TWI601826B

TWI601826B - 鑑定石斑魚性別之方法及套組

Info

Publication number: TWI601826B
Application number: TW102127151A
Authority: TW
Inventors: 陳宗嶽; 王廷瑜; 吳佳倩; 陳永茂; 徐浩軒; 吳志展
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2017-10-11
Also published as: TW201504437A

Description

鑑定石斑魚性別之方法及套組

本發明係有關一種性別鑑定技術。詳言之，本發明係關於一種利用特定基因表現量鑑定石斑魚性別之技術。

石斑魚(Epinephelus spp.)，分類上屬於硬骨魚總綱(Osteichthyes)、輻鰭魚綱(Actinopterygii)、新鰭亞綱(Neopterygii)、鱸形(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑魚屬(Epinephelus)。石斑魚為肉食之暖水性魚類，主要分佈於熱帶及亞熱帶海域，種類繁多，全世界約有400多種，除了可以食用之外，部分的石斑魚也具有觀賞的價值。石斑魚生長快速，肉質鮮美，深受海內外大眾喜愛，於是漁民積極繁殖飼養，石斑魚現今已被養殖界公認為亞太地區最重要之高經濟價值的食用魚種。

環視整個石斑魚養殖產業結構，一般石斑魚養殖至少需十二至十四個月才達上市體型，但目前最後的養成率都不高，僅達放養魚卵的0.3%。除了水生生物疾病外，魚卵孵化率低、仔魚畸形率高、及白身苗變態失敗等遺傳弱化現象皆造成水產養殖業者之經濟損失。再者，石斑魚為雌性先熟型之生物。在生殖腺發育中，卵巢部分先發育成熟為雌性相，隨著魚體生長，部份魚發生性轉化為雄性，因此雄性魚較難得到。於石斑魚種苗供應之各式問題中，如何早期且有效篩選出公母種魚進行培育，不僅是一個亟待解決的瓶頸更是節省生產成本的重要課題。在石斑魚種魚管理上，習知技術為於生殖季節時，觀察其生殖器特徵判斷雌雄石斑魚性別，其中雌性魚腹部膨大，并有三個孔，從前至后依次為肛門、生殖孔和泌尿孔，生殖孔呈暗紅色向外微張，自開口處有許多細紋向外輻射；而雄魚只有肛門和泌尿生殖孔，然而在非生殖季節則難以利用此特徵區分雌雄種魚。

富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)，也稱作osteonectin或BM40，其係為外泌型醣蛋白，可表現在骨細胞、纖維母細胞、血管內皮細胞、萊氏細胞(Leydig cells)、史托立細胞、黃體細胞等，其功能參與細胞與間質之間的連結及膠原蛋白的結合。過去研究顯示，小鼠在性別分化時期的史托立細胞會表現SPARC蛋白。現今已選殖出點帶石斑魚及龍膽石斑魚之SPARC基因，經全序列胺基酸分析結果，石斑魚SPARC胺基酸序列包含17個胺基酸的訊息胜肽(siganl peptide)及其他三個功能區域：酸性區(acidic dimain，18-70a.a.)、卵泡抑素區(Follistatin like domain，71-154a.a.)、細胞外鈣離子結合區(EC domain；extracellular calcium binding domain，155-303a.a.)。但過去並無石斑魚SPARC基因與性別鑑定之相關報導。

熱休克蛋白70(Heat Shock Protein 70，HSP70)家族有兩種成員，一種為持續表現型的HSC70(Heat Shock Cognate Protein)，一種則是在熱壓力下才表現的HSP70，熱休克蛋白可在熱壓力狀況下協助其他蛋白折疊、運輸和組裝成複合物。過去研究顯示HSP70家族蛋白表現在小鼠雄性生殖器官之精母細胞，並幫助消除減數分裂錯誤之生殖細胞，也可讓個體內的生殖細胞數保持恆定。點帶石斑魚之HSC70基因已選殖出，其全長為2409bp，共可轉譯出649個胺基酸，序列中包含熱休克蛋白家族70的三個特徵序列；在熱休克蛋白家族中，其C端會有一段高保守性的EEVD序列，其為共伴隨蛋白(co-chaperon)的結合位，共伴隨蛋白可幫助伴隨蛋白執行蛋白質折疊。在分析HSC70前端調控區之序列發現有多種蛋白結合作用區位置，其中較上游有三個SRY(Sex-determining Region Y)結合區域，是動物中調控雄性睪丸發育的蛋白，作用方式為與特定DNA序列結合，以調控下游基因序列的轉錄及轉譯。但過去並無石斑魚熱休克蛋白70基因與性別鑑定之相關報導。

職是之故，發展一可快速、操作簡單且準確檢測石斑魚性別之方法乃為業界所需。

本發明開發石斑魚性別鑑定技術，其可應用於早期篩選出石斑魚之性別，可提升種魚篩選效率，並可以較低的種魚培育成本提供石斑優質種苗供應，具多面效益。

本發明係提供一種鑑定石斑魚性別之方法，其包含檢測一待測石斑魚生殖器官細胞中富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)基因及HSC70基因之表現量及/或檢測該待測石斑魚非生殖器官細胞中HSC70基因之表現量，其中：如生殖器官細胞中SPARC基因之表現量大於HSC70基因之表現量或如生殖器官細胞中SPARC基因之表現量大於一已確定為雌性石斑魚之卵巢器官中SPARC基因之表現量，則該待測石斑魚為雄性；及如生殖器官細胞中HSC70基因之表現量大於SPARC基因之表現量或如生殖器官細胞中HSC70基因之表現量大於非生殖器官細胞中HSC70基因之表現量，則該待測石斑魚為雌性。

本發明另提供一種鑑定石斑魚性別之套組，其包含可用以檢測富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白基因表現量之寡核苷酸。

圖1顯示SPARC基因在卵巢及精巢之基因表現量結果圖。

圖2顯示HSC70基因在卵巢及精巢之基因表現量結果圖。

根據本發明之石斑魚係指分類上屬於硬骨魚總綱、輻鰭魚綱、新鰭亞綱、鱸形、鮨科、石斑魚屬之魚類。於本發明之較佳具體實施例中，該石斑魚係為瑪拉巴石斑(E.malabaricus)、點帶石斑(E.coioides)、鞍帶石斑(E.lanceolatus)、棕點石斑(E.fuscoguttatus)、黃鰭石斑(E.flavocaeruleus)、褐石石斑(E.bruneus)、七帶石斑(E.septemfasciatus)、棕點石斑(E.fuscoguttatus)、清水石斑(E.polyphekadion)、赤點石斑(E.akaara)、清石石斑(E.awoara)、藍身石斑(E.tukula)、玳瑁石斑(E.quoyanus)或布氏石斑(E.bleekeri)。

另一方面，根據本發明之石斑魚較佳係為種魚。

根據本發明之生殖器官係指與生殖相關之器官，較佳地，該生殖器官包含生殖腺。於本發明之具體實施例中，該生殖器官係為卵巢或精巢。

於本發明之較佳具體實施例中，該生殖器官細胞係經石斑魚生殖孔採樣而得，生殖孔位於石斑魚腹側近臀鰭部分，位於臀鰭前方處。於生殖孔內採集生殖器官細胞之方法例如以細管導入生殖孔內並抽取少量組織而得。

根據本發明之非生殖器官係指與生殖無關之器官。於本發明之具體實施例中，該非生殖器官係為鰭、鰓或肌肉。

根據本發明方法較佳係直接使用均質化後之生殖器官或非生殖器官，並使用適當之緩衝液適度溶解生殖器官或非生殖器官，並暴露核酸俾利後續之檢測反應進行，而不需完全自生殖器官或非生殖器官中純化核酸。均質化生殖器官或非生殖器官之方法係為可使生殖器官或非生殖器官均勻散佈於溶解緩衝液者，以使緩衝液中之成分可充分與生殖器官或非生殖器官反應，以適度溶解生殖器官或非生殖器官。於本發明之一較佳具體實施例中，係以磨碎方式均質化生殖器官或非生殖器官，並經進一步排除均質化生殖器官或非生殖器官懸浮物及不溶物外之溶液部分，較佳地，係離心該均質化生殖器官或非生殖器官，以取得澄清液。

根據本發明之檢測富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白基因及HSC70基因之表現量之方法可為檢測一基因表現量之方法，例如使用以雜合反應或反轉錄聚合酶連鎖反應檢測。

於本發明之具體實施例中，雜合反應係使用探針進行。

本文所使用之「探針」一詞係指一包含連續至少8個核苷酸的分子，較佳為連續10至50個核苷酸，更佳為連續15至40個核苷酸，最佳為連續17至27個核苷酸。另一方面，較佳地，探針之3’端包含8至10個胸腺嘧啶。該探針可與標的DNA於雜合條件下進行雜合反應。本發明所屬技術領域中具通常知識者可決定雜合反應之條件，其中該雜合反應之較佳條件係於約40℃至約65℃中進行。

探針設計原則如下：1.探針所在位置序列不常發生變異；2.探針長度介於17至27個核苷酸是最理想的範圍，探針過短會造成與目標DNA結合不易，過長容易產生非特異性的雜合反應；3.G+C比例介於40%至60%，以降低二級結構產生的機率；4.探針Tm值(melting temperature)盡可能的設計在介於雜合反應時的雜合溫度(hybridization temperature)±5℃之間。例如雜合溫度若設定在50℃，則探針的Tm值應該盡量為45℃至55℃；5.盡量避開可能會產生髮夾環結構(hairpin loops)、迴文結構(palindrome)或是重複鹼基(repeats)結構；設計完的探針經過BLAST搜索，以確定沒有與GenBank上其他基因的序列相似，避免交叉反應(cross hybridization)。

於本發明之較佳具體實施例中，可利用針對SPARC及HSC70具有不同標記之探針與源自石斑魚生殖器官或非生殖器官之細胞之核苷酸進行雜合，並藉由偵測標記種類以鑑定基因表現量之多寡，例如使用螢光作為標記，不同螢光標記之探針會與不同基因互補。

於本發明之具體實施例中，基因表現量檢測係以反轉錄聚合酶連鎖反應檢測進行。該反轉錄聚合酶連鎖反應係於聚合酶連鎖反應之前，先進行反轉錄反應聚合酶反應，以將源自石斑魚生殖器官細胞之mRNA合成為DNA。較佳地，該反轉錄聚合酶連鎖反應係為即時反轉錄聚合酶連鎖反應。本文中所言之「聚合酶連鎖反應」包含四個步驟：(1)使一模版進行變性，以形成兩單股；(2)使兩引子分別與步驟(1)之兩股進行黏附(annealing)；(3)以DNA聚合酶延伸該等引子；及(4)取得兩雙股之DNA。重複上述之諸等步驟，而一特定之DNA片段即可獲得擴增。「即時聚合酶連鎖反應」係為利用螢光偵測「聚合酶連鎖反應」之發生，並可以進行定量，並可從而推知參與反應之模版量。目前發展之即時聚合酶連鎖反應是在一個封閉式的反應管中，除了聚合酶連鎖反應所需的引子與鹼基外，一併將螢光訊號加入反應管中，再配合儀器逐週期偵測，便可達到同時擴增去氧核醣核酸且同時偵測訊號之功能。故即時聚合酶連鎖反應具有擴增完成可直接定量及不需後處理之優點，不僅省時省力，更可避免後處理所造成之污染。同時亦因逐週期紀錄的去氧核醣核酸螢光訊號，同時描繪出基因複製時之完整圖形，故具有較好之準確率與敏感性。另一方面，即時聚合酶連鎖反應可於數分鐘內完成大量之樣品檢測，不僅可節省時間，且自動化平行的操作，可大幅減低人為操作所造成之誤差。

於本發明一較佳具體實施例中，其係使用針對SPARC設計之引子對及針對HSC70設計之引子對進行聚合酶連鎖反應。此方法同時使用多重引子對於一次操作中，可同時檢測兩種基因之表現量，且準確性高，彼此間不會產生交叉反應。

於本發明之一較佳具體實施例中，以即時反轉錄聚合酶連鎖反應檢測方法分析雌性與雄性龍膽石斑魚其生殖器官中SPARC及HSC70 mRNA表現量，結果顯示SPARC在精巢表現量較卵巢表現量高於約2倍以上，因此如SPARC基因之表現量大於約2倍以上之HSC70基因之表現量，則該待測石斑魚為雄性。

於本發明之一較佳具體實施例中，以即時反轉錄聚合酶連鎖反應檢測方法分析雌性與雄性龍膽石斑魚其生殖器官中SPARC mRNA表現量，結果顯示SPARC在精巢表現量較卵巢表現量高於約2倍以上。根據請求項第1項之方法，其中如生殖器官細胞中SPARC基因之表現量大於約2倍以上之該已確定為雌性石斑魚之卵巢器官中SPARC基因之表現量，則該待測石斑魚為雄性。

於本發明之一較佳具體實施例中，以即時反轉錄聚合酶連鎖反應檢測方法分析雌性與雄性龍膽石斑魚其生殖器官中SPARC及HSC70 mRNA表現量，結果顯示HSC70在卵巢表現量較精巢表現量高於約2倍以上，因此HSC70基因之表現量大於約2倍以上之SPARC基因之表現量，則該待測石斑魚為雌性。

於本發明之一較佳具體實施例中，以即時反轉錄聚合酶連鎖反應檢測方法分析雌性與雄性龍膽石斑魚其生殖器官中與鰓中HSC70 mRNA表現量，結果顯示HSC 70在卵巢表現量較鰓表現量高於約2倍以上，因此如生殖器官細胞中HSC70基因之表現量大於約2倍以上之非生殖器官細胞中HSC70基因之表現量，則該待測石斑魚為雌性。

與傳統方法相比，根據本發明之方法能準確並快速偵測出兩種性別標誌，用於區分出雌雄石斑魚。能有效應用於石斑魚種魚管理與篩選，解決種魚管理上雌雄魚難以在非生殖季節準確辨別性別的困窘，更可應用於早期篩選出雄性石斑魚，以增加雄性石斑魚之多樣性。

本發明亦提供一種鑑定石斑魚性別之套組，其包含可用以檢測富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白基因表現量之寡核苷酸。

於本發明之較佳具體實施例中，該寡核苷酸係為探針或引子。

於本發明之一更佳具體實施例中，該寡核苷酸係為引子，且該寡核苷酸包含第一引子及第二引子其中該第一引子具有SEQ ID No.1所示之序列；該第二引子具有SEQ ID No.2所示之序列。

另一方面，根據本發明之套組較佳另包含雜合反應或反轉錄聚合酶連鎖反應所需之試劑。該等試劑之確實成分及組成係為本發明所屬技術領域中具通常知識者可完成者。

於本發明之一更佳具體實施例中，該套組另包含即時反轉錄聚合酶連鎖反應所需之試劑。該等試劑之確實成分及組成係為本發明所屬技術領域中具通常知識者可完成者。

另一方面，於本發明之一更佳具體實施例中，該套組另包含可自該待測石斑魚之生殖孔採樣生殖器官細胞之裝置。該等裝置之確實設計及材質係為本發明所屬技術領域中具通常知識者可完成者，例如使用橡膠或矽膠軟管導入，並以針筒抽取。

茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。

組織RNA之萃取：

將石斑魚放置冰上麻痺之後，解剖取出欲分析的各個組織約200mg後，立即加入1ml TRIzol reagent於1.5ml微量離心管中浸泡，再以均質機將微量離心管中之組織磨碎，劇烈震盪1分鐘，並於室溫下靜置5分鐘，直到組織完全被磨碎，接著加入200μl氯仿(Chloroform)，劇烈搖晃15秒後於冰上靜置10分鐘後，置於4℃、13500rpm離心15分鐘，吸取上層液至另一乾淨的微量離心管中，加入500μl的異戊醇(Isopropanol)，反轉管身4-6次後，冰上靜置10分鐘，再以4℃、13500rpm離心10分鐘，倒掉上清液後，加入-20℃的75%酒精清洗沉澱之RNA，以4℃，8500rpm離心5分鐘，倒掉上清液，將RNA沉澱物置於無菌操作台中風乾至接近半透明時，再以適量的DEPC水回溶RNA，並保存於-20℃冰箱。

反轉錄聚合酶鏈鎖反應

以石斑魚組織萃取所得之RNA為模板，取2μg RNA並加入1μl 10mM oligo dT引子及12μl的DEPC水，置於70℃下10分鐘後，再加入1μl M-MLV反轉錄酶(200U/μl)(Promega)、5μl M-MLV RT 5X buffer、4μldNTP，混和均勻後將管壁液體稍作離心，於42℃下反應1小時(反應總體積25μl)後，放置於94℃、5分鐘，離心後即完成RNA反轉錄成cDNA。

SYBR Green系統即時聚合酶連鎖反應定量：

將石斑魚各組織萃取而來的RNA回溶在50μl DEPC水中，以分光光度計定量之後，取2μg進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應。用隨機引子1μl(10μM)作為引子，補水至14μl，於70℃下作用10分鐘後置於冰上冷卻；加入5μl MMLV反轉錄緩衝液(5X)、4μl dNTP(10mM)及MMLV反轉錄酶1μl後，於42℃下作用60分鐘，94℃去活化5分鐘，即可得由mRNA反轉錄而得的cDNA。即時聚合酶連鎖反應定量則使用即時螢光定量所專用的微量離心管取cDNA樣本5μl，加入兩端特異性引子各0.2μl(20μM)，以及10μl的2X SYBR Green PCR Master Mix kit，最後補水至15μl；將此微量離心管置放於即時螢光定量PCR中的8孔盤上，記錄好各樣本所相對應的位置，開始進行反應，其條件為50℃進行2分鐘，95℃進行10分鐘，之後以95℃進行15秒，60℃進行60秒連續40個循環。以SetpOne Software^TM 2.0進行△Ct相對定量分析。

所使用之引子如表1所示：

其結果示於圖1及圖2。

圖1結果顯示SPARC在精巢表現量較卵巢表現量高出8倍，故SPARC可作為鑑定雄性石斑魚的基因分子標誌。

圖2結果顯示Hsc70在生殖器官內表現量較高。且Hsc70在卵巢表現量較精巢表現量高出12倍，故Hsc70可作為鑑定雌性石斑魚的基因分子標誌。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

<110> 國立成功大學

<120> 鑑定石斑魚性別之方法及套組

<130> 無

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

Claims

一種於活體外鑑定石斑魚性別之方法，其包含檢測一待測石斑魚生殖器官細胞中富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)基因之表現量，其中：如生殖器官細胞中SPARC基因之表現量大於一已確定為雌性石斑魚之卵巢器官中SPARC基因之表現量，則該待測石斑魚為雄性。
根據請求項第1項之方法，其中該生殖器官包含生殖腺。
根據請求項第1項之方法，其中該生殖器官細胞係經石斑魚生殖孔採樣而得。
根據請求項第1項之方法，其中檢測該待測富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白基因之表現量之方法包含以雜合反應或反轉錄聚合酶連鎖反應檢測。
根據請求項第1項之方法，其中檢測該待測富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白基因之表現量之方法包含以即時反轉錄聚合酶連鎖反應檢測。
根據請求項第1項之方法，其中如生殖器官細胞中SPARC基因之表現量大於2倍以上之該已確定為雌性石斑魚之卵巢器官中SPARC基因之表現量，則該待測石斑魚為雄性。
一種鑑定石斑魚性別之套組，其包含可用以檢測富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白基因表現量之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係為引子，且該寡核苷酸包含第一引子及第二引子，其中該第一引子具有SEQ ID No.1所示之序列；該第二引子具有SEQ ID No.2所示之序列。
根據請求項第7項之套組，其另包含雜合反應或反轉錄聚合酶連鎖反應所需之試劑。
根據請求項第8項之套組，其另包含即時反轉錄聚合酶連鎖反應所需之試劑。