JP2022511375A - インビトロ細胞培養粘液系 - Google Patents
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Description
本願は2018年11月16日出願の米国仮特許出願シリアルNo.62/768,259の利益及び優先権を主張し、此れの開示は其の全体が参照に依って本願に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号DK109559に依る政府の支援に依って成された。政府は本発明に或る種の権利を有する。
コラーゲンハイドロゲル上に於けるヒト結腸上皮幹細胞のインビトロ拡大培養.ヒト由来腸上皮幹細胞を拡大培養する為には、単層培養技術を以前に公開されたプロトコールに従って用いた27,30。手短には、結腸陰窩を死体ドナー(男性、23歳)の横行結腸組織標本から単離し、1,000陰窩/標準的な6ウェル培養プレート(1mm厚コラーゲンハイドロゲルを保有する)のウェルの密度でコラーゲンハイドロゲルに直接的にプレーティングし、4mLの幹細胞用培地を重層した(SM-表1)。培地は48時間毎に換えた。細胞のコンフルエンシーが≧80%に達した時に(典型的には5~7日)、単層を継代し、新鮮なコラーゲンハイドロゲル上で1:3の継代比で継代培養した27,30。細胞をP11に於いて核型分析し、10個の塗沫標本中の10個が正常な核型を呈した。本明細書の全ての実験は細胞をP15未満の継代数で用いた。
粘液層の細菌分離能を実証する為には、2μg/mLのヘキスト33342を含有する1mL培地を基底リザーバに1hに渡って追加する事に依って、上皮生細胞を第1にヘキスト33342に依って染色し、其れから、2億コロニー形成単位(cfu)/mLの密度のGFP-EC(ATCC、#25922GFP)又は108ビーズ/mLの密度の1μm赤色蛍光ビーズ(サーモフィッシャーサイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific)、#F13083)の0.5mLの懸濁液を頂端リザーバに追加した。20minの播種後に、トランズウェルインサートをカバーガラス上に置き、組織をオリンパス株式会社FluoView-FV3000共焦点レーザー走査顕微鏡に依ってイメージングした。
気液界面(ALI)培養はコンパクトな粘液層が頂端結腸上皮上に蓄積する事を可能化する
最初に、粘液層の生成を助ける為に、気液界面(ALI)培養を試験した。何故なら、標準的な浸漬培養に於いて上に重なる培地は、粘液が分泌されるに連れて其れを希釈して行き、高密度の粘液層が形成される事を防止し得るという仮説が立てられたからである。横行結腸から得られたヒト上皮幹細胞をマトリゲルコーティングされたトランズウェル(多孔質膜)にプレーティングし、拡大培養培地(EM)中で5日に渡って培養して、細胞が増殖しコンフルエントな単層を形成する事を可能化した。第5日に、培地を分化培地(DM)に切り替え、細胞を浸漬培養(頂端及び基底リザーバ両方に培地)として又はALI培養(基底リザーバのみに培地)としての何方かで追加の5日に渡って培養した(図2A)。DM中の成長因子の不在を原因として、細胞は其れ等の増殖能を失い、結腸細胞、杯細胞、及び腸内分泌細胞の混合物から構成される成熟した細胞系列に自発的に分化した29。培養の第10日に、粘液層は浸漬培養では不在であった(図2B)。図2Cに示されている通り、走査電子顕微鏡法(SEM)に依って観た時に、粘液層は此れ等の単層上には可視ではなく、上皮及び其の頂端特徴(杯細胞の分泌顆粒、矢印)が容易く明らかであった(図1C、上側パネル)。以前に記載されている通り、溶解したムチンが酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)に依って内腔培地中に検出可能であった30。其れ故に、杯細胞に依って分泌されるムチンは培地に依って急速に希釈され、其れ故に、高密度の生理的なハイドロゲルを築く能力がないという事が可能であった。
改変されたALI培養に於いて内腔の水分泌を促進する事に依って、水和した厚い粘液層が作出され得る
細菌代謝を起源とする気体が大腸のルーメン内に存在する;然し乍ら、インビボの内腔表面は、主として、高い水含量を保有する非消化性の材料及び老廃物との接触をしている。其れ故に、幾つかの実施形態では、頂端表面に於ける水の不在を原因として、上に記載されているALI培養はインビボの腸内腔環境を詳しくは反映しない。実際に、結腸粘膜の水及び電解質のホメオスタシスは、水がルーメン内に及び外に動く事に依って平衡化されている。健康な成人では、ルーメンから外への水の動きの速度は17.8mL/minであり、ルーメン内への物は16mL/minであり、1.85mL/minの正味の水流出を齎し、糞便の固化を引き起こす41。腸ホルモン、例えば5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン;5-HT)、血管作動性腸ペプチド(VIP)、及びP物質は、大腸の内腔内容物の流体平衡又は水含量を制御する事に主要な役割を演ずる42。均一な厚さの厚い高度に水和した途切れない粘液層を生ずる為の戦略を開発する為に、VIP含有DM(DM-VIP)を用いるホルモンVIPに対する基底上皮表面の暴露を用いて、上皮を通る流体の動きの平衡を補助した(図3A)。VIPは内因性のホルモンであり、健康な成人の血漿中濃度は14から76pg/mLの範囲である43。腸に於ける其の役割は、腸ルーメンへの水及び電解質の分泌を刺激する事である44。VIPは、杯細胞に依る粘液分泌及び産生を増大させ、杯細胞への系列配分を強化する様にもまた作用し得る45。
粘液層は初代ヒト結腸上皮に対するC.ディフィシル毒素の効果を妨害する
粘液層がインビトロ結腸上皮モデルの生理学的な該当性を改善するという事を実証する為に、初代ヒト結腸上皮(GC及び/又はOC)を粘液層の不在下又は存在下に於いてC.ディフィシル毒素に暴露した(図4A)。C.ディフィシルはホストGTPアーゼ(Rho、Rac、及びCdc42を包含する)を不活性化する事が出来る2つの強力な毒素A及びBを生じ、上皮バリアの変改、ヒト腸粘膜へのダメージ、及び結腸の炎症に至る50。浸漬培養法に於いて、粘液層の不在下では、A毒素は細胞のダメージを速やかに誘導し、最も早い変化は2hの毒素インキュベーション以内に観察された。4hには、毒素処置された上皮単層では、細胞間透過性が有意に増大し(図4B)、IL-8分泌もまた有意に強化された(図4C)。頂端F-アクチン構造及びZO-1タイトジャンクション両方は毒素処置に依って顕著に変改された。コントロールの上皮単層は頂端刷子縁に於ける秩序立ったF-アクチンとZO-1の連続的な「チキンワイヤー」パターンとを有したが、A毒素処置された単層は、細胞の球状化、正常なF-アクチンの乱れ及び破壊、並びにZO-1アーキテクチャの分解を見せた(図4D)。此の傾向は8h(図4E及び4F)及び24hに於いて観察された。此れ等の結果は、A毒素が上皮バリア機能を破壊し、免疫学的応答を誘起するという事を実証している。此れは他の腸上皮モデルについての以前の研究と整合する15,51,52。
粘液層は物理的バリアとして働き、細菌に依って誘導される免疫応答を無くす
インビボでは、粘液層は、片利共生微生物をホスト上皮から隔離する為の物理的バリアとして働く事に依って、粘膜免疫系の不可欠なコンポーネントとして作用する。此の物理的隔離を原因として、片利共生微生物はホスト炎症性応答を開始する事なしに上皮と共存する6。インビトロ粘液層が同じ保護機能を供し得るという事を実証する為に、上皮単層を大腸菌(内腔側)及び末梢血単核細胞(PBMC、基底側)と24hに渡って粘液層の不在下(浸漬法に依って培養した)又は存在下(ALIプラスDM-VIP法に依って作り出した)に於いて共培養した(図5A)。基底上皮側から分泌される炎症性サイトカインを定量した(図5Bから5E)。大腸菌への暴露なしでは、PBMCは比較的低いレベルのサイトカインを生じた。PBMC及び上皮の共培養は類似のレベルのサイトカインを生じた。然し乍ら、上皮が粘液層の不在下に於いて細菌に暴露された後には、細菌無しのコントロールの物に対して相対的にサイトカイン産生の有意な増大が観察された。此れ等の結果は、粘液を産生しないCaco-2細胞が非病原性大腸菌の存在下に於いて成長させられる時に得られる物に類似である53,54。
全ての特許、特許出願、及び其れ等の公開物、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー(例えば、GENBANK(登録商標)データベースエントリー及び其の中の全ての利用可能な注釈)を包含するが是等に限定されない本明細書に列記される全ての参照は、其れ等が本明細書に於いて採用される方法論、技術、及び/又は組成物を補うか、説明するか、背景を提供するか、又は教示する程度迄、其れ等の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
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50. フォート(Voth)DE,バラード(Ballard)JD著,「クロストリジウム・ディフィシル毒素:疾患に於ける作用及び役割のメカニズム(Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease)」,クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ(Clinical microbiology reviews),2005年;第18巻:p.247-263
51. ヒー(He)D,ソウギオウルジス(Sougioultzis)S,ヘイゲン(Hagen)S,リウ(Liu)J,キーテス(Keates)S,キーテス(Keates)AC,ポゾウラキス(Pothoulakis)C,ラモント(LaMont)JT著,「クロストリジウム・ディフィシルA毒素はミトコンドリアの酸素ラジカル生成に依ってヒト結腸細胞IL-8放出を誘発する(Clostridium difficile toxin A triggers human colonocyte IL-8 release via mitochondrial oxygen radical generation)」,ガストロエンテロロジー(Gastroenterology),2002年;第122巻:p.1048-1057
52. マヒダ(Mahida)YR,マハ(Makh)S,ハイド(Hyde)S,グレイ(Gray)T,ボレイロ(Borriello)SP著,「ヒト腸上皮細胞に対するクロストリジウム・ディフィシルA毒素の効果:細胞剥離後のインターロイキン8産生及びアポトーシスの誘導(Effect of Clostridium difficile toxin A on human intestinal epithelial cells: induction of interleukin 8 production and apoptosis after cell detachment)」,ガット(Gut),1996年;第38巻:p.337-347
53. ハラー(Haller)D,ボーデ(Bode)C,ハメス(Hammes)WP,ファイファー(Pfeifer)AMA,シフリン(Schiffrin)EJ,ブルム(Blum)S著,「非病原性細菌は腸上皮細胞/白血球共培養に依る差別的サイトカイン応答を誘起する(Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures)」,ガット(Gut),2000年;第47巻:p.79-87
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B 基底側
BS 基底側
CML 濃縮された粘液層
DM 分化培地
EM 拡大培養培地
GC 杯細胞
LS 内腔側
M ムチン
OC 他の細胞型
PM 多孔質マトリックス
R リザーバ
SC 幹細胞
Claims (23)
- 方法が:
細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と;
幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、
を含み、
細胞単層の粘液産生細胞が、細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる、
粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法。 - 粘液層が微小物体にとって実質的に透過不可能である、請求項1に記載の方法。
- 粘液層の厚さが約1ミクロンから約1cmである、請求項1に記載の方法。
- 粘液層の厚さが約30ミクロンから約1cmである、請求項3に記載の方法。
- 基底リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の基底側の下方に存在し、内腔リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側の上方に存在し、基底リザーバ及び内腔リザーバは其々が液体培地を含み;
方法が:更に、
内腔リザーバ内の液体培地を取り除いて、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に気液界面を生ずる事;及び/又は
内腔リザーバ内の液体培地の体積を、細胞単層の内腔側の上方に於いて、約0.001mmから約10mm、任意に約0.001mmから約1mmの範囲の深さに調整する事、
を含む、
請求項1に記載の方法。 - 更に、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に又は其の上方に、不透過性の物理的バリア及び/又は部分的に透過性の物理的バリアを配置する事を含む、請求項1~5の何れか1項に記載の方法。
- 不透過性の物理的バリア及び/又は部分的に透過性の物理的バリアが、粘液産生細胞を含む細胞単層及び/又は細胞単層の粘液産生細胞に依って生ずる粘液層の内腔側と直接的接触をしている、請求項6に記載の方法。
- 液体培地が、不透過性の物理的バリア及び/又は部分的に透過性の物理的バリアと、粘液産生細胞を含む細胞単層及び/又は粘液層の内腔側との間にあり、液体培地の深さが約0.001mmから約10mm、任意に約0.001mmから約1mmの範囲である、請求項6に記載の方法。
- 液体培地がホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び/又は高張塩溶液を含む(ホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び/又は高張塩溶液)、請求項5に記載の方法。
- 幹細胞が、上皮幹細胞、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、呼吸器幹細胞、胃幹細胞、鼻腔幹細胞、生殖器官細胞(子宮頸部、膣、子宮)、尿道細胞、嗅覚細胞、口腔細胞、舌細胞、及び/又は結膜細胞である、請求項1~5の何れか1項に記載の方法。
- 幹細胞が腸上皮幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 粘液層が、約1から約100ミクロンのサイズ範囲のビーズ又は微生物にとって実質的に透過不可能である、請求項1に記載の方法。
- 力が細胞単層の表面に平行して適用される、請求項1~12の何れか1項に記載の方法。
- 力が表面張力の力の適用又は機械的な力の適用を含む、請求項13に記載の方法。
- 機械的な力が、攪拌子、細胞表面に平行して動く半固体材料、及び/又は細胞表面の上側に於けるスラリーの循環である、請求項14に記載の方法。
- 請求項1~15の何れか1項に記載の方法に依って生ずる、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
- 粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、請求項16に記載の生細胞コンストラクト。
- 粘液層が微小物体(micro-objective)にとって実質的に透過不可能である、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
- 粘液層が約1ミクロンから約1cmの厚さを含む、請求項18に記載の生細胞コンストラクト。
- 粘液層が約1ミクロンから約100ミクロンのサイズ範囲の微小物体にとって透過不可能である、請求項18に記載の生細胞コンストラクト。
- 粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、請求項18に記載の生細胞コンストラクト。
- 方法が:
請求項16に記載の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、薬物、又は粒子と接触させる事と;
生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと動く距離を測定し、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する事と、
を含む、
細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する方法。 - 生物が細菌、ウイルス、真菌、原虫、及び/又は蠕虫である、請求項22に記載の方法。
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