JP7117245B2 - 二重管状構造体 - Google Patents
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Description
典型的には、フィーダー細胞とは、有糸分裂不能であり、かつ標的細胞型の所望の表現型の維持において重要である必要不可欠な増殖因子およびサイトカインを分泌する代替ニッチ細胞として機能している、細胞のシートからなる。フィーダー細胞は、培養培地に増殖因子を放出することによって、また所望の細胞-ECM相互作用を高める細胞外マトリックス支持体を供給することによっても、他の細胞の増殖を支えている。幹細胞のその微小環境との相互作用によって、幹細胞の自己再生のメカニズムと分化能が調節されている。しかし、記載の通り、トランスウエルセットアップでは、残念なことに、これらのモデルは、低い経上皮電気抵抗(TEER)、通常では不透過性のマーカー分子の高透過性、トランスポーターの低い発現および機能(たとえば、P-糖タンパク質流出ポンプ)、および短期の生存率を示し、このようなことが、フィーダー層との組み合わせにおいても、モデルとしてその価値を制限している。
本開示の一部には、著作権保護の対象となる資料が含まれている(たとえば、これらに限定されないが、図、デバイスの写真または著作権保護が任意の法域で利用できるもしくは利用できる場合がある本提出物のその他の任意の態様。)。著作権者は、それが米国特許庁の特許ファイルまたは記録に存在する場合、誰でも特許文書または特許開示の複写をすることに対して異議がないが、ただし、そうでない場合には、何であろうとも著作権についての全ての権利を留保する。
「約(about)」および「およそ(approximately)」について、これらの用語は、量、時間的な期間等などの測定可能な数値に言及する場合に、具体的な数値からの±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、さらにより好ましくは±0.1%の変動を包含することを意味し、なぜなら、このような変動は開示される方法を実施するのに適切であるからである。
「含む(comprising)」について、この用語は、包括的およびオープンエンドであり、かつ排他的ではないと解釈される。具体的には、この用語および変化形は、特定の特徴、ステップ、または構成成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、または構成成分の存在を除外すると解釈されるべきではない。
「例示的な(exemplary)」について、この用語は、「一例、一事例、または一例示としての役割を果たす」ことを意味し、本明細書に開示されたその他の構成を除外すると解釈されるべきではない。
本明細書に記載の任意の方法、使用または組成物は、本明細書に記載の他の任意の方法、使用または組成物に対して実施することができることが企図される。本発明の方法、使用および/または組成物に関する文脈において論議する実施形態は、本明細書に記載の他の任意の方法、使用または組成物に対して用いることができる。したがって、一方法、使用または組成物に関連する一実施形態は、同様に本発明のその他の方法、使用および組成物に適用することができる。
a)マイクロ流体チャネルネットワーク中に間葉系細胞を導入するステップであって、間葉系細胞をマイクロ流体チャネルネットワーク中に
a1)水性培地を使用して導入し、または
a2)ゲル前駆体を使用して導入し、ゲル前駆体はマイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるステップ、
b)ステップa1)の場合において、好ましくはステップa2)の場合において、好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆されるまで、間葉系細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ、
c)間葉系細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワーク中に上皮細胞を導入するステップ、ならびに
d)好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの表面(壁)の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、および/または間葉系細胞の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、上皮細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ
を含む方法が、提供される。
A1.1)ゲル前駆体を、好ましくは細胞外マトリックスゲル前駆体を、マイクロ流体チャネルネットワーク中に、たとえば、マイクロ流体チャネルネットワークの一部分中に、たとえば、中空の体積部中に、導入するステップ、
A1.2)ゲルが固化またはゲル化することを可能とするステップ、
A1.3)ECMゲルによって被覆されていない、マイクロ流体チャネルネットワークの別の技術中に間葉系細胞を導入するステップ、あるいは
A2)細胞をゲル前駆体と混合するステップ、およびゲル前駆体がマイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるステップ、
B)ステップa1)の場合において、好ましくはステップa2)の場合において、好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆されるまで、間葉系細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ、
C)間葉系細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワーク中に上皮細胞を導入するステップ、ならびに
D)好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの表面の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、および/または間葉系細胞の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、上皮細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ
を含む方法が、提供される。
・ 骨形成タンパク質(BMP)のアクチベーターおよびインヒビターが含まれる。BMPは第一義的な形態形成シグナルの群を構成し、身体全体を通して組織形成を指揮している。
・ PDGF-BおよびPDGFA、血小板由来成長因子サブユニットBおよびサブユニットA。このファミリーのメンバーは、間葉系由来の細胞の分裂促進因子であり、8個のシステインのモチーフによって特徴付けられる。
a)上皮細胞および間葉系細胞の混合物をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップであって、水性培地を使用して細胞の混合物をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップ、
b)好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が細胞で被覆されるまで、間葉系細胞および上皮細胞が増殖することを可能とするステップ、
を含む方法が提供される。
ここで、本発明について全体的に説明してきたが、例示によって提供されかつ本発明を限定すること意図しない、以下の実施例を参照することにより本発明はさらに容易に理解されるであろう。
材料および方法
ヘッジホッグ、WntおよびBMPシグナルは、腸管の発達パターン化に際してならびに陰窩-絨毛軸を確立するのに必要とすることができる。in vivoにおいて、腸上皮細胞は相互作用し、下部にある間葉からのシグナルに依拠している。腸の間葉系細胞は、上皮-間葉系相互作用に動的に寄与し、上皮の増殖および分化の両方を調節している。
腸管の発達をモデル化するのに、本発明者らは好ましくは、腸管由来の(たとえば、マウス胚線維芽細胞、マウス線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、腸の線維芽細胞、平滑筋細胞、腸の筋線維芽細胞、好ましくはヒトの)間葉系細胞を使用し、ゲル(たとえば、コラーゲンI、IV、Hystem c、マトリゲルであってよい)の2レーンまたは3レーンに、ECM中1E6または5E6または10E6または15E6または20E6細胞/mlの密度で播種し、あるいは、pen/strep、1×NEAA、1×Glutamaxで補ったDMEM(またはEMEMまたはRPMI培地)中の10または15%FCSで構成される培地とECMとの組み合わせ中に播種した。ECMと培地との間の比率は、たとえば、9:1または8:1または7:1または6:1または5:1または3:1または2:1または1:1とすることができる。
本方法の一実験では、これらキューの組み合わせのうちの1つを染みこませてあるゲル含有樹脂(たとえば、Affi-gelビーズ(Bio Rad、153-7302)に間葉系細胞を播種することができ、hrSHH(たとえばPBS中0.1~1mg/mL;R&D Systems;1845-SH)に含浸し、これに、ゲル中の間葉系細胞を播種して、細胞濃縮を誘導した。次に、腸オルガノイド細胞(単層細胞またはTrypLEを5’min間使用することによって調製した細胞の2~5の細胞クラスター)をECMの、またはECMに対する次のチャネル中に導入した。細胞を1E6または5E6または10E6または15E6または20E6細胞/mlの密度で播種することができる。
重要な経路をアゴニストおよびインヒビターで処理する期間に続いて2つの細胞種をこうして続いて播種することによって、成熟した管状の腸ミニ臓器の首尾よい発達が確実となる。
間葉系細胞および上皮細胞の連続的播種
本実験については、図1に示す通り、400ミクロン幅のレーンを備える3レーンOrganoPlate(登録商標)(MIMETAS)を使用した。ECMゲルに播種した(下を参照)、腸の筋線維芽細胞を、5000個の細胞/実験の濃度で、ゲルレーン(103)に注入した。その後、EMEM培地中のCaCO-2細胞を(下記のように)、20,000細胞/実験の濃度でかん流レーン(102)に注入した。次に、Caco-2細胞を7日間培養した(筋線維芽細胞の存在下で)。第3のマイクロ流体チャネル(106)にはsmGM培地(平滑筋増殖培地;Lonza)が存在した。第7日目、位相差画像を撮り、その結果を図29Aおよび図29Bに示す。
EMEM(ATCC、Cat.No.30-2003)
Pen/Strep 1%(Sigma、Cat.No.P4333)
MEM非必須アミノ酸溶液(100×)1%(Gibco、Cat.No.11140-050)
FBS HI 10%(Gibco、Cat.No.16140-071)。
ECMゲル:
コラーゲンI 5mg/mL(AMSbio Cultrex3DコラーゲンIラット尾、5mg/mL、#3447-020-01)
i. 1M HEPES(Life Technologies 15630-122)
ii. 37g/L NaHCO3(Sigma S5761-500G))
SmGM-2 平滑筋増殖培地-2
SmGM-2 完全培地:
- SmBM基礎培地(Lonza、CC-3156)
- SmGM(商標)-2 SingleQuots(商標)サプルメントおよび増殖因子(hEGF、インシュリン、FGF-B、FBSおよびゲンタマイシン/アムホテリシンB)
間葉系細胞チューブ/上皮細胞チューブ
本実験については、400ミクロン幅のレーンを備える2レーンOrganoPlate(登録商標)(MIMETAS)を使用した。
細胞を、内皮細胞増殖培地MV2(Promocel、Cat:C-22022)中のvvHUVEC-RFP内皮細胞(Angiocrine、細胞通路4)と、周皮細胞培地(Sciencell)中の脳血管周皮細胞(Sciencell、細胞通路4)との4:1混合物、5000細胞/μLの総出発濃度で、培養し、いっぽう、2レーンOrganoPlate(登録商標)をかん流ロッカーに配置した(傾斜角7°、ロッキングサイクル8min)。
出願時の特許請求の範囲は以下の通り。
[請求項1]
マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および/またはモニタリングする方法であって、
a)前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に間葉系細胞を導入するステップであって、前記間葉系細胞を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に
a1)水性培地を使用して導入し、または
a2)ゲル前駆体を使用して導入し、前記ゲル前駆体は、前記マイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるステップ、
b)ステップa1)の場合において、好ましくはステップa2)の場合において、好ましくは、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆されるまで、前記間葉系細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ、
c)前記間葉系細胞を含む前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に上皮細胞を導入するステップ、ならびに
d)好ましくは、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、および/または前記間葉系細胞の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、前記上皮細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ
を含む方法。
[請求項2]
ゲル前駆体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入され、前記ゲル前駆体は前記マイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占める、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
前記ゲルを、好ましくは、毛細管圧力障壁の使用によって、UVパターン化によって、またはゲル化後に針を引っ込ませることによって、またはゲル化後に除去される犠牲層を有することによって、パターン化する、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
[請求項4]
ステップa)において導入される前記間葉系細胞は、前記ゲル前駆体中に分散/懸濁されている、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法
[請求項5]
ステップa)において、水性培地を使用して、好ましくはゲルに沿って、前記間葉系細胞を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
[請求項6]
ステップb)において、間葉系細胞の少なくとも群/層/シートが前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記間葉系細胞を増殖および/または分化させる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
[請求項7]
ステップb)において、間葉系細胞の少なくとも管状構造体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記間葉系細胞を増殖および/または分化させる、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
[請求項8]
導入する際、前記間葉系細胞および/または前記上皮細胞は解離している、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
[請求項9]
ステップd)において、上皮細胞の少なくとも群/層/シートが前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記上皮細胞を増殖および/または分化させる、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
[請求項10]
ステップd)において、上皮細胞の少なくとも管状構造体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記上皮細胞を増殖および/または分化させる、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
[請求項11]
ステップa)において前記間葉系細胞をゲル中において導入する場合、ステップd)において、上皮細胞の少なくとも群/層/シートが、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占める前記ゲルの少なくとも一部分を被覆するまで、前記上皮細胞を増殖および/または分化させる、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
[請求項12]
前記管状構造体の内腔を通して増殖培地の流れが適用され、前記流れは一方向性であっても二方向性であってもよい、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
[請求項13]
因子Wnt、ノギン、egf/fgf、および/またはrespondinのうちの少なくとも1つを含む増殖培地の存在下で細胞を培養する、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法
[請求項14]
前記間葉系細胞の少なくとも一部分はマイクロ流体チャネルネットワークの壁と前記上皮細胞との間に配置される、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
[請求項15]
ステップd)において、前記上皮細胞は、前記間葉系細胞によって形成される管状構造体の内側に管状構造体を形成する、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
[請求項16]
ステップd)において、前記上皮細胞は、頂端側および基底側を備える細胞の層を形成することが可能となり、前記基底側は前記間葉系細胞に面している、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
[請求項17]
前記間葉系細胞の少なくとも一部分は前記上皮細胞の少なくとも一部分と直接接触し、かつ/または、間葉系細胞シートと上皮細胞シートとの間の距離は、基底板の厚さ以下である、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
[請求項18]
前記間葉系細胞は、筋線維芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞および間質細胞から選択され、好ましくは、前記間葉系細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
[請求項19]
前記上皮細胞は、単層上皮細胞、単層扁平上皮細胞、重層上皮細胞、または円柱上皮細胞から選択され、好ましくは、前記上皮細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
[請求項20]
前記間葉系細胞および/または前記上皮細胞は初代細胞である、請求項1から19のいずれか1項に記載の方法。
[請求項21]
前記方法は、前記上皮細胞を含む前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に存在する水性培地を除去することによって前記上皮細胞を空気にさらすステップをさらに含む、請求項1から20のいずれか1項に記載の方法。
[請求項22]
前記マイクロ流体細胞培養システムは培養チャンバを備え、ここに、ステップa)における前記間葉系細胞およびステップc)における前記上皮細胞を導入する、請求項1から21のいずれか1項に記載の方法。
[請求項23]
前記マイクロ流体チャネルネットワークは、好ましくは前記間葉系細胞および前記上皮細胞を含む前記培養チャンバへの行き来であるが、前記細胞に流体流路を提供するように構成されている第1の部分および/または前記細胞からの流体流路を提供するように構成されている第2の部分の存在によって特徴付けられる、請求項1から22のいずれか1項に記載の方法。
[請求項24]
ゲルが存在する場合、前記ゲルを、前記マイクロ流体チャネルネットワーク内に、または前記マイクロ流体チャネルネットワークに隣接しているチャネル内に供給し、かつ前記ゲルは前記マイクロ流体チャネルネットワークと直接接触している、請求項1から23のいずれか1項に記載の方法。
[請求項25]
前記ゲルに隣接して、前記ゲルと接触しているさらなる中空マイクロ流体チャネルが存在するが、前記チャネルは、前記上皮細胞を含む前記マイクロ流体チャネルと直接接触していない、請求項1から24のいずれか1項に記載の方法。
[請求項26]
ステップa)において様々な種類の間葉系細胞を導入し、および/または、ステップc)において様々な種類の上皮細胞を同一のマイクロ流体チャネル中に導入する、請求項1から25のいずれか1項に記載の方法。
[請求項27]
前記ゲルは、基底膜抽出物、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、コラーゲンI、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、D-リジン、エンタクチン、ヘパランスルフィドプロテオグリカンまたはそれらの組み合わせである、請求項1から26のいずれか1項に記載の方法。
[請求項28]
前記マイクロ流体細胞培養システムによって、前記マイクロ流体チャネルネットワーク中の前記細胞におよび/もしくは前記ゲルにならびに/またはさらなるマイクロ流体チャネルネットワークに、連続した光路をもたらす、請求項1から27のいずれか1項に記載の方法。
[請求項29]
前記方法は、前記マイクロ流体培養システムにおける、前記細胞、ゲル、および/またはマイクロ流体チャネルネットワークの複数の画像を撮るステップをさらに含む、請求項1から28のいずれか1項に記載の方法。
[請求項30]
ステップa)~d)のいずれかと同時にまたはその後に、前記細胞を試験化合物と接触させる、請求項1から29のいずれか1項に記載の方法。
[請求項31]
請求項1から30のいずれか1項に記載の前記方法により得られるマイクロ流体細胞培養システム中の前記細胞の使用であって、上皮障壁を越えての輸送の評価、毒性研究、マイクロバイオームとの共培養、食品の吸収の研究、炎症の研究、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、COPD、喘息、がんなどの疾患モデルの提供のため、健常および疾患条件での上皮機能に関する機構研究のための使用。
[請求項32]
細胞の内側群および細胞の外側群を含むマイクロ流体チャネルネットワークを有するマイクロ流体細胞培養システムを含む組成物またはシステムであって、細胞の前記内側群は細胞の前記外側群によって少なくとも部分的に被覆され、かつ、前記内側群の前記細胞は上皮細胞であり、前記外側群の前記細胞は、間葉系細胞であり、好ましくは、細胞の前記内側群および細胞の前記外側群は相互作用しているか、または直接接触している、
組成物またはシステム。
[請求項33]
マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および/またはモニタリングする方法であって、
a)上皮細胞および間葉系細胞の混合物を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップであって、水性培地を使用して細胞の前記混合物を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップ、
b)好ましくは、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が前記細胞で被覆されるまで、前記間葉系細胞および前記上皮細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ、
を含む方法。
[請求項34]
好ましくは、間葉系細胞および上皮細胞が管状構造体を形成する、前記間葉系細胞および上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システム。
[請求項35]
先行請求項のいずれか1項に記載の、上皮細胞を培養および/またはモニタリングする方法によって入手可能な、間葉系細胞および上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システム。
Claims (14)
- マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および/またはモニタリングする方法であって、
a)前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に間葉系細胞を導入するステップであって、前記間葉系細胞を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に
a1)水性培地を使用して導入し、または
a2)ゲル前駆体を使用して導入し、前記ゲル前駆体は、前記マイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるステップ、
b)前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆され、間葉系細胞の少なくとも群/層/シートが形成されるまで、前記間葉系細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ、
c)前記間葉系細胞を含む前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に上皮細胞を導入するステップ、ならびに
d)前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、および/または前記間葉系細胞の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆され、上皮細胞の少なくとも群/層/シートが形成されるまで、前記上皮細胞が増殖および/または分化することを可能とするステップ
を含み、
前記間葉系細胞が、前記上皮細胞と直接接触している、方法。 - 前記間葉系細胞が、前記上皮細胞と直接接触しており、人工的な、非天然の、または外部から導入された膜が存在しない、請求項1に記載の方法。
- ゲル前駆体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入され、前記ゲル前駆体は前記マイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占める、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲルをパターン化する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)において、間葉系細胞の少なくとも管状構造体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記間葉系細胞を増殖および/または分化させる;及び
ステップd)において、上皮細胞の少なくとも管状構造体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記上皮細胞を増殖および/または分化させる、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記管状構造体の内腔を通して増殖培地の流れが適用され、前記流れは一方向性であっても二方向性であってもよい、請求項5に記載の方法。
- ステップd)において、前記上皮細胞は、頂端側および基底側を備える細胞の層を形成することが可能となり、前記基底側は前記間葉系細胞に面している、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記間葉系細胞の少なくとも一部分は前記上皮細胞の少なくとも一部分と直接接触し、かつ/または、間葉系細胞シートと上皮細胞シートとの間の距離は、基底板の厚さ以下である、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記間葉系細胞は、筋線維芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞および間質細胞から選択され;及び、
前記上皮細胞は、単層上皮細胞、単層扁平上皮細胞、重層上皮細胞、または円柱上皮細胞から選択される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記マイクロ流体細胞培養システムは培養チャンバを備え、ここに、ステップa)における前記間葉系細胞およびステップc)における前記上皮細胞を導入する、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップa)において様々な種類の間葉系細胞を導入し、および/または、ステップc)において様々な種類の上皮細胞を同一のマイクロ流体チャネル中に導入する、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マイクロ流体細胞培養システムによって、前記マイクロ流体チャネルネットワーク中の前記細胞におよび/もしくは前記ゲルにならびに/またはさらなるマイクロ流体チャネルネットワークに、連続した光路をもたらす、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- ステップa)~d)のいずれかと同時にまたはその後に、前記細胞を試験化合物と接触させる、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から13のいずれか1項に記載の前記方法により得られるマイクロ流体細胞培養システム中の間葉系細胞及び上皮細胞の使用であって、上皮障壁を越えての輸送の評価、毒性研究、マイクロバイオームとの共培養、食品の吸収の研究、炎症の研究、疾患モデルの提供のため、健常および疾患条件での上皮機能に関する機構研究のための使用。
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