WO2004092365A1 - 肝障害関連遺伝子群の抽出選択法およびそれを用いた肝障害もしくは肝機能評価・診断方法 - Google Patents

肝障害関連遺伝子群の抽出選択法およびそれを用いた肝障害もしくは肝機能評価・診断方法 Download PDF

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Masaki Mori
Tohru Utsunomiya
Hiroshi Inoue
Masahiro Okamoto
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Kyushu Tlo Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting and selecting a group of genes related to liver injury, and a method for evaluating liver cancer and liver function using the same. More specifically, the present invention relates to a method for extracting and selecting a group of liver disorder-related genes related to liver disorders such as hepatitis, cirrhosis, and the like; a method for evaluating liver function and liver function using the method; The present invention relates to a method and a gene expression analysis system in which such liver injury-related genes are efficiently concentrated.
  • liver cancer cases in Japan have chronic liver injury. It is necessary to accurately determine the severity of liver disease in treating liver cancer.
  • the accuracy of the conventionally used methods for evaluating liver function such as the Chi Id classification and the ICG value, has certain limitations. At present, there is no more accurate and comprehensive evaluation method for evaluating hepatitis activity and liver fibrosis.
  • liver biopsy has been performed for that purpose.
  • morphological diagnosis using pathological tissues it is as large as 14–18 G. Needle liver biopsy is required. This test requires a hospitalization to control bleeding and pain after biopsy, and has the disadvantage that pathological diagnosis is not an objective evaluation method because of the subjective opinion of a pathologist.
  • fibrosis markers for examining hepatic fibrosis, but these do not change and have low specificity in mild hepatic fibrosis. . Therefore, an evaluation method combining several markers is also being studied, but the basis for selecting each marker is poor and it has not been widely applied to clinical practice at present.
  • the present inventors have conducted extensive research on gene expression profiling (extraction) targeting hepatic injury, and as a result, by using DNA microarray method, the conventional liver function
  • gene expression profiling extraction
  • DNA microarray method DNA microarray method
  • the present invention provides a method for extracting a liver-damage-related gene having a function associated with liver damage from a sample, and selecting a liver-damage-related gene group comprising a plurality of such liver damage-related genes.
  • An object of the present invention is to provide a method for extracting and selecting a group of genes.
  • An object of the present invention is to provide an extraction selection method comprising selecting the above-mentioned hepatic disorder-related gene group using gene expression analysis means such as a microarray equipped with each disorder-related gene.
  • the present invention provides an extraction and selection method comprising selecting the above-mentioned group of liver injury-related genes by a statistical method based on liver injury-related factors from liver injury-related genes having a predetermined expression pattern.
  • the purpose is.
  • the present invention in a preferred embodiment thereof, has an object to provide a method for extracting and selecting a liver damage-related gene group, wherein the liver damage-related gene group comprises 3 to about 200 liver damage-related genes.
  • the present invention provides a method for diagnosing / evaluating hepatic disorder or liver function by the above-described extraction and selection method for the expression pattern of a gene associated with hepatic disorder or liver function. Another purpose is to provide a method.
  • the present invention provides a gene expression analysis system in which liver damage genes having a predetermined expression pattern constituting the liver damage related gene group selected by the extraction selection method are effectively and concentratedly arranged.
  • the present invention provides a method for extracting the expression of a liver damage-related gene having a function related to liver damage from a sample, and extracting a liver damage-related gene group comprising a plurality of the extracted liver damage-related genes.
  • the present invention provides a method for extracting and selecting a group of genes related to liver injury, which comprises selecting.
  • the present invention provides, as a preferred embodiment thereof, a method for extracting and selecting a group of genes related to hepatic disorder, which comprises extracting the expression pattern of a gene related to hepatic disorder using a gene expression analysis means such as a microarray.
  • the hepatic disorder-related gene group is determined based on hepatic disorder-related factors such as hepatitis, cirrhosis, liver cancer and other liver disorders, hepatitis activity, and degree of liver fibrosis. Based on the 'supervised leaning method' support vector, statistical methods such as the support vector regression method, the variable increase method, and the combined analysis method are used.
  • the present invention provides a method for selecting and selecting liver-related genes.
  • the degree and severity of liver damage are evaluated by, for example, the rate of liver fibrosis based on the area ratio stained by histological examination using a rat cirrhosis model.
  • a method for extracting and selecting a group of genes related to liver injury is provided.
  • the present invention provides, as yet another preferred embodiment, a method for extracting and selecting a liver damage-related gene group, comprising identifying a liver damage-related gene based on the following formula (1).
  • a gene having a high absolute value of the Pearson's correlation coefficient Rj of the measured hepatic fibrosis rate and the expression level of the gene is set as a hepatic disorder-related gene strongly associated with hepatic fibrosis.
  • a method for extracting and selecting a group of genes related to liver injury comprising identifying a liver damage-related gene based on the following formula (1).
  • the liver fibrosis rate is determined based on a correlation between the measured fibrosis rate and a predicted fibrosis rate calculated by the following equation (2).
  • a method for extracting and selecting a harm-related gene group is provided.
  • extraction of a group of hepatic disorder-related genes comprising predicting the hepatic fibrosis rate of a sample whose measured fibrosis rate is unknown from a regression line of the measured fibrosis rate F i and D x ⁇ Provides a selection method.
  • the present invention provides, as another preferred embodiment thereof, a method for extracting and selecting a group of liver damage-related genes, wherein the number of genes used for prediction is determined by a cross-validation method.
  • an error ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ per sample is calculated from the calculated predicted liver fibrosis rate ⁇ and the actually measured liver fibrosis rate F i according to the following formula (3), and the gene when X is minimized
  • the present invention provides a method for selecting and selecting a group of genes related to liver injury, which comprises using the numbers in an actual prediction.
  • the present invention provides, in a more preferred embodiment thereof, the number of genes is from 3 to about 200, preferably about 170 or less, more preferably about 120 or less, that is, preferably 3 or less.
  • the present invention provides a method for extracting and selecting a group of genes related to hepatic injury, the number of which ranges from about 100 to about 100, especially from 3 to about 50.
  • the present invention also relates to liver disorders such as hepatitis and cirrhosis, and their severity and degree.
  • the present invention provides a method for extracting and selecting a group of liver injury-related genes, which is evaluated based on the rate of fibrosis.
  • the present invention provides a method for diagnosing and evaluating liver function based on the liver injury-related gene group selected by the extraction / selection method or on the basis of the expression pattern of the liver injury-related gene group.
  • a method comprising diagnosing ⁇ evaluating or treating is provided.
  • the present invention further comprises arranging a gene having a predetermined expression pattern so as to intensively generate the expression pattern of the liver disorder-related gene group selected by the extraction method.
  • a tissue is collected with a needle finer than 21 G. And a method for collecting tissue.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing no determination of the number of genes for scoring the liver fibrosis rate.
  • FIG. 2 shows the validity of the prediction of rat liver fibrosis rate using 95 genes related to liver injury (liver fibrosis).
  • FIG. 3 is a diagram showing the validity of the prediction of rat liver fibrosis rate using 83 genes related to liver injury (liver fibrosis).
  • FIG. 4 shows the validity of the prediction of rat liver fibrosis rate using 37 genes related to liver injury (liver fibrosis).
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between each case and the liver fibrosis rate.
  • FIG. 6 is a graph showing the correlation between each case and the GPT value.
  • FIG. 7 is a graph showing the correlation between each case and G ra ding based on the new Inuyama classification.
  • the method for extracting and selecting a liver-damage-related gene group comprises extracting a liver-damage-related gene group having a function related to liver damage from a sample such as liver tissue and selecting the liver-damage-related gene group. It is configured.
  • the extraction and selection method of the present invention is implemented by extracting and selecting a liver-damage-related gene having a predetermined expression pattern from the liver-damage-related genes using a statistical technique based on the liver-damage-related factor. can do.
  • liver damage-related gene group extracted and selected by the extraction selection method of the present invention will be described.
  • the present invention can be fundamentally studied using a rat cirrhosis model as an example.
  • the rat cirrhosis model used for that purpose is commonly used in the art. It can be prepared according to the method.
  • the extraction and selection method according to the present invention can be similarly subjected to a basic study using an experimental model of an animal other than the rat cirrhosis model.
  • other animal test models can be prepared according to a method commonly used in the art, similarly to the rat cirrhosis model.
  • liver fibrosis rate The hepatic dystrophy specimen of the rat cirrhosis model prepared in this manner is stained by a staining method for staining liver fibrotic tissue, for example, Azan (AZAN) staining. Calculate the area ratio.
  • this area ratio is referred to as the liver fibrosis rate.
  • the expression of liver-related genes related to liver damage (sample, gene profile) from a sample is determined by gene expression such as a microarray in which thousands to tens of thousands of genes including liver-related genes are fixed. It can be detected using an analysis device or the like. As such a microarray, for example, a commercially available DNA chip format chip or the like can be used. Also, the gene can be expressed by a method commonly used in the art.
  • a group of hepatic disorder-related genes consisting of a plurality of hepatic disorder-related genes having a predetermined expression pattern is extracted and selected using a statistical method based on the hepatic disorder-related factors. .
  • liver damage-related factors for example, the degree of liver fibrosis indicated by liver damage, hepatitis activity, liver fibrosis rate and the like can be used.
  • liver disorder for example, liver disease such as hepatitis, cirrhosis, and liver cancer can be used as an index.
  • a supervised leaning method for example, a support 'vector' regression method, a variable increase method, and an analysis method combining these are used.
  • a supervised leaning method for example, a support 'vector' regression method, a variable increase method, and an analysis method combining these are used.
  • examples of the supervised leaning method include a leave-one-out method.
  • liver fibrosis rate which is one of the liver damage factors
  • the liver fibrosis rate of a rat liver cirrhosis model prepared by a conventional method is calculated based on the area ratio by Azan staining, and gene expression is analyzed using a cDNA microarray method. Based on this analysis, the expression patterns of multiple top genes that have a strong correlation with the liver fibrosis rate are selected, and whether the predicted value of liver fibrosis calculated from the expression pattern correlates with the measured value of the liver fibrosis rate Consider whether.
  • a group of genes related to liver injury is extracted from the gene profile obtained based on the results of this study, and a prediction formula for the rate of liver fibrosis is determined based on gene expression. Thus, scoring of liver fibrosis based on the gene expression pattern can be realized.
  • the extraction of the group of genes related to hepatic injury can be performed, for example, by using Fant ' It can be carried out according to the method of Hue et al. (Van't Veer, LI, et al .: Nature 2002; 415: 530-536).
  • the liver damage-related gene in order to extract a liver damage-related gene group from a gene profile, can be identified according to the following formula (1).
  • a gene having a high absolute value of the Pearson correlation coefficient Rj can be identified as a liver damage-related gene strongly associated with liver fibrosis.
  • the predicted liver fibrosis rate is calculated according to the following equation (2).
  • the sample ⁇ in which the Pearson's correlation coefficient DX ⁇ is close to 1 is predicted to have a liver fibrosis rate close to 0%, and the regression line of the measured fibrosis rates F i and D xi is estimated. From this, it is possible to predict the liver fibrosis rate of a sample whose measured fibrosis rate is unknown.
  • the number of genes X used for prediction is determined. This determination can be made by the cross validation method according to the following equation (3). (Van't Veer, LJ, et al .: ibid).
  • the number of genes should be about 3 to about 200 selected from the liver damage related genes listed in the table below. Good.
  • the preferred number of genes is about 170 or less, and the more preferred number of genes is about 120 or less, that is, more preferably 3 to about 100, and particularly preferably 3 to about 5
  • the range should be 0.
  • the gene can be arbitrarily selected from the rat or mouse gene list in the table below.
  • the method for extracting and selecting a group of genes related to liver injury according to the present invention is to search only the expression pattern of genes related to liver injury in a cirrhosis model in which the factors of age, sex and liver injury are unified. The degree of liver fibrosis can be evaluated.
  • This clinical study can be performed, for example, by performing a DNA microarray analysis using a resected specimen of a non-cancerous part of a liver cancer patient.
  • a non-cancerous excision specimen was collected, DA microarray analysis was performed, and liver fibrosis was determined based on the area ratio by Azan staining. Calculate the rate.
  • the fibrosis rate measured here is an index determined only by a wide and sufficient amount of resected liver tissue, and is a teacher value that evaluates the degree of liver fibrosis that cannot be determined by other evaluation methods such as liver biopsy tissue. As an index.
  • Liver damage-related genes can be determined.
  • the quantification score of the hepatic fibrosis rate that can be calculated using the genes constituting the hepatic disorder gene group correlates well with the measured fibrosis rate.
  • the correlation is also good using the leave-one-out method, which is a supervised, leaning method.
  • this measured fibrosis rate was measured using existing liver function tests (including liver fibrosis markers), ie, type IV collagen, ICGR, PT, albumin level, platelet count, hyaluronic acid, It also shows a correlation with the plastin test. Therefore, the accuracy of the existing index that most reflects the measured fibrosis rate as a teacher value can be significantly improved by using a quantification score based on the gene expression pattern.
  • hepatitis activity-related genes can be selected using the GPT value, which is one of the indicators of hepatitis activity.
  • GPT value is one of the indicators of hepatitis activity.
  • the genes shown in Table 2 were used.
  • the quantification score of hepatitis activity determined using the hepatic disorder-related genes selected in this way correlates well with the GPT value, and the leave-one-out method is used. However, the correlation is relatively good.
  • SSRPl Human high mobility group box
  • PACE4 Human subtilisin-like protein
  • TATA box binding protein (TBP) -associated factor TATA box binding protein (TBP) -associated factor, RNA polyBG164482 merase II, G, 32kD
  • the present invention evaluates a disease state such as liver damage or liver function or the degree or severity of liver damage based on the liver damage-related gene group selected by the method for extracting and selecting the liver damage-related gene group or the expression pattern thereof. Or, provide an evaluation / diagnosis method capable of making a diagnosis.
  • the present invention provides hepatitis by evaluating or diagnosing the disease state, such as the degree and severity of liver damage, based on the expression pattern of the liver damage-related genes selected by the method for extracting and selecting liver damage-related genes.
  • the present invention can provide a liver damage treatment method for treating liver damage including diseases such as cirrhosis and liver cancer.
  • the present invention provides a gene expression analysis device in which a liver damage-related gene group mainly composed of the liver damage-related gene selected by the method for extracting and selecting the liver damage-related gene group is concentrated.
  • the present invention can provide an analysis system for liver damage gene expression including the above.
  • a group of genes related to liver damage can be extracted and selected more quickly and easily.
  • by analyzing the expression pattern of the group of genes related to liver injury not only the type of liver injury but also the degree and severity of liver injury can be evaluated and diagnosed.
  • liver tissue is collected from non-cancerous liver tissue of the same case with an 18G or 20G biopsy needle, and the comparison between the resected tissue and the gene expression pattern is examined.
  • the current pathological evaluation based on liver biopsy cannot be an objective evaluation that involves the subjective opinion of a pathologist.
  • the rating is 4 or 5 (simple grouping is inferior in quantification).
  • F2 close to F1 and F2 close to F3 there is a large difference between F2 close to F1 and F2 close to F3.
  • mice Male rats (Wistar breeds) weighing between 100 and 150 grams were fed a standard laboratory chow and water ad libitum for 7 days prior to the start of the experiment and were controlled to cycle between 12 hours of light and darkness. The animals were bred in animal breeding houses according to predetermined guidelines.
  • Non-Patent Document Hepatic fibrosis was induced by continuously administering drinking water containing 0.03% thioacetamide to 20 rats for 12 weeks. After removing thioacetamide by breeding under the same conditions for another 2 weeks without administration of thioacetamide, the animals were subjected to experiments.
  • a 5-micron thick section was taken from each liver tissue specimen fixed in a 10% formaldehyde solution, and collagen fibers were stained with azan. Five images of these sections were arbitrarily selected, and color photographs were taken at a magnification of 40 times using an optical microscope. These photos were entered into a computer. The ratio of the aza-stained area expressing collagen fibers to the entire area in the image was calculated as “measured liver fibrosis rate (%)”.
  • RNA was prepared from a cryopreserved tissue specimen by a guadinium / cesium trifluoroacetate extraction method using a Quick Prep total RNA extraction kit (Amersham Pharmacia Biotech). The concentration and purity of the isolated was determined by Bioanalyzer (Agilent 2100). (Signs, hybridization and scanning)
  • RNA from normal liver tissue were treated with Cy 5 -deoxyperidine triphosphate (d UTP) and Cy 3-d UTP. Each was labeled.
  • the labeled probe was hybridized at 65 ° C for 12 to 14 hours in a hybridization buffer using a commercial rat cDNA microarray kit (Agilent) equipped with more than 14,000 clones. Soy. After hybridization, the slides were washed and scanned with a confocal laser scanner (AgiIent). The intensity of each hybridization signal was quantified and the values were corrected for background levels and optimized.
  • Rat fibroblast growth factor receptor 3 (Fgfr3) mRNA complete AF277717 cds.
  • the hepatic fibrosis rate calculated based on the expression pattern of the above top 95 genes having a strong correlation with the hepatic fibrosis rate correlated very well with the measured hepatic fibrosis rate (Fig. 1, 2).
  • the liver fibrosis rate of another 6 animals (Test Sample) was analyzed.
  • Teest Sample another 6 animals
  • liver injury-related gene group was composed of 83 genes.
  • the hepatic fibrosis rate calculated based on the expression pattern of the above-mentioned top 83 genes having a strong correlation with the hepatic fibrosis rate correlates very well with the measured hepatic fibrosis rate (FIG. 3). .
  • Rat mRNA for MHC class Il-associated invariant chain Rat mRNA for MHC class Il-associated invariant chain.
  • Rat thymosin beta-10 gene complete cds.N58405
  • DIG-1 Rat dithiolethione-inducible gene-1 (DIG-1) mRNA, complete cds.U66322
  • liver injury-related gene group was composed of 37 genes.
  • Clinical liver function evaluation was performed as follows.
  • Microarray analysis of DNA was performed on the resected non-cancer tissues of 6 metastatic liver cancer cases and 36 liver cancer cases using a DNA chip (12, 814 genes).
  • liver RT-PCR method significantly correlated with the rate of liver fibrosis. Furthermore, when a gene group correlated with the rate of liver fibrosis was extracted by DNA microarray analysis, the normal liver group and the cirrhosis group could be completely classified into one cluster.
  • Azan (AZAN) staining was performed in the same manner as in the rat cirrhosis model using excised non-cancer tissue from 56 cases of liver cancer, and the measured fibrosis rate was measured.
  • This fibrosis rate is an average of 9 visual fields (40 times visual field) and is an index that can be determined only by a sufficient amount of resected liver tissue of 1 cm 2 or more, and cannot be determined by liver biopsy tissue, etc. It is an index as a teacher value for evaluating the degree of liver fibrosis.
  • type IV collagen 0.65
  • ICGR15 0.53
  • PT 0.51
  • albumin Values 0.45
  • platelet count 0.38
  • hyaluronic acid 0.36
  • hepalastin test 0.28.
  • the existing index that most correlates with the measured fibrosis rate as a teacher value is type IV collagen: 0.65, but the accuracy can be significantly improved by using the quantification score based on the gene expression pattern: 0.94 Met. Table 6
  • proteasome prosome, macropain subunit
  • beta type beta type
  • 9 large AW005503 multifunctional protease 2
  • the method for extracting and selecting a liver damage-related gene group according to the present invention having the above-described structure is a more accurate and comprehensive evaluation for evaluating liver damage including hepatitis activity and liver fibrosis. Can be used as a law. Also, based on the liver damage-related gene group selected by the extraction selection method of the present invention or the expression pattern thereof, it is possible to evaluate or diagnose liver damage or liver function, or a disease state such as the degree or severity of liver damage.
  • the DNA microarray method can classify liver function, and it may be possible to evaluate even cases in which it is difficult to judge using ICGR15 values or pathological findings alone.
  • a liver biopsy for liver function test can be performed with a needle smaller than 21 G, and the burden on the patient undergoing the test is greatly reduced. It is extremely useful to be able to do it.

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Abstract

この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、検体における肝障害に関連する肝障害関連遺伝子の発現パターンをマイクロアレイなどの遺伝子発現解析システムなどによって得、抽出し、所定の発現パターンを有する複数の該肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝子群を選択することから構成されている。この抽出選択法においては、肝障害の度合いを組織検査によって染色される面積比による肝線維化率などによって評価している。

Description

明 細 書 肝障害関連遺伝子群の抽出選択法およびそれを用いた肝障害もしくは
肝機能評価■診断方法 技術分野
この発明は、 肝障害関連遺伝子群の抽出選択法およびそれを用いた肝障害ならびに肝 機能の評価 '診断方法に関するものである。 更に詳細には、 この発明は、 肝炎、 肝硬変 などの肝障害に関違する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法、 それを用いた肝障害ならび に肝機能の評価■診断方法ならびに肝障害の治療方法およびかかる肝障害関連遺伝子群 を効率的に集中させて配置している遺伝子発現解析システムに関するものである。
背景技術
わが国の肝がん症例の約 8割に慢性肝障害が併存しておリ、 肝がん治療にはその併存 肝疾患の重症度を正確に把握する必要がある。 しかしながら、 従来より汎用されている 肝機能評価法である C h i I d分類や I C G値などにはその精度に一定の限界がある。 また、 肝炎活動性や肝線維化を評価するためのよリ正確でかつ包括的な評価法もないの が現状である。
一方、 近年目覚しい進展を遂げているゲノム構造解析の結果、 数多くの遺伝子の構造 が解明されてきている。 同時に、 かかる遺伝子の機能も少しずつではあるが明らかにさ れてきて、 種々の疾患の病因や病変も遺伝子レベルで徐々に解明されてきている。
これまでは、 疾患関連遺伝子の発現は、 ノーザンブロッテイング法ゃサザンブロッテ イング法などの従来法によって検出されてきた。 このような手法は、 少数の遺伝子を极 う場合には有効であり、 有用であるけれども、 多数の遺伝子を一度に取り扱う場合には 時間も手間も費用もかかり、非常に非効率的である。更に、疾患に関連する遺伝子を個々 に検出し、 それらの遺伝子を解明したとしても、 それらの遺伝子発現とその疾患全体と の関係は必ずしも明確にならない。
一方、 多数の疾患関連遺伝子の発現を一度に検出することができれば極めて便利であ リ有用である。 このような目的を達成するために、 D N Aチップなどの D N Aマイクロ アレイ法が急激に発展してきている。 このような D N Aマイクロアレイ法を使用すれば, 同一検体から多数の遺伝子の発現を一括して検出することができ、 そのなかから目的と する疾患に関連する疾患関連遺伝子の発現をプロフアイリングすることができるよう になってきた。 このように、 ある特定の疾患に関連する関連遺伝子全体の発現をプロフ アイルすることは極めて有効であると考える。
ところで、 C型慢性肝炎患者のインターフ Iロン治療適応決定のために、 肝炎活動性 や肝線維化の程度が従来よリ評価されているが、 その目的のために肝生検が行われてい る。 しかしながら、 病理組織を用いた形態診断のためには、 1 4— 1 8 Gという大きい 針での肝生検が必要である。 この検査は、 生検後の出血や疼痛を管理するために入院が 必要であり、 また、 病理診断は病理医の主観が入るため客観的な評価法とはなり難いと いう欠点がある。
更に、 肝線維化を調べるための線維化マ一カーとして血中ヒアルロン酸、 I V型コラ 一ゲンなどが臨床応 されているが、 これらは軽度の肝線維化では変化せず、 特異性も 低い。 したがって、 いくつかのマーカーを組み合わせた評価法も検討されているが、 そ れぞれのマーカーを選択する根拠に乏しく広く臨床応用されるには至ってはいないの が現状である。
これまで、 肝障害をターゲッ卜とした遺伝子発現プロファイリングについての報告は 皆無といえる。 したがって、 各患者の病因遺伝子もしくは遺伝子群をその発現プロファ ィルして、 簡便にかつ効率よく検出できる方法が要請されている。
発明の開示 .,
上記のような先行技術を前提として、 本発明者らは、 肝障害をターゲットとした遺伝 子発現プロフアイリング （抽出） について銳意研究をした結果、 D N Aマイクロアレイ 法を用いることによって、 従来の肝機能評価法に比べてより正確でかつ包括的な肝炎活 動度や肝線維化を評価することができる新規な肝予備能評価法を見出すと共に、 肝がん 症例にかなリ多くに認められる併存慢性肝障害の重症度をも正確に把握することがで きることを見出して、 この発明を完成した。
したがって、 この発明は、 検体から肝障害に関連する機能を有する肝障害関連遺伝子 の発現を抽出し、 複数のかかる肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝子群を選択す ることからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法を提供することを目的としている。 この発明は、 各障害関連遺伝子を搭載したマイクロアレイなどの遺伝子発現解析手段 を用いて上記肝障害関連遺伝子群を選択することからなる抽出選択方法を提供するこ とを目的としている。
また、 この発明は、 所定の発現パターンを有する肝障害関連遺伝子から、 肝障害関連 要因に基づいて統計学的手法により上記肝障害関連遺伝子群を選択することからなる 抽出選択方法を提供することを目的としている。
更に、 この発明は、 その好ましい態様において、 肝障害関連遺伝子数が 3個ないし約 2 0 0個からなる肝障害関連遺伝子群を選択する肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法 を提供することを目的としている。
上記に加えて、 この発明は、 肝障害もしくは肝機能に関連する遺伝子の発現パターン を上記抽出選択方法によって、 肝障害もしくは肝機能を診断■評価する診断■評価方法 およぴ肝障害を診断する方法を提供することを別の目的としている。
その上、 この発明は、 上記抽出選択方法によって選択した肝障害関連遺伝子群を構成 する所定の発現パターンを有する肝障害遺伝子を効喿的に集中して配置した遺伝子発 現解析システムを提供することを別の目的としている。 上記目的を達成するために、 この発明は、 検体から肝障害に関連する機能を有する肝 障害関連遺伝子の発現を抽出し、 抽出した複数の該肝障害関連遺伝子からなる肝障害関 連遺伝子群を選択することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
この発明は、 その好ましい態様として、 マイクロアレイなどの遺伝子発現解析手段を 利用して、 肝障害関違遺伝子の-発現パターンを抽出することからなる肝障害関違遺伝子 群の抽出選択法を提供する。
また、 この発明は、 その好ましい態様として、 上記肝障害関連遺伝子群を、 肝炎、 肝 硬変、 肝がんなどの肝障害、 肝炎活動性、 肝線維化の程度などの肝障害関連要因に基づ いて、 スーパーバイズド ' リ一ニング法 (supervised leaning method) サポー卜 'べク ター.レグレツション法 (support vector regression method), 変数増加法ならびにこれ らを組み合わせた解析法などの統計学的手法により肝障害関連遺伝子群の抽出選択法 を提供する。
この発明はまた、 その別の好ましい態様として、 肝障害の度合いや重症度などを、 例 えば、 ラット肝硬変モデルによる組織検査によって染色される面積比による肝線維化率 によつて評価することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
この発明は、 その更に別の好ましい態様として、 肝障害関連遺伝子を下記式 （1 ) に 基づいて同定することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。 この発明 のより好ましい態様として、 実測肝線維化率と遺伝子の発現量のピアソンの相関係数 R jの絶対値が高い遺伝子を肝線維化と関連が強い肝障害関連遺伝子とすることからな る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
また、 この発明は、 その好ましい態様として、 肝線維化率を、 実測線維化率と、 下記 式 （2 ) で計算される予測線維化率との相関関係に基づいて決定することからなる肝障 害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。 この発明の更により好ましい態様として、 実 測線維化率 F i と D x ίの回帰直線から、 実測線維化率不明のサンプルの肝線維化率を 予測することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。
更に、この発明は、その別の好ましい態様として、予測に使用する遺伝子数をクロス■ バリデーション法で決定することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提 供する。 そのより好ましい態様として、 算出予測肝線維化率 Φχΐと実測肝線維化率 F i から、 1サンプル当たりの誤差 ε χを下記式 （3 ) に従って算出し、 誤差ど Xが最小に なるときの遺伝子数を実際の予測に用いることからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選 択法を提供する。
その上、 この発明は、 そのより好ましい態様として、 遺伝子数が 3個ないし約 2 0 0 個、 好ましくは約 1 7 0個以下、 より好ましくは約 1 2 0個以下、 つまり、 好ましくは 3個ないし約 1 0 0個、 特に 3個ないし約 5 0個の範囲であることからなる肝障害関連 遺伝子群の抽出選択法を提供する。
この発明はまた、 肝炎、 肝硬変などの肝障害ならびにその重症度や度合いなどを肝線 維化率によつて評価することからなる肝障害関連遺伝子群の抽出選択法を提供する。 更に、 この発明は、 上記抽出■選択方法により選択される肝障害関連遺伝子群に基づ いてまたは上記肝障害関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝機能の診断■評価する 方法と共に、 肝障害の診断■評価または治療することからなる方法を提供する。
上記方法に加えて、 この発明は、 上記抽出 '選択方法によリ還択される肝障害関連遺 伝子群の発現パターンを集中的に発生するように所定の発現パターンを有する遺伝子 を配置しているマイクロアレイなどの遺伝子発現解析デ /《イスなどの遺伝子発現解析 システムを提供する。
更にまた、 この発明は、 その別の実施態様として、 この発明に係る肝障害関違遺伝子 群の抽出選択法によって肝障害の評価を行うために、 2 1 Gより細い針で組織を採取す ることからなる組織の採取方法を提供する。
図面の簡単な説明
図 1は、 肝線維化率のスコア化のための遺伝子数決定を示ず説明図である。
図 2は、 肝障害 （肝線維化） 関連 9 5遺伝子を用いたラット肝線維化率予測の妥当性 を示す図である。
図 3は、 肝障害 （肝線維化） 関連 8 3遺伝子を用いたラット肝線維化率予測の妥当性 を示す図である。
図 4は、 肝障害 （肝線維化） 関連 3 7遺伝子を用いたラッ卜肝線維化率予測の妥当性 を示す図である。
図 5は、 各症例と肝線維化率との相関関係を示すグラフである。
図 6は、 各症例と G P T値との相関関係を示すグラフである。
図 7は、 各症例と新犬山分類に基づく G r a d i n gとの相関関係を示すグラフであ る。
発明を実施するための最良の形態
この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、 肝組織などの検体から肝障害に 関連する機能を有する肝障害関連遺伝子の発現パターンを抽出して肝障害関連遺伝子 群を選択することから構成されている。
つまり、 この発明の抽出選択方法は、 肝障害関連遺伝子の中から、 肝障害関連要因に 基づいて統計学手法を使用して、 所定の発現パターンを有する肝障害関連遺伝子を抽出 選択することによって実施することができる。
ここで、 この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法について基礎的検討と臨 床的検討の観点から説明する。
まず、 この発明の抽出選択方法によって抽出選択した肝障害関連遺伝子群に対する基 礎的検討について説明する。
この発明については、 ラット肝硬変モデルを例として使用して基礎的検討を行なうこ とができる。 そのために使用するラッ卜肝硬変モデルは当該技術分野で慣用されている 方法に従って作製することができる。
なお、 この発明に係る抽出選択方法は、 ラッ卜肝硬変モデル以外のその他の動物の実 験モデルを使用しても同様に基礎的検討を行なうことができる。 また、 その他の動物の 宾験モデルもラッ卜肝硬変モデル同様に当該技術分野で慣用されている方法に従って 作製することができる。
このようにして作製したラッ卜肝硬変モデルの肝朧標本は、 肝線維化された組織を染 色する染色法、 例えばァザン （A Z A N ) 染色によって染色し、 その標本組織の面積全 体に対する染色組織の面積の比率を算出する。 以下、 この面積比を肝線維化率とする。 この発明において、 検体から肝障害に関連する肝障害関連遺伝子の発現 （つまリ、 遺 伝子プロファイル） は、 肝障害関連遺伝子を含む数千ないし数万個の遺伝子を固定した マイクロアレイなどの遺伝子発現解析デバイスなどを用いて検出することができる。 か かるマイクロアレイとしては、 例えば、 市販されている D N Aチップゃォリゴァレイチ ップなどを使用することができる。 また、 遺伝子の発現方法にしても、 当該技術分野で 慣用されている方法によって行うことができる。
このようにして発現した遺伝子について、 肝障害関連要因に基づいて統計学手法を使 用して、 所定の発現パターンを有する複数の肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遺伝 子群が抽出選択される。
ここで、 ここで使用することができる肝障害関連要因としては、 例えば、 肝障害、 肝 炎活動性、 肝線維化率などで示す肝線維化の程度を使用することができる。 また、 肝障 害としては、 例えば、 肝炎、 肝硬変、 肝がんなどの肝疾患をその指標として使用するこ とができる。
統計学手法としては、 例えば、 スーパーバイズド . リーニング法（supervised leaning method),サポ一卜'ベクタ一'レグレツション法 (support vector regression method) 変数増加法ならびにこれらを組み合わせた解析法などが使用することができる。 また、 スーパーバイズド 'リーニング法としては、例えば、 リーブワンァゥト (leave-one-out) 法などが挙げられる。
そこで、 以下、 肝障害要因の 1つである肝線維化率を指標として使用した場合を例に 取り、 この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法について説明する。
つまり、 上記したように、 慣用方法で作製したラット肝硬変モデルについての肝線維 化率をァザン染色による面積比によって算出し、 c D N Aマイクロアレイ法を用いて遺 伝子発現を解析する。 この解析により、 肝線維化率と相関関係が強い複数個の上位遺伝 子の発現パターンを選択し、 その発現パターンから算定される肝線維化予測値が肝線維 化率実測値と相関しているかどうかを検討する。 この検討結果に基づいて得られた遺伝 子プロファイルから肝障害関連遺伝子群を抽出し、 遺伝子発現によって肝線維化率の予 測式を決定する。 これによつて、 遺伝子発現パターンに基づいた肝線維化のスコア化を 実現することができる。 なお、 この肝障害関連遺伝子群の抽出は、 例えば、 ファント ' フエ一 （van'tVeer) らの方法に準じて行うことができる （van't Veer, LI, et al.: Nature 2002; 415:530-536)。
この発明において、 遺伝子プロフアイルから肝障害関連遺伝子群の抽出を行うために は、 肝障害関連遺伝子を下記式 （1 ) に従って同定することができる。
Figure imgf000007_0001
(式中、 R jは、 試験サンプル数 mを用いて計算した実測線維化率 F i
( i = 1 , 2， 3, ···, m) と遺伝子 j ( j = 1 , 2， 3，···，
η) の発現量 Ε i jのピアソン （P e a r s o n) の相関係数 を表わす）。
この発明では、 上記式 （1 ) において、 上記ピアソン相関係数 R jの絶対値が高い遺 伝子を肝線維化と関連が強い肝障害関連遺伝子であると同定することができる。
次ぎに、 下記式 （2) に従って予測肝線維化率を算出する。
Figure imgf000007_0002
(式中、 D x iは、 肝線維化関連遺伝子 x個について計算した正常サンプ
ルでの発現の平均値 E j 0=1, 2, 3... X)と各ラッ卜の遺伝子発現 量 E i jのピアソンの相関係数を表す）。
上記式 （2) において、 上記ピアソンの相関係数 D X ίが 1に近いサンプル ί を肝線 維化率が 0%に近いものと予測して、 実測線維化率 F iと D x iの回帰直線から、 実測 線維化率が不明のサンプルの肝線維化率を予測することができる。
続いて、 予測に用いる遺伝子数 Xの決定を行う。 この決定は下記式 （3) に準じたク ロスバリデーション（Cross validation)法で行いことができる。（van't Veer, L.J., et al.: ibid)。
Figure imgf000007_0003
m
上記式 （3) において、 試験サンプル中の 1サンプルを除外し、 残り （m— 1 ) のサ ンプルから、 除外した 1サンプルの線維化率を予測し (leave-one out法）、 このこ とをすベての試験サンプルで繰り返し、 実測線維化率 F iと予測線維化率 から、 1 サンプル当たりの誤差ど Xを算出する。 12
7 更に、 誤差ど xが最小になるときの遺伝子数を算出する。 この算出は、 肝線維化と関 連の強い 5遺伝子から開始し、 1遺伝子ずつ増やして 2 0 0遺伝子まで誤差 s xを計算 し、 誤差 が最小となるときの遺伝子数を実際の予測に用いることにする。
上記手法に従って算出された誤差 ε χが最小になるときの遺伝子数は、 下表に列挙さ れている肝障害関連遗伝子から選択される約 3個ないし約 2 0 0個で るのがよい。 ま た、 好ましい遺伝子数は、 約 1 7 0個以下であり、 更に好ましい遺伝子数は、 約 1 2 0 個以下、 つまり、 更に好ましくは 3個〜約 1 0 0個、 特に 3個〜約 5 0個の範囲である のがよい。
なお、 遗伝子は、 下表のラットまたはマウス遺伝子リストから任意に選択することが できる。
表 1 ：
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
95 Rat mRNA for nucleoside diphosphate kinase beta isoform, D13374 complete cds.
96 Rat Wistar transforming growth factor beta-3 mRNA, complete U03491 cds.
97 Rat T PM-2 mRNA, complete cds. 嶋 723
98 Mouse Ankhzn mRNA, complete cds. AB011370
99 Mouse myo-inositol 1 -phosphate synthase Al (IsynAl) mRNA, AF288525 complete cds.
100 Rat Ig active kappa-chain mRNA VJC-region from immuno-cytoma M 14434 IR2.
101 Rat DiMA for nucleoside diphosphate kinase alpha isoform, partial D89068 cds.
102 Rat cholesterol 7-alpha-hydroxylase gene, exon 6. M59189
103 Mouse MHC (Qa) Q2-k gene for class I antigen, intron 3 part. X16515
104 Mouse UNC51.1 serine/threonine kinase (Unc51.1) mRNA, AF072370 complete cds.
105 dipeptidyl peptidase 8 AAG29767
106 predicted using Genefinder; preliminary prediction CAB60938
107 Rat secretory carrier membrane protein 2 mRNA, partial cds. AF295405
108 Rat mRNA for retinoic acid X receptor gamma-1, partial. AJ223083
109 Mouse mRNA for histone deacetylase. X98207
110 Rat Eker rat-associated intracisternal-A-particle element. U23776
111 Rat glycoprotein-39 precursor, mRNA, partial cds. AF062038
112 Rat mRNA for myosin regulatory light chain, complete cds. D14688
113 Rat mRNA for novel golgi-associated protein GCP360, complete D25543 cds.
114 Rat G-protein betal subunit (rGbl) mRNA, complete cds. U88324
115 Rat mRNA for ribosomal protein L7a. X15013
116 Rat Sprague-Dawley cytochrome P450 (CYPIBI) mRNA, U09540 complete cds.
117 Rat p41-Arc mRNA, complete cds. AF083269
118 Mouse testis - specific chromodomain Y-like protein (Cdyl) mRNA, AF081261 alternatively processed, complete cds.
119 Rat PMSG-induced ovarian mRNA, 3'sequence, N7. D84484
120 Rat plasma membrane Ca2+ ATPase-isoform 1 mRNA, completeコ 03753 cds.
121 Mouse npdc-1 mRNA for npdcf-1 protein. X67209
122 Mouse Magoh mRNA, complete cds. D26107
123 Rat tissue-type liver thioredoxin reductase 1 mRNA, complete cds. AF220760
124 Rat tyrosine kinase receptor (Ptk-3) gene, complete cds. L26525
125 Mouse inhibitor protein of cAMP-dependent protein kinase, M63554 complete cds.
126 Rat mRNA for DNA cytosine 5 methyltransferase, complete cds. AB012214
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
1■i 8 on9 Rat ΠΊΚΙ Α Tor membrane-type matrix metdlloprotesse. O"3匚っ" 7
AO DD /
190 Mouse aiconoi dehydrogenase ranio ITIKIMA, complete cos.
191 Mouse Down syndrome candidate region 1-like protein 1 (Dscrlll) Ar o/oo/ mRNA, complete cds.
192 Rat tos- eiateo antigen DMA, ΘΧΟΠ 4.
193 Rat protein-tyrosine-phosphatase (LRP) mRNA, complete cds. LUl/U
194 1 P-Dinoing proiein ara AAU4U /Z
195 Rat mRNA for ribosomal protein L14. X94242
196 Rat mR A for 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bis-phospha- X15579
tase (clone RL2K-5c, EC 2.7.1.105 / EC 3.1.3.46).
197 Rat mRNA for granzyme-like protein II. X68657
198 Rat prosね sin mRNA, complete cds. AF202076
199 14-3-3 protein gamma subtype=putative protein kinase C S55305
regulatory
protein「rats, brain, mRNA, 3410 nt].
200 Rat dithiolethione-inducible gene-1 (DIG-1) mRNA, complete cds. U66322
201 Rat mRNA for ibal, ionized calcium binding adapter molecule 1, D82069
complete cds.
202 Mouse zinc finger protein mRNA. L28167
203 Mouse mRNA for Rho guanine nucleotide- exchange factor, AJ010045 splice variant NET1A.
204 Mouse mRNA fragment. L31927
205 Rat PMSG-induced ovarian mRNA, 3'sequence, N4. D84482
206 Rat peripheral plasma membrane protein CASK mRNA, complete U47110
cds.
207 Mouse major histocompatibility locus class III regions Hsc70t AF109905 gene,
nartial cds' smRNP, G7A NG? MutS homoloa CLCP, IMG24,
NG25,
and NG26 genes, complete cds; and unknown genes.
208 Rat IgE binding protein mRNA, complete cds. J02962
209 Rat amino acid transporter system A (ATA2) mRNA, complete cds. AF249673
210 Mouse cell surface antigen AA4 (AA4) mRNA, complete cds. AF081789 上記基礎的検討の結果から、 この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、 肝 線維化率と相関が強い上位遺伝子の発現パターンにより算出される肝線維化率予測値
(定量化スコア） が、 肝線維化率実測値と極めて高い相関を示すところから、 この方法 によるスコア化は妥当と判断することができる。 したがって、 このことから、 この発明 の肝障害関連遺伝子群の抽出選択法は、 年齢，性■肝障害の要因などを統一した肝硬変 モデルにおいては、 肝障害関連遺伝子の発現パターンのみを検索することによリ肝線維 化の程度を評価することができる。 次に、 この発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法についての臨床的検討につい て、 かかる基礎的検討結果を踏まえて説明する。
この臨床的検討は、 例えば、 肝がん患者の非癌部切除標本を用いて D N Aマイクロア レイ解析をすることによって行なうことができる。 つまり、 所定の施設の倫理委員会の 承認ならびに患者ィンフォームドコンセン卜取得のもと非癌部切除標本を镲取し、 D Aマイクロアレイ解析を行ない、 ァザン染色による面積比に基づいて肝線維化率を算出 する。 ここで測定する線維化率は、 広範かつ十分量の切除肝組織によってのみ決定され る指標であり、 肝生検組織などの他の評価法では決定できない肝線維化の程度を評価す る教師値としての指標である。 D M Aマイクロアレイ解析結漀と実測肝線維化率との関 連より、 例えば、 サポート 'ベクター ' レグレツシヨン法と変数増加法とを組み合わせ た解析法を用いて、 表 2に示すような肝障害関連遺伝子から肝障害関連遺伝子群を決定 することができる。 かかる肝障害遺伝子群を構成する遺伝子を用いて算出できる肝線維 化率の定量化スコアは、 実測線維化率と良く相関している。 また、 その相関は、 スーパ 一バイズド， リーニング法であるリーブワンアウト法を用いても良好である。 更に、 同 様の症例において、この実測線維化率は、既存の肝機能検査（肝線維化マーカーを含む）、 つまり、 I V型コラーゲン、 I C G R、 P T、 アルブミン値、血小板数、 ヒアルロン酸、 へパプラスチンテストとも相関を示している。 したがって、 教師値としての実測線維化 率を最も反映する既存の指標は、 遺伝子発現パターンに基づく定量化スコアを用いるこ とで、 その精度を格段に向上させることができる。
一方、 肝炎活動性の指標の 1つである G P T値を用いて、 肝炎活動性関連遺伝子群を 選択することができる。 つまり、 G P T値と非癌部切除標本の D N Aマクコロアレイ解 析結果から、 例えば、 サポート■ベクター■ レグレツシヨン法と変数増加法とを組み合 わせた解析法を用いて、 表 2に示すような遺伝子から遺伝子群を決定することができる c このようにして選択した肝障害関連遺伝子群を用いて決定した肝炎活動性の定量化ス コアは、 G P T値と良く相関し、 またリーブワンアウト法を用いてもその相関は比較的 良好である。
更に、 もう一つの肝炎活動性の指標である新犬山分類に基づいて決定した Grading (AO A3、 2人の肝臓病理医の Grading スコアの平均値を用いた） と肝がんの切除非が ん組織の D N Aマイクロアレイ解析結果より、 例えば、 サポート 'ベクタ一 ' レグレツ ション法と変数増加法とを組み合わせた解析法を用いて、 表 2に示すような肝障害関連 遺伝子から肝障害関連遺伝子群を決定することができる。 これらの遺伝子を用いて決定 した肝炎活動性の定量化スコアは、同様な症例において、組織学的な Grading と良く相 関し、 またその相関はスーパーバイズド ' リーニング法であるリーブワンアウト法を用 いても良好である。 Gene definition NCBI
Accession iiunioer
Human genomic DMA, chromosome 21q, section 60/105. AP001716
Human mRNA for complement component Clr. BG878337
Human high mobility group box (SSRPl) mRNA, complete cds. 嶋 737
Human, S100 calcium-binding protein P, clone MGC:5028 AI148603 IHAGE:3448490, mRNA, complete cds
Human (chromosome X) glypican (GPC3) mRNA, complete cds. AL543321
Human protein phosphatase 2C alpha 2 mRNA, complete cds. AF070670
Human cDNA: FU21886 fis, clone HEP03022. A 025539 cyclin Gl BC000196 splicing factor 3b, subunit 3, 130kD BC003146
Human cDNA FU12255 fis, clone MAMMA1001476, highly similar AK022317 to URIDINE KINASE (EC 2.7.1.48).
Human pephBGT-1 betaine-GABA transporter mRNA, complete U27699 cds.
Human thrombospondin 2 (THBS2) mRNA, complete cds. LI 2350
Human subtilisin-like protein (PACE4) mRNA, complete cds. 隱 482
Human 54 kDa progesterone receptor-associated immunophilin U42031 FKBP54 mRNA, partial cds.
Human mRNA for fibroblast tropomyosin TM30 (pi). X05276 hypothetical SBBI03 protein BC012199
Human mRNA- cDNA DKFZD586D2322 ("from clone AL049455 DKFZp586D2322).
Human stress responsive serine/threonine protein kinase Krs-2 U60207 mRNA, complete cds.
TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polyBG164482 merase II, G, 32kD
Human, protein phosphatase 2, regulatory subunit B (B56), delta BC001095 isoform, clone MGC:3277 IMAGE:3507280, mRNA, complete cds.
Human lysyl oxidase-like 3 protein (LOXL3) mRNA, complete cds. AF311313 zinc finger protein 220 AA777633
Huma一n gコlutーamate transp「orter mRNA, / comp「lete cds. U08989
Human clone ras卜 1 matrix metalloprotease RASI-1 mRNA, U37791 complete cds.
predicted using Genefinder^contains similarity to Pfam domain: CAA21631 PF00465 (Iron-containing alcohol dehydrogenases), Score=177.7,
E-value=1.9e-50, N=2~cDNA EST EMBL:Z14517 comes from
this gene; cDNA EST ykl8d4.3 comes from this gene c
Human hairy (HRY) mRNA, complete cds. BG290521 putative BAB27264 つ o interferon, aipna-inducible protein d o BnG5 "35 c~70n
/iy
29 small inducible cytokine subfamily B (Cys - X-Cys), member 10 NM— 001565
3ゥ Λ0 proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 9 (large AW005503
M iUIlliUnCtlunal rOtcdSc ZJ
丄 ΠυΓΠαι 1 Ldl I l i I I^JIA. DT-ZZO
-γ) Hi imsn mRM A fn H I Δ-Π ls c TT ΏΠΗΠ Π Π 1 rhsin
33 small inducible cytokine subfamily B (Cys-X-Cys), member 10 NM_001565
34 Human ubiquitin-like protein FAT10 (FAT10) m MA, complete cds. AF123050
35 Human mRNA for polyA binding protein. Y00345
36 Human defensin-related pseudogene sequence. U10267
37 Human mRiMA for HLA-D class II antigen DR1 beta chain. X03069 なお、 上記遺伝子リス卜は、 この発明にて抽出選択される肝障害関連遺伝子を制限す るものではなく、 かかる遺伝子を例示的に記載したものであって、 上記遺伝子リストに 記載されていない遺伝子であっても肝障害関連遺伝子であればいずれもこの発明に適 用することができる。
更に、 この発明は、 上記肝障害関連遺伝子群の抽出選択法によって選択した肝障害関 連遺伝子群またはその発現パターンに基づいて肝障害もしくは肝機能または肝障害の 度合いや重症度などの病態を評価または診断をすることができる評価■診断方法を提供 する。
その上、 この発明は、 上記肝障害関連遺伝子群の抽出選択法によって選択した肝障害 関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝障害の程度や重症度などの病態などを評価 もしくは診断することにより肝炎、 肝硬変、 肝がんなどの疾患を含む肝障害を治療する 肝障害治療方法を提供することができる。
上記方法に加えて、 この発明は、 上記肝障害関連遺伝子群の抽出選択法によって選択 した肝障害関連遺伝子から主に構成される肝障害関連遺伝子群を集中的に配置した遺 伝子発現解析デバイスなどを含む肝障害遺伝子発現用解析システムを提供することが できる。 この肝障害遺伝子発現用解析システムを使用することによって、 肝障害に関連 する遺伝子群をより迅速にかつ簡便に抽出選択することができる。 また、 かかる肝障害 関連遺伝子群の発現パターンを解析することによって、 肝障害の種類ばかりではなく、 肝障害の度合いや重症度までも評価■診断することができる。
この発明に係る抽出選択方法を臨床応用する場合、 標本の採取は肝生検によることが 想定される。 そこで、 同一症例の非癌肝組織より 18G、 20Gの生検針にて肝組織を採取 し、 切除組織と遺伝子発現パターンとの比較について検討する。
解析で有意差を認める多数の遺伝子において、 生検組織と切除組織との相関係数も、 一致率も非常に高いことが判明した。 また、 クラスター解析でも 1つのクラスターに分 類される。 20Gの肝生検針にて解析に必要な量の total RNAを採取可能であり、 極細の 肝生検針にて採取した極く微量の組織にて非癌部切除標本にて得られた解析結果と同 様の評価が可能であると考えられる。
ところで、 現在の肝生検による病理学的評価では、 病理医の主観が入り決して客観的 評価とはなりえない。 新犬山分類の場合、 4ないし 5段階の評価 （単なるグルーピング で定量性に劣る〉 であリ、 例えぱ同じ F2でも F1に近い F2と F3に近い F2では大きく 異なっている。これに対して、 この発明の抽出選択方法による定量化スコアを用いれば、 客観的かつ詳細な数値として肝障害度 （線維化や肝炎活動性） を評価できる。 更に、 肝 生検ではある一定以上の組織 （通常、 非癌肝組織の評価では 18G以上の針を用いる） が 必要であり、 これは科学の進歩によっても改善の余地は少ない。 一方、 分子遺伝学的手 法を用いたこの発明の定量化スコアでは、 従来では不可能であるような極細の針で低侵 襲下に組織を採取し解析可能である。
以下、 この発明を実施例によって更に詳細に説明する。 ただし、 この発明は、 下記実 施例によって一切限定されるものではない。
実施例 1 ：
(動物）
体重 1 0 0グラムないし 1 5 0グラムの雄ラット （ウィスター種） を、 実験開始前 7 日間標準研究用飼料と水を自由給餌し、 1 2時間サイクルで灯火と暗室とを繰り返すよ うに制御した動物飼育舎で所定のガイドラインに沿って飼育した。
(チオアセタミド誘導肝硬変）
2 0頭のラッ卜に 0 . 0 3 %のチオアセタミドを含む飲料水を 1 2週間継続して投与 して肝線維化を誘導した （非特許文献） 。 チオアセタミドを投与せずに更に 2週間同一 条件下で飼育してチオアセタミ ドを除去した後、 動物を実験に供した。
(組織サンプリング）
ラットを人為的に殺して肝臓組織を摘出し、 組織標本の一部を 1 0 %ホルムアルデヒ ド溶液中に浸潰し、ァザン （a Z a n ) 染色のためにパラフィン中に包埋した。 残りの 肝臓組織標本は RNA調製まで一 9 0 °Cで冷凍保存した。
(組織切片の調製ならびに肝線維化領域の測定）
1 0 %ホルムアルデヒド溶液中に固定した各肝臓組織標本から厚さ 5ミクロンの切 片を取り、 コラーゲン線維に対してァザンで染色した。 これらの切片の画像 5枚を任意 に選択し、 光学顕微鏡を用いて 4 0倍の倍率でカラー写真を撮影した。 これらの写真を コンピューターに入力した。 画像中の全領域に対するコラーゲン線維を発現しているァ ザン染色領域の割合を 「実測肝線維化率 （％) 」 として計算した。
(R A調製）
全肝臓 RNAを冷凍保存した組織標本から Q u i c k P r e p全 R N A抽出キット (Amersham Pharmacia Biotech) を用いたグアジニゥム /セシウム卜リフルォロ アセテート抽出法によって調製した。 単離した の濃度と純度はバイオアナライザー (アジレン卜 2100) によって決定した。 (標識、 ハイブリダィゼーシヨンならびにスキャンニング）
チオアセタミドを投与して損傷した肝臓組織の標本と、 正常な肝臓組織からの全 RNA の 20マイクログラムを、 C y 5—デォキシゥリジントリホスフェート （d U T P) と C y 3— d U T Pでそれぞれ標識した。 標識したプローブを、 1 4000個以上のクロ —ンを搭載した市販ラッ卜 c D N Aマイクロアレイキット （A g i l e n t ) を用いて、 ハイブリダイゼーシヨンバッファ中で 6 5 °C 1 2時間ないし 1 4時間ハイブリダイズ した。 ハイブリダィゼーシヨン後、 スライドを洗浄し、 共焦レーザ一スキャナー （A g i I e n t )でスキャンした。各ハイブリダィゼーシヨンシグナルの強度は定量化して、 その値をバックグラウンドレベルで補正して適正化した。
(肝障害関連遺伝子の同定および定量化スコアの算出法）
(肝線維化関連遺伝子の同定）
下記式 （4) (上記式 （1 ) にいて m= 20) に従って、 2 0頭の試験サンプルを用 いて、 実測線維化率 F i ( ί =1, 2, 3, ..., 20) と遺伝子 j ( j =1, 2, 3, ...,η) の発現量 (E i j ) の Pearsonの相関係数 （R j ) を、 計算した。
20∑ (^^)-(∑ )-(∑^
F
Eij)
(予測のための遺伝子数決定）
更に、 予測に用いる遺伝子数 Xを決定は、 上記クロス■バリデーシヨン法によって決 定した。 更に、 上記式 （3) (m= 20) に従って、 上記実測線維化率 F i と予測線維 化率 0xiから、 1頭当たりの誤差ど Xを算出し、 誤差 εχが最小になる遺伝子数を決定 した （図 1、 2)。 この実施態様においては、 肝障害関連遺伝子群は 9 5個の遺伝子か ら構成されていた。
表 3 ：
Gene definition NCBI
Accession number
1 Rat cytokeratin 8 polypeptide mRNA, complete cds. M63482
2 Rat gene encoding aldolase A, exon 1. X04260
3 Rat brain creatine kinase mRNA, complete cds.
4 Rat mRNA for ezrin p81. X67788
5 Rat mRNA for MHC class II antigen RT1.B-1 beta-chain. X56596
6 Rat mRNA encoding alpha-tubulin. V01227
7 Rat mRNA for D6.1A protein. Y13275
8 Rat fibroblast growth factor receptor 3 (Fgfr3) mRNA, complete AF277717 cds.
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
本実施例において、 肝線維化率と相関が強い上記上位 9 5遺伝子の発現パターンに基 づいて算定された肝線維化率は、実測肝線維化率と極めてよく相関している（図 1、 2 )。 また、 上記 2 0頭 （Training Sample) において、 肝線維化率と相関する上記 9 5遺伝 子の発現パターンを解析することによって、全く独立する別の 6頭 （Test Sample) の肝 線維化率を予測することができた。 すなわち、 分子遺伝学的に肝線維化率を評価可能で あることが、 supervised leaning法によって実証された。
実施例 2：
1 8頭の Training Sampleを使用して実施例 1と同様に処理して決定したところ、 肝 障害関連遺伝子群は 8 3個の遺伝子から構成されていた。
本実施例においても、 肝線維化率と相関が強い上記上位 8 3遺伝子の発現パターンに 基づいて算定された肝線維化率は、実測肝線維化率と極めてよく相関している（図 3 )。 表 4 ：
Gene definition NCBI
Accession number
1 Rat thymosin beta-10 gene, complete cds. M58405
2 Rat cytokeratin 8 polypeptide mRNA, complete cds. M63482
3 Rat heat stable antigen CD24 mRNA, complete cds. U49062
4 Rat mRNA for carbonic anhydrase II. X58294
5 Rat tetraspan protein LRTM4 (LRTM4) mRNA, complete cds. AF205717
6 Rat (diabetic BB) MHC class II alpha chain RT1.D alpha (u . Y00480
7 Incyte EST
8 Rat m IMA for D6.1A protein. Y13275
9 Rat growth response protein (CL-6) mRNA, complete cds. L13619
10 Rat aldehyde dehydrogenase mRNA, complete cds. M23995 Incyte EST
Mouse transgelin mRNA, complete cds. AF149291
Rat mRNA for ezrin p81. X67788
Mouse beta chemokine Exodus-2 mRNA, complete cds. U88322
Rat mRMA for MHC class Π-associated invariant chain. X14254
Rat mRNA for MHC class Il-associated invariant chain.
Rat thymosin beta-10 gene, complete cds. N58405
Rat protocadherin (Fat) mRNA, complete cds. AF100960
Mouse myo-inositol 1-phosphate synthase Al (IsynAl) mRNA, AF288525 complete cds.
Mouse Ig J chain mRNA, partial cds. X78604
Rat gene encoding aldolase A, exon 1. X04260
Rat tissue-type liver thioredoxin reductase 1 mRNA, complete cds. AF220760
Rat Ig germline alpha H-chain C-region gene, exon 2 (partial) M13801 and exon 3.
Rat mRNA for ribosomal protein S5. X58465
Incyte EST
Incyte EST
Mouse clone M2-2 transcription factor USF2 mRNA, complete cds. U01662
Rat Bcl-2-related ovarian killer protein (Bok) mRNA, complete cds. AF027954
Incyte EST
Rat ribosomal protein L5 mRNA, complete cds. M17419
Rat epoxide hydrolase mRNA, complete cds. M26125
Ran— GTP binding protein 5 CAA70103
Rat fibroblast growth factor receptor 3 (Fgfr3) mRNA, complete cds. AF277717
Incyte EST
Rat aflatoxin Bl aldehyde reductase (AFAR) mRNA, complete cds. AF045464
Rat mRNA for plasma glutathione peroxidase precursor, D00680 complete cds.
monocyte/neutrophil elastase inhibitor AAC31394
Rat mRNA for MHC class II antigen RTl.B-1 beta-chain. X56596
Rat mRNA for Nogo-C protein. AJ242963
Rat mRNA for the cysteine protease inhibitor cystatin C. X16957
Incyte EST
Rat dithiolethione-inducible gene-1 (DIG-1) mRNA, complete cds. U66322
Rat agrin mRNA, complete cds. M64780
Rat mRNA for protein kinase C-eta. X68400
Mouse AKR1C13 mRNA for aldo-keto reductase AKR1C13, AB027125 complete cds.
Rat mRNA for calpactin I heavy chain. X66871
Incyte EST
Rat mRNA for cyclin Dl, complete cds. D14014
Mouse synexin mRNA, complete cds. L13129
Figure imgf000024_0001
害施例 3 1 9頭の Training Sampleを使用して実施例 1と同様に処理して決定したところ、 肝 障害関連遺伝子群は 3 7個の遺伝子から構成されていた。
本宾施例においても、 肝線維化率と相関が強い上記上位 3 7遺伝子の発現パターン (；: 基づいて算定された肝線維化率は、実測肝線維化率と極めてよく相関している（図 4 )。
Figure imgf000025_0001
32 Incyte EST
J3 Rat mKNA ror tne cysteine protease inniDitor cystatinし. xi yD/
34 Rat sodium-dependent high-affinity dicarboxylate transporter AF081825 fNADC3) m陽， complete cds.
35 poly(A)-binding protein testis - specific isoform; PABPT 觸 70164
36 Rat mRNA for fatty acid synthase (EC 2.3.1.85). X13415
37 Rat mRNA for cyclin Dl, complete cds. D14014 実施例 4： '
臨床的肝機能評価を次のようにして行った。
転移性肝がん 6例と肝がん 3 6例の切除非がん組織に対して、 D N Aチップ （1 2， 8 1 4遺伝子） を用いて D N Aマイクロアレイ解析を行った。
臨床的肝機能評価は、 I C G R 1 5値等の血液検査と病理所見を用いて行った。 その 結果、 I C G R 1 5値は、 肝線維化率と有意に相関があることが認められた。
また、 R T— P C R法による肝組織 T G F )S 1と T I M P— 1との遺伝子発現は、 肝 線維化率と有意に相関することが認められた。 更に、 D N Aマイクロアレイ解析によつ て肝線維化率と相関する遺伝子群を抽出すると、 正常肝群と、 肝硬変群とを完全にクラ スタ一分類することができた。
実施例 5：
肝がん 5 6例の切除非がん組織を用いてラット肝硬変モデルと同様にァザン （AZAN) 染色を行い、 実測線維化率を測定した。 本線維化率は 9視野 （4 0倍視野） の平均であ リ、 1 cm2以上の十分な量の切除肝組織によってのみ決定可能な指標であり、 肝生検組 織などでは到底決定できない肝線維化の程度を評価する教師値としての指標である。 D N Aマイクロアレイ （アジレント社製、 約 13,000遺伝子搭載） の解析結果と実測線維 化率との関連よリ、 サポート■べクタ一 · レワレツシヨン （support vector regression) 法と変数増加法を組み合わせた解析法を用いて 2 7個の肝障害 （肝線維化） 関連遺伝子 群を決定した （表 6 )。 これら 2 7遺伝子を用いて算出した肝線維化の （遺伝子発現パ ターンに基づく） 定量化スコアは実測線維化率と良く相関した （R=0.94)。 スーパ一バ ィズド . リーニング法 （ SUppervised leaning method ) であるリーブワンアウト (leave-one-out) 法を用いても R=0.84 と良好であった （図 5 )。 同様の症例において 実測線維化率と既存の肝機能検査 （肝線維化マーカーを含む） との相関係数をみると、 良好な順に、 IV型コラーゲン： 0.65, ICGR15： 0.53、 PT： 0.51, アルブミン値： 0.45、 血小板数： 0.38、 ヒアルロン酸： 0.36、 へパプラスチンテスト： 0.28であった。
以上の如く、教師値としての実測線維化率に最も相関する既存の指標は IV型コラーゲ ン： 0.65 であるが、 遺伝子発現パターンに基づく定量化スコア： 0.94 を用いることで 格段に精度を向上可能であった。 表 6
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
実施例 6：
肝障害の中でも肝炎活動性の評価においては、 現在、 血液肝機能検査で ¾る G P T値 と組織学的に新犬山分類に基づいて決定する Grading (A0-A3)が用いられる。そこで、 肝がん 5 8例の切除非がん組織の D N Aマイクロアレイ解析結杲と G P T値よリサポ 一ト■ベクター■ レグレツシヨン法と変数増加法を組み合わせた解析法を用いて 5個の 肝障害 （肝炎活動性） 関連遺伝子群を決定した。 これら 5遺伝子を用いて決定した肝炎 活動性の （遺伝子発現パターンに基づく） 定量化スコアは training sample 4 6症例に おいて G P T値と良く相関した （R=0.61)。 スーパ一バイズド ' リ一ニング法であるリ ーブワンアウト法を用いても R=0.59 と良好であった。 また、 全く独立する 1 2症例に おいても R=0.61 と良好な相関を示した （表 7 , 図 6 )。
表 7 ：
Figure imgf000028_0002
実施例 7 :
別の肝炎活動性の指標である新犬山分類に基づいて決定する Grading (A0-A3, 今回 の検討では、 2人の肝臓病理医の Grading スコア の平均値を用いた） と肝がん 5 1例 の切除非がん組織の D N Aマイクロアレイ解析結果よリサポート 'ベクター ' レグレツ シヨン法と変数増加法を組み合わせた解析法を用いて 5個の肝障害 （肝炎活動性） 関連 遺伝子群を決定した。 これら 5遺伝子を用いて決定した肝炎活動性の （遺伝子発現バタ ーンに基づく） 定量化スコアは training sample 4 1症例において組織学的な Grading と良く相関した （R=0.64)。 スーパーバイズド ' リーニング法であるリーブワンアウト 法を用いても R=0.61 と良好であった。 また、 全く独立する 1 0症例においても R=0.76 と良好な相関を示した （表 8、 図 7 )。
¾ & ：
Gene definition NCBI
Accession number
1 interferon, alpha-inducible protein 27 BG535739 2 small inducible cytokine subfamily B (Cys-X-Cys), member 10 NM_001565
3 proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 9 (large AW005503 multifunctional protease 2)
4 Human can mRIMA. X64228
5 Human mRNA for HLA-D class II antigen DR1 beta chain. X03069 産業上の利用可能性
上記のような構成からなるこの発明に係る肝障害関連遺伝子群の抽出選択方法は、 肝 炎活動性や肝線維化などを含む肝障害などを評価するためのよリ正確でかつ包括的な 評価法として利用することができる。 また、 この発明の抽出選択法によって選択した肝 障害関連遺伝子群またはその発現パターンに基づいて肝障害もしくは肝機能または肝 障害の度合いや重症度などの病態を評価または診断をすることもできる。
また、臨床例においても、 D N Aマイクロアレイ法は、肝機能を分類することができ、 I C G R 1 5値や病理所見単独では判定困難な症例でも評価ができる可能性がある。 更に、 この発明によれば、 肝機能検査をするための肝生検をする場合に、 2 1 Gより も細い針で行うことができるようになり、 検査を受ける患者にとって負担を非常に少な くすることができることになリ極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 検体における肝障害に関連する肝障害関連遺伝子の発現パターンを抽出し、 所定 の発現パターンを有する複数の該肝障害関連遺伝子からなる肝障害関連遣伝子群を選 択することを特徵とする肝障窖関遑迫伝子群の抽出選択法。
2 . 請求の範囲 1に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 前記肝障害 関連遺伝子の発現パターンを遺伝子発現解析システムによって得ることを特徴とする 肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
3 . 請求の範囲 1または 2に記載する肝障害関遑遺伝子群の抽出選択法において、 前 記肝障害関連遺伝子群を肝障害関連要因に基づいて統計学的手法により抽出選択する ことを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
4 . 請求の範囲 1ないし 3のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択 法において、 前記肝障害関連要因が、 肝障害、 肝炎活動性または肝線維化率であること を特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
5 . 請求の範囲 4に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 前記肝障害 が肝炎、 肝硬変または肝がんであることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
6 . 請求の範囲 4または 5に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 前 記肝障害が更にその重症度を評価することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選 択法。
7 . 請求の範囲 4に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 前記肝線維 化率が実測線維化率と予測線維化率との相関関係に基づいて決定されることを特徴と する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
8 . 請求の範囲 4に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 前記肝線維 化率が組織検査により染色される面積比に基づいて決定されることを特徴とする肝障 害関連遺伝子群の抽出選択法。
9 . 請求の範囲 3ないし 8のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択 法において、 前記統計学的手法が、 スーパーバイズド■ リーニング法、 サポート■べク ター . レグレツシヨンもしくは変数增加法またはそれらを組み合わせた解析法であるこ とを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
1 0 . 請求の範囲 1ないし 9のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選 択法において、 前記肝障害関連遺伝子を下記式に基づいて同定することを特徴とする肝 障害関連遺伝子群の抽出選択法。
RJ _
Figure imgf000030_0001
(式中、 R jは、 試験サンプル数 mを用いて計算した実測線維化率 F i
( i = 1 , 2 , 3 , …， m) と遺伝子数 j ( j = 1 , 2 , 3 ,■■·, η ) の発現量 Ε i jのピアソン （P e a r s o r> ) の相関係数 を表わす）。
1 1 . 請求の範囲 1 0に記 aする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 R jの 絶対値が高い遺伝子を肝線維化と関違が強い肝障害関速遺伝子とすることを特徴とす る肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
1 2 . 請求の範囲 1 1に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 予測肝 線維化率を下記式に従って計算することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択 法。
Figure imgf000031_0001
(式中、 D x iは、 肝線維化関連遺伝子 x個について計算した正常サンプ
ルでの発現の平均値 E j (j=1，2, 3 x)と各ラッ卜の遺伝子発現 量 E i jのピアソンの相関係数を表す）。
1 3 . 請求の範囲 1 2に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 D x i が 1 に近いサンプル ίを肝線維化率が 0%に近いものと予測して、 実測線維化率 F i と D x iの回帰直線から、 実測線維化率が不明のサンプルの肝線維化率を予測すること特 徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
1 4 . 請求の範囲 7、 1 2および 1 3のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群 の抽出選択法において、 予測に使用する遺伝子数をクロス 'バリデ一シヨン法で決定す ることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
1 5 . 請求の範囲 7ないし 1 2〜1 4のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群 の抽出選択法において、 サンプル数 （m) から除外したサンプル 1個の肝線維化率を残 りのサンプル （m— 1 ) から予測し、 これを全てのサンプルに繰り返すことによって算 出した予測肝線維化率 Φ χ ί と実測肝線維化率 F iから、 1サンプル当たりの誤差ど Xを 下記式に従って算出することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
Figure imgf000031_0002
m
1 6 . 請求の範囲 1 5に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 誤差ど Xを、 肝線維化と関連の強い 5遺伝子から開始し、 1遺伝子ずつ増やして誤差 を計 算し、 誤差ど が最小となるときの遺伝子数を実際の予測に用いることを特徴とする肝 障害関連遺伝子群の抽出選択法。
1 7 . 請求の範囲 1ないし 1 6のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法において、 該遺伝子数が 3個ないし 2 0 0個であることを特徴とする肝障害関連 遣伝子群の抽出選択法。
1 8 . 請求の範囲 1ないし 1 7のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法において、 該遺伝子数が 1 7 0個以下であることを特徴とする肝障害関連遺伝子 群の抽出選択法。
1 9 . 請求の範囲 1ないし 1 8のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法において、 該遺伝子数が 1 2 0個以下であることを特徴とする肝障害関連遺伝子 群の抽出選択法。 ' 2 0 . 請求の範囲 1ないし 1 9のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法において、 該遺伝子数が 3個から 1 0 0個の範囲であることを特徴とする肝障害 関連遺伝子群の抽出選択法。
2 1 . 請求の範囲 1ないし 2 0のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法において、 該遺伝子数が 3個から 5 0個の範囲であることを特徴とする肝障害関 連遺伝子群の抽出選択法。
2 2 . 請求の範囲 1ないし 2 1のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法により選択した肝障害関連遺伝子群に基づいて肝障害または肝機能を評価また は診断することを特徴とする評価■診断方法。
2 3 . 請求の範囲 1ないし 2 1のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法により選択した肝障害関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝障害または肝 機能を評価または診断することを特徴とする評価■診断方法。
2 4 . 請求の範囲 2 2または 2 3に記載する評価■診断方法において、 前記肝障害も しくは前記肝機能の障害の度合いまたは重症度を評価または診断することを特徴とす る評価，診断方法。
2 5 . 請求の範囲 1ないし 2 1のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法により選択した肝障害関連遺伝子群に基づいて肝障害を治療することを特徴と する肝障害治療方法。
2 6 . 請求の範囲 1ないし 2 1のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出 選択法により選択した肝障害関連遺伝子群の発現パターンに基づいて肝障害を治療す ることを特徴とする肝障害治療方法。
2 7 . 請求の範囲 2 2ないし 2 4のいずれか 1項に記載する評価■診断方法に基づい て肝障害を治療することを特徴とする肝障害治療方法。
2 8 . 請求の範囲 1に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 前記検体 が組織または細胞であることを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択法。
2 9 . 請求の範囲 2 8に記載する肝障害関連遺伝子群の抽出選択法において、 前記組 織を 2 1 Gより小さい針で採取することを特徴とする肝障害関連遺伝子群の抽出選択 法。
3 0. 請求の範囲 1 7ないし 2 1のいずれか 1項に記載する肝障害関連遣伝子群の抽 出選択法により選択される肝障害関違遺伝子群を構成する遺伝子を集中的に配置する ことを特徴とする遺伝子発現解析システム。
3 1 . 請求の範囲 1 7ないし 2 1のいずれか 1項に記載する肝障害関連遺伝子群の抽 出選択法により選択される肝障害関連遺伝子群の遺伝子の発現パターンを集中的に配 置することを特徴とする遺伝子発現解析システム。
3 2 . 請求の範囲 3 0または 3 1に記載する遺伝子発現解析システムを用いて肝障害 または肝機能を診断または評価することを特徴とする診断■評価方法。
3 3 . 請求の範囲 3 2に記載する診断■評価方法に基 いて肝障害を治療することを 特徴とする治療方法。
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