能を診断・評価する診断・評価方法および肝障害を診断する方法を提供することを別の目的としている。
その上、この発明は、上記抽出選択方法によって選択した肝障害関連遺伝子群を構成する所定の発現パターンを有する肝障害遺伝子を効果的に集中して配置した遺伝子発現解析システムを提供することを別の目的としている。
上記目的を達成するために、この発明は、検体から肝障害に関連する機能を有する肝障害関連遺伝子の発現を抽出し、抽出した複数の該肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝子群を選択することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
この発明は、その好ましい態様として、マイクロアレイなどの遺伝子発現解析手段を利用して、肝障害関連遺伝子の発現パターンを抽出することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
また、この発明は、その好ましい態様として、上記肝障害関連遺伝子群を、肝炎、肝硬変、肝がんなどの肝障害、肝炎活動性、肝線維化の程度などの肝障害関連要因に基づいて、スーパーバイズド・リーニング法（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｌｅａｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、サポート・ベクター・レグレッション法（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、変数増加法ならびにこれらを組み合わせた解析法などの統計学的手法により肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
この発明はまた、その別の好ましい態様として、肝障害の度合いや重症度などを、例えば、ラット肝硬変モデルによる組織検査によって染色される面積比による肝線維化率によって評価することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
この発明は、その更に別の好ましい態様として、肝障害関連遺伝子を下記式（１）に基づいて同定することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。この発明のより好ましい態様として、実測肝線維化率と遺伝子の発現量のピアソンの相関係数Ｒｊの絶対値が高い遺伝子を肝線維化と関連が強い肝障害関連遺伝子とすることからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
また、この発明は、その好ましい態様として、肝線維化率を、実測線維化率と、下記式（２）で計算される予測線維化率との相関関係に基づいて決定することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。この発明の更により好ましい態様として、実測線維化率ＦｉとＤｘｉの回帰直線から、実測線維化率不明のサンプルの肝線維化率を予測することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
更に、この発明は、その別の好ましい態様として、予測に使用する遺伝子数をクロス・バリデーション法で決定することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。そのより好ましい態様として、算出予測肝線維化率Φｘｉと実測肝線維化率Ｆｉから、１サンプル当たりの誤差εｘを下記式（３）に従って算出し、誤差εｘが最小になるときの遺伝子数を実際の予測に用いることからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
その上、この発明は、そのより好ましい態様として、遺伝子数が３個ないし約２００個、好ましくは約１７０個以下、より好ましくは約１２０個以下、つまり、好ましくは３個ないし約１００個、特に３個ないし約５０個の範囲であることからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
この発明はまた、肝炎、肝硬変などの肝障害ならびにその重症度や度合いなどを肝線維化率によって評価することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
更に、この発明は、上記抽出・選択方法により選択される肝障害関連遺伝子群に基づいてまたは上記肝障害関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝機能の診断・評価する方法と共に、肝障害の診断・評価または治療することからなる方法を提供する。
上記方法に加えて、この発明は、上記抽出・選択方法により選択される肝障害関連遺伝子群の発現パターンを集中的に発生するように所定の発現パターンを有する遺伝子を配置しているマイクロアレイなどの遺伝子発現解析デバイスなどの遺伝子発現解析システムを提供する。
更にまた、この発明は、その別の実施態様として、この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法によって肝障害の評価を行うために、２１Ｇより細い針で組織を採取することからなる組織の採取方法を提供する。

図１は、肝線維化率のスコア化のための遺伝子数決定を示す説明図である。
図２は、肝障害（肝線維化）関連９５遺伝子を用いたラット肝線維化率予測の妥当性を示す図である。
図３は、肝障害（肝線維化）関連８３遺伝子を用いたラット肝線維化率予測の妥当性を示す図である。
図４は、肝障害（肝線維化）関連３７遺伝子を用いたラット肝線維化率予測の妥当性を示す図である。
図５は、各症例と肝線維化率との相関関係を示すグラフである。
図６は、各症例とＧＰＴ値との相関関係を示すグラフである。
図７は、各症例と新犬山分類に基づくＧｒａｄｉｎｇとの相関関係を示すグラフである。

この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、肝組織などの検体から肝障害に関連する機能を有する肝障害関連遺伝子の発現パターンを抽出して肝障害関連遺伝子群を選択することから構成されている。
つまり、この発明の抽出選択方法は、肝障害関連遺伝子の中から、肝障害関連要因に基づいて統計学手法を使用して、所定の発現パターンを有する肝障害関連遺伝子を抽出選択することによって実施することができる。
ここで、この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法について基礎的検討と臨床的検討の観点から説明する。
まず、この発明の抽出選択方法によって抽出選択した肝障害関連遺伝子群に対する基礎的検討について説明する。
この発明については、ラット肝硬変モデルを例として使用して基礎的検討を行なうことができる。そのために使用するラット肝硬変モデルは当該技術分野で慣用されている方法に従って作製することができる。
なお、この発明に係る抽出選択方法は、ラット肝硬変モデル以外のその他の動物の実験モデルを使用しても同様に基礎的検討を行なうことができる。また、その他の動物の実験モデルもラット肝硬変モデル同様に当該技術分野で慣用されている方法に従って作製することができる。
このようにして作製したラット肝硬変モデルの肝臓標本は、肝線維化された組織を染色する染色法、例えばアザン（ＡＺＡＮ）染色によって染色し、その標本組織の面積全体に対する染色組織の面積の比率を算出する。以下、この面積比を肝線維化率とする。
この発明において、検体から肝障害に関連する肝障害関連遺伝子の発現（つまり、遺伝子プロファイル）は、肝障害関連遺伝子を含む数千ないし数万個の遺伝子を固定したマイクロアレイなどの遺伝子発現解析デバイスなどを用いて検出することができる。かかるマイクロアレイとしては、例えば、市販されているＤＮＡチップやオリゴアレイチップなどを使用することができる。また、遺伝子の発現方法にしても、当該技術分野で慣用されている方法によって行うことができる。
このようにして発現した遺伝子について、肝障害関連要因に基づいて統計学手法を使用して、所定の発現パターンを有する複数の肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝子群が抽出選択される。
ここで、ここで使用することができる肝障害関連要因としては、例えば、肝障害、肝炎活動性、肝線維化率などで示す肝線維化の程度を使用することができる。また、肝障害としては、例えば、肝炎、肝硬変、肝がんなどの肝疾患をその指標として使用することができる。
統計学手法としては、例えば、スーパーバイズド・リーニング法（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｌｅａｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、サポート・ベクター・レグレッション法（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、変数増加法ならびにこれらを組み合わせた解析法などが使用することができる。また、スーパーバイズド・リーニング法としては、例えば、リーブワンアウト（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）法などが挙げられる。
そこで、以下、肝障害要因の１つである肝線維化率を指標として使用した場合を例に取り、この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法について説明する。
つまり、上記したように、慣用方法で作製したラット肝硬変モデルについての肝線維化率をアザン染色による面積比によって算出し、ｃＤＮＡマイクロアレイ法を用いて遺伝子発現を解析する。この解析により、肝線維化率と相関関係が強い複数個の上位遺伝子の発現パターンを選択し、その発現パターンから算定される肝線維化予測値が肝線維化率実測値と相関しているかどうかを検討する。この検討結果に基づいて得られた遺伝子プロファイルから肝障害関連遺伝子群を抽出し、遺伝子発現によって肝線維化率の予測式を決定する。これによって、遺伝子発現パターンに基づいた肝線維化のスコア化を実現することができる。なお、この肝障害関連遺伝子群の抽出は、例えば、ファント・フェー（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ）らの方法に準じて行うことができる（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ ２００２；４１５：５３０−５３６）。
この発明において、遺伝子プロファイルから肝障害関連遺伝子群の抽出を行うためには、肝障害関連遺伝子を下記式（１）に従って同定することができる。

（式中、Ｒｊは、試験サンプル数ｍを用いて計算した実測線維化率Ｆｉ（ｉ＝１，２，３，…，ｍ）と遺伝子ｊ（ｊ＝１，２，３，…，ｎ）の発現量Ｅｉｊのピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相関係数を表わす）。
この発明では、上記式（１）において、上記ピアソン相関係数Ｒｊの絶対値が高い遺伝子を肝線維化と関連が強い肝障害関連遺伝子であると同定することができる。
次ぎに、下記式（２）に従って予測肝線維化率を算出する。

（式中、Ｄｘｉは、肝線維化関連遺伝子ｘ個について計算した正常サンプルでの発現の平均値Ｅｊ（ｊ＝１，２，３_…ｘ）と各ラットの遺伝子発現量Ｅｉｊのピアソンの相関係数を表す）。
上記式（２）において、上記ピアソンの相関係数Ｄｘｉが１に近いサンプルｉを肝線維化率が０％に近いものと予測して、実測線維化率ＦｉとＤｘｉの回帰直線から、実測線維化率が不明のサンプルの肝線維化率を予測することができる。
続いて、予測に用いる遺伝子数ｘの決定を行う。この決定は下記式（３）に準じたクロスバリデーション（Ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）法で行いことができる。（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．：ｉｂｉｄ）。

上記式（３）において、試験サンプル中の１サンプルを除外し、残り（ｍ−１）のサンプルから、除外した１サンプルの線維化率を予測し（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ ｏｕｔ法）、このことをすべての試験サンプルで繰り返し、実測線維化率Ｆｉと予測線維化率Φｘｉから、１サンプル当たりの誤差εｘを算出する。
更に、誤差εｘが最小になるときの遺伝子数を算出する。この算出は、肝線維化と関連の強い５遺伝子から開始し、１遺伝子ずつ増やして２００遺伝子まで誤差εｘを計算し、誤差εｘが最小となるときの遺伝子数を実際の予測に用いることにする。
上記手法に従って算出された誤差εｘが最小になるときの遺伝子数は、下表に列挙されている肝障害関連遺伝子から選択される約３個ないし約２００個であるのがよい。また、好ましい遺伝子数は、約１７０個以下であり、更に好ましい遺伝子数は、約１２０個以下、つまり、更に好ましくは３個〜約１００個、特に３個〜約５０個の範囲であるのがよい。
なお、遺伝子は、下表のラットまたはマウス遺伝子リストから任意に選択することができる。

上記基礎的検討の結果から、この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、肝線維化率と相関が強い上位遺伝子の発現パターンにより算出される肝線維化率予測値（定量化スコア）が、肝線維化率実測値と極めて高い相関を示すところから、この方法によるスコア化は妥当と判断することができる。したがって、このことから、この発明の肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、年齢・性・肝障害の要因などを統一した肝硬変モデルにおいては、肝障害関連遺伝子の発現パターンのみを検索することにより肝線維化の程度を評価することができる。
次に、この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法についての臨床的検討について、かかる基礎的検討結果を踏まえて説明する。
この臨床的検討は、例えば、肝がん患者の非癌部切除標本を用いてＤＮＡマイクロアレイ解析をすることによって行なうことができる。つまり、所定の施設の倫理委員会の承認ならびに患者インフォームドコンセント取得のもと非癌部切除標本を採取し、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行ない、アザン染色による面積比に基づいて肝線維化率を算出する。ここで測定する線維化率は、広範かつ十分量の切除肝組織によってのみ決定される指標であり、肝生検組織などの他の評価法では決定できない肝線維化の程度を評価する教師値としての指標である。ＤＮＡマイクロアレイ解析結果と実測肝線維化率との関連より、例えば、サポート・ベクター・レグレッション法と変数増加法とを組み合わせた解析法を用いて、表２に示すような肝障害関連遺伝子から肝障害関連遺伝子群を決定することができる。かかる肝障害遺伝子群を構成する遺伝子を用いて算出できる肝線維化率の定量化スコアは、実測線維化率と良く相関している。また、その相関は、スーパーバイズド・リーニング法であるリーブワンアウト法を用いても良好である。更に、同様の症例において、この実測線維化率は、既存の肝機能検査（肝線維化マーカーを含む）、つまり、ＩＶ型コラーゲン、ＩＣＧＲ、ＰＴ、アルブミン値、血小板数、ヒアルロン酸、ヘパプラスチンテストとも相関を示している。したがって、教師値としての実測線維化率を最も反映する既存の指標は、遺伝子発現パターンに基づく定量化スコアを用いることで、その精度を格段に向上させることができる。
一方、肝炎活動性の指標の１つであるＧＰＴ値を用いて、肝炎活動性関連遺伝子群を選択することができる。つまり、ＧＰＴ値と非癌部切除標本のＤＮＡマクコロアレイ解析結果から、例えば、サポート・ベクター・レグレッション法と変数増加法とを組み合わせた解析法を用いて、表２に示すような遺伝子から遺伝子群を決定することができる。このようにして選択した肝障害関連遺伝子群を用いて決定した肝炎活動性の定量化スコアは、ＧＰＴ値と良く相関し、またリーブワンアウト法を用いてもその相関は比較的良好である。
更に、もう一つの肝炎活動性の指標である新犬山分類に基づいて決定したＧｒａｄｉｎｇ（Ａ０〜Ａ３、２人の肝臓病理医のＧｒａｄｉｎｇスコアの平均値を用いた）と肝がんの切除非がん組織のＤＮＡマイクロアレイ解析結果より、例えば、サポート・ベクター・レグレッション法と変数増加法とを組み合わせた解析法を用いて、表２に示すような肝障害関連遺伝子から肝障害関連遺伝子群を決定することができる。これらの遺伝子を用いて決定した肝炎活動性の定量化スコアは、同様な症例において、組織学的なＧｒａｄｉｎｇと良く相関し、またその相関はスーパーバイズド・リーニング法であるリーブワンアウト法を用いても良好である。

なお、上記遺伝子リストは、この発明にて抽出選択される肝障害関連遺伝子を制限するものではなく、かかる遺伝子を例示的に記載したものであって、上記遺伝子リストに記載されていない遺伝子であっても肝障害関連遺伝子であればいずれもこの発明に適用することができる。
更に、この発明は、上記肝障害関連遺伝子群の抽出選択法によって選択した肝障害関連遺伝子群またはその発現パターンに基づいて肝障害もしくは肝機能または肝障害の度合いや重症度などの病態を評価または診断をすることができる評価・診断方法を提供する。
その上、この発明は、上記肝障害関連遺伝子群の抽出選択法によって選択した肝障害関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝障害の程度や重症度などの病態などを評価もしくは診断することにより肝炎、肝硬変、肝がんなどの疾患を含む肝障害を治療する肝障害治療方法を提供することができる。
上記方法に加えて、この発明は、上記肝障害関連遺伝子群の抽出選択法によって選択した肝障害関連遺伝子から主に構成される肝障害関連遺伝子群を集中的に配置した遺伝子発現解析デバイスなどを含む肝障害遺伝子発現用解析システムを提供することができる。この肝障害遺伝子発現用解析システムを使用することによって、肝障害に関連する遺伝子群をより迅速にかつ簡便に抽出選択することができる。また、かかる肝障害関連遺伝子群の発現パターンを解析することによって、肝障害の種類ばかりではなく、肝障害の度合いや重症度までも評価・診断することができる。
この発明に係る抽出選択方法を臨床応用する場合、標本の採取は肝生検によることが想定される。そこで、同一症例の非癌肝組織より１８Ｇ、２０Ｇの生検針にて肝組織を採取し、切除組織と遺伝子発現パターンとの比較について検討する。
解析で有意差を認める多数の遺伝子において、生検組織と切除組織との相関係数も、一致率も非常に高いことが判明した。また、クラスター解析でも１つのクラスターに分類される。２０Ｇの肝生検針にて解析に必要な量のｔｏｔａｌ ＲＮＡを採取可能であり、極細の肝生検針にて採取した極く微量の組織にて非癌部切除標本にて得られた解析結果と同様の評価が可能であると考えられる。
ところで、現在の肝生検による病理学的評価では、病理医の主観が入り決して客観的評価とはなりえない。新犬山分類の場合、４ないし５段階の評価（単なるグルーピングで定量性に劣る）であり、例えば同じＦ２でもＦ１に近いＦ２とＦ３に近いＦ２では大きく異なっている。これに対して、この発明の抽出選択方法による定量化スコアを用いれば、客観的かつ詳細な数値として肝障害度（線維化や肝炎活動性）を評価できる。更に、肝生検ではある一定以上の組織（通常、非癌肝組織の評価では１８Ｇ以上の針を用いる）が必要であり、これは科学の進歩によっても改善の余地は少ない。一方、分子遺伝学的手法を用いたこの発明の定量化スコアでは、従来では不可能であるような極細の針で低侵襲下に組織を採取し解析可能である。
以下、この発明を実施例によって更に詳細に説明する。ただし、この発明は、下記実施例によって一切限定されるものではない。
実施例１：
（動物）
体重１００グラムないし１５０グラムの雄ラット（ウィスター種）を、実験開始前７日間標準研究用飼料と水を自由給餌し、１２時間サイクルで灯火と暗室とを繰り返すように制御した動物飼育舎で所定のガイドラインに沿って飼育した。
（チオアセタミド誘導肝硬変）
２０頭のラットに０．０３％のチオアセタミドを含む飲料水を１２週間継続して投与して肝線維化を誘導した（非特許文献）。チオアセタミドを投与せずに更に２週間同一条件下で飼育してチオアセタミドを除去した後、動物を実験に供した。
（組織サンプリング）
ラットを人為的に殺して肝臓組織を摘出し、組織標本の一部を１０％ホルムアルデヒド溶液中に浸漬し、アザン（ａｚａｎ）染色のためにパラフィン中に包埋した。残りの肝臓組織標本はＲＮＡ調製まで−９０℃で冷凍保存した。
（組織切片の調製ならびに肝線維化領域の測定）
１０％ホルムアルデヒド溶液中に固定した各肝臓組織標本から厚さ５ミクロンの切片を取り、コラーゲン線維に対してアザンで染色した。これらの切片の画像５枚を任意に選択し、光学顕微鏡を用いて４０倍の倍率でカラー写真を撮影した。これらの写真をコンピューターに入力した。画像中の全領域に対するコラーゲン線維を発現しているアザン染色領域の割合を「実測肝線維化率（％）」として計算した。
（ＲＮＡ調製）
全肝臓ＲＮＡを冷凍保存した組織標本からＱｕｉｃｋＰｒｅｐ全ＲＮＡ抽出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたグアジニウム／セシウムトリフルオロアセテート抽出法によって調製した。単離したＲＮＡの温度と純度はバイオアナライザー（アジレント２１００）によって決定した。
（標識、ハイブリダイゼーションならびにスキャンニング）
チオアセタミドを投与して損傷した肝臓組織の標本と、正常な肝臓組織からの全ＲＮＡの２０マイクログラムを、Ｃｙ５−デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）とＣｙ３−ｄＵＴＰでそれぞれ標識した。標識したプローブを、１４０００個以上のクローンを搭載した市販ラットｃＤＮＡマイクロアレイキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ハイブリダイゼーションバッファ中で６５℃１２時間ないし１４時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、スライドを洗浄し、共焦レーザースキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ）でスキャンした。各ハイブリダイゼーションシグナルの強度は定量化して、その値をバックグラウンドレベルで補正して適正化した。
（肝障害関連遺伝子の同定および定量化スコアの算出法）
（肝線維化関連遺伝子の同定）
下記式（４）（上記式（１）にいてｍ＝２０）に従って、２０頭の試験サンプルを用いて、実測線維化率Ｆｉ（ｉ＝１，２，３，．．．，２０）と遺伝子ｊ（ｊ＝１，２，３，．．．，ｎ）の発現量（Ｅｉｊ）のＰｅａｒｓｏｎの相関係数（Ｒｊ）を、計算した。

（予測のための遺伝子数決定）
更に、予測に用いる遺伝子数ｘを決定は、上記クロス・バリデーション法によって決定した。更に、上記式（３）（ｍ＝２０）に従って、上記実測線維化率Ｆｉと予測線維化率φｘｉから、１頭当たりの誤差εｘを算出し、誤差εｘが最小になる遺伝子数を決定した（図１、２）。この実施態様においては、肝障害関連遺伝子群は９５個の遺伝子から構成されていた。

本実施例において、肝線維化率と相関が強い上記上位９５遺伝子の発現パターンに基づいて算定された肝線維化率は、実測肝線維化率と極めてよく相関している（図１、２）。
また、上記２０頭（Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅ）において、肝線維化率と相関する上記９５遺伝子の発現パターンを解析することによって、全く独立する別の６頭（Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅ）の肝線維化率を予測することができた。すなわち、分子遺伝学的に肝線維化率を評価可能であることが、ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｌｅａｎｉｎｇ法によって実証された。
実施例２：
１８頭のＴｒａｉｎｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅを使用して実施例１と同様に処理して決定したところ、肝障害関連遺伝子群は８３個の遺伝子から構成されていた。
本実施例においても、肝線維化率と相関が強い上記上位８３遺伝子の発現パターンに基づいて算定された肝線維化率は、実測肝線維化率と極めてよく相関している（図３）。

実施例３：
１９頭のＴｒａｉｎｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅを使用して実施例１と同様に処理して決定したところ、肝障害関連遺伝子群は３７個の遺伝子から構成されていた。
本実施例においても、肝線維化率と相関が強い上記上位３７遺伝子の発現パターンに基づいて算定された肝線維化率は、実測肝線維化率と極めてよく相関している（図４）。

実施例４：
臨床的肝機能評価を次のようにして行った。
転移性肝がん６例と肝がん３６例の切除非がん組織に対して、ＤＮＡチップ（１２，８１４遺伝子）を用いてＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
臨床的肝機能評価は、ＩＣＧＲ１５値等の血液検査と病理所見を用いて行った。その結果、ＩＣＧＲ１５値は、肝線維化率と有意に相関があることが認められた。
また、ＲＴ−ＰＣＲ法による肝組織ＴＧＦβ１とＴＩＭＰ−１との遺伝子発現は、肝線維化率と有意に相関することが認められた。更に、ＤＮＡマイクロアレイ解析によって肝線維化率と相関する遺伝子群を抽出すると、正常肝群と、肝硬変群とを完全にクラスター分類することができた。
実施例５：
肝がん５６例の切除非がん組織を用いてラット肝硬変モデルと同様にアザン（ＡＺＡＮ）染色を行い、実測線維化率を測定した。本線維化率は９視野（４０倍視野）の平均であり、１ｃｍ^２以上の十分な量の切除肝組織によってのみ決定可能な指標であり、肝生検組織などでは到底決定できない肝線維化の程度を評価する教師値としての指標である。ＤＮＡマイクロアレイ（アジレント社製、約１３，０００遺伝子搭載）の解析結果と実測線維化率との関連より、サポート・ベクター・レグレッション（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）法と変数増加法を組み合わせた解析法を用いて２７個の肝障害（肝線維化）関連遺伝子群を決定した（表６）。これら２７遺伝子を用いて算出した肝線維化の（遺伝子発現パターンに基づく）定量化スコアは実測線維化率と良く相関した（Ｒ＝０．９４）。スーパーバイズド・リーニング法（ｓｕｐｐｅｒｖｉｓｅｄ ｌｅａｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）であるリーブワンアウト（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）法を用いてもＲ＝０．８４と良好であった（図５）。同様の症例において実測線維化率と既存の肝機能検査（肝線維化マーカーを含む）との相関係数をみると、良好な順に、ＩＶ型コラーゲン：０．６５、ＩＣＧＲ１５：０．５３、ＰＴ：０．５１、アルブミン値：０．４５、血小板数：０．３８、ヒアルロン酸：０．３６、ヘパプラスチンテスト：０．２８であった。
以上の如く、教師値としての実測線維化率に最も相関する既存の指標はＩＶ型コラーゲン：０．６５であるが、遺伝子発現パターンに基づく定量化スコア：０．９４を用いることで格段に精度を向上可能であった。

実施例６：
肝障害の中でも肝炎活動性の評価においては、現在、血液肝機能検査であるＧＰＴ値と組織学的に新犬山分類に基づいて決定するＧｒａｄｉｎｇ（Ａ０〜Ａ３）が用いられる。そこで、肝がん５８例の切除非がん組織のＤＮＡマイクロアレイ解析結果とＧＰＴ値よりサポート・ベクター・レグレッション法と変数増加法を組み合わせた解析法を用いて５個の肝障害（肝炎活動性）関連遺伝子群を決定した。これら５遺伝子を用いて決定した肝炎活動性の（遺伝子発現パターンに基づく）定量化スコアはｔｒａｉｎｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ４６症例においてＧＰＴ値と良く相関した（Ｒ＝０．６１）。スーパーバイズド・リーニング法であるリーブワンアウト法を用いてもＲ＝０．５９と良好であった。また、全く独立する１２症例においてもＲ＝０．６１と良好な相関を示した（表７，図６）。

実施例７：
別の肝炎活動性の指標である新犬山分類に基づいて決定するＧｒａｄｉｎｇ（Ａ０〜Ａ３、今回の検討では、２人の肝臓病理医のＧｒａｄｉｎｇスコアの平均値を用いた）と肝がん５１例の切除非がん組織のＤＮＡマイクロアレイ解析結果よりサポート・ベクター・レグレッション法と変数増加法を組み合わせた解析法を用いて５個の肝障害（肝炎活動性）関連遺伝子群を決定した。これら５遺伝子を用いて決定した肝炎活動性の（遺伝子発現パターンに基づく）定量化スコアはｔｒａｉｎｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ４１症例において組織学的なＧｒａｄｉｎｇと良く相関した（Ｒ＝０．６４）。スーパーバイズド・リーニング法であるリーブワンアウト法を用いてもＲ＝０．６１と良好であった。また、全く独立する１０症例においてもＲ＝０．７６と良好な相関を示した（表８、図７）。

上記のような構成からなるこの発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法は、肝炎活動性や肝線維化などを含む肝障害などを評価するためのより正確でかつ包括的な評価法として利用することができる。また、この発明の抽出選択法によって選択した肝障害関連遺伝子群またはその発現パターンに基づいて肝障害もしくは肝機能または肝障害の度合いや重症度などの病態を評価または診断をすることもできる。
また、臨床例においても、ＤＮＡマイクロアレイ法は、肝機能を分類することができ、ＩＣＧＲ１５値や病理所見単独では判定困難な症例でも評価ができる可能性がある。
更に、この発明によれば、肝機能検査をするための肝生検をする場合に、２１Ｇよりも細い針で行うことができるようになり、検査を受ける患者にとって負担を非常に少なくすることができることになり極めて有用である。

Claims (33)

1. 検体における肝障害に関連する肝障害関連遺伝子の発現パターンを抽出し、所定の発現パターンを有する複数の該肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝子群を選択することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
2. 請求の範囲１に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝障害関連遺伝子の発現パターンを遺伝子発現解析システムによって得ることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
3. 請求の範囲１または２に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝障害関連遺伝子群を肝障害関連要因に基づいて統計学的手法により抽出選択することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
4. 請求の範囲１ないし３のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝障害関連要因が、肝障害、肝炎活動性または肝線維化率であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
5. 請求の範囲４に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝障害が肝炎、肝硬変または肝がんであることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
6. 請求の範囲４または５に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝障害が更にその重症度を評価することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
7. 請求の範囲４に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝線維化率が実測線維化率と予測線維化率との相関関係に基づいて決定されることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
8. 請求の範囲４に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝線維化率が組織検査により染色される面積比に基づいて決定されることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
9. 請求の範囲３ないし８のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記統計学的手法が、スーパーバイズド・リーニング法、サポート・ベクター・レグレッションもしくは変数増加法またはそれらを組み合わせた解析法であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
10. 請求の範囲１ないし９のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記肝障害関連遺伝子を下記式に基づいて同定することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
    

    

    （式中、Ｒｊは、試験サンプル数ｍを用いて計算した実測線維化率Ｆｉ（ｉ＝１，２，３，…，ｍ）と遺伝子数ｊ（ｊ＝１，２，３，…，ｎ）の発現量Ｅｉｊのピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相関係数を表わす）。
11. 請求の範囲１０に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、Ｒｊの絶対値が高い遺伝子を肝線維化と関連が強い肝障害関連遺伝子とすることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
12. 請求の範囲１１に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、予測肝線維化率を下記式に従って計算することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
    

    

    （式中、Ｄｘｉは、肝線維化関連遺伝子ｘ個について計算した正常サンプルでの発現の平均値Ｅｊ（ｊ＝１，２，３…ｘ）と各ラットの遺伝子発現量Ｅｉｊのピアソンの相関係数を表す）。
13. 請求の範囲１２に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、Ｄｘｉが１に近いサンプルｉを肝線維化率が０％に近いものと予測して、実測線維化率ＦｉとＤｘｉの回帰直線から、実測線維化率が不明のサンプルの肝線維化率を予測すること特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
14. 請求の範囲７、１２および１３のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、予測に使用する遺伝子数をクロス・バリデーション法で決定することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
15. 請求の範囲７ないし１２〜１４のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、サンプル数（ｍ）から除外したサンプル１個の肝線維化率を残りのサンプル（ｍ−１）から予測し、これを全てのサンプルに繰り返すことによって算出した予測肝線維化率Φｘｉと実測肝線維化率Ｆｉから、１サンプル当たりの誤差εｘを下記式に従って算出することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
    

    
16. 請求の範囲１５に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、誤差εｘを、肝線維化と関連の強い５遺伝子から開始し、１遺伝子ずつ増やして誤差εｘを計算し、誤差εｘが最小となるときの遺伝子数を実際の予測に用いることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
17. 請求の範囲１ないし１６のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、該遺伝子数が３個ないし２００個であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
18. 請求の範囲１ないし１７のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、該遺伝子数が１７０個以下であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
19. 請求の範囲１ないし１８のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、該遺伝子数が１２０個以下であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
20. 請求の範囲１ないし１９のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、該遺伝子数が３個から１００個の範囲であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
21. 請求の範囲１ないし２０のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、該遺伝子数が３個から５０個の範囲であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
22. 請求の範囲１ないし２１のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法により選択した肝障害関連遺伝子群に基づいて肝障害または肝機能を評価または診断することを特徴とする評価・診断方法。
23. 請求の範囲１ないし２１のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法により選択した肝障害関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝障害または肝機能を評価または診断することを特徴とする評価・診断方法。
24. 請求の範囲２２または２３に記載する評価・診断方法において、前記肝障害もしくは前記肝機能の障害の度合いまたは重症度を評価または診断することを特徴とする評価・診断方法。
25. 請求の範囲１ないし２１のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法により選択した肝障害関連遺伝子群に基づいて肝障害を治療することを特徴とする肝障害治療方法。
26. 請求の範囲１ないし２１のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法により選択した肝障害関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝障害を治療することを特徴とする肝障害治療方法。
27. 請求の範囲２２ないし２４のいずれか１項に記載する評価・診断方法に基づいて肝障害を治療することを特徴とする肝障害治療方法。
28. 請求の範囲１に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記検体が組織または細胞であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
29. 請求の範囲２８に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、前記組織を２１Ｇより小さい針で採取することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
30. 請求の範囲１７ないし２１のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法により選択される肝障害関連遺伝子群を構成する遺伝子を集中的に配置することを特徴とする遺伝子発現解析システム。
31. 請求の範囲１７ないし２１のいずれか１項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法により選択される肝障害関連遺伝子群の遺伝子の発現パターンを集中的に配置することを特徴とする遺伝子発現解析システム。
32. 請求の範囲３０または３１に記載する遺伝子発現解析システムを用いて肝障害または肝機能を診断または評価することを特徴とする診断・評価方法。
33. 請求の範囲３２に記載する診断・評価方法に基づいて肝障害を治療することを特徴とする治療方法。

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