JP7451427B2 - 幹細胞/増殖細胞区画及び分化細胞ゾーンを有する平面腸陰窩のアレイの形成 - Google Patents
幹細胞/増殖細胞区画及び分化細胞ゾーンを有する平面腸陰窩のアレイの形成 Download PDFInfo
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Description
本出願は、開示内容が参照により完全な形で本明細書に組み込まれている、2018年5月25日に出願された米国特許仮出願第62/676,418号の利益及び優先権を主張するものである。
連邦支援の陳述
そこで、関心対象の組織構成物、特に2つ以上の異なる細胞集団を含みうる組織構成物(例えば、腸組織)を平面上に生成する新しい方法が常に必要とされている。
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、本開示対象を限定するものではない。
特に断らない限り、本明細書及び特許請求項において使用されている、成分、反応条件、その他の量を表す全ての数値は、あらゆる場合において「約(about)」で修飾されるものと理解されたい。従って、反対のことが示されない限り、本明細書及び添付の特許請求項に記載された数値パラメータは、本開示対象により得られることが求められている所望の特性に応じて様々であってよい近似である。
幹細胞の系列決定は、生化学的合図(例えば、シグナリング分子や代謝産物)及び組織の生物物理学特性(例えば、マトリックス特性、機械力等)を含む多数の因子に影響される。ターリン等(Terryn et al.)著、F1000Research 2018、p.7、セムロー、ファン・オーデナールデン(Semrau and van Oudenaarden)著、アニュアル レビュー オブ セル アンド デベロップメント バイオロジー(Annual Review of Cell and Developmental Biology) 2015年、31号、p.317-345、イトウ、イトウ(Ito and Ito)著、アニュアル レビュー オブ セル アンド デベロップメント バイオロジー (Annual Review of Cell and Developmental Biology)、2016年、32号、p.399-409、ガッタッツォ等(Gattazzo et al.)著、バイオキミカ エト バイオフィジカ アクタ(Biochminica et Biophysica Acta)(BBA)、ジェネラルサブジェクツ(General Subjects)、2014年、1840号、p.2506-2519、並びにリ等(Li et al.)著、リジェネレイティブ メディシン(Regnerative Medicine)、2011年、6、p.229-240を参照されたい。腸上皮は、適正な機能を維持する為に系列決定が行われる系の一例である。腸上皮は、絶え間ない生化学的攻撃、微生物攻撃、及び物理的攻撃に直面して、それらから腸を保護する、腸の外層である。腸上皮は、腸幹細胞から派生した様々な細胞型からなる。結腸では、腸幹細胞は、陰窩の底部に位置して、急速に増殖し、陰窩に沿って動き、腸細胞、杯細胞、及び腸内分泌細胞のように機能が異なる細胞の様々な系列に分化する。腸上皮の幹細胞らしさの維持、増殖、及び分化のバランスが腸の健康を左右する。このバランスは、シグナリング分子、微生物由来化合物、ガス、及び剛性を含む局所微小環境によって調整される。ワン等(Wang et al.)著、セルラー アンド モレキュラー ガストロエンテロロジー アンド ヘパトロジー(Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology)、2018年、5(3)、p.440-453を参照されたい。例えば、高濃度のWnt、Wnt/β-カテニンシグナリング用リガンド、及び低レベルの細菌代謝産物ブチレートを陰窩の底部に置くことにより、幹細胞集団を維持して閉じ込めることが可能である。
幾つかの実施形態では、本開示は、それぞれが異なる細胞集団又は細胞系列を含む2つ以上の別個の領域を含む組織構成物を生成すること、及び/又は腸陰窩又は結腸陰窩の2次元生細胞培養モデルを生成することの為の方法において有用な装置を提供する。幾つかの実施形態では、本装置は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも1つの側壁と、少なくとも1つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、底壁上にあるか底壁を含む細胞支持基材であって、細胞支持基材は2つ以上の物理的に別個の領域を含み、支持基材の2つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なり、支持基材又は基材アセンブリの2つ以上の物理的に別個の領域は異なる物理特性を含む、細胞支持基材と、を含む。
1)生理学的研究(細胞間の高分子、イオン、及び水の輸送、酵素の機能、細菌との相互作用)の為のインビトロモデル。
2)薬品、生物学的製剤、食品化合物、毒素、突然変異原、発がん物質、病原体、ウイルス、微生物叢等のスクリーニング。
3)翻訳動物モデル又はヒトに由来する幹細胞及び/又は初代細胞を使用することによる病気モデル。
4)薬品、食品化合物等の包括的用量反応特性を含むスクリーニングの為の薬理学モデル、薬物動態学モデル、及び薬力学モデル。
5)代謝を研究する為のインビトロモデル。
6)バリア機能を維持及び修復する上皮組織の創傷治癒のインビトロモデル。
7)微生物とホストの相互作用の研究の為のインビトロモデル。
8)損傷した上皮を修復する移植の為の組織設計。
9)特定の遺伝的背景を有する個々の患者からの細胞に対して実施された研究によるオーダーメード医療。
10)機能アッセイ(水及び電解質(ナトリウム、塩化物、重炭酸塩、プロトン、カリウム、カルシウム)、微生物由来代謝産物(短鎖脂肪酸等)の吸収及び輸送、未吸収栄養素の回収等)。
11)(例えば、嚢胞性線維症における)粘液の生成、流れ、移動、及び粘液に対する病気関連の影響。
12)便秘に対する下痢止めの薬剤及び治療(例えば、緩下剤)のアッセイ。
13)シンバイオティクス、プレバイオティクス、及びプロバイオティクスのアッセイ。
14)X線不透過性マーカ及びシンチグラフィマーカ検査、並びに上皮に対するそれらの影響のアッセイ。
15)上皮に対する免疫細胞及びそれらの生成物(抗体及びサイトカイン)の影響。
16)上皮に対する腸神経細胞及びそれらの生成物の影響。
17)上皮に対する筋肉細胞、それらの収縮及び弛緩、並びにそれらの代謝産物の影響。
18)水溶性繊維及び不溶性繊維、並びに上皮に対するそれらの影響のアッセイ。
19)任意のタイプのけがに対する反応としての上皮の修復の理解。
20)偽膜形成(例えば、クロストリジウムディフィシル)につながる細菌の調査。
21)生物兵器化合物のスクリーニング。
22)NSAID療法、化学療法、放射線療法等の薬品及び療法の副作用を理解する研究。
23)上皮の完全性、機能、及び病気(例えば、炎症性大腸炎、腸疾患、がん等)に対する自然免疫系及び適応免疫系の役割の研究。
24)オフターゲット効果を向上させる放射線療法及び化学療法並びに薬剤のアッセイ。
25)液状がん(例えば、白血病や骨髄腫)及び/又は固体がん(例えば、黒色腫、がん腫、肉腫、リンパ腫、胚細胞腫瘍、及び/又は混合がん)を包含する低酸素状態又は時間及び/又は空間における酸素勾配を模倣する腫瘍モデル。
26)抗菌剤、抗ウイルス薬、及び/又は抗真菌薬のアッセイ。
27)片利共生細菌及び病原性細菌に対するバクテリオファージの効果、並びにそれらとホスト細胞との相互作用を理解する研究。
28)グラム陰性菌、グラム陽性菌を包含するグラム陽性細菌感染及び/又はグラム陰性細菌感染のインビトロモデル系。そのような細菌として、アシネトバクターバウマニー、イスラエル放線菌、炭疽菌、バクテロイデスフラジリス、バルトネラヘンセラ菌、百日咳菌、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアガリニ、ボレリアアフゼリ、ボレリアレカレンチス、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、類鼻疽菌、カンピロバクタージェジュニ、クラミジアニューモニエ、クラミジアトラコマチス、オウム病クラミジア、ボツリヌス菌、クロストリジウムディフィシル、クロストリジウムパーフリンジェンス、破傷風菌、コリネバクテリウムアミコラトゥム、ジフテリア菌、コクシエラバーネッティ、エーリキアカニス、エーリキアシャフェンシス、大便連鎖球菌、エンテロコッカスフェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、侵入性大腸菌、腸管出血性大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、肺炎桿菌、レジオネラニューモフィラ、レプトスピラ種、リステリア菌、ハンセン菌、ヒト型結核菌、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、パラクラミジア、緑膿菌、ノカルジアアステロイデス、ロッキー山紅斑熱リケッチア、サルモネラ菌、シゲラ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、B群溶血性連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、ビリダンス型連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、コレラ菌、ビブリオバルニフィカス、及び/又はエルシニア菌があってよく、これらに限定されない。
29)二本鎖DNAウイルス、一本鎖DNAウイルス、二本鎖RNAウイルス、プラス鎖RNAウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、円形一本鎖RNAウイルス、RNA逆転写ウイルス、DNA逆転写ウイルスを含むウイルスによる感染を理解する為のインビトロ培養システム。そのようなウイルスとして、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、マストアデノウイルス、アルファパピローマウイルス、ベータパピローマウイルス、ガンマパピローマウイルス、ミューパピローマウイルス、ニューパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、モラスキポックスウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アルファトルクウイルス、ベータトルクウイルス、ガンマトルクウイルス、ゲミサーキュラーウイルス、エリスロウイルス、ディペンドウイルス、ボカウイルス、コルティウイルス、ロタウイルス、セドルナウイルス、ヘペウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、トロウイルス、マムアストロウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペギウイルス、カルジオウイルス、コサウイルス、エンテロウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、ロサウイルス、サリウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、デルタウイルス、リッサウイルス、ベシクロウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、パラミクソウイルス、ヘニパウイルス、モービリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、メタニューモウイルス、ニューモウイルス、アレナウイルス、ペリブニヤウイルス、オルトブニヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フェヌイウイルス、フレボウイルス、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、及び/又はオルトヘパドナウイルス等があり、これらに限定されない。
30)低酸素状態を必要とするワクチンを生成する為のインビトロ培養システム。
31)原虫感染症(例えば、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウムパルバム、クリプトスポリジウムホミニス、サイクロスポーラカエタネンシス、及び/又はランブル鞭毛虫)の為のインビトロ培養システム。
32)単細胞及び/又は多細胞真菌感染症の為のインビトロ培養システム。そのような菌類は、コウジカビ属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカスネオフォルマンス属、クリプトコッカスガッティ、ヒストプラスマ属、クモノスカビ属、ケカビ属、リクテイミア属、ニューモシスティスジロヴェチ、及び/又はスポロトリクス属の菌類である。
33)抗バイオフィルム薬剤によるバイオフィルムの形成、成長、拡散、及び/又は崩壊のモデル。及び/又は、
34)(空間又は時間における)酸素勾配又は低酸素状態を必要とするモデル系、又はそれらの系の組み合わせ。そのようなものとして、毛包ニッチ、脳卒中後の脳低酸素症、シアン化物中毒、ディッシュシステムの傷痕、線維症及び創傷の治癒、網膜症、角膜の酸素不足及び血管新生、歯周炎、上下気道モデル、細気管支炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺炎(細菌感染、ウイルス感染、マイコプラズマ感染)、間質性肺炎、肺水腫、低酸素性肺血管収縮反応モデル、肝臓組織モデル、肝再生、肝線維症、ウイルス性肝炎、脂肪肝疾患、腎症、腎炎、骨の成長と再生、軟骨再生、骨髄、骨折治癒機転モデル、血栓症、造血幹細胞ニッチ、鎌状赤血球病を含む貧血、運動中の筋肉のモデル、生殖器官モデル、子宮内膜症、子宮内低酸素症を含む胎盤発育モデル、胚発生モデル、虚血(心虚血、腸管虚血、脳虚血、肢虚血、皮膚虚血)及び虚血再灌流障害モデル、麻酔、及び/又は肥満モデルがある。
以下の実施例は、本開示対象の代表的な実施形態を実施する為の指針を当業者に提供する為に記載したものである。本開示、及び当該技術分野における一般的な技量の観点から、当業者であれば理解されるように、以下の実施例は単に例示であるものとし、本開示対象の範囲から逸脱しない限り、様々な変更、修正、及び改変が行われてよい。
マイクロデバイスの製造:
薄いフォトレジストフィルムに貫通穴をパターニングすることにより、(それぞれが50μm径の)微細穴の10×10のアレイを薄いフォトレジストフィルムに作成した。パターニングしたフォトレジストフィルムを、修正されたTRANSWELL(登録商標)カセット(コーニング(Corning, Inc.)、米国ニューヨーク州コーニング)の上にマウントし、細胞培養用コラーゲン層を切れ目なく、但し薄く被せた。
シミュレーションと拡散の研究:
オスとメスのマウスの腸から採取した陰窩を、既述のように緩衝液(2.0mMのEDTAと0.5mMのDTT)に隔離した。ワン等(Wang et al.)著、セルラー アンド モレキュラー ガストロエンテロロジー アンド ヘパトロジー(Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology)、2017年、4、p.165-182を参照されたい。染色体の完全性を確保する為に、使用した細胞は全て、5継代培養未満とした。マウス腸細胞を、増殖培地(EM)下の中和コラーゲンゲル(6ウェルプレートに入れた1mL)の平らな表面上で単層として培養した。EMは、培養物内の幹細胞を支援する為にWnt3A、R-スポンディン3、及びノギンを有する。EMの組成については後で表2において詳述する。EMで使用した化学物質は、以下の供給元から購入した。即ち、Advanced DMEM/F12、GlutaMAX、及びHEPESをサーモフィッシャーサイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific, Inc.)(米国マサチューセッツ州ウォルサム))から、マウスEGFをペプロテックUS(PeproTech US)(米国ニュージャージー州ロッキーヒル)から、A83-01をシグマアルドリッチ(Sigma Aldrich)(米国ミズーリ州セントルイス)から、N-アセチルシステインをMPバイオ(MP Bio)(MPバイオメディカル(MP Biomedical)、米国カリフォルニア州サンタアナ)から、ROCK阻害剤(Y-27632)をアペックスバイオテクノロジー(ApexBio Technology, LLC)(米国テキサス州ヒューストン)から、商品名PRIMOCIN(TM)で販売されている抗菌薬をインビボジェン(InvivoGen)(米国カリフォルニア州サンジエゴ)から、それぞれ購入した。
細胞の画像化:
平面腸陰窩を支持するマイクロデバイスの製作及び特性化
平面腸陰窩を支持するマイクロデバイス装置の製作の一例示的工程を図4Aに示す。本デバイスを製作する為に、1002Fの層(SEMで40μm厚)をスライドガラスにコーティングし、10×10個の不透明の円のアレイ(50μm径、エッジ間距離300μm)を有するマスクを使用してフォトパターニングした。図4Bを参照されたい。水中でインキュベートすることにより1002Fをスライドガラスから取り外し、このフィルムをTRANSWELL(登録商標)インサート(コーニング(Corning, Inc.)、米国ニューヨーク州コーニング)(購入時に貼り付けられていた膜は除去されている)の底部に移した。1002Fフィルムが貼り付けられたインサートをPDMS面上に置き、コラーゲンをリザーバに装填して、マイクロパターニングされた1002Fの上に1mm厚のコラーゲンゲルを形成した。次に、このコラーゲンを脱水すると、表面上に広がって微細穴間を架橋する凝縮されたコラーゲン層が残り、これを塩結晶で覆った。図4Cの上側のパネルを参照されたい。このコラーゲンを再水和すると、デバイスの上面全体にわたって、高密度ながら多孔質のコラーゲン膜(共焦点蛍光顕微鏡で4.7μm厚)が得られた。図4Cの下側のパネルを参照されたい。微細穴及び10002F面の上方の領域でのコラーゲン層の剛性は、4.5μm径のプローブチップを有するAFMで測定すると、それぞれ55.83±19.21kPa及び146.38±42.27kPa(n=3、試料毎に10箇所、p<0.0001)において有意差があった。脱水及び再水和の過程で、1002F面全体にわたってコラーゲン密度が増加した。これは、このステップによってコラーゲン厚が1mmから4.7μmに減少した為である。そして、この密度の増加によって、非凝縮時には濃度に応じて剛性が10~1000Paであることが報告されているコラーゲンの剛性も同様に増加した。ワン等(Wang et al.)著、セルラー アンド モレキュラー ガストロエンテロロジー アンド ヘパトロジー(Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology)、2017年、4、p.165-182を参照されたい。コラーゲンでコーティングされた1002F面の剛性が高くなったことは、コラーゲンのコーティングによって1002Fフィルムの剛性が完全にマスクされるわけではないことを示唆している。EPON樹脂の典型的な剛性は数GPaである。エンゲルベルク、テソロ(Engelberg and Tesoro)著、ポリマー エンジニアリング アンド サイエンス(Polymer Engineering & Science)、1990年、30、p.303-307、並びにヴァッロ等(Vallo et al.)著、ポリマー ゲルス アンド ネットワークス(Polymer Gels and Networks)、1993年、1、p.257-266を参照されたい。AFMによると、押込み深さは約150nmであった。これは、一般に細胞が感知する押込み深さより浅い。しかしながら、いかなる理論にもとらわれずに言えば、細胞は、AFMチップで検知できる以上に、下層の1002Fフィルムの剛性を「感じる(feel)」ことができる可能性がある。ク等(Qu et al.)著、サイエンティフィック レポーツ(Scientific Reports)、2018年、8、p.3295、並びにフランク等(Franck et al.)著、プロス ワン(PloS one)、2011年、6、p.e17833を参照されたい。
コラーゲンでコーティングされ、パターニングされたフィルム上での初代マウス腸上皮細胞の増殖
管腔リザーバ(上側)及び基礎リザーバ(下側)にEM又は幹細胞支持培地を置いて(EM/EM)、コラーゲンでコーティングされ、パターニングされた微細穴を有する1002Fフィルム上で4日間、細胞を培養した。培養期間を4日間としたのは、マウス結腸上皮細胞の典型的な寿命(3~5日)を模倣する為である。ツボウチ(Tsubouchi)著、デベロップメント ダイナミクス(Developmental Dynamics)、1981年、161、p.239-246を参照されたい。それぞれ、EdU組み込み及びアルカリホスファターゼ(ALP)活性によって示される細胞の増殖及び分化を経時追跡した。図5を参照されたい。2日目に細胞はロバストな増殖を示した。これは、フィルム表面全体にわたって細胞にEdUを組み込んだことによって示された。一方、ALP活性は、上皮細胞内ではほとんど検出されなかった。このことは、これらの条件下では、且つこの時点では、分化細胞がほとんど存在していないことを示唆している。培養の3日目には、EdU+細胞がアレイ全体にわたって存在したままであり、これに低レベルのALP活性が伴った。しかしながら、培養の4日目には、微細穴の中心から外に50-60μm広がったEdU+細胞の円形領域による特徴的な細胞パターニングが存在した。図5並びに図6A及び6Jを参照されたい。微細貫通穴の中心から70μmを超える距離にはEdU+細胞が存在しなかった。図5並びに図6A及び6Jを参照されたい。一方、微細穴の中心から90μmを超える距離の細胞内に低レベルのALP活性が存在したままであった。図5並びに図6A及び6Kを参照されたい。微細穴の中心から70μm以内の細胞には、測定可能なALP活性が発現しなかった。微細穴の中心から60~70μmの過渡ゾーンにある細胞にはEdU組み込みもALP活性もほとんどなかった。このことは、これらの領域で、増殖シグナルと分化シグナルとが等しくバランスしていたことを示唆している。
幹細胞/増殖細胞区画及び分化細胞ゾーンの作成
いかなる理論にもとらわれずに言えば、分化細胞に高ALP活性がなかったのは、おそらく増殖因子であるWnt-3、ノギン、及びR-スポンディンがずっと存在した為であった。EM/EM中のアレイ上で細胞を2日間培養して、コラーゲンでコーティングされた表面全体にわたって細胞が付着して広がることを可能にし、次に、DM/EM(管腔/基礎)に切り替えて更に2日間培養した。DM(分化培地)はWnt3A、R-スポンディン、又はノギンを含まず、腸上皮細胞を腸細胞系列又は吸収性細胞系列に向けて強制分化させる。ワン等(Wang et al.)著、ACSバイオマテリアルズ サイエンス アンド エンジニアリング(ACS Biomaterials Science & Engineering)、2017年、3、p.2502-2513を参照されたい。DM/EMに曝された細胞の末路を調べる為に、細胞の増殖及び分化を経時追跡した。図5を参照されたい。培養の3日目に、増殖細胞を微細穴の上の表面領域にほぼ局在化し、ALP活性がある細胞を他の領域に限定した。4日目に、2つの別個の細胞区画を難なく可視化した。微細穴の上にのみ配置された増殖細胞区画と、4日後に作成されたEM/EMの増殖細胞区画との間にサイズの統計的な差はなかった。図6C、6D、及び6Jを参照されたい。このことは、微細穴の上の細胞が拡散して微細穴を通り抜けて、EM中の増殖因子をすぐに利用できたことを示唆している。これに対し、細胞のALP活性は、微細穴の中心から60μmのところで増え始め、130μmのところで最大活性に達した。これらの外側領域では、ALP活性は、EM/EMによって生成されてから大幅に増えた(4.5倍、n=5陰窩、p<0.0005)。図6Kを参照されたい。上部リザーバ内のDMは、その下の表面とともに、腸上皮細胞を非増殖表現型に方向づけ、ALP活性を大幅に増やして、微細穴の上の増殖細胞ゾーン(0~50μm)を取り囲む分化細胞ゾーン(>130μm)を作成した。この区画化された培養を、少なくとも6日目まで続行した。
平面陰窩アレイ上での腸上皮細胞の移動及び死
インビボの腸では、陰窩の底部にある幹細胞が増殖すると、増殖期細胞の移行が引き起こされ、増殖期細胞は分割し続け、腸の管腔表面に向かって陰窩の長軸を上昇し続ける。細胞は、管腔に近づくにつれて、分化して非分裂系列(腸細胞、胚細胞、及び腸内分泌細胞)になる。バーバー(Barber)著、ネイチャー レビューズ モレキュラー セル バイオロジー(Nature Reviews Molecular Cell Biology)、2014年、15、p.19を参照されたい。平面陰窩アレイ上の細胞が、この、増殖細胞区画から分化細胞領域への秩序立った細胞移動を再現するかどうかを調べる為に、コラーゲンでコーティングされた微細穴アレイ上のマウス内皮細胞をEM/EMで2日間(1日目及び2日目)培養し、その後、DM/EMで更に2日間(3日目及び4日目)分極させた。その後、細胞をEdUで3時間インキュベートし、その後、EdUを洗い流し、細胞をDM/EMで更に2日間(5日目及び6日目)培養した。EdU+細胞の位置を、4日目のEdUインキュベーションの直後に測定し、(2日間の追跡期間を経て)6日目に再度測定した。4日目には、予想されたように、全てのEdU+細胞が増殖細胞ゾーンの微細穴の上に位置した(細胞の平均位置は微細穴の中心から36±15μm、n=165細胞)。図7A及び7Cを参照されたい。しかしながら、6日目には、EdU+細胞の大部分が分化細胞ゾーン内に位置した(細胞の平均位置は微細穴の中心から105±44μm、n=386細胞、図7B及び7Dを参照)。このことは、これらの細胞がその間の2日間に増殖ゾーン(パルス位置)から分化細胞ゾーンに移動したことを示している。6日目のEdU+細胞の位置は、4日目の位置との間に統計的な差があった(p<0.0001)。EdU+細胞の多くが、6日目に測定されたALP活性とも共局在化しており、このことは、これらの4日目の増殖細胞が、外向きに移動する間に分化したことを示している。これらの細胞の平均速度は1.6±1.1μm毎時であった(EdUが洗い流されてから0時間後及び44時間後の平均EdU+細胞位置の差を44時間で割ったもの)。これは、インビボの下部陰窩内での細胞移動速度と同等である(1.3μm毎時)。ツボウチ(Tsubouchi)著、デベロップメント ダイナミクス(Developmental Dynamics)、1981年、161、p.239-246を参照されたい。陰窩底部における幹/増殖ニッチから腸の管腔表面への細胞の上向きの流れは、平面陰窩アレイにおいて回復された。
マウス腸上皮細胞の増殖及び分化に対する短鎖脂肪酸の効果
結腸上皮増殖及び分化は、線維性物質の細菌発酵の間に生成される短鎖脂肪酸のような微生物生成物の影響を受ける。コー等(Koh et al.)著、セル(Cell)、2016年、165、p.1332-1345を参照されたい。例えば、プロピオネートやブチレートは、腸腫瘍細胞株における増殖を抑制する。ガーメット等(Gamet et al.)著、インターナショナル ジャーナル オブ カンサー(International Journal of Cancer)、1992年、52、p.286-289、並びにホワイトヘッド等(Whitehead et al.)著、ガット(Gut)、1986年、27、p.1457-1463を参照されたい。ブチレートは又、初代マウス腸オルガノイドにおける増殖を減少させる。カイコ等(Kaiko et al.)著、セル(Cell)、2016年、165、p.1708-1720を参照されたい。平面陰窩アレイ上の腸上皮細胞の増殖及び分化に対する短鎖脂肪酸の効果を評価する為に、2日間の分極の間、即ち、アレイ上の細胞培養の3日目及び4日目に、短鎖脂肪酸(24mMのアセテート、6mMのプロピオネート、又は1mMのブチレート)をDM管腔培地に加えた。EdU+及びALP+の面積を測定し、Hoechst 33342に対して陽性である面積(細胞数のプロキシとしての細胞核の総面積)に対して正規化した。アセテートは、EdU+細胞の正規化面積を大幅に増加させた。プロピオネート及びブチレートは、EdU+細胞の正規化面積を、短鎖脂肪酸のない対照の場合に比べて大幅に減少させた。図8Bを参照されたい。このことは、コラーゲンゲル上で単層として培養されたマウス腸細胞(ワン等(Wang et al.)著、セルラー アンド モレキュラー ガストロエンテロロジー アンド ヘパトロジー(Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology)、2017年、4、p.165-182を参照)、マトリゲルパテ内のマウス腸オルガノイド(カイコ等(Kaiko et al.)著、セル(Cell)、2016年、165、p.1708-1720を参照)、及び組織培養HT29ヒト結腸がん細胞の挙動と矛盾しない。ガーメット等(Gamet et al.)著、インターナショナル ジャーナル オブ カンサー(International Journal of Cancer)、1992年、52、p.286-289を参照されたい。対照的に、アセタートはALP活性を大幅に減少させたが、プロピオナート及びブチラートは、ALP活性を対照に対して大幅に増加させた。図8Cを参照されたい。ブチラート及びプロピオナートはALP活性を大幅に増加させたが、これは、これら2つの短鎖脂肪酸を、初代ヒト結腸細胞から形成された3次元陰窩に対する勾配として適用した場合の影響と同様である。ワン等(Wang et al.)著、セルラー アンド モレキュラー ガストロエンテロロジー アンド ヘパトロジー(Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology)、2018年、5、p.113-130を参照されたい。ブチラートは、唯一の短鎖脂肪酸であった場合より大幅にALP活性を増加させており、陰窩当たりのHoechst 33342+細胞数を約17%(p<0.001)減らした(図8Dを参照)。これは、以前の観測でブチラートがヒト結腸がん細胞株においてアポトーシスを引き起こしたことと矛盾しない。ルーメレ等(Ruemmele et al.)著、ガット(Gut)、2003年、52、p.94-100、ファン等(Fung et al.)、ジャーナル オブ プロテオーム リサーチ(Journal of Proteome Research)、2011年10、p.1860-1869、並びにク等(Xu et al.)著、シグナル トランスダクション アンド ターゲッテッド セラピー(Signal Transduction and Targeted Therapy)、2017年、2、p.16035を参照されたい。これらのデータは、平面陰窩アレイが微生物代謝産物に対する重要な腸上皮細胞応答を再現することを示している。
ヒト腸上皮モデル系の為の平面陰窩の形成
実施例1で説明し、実施例2で使用したものと同じマイクロデバイスを使用して、初代ヒト腸上皮細胞を使用するヒト平面陰窩を作成した。このプラットフォームで4日間、管腔培地及び基礎培地に増殖因子が存在する中でヒト初代上皮細胞を培養した。4日目に、細胞を更に4日間インキュベートした。これは、1)増殖因子が管腔培地及び基礎培地の両方に存在したEM/EM条件、2)増殖因子が基礎培地にのみ存在したDM/EM条件、そして、3)増殖因子がどの区画にも存在しなかったDM/DM条件で実施した。培養中は2日毎に培地を交換した。8日目に細胞をEdUで3日間パルス標識し、その後、30分間のALPアレイにかけ、その後、固定して、増殖細胞及び結腸細胞をそれぞれ標識した。MUC2抗体を使用した免疫蛍光により、杯細胞を検出した。クリックケミストリによってCy5蛍光体をコンジュゲートすることにより、EdUを検出した。図9は、これら3つの異なる培地条件での、このプラットフォーム上の細胞を示す。DM/EM条件下の細胞だけがEdU+増殖細胞及びMUC2+杯細胞の両方を示した。EdU+増殖細胞は、穴の上及び近くに密集して増殖ゾーンを形成した。
Claims (15)
- 組織構成物を生成する方法であって、
(a)装置上に上皮細胞を堆積/配置するステップであって、前記装置は、
(i)第1の底壁と、前記第1の底壁から上方に延びて第1のウェルを画定する少なくとも1つの側壁とを含む基礎容器であって、前記第1のウェルは第1の細胞培地を含む、基礎容器と、
(ii)前記基礎容器の前記第1のウェル内に保持された管腔容器であって、
(1)1つ以上の微細孔が横断する第2の底壁と、
(2)前記第2の底壁を覆う上皮細胞の培養用の多孔質層であって、前記第2の底壁は当該多孔質層と比較して低い多孔率を有する、多孔質層と、
(3)前記第2の底壁から上方に延びて第2のウェルを画定する少なくとも1つの側壁であって、前記第2のウェルは第2の細胞培地を含み、前記上皮細胞は、
(i)前記1つ以上の微細孔上に位置し、増殖及び/又は分化して第1の上皮細胞集団又は細胞系列を形成する前記多孔質層の第1の領域と、
(ii)前記1つ以上の微細孔上に位置せず、増殖及び/又は分化して、前記第1の上皮細胞集団又は細胞系列とは異なる第2の上皮細胞集団又は細胞系列を形成する前記多孔質層の第2の領域と、の表面に定着又は接着する、少なくとも1つの側壁と、
を含む管腔容器と、を含む、ステップと、
(b)前記第1のウェルに前記第1の細胞培地を設けると共に、前記第2のウェルに前記第2の細胞培地を設けるステップと、
(c)前記上皮細胞を培養するステップであって、
(i)前記第1の上皮細胞集団又は細胞系列は、前記多孔質層の前記第1の領域上で増殖及び/又は分化し、
(ii)前記第2の上皮細胞集団又は細胞系列は、前記多孔質層の前記第2の領域上で増殖及び/又は分化する、ステップと、
を含む方法。 - 前記上皮細胞は、初代上皮細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の細胞培地及び/又は前記第2の細胞培地は、1つ以上の刺激を含み、
前記1つ以上の刺激のそれぞれは、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から成る群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記1つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを更に含み、前記検出又は測定するステップは、前記1つ以上の刺激に曝された後の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、前記1つ以上の刺激に曝される前の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方、及び/又は、前記1つ以上の刺激に曝されていない比較可能な組織構成物中の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方と比較することを含む、請求項3に記載の方法。
- 組織構成物を生成する装置であって、
(a)第1の底壁と、前記第1の底壁から上方に延びて第1のウェルを画定する少なくとも1つの側壁とを含む基礎容器であって、前記第1のウェルは第1の細胞培地を含む、基礎容器と、
(b)前記基礎容器の前記第1のウェル内に保持された管腔容器であって、
(i)1つ以上の微細孔が横断する第2の底壁と、
(ii)前記第2の底壁を覆う上皮細胞の培養用の多孔質層であって、前記第2の底壁は当該多孔質層と比較して低い多孔率を有する、多孔質層と、
(iii)前記第2の底壁から上方に延びて第2のウェルを画定する少なくとも1つの側壁であって、前記第2のウェルは第2の細胞培地を含む、少なくとも1つの側壁と、を含む管腔容器と、
を含む装置。 - 前記第2の底壁は、非多孔質材料を含む、請求項5に記載の装置。
- 前記多孔質層は、ヒドロゲル又はコラーゲンを含む、請求項6に記載の装置。
- 腸陰窩又は結腸陰窩の2次元生上皮細胞培養モデルを調製する方法であって、
(a)請求項5~7のいずれか一項に記載の装置を用意するステップと、
(b)前記多孔質層上に1つ以上の上皮細胞を堆積/配置するステップであって、前記1つ以上の上皮細胞は、
(i)前記1つ以上の微細孔上に位置し、増殖及び/又は分化して第1の上皮細胞集団又は細胞系列を形成する前記多孔質層の第1の領域と、
(ii)前記1つ以上の微細孔上に位置せず、増殖及び/又は分化して、前記第1の上皮細胞集団又は細胞系列とは異なる第2の上皮細胞集団又は細胞系列を形成する前記多孔質層の第2の領域と、
の表面に定着又は接着する、ステップと、
(c)前記第1のウェルに前記第1の細胞培地を設けると共に、前記第2のウェルに前記第2の細胞培地を設けるステップと、
(d)前記上皮細胞を培養するステップであって、
(i)前記第1の上皮細胞集団又は細胞系列は、前記多孔質層の前記第1の領域上で増殖及び/又は分化し、
(ii)前記第2の上皮細胞集団又は細胞系列は、前記多孔質層の前記第2の領域上で増殖及び/又は分化する、
ステップと、
を含む方法。 - 前記第1の細胞培地と前記第2の細胞培地は同じであってよく、異なってもよい、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の細胞培地と前記第2の細胞培地は、前記1つ以上の上皮細胞が堆積/配置された後の少なくとも第1の期間にわたって同一である、請求項9に記載の方法。
- 前記第1及び第2の細胞培地は、幹細胞の増殖を支援する増殖因子を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記第1の期間が経過した後に前記第1又は第2の細胞培地を第3の細胞培地に交換するステップを含み、前記第3の細胞培地は前記第1及び第2の細胞培地と異なり、前記第3の細胞培地は、幹細胞の増殖を支援する増殖因子がない、請求項10又は請求項11に記載の方法。
- 前記第3の細胞培地は1つ以上の刺激を含み、各刺激は、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記第1及び第2の細胞培地の一方又は両方が1つ以上の刺激を含み、各刺激は、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記異なる細胞集団又は細胞系列のうちの1つ以上に対する前記1つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを更に含み、前記検出又は測定するステップは、前記1つ以上の刺激に曝された後の、前記1つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、前記1つ以上の刺激に曝される前の、前記1つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方、及び/又は、前記1つ以上の刺激に曝されていない比較可能な細胞培養モデルの1つ以上の細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方と比較することを含む、請求項13又は14に記載の方法。
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2024
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Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Biomaterials,2017年,Vol.128,p.44-55 (p.1-26),doi:10.1016/j.biomaterials.2017.03.005 |
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