KR20180131569A

KR20180131569A - 이중 관형 구조

Info

Publication number: KR20180131569A
Application number: KR1020187029134A
Authority: KR
Inventors: 폴 부우투; 도로타 마우고르자타 쿠렉; 아드리아너스 테오도루스 요오레; 세바스티안 요하네스 트리치; 헨리에테 레오노레 란츠
Original assignee: 미메타스 비.브이.
Priority date: 2016-03-09
Filing date: 2017-03-09
Publication date: 2018-12-10
Also published as: WO2017155399A1; AU2017231580A1; JP7117245B2; KR102403435B1; CA3017100A1; JP2019507602A; CN109072184A; NL2016404B1; NL2016404A; EP3426769A1; BR112018068303A2; US20190076842A1; RU2756404C1; AU2017231580B2

Abstract

본 발명은 미세유체 채널 네트워크(microfluidic channel network)를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 사용하여 상피 세포를 배양 및/또는 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서 상피 세포가 중간엽 기원의 세포에 의해 미세유체 세포배양 시스템에서 줄지어 있다. 세포는 튜브형(tubular) 또는 튜브형(tube-like) 구조, 즉 튜브 내 튜브를 형성할 수 있다. 이 방법은, 이에 제한되지 않으나 고처리량 스크리닝(high-throughput screening) 및 건강 및 질병의 상피 분석을 포함하여 다양한 용도에 적합한 개선된 상피 모델을 허용한다.

Description

이중 관형 구조

상피(epithelium)는 내부 및 외부 신체 표면의 내벽(lining)을 형성하는 전문화되고 분극화된 조직이다. 상피를 형성하는 세포는 밀집되어 하나 이상의 층을 형성할 수 있다. 상피는 하나의 세포가 두껍거나 (단층 상피) 또는 두 개 또는 그 이상의 세포가 두껍게 될 수 있다(중층 상피). 편평 상피(squamous epithelium), 입방 상피(cuboidal epithelium), 원주 상피(columnar epithelium) 및 이행 상피(transitional epithelium)를 포함하여, 형태 및 기능에 기초한 상이한 유형의 상피(단층 및 중층 상피 모두)가 인식된다.

일반적으로 기저막으로 불리는 결합 조직의 얇은 시트는 하부 조직(underlying tissue)으로부터 상피를 분리한다. 기저막은 상피에 구조적 지지를 제공하고 그것을 인접 구조에 연결한다. 기저막은 부상(injuries) 후 상피가 성장하고 재생할 수 있는 스케폴드 역할을 한다. 상피 조직은 신경 지배적(innervated)이지만 무혈관성(avascular)이며, 상피는 하부 조직의 혈관에서 확산되는 물질에 의해 영양공급되어야 한다. 기저막은 어느 물질이 상피에 들어갈 수 있는지를 결정하는 선택적으로 투과 가능한 막으로 작용한다

발달(development) 중 상피의 분화는 형태 발생 과정(morphogenetic events)의 정렬된 순서와 밀접하게 관련되어 있다. 여러 실험적 연구는 이러한 발달 과정이 상호간 상피 중간엽 작용(reciprocal epithelial-mesenchymal interactions)에 의존한다는 것을 강조했다.

인 비보(in vivo)에서 관찰된 조직 및 제한적인 행동을 반복하는 상피 장벽 조직의 인 비트로(in vitro) 모델의 개발에 상당한 관심이 있으며, 이는, 예를 들어, 비 침습적, 신속, 경제적, 및 신약 후보 물질, 화학물질 및 식료품의 재현 가능한 시험 및/또는 스크리닝에 대한 사용을 허용할 것이다. 그러나 중요한 신호(important signals)는 세포가 2차원 플라스틱 기판(plastic substrata)에서 엑스 비보(ex vivo)로 배양될 때 손실된다. 수득된 조직은 많은 경우에 있어서 그들의 인 비보 등가 조직의 형태학적 특성을 나타내지 않으며, 많은 특수화고 분화된 세포 유형이 부재한다.

이러한 한계를 극복하기 위한 노력으로 세포가 세포외 기질(extracellular matrix)에 내포되어 성장한 3D 세포 배양 모델이 개발되었다. 이 접근법은 차별화된 기능의 발현을 향상시키고 조직 구성을 개선시킨다(Pampaloni et al. (2007). Nat Rev Mol Cell Biol 8: 839-84).

특히 오르가노이드 배양(organoid culture) 분야에서 최근의 진보가 이루어졌다. 오르가노이드는 일반적으로 인체에서 사용할 수 있는 가장 특수화된 세포로 구성되는 3차원 오간 버드(three-dimensional organ-bud)이다. 실제로, 배아 발달 동안 조직의 배양 및 분화는 줄기세포가 다양한 분화된 세포로 분화되도록 인 비트로 환경에서 모방된다. 그런 오르가노이드의 잘 알려진 예로는 소장 오르가노이드(small intestinal organoids)이다(Shoichi Date and Toshiro Sato, Mini-Gut Organoids: Reconstitution of the Stem Cell Niche, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2015, Vol. 31: 269-289). Wnt 경로 작용제(예: Wnt3a, R-spondin, CHIR99021), BMP/TGF 경로 억제제(예: Noggin), EGF 및 기저막 추출물의 환경(마트리겔(matrigel) 또는 이와 유사한 것)과 같은 성장 인자 및 신호 분자의 칵테일은, 원발성 장 소낭선(primary gut crypts)의 배양, 이들의 줄기세포 적소(stem cell niche) 및 예를 들어 배상 세포(goblet cells), 장 세포(enterocytes cells) 및 장내분비 세포(enteroendocrine cells)에 대한 세포의 분화 잠재력 유지를 보장한다. 이것은 소낭선(crypt) 및 융모(villus) 형성을 포함하여 소화관(gut)의 이차 형태학적 양상을 갖는 3차원 구조로 이어진다. 초기 인간의 식도, 위, 결장, 간 및 췌장의 배양을 위해 유사한 3차원 배양이 확립되었다.

최근에, 유도된 다능성 줄기세포(induced pluripotent stem cells)로부터 두뇌 오르가노이드(brain organoids)를 성장시키는데 엄청난 진보가 있었다. 지속적인 떨림이 있는 정지된(suspended) 회전 타원체(spheroids)의 장기간의 배양은 전뇌(forebrain) 및 후뇌(hindbrain)의 특징과 같은 특수한 부분을 가진 소위 미니브레인(minibrains)으로 이어진다. 최근에는, 복잡한 배양 프로토콜을 사용하여, 사람 신장의 사구체(glomeruli)에 존재하는 고도로 전문화된 세포로 다시 인도되는, 트랜스웰 시스템(transwell systems)에서 유도된 다능성 줄기세포로 시작하는 신장 사구체의 배양에서 돌파구가 실현되었다.

이러한 오르가노이드 기술의 단점은 미니 기관(mini-organs)에 대한 구조적 컨트롤(structural control)이 없다는 점이다. 특히 구면형태로 인해 독립적인 정점-기저(apical-basal) 접근이 부족하다. 세포외 기질 컨텍스트가 오르가노이드 성장에 중요하기 때문에, 정점 기저 접근이 가능하지만, 지금까지의 진행은 매우 제한적일 수 있도록, 트랜스웰 멤브레인 상에 평탄한 극성 조직을 생성하기 위해 오르가노이드 프로토콜을 적용하려고 시도되어 왔고, 이것의 통합은 누수 방지 벽(leak-tight barriers)을 가져오지 않는다.

고정된 인비트로 모델(Static in vitro models)은 트랜스웰 셋업에서, 상이한 출처로부터의 상피세포를 단독으로 배양함으로써, 또는 반투과 멤브레인(semipermeable membrane)에 지지 세포[배양보조세포층(feeder layers) 또는 섬유아세포 같은 중간엽 세포(mesenchymal cells)]와의 조합으로 배양함으로써 개발되었다. 불행하게도, 이들 모델은 낮은 상피 전기저항(trans-epithelial electrical resistance; TEER), 전형적으로 불침투성 마커 분자의 높은 투과성, 운반자[예를 들어, P-당단백질 유출 펌프(P-glycoprotein efflux pump)]의 낮은 발현 및 기능, 및 단기 생존력을 나타낸다. 이것은 모델로서의 이들의 가치를 제한할 수 있다.

배양보조세포층은 일반적으로 많은 유형의 배아 및 성인 줄기세포의 배양을 지지한다. 예를 들어, 배아 줄기세포(embryonic stem cells; ESC)의 배양을 지원하기 위해 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts; MEF)가 자주 사용된다. 다른 줄기세포 형태의 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSC)의 유지는 간질 중간엽 줄기세포(stromal mesenchymal stem cells)와의 공배양(co-culture)에 의해 달성되고 촉진될 수 있다.

전형적으로, 배양보조세포층은 유사 분열을 일으키지 않는(mitotically inactive) 세포 시트로 구성되며, 표적세포 유형의 원하는 표현형의 유지에 중요한 필수 성장인자 및 사이토카인을 분비하는 대체 적소(niche) 세포로서 작용한다. 배양보조세포층은 배양 배지에 성장인자를 방출할 뿐만 아니라 원하는 세포-ECM 상호작용을 강화시키는 세포외 기질을 제공함으로써 다른 세포의 성장을 지지한다. 줄기세포의 미세환경(microenvironment )과의 상호작용은 줄기세포의 자가재생 및 분화능력을 조절한다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이, 불행히도 트랜스웰 셋업에서 이들 모델은 낮은 상피 전기저항(TEER), 전형적으로 불침투성 마커 분자의 높은 투과성, 운반자(예를 들어, P-당단백질 유출 펌프)의 낮은 발현 및 기능, 및 단기 생존력을 나타내며, 이는 배양보조세포층과의 조합에서도 모델로써의 가치를 제한한다.

또한, 현재의 방법 및 수단은 상피 조직을 통한 흡수, 수송 및/또는 분비의 분석과 같은 고처리량(high-throughput) 연구를 허용하지 않는다. 예를 들어, 공지된 트랜스웰 플레이트는 조직 샘플이 트랜스웰 플레이트의 멤브레인에 충분히 부착되지 않기 때문에 상피 조직의 샘플에 대한 흡수, 수송 및/또는 분비를 측정하기에 적합하지 않다.

따라서, 세포의 증식 및 분화가 인비보 상황을 모방하는 인간 상피를 배양하는, 보다 명확하고 예측 가능한 모델을 개발할 필요가 있다. 이에 비추어, 개선된 인비트로 상피 모델의 생성물, 조성물, 방법 및 사용은 매우 바람직할 것이지만 아직 이용 가능하지는 않다. 특히, 인비트로 상피 장벽 모델에 독립적인 정점-기저 접근을 제공할 수 있고, 예를 들어 인비보에서 동등한 조직으로 존재하는 대부분의 특수화된 세포를 나타낼 수 있는, 신뢰성 있고 효율적이며 재생 가능한 방법에 대한 당업계의 명백한 요구가 있다. 이들 모델은 예를 들어, 고처리량 스크리닝, 약물 흡착, 수송 및 독성 연구, 질병 모델링, 예를 들어 미생물 배양 및/또는 영양소 섭취(nutrient uptake)를 연구하기 위한 모델과의 상호작용에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 근간을 이루는 기술적 문제는 전술한 필요성들 중 어느 하나를 따르기 위한 그러한 제품, 조성물, 방법 및 용도의 제공에서 알 수 있다. 기술적인 문제점은 청구범위 및 이하에서 특징되는 실시예에 의해 해결된다.

도 1: 상피 튜브를 배양하기 위한 장치의 예(축척에 맞지 않음): 밑면에서의 시각.
도 2: 상피 튜브를 배양하기 위한 장치의 예(축척에 맞지 않음): 윈도우 시각의 클로즈업.
도 3: 상피 튜브를 배양하기 위한 장치의 예(축척에 맞지 않음): 도 2의 수직 단면.
도 4 및 5: 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계: 중간엽 세포를 포함하는 ECM 겔 전구체를 도 2/3의 겔 레인에 삽입하고 모세관 압력 장벽 상에 고정시키고 겔화시킨다. ECM은 예를 들어, 마트리겔(감소된 성장인자 또는 감소되지 않은 성장인자), 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브리노겐, 피브로넥틴 또는 이들의 조합뿐만 아니라 합성 ECM일 수 있다.
도 6 및 7: 도 4/5에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 상피 세포는 제1 관류채널에 도입된다(및 선택적으로 성장 배지는 제2 관류 채널에 도입된다).
도 8 및 9: 도 6/7에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 도 3의 장치는 상피 세포가 겔 표면 상에 안착하도록(settling) 수직으로 위치된다. 상피 세포가 부착되면 흐름이 유도된다(나타내지 않음).
도 10 및 11: 도 8/9에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 상피 세포는 증식되고, 세뇨관(tubule)을 형성하기 위해 채널 벽 및 겔 표면을 선상화(line)한다.
도 12 및 13: 도 10/11에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 중간엽 세포가 상피 세포와 상호작용하고 상피가 분화되는 단계; 분화는 규칙적인 형태학적 패턴을 유도할 수 있다: 소낭선 구조(crypt structures).
도 14 및 15: 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계: ECM 겔 전구체가 도 2/3의 겔 레인에 삽입되고, 모세관 압력 장벽에 고정되어 젤화된다.
도 16 및 17: 도 14/15에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 중간엽 세포가 제1 관류채널에 도입된다(및 선택적으로 성장 배지는 제2 관류채널에 도입된다).
도 18 및 19: 도 16/17에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 도 3의 장치는 중간엽 세포가 겔 표면 상에 안착되도록 수직으로 위치된다. 중간엽 세포의 접착시 흐름이 유도될 수 있다(나타내지 않음).
도 20 및 21: 도 18/19에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 중간엽 세포가 증식되고 채널 벽 및 겔 표면을 선상화한다.
도 22: 도 20/21에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 상피 세포는 제1 관류채널에 도입된다(및 선택적으로 상이한 배지가 사용된다).
도 23: 도 22에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 도 3의 장치는 겔 표면 상에 안착된 중간엽 세포 상에 상피 세포가 안착하도록 수직으로 위치한다. 중간엽 세포의 접착시 흐름이 유도될 수 있다(나타내지 않음).
도 24: 도 23에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 여기서 상피 세포는 증식할 수 있고 단단한 접합부를 갖는 세뇨관을 형성하기 위해 채널 벽 및 겔 표면을 선상화한다.
도 25 및 26: 도 24에 설명된 단계에 따라 상피 튜브를 배양하는 방법의 단계로, 중간엽 세포 및 상피 세포가 상호작용하고 상피가 분화되는 단계; 분화는 규칙적인 형태학적인 패턴으로 이어질 수 있다: 소낭선 구조물 및 돔(domes).
도 27: 1 겔 레인 및 한 개의 관류 레인을 갖는 도 1의 다른 실시양태.
도 28: 단일 유입구(single inlet)로부터 채워지는 2 겔 레인을 갖는 도 1의 다른 실시양태(선택적으로 분리된 유입구일 수 있음).
도 29: 1. 도 1에서 나타낸 바와 같이 400 micron 와이드 레인을 갖춘 3 레인 OrganoPlate®(MIMETAS)에서 중간엽 및 상피 세포를 순차적으로 파종한 후의 위상차 영상(Phase contrast images).
도 30: 관 모양의 구조(tubular structure)를 보여주는, 400 micron 와이드 레인을 갖춘 2 레인 OrganoPlate®(MIMETAS)에서 중간엽/상피 세포를 파종한 공초점 현미경 검사 결과.

정의

본 개시 내용의 일부는 저작권 보호 대상(다이어그램, 장치 사진 또는 저작권 보호가 관할 지역에서 사용 가능할 수도 있는 이 제출의 다른 측면 등)을 포함한다. 저작권 소유자는 특허청 특허 파일이나 기록에 나타나기 때문에 특허 문서 또는 특허 공개 중 누구라도 팩스 복제에 반대하지 않지만 다른 방법으로 모든 저작권 권리를 보유한다.

본 발명의 방법, 조성물, 용도 및 다른 측면에 관한 다양한 용어가 명세서 및 청구범위를 통해 사용된다. 이러한 용어는 달리 언급하지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 통상적인 의미를 부여받는다. 다른 특별히 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다. 본원에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 실시하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재되어 있다.

"A", "an" 및 "the": 이 단수형 용어는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포(a cell)"에 대한 언급은 2개 이상의 세포들의 조합 등을 포함한다.

"약(About)" 및 "대략(approximately)": 이 용어는 양, 시간 지속 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게 ±5%의 변화를 포함하는 것을 의미하며, 더욱 바람직하게는 ±1%, 더욱 더 바람직하게는 ±0.1%이다.

"포함(Comprising)": 이 용어는 포괄적이고 개방적이며 독점적이지 않은 것으로 해석된다. 특히, 용어 및 그 변형은 명시된 특징, 단계 또는 구성 요소가 포함됨을 의미한다. 이러한 용어는 다른 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다.

"예시적인(Exemplary)": 이 용어는 "예시(example), 예(instance) 또는 도시(illustration)로서의 역할을 하는"것을 의미하며, 여기에 개시된 다른 구성을 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다.

상세 설명

여기에 기술된 임의의 방법, 용도 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법, 용도 또는 조성물에 대해 구현될 수 있음이 고려된다. 본 발명의 방법, 용도 및/또는 조성물과 관련하여 논의된 실시양태는 본원에 기술된 임의의 다른 방법, 용도 또는 조성물에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법, 용도 또는 조성물에 관한 실시양태는 본 발명의 다른 방법, 용도 및 조성물에도 적용될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도, 본원 발명의 기술적 문제가 본원에 기재된 미세유체 세포배양(microfluidic cell culturing) 방법에 의해 해결될 수 있다는 것을 발견했다.

미세유체 세포배양은 중요성이 증가하는 기술이다. 이 기술은 약물 스크리닝, 조직배양, 독성 스크리닝 및 생물학적 연구에서 그 응용성을 발견할 수 있다. 미세유체 세포배양의 주요 이점은 재관류 흐름(perfusion flow), 향상된 공동 배양(co-culturing) 및 전통적인 세포 배양에 안정적인 구배(gradients)와 같은 측면을 추가할 수 있으며, 높은 품질의 데이터, 시약 소비 감소 및 비용 절감을 제공 할 수 있다는 것이다.

미세유체 시스템, 장치, 방법 및 제조와 관련된 많은 양상이 WO2002/079320, WO 2013/151616, WO 2010/086179, WO2012/120101과 같은 특허 문헌을 포함하여 선행기술에서 논의되거나 또는 예를 들어 Mimetas, Leiden, The Netherlands (e.g. OrganoPlate; www.mimetas.com)와 같이 상업적으로 이용 가능하다. 본 출원 및 문서를 본 명세서에 기재된 청구범위로 특별한 제한을 두지 않아도 되지만,이 문서는 특정 실시양태와 관련된 유용한 배경자료를 제공한다.

고품질의 시료 준비는 많은 임상, 연구 및 기타 응용 분야에서 중요하다. 세포의 배양, 특성 분석 및 시각화는 약물 발견, 질병 진단 및 분석, 다양한 치료 및 실험 작업 분야에서 점차 중요하게 평가되고 있다. 미세유체 세포배양 기술을 사용하면 체외에서의 특성을 면밀하게 나타내는 시험관내 시료를 얻을 수 있다는 것이 중요하다. 이러한 인비트로 샘플은 광범위한 분자 및 세포 응용 분야에 잠재적으로 도움이 될 수 있다.

본 발명의 근간을 이루는 기술적 문제점은 생체 내 특성을 보다 정확하게 나타내는 인비트로 상피 세포 배양을 제공할 수 있는 세포배양 방법 및 시스템 분야에 있다. 이것은 극성(전달 및 채널 단백질(OAT2/3, MATE1/2, NKCC1)과 같은 정점 및 기저 측 단백질의 발현, 구조 관련 단백질(villin in brush borders, actin)의 발현 및 기능, 막 수용체(EGFR/ErbB), 부착 접합부(adherens junctions), 초점 점착(focal adhesions), 세포 및 세포층 형성의 형태(모양 및 외관; 치수; 미세 융모(microvilli); 섬모(cilia); 컨플루언시(confluency)) 및 기능(장벽 기능, 세포 표면 수용체의 발현, 흡수 및 분비)을 포함할 수 있다.

가장 중요하게는, 이들 모델은 바람직하게는 특정 위치에서 특이적 세포로 세포를 분화시키는 반면, 다른 특정 위치에서 줄기세포 적소를 유지하는 것을 나타낸다. 소장에서 이러한 특수화된 세포의 예로는 장세포(enterocytes), 배상세포(goblet cells), 파네스 세포(Paneth cells), 신장 내 족세포(podocytes), 다양한 특수 입체 상피세포(cuboidal epithelia), 망막 내 망막 색소 상피세포(retinal pigment epithelium), 간상체(rods), 원뿔(cones), 양극성 세포(bipolar cells), 신경절 세포(ganglion cells), 폐 내 타입 1 편평폐포세포(squamous alveolar cell), 타입 2 great 폐포세포를 포함한다. 특정 위치에서 세포의 분화는 별개의 기능 및 행동을 갖는 특수화된 세포를 유도할뿐만 아니라, 많은 경우 조직의 형태를 변화시켜 특성 형태를 부여한다. 예를 들면 소장 내의 소낭선-융모(crypt-villi) 구조 및 점액(mucin) 생성, 폐 내의 폐포, 사구체(glomerula), 신장 내 Henle의 근위 및 원위 세뇨관 및 루프, 망막 내의 색소층과 간상체 및 원뿔의 층이 있다. 트랜스웰 및 표면 부착 세포 배양의 평면 팬케이크 유사 세포층(flat pancake-like cell layers), 또는 인비보 상황 또는 미세유체 시스템에서 조직의 관형 구조(tubular structures)와 같은 1차 형태에 대해 차별화하기 위해 이러한 특징적인 형상을 2차 형태로 지칭한다.

생체 내 대응물에 더 잘 부합하는 인비트로 샘플을 제공하는 것이 중요하다.

당업계에서는 미세유체 세포배양 시스템, 마이크로챔버 또는 미세유체를 이용하는 몇몇 방법이 제안되어있다. 대부분의 다른 시스템은 표준 배양 플레이트를 사용하고 생체 내 특성을 보다 잘 나타내는 상피 세포를 배양하기 위해 다양한 장벽 삽입물을 사용한다(예: 트랜스웰 투과성 지지체). 그러나 현재 이용가능한 시스템은 생체 내 특성과 매우 흡사한 시험관내 상피 세포 샘플 제공 및 사용 용이성, 높은 처리량 또는 자동화된 응용에 필요한 여러 측면과 관련하여 아직 성취하지 못했다.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도, 미세유체 채널 네트워크를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 사용하여 상피 세포를 배양 및/또는 모니터링하는 방법을 제공함으로써 당업계의 문제점을 해결할 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 방법은 2차 형태학을 나타낼 수 있고 특화되고 분극화된 분화된 세포를 제공할 수 있는 미세유체 장치에서 튜브 형성(tube-formation)을 가능하게한다. 이것은 생체 내 조직 조직(tissue organization)과 닮은 것으로 보이는 패턴에 따른 것일 수 있다. 이는 간략하게는 중간엽 세포와 상피 세포의 라이닝(lining)에 의해 달성되고, 바람직한 실시양태에서, 세포외 매트릭스 겔과 같은 겔의 사용은 2차 형태를 수용하며, 예를 들어 트랜스 구조(transwell) 시스템은 강체 구조(rigid structure)를 사용한다.

따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 미세유체 채널 네트워크를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 사용하여 상피 세포를 배양 및/또는 모니터링하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

a) 중간엽 세포(mesenchymal cells)를 미세유체 채널 네트워크에 도입하는 단계로, 여기서 상기 중간엽 세포는 미세유체 채널 네트워크 내로 도입될 때

a1) 수성 배지(aqueous medium)를 사용하는 단계; 또는

a2) 겔 전구체(gel precursor)를 사용하여 겔 전구체를 미세유체 채널 네트워크에서 겔화시켜 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부를 차지하게 하는 단계;

b) 단계 a1)의 경우, 및 바람직하게는 단계 a2)의 경우, 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부가 중간엽 세포로 덮일 때까지 중간엽 세포를 증식(proliferate) 및/또는 분화(differentiate)시키는 단계;

c) 중간엽 세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크에서 상피 세포를 도입하는 단계; 및

d) 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크 표면(벽)의 적어도 일부가 상피 세포로 덮일 때까지 및/또는 중간엽 세포의 적어도 일부가 상피 세포로 덮일 때까지 상피 세포가 증식 및/또는 분화되도록 하는 단계를 포함한다.

대안적으로, 미세유체 채널 네트워크를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 사용하여 상피 세포를 배양 및/또는 모니터링하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

A1.1) 겔 전구체, 바람직하게는 세포외 기질 겔 전구체(extracellular matrix gel precursor)를 미세유체 채널 네트워크, 예를 들어 미세유체 채널 네트워크의 일부인 중공 체적(hollow volume) 내로 도입하는 단계.

A1.2) 겔의 안착(set) 또는 겔화(gelate)를 허용되는 단계.

A1.3) ECM 겔에 의해 커버되지 않는 미세유체 채널 네트워크의 또 다른 기술로 중간엽 세포를 도입하는 단계; 또는

A2) 세포를 겔 전구체와 혼합하고, 겔 전구체를 미세유체 채널 네트워크에서 겔화시켜 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부를 차지하게 하는 단계;

B) 단계 a1)의 경우, 및 바람직하게는 단계 a2)의 경우에, 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부가 중간엽 세포로 덮일 때까지 중간엽 세포가 증식 및/또는 분화되도록 하는 단계;

D) 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크 표면의 적어도 일부가 상피 세포로 덮일 때까지 및/또는 중간엽 세포의 적어도 일부가 상피 세포로 덮일 때까지, 상피 세포가 증식 및/또는 분화되도록 하는 단계를 포함한다.

설명 및 청구범위에서 전술한(예를 들어, 단계 a) 내지 d)) 제1 방법에 대한 참조가 이루어지지만, 본원에 기술된 임의의 방법, 용도 또는 조성물은 대안적인 표현(예를 들어 단계 A) 내지 D))으로 제시된 방법에 대해 마찬가지로 구현될 수 있음을 당업자는 이해한다.

본 발명의 방법에서, 미세유체 채널 네트워크에서, 중간엽 기원의 세포가 배양되어 층 또는 시트를 형성하는 제1 세포군을 형성한다. 중간엽 세포가 미세유체 네트워크 및/또는 겔의 표면의 적어도 일부를 덮은 후에, 상피 세포는 미세유체 채널 네트워크, 바람직하게는 중간엽 세포 층 또는 시트 내에 도입된다(즉, 미세유체 채널의 (인공)벽으로부터 떨어짐). 상피 세포 (및 중간엽 세포)는 바람직하게는 적어도 컨플루언시에 도달할 때까지 증식 및/또는 분화가 허용된다.

본 발명의 방법으로, 중간엽 세포의 층과 직접 접촉하는 상피 세포의 층이 제공되며, 2개의 세포 유형에 의해 배설되는 중간 기저판(intermediate basal lamina) 등가물을 가질 수 있고, 이것이 생체 내 상황과 더 유사한 것은 당업계에서 설명된 방법과 비교된다. 예를 들어, 중간엽 세포 및/또는 기저판은 트랜스웰 시스템에 사용되는 멤브레인과 같이 자연적이지 않은 인위적이거나 외부에서 도입된 멤브레인의 존재없이 상피 세포와 직접 접촉할 수 있다. 동시에, 본 발명의 방법으로, 상피 세포는 미세유체 세포배양 시스템의 미세유체 채널 네트워크의 인공적(예를 들어, 플라스틱 또는 유리) 벽(표면)과의 접촉이 감소된다.

또한, 세포외 기질 겔의 사용에 의해, 세포의 2차 형태는 예를 들어 적어도 10 μm의 인공 다공성 막(artificial porous membrane)의 경질 구조(rigid structure)를 제공하는 트랜스웰 시스템을 사용하는 당업계의 방법과는 대조적으로 더욱 수용된다 .

본 발명자들은 이론에 얽매이지 않고, 세포의 증식과 분화가 상피 세포 및 중간엽 세포 사이의 양방향 통신(bidirectional communication)에 의존한다고 추측하고, 특히 트랜스웰 시스템에 적용되는 이러한 단단한 구조가 존재하기 때문에 본 발명의 방법에 의해, 및/또는 사용된 배양장치의 견고한 벽과 상피 세포의 접촉을 방지 또는 감소시킴으로써, 및/또는 중공 미세유체 채널(즉, 미세유체 채널 네트워크)에서 생체 내 상황과 더 유사한 세포의 증식 및 분화를 허용하는 (마이크로)환경의 생성에 의해, 이 통신이 개선된다고 추측한다.

특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, 우리는 중간엽 세포의 존재가 상피를 향해 지시적이라는(instructive) 가설을 세운다. 시그널링 분자의 교환, 예를 들면 모르포겐(morphogen)은 구체적으로 이러한 분자, 즉 모르포겐의 조합 패턴을 유도한다. 특정 위치에서 이들의 특정 조합은 줄기세포 적소의 유지를 초래할 수 있는 반면, 다른 특정 위치에서의 모르포겐의 조합은 특정 아형을 향한 분화를 초래한다. 모르포겐은 일반적으로 형태형성(morphogenesis)의 과정에서 조직 발달의 패턴을 관리하는 물질, 그리고 조직 내의 다양한 특수 세포 유형의 위치로 이해된다. 보다 구체적으로, 모르포겐은 국소 농도에 따라 특정 세포반응을 생성하기 위해 세포에 직접 작용하는 신호분자일 수 있다.

특정 이론에 구속되기를 바라지는 않고, 우리는 신호분자, 특히 모르포겐의 특정 조합이 다소 일정한 간격으로 발생한다고 가정한다. Regular는 생물학의 맥락에서 해석되어야 하며, 이는 얼룩말의 줄무늬 또는 판터의 모피에 있는 패치와 같은 규칙성(regularity )이다: 정확한 규칙성(precise regularity)이 아닌, 명확한 패턴(clear pattern).

이러한 패턴 형성에서 중요한 모르포겐은 Wnt-family members, hedgehog family members, 노긴(noggin), 뼈 형태 형성 단백질(bone morphogenic protein), 상피 성장 인자(epithelial growth factors; EGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factors; FGF) 및 Dickkopf (DKK) 단백질을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.

세포외 기질 또는 기저판(basal lamina)은 특정 형태 형성 인자(ertain morphogenic factors)에 결합하여 국소 농도를 나타내고, 다른 것들은 확산시킬 수 있기 때문에 이러한 규칙적인 패턴(regular patterns)의 형성에서 중요한 요소이다.

본 발명의 맥락에서, 미세유체 네트워크는 2개의 측벽(표면), 하부 기판 및 채널 네트워크를 폐쇄하는 상부 기판에 의해 형성된 중공 체적(hollow volume)이다. 양쪽 벽, 상부 기판 및 하부 기판은 미세유체 채널 네트워크와 접촉할 때 벽(walls)으로 지칭될 수 있다. 채널 네트워크는 또한 외부 세계로부터 네트워크를 채우는 데 사용되는 유입구(inlet), 일반적으로 상단 기판의 구멍(hole)에 연결된다. 또한 네트워크에 제1 유체(일반적으로 액체)를 채우면 네트워크(일반적으로 공기)에 있는 유체를 배출할 수있는 통풍구(vent )가 있어야 한다. 채널 네트워크는 서로 연결된 하나의 미세유체 채널 또는 다수의 미세유체 채널을 포함할 수 있다. 미세유체 채널 네트워크는 추가적으로 유입구 또는 유출구(outlets)에 연결될 수도 있다.

상기 방법의 제1 단계에서, 중간엽 세포는 미세유체 세포배양 시스템의 미세유체 채널 네트워크에 도입된다.

본 발명에서 사용될 수 있는 중간엽 세포는 임의의 유형의 중간엽 기원 세포일 수 있다. 중간엽 세포 또는 적어도 하나 이상의 중간엽 세포는 골수(bone marrow), 전립선(prostate), 심장, 폐, 장, 신장, 혈관 및 힘줄을 포함하는 신체의 상이한 부위로부터 섬유아세포, 근섬유아세포, 평활근 세포, 지방세포, 연골세포, 골아세포 및 간질세포(stromal cells)를 포함한다. 바람직하게는, 중간엽 세포는 섬유아세포 또는 근섬유아세포이다. 중간엽 세포는 증식 상태 또는 유사분열 비활성(mitotically inactive) 상태일 수 있다. 중간엽 세포는 분화된 중간엽 세포 또는 중간엽 전구세포일 수 있다. 중간엽 전구세포는, 중간엽 기원의 다양한 계통으로 분화할 수 있는 세포인, 중간엽 근원의 다능성 세포(multipotent cell)를 의미한다. 의심의 여지없이, 중간엽 줄기 세포는 중간엽 기원 세포를 지향한다.

중간엽 세포는 신생아(neonatal) 또는 성체 세포일 수 있다. 바람직하게는, 중간엽 세포는 포유류 세포, 보다 바람직하게는 인간 중간엽 세포이다. 중간엽 세포는 새롭게 단리된 세포 또는 다수의 계대배양된 세포일 수 있다. 중간엽 세포는 일차세포 또는 (불멸화된) 세포주일 수 있다. 중간엽 세포는 종양을 비롯한 건강한 또는 질병 조직으로부터 분리될 수 있다. 중간엽 세포는 하나 이상의 유형의 중간엽 세포를 포함할 수 있다. 중간엽 세포는 또한 유도된 다능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell) 기술과 같은 줄기세포 기술을 통해 얻을 수 있다. 중간엽 세포 또한 상피 간엽 전이(EMT)의 유도를 통해 상피에서 파생될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 중간엽 세포는 근섬유아세포, 섬유아세포, 지방세포, 연골모세포(chondroblasts), 골아세포, 평활근 세포 및 간질세포 중에서 선택되며, 바람직하게는 중간엽 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포이다.

세포는 임의의 적절한 수단에 의해 미세유체 채널 네트워크에 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 수성 배재, 전형적으로 세포 배양 배지를 사용하여 도입될 수 있다. 세포 배양 배지는 세포의 성장 및/또는 증식에 필수적인 모든 영양소 및 다른 화합물을 전달할 수 있어야 하지만, 바람직하게는 세포의 성장 및/또는 증식에 유해할 수 있는 화합물을 함유하지 않을 수 있다.

세포는 상기 배지에 분산되고, 배지가 미세유체 채널 네트워크에 들어가도록 허용함으로써 미세유체 채널에 도입될 수 있다. 전형적으로, 피펫은 유입구 내의 배지 내에 세포를 분배하고 미세유체 채널 네트워크가 모세관력을 통해 채우도록 하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 배지 내의 세포는 활성 펌핑을 통해 미세유체 채널 네트워크로 도입될 수 있다. 일단 세포가 미세유체 채널 네트워크에 도입되면, 세포는 침전되고 분화 및/또는 증식을 시작해야한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 세포의 침강(settling)은 표면 중 하나에 있을 수 있다. 사용된 수성 배지는 중간엽 세포의 증식 및/또는 분화에 적합한 배지가 바람직하다. 이러한 배지의 조성물은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 원하는 추가의 (성장) 인자가 보충되는 경우 임의의 적합한 성장 배지가 사용될 수 있다. 세포가 침전되고 선택적으로 (존재한다면) 겔, 예를 들어 세포외 기질 겔 및/또는 미세유체 채널 네트워크의 벽에 부착된 후, 중간엽 세포에 영양소 및 산소를 제공하는 적합한 성장 배지가 제공되어 중간엽 세포가 증식 및/또는 분화되도록 한다. 성장 배지는 흐름(flow)으로 제공될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 흐름의 경우, 성장 배지는 세포에 의해 생성된 폐기물 대사산물을 제거하거나 희석할 수도 있다.

대안적으로, 중간엽 세포는 겔 전구체를 사용하여 미세유체 채널 네트워크에 도입될 수 있다. 세포는 겔 전구체에 분산/현탁되고, 겔 전구체가 미세유체 채널 네트워크에 들어가도록 허용하고, 예를 들어 모세관 압력 장벽과 같은 패터닝 기술의 도움으로 네트워크의 선택된 영역을 여과시킴으로써 미세유체 채널 네트워크에 도입될 수 있다. 이어서 겔 전구체는 미세유체 채널의 특정 영역에서 겔화(응고)되어 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부를 차지하게 된다. 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부분의 점유와 관련하여, 당업자는 겔이 미세유체 채널 네트워크 전반에 걸쳐 존재하지만, 바람직하게는 특정 영역 또는 네트워크를 점유할 필요가 없으며, 선택된 다른 영역은 예를 들어, 다른 겔 또는 성장 배지, 예를 들어 관류 흐름을 도입하기 위해 접근 가능하다는 것을 이해한다. 또한, 겔은 미세유체 채널 네트워크를 통한 성장 배지의 통과를 차단하면 안된다는 것을 이해할 것이다.

겔 전구체는 전술한 바와 같이 채널에 제공될 수 있다. 겔을 제공한 후, 추가의 유체를 도입하기 전에 겔화시킨다. 적합한 (전구체) 겔은 당업계에 잘 알려져있다. 예로서, 겔 전구체는 하이드로겔(hydrogel)일 수 있으며, 통상적으로 세포외 기질(ECM) 겔이다. ECM은 예를 들어 콜라겐, 피브리노겐, 피브로넥틴, 및/또는 마트리겔 또는 합성겔과 같은 기저막 추출물(basement membrane extracts)을 포함할 수 있다. 예를 들어 겔 전구체는 Eppendorf Combitips advanced ® (Eppendorf AG, Germany, catalogue number 0030 089.405)와의 조합된 Eppendorf Multipette® M4 (Eppendorf AG, Germany, catalogue number 4982 000.012)와 같은 반복적인 피펫과 같은 피펫으로 입구에 도입될 수 있다.

따라서, 겔은 기저막 추출물, 인간 또는 동물 조직 또는 세포배양 유래 세포외 기질, 동물조직 유래 세포외 기질, 합성 세포외 기질, 하이드로겔, 콜라겐, 연질아가, 달걀 흰자 및 마트리겔과 같은 상업적으로 이용 가능한 제품을 포함할 수 있다.

기저박판을 포함하는 기저막은 생체 내에서 상피 세포의 밑에 있는 얇은 세포외 기질이며, 단백질 및 프로테오글리칸(proteoglycans)과 같은 세포외 기질로 구성된다. 상피 세포층, 다층(multilayer) 또는 단층(monolayer)이 외부 세계로부터의 외인성 물질의 침입을 장벽으로써 막지만, 기저막 자체는 물리적 장벽으로 작용한다. 따라서, 상피 조직을 포함하는 상피 세포는 기저막과 협력하여 고체 장벽을 형성하고 내부 생체 활성을 보호한다.

이들은 콜라겐 IV, 라미닌(laminin), 엔탁틴(entactin), 헤파란 설파이드 프로테오글리칸(heparan sulfide proteoglycans) 및 기타 여러가지 작은 구성요소로 구성되어 있다(Quaranta et al, Curr. Opin. Cell Biol.6, 674-681, 1994). 손상되지 않은 기저막뿐 아니라 이들 성분만으로 생물학적으로 활성을 나타내며 세포 부착, 이동 및 많은 경우 성장과 분화를 촉진한다. 기저막을 기본으로한 젤의 예는 마트리겔(US 4829000)이라고 한다. 이 물질은 상피 세포의 기질로서 인비트로에서 매우 생물학적으로 활성이다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 많은 상이한 적합한 겔은 상업적으로 입수 가능하며, 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 마트리겔 rgf, BME1, BME1rgf, BME2, BME2rgf, BME3 (모두 마트리겔 변이체) 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 I 및 IV의 혼합물, 또는 콜라겐 I 및 IV의 혼합물, 및 콜라겐 II 및 III), puramatrix, 하이드로겔, Cell-Tak™, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, Matrigel® Matrix, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 오스테오폰틴(Osteopontin), Poly-Lysine (PDL, PLL), PDL/LM 및 PLO/LM, PuraMatrix® 또는 비트로넥틴(Vitronectin). 하나의 바람직한 실시양태에서, 매트릭스 성분은 상업적으로 입수 가능한 Corning® MATRIGEL® Matrix(Corning, NY 14831, USA)로서 수득된다.

MATRIGEL® Matrix는 Engelbreth-Holm-Swarm("EHS") 마우스 종양에서 추출되며, 이는 기저막이 풍부한 종양이다. 주요 매트릭스 성분은 라미닌, 콜라겐 IV, 엔탁틴 및 헤파란 설파이드 프로테오글리칸("HSPG")이다. 매트릭스는 또한 아직 정의되지 않은 세포외 기질 성분뿐만 아니라 성장 인자, 매트릭스 금속 단백질 분해 효소 (matrix metalloproteinases)(collegenases) 및 기타 단백질 분해효소(plasminogen activator)를 포함한다. 상온에서 MATRIGEL® Matrix 젤은 재구성된 기저막을 형성한다.

바람직하게는, 겔 (전구체)은 기저막 추출물, 세포외 기질 성분, 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, D-리신, 엔탁틴, 헤파란 설파이드 프로테오글리칸 또는 이들의 조합물이다.

겔 전구체는 잠재적으로 중력에 의해 도움을 받는 모세관력에 의해 미세유체 네트워크 입구로 방출되어 미세유체 네트워크로 운반된다. 겔은, 예를 들면, 위상 도파관(phaseguide)으로 정지될 수 있는데, 이는 본질적으로 미세유체 채널 네트워크의 전체 폭에 걸쳐서 겔화되도록 하는 모세관 압력 장벽이다. 겔이 형성된 후, 겔 내의 중간엽 세포에 영양분 및 산소를 제공하는 적합한 성장 배지가 제공되어, 중간엽 세포가 증식 및/또는 분화되도록 한다. 성장 배지는 흐름으로 제공될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 흐름의 경우, 성장 배지는 세포에 의해 생성된 폐기물 대사산물을 제거하거나 희석할 수도 있다.

겔 전구체의 패터닝, 예를 들어 ECM 겔 전구체는 포토 리소그래피(photolithograpihic) 패터닝 및 모세관 압력 기술을 이용한 패터닝을 포함하는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 모세관 장벽의 기능 및 패터닝은 본 출원인에 의해 이미 기재되어있다: WO2014038943 호. 모세관 압력 장벽은 겔 전구체로 채워진 벽 또는 공동으로 이해되어서는 안되지만, 표면 장력(surface tension)으로 인해 겔 전구체가 펼쳐지지 않도록 하는 요소로 구성된다. 이 개념을 메니스커스 피닝(meniscus pinning)이라고 한다. 이와 같이, (ECM) 겔 전구체로 구성된 유체 meniscii의 안정한 제한(confinement)은 미세유체 채널에서 달성될 것이다.

제공된 모세관 압력 장벽은 예를 들어, 바닥 기판으로부터 돌출된(protruding) 재료의 테두리(rim) 또는 바닥 기판으로 돌출하는 홈으로 구성될 수 있다. 테두리의 측벽은 가능한 큰 테두리의 상부와의 각도를 갖는다. 좋은 장벽을 제공하려면 이 각도가 70°이상, 일반적으로 약 90°이상이어야 한다. 리지(ridge)의 측벽 및 하부 기판의 상부 측 사이의 각도에 대해서도 동일하다.

모세관 압력 장벽을 생성하기 위한 대안적인 방법은 주변 재료보다 상당히 소수성인 재료의 라인을 바닥 기판상에 도포하는 것이다. 후자는 모세관력/표면 장력으로 인해 퍼짐 중지로 작용한다. 그 결과, 액체는 모세관 압력 장벽을 넘어서 유동하는 것이 방지되고, 미세유체 채널 네트워크에서 안정한 제한 메니스커스의 형성을 가능하게 한다. 따라서 특정 실시양태에서, 사용되는 모세관 압력 장벽은 특히 테두리(rim), 홈(groove), 구멍(hole), 또는 소수성 물질 라인 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서 모세관 압력 장벽은 겔에 의해 점유될 영역을 라이닝하는 선택된 간격으로 필러(pillars)에 의해 생성될 수 있다.

(ECM) 겔 전구체를 선택적으로 패터닝하는 다른 방법은 겔 전구체를 삽입할 때 미세유체 채널 네트워크에 존재하고 겔의 겔화시 제거되는 희생층(sacrificial layer) 또는 제거 가능한 구조의 사용을 포함한다.

다르게는 감광성(photosensitive) 가교 결합제가 겔 내에 존재할 수 있어, 예를 들어, 자외선의 노출에 의해 젤이 젤화 된다. 광원을 마스킹하는 것은 겔 전구체의 선택적 겔화를 가능하게 하고 겔이 없어야 하는 영역으로부터 비응고된 겔 전구체를 제거할 수 있게 한다.

중간엽 세포가 수성 배지, 바람직하게는 성장 배지를 사용하거나 또는 겔 (전구체)을 사용하여 미세유체 채널 네트워크에 도입된 후, 중간엽 세포는 미세유체 채널 네트워크에서 증식 및/또는 분화될 수 있다. 중간엽 세포의 증식은 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부가 중간엽 세포로 덮일 때까지의 기간동안 계속된다. 미세유체 채널에서 배양된 세포를 가져올 때, 이들은 전형적으로 관형 구조물(tubular structure)의 루멘(즉, 채널의 벽으로부터 멀리 향하는 세포의 측면)을 통한 유동으로 관류(perfused)될 수 있는 관형 구조물을 형성한다.

즉, 일단 중간엽 세포가 미세유체 채널 네트워크에 도입되면, 중간엽 세포는 세포가 미세유체 채널 네트워크에서 세포의 시트, 층, 그룹을 형성하도록 성장, 분화, 팽창 및 분할이 허용된다. 겔이 미세유체 채널 네트워크에 존재하지 않는 실시양태에서, 세포는 채널의 (단단한) 벽에 적어도 부분적으로 부착된 세포 군의 시트, 층을 형성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 그리고 이하에 상세히 설명되는 바와 같이, 미세유체 채널 네트워크의 일부는 겔 전구체가 중간엽 세포와 함께 제공되지 않는 겔을 포함하고, 예를 들어 중간엽 세포가 수성 배지를 사용하여 채널에 도입된다. 이러한 실시양태에서, 중간엽 세포는 미세유체 채널 네트워크뿐만 아니라 겔에 의해 형성되지 않은 채널의 (단단한) 벽에 존재하는 겔 상에 세포의 그룹 또는 시트 또는 층을 형성할 수 있다(예를 들어, 벽이 어떤 유형의 재료로 구성되는지에 따라 미세유체 채널 네트워크의 플라스틱 또는 유리 벽).

중간엽 줄기세포가 겔 전구체를 사용하여 채널에 도입되는 실시양태에서, 세포는 겔에서 성장, 분열, 증식 및/또는 분화되고, 및/또는 겔 외부로 성장하여 미세유체 채널 네트워크로 들어간다.

미세유체 채널 네트워크의 커버링(covering)과 관련하여, 이것은 겔에서만, 채널에서만, 그리고 겔과 채널 모두에서 중간엽 세포의 존재를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 중간엽 세포는 세포가 도입된 미세유체 채널의 전체 영역을 덮는다(따라서 관형 구조를 형성할 수 있다). 이것은 100% 컨플루언시(confluency)라고 할 수 있다. 컨플루언스는 미세유체 장치의 부착세포의 수의 추정치로써 일반적으로 사용되는 용어로 세포가 덮는 표면의 비율을 나타낸다. 예를 들어, 50% 컨플루언스란 표면의 약 절반이 덮여 있음을 의미한다. 층이 컨플푸언스한다고 말하면, 겔의 표면의 약 100%가 세포에 의해 덮여있고, 세포가 단일층으로서 성장할 여지는 더 이상 남지 않는다.

미세유체 채널 네트워크의 100% 컨플루언시 또는 커버링(세포가 도입되거나 모니터링되는 영역에서)은 필요하지 않으며, 예를 들어 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%와 같은 낮은 커버리지가 본 발명에 적합하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 중간엽 세포는 겔에만 존재할 수 있다. 후자의 경우, 중간엽 세포는 채널 벽상에서 반드시 또는 바람직하게는 성장하지 않지만 바람직하게는 세포의 클러스터로서 (ECM) 겔 내부에서 성장한다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 중간엽 세포가 겔 전구체에 의해 미세유체 채널 네트워크에 도입되는 실시양태에서, 중간엽 세포가 본 발명의 다음 단계에서 상피 세포가 도입되기 전에 증식 및/또는 분화되도록 할 필요는 없다. 또한, 중간엽 세포를 포함하는 겔의 겔화 후에 채널에 상피 세포를 도입하고, 중간엽 및 상피 세포가 함께 증식 및/또는 분화되도록 할 수 있다.

그러나, 바람직하게는 상피 세포가 배양 시스템에 도입되기 전에 중간엽 세포가 증식 및 분화되도록 허용된다. 기간의 길이는 도입된 중간엽 세포의 유형, 도입 방법, 도입된 세포의 수, 세포의 증식 및/또는 분화에 사용되는 성장 배지의 조성, 온도 등과 같은 다양한 인자에 의존한다. 예를 들어, 기간은 최소 20분, 최소 1시간, 최소 6시간, 최소 12시간, 최소 24시간, 최소 1, 2, 3 또는 4일 수 있다. 일반적으로 이 기간은 14일을 넘지 않는다. 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 배양 조건을 확립하는데 아무런 문제가 없을 것이다.

다음으로, 상피 세포는 중간엽 세포가 존재하는 미세유체 채널 네트워크에 도입된다.

본 발명에 사용될 수 있는 상피 세포는 상피성 특징을 갖는 임의의 유형의 세포일 수 있거나 이러한 특징을 갖는 세포로 분화될 수 있다. 전형적으로 상피 세포는 외배엽(ectodermal) 또는 내배엽(endodermal) 기원이다. 상피 세포를 언급할 때 우리는 또한 본 발명의 대상이 되는 상피 세포로 분화하는 능력을 가진 전구세포 및 줄기세포를 의도한다.

상피 세포 또는 하나 이상의 상피 세포는 단순한 상피, 예컨대 중피(mesothelium) 또는 내피(endothelium)와 같은 단순한 편평 상피(simple squamous epithelium)일 수 있다. 대안으로, 상피 세포는 표피 세포(epidermal cell) 또는 원주 상피 세포(columnar epithelia cell)와 같은 층화 상피(stratified epithelia) 세포일 수 있다. 이러한 세포는 신장, 결장, 소장, 폐, 망막의 상피 세포를 포함할 수 있다. 상피 세포는 분화된 상피 세포 또는 상피 전구세포일 수 있다. 상피 전구세포는 상피 전위를 갖는, 예를 들어 상피 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포를 의미한다.

상피 세포는 신생아 또는 성인 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상피 세포는 포유류 세포, 보다 바람직하게는 인간 상피 세포이다. 상피 세포는 신선하게 분리된 세포 또는 다수의 계대 배양된 세포일 수 있다. 상피 세포는 일차 세포 또는 (불사화) 세포주일 수 있다. 상피 세포는 건강한 또는 질병 조직으로부터 분리될 수 있다. 상피 세포는 하나 이상의 유형의 상피 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체 예에서, 2종 이상의 유형의 상피 세포를 상이한 비율로 혼합하고 중간엽 세포 상에 성장시킨다.

바람직하게는 상피 세포는 단순 상피 세포, 단순 편평 상피 세포, 층상 상피 세포 또는 원주 상피 세포로부터 선택되며, 바람직하게는 상피 세포는 포유 동물 세포, 바람직하게는 인간 세포이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 상피 세포는 예를 들어 US2012/0196312에 기술된 바와 같이 체외 배양된 오르가노이드(organoid)부터 수득된다. 오르가노이드 내의 세포는 미세유체 채널 네트워크에 도입되기 전에, 예를 들어 단일 세포 또는 세포 덩어리(clumps)를 제공하도록 처리될 수 있다(예를 들어 2 내지 50 세포, 바람직하게는 20, 10 세포 이하).

일부 실시양태에서, 상피 세포 및 중간엽 세포는 동일한 기원을 가지며, 즉 동일한 동물 유형에 속하거나 동일한 동물에 속한다. 바람직하게는, 상피 세포 및 중간엽 세포는 동일한 신체 부위로부터 유래한다.

일부 실시양태에서, 상피 세포 및 중간엽 세포는 상이한 기원, 즉 상이한 유형의 동물 유래이거나 동일한 유형의 동물 또는 동일한 동물의 상이한 신체 부위로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 상피 세포는 병이 있는 조직으로부터 유래되고 중간엽 세포는 건강한 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 중간엽 세포는 병이 있는 조직으로부터 유래하고 상피 세포는 건강한 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양으로부터 수득된다.

또한 단계 a)에서 상이한 유형의 중간엽 세포가 도입되고 및/또는 단계 c)에서 상이한 유형의 상피 세포가 동일한 미세유체 채널에 도입되는 것 또한 제공된다. 이것은 더 복잡한 상피 조직의 연구를 가능하게 하는데, 예를 들어 상이한 유형의 상피 세포간의 상호작용, 건강한 조직 및 병이 있는 조직으로부터 유래한 상피 세포 사이의 상호 작용을 연구할 수 있다.

상피 세포는 임의의 적절한 수단에 의해 미세유체 채널 네트워크에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 수성 배지를 사용하여 도입될 수 있다. 세포는 상기 배지에 분산되어 중간엽 줄기세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크에 배지가 유입됨으로써 미세유체 채널에 도입될 수 있다. 일단 세포가 미세유체 채널에 도입되면, 세포는 침전되고 증식을 시작한다는 것은 숙련된 사람에 의해 이해될 것이다. 바람직하게는, 사용되는 수성 배지는 상피 세포, 바람직하게는 상피 세포 및 중간엽 세포의 증식에 적합한 배지이다. 이러한 배지의 조성물은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 원하는 추가의 (성장) 인자가 보충되는 경우 임의의 적합한 성장 배지가 사용될 수 있다. 상피 세포가 침전되고(settled) 부착된 후, 상피 세포 (및 중간엽 세포)가 증식 및/또는 분화되도록 하는 영양 공급 및 산소를 세포에 제공하는 적합한 성장 배지가 제공된다. 성장 배지는 흐름으로 제공될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 흐름의 경우, 성장 배지는 세포에 의해 생성된 폐기물 대사산물을 제거하거나 희석할 수도 있다.

상피 세포가 중간엽 세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크에 도입된 후에, 세포는 미세유체 채널 네트워크에서 증식 및/또는 분화될 수 있다. 미세유체 채널에서 배양된 세포를 가져올 때, 이들은 전형적으로 관형 구조물의 루멘을 통한 흐름으로 관류될 수 있는 관형 구조(tubular structure)를 형성한다(즉, 채널의 벽과 마주하는 세포 층의 측면)에 위치한다.

관형 구조는 세포가, 상피 세포 현탁액이 도입된 관류 흐름 채널에 면하는 ECM 겔 자체의 표면 뿐만이 아니라 ECM 겔에 의해 커버되지 않는 관류 흐름 채널의 채널 표면의 대부분을 라이닝한다는 것을 의미한다. 관형 구조는 전형적으로 하나의 입구에서 다른 입구로의 채널의 전체 길이를 따라 형성된다. 입구는 또한 세뇨관의 내부 또는 내강(lumen)으로의 접근을 허용한다. 배지가 흐르는 경우 상피 세뇨관의 관 내측(luminal side)에 흐름이 가해진다. 전형적으로 이것은 상피의 정점 측(apical side)과 일치한다.

도입된 중간엽 세포에 의해 형성된 생물학적 물질의 적어도 일부가, 도입된 상피 세포에 의해 형성된 생물학적 물질에 의해 덮일 때까지 상피 세포의 증식이 일정기간 동안 지속된다. 바꿔 말하면, 중간엽 세포 및 상피 세포는, 중간엽 세포 및 상피 세포의 배양 중에 형성된 기저판(basal lamina) 또는 기저판 유사 구조를 비롯한 중간엽 세포와 밀접하게 접촉하는 상피 세포층을 형성할 수 있는 기간 동안 배양된다. 예를 들어, 기간은 최소 20분, 최소 1시간, 최소 6시간, 최소 12시간, 최소 24시간, 최소 1, 2, 3 또는 4일 수 있다. 일반적으로 기간은 최소 6시간, 최소 22시간 또는 최소 1, 2, 3, 4일이다. 일반적으로 기간은 14일을 넘지 않는다.

중간엽 세포의 커버링과 관련하여, 바람직한 실시양태에서, 상피 세포는 중간엽 세포에 의해 덮인 영역 전체를 덮는다. 그러나, 미세유체 채널 네트워크 (세포가 도입되거나 모니터링되는 영역)에서 중간엽 세포의 100% 적용 범위는 필요하지 않으며, 이보다 낮은, 예를 들어 10, 20, 30, 40 , 50, 60, 70, 80 또는 90%가 본 발명에서 적절하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에서, 상피 세포의 적어도 일부는 중간엽 세포의 적어도 일부 및/또는 세포 배양 중에 형성된 임의의 기저판 및/또는 기저판 유사 구조와 밀접하게 접촉해야 한다.

예를 들어, 중간엽 세포는 미세유체 채널에 존재하는 겔의 표면, 및/또는 본원에서 개시하는 겔 전구체에 의해 채널 내로 도입되는 중간엽 세포의 실시양태에서의 겔의 표면 및 표면 상에만 존재할 수 있다. 상피 세포는 상피 세포에 의해 겔의 표면에 또는 그 표면에 가까운 중간엽 세포가 있는 영역의 적어도 일부가 덮여있을 때 중간엽 세포의 적어도 일부를 커버하는 것으로 이해해야 한다.

하기에 상세히 설명되고, 매우 바람직한 실시양태에서, 중간엽 세포는 미세유체 채널 네트워크에서 관형 구조를 형성하고, 관형 구조 내에서 상피 세포가 증식되도록 허용함으로써, 바람직한 실시양태에서, 상기 중간엽 세포의 관형 구조 내에서 관형 구조를 형성하며, 중간엽 세포는 상피 세포에 의해 적어도 부분적으로 덮인다. 이러한 실시양태에서, 다시, 중간엽 세포 및/또는 세포의 배양 중에 형성된 임의의 기저판 및/또는 기저판 유사 구조는 상피 세포와 밀접하게 접촉한다.

예를 들어 선행기술의 몇몇 방법과 비교할 때, 본 발명으로 확인된 상피 세포 및/또는 중간엽 세포는 생체 내에서 발견된 상피 세포 및/또는 중간엽 세포와 더욱 유사하다는 것을 알았다. 이는 생체 내 상황에 전형적인 특정 유전자의 발현에 의해, 생체 내 형태학과 더 유사항 형태학에 의해, 개선된 상피 장벽 기능에 의해, 정점 및 기저 외막의 존재 및 기능에 의해, 또는 융모(villi), 소낭선(crypts), 섬모 조직(cillated tissue), 점막층(mucous membrane layer)의 존재에 의해, 및/또는 상피 세포의 시트 또는 층에서 상이하게 분화된 세포의 존재에 의해서 나타났다. 상피 세포층은 배지에서 및 배지로부터 상이한 유형의 물질을 분비 및/또는 흡수할 수 있다. 가장 중요한 것은 세포가 기원 조직의 다양한 혈통으로 분화될 수 있다는 것이다.

본 발명의 방법 내에서, 미세유체 채널 네트워크에 겔 전구체를 도입하여 겔 전구체를 미세유체 채널 네트워크에서 겔화시켜 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부를 차지하게 하는 것도 가능하다. 일부 실시양태에서, 겔 전구체는 전술한 바와 같이 중간엽 세포를 포함할 수 있지만, 중간엽 세포를 포함하지 않는 미세유체 채널 네트워크에 겔을 도입하는 것도 고려된다.

예로서, 겔 전구체는 채널에 도입되고, 중간엽 세포가 미세유체 채널 네트워크에, 예를 들어 수성 배지에 의해 도입되기 전에 겔화되도록 허용될 수 있다.

이들 실시양태에서, 미세유체 채널 네트워크의 벽은 부분적으로 겔에 의해 형성된다. 다시, 도입된 겔 전구체는 중간엽 세포를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

중간엽 세포가 존재하지 않는 상태에서 겔을 도입하는 경우, 중간엽 세포는 수성 배지, 바람직하게는 영양소 및 산소를 제공하는 성장 배지를 사용하여 채널에 도입될 수 있다. 이 배지를 통해 세포가 채널에 도입되어 젤에 대한 세포의 침착(depositing)을 유도하고 중간엽 세포가 세포의 시트, 그룹 또는 층, 예를 들어 젤을 형성하게 한다.

전술한 바와 같이, 미세유체 채널에서 배양된 세포를 가져올 때, 관형 구조의 루멘을 통한 흐름으로 관류될 수 있는 관형 구조를 전형적으로 형성하지만, 필수적이지는 않다(즉, 채널의 벽과 마주하는 세포의 측면). 따라서, 일부 실시양태에서, 겔이 먼저 채널에 제공되어, 겔화 후에 중간엽 세포는 배지, 예를 들어 배양 배지에 의해 채널에 도입되어, 세포가 겔과 접촉하고 겔 상에 세포층을 형성시키게 한다(예를 들어, 시트, 또는 관형 구조 또는 혈관). 다음으로, 상피 세포를 배지, 예를 들어 배양 배지에 의해 채널에 도입하여, 상피 세포가 중간엽 세포와 접촉하도록 허용하고 중간엽 세포 상에 세포층(예를 들어, 시트, 또는 관형 구조 또는 혈관)을 형성하도록 하여 이로써 정점 및 기저 측이 생성된다.

관상 구조는 간엽성 기원 세포가 상피의 경우와 같이 단단한 층을 형성한다고 예상하지 않음을 말한다. 상피가 단단한 접합부로부터 알려진 반면, 브러쉬 보더(brush borders) 및 융모가 있는 코블스톤(coblestone) 모양이 있고, 중간엽 기원 세포, 섬유아세포 및 근섬유아세포가 단단한 접합 없이 느슨한 네트워크를 형성한다. 상피는 E-cadherin 및 빌린(villin)과 같은 상피 세포 마커를 발현하고 중간엽 세포는 α-SMA 및 비멘틴(vimentin)과 같은 중간엽 세포 마커를 발현한다.

중간엽 세포를 도입하기 위해 겔 전구체가 사용되는 실시양태 및 중간엽 세포가 도입되는데 겔 전구체가 사용되지 않는 실시양태 모두에서, 다중 겔(multiple gels)은 서로 인접하여 패터닝될 수 있다. 다중 겔은 겔 전구체를 주입하고, 모세관 압력 장벽에 의해 전구체의 진행을 정지시키고, 전구체를 네트워크(채널)의 상이한 부분에서 연속적으로 또는 병렬로 젤화시킴으로써 패턴화될 수 있다. 제1 겔 전구체에서 제1 세포 유형의 현탁액, 이어서 제2 겔 전구체에서의 제2 세포 유형의 결과는 세포 유형이 서로 인접하여 배양되는 소위 층화된 공동 배양을 초래한다. 겔은 바람직하게는 하나 이상의 채널 벽에 접촉/증착된다.

겔은 실질적으로 희석 가교결합 시스템으로 정의되며 일단 겔화되면 그 위치에 남아있지만 젤을 통과하는 틈새 흐름(interstitial flow)을 허용한다. 겔은 종종 유체에 의해 전체 볼륨으로 확장되는 비유체 콜로이드 네트워크(non-fluid colloidal network) 또는 폴리머 네트워크이다. 하이드로겔 또는 아쿠아겔은 팽창제(swelling agent)가 물인 겔이다. 본 발명의 방법의 맥락에서, 겔 물질은 바람직하게는 물에 불용성이지만 2 또는 3차원 지지체 구조(support structure)를 갖도록 물을 포함하는 물-함유 겔일 수 있다. 본 발명에서, 사용된 겔은 상기 겔 내의 물질의 확산을 허용한다.

본 발명에서 사용되는 겔은 상기 특성을 가지며 겔상에 세포층을 형성할 수있는 한 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로 사용되는 겔에는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브리노겐, 마트리겔 및/또는 아가로스를 포함하는 생물학적 기원의 겔, 및 PEG(polyethylene glycols), 펩타이드, PLLA(poly-L-lactide), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)와 같은 다양한 스캐폴드(scaffolds)에 기초한 합성 겔을 포함한다.

겔을 패턴화하기 위해, 즉 제한되지는 않지만 광경화성 겔(photocurable gels)의 리소그래피 패터닝(lithographic patterning), 예를 들어 필러(pillars)를 사용하여 모세관 힘에 기반한 패터닝, 소수성 패치(hydrophobic patches) 또는 위상가이드(phaseguides), 및 선택적 증착(selective deposition)을 포함하는, 미세유체 채널의 일부를 겔로 채우기 위해 여러 기술이 사용될 수 있다.

겔은 바람직하게는 모세관 압력 장벽의 사용에 의해, UV 패터닝에 의해, 또는 겔화 후에 바늘을 수축시킴으로써, 또는 겔화 후에 제거되는 희생층을 가짐으로써 패턴화된다.

상술한 바와 같이, 단계 a)에서 도입된 중간엽 세포는 겔 전구체에 분산/현탁시키거나, 수성 배지를 사용하여 미세유체 채널 네트워크에 도입할 수 있으며, 바람직하게는 겔(예를 들어, 중간엽 줄기세포가 분산되지 않은 겔)은 겔 옆에 존재한다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서, 중간엽 세포는 미세유체 채널 네트워크 및/또는 겔에서 적어도 하나의 그룹/층/시트의 중간엽 세포가 형성될 때까지 증식된다. 본 발명의 방법에서 배양된 중간엽 세포는 세포의 시트 또는 층을 형성할 수 있다. 이러한 시트 또는 층은 단층일 수 있지만, 하나 이상의 층으로 이루어질 수 있고 시트를 따라 상이한 두께를 표시할 수 있다. 시트 또는 층은 임의의 크기일 수 있다.

바람직하게는 단계 b)에서, 중간엽 세포의 관형 구조가 적어도 미세유체 채널 네트워크에서 형성될 때까지 중간엽 세포가 증식된다. 본 발명의 문맥에서, 중간엽 세포의 관형 구조는 미세유체 채널 네트워크의 유입구에서 유출구로 성장하는 세포에 의해 형성되는 구조이며, 이로써 대부분의 채널 및/또는 겔 표면을 라이닝한다. 당해 기술분야의 당업자는 그 구조가 완전 "원형" 튜브일 필요는 없지만, 실제로는 예를 들어 미세유체 채널 네트워크 및/또는 겔의 벽의 형태에 의해 지시되는 바와 같은 임의의 형태를 가질 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 관형 구조체는 반드시 채널의 형태를 따라야하는 것은 아니며, 예를 들어 원형 또는 보다 직사각형의 튜브를 비롯한 임의의 유형의 정규 규칙을 적응시킬 수 있다.

중간엽 세포는 상피 세포가 상기 관형 구조물 내로 도입되어 튜브형으로 중간엽 세포를 덮을 수 있게 함으로써, 중간엽 세포가 본 발명과 관련하여 정의된 관형 구조물을 형성하는 것이 바람직하다. 이러한 "튜브 인 튜브(tube-in-a-tube)" 또는 이중 튜브 조직은 본원에 개시된 것과 같은 표현형 특성에 대해 생체 내 조직과 매우 유사하다는 것이 밝혀졌다.

중간엽 세포에 관해서도 마찬가지로, 바람직하게는 단계 d)에서, 상피 세포는 미세유체 채널 네트워크에서 적어도 하나의 그룹/층/시트의 상피 세포가 형성될 때까지 증식한다. 당업자는 상피 세포가 미세유체 채널 네트워크의 일부, 예를 들어 벽이나 표면을 커버할 수 있음을 이해할 수 있고, 중간엽 세포에 의해 덮히지 않는 젤을 포함하여 모든 젤을 포함하지만, 중간엽 세포의 일부도 상피 세포에 의해 덮여 있을 것이다. 본 발명의 방법에서 배양된 상피 세포는 사용된 상피 세포의 유형에 따라 단일층 또는 상이한 층으로 형성된 세포의 시트 또는 층을 형성할 수있다(예를 들어, 층화된 상피 조직의 세포가 사용될 때 발생할 수 있다). 층은 시트에 따라 다른 두께로 표시될 수 있다. 시트 또는 층은 임의의 크기일 수 있다.

바람직하게 단계 d)에서, 적어도 상피 세포의 관형 구조물이 미세유체 채널 네트워크에서 형성될 때까지 상피 세포가 증식된다. 본 발명과 관련하여, 상피 세포의 관형 구조는 미세유체 채널 네트워크의 유입구에서 유출구로 성장하는 세포에 의해 형성된 구조로서, 이로써 중간엽 세포로 덮이거나 덮이지 않은 대부분의 채널 및/또는 겔 표면을 라이닝한다. 당해 기술분야의 당업자는 그 구조가 완전히 "원형"인 튜브일 필요는 없지만, 실제로는 예를 들어 미세유체 채널 네트워크의 벽 및/또는 겔 및/또는 중간엽 세포의 형태로 존재할 수 있다. 그러나, 관형 구조체는 반드시 채널의 형태 또는 중간엽 세포 시트의 형태를 따라야하는 것은 아니지만, 예를 들어 원형 또는 보다 직사각형의 튜브를 비롯한 임의의 유형의 정규 규칙을 적응시킬 수 있다.

중간엽 세포가 단계 a)에서 겔(즉, 겔 전구체를 사용하여 도입됨)에 도입되는 경우, 방법의 단계 d)에서, 상피 세포는 상피의 적어도 상피 세포의 그룹/층/시트가 미세유체 채널 네트워트의 적어도 일부를 차지하여 적어도 겔의 일부를 덮을 때까지 증식되는 것이 바람직하다.

그러나, 바람직하게는 중간엽 세포 및 상피 세포 모두 본 발명의 문맥 내에서 관형 구조를 형성하며, 이로써 상피 세포층은 단단한 결합 형성에 의해 특징지어지고 중간엽 세포층은 세포의 느슨한 네트워크에 의해 특징지워진다. 따라서, 단계 d)에서 상피 세포가 중간엽 세포에 의해 형성된 관형 구조 내부에 관형 구조를 형성하는 본 발명의 방법이 제공된다. 또한 이 실시양태에서, 중간엽 세포는 적어도 부분적으로 상피 세포에 의해 덮히거나 그렇지 않으면 상피 세포는 적어도 부분적으로 중간엽 세포에 의해 라이닝된다. 중간엽 세포 및 상피 세포의 밀접한 접촉으로 인하여, 예를 들어 wnt family, hedgehog family (sonic hedgehog, indian hedgehog), 노긴, BMP's, rspondin, notch-family 및 기타의 멤버와 같은 분비성 요소 또는 신호 분자에 의한 세포간 통신은 예를 들어 트랜스웰 시스템을 사용하는 방법 또는 다른 유형의 지지체, 필터 또는 막을 포함하는 방법과 비교하여 최적화된다.

환경(circumstance) 하에서, 중공 미세유체 채널(hollow microfluidic channel)(즉, 미세유체 채널 네트워크에서) 샘플에서 성장 배지가 흐르지 않거나 흐르는 것이 바람직할 수 있으며, 상기 흐름은 단방향 또는 양방향이다. 특히, 중간엽 세포 또는 상피 세포 또는 바람직하게는 둘 다의 관형 구조가 수득되는 경우, 관상 구조물의 루멘을 통해 성장 배지의 흐름을 적용하는 것이 바람직할 수 있다.

예로서, 이러한 흐름을 적용하는 것은 상피 세포가 생체 내 상황, 예를 들어 생체 내 상황에서도 액체의 흐름이 상피 세포에 적용될 때와 유사한 표현형을 채택하도록 더 일으킬(trigger) 수 있다. .

다른 예로서, 흐름은 배지 내의 물질, 예를 들어 상피 기능 또는 반응의 영향에 대해 테스트할 약물을 도입 또는 제거하는데 사용될 수 있다.

당업자는 본 발명의 방법에서 사용된 성장 배지가 그 조성물에 대해 특별히 제한되지 않는다는 것을 이해한다. 예를 들어, 사용된 세포의 상황에 따라, Wnt, 노긴, egf/fgf, notch ligands 및/또는 Rspondin 및 기타 본원에 기술된 것과 같은 특정 인자(신호전달 분자, 성장 인자, 억제제 및/또는 신호전달 경로의 활성제)로 성장 배지를 보충하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 요인들은 상피의 줄기세포 적소를 유지하는데 유익한 것으로 알려져 있으며, 혈통(pedigree) 세포를 관심 상피의 하위 계통(sub-lineages)으로 분화 및 증식시키는데 중요하다. 예를 들어, 소장 오르가노이드의 경우 마트리겔에 부유된 세포에 이들 인자를 첨가하면 줄기세포, 장 세포(enterocytes), 배상 세포(goblet cells), 파네드 세포(paneth cells), 장 내분비 세포(enteroendocrine cells)로 이루어진 완전한 소낭선-융모 구조(crypt-villi structures)가 생성된다는 것이 밝혀졌다.

중간엽 세포를 배양하는 단계 및/또는 중간엽 세포 및 상피 세포를 배양하는 단계에서 하나 이상의 요소가 제공될 수 있다.

하나 이상의 인자는 세포배양을 통해 또는 제한된 기간 동안만 존재할 수 있다(예를 들어, 1 내지 24시간, 48시간, 72시간, 1,2,3,4,5,6,7일 또는 그 이상).

하나 이상의 요인이 상피 세포의 정점으로부터 또는 상피 세포의 기저 외측으로부터 또는 양측으로부터 세포에 제공될 수 있다.

하나 이상의 인자는 본원에 기재된 하나 이상의 신호 전달 경로(signaling pathways)의 억제제 또는 활성제일 수 있다(예를 들어, hedgehog signaling pathways, Wnt signaling pathways, BMP signaling pathways). 세포가 먼저 특정 신호 전달 경로의 억제제로 치료되고, 이어서 동일한 경로의 활성화제 또는 다른 방법으로 치료되는 것으로 고려된다. 또한, 세포가 활성화제로 정점 측에서 처리되고, 기저 외측에서 동일한 경로의 억제제로, 또는 그 반대 방향으로 처리되는 것이 고려된다. 하나 이상의 요소가 동시에 사용될 수 있다.

또한, 하나 이상의 인자의 농도구배(concentration gradient)가 예를 들어, 정점에서 기저 외측으로, 또는 유입구에서 배출구로의 중공 채널을 따라 형성될 수 있다. 구배는 선형 또는 비선형일 수 있다. 요인의 농도는 배양(cultivation)의 단계에 따라 달라질 수 있다. 인자는 성장 배지를 사용하여 또는 겔을 통해, 예를 들어 배양 전 겔 중에 분산되거나 배양 중에 겔에 제공됨으로써 공급될 수 있다.

1, 2, 3개 또는 그 이상의 신호전달 경로를 표적으로 삼는 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 인자의 조합에 관해서도 사용될 수 있다.

표적화된 신호전달 경로, 억제제 및 그의 활성제(예를 들어, 인자)가 될 수 있는 인자는 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다:

- BMP(bone morphogenetic protein)의 활성제 및 억제제. BMP는 몸 전체에 조직 구조를 조율하는 중추적인 형태 발생 신호 그룹을 구성한다.

적합한 BMP 시그널링 억제제는, 노긴(Noggin, NOG, 신경 조직, 근육 및 뼈를 포함하는 많은 신체 조직의 발달에 관여하는 단백질; 예를 들어 10-500 ng/ml의 농도), 초르딘(chordin) 및 폴리스타틴(follistatin)과 같은 억제제를 포함하여, BMP 수용체에 대한 BMP(bone morphogenetic protein)의 결합에 의해 매개되는 BMP 시그널링의 억제에 관여하는 분자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 성질을 갖는 소분자 BMP 억제제의 다른 예로는 돌소몰핀(Dorsomorphin)과 같은 전사인자 SMAD1, SMAD5 또는 SMAD8을 활성화시킬 수 있는 BMP2, BMP4, BMP6 또는 BMP7을 억제하는 화합물이 있다(P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: 11 60; RB. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4: 33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE (www. plozone. org), 3 (8): e2904). 또한, BMP I-타입 수용체 키나아제 억제제의 예는 LDN-193189를 포함한다(이는, 4-(6-(4-(piperazin-l-yl)phenyl)pyrazolo[l,5-a]pyrimidin-3-yl)quinolone; Yu PB et al. Nat Med, 14: 1363-9, 2008). LDN-193189는 예를 들어 Stemgent에서 상업적으로 입수 가능하다.

적합한 BMP 신호 전달 활성제의 예는 BMP를 포함한다(예를 들어 BMP1, BMP2, BMP4, BMP7과 같은 transforming growth factor-beta(TGFB) superfamily에 속함)(예를 들어 0.1 ng/ml ~ 250 ng/ml 배지의 농도에서).

- Wnt 신호전달(signaling) 활성제 및 억제제. Wnt 신호전달 경로는 세포 표면 수용체를 통해 신호를 세포로 전달하는 단백질로 이루어진 신호전달 경로(signal transduction pathways)의 그룹이다. 3가지 Wnt 신호전달 경로, 즉 표준 Wnt 경로(canonical Wnt pathway), 비표준 평면 세포 극성 경로(noncanonical planar cell polarity pathway) 및 비표준 Wnt/칼슘 경로(noncanonical Wnt/calcium pathway)가 특징적으로 나타난다. 3가지 경로 모두 Wnt 단백질 리간드를 Frizzled family 수용체에 결합시킴으로써 활성화되며, 세포 수용체는 세포 내에서 흐트러진 단백질에 생물 신호를 전달하고, Wnt는 350-400개의 아미노산 길이의 분비된 지질-변형 시그널링 당단백질(lipid-modified signaling glycoproteins)의 다양한 계열을 포함한다. 이 단백질들에서 일어나는 지질 변형의 유형은 23-24 시스테인 잔기의 보존된 패턴에서 시스테인의 팔미토일화(palmitoylation)이다.

적합한 Wnt 활성제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, BML-284; 2-Amino-4-[3,4-(methylenedioxy)benzylamino]-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine 또는 DKK1 억제제; R-spondin-1(예를 들어, 0,01-5 microgram/ml 배지 농도에서) 및 Wnt3a 및 기타 포함 Wingless-Type MMTV Integration Site Family 단백질을 포함하는, (1-(4-(Naphthalen-2-yl)pyrimidin-2-yl)piperidin-4-yl)methanamine 및 R-spondin family의 단백질(예를 들어, 적어도 50, 100, 500, 1000 ng/ml의 농도에서, 예를 들어 50-1000 ng/ml 사이).

Wnt 신호 억제제의 예는 XAV-939, PORCN 억제제 Wnt-C59 (C59), LGK-974, ICG-001, IWP-2, IWP-L6 및 기타 많은 것들을 포함한다.

- GSK 베타 억제제 및/또는 활성화제 또한 적합하다. Glycogen synthase kinase-3(GSK-3)는 최초로 글리코겐 합성효소의 인산화(phosphorylating) 및 불활성화(inactivating )제로 확인된 프롤린-유도 세린-트레오닌 키나아제(proline-directed serine-threonine kinase)이다. 2개의 isoform, alpha (GSK3A) 및 beta는 높은 수준의 아미노산 상동성을 보여준다. GSK3B는 에너지 대사, 신경세포 발달 및 신체 패턴 형성에 관여한다.

GSK 베타 억제제의 비제한적인 예는 CHIR-99021 (CT99021), SB216763, CHIR-98014, 티테글루십(Tideglusib), 아세톡심(acetoxime) 및 AZD2858, LiCl을 포함한다(예를 들어, 0.1 mM 내지 100 mM의 농도에서). CHIR 99021 또는 CHIR 98014는 예를 들어, 배지에서 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 사용될 수 있다.

- 또 다른 예는, 표피 성장인자 또는 EGF는 수용체 EGFR에 결합하여 세포 성장, 증식 및 분화를 자극하는 성장인자이다. 인간 EGF는 53 아미노산 잔기를 갖는 6045-Da 단백질이며, EGF는 예를 들어 5 내지 200 ng/nl, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 예를 들어 50 ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.

- 노치(Notch) 경로의 활성제 및 억제제. 노치 신호 전달 경로는 대부분의 다세포 생물에 존재하는 고도로 보존된 세포신호 시스템이다. 포유류에는 NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 및 NOTCH4라고 하는 네 가지 노치 수용체가 있다. 노치 수용체는 단일 통과 투과막 수용체 단백질이다. 노치 신호는 신경발생 과정에서 증식 신호를 촉진하고, Numb는 그 작용을 억제하여 신경 분화를 촉진한다. 노치 신호전달 경로는 배아 및 성인 라이프 동안 다중세포 분화(multiple cell differentiation) 과정을 제어하는 유전자 조절 기작을 포함하는 세포-세포 통신에 중요하다. 노치 경로 조절제의 예는 DAPT(예를 들어, 0.1 내지 50 micorM의 농도) 및/또는 FLI-06, LY411575, 다이벤자핀(Dibenzazepine), 세마가세스타트(Semagacestat), L658 및 그 밖의 것들과 같은 감마-세크리타아제(gamma-secretase) 억제제를 포함한다.

- 혈관 형성, 상처 치유, 배아 발달 및 다양한 내분비(endocrine) 신호 전달 경로에 관여하는 구성원과 함께 성장인자 패밀리인 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor) 또는 FGFs의 또 다른 예. FGF는 헤파린 결합 단백질이며 세포 표면 관련 헤파란 황산 프로테오글리칸과의 상호작용은 FGF 신호전달에 필수적인 것으로 나타났다. FGF는 다양한 세포 및 조직의 증식 및 분화 과정에서 중요한 역할을 한다.

- 이러한 요인의 또 다른 예는 TGF-β superfamily에 속하는 다기능 사이토 카인인 TGF-β(transforming growth factor beta)이며 세 가지 다른 동형 단백질(TGF-β1-3) 및 많은 다른 신호 단백질을 포함한다.

- 엔도테린-1(Endothelin-1)

- PDGF-B 및 PDGFA, 혈소판 유래 성장 인자 서브유닛 B 및 서브유닛 A. 이 부류의 구성원은 중간엽 기원 세포에 대한 유사분열 인자이며, 88개의 시스테인 모티프(motif)로 특징지워진다.

- 헤지호그(Hedgehog) 단백질을 포함한 Hedgehog 신호 전달 물질 및 억제제. 헤지호그 신호전달 경로는 적절한 개발에 필요한 세포에 정보를 전송하는 신호전달 경로이다. 포유류에는 DHH, IHH 및 SHH와 같은 3개의 헤지호그 동족체가 있으며, 그 중 Sonic(SHH)가 가장 잘 연구되고 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 단백질 인자는 예를 들어 0.01 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 0.1 내지 1 mg/ml 이하의 농도에서 Shh, Ihh 및 Hh를 포함한다. 저해제에는 LDE 225, saridegib, BMS 833923, LEQ 506, PF-04449913 및 TAK-441이 포함된다.

이러한 인자는 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 문맥 내에서 이들을 사용하는 방법을 알고 있다.

최근 중간엽 기원(이 경우 유사분열 불활성화된 3T3 섬유아세포)의 배양보조세포층(feeder layers)의 사용은 마트리겔의 사용없이 평면 트랜스웰 기판에 오르가노이드(organoids)의 성장을 활성화 것으로 나타났다(X. Wang, Y. Yamamoto, L.H. Wilson, T. Zhang, B.E. Howitt, M.A. Farrow, F. Kern, G. Ning, Y. Hong, C.C. Khor, et al., Nature, 522 (2015), pp. 173-178). 또한 여기에서는 소장의 필수 하위 유형을 구별하는 것이 가능해 보였다. 그러나, 트랜스웰의 경질 기질은 2차 형태의 자유 세대(free generation)를 허용하지 않았고, 본 발명자는 흐름 조건의 부재뿐만 아니라 분화가 제한되어 있다고 규정하고 있다.

본 발명의 방법을 사용하여, 바람직한 실시양태에서, 겔, 예를 들어 세포외 기질 겔에 대해 중간엽 줄기 세포층의 존재하에 상피 세포를 배양하는 것이 가능하며, 이로 인해 명확한 정점/기저 배향 및 재관류의 가능성을 갖는 성장 관형 구조에 부가하여, 2차 형태의 형성에 대한 완전한 유연성을 제공한다. 이들 세포가 겔과 접촉하는 경우, (단단한) 벽 또는 필터(예를 들어 직물 필터)가 완전히 존재하지 않는다.

상기에서 상세히 설명한 바와 같이, 상피 시트 또는 관형 구조물은 중간엽 세포에 의해 라이닝되고, 중간엽 세포는 미세유체 채널 네트워크의 벽과 상피 세포 사이에 위치하는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 중간엽 세포의 적어도 일부가 미세유체 채널 네트워크 벽과 상피 세포 사이에 위치한다는 것이다.

또한, 단계 d)에서 상피 세포가 정점 및 기저 측부를 갖는 세포층을 형성하도록 허용되며, 기저 외측부는 중간엽 세포를 향하게된다. 정점-기저부 분극에 중요한 것은 ECM/Basal lamina의 존재이다. 또한 관류 흐름의 사용은 훌륭하게 편광된 관(nicely polarized tubules)을 산출한다.

극화된 세포의 정점 막은 루멘을 안쪽으로 향한 원형질 막(plasma membrane)의 표면이다. 극화된 세포의 기저측 막은 기저부와 측면을 형성하는 원형질막의 표면이다. 생체 내에서 이는 간극(interstitium)을 향하고 루멘에서 멀어진다. 본 발명에서, 기저 외측 막은 중간엽 세포(들) 및/또는 겔, 예를 들어 세포외 기질 겔과 대면하거나 밀접하게 접촉하는 막이다. 상피 세포는 서로 단단히 결합하여 밀집한 막을 만든다. 각각의 원형질막 도메인은 기저 방향 또는 정점 방향으로 막 위에 특정 화합물의 수송을 허용하는 특정 수송체를 포함하는, 특정 단백질 조성물을 갖는다.

상기에서 언급한 바와 같이, 중간엽 세포의 적어도 일부는 상피 세포의 최소 부분과 밀접한 (또는 직접적인) 접촉을 한다. 본 발명과 관련하여, 이것은 상피 세포 및 중간엽 세포가 직접 또는 본 발명에 따라 배양 중 세포 사이에 형성된 기저판(basal lamina)의 존재를 통해 서로 연결됨을 나타내는 것이다. 전형적으로, 중간엽 세포 시트 및 상피 세포 시트 사이의 거리는 기저판의 두께보다 얇다(예를 들어, 바람직하게는 100 마이크로미터 미만, 보다 바람직하게는 10 마이크로미터의 범위). 본 발명과 관련하여, 당업자는 기저판이 상피 세포 및 상피 세포의 성장 및 조절 메카니즘에서 중요한 중간엽 세포 사이의 구조적 및 기능적 계면(interface)임을 이해한다. 기저판의 두께는 예를 들어, 상피의 유형 또는 위치, 및 신체의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 30-300 nm, 예를 들면, 100 nm(예를 들어, Dockery et al. Hum.Repr.Update (1998) 4(5):486-495), 당업계에서 사용되는 막 및 필터보다 작은 값의 두께를 가질 수 있다.

또한, 상기 방법은 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크에 존재하는 수성 배지의 제거에 의해 상피 세포를 대기에 노출시키는 단계를 더 포함한다. 중간엽 세포 및 상피 세포가 증식하도록 허용된 후, 바람직하게는 관형 구조물을 형성시킨 후에 공기에 노출시킬 수 있다(subjection to air). 이 실시양태는 생체 내 조건 하에 있는 상피 세포를 사용하는 경우, 예를 들어 폐, 피부 또는 장에서 공기에 또한 적용될 때 특히 바람직하다.

당업자는 상피 세포가 공기에 제한되지 않는 다양한 조건을 노출될 수 있고, 이는 다른 기체, 유체, 약물 및 화합물, 식품 성분에 노출될 수 있음을 이해한다. 세포가 예를 들어 위장관(gastro-intestinal tract) 또는 질 상피(vaginal epithelia)의 루멘(lumen)에서 박테리아에 노출되는 것이 고려된다.

또한, 미세유체 세포배양 시스템은 단계 a)에서의 중간엽 세포 및 단계 c)에서의 상피 세포가 도입되는 배양 챔버를 포함한다. 따라서, 이러한 챔버는 미세유체 채널 네트워크를 형성한다.

바람직한 실시양태에서, 세포가 도입되는 미세유체 채널 네트워크는 세포로의 유체 경로를 제공하도록 구성된 제1 부분 및/또는 상기 세포로부터 유체 경로를 제공하도록 구성된 제2 부분의 존재를 특징으로 하며, 바람직하게 상기 세포는 중간엽 세포 및 상피 세포를 포함하는 배양 챔버로부터 분리된다. 이것은 채널을 통해 그리고 채널에 존재하는 세포를 따라, 예를 들어 배양 챔버 내에서 성장 배지의 유동을 허용한다.

겔이 존재할 때, 겔은 미세유체 채널 네트워크 또는 미세유체 채널 네트워크에 인접한 채널에 제공될 수 있으며, 상기 겔은 미세유체 채널 네트워크와 직접 접촉한다. 두 경우 모두에서, 겔은 따라서 세포가 도입되는 미세유체 채널 네트워크의 벽의 일부를 덮거나 형성한다.

겔과 인접하여, 겔과 접촉하는 추가의 미세유체 채널 네트워크가 존재하지만, 상기 채널은 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널과 직접 접촉하지 않는 경우일 수도 있다. 예를 들어, 세포가 도입될 채널에 인접한 채널에 겔이 존재하는 경우, 겔은 이 채널의 벽의 일부를 형성한다. 겔의 다른면에는, 추가 채널이 존재할 수 있으며, 예를 들어 겔에 영양분 또는 화합물을 제공하기 위해 사용될 수 있거나 세포에 의해 분비된 물질을 수집하는데 사용될 수 있다.

대안적으로, 겔은 관류 채널의 두면에 존재할 수 있다. 이 실시양태는 최대 겔 표면이 세뇨관을 향해 노출된다는 이점을 갖는다. 겔은 여러개의 입구 또는 하나의 공통입구에서 도입될 수 있다. 특히, 위상 가이드와 같은 모세관 압력 장벽을 사용하여 작업할 때, 메니스커스 피닝시의 겔 전구체의 메니스커스는 관류 채널 내로 연장되어, 단면(cross section)에서 원호형(arc-shaped) 메니스커스가 존재하게된다. 이것은 형성될 세관의 보다 구형인 단면을 달성하는데 유리할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에서, 미세유체 세포배양 시스템은 미세유체 채널 네트워크 및/또는 겔 및/또는 추가의 미세유체 채널 네트워크에서 세포에 중단 없는 광 경로를 제공한다. 이것은 중공 채널/미세유체 채널 네트워크에서 배양된 세포의 중단 없는 측정, 모니터링 또는 관찰을 가능하게 한다. 상기 방법은 또한 배양 중에 또는 본 발명의 방법으로 배양된 세포를 사용하여 미세유체 배양 시스템에서 세포, 겔 및/또는 미세유체 채널 네트워크의 복수의 이미지를 포착하는 것을 포함할 수 있다.

또한 단계 a) 내지 d) 중 임의의 단계와 동시에 또는 후에 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 것이 제공된다. 시험 화합물은 임의의 유형의 화합물, 예를 들어 약물, 식품 또는 혈액에서 발견되는 물질일 수 있다. 시험 화합물이 박테리아, 진핵 세포의 바이러스(예를 들어, 혈액 세포를 포함)인 것으로 고려된다. 이러한 화합물이 상피 기능에 미치는 영향은 이러한 화합물이 없는 조건과 비교함으로써 결정될 수 있다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 방법으로 미세유체 시스템에서 수득된 세포는 매우 다양한 환경에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상피 장벽, 독성 연구, 미생물과의 공동 배양, 식품 흡수 연구(food absorption studies), 염증 연구, 염증성 장질환, 낭포성 섬유증, COPD, 천식, 암과 같은 질병 모델 제공, 건강 및 병이 있는 조건에서의 상피 기능에 대한 역학 연구를 평가하기 위한 것 등을 포함한다. 당업자는 이러한 실험 설정의 맥락에서 본 발명에 따라 배양된 세포를 사용하는 방법을 이해한다. 본 발명에 따른 미세유체 시스템을 사용하는 것은 신뢰성 높은 고처리량 시험을 가능하게 한다.

또한, 세포의 내부 그룹 및 세포의 외부 그룹을 포함하는 미세유체 채널 네트워크를 갖는 미세유체 세포배양 시스템을 포함하는 조성물 또는 시스템이 제공되며, 상기 세포의 내부 그룹은 상기 세포의 외부 그룹에 의해 적어도 부분적으로 덮히고, 내부 그룹의 세포는 상피 세포이고, 외부 그룹의 세포는 중간엽 세포이고, 바람직하게는 세포의 내부 그룹 및 세포의 외부 그룹은 상호작용하거나 직접 접촉한다. 다시 말해서, 여기에 기술된 바와 같이 서로 밀접하게 접촉하는 중간엽 세포층 및 상피 세포층을 내부에 포함하는 미세유체 세포배양 장치가 또한 제공된다. 바람직하게는 중간엽 세포 및 상피 세포는 본원에서 정의된 관형 구조의 형태이다. 또한, 미세유체 채널 네트워크를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 사용하여 상피 세포를 배양 및/또는 모니터링하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

a) 수성 배지를 사용하여 미세유체 채널 네트워크에 세포의 혼합물이 도입되는, 미세유체 채널 네트워크에서 상피 세포 및 중간엽 세포의 혼합물을 도입하는 단계;

b) 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부가 세포로 덮일 때까지 중간엽 세포 및 상피 세포가 증식하도록 하는 단계.

마지막으로, 중간엽 세포 및 상피 세포를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템이 제공되며, 바람직하게 여기서 중간엽 세포 및 상피 세포가 관형 구조를 형성하고 또는, 본 발명의 상피 세포를 배양 및/또는 모니터링하는 방법에 의해 수득되는 중간엽 및 상피 세포를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 제공한다.

중간엽 세포 및 상피 세포를 갖는 이러한 미세유체 세포배양 시스템이 중요한 이점을 제공함을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 시스템으로, 소비자는 예를 들어, 적절한 세포를 이미 포함하는 시스템(예를 들어, 테스트용)을 준비할 수 있거나, 제한된 추가 배양 및 처리만을 요구하는 시스템으로 제공될 수 있다. 이는 본 발명의 방법으로 배양된 세포를 사용할 때 얻어진 실험 데이터의 재현성 및 품질을 향상시킨다. 따라서, 미세유체 세포배양 시스템은 본원에 기술된 임의의 발달 단계에 있을 수 있는 중간엽 및 상피 세포를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.

당업자는 이 방법에 대한 다양한 실시양태 및 선호도와 관련하여, 이 방법에 적용가능한 한, 상세한 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐 본 명세서에 기재된 다양한 실시양태 및 선호사항을 참조할 수 있음을 이해한다.

이제는 본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 이는 예시로서 제공되는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아닌 다음의 실시예를 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 것이다.

실시예

재료 및 방법

cedge-villus axis를 확립하는 것 뿐만 아니라 창자의 발달 패턴을 형성하는 동안 Hedgehog, Wnt 및 BMP 신호가 필요할 수 있다. 생체 내에서(in vivo), 장 상피 세포는 상호 작용하고, 하부중간엽(underlying mesenchyme)으로부터의 신호를 중계(relay on)한다. 장의 중간엽 세포는 상피-중간엽의 상호 작용에 동적으로 기여하여 상피의 증식과 분화 모두를 조절한다.

장관(intestinal tract)의 미세유체 모델에 소낭선-융모 축(crypt-villus axis)을 설정하기 위해, 우리는 문헌에 설명된대로 인간의 장조직 샘플로부터 설립된 장 오르가노이드 배지를 사용했다(Sato, T. et al., 2011, Gastroenterol). 마우스, 개과 동물, 고양이과 동물 등의 오르가노이드도 사용할 수 있다.

오르가노이드는 10-50 microl ECM(예: 마트리겔, 바람직하게는 마트리겔, BME(Cultrex Basement Membrane Extracts, BME2))에 내포되었고(embedded), 48- 또는 24-웰 플레이트에 파종되었으며(seeded), 페니실린/스트렙토마이신, 1x Glutamax, 10 mmol/L HEPES, 1x N2, 1x B27(모두 Life Technologies로부터 수득), 50 ng/ml 쥣과 EGF, 1 mmol/L N-아세틸시스테인(Sigma), 100 ng/ml의 쥣과 노긴(noggin), 1 μg/ml의 인간 R-spondin-1, 1 mM의 가스트린(gastrin), 10 mM의 니코틴아미드(nicotinamide), 10 μM의 SB202190, 500 nM의 A83-01, 50%의 Wnt3a 조건화 배지(conditioned medium) 또는 200(300, 400, 500 또는 그 이상의) ng/ml 재조합 Wnt3a 단백질(R&D)로 보충된, advanced Dulbecco's modified Eagle/F12로 구성된 기본 배지(basal medium) 250-750 microliter로 중첩되었다(overlaid). 전체 배지는 2-3일마다 교체되었고 오르가노이드는 매주 1:2(또는 1:3, 1:4, 1:5)로 계대되었다.

장관 개발을 모델링하기 위해, 우리는 바람직하게는 장기관 유래의 중간엽 세포(예: 마우스 배아 섬유아세포, 마우스 섬유아세포, 인간 섬유아세포, 장 섬유아세포, 평활근세포, 바람직하게는 사람의 장섬유근세포(intestinal myo-fibroblasts))를 사용하여, ECM에서 1E6 또는 5E6 또는 10E6 또는 15E6 또는 20E6 세포/ml의 밀도로 겔(예를 들어, 콜라겐 I, IV, Hystem c, 마트리겔일 수 있음) 내의 2차 레인 또는 3차 레인에 파종되거나, pen/strep, 1x NEAA, 1x Glutamax가 보충된 DMEM(또는 EMEM 또는 RPMI 배지) 중 10 또는 15% FCS로 구성된 배지와 ECM의 조합에 파종된다. ECM 및 배지 사이의 비율은 예를 들어 9:1 또는 8:1 또는 7:1 또는 6:1 또는 5:1 또는 3:1 또는 2:1 또는 1:1일 수 있다.

또 다른 실험에서, 예를 들어 장관의 기원(바람직하게는 인간의 장 섬유아세포, 장섬유근세포)의 중간엽 세포가 ECM에 대해 도입된다. 중간엽 세포의 배양 후 약 0-72 시간 또는 그 이상 동안, 상피 장 오르가노이드 세포가 중간엽 세포에 인접한 채널로 도입된다.

하부 중간엽의 패터닝은 상피 세포의 패터닝과 소낭선 형성(crypt formation)에 중요할 수 있다. 장관(intestinal tract)의 발달 동안, 중간엽 세포는 장 상피의 소낭선 형성의 신호를 제공할 pericryptal 지역에 집중되어 있다. 소낭선 형성을 돕는 중간엽 농축 세포에 의해 생성되는 주된 요인 중 하나가 Wnt 단백질이다.

TGFβ, 엔도테린 1(endothelin 1), PDGF-B, PDGFA 및 헤지호그(Hedgehog) 단백질(Shh, Ihh, Hh)과 같은 주화성 신호를 제공함으로써 장 중간엽 세포(intestinal mesenchymal cells)가 농축된 세포 클러스터를 형성하도록 동원될 수 있음이 밝혀졌다. 장 중간엽은 많은 종류의 Wnt 단백질을 생산한다. 하나의 실험에서, 상기 방법은 중간엽 세포가 이들 신호들의 조합 중 하나(예를 들어, Affi-gel beads(Bio Rad, 153-7302)를 hrSHH(예를 들어, PBS 중 0,1 내지 1 mg/mL; R&D Systems; 1845-SH)에 담금)와 함께 흠뻑 적셔진 수지를 함유하는 겔에 시딩될 수 있고 세포 농도를 유도하기 위해 겔 내의 중간엽 세포와 함께 시딩될 수 있다. 다음으로 장기관 세포(단세포 또는 5분 동안 TrypLE을 사용하여 준비된 세포의 2-5세포 클러스터)가 ECM의 다음 채널 또는 ECM에 대하여 도입되었다. 세포는 1E6 또는 5E6 또는 10E6 또는 15E6 또는 20E6 세포/ml의 밀도로 접종될 수 있다.

중간 레인에 한 종류의 ECM을 갖는 미세유체 배양 장치의 3레인 디자인에서, 중간엽 세포는 구슬에 농축 신호를 갖는 젤에 도입될 수 있다(아가로오스 비드는 주화인자(chemoattractant)/신호분자(signaling molecule)로 적셔진다). 다음의 상피 세포는 인접한 채널 중 하나에 도입된다.

극화된 상피 세포는 세포-세포 접촉에 의존하고, 파괴되면 세포사멸(apoptosis)을 겪는다. 따라서 상피 세포가 해리되는 동안 상피 세포의 생존을 증가시키기 위해 락키나제(Rock kinase) 억제제를 제공하는 것이 중요할 수 있다. 바람직하게는 10 μM Y27632 락 억제제(Rock inhibitor)를 사용할 수 있다.

상피 세포는 기본 배지에서 예를 들어 1 또는 2 또는 3 또는 4일 동안 정점에서 및 기저에서 유지된다. 장 상피 세포 채널의 배지는 Wnt3a를 고갈시켰지만 말초(distal) 채널 배지에서는 여분의 wnt3a 단백질이 보충되었다. 이것은 Wnt 단백질이 튜브의 한쪽면에 있는 소낭선-유사 구조를 유지하기 위한 신호를 제공할 것이기 때문에 상피 구조를 유도한 장 줄기세포를 배양할 때 특히 유리할 수 있으며 다른 채널의 Wnt 농도가 감소하면 상피 장벽의 분화를 지원할 수 있다.

장치 내에서 예를 들어, 인비보 내장에서 발견된 Wnt 신호의 세포 미세 환경 및 시그널링 구배의 재현(recreating)은 기능적 장 조직의 조립에 유리한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 적어도 100 ng/ml 이상의 농도의 Wnt3a 재조합 단백질은 이 신호의 농도 구배를 생성하는 데 사용하는 것이 바람직하다. 동일한 농도 구배 효과의 증폭은 예를 들어 50 ng/ml 이상의 농도의 R-spondin(예: R-spondin 1) 단백질로 생성되야한다. Wnt3a 조건화된 배지 및 R-spondin 1 조건화된 배지는 또한 그러한 구배를 생성하는데 사용될 수 있다. R-spondin 조건화된 배지의 농도는 바람직하게는 10% 이상일 수 있다. Wnt3a 조건화된 배지에 대한 농도는 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 30% 이상일 수 있다.

GSKβ 저해제 소분자 CHIR은 표준 Wnt 경로를 활성화시킨다. CHIR 분자는 예를 들어 3 μM 이상의 농도로 사용될 때, 장치 내에서 장 상피의 초기 팽창 단계 동안 Wnt3a 또는 R-spondin 1 단백질의 사용을 대체할 수 있다. CHIR 분자는 Wnt 시그널링 농도구배의 생성에 바람직하지 않을 수 있는데, 이는 이 작은 분자가 단백질과 달리 배양에서 빠르게 확산될 수 있기 때문이다. CHIR 대신에, 예를 들어 1 mM 내지 30 mM 농도의 또 다른 GSKβ 억제제인 LiCl이 사용될 수 있다.

Bmp 신호 분자(예, BMP4)는 생체 내에서 하부 중간엽에 의해 생성되고 방출된다. BMP 신호 전달은 장의 줄기세포에 대한 분화 신호를 제공한다. 따라서 줄기세포 구획(BMP에 의해 저해됨)의 활성 증식을 지원하고 생체 내에서 발견되는 대조 물과 유사한 장관의 분리(segregation) 및 분화(differentiation)를 허용하기 위해 BMP 억제제(예: 노긴(Noggin))의 구배를 재현하는 것이 유리할 수 있다.

노긴(Noggin) 함유 배지는 장치의 한쪽면에 제공될 수 있으며, 예를 들어,소낭선의 "바닥"에서 공급될 수 있다. 예를 들어, 상피 세포가 컨플루언시(confluency)에 도달한 후에 (또는 이전에) 이 신호의 구배가 생성될 수 있다. 노긴이 고갈된 배지는 조작된 튜브의 정점 측(apical side)에 제공될 수 있다. 이 방법은 그 분화 상태의 특정 발현이 정점 측에서 점액(mucins) 생성과 같은 것이 요구될 때 장내 라이닝(intestinal lining)의 성숙에 특히 유익할 수 있다.

EGF는 또한 인비보 및 인비트로에서 장의 줄기세포 및 전구세포를 유지하는 데 중요할 수 있다. 또한, (예컨대, 모유로) 정점에서 보충되면 신생아에서 진행하는 소장의 세포사멸 및 괴사로부터 보호할 수 있다. 따라서 EGF 보충은 예를 들어 10 ng/ml 이상 100 ng/ml 이하, 바람직하게는 50 ng/ml의 농도로 배양기간 동안 유지되어 상피 세포의 증식을 지원하고 이들 세포에서 세포사멸을 억제할 수 있다.

노치 경로(Notch pathway) 활성은 장 상피의 증식 상태에 중요하며, 예를 들어 ρ-세크리테아제(secretase) 저해제로 억제될 경우 장 세포의 예를 들어 배상 세포(goblet cell)로의 말단 분화를 초래할 수 있다. 따라서 점액 생성을 위한 배상 세포의 성숙을 향상시키기 위한 Notch 경로 억제제의 단기 펄스를 주는 것이 유익할 수 있다. β-세크레타아제 억제제(예를 들어, 10 μM DAPT)는 장치에서 상피 세포의 초기 증식 후에 사용되는 것이 바람직할 수 있다.

예를 들어 3일 후 상피 세포를 접종한 후 또는 세포의 상피 세포층이 컨플루언시에 도달한 후에 ρ-세크리테아제 억제제를 정점 측 배지에 첨가하여 배상 세포의 성장 정지 및 성숙을 유도할 수 있다. 배지는 ρ-세크리테아제 저해제 존재 하에서 줄기세포 적소(crypt)의 손실을 방지하기 위해 ρ-세크리테아제 저해제가 고갈될 수 있으며, 예를 들어 연속 배양 5일 이내인 것이 바람직하다(예: 12시간 또는 24시간 또는 48시간 이후 등). 이 치료법은 성숙한 배상 세포에 의한 점액층 생성을 개선할 수 있으며, 노치 억제제로 짧은 치료를 하고 기저부 측에서 강하게 Wnt 작용제를 투여하면 (소낭선에 가깝게) 줄기세포 적소가 보존될 수 있다.

이 두 가지 세포 유형을 연속적으로 접종한 후 중요한 경로의 작동제(agonists)와 억제제(inhibitors)를 투여하면 성숙한 관 형태의 장 미니 장기(tubular intestinal mini-organ)가 성공적으로 개발될 것이다.

중간엽 및 상피 세포의 연속 파종

이 실험을 위해 도 1과 같이 400 미크론 와이드 레인을 갖춘 3레인 OrganoPlate®(MIMETAS)가 사용되었다. ECM 겔(아래 참조)에 5000 세포/실험 농도로 파종된 장근섬유아세포를 겔 레인(103)에 주사하였다. 그 후, EMEM 배지(아래 기재) 중의 CaCO-2 세포를 관류 레인(perfusion lane)(102)에 20,000 세포/실험의 농도로 주입하였다. 다음으로, Caco-2 세포를 7일 동안 배양하였다(근섬유아세포 존재 하에). 제3미세유체 채널(106)에서 smGM 배지(평활근 성장 배지; Lonza)가 존재하였다. 7일째, 위상 콘트라스트 영상을 촬영하였으며, 그 결과는 도 29a 및 도 29b에 도시된다.

Caco-2 세포가 근섬유아세포를 포함하는 겔 레인에 들어갔고, 근섬유아세포와 상호작용하여 상부에 층을 형성한다는 것을 이 수치에서 알 수 있다. 또한 이 실험은 Caco-2 세포 및 근섬유아세포가 상호작용하는 곳에서 이차 형태와 조직이 형성됨을 보여준다. 화살표는 결장 또는 소장에서 발견되는 소낭선(crypt) 및 융모(villus) 모양과 유사하게 생겼으며 생체 내 상황과 매우 흡사한 그러한 구조를 가리킨다.

EMEM 배지:

EMEM (ATCC, Cat.No. 30-2003)

Pen/Strep 1% (Sigma, Cat.No. P4333)

MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) 1% (Gibco, Cat.No. 11140-050)

FBS HI 10% (Gibco, Cat. No. 16140-071).

ECM 겔:

콜라겐 I 5 mg/mL (AMSbio Cultrex 3D collagen I rat tail, 5 mg/mL, #3447-020-01)

i. 1M HEPES (Life Technologies 15630-122)

ii. 37 g/L NaHCO3 (Sigma S5761-500G))

SmGM-2 평활근 성장 배지-2 (Smooth Muscle Growth Medium-2)

SmGM-2 완전 배지(complete medium):

- SmBM 기본 배지(Basal Medium) (Lonza, CC-3156)

- SmGM^TM _-2 SingleQuots^TM보충제 및 성장인자 (hEGF, 인슐린, FGF-B, FBS 및 겐타마이신(gentamicin)/암포테리신B(amphotericinB))

간엽/상피 세포 튜브

이 실험을 위해 400 미크론 와이드 레인을 갖춘 2레인 OrganoPlate®(MIMETAS)가 사용되었다.

내피 세포 성장 배지(Endothelial Cell Growth Medium) MV2 (Promocel, Cat: C-22022)에서 vvHUVEC-RFP 내피 세포(Angiocrine, 세포 통로 4)의 4:1 혼합물; ㅎ혈관주위세포 배지(Pericyte Medium)(Sciencell) 중 뇌혈관주위세포(Sciencell, cell passage 4); 5000 세포/μL의 전체 시작 농도에서 2레인 OrganoPlate®를 관류 로커(perfusion rocker)에 놓았다(7 ° 경사 각도, 8분 록킹 사이클).

배양 3일 후, Actin-Green을 사용하여 세포를 염색하였다. 형성된 튜브의 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 만들었다(Leica, TCS SP5 STED). 3D 프로젝션은 3D 뷰어 피지 플러그인(3D viewer Fiji plug in)을 사용하여 생성되었다(Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772.). 결과를 도 31에 나타내었다. 알 수 있는 바와 같이, 중간엽 세포 및 내피 세포는 내피 세포 및 혈관주위세포 모두를 포함하는 튜브를 형성할 수 있다.

본 발명을 완전히 설명하였으므로, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나 과도한 실험없이 다양한 균등한 파라미터, 농도 및 조건 범위 내에서 동일한 것을 수행할 수 있음을 알 것이다. 본 발명이 특정 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 추가 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 이 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적용을 포함하며, 본 발명이 속하는 기술분야의 공지된 또는 통상적인 실시 내에서의 본 개시로부터의 이탈을 포함하며, 첨부된 청구항의 범위 내에서 이하에 설명된 본질적인 특징들에 적용될 수 있다.

저널 기사 또는 초록, 출판된 또는 이에 상응하는 특허 출원, 특허 또는 임의의 다른 참고 문헌을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 인용된 참고 문헌에 제시된 모든 데이터, 표, 그림 및 텍스트를 포함하여 본원에 참조로 통합된다. 또한, 본원에 인용된 참고 문헌에 인용된 참고 문헌의 전체 내용은 참고 문헌으로 전체적으로 포함된다.

공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 언급은 어떤식으로든 본 발명의 임의의 양상, 설명 또는 실시예가 관련 분야에서 개시, 교시 또는 제안된다는 것을 인정하지 않는다.

특정 실시예에 대한 전술한 설명은 다른 사람이 (본 명세서에 인용된 참고 문헌의 내용을 포함하여) 당업자의 지식 범위 내에서 지식을 적용함으로써 다양한 적용에 대해 용이하게 수정 및/또는 개조할 수 있는 본 발명의 일반적인 성질을 충분히 밝힐 것이고, 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않고, 과도한 실험없이 이러한 특정 실시예를 구현할 수 있다. 그러므로, 그러한 적응 및 수정은 여기에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 실시예들의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 어구 또는 용어는 본 명세서의 용어 또는 표현이 본 명세서에 제시된 가르침 및 지침에 비추어 숙련된 당업자에 의해 해석되도록 그러한 설명을 위한 것이지 한정하기 위한 것이 아니며, 당업자의 지식과 조합하여 사용된다.

Claims

미세유체 채널 네트워크(microfluidic channel network)를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 사용하여 상피 세포(epithelial cells)를 배양 및/또는 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 중간엽 세포(mesenchymal cells)를 미세유체 채널 네트워크에 도입하는 단계로, 여기서 상기 중간엽 세포는 미세유체 채널 네트워크 내로 도입될 때
a1) 수성 배지(aqueous medium)를 사용하는 단계; 또는
a2) 겔 전구체(gel precursor)를 사용하여 겔 전구체를 미세유체 채널 네트워크에서 겔화시켜 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부를 차지하게 하는 단계;
b) 단계 a1)의 경우, 및 바람직하게는 단계 a2)의 경우, 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부가 중간엽 세포로 덮일 때까지 중간엽 세포를 증식(proliferate) 및/또는 분화(differentiate)시키는 단계;
c) 중간엽 세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크에서 상피 세포를 도입하는 단계; 및
d) 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부가 상피 세포로 덮일 때까지 및/또는 중간엽 세포의 적어도 일부가 상피 세포로 덮일 때까지 상피 세포가 증식 및/또는 분화되도록 하는 단계.
제1항에 있어서, 겔 전구체가 미세유체 채널 네트워크에 도입되고, 겔 전구체가 미세유체 채널 네트워크에서 겔화되어 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부를 점유하게 하는 방법.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 겔은 바람직하게는 모세관 압력 장벽(capillary pressure barrier)의 사용, UV 패터닝, 또는 겔화 후에 바늘을 철회(retracting)하거나 겔화 후에 제거되는 희생층(sacrificial layer)을 가짐으로써 패터닝되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 도입된 중간엽 세포가 겔 전구 약물체에 분산/현탁되는(dispersed/suspended) 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 중간엽 세포는 수성 배지(aqueous medium), 바람직하게는 겔을 사용하여 미세유체 채널 네트워크에 도입되는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 중간엽 세포가 미세유체 채널 네트워크에서 적어도 하나의 중간엽 세포의 그룹/층/시트가 형성될 때까지 증식 및/또는 분화되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 중간엽 세포가 미세유체 채널 네트워크에서 적어도 중간엽 세포의 관형 구조(tubular structure)가 형성될 때까지 증식 및/또는 분화되는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 세포 및/또는 상피 세포가 도입될 때 분해되는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상피 세포가 미세유체 채널 네트워크에서 적어도 하나의 상피세포의 그룹/층/시트가 형성될 때까지 증식 및/또는 분화되는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상피 세포가 미세유체 채널 네트워크에서 적어도 상피 세포의 관형 구조가 형성될 때까지 증식 및/또는 분화되는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 중간엽 줄기세포가 단계 a)에서 겔 내로 도입되면, 상피 세포는 적어도 하나의 상피 세포의 그룹/층/시트가 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부분을 차지하는 겔의 적어도 일부를 덮을 때까지 증식 및/또는 분화하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 관형 구조의 루멘(lumen)을 통한 성장 배지의 흐름(flow)이 적용되고, 상기 흐름은 단방향(uni-directional) 또는 양방향(bi-directional)일 수 있는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 Wnt, noggin, egf/fgf 및/또는 Rspondin 중 적어도 하나를 포함하는 성장 배지의 존재하에 배양되는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 세포의 적어도 일부가 미세유체 채널 네트워크 벽 및 상피 세포 사이에 위치하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상피 세포는 중간엽 세포에 의해 형성된 관형 구조 내부에 관형 구조를 형성하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상기 상피 세포가 정점(apical) 및 기저 측(basolateral side)을 갖는 세포층을 형성하도록 허용되고, 상기 기저 측이 상기 중간엽 세포를 향하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 세포의 적어도 일부가 상피 세포의 적어도 일부와 직접 접촉 및/또는 중간엽 세포 시트 및 상피 세포 시트 사이의 거리가 기저판(basal lamina)의 두께보다 얇은 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 세포가 근섬유아세포(myofibroblasts), 섬유아세포(fibroblasts), 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondroblasts), 골아세포(osteoblasts), 평활근세포(smooth muscle cells) 및 간질세포(stromal cells) 중에서 선택되고, 바람직하게는 중간엽 세포가 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상피 세포는 단순 상피 세포(simple epithelia cells), 단순 편평 상피 세포(simple squamous epithelia cells), 중층 상피 세포(stratified epithelia cells) 또는 원주 상피 세포(columnar epithelia cells)로부터 선택되며, 바람직하게는 상기 상피 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 세포 및/또는 상피 세포는 일차 세포(primary cells)인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크에 존재하는 수성 배지의 제거에 의해 상피 세포를 공기에 노출시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 세포배양 시스템은 배양 챔버를 포함하고, 여기서 단계 a)의 중간엽 세포 및 단계 c)의 상피 세포가 도입되는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세유체 채널 네트워크는 세포로의 유체 경로(fluid path)를 제공하도록 구성된, 바람직하게는 중간엽 세포 및 상피 세포를 포함하는 배양 챔버로의 유체 경로를 제공하도록 구성된 제1부분 및/또는 상기 세포로부터 유체 경로를 제공하도록 구성된, 바람직하게는 중간엽 세포 및 상피 세포를 포함하는 배양 챔버로부터 유체 경로를 제공하도록 구성된 제2부분의 존재를 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 겔이 존재하는 경우, 겔은 미세유체 채널 네트워크 또는 미세유체 채널 네트워크에 인접한 채널에 제공되고, 상기 겔은 미세유체 채널 네트워크와 직접 접촉하는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 겔에 인접하여 젤과 접촉하는 추가의 중공 미세유체 채널(hollow microfluidic channel)이 존재하지만 상기 채널은 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널과 직접 접촉하지 않는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 상이한 유형의 중간엽 세포가 도입되고 및/또는 단계 c)에서 상이한 유형의 상피 세포가 동일한 미세유체 채널에 도입되는 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 겔은 기저막 추출물(basement membrane extract), 세포외 기질 성분(extracellular matrix component), 콜라겐(collagen), 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), D-리신(D-lysine), 엔탁틴(entactin), 헤파란 설파이드 프로테오글리칸(heparan sulfide proteoglycans) 또는 이들의 조합물인 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 세포배양 시스템은 미세유체 채널 네트워크 및/또는 겔 및/또는 추가의 미세유체 채널 네트워크에서 세포들에 중단 없는 광 경로(uninterrupted optical path)를 제공하는 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 미세유체 배양 시스템에서 세포, 겔 및/또는 미세유체 채널 네트워크의 다수의 이미지를 포획하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 내지 d) 중 임의의 단계와 동시 또는 이후에 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 방법.
상피 장벽을 통한 이동(transport), 독성 연구, 미생물(microbiome)과의 공동 배양, 식품 흡수 연구, 염증 연구를 평가하기 위한, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식(asthma), 암과 같은 질병 모델을 제공하기 위해, 건강 및 병이 있는 상태에서의 상피 기능에 대한 역학 연구를 위한, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법으로 수득된 미세유체 세포배양 시스템에서의 세포의 용도.
미세유체 채널 네트워크를 갖는 미세유체 세포배양 시스템을 포함하는 조성물 또는 시스템으로서, 세포의 내부 그룹(inner group) 및 세포의 외부 그룹(outer group)을 포함하고, 여기서 세포의 내부 그룹은 상기 세포의 외부 그룹에 의해 적어도 부분적으로 덮히고, 여기서 내부 그룹의 세포는 상피 세포이고 외부 그룹의 세포는 중간엽 세포이고, 여기서 바람직하게는 세포의 내부 그룹 및 세포의 외부 그룹은 상호작용하거나 직접 접촉하는, 조성물 또는 시스템.
미세유체 채널 네트워크를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템을 사용하여 상피 세포를 배양 및/또는 모니터링하는 방법으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 미세유체 채널 네트워크에서 상피 세포 및 중간엽 세포의 혼합물을 도입하는 단계로, 여기서 상기 세포의 혼합물은 수성 배지를 사용하여 미세유체 채널 네트워크에 도입되는 단계;
b) 바람직하게는 미세유체 채널 네트워크의 적어도 일부가 세포로 덮일 때까지 중간엽 세포 및 상피 세포가 증식 및/또는 분화되도록 하는 단계.
중간엽 줄기세포 및 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크를 포함하는 미세유체 세포배양 시스템으로, 바람직하게는 중간엽 세포 및 상피 세포가 관형 구조를 형성하는, 미세유체 세포배양 시스템.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 상피 세포 배양 및/또는 모니터링 방법에 의해 수득 가능한 중간엽 세포 및 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널 네트워크를 포함하는, 미세유체 세포배양 시스템.