ITMI20131468A1 - Processo per la realizzazione di film self standing a base di macromolecole di origine naturale o sintetica caratterizzati da micro-pattern a porosità controllata - Google Patents

Description

Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo: ”Processo per la realizzazione di film self standing a base di macromolecole di origine naturale o sintetica caratterizzati da micro-pattern a porosità controllata”.

Settore tecnico dell’invenzione

L’invenzione si riferisce ad un processo per la realizzazione di strutture bidimensionali (film) self-standing a spessore variabile e controllato a base di macromolecole polielettrolite di origine naturale o sintetica, pH-dipendenti ,caratterizzati da micro-pattern a porosità controllata.

Più in particolare si riferisce ad un processo elettrochimico/elettroforetico per depositare in modo controllato su “template conduttivo micropatternato”, preferibilmente griglie in materiale conduttivo quale grafite o metallo, avente opportune dimensioni del lume delle maglie, macromolecole polielettroliti, tra le quali, come esempio non esaustivo, chitosano, alginato, collagene, al fine di conseguire film self-standing caratterizzati da micro-pattern a porosità controllata a base di dette macromolecole.

L’invenzione si riferisce inoltre ai materiali ottenuti attraverso il suddetto processo.

Il processo dell’invenzione trova applicazione industriale, come esempio non esaustivo, nel settore dei biomateriali porosi, sistemi per il rilascio di farmaci e biosensori, oltre che per la deposizione di biopolimeri e prodotti biologici.

Stato della tecnica

Dalla letteratura tecnico-scientifica e dall’esperienza del mondo industriale è noto che la principale strategia terapeutica per il trattamento delle lesioni della cute, e in molti casi anche delle lesioni profonde della pelle, è rappresentata dall’uso di bendaggi. Questi sono in genere realizzati con materiali di origine naturale, mediante tecniche convenzionali di lavorazione dei tessuti (filatura e successiva tessitura). Alcuni dispositivi sono invece realizzati utilizzando tessuti non tessuti.

Nel caso di lesioni irreversibili della pelle, l’approccio terapeutico più comune è rappresentato da innesti cutanei autologhi (Atiyeh, Costagliola 2007, Metcalfe, Ferguson 2007). Tuttavia, nei casi in cui le lesioni siano molto estese (come nei grandi ustionati) o compromesse nelle funzionalità rigenerative (come nel caso delle ulcere da diabete), i siti donatori possono essere insufficienti. In questi casi è necessario ricorrere a cure basate sulla rigenerazione tissutale.

Per entrambi gli approcci terapeutici, nel corso degli anni, sono stati progettati e messi in commercio diversi dispositivi, caratterizzati da supporti con opportune caratteristiche chimicofisiche e morfologiche. Dal punto di vista morfologico, tali strutture possono essere di due tipi: continue, eventualmente caratterizzate da una porosità casuale ma controllata in dimensione e interconnesione alla scala micrometrica, ovvero micro-patternate. Esistono tecniche differenti che consentono l’ottenimento di morfologie appartenenti alla prima o alla seconda categoria: in base all’applicazione deve pertanto essere scelta la tecnica di ottenimento più adeguata.

Sono state proposte numerose tecnologie per la fabbricazione di bendaggi e strutture porose in chitosano: rilascio di agenti porogeni, stampa 3D, separazione di fase, film casting, electrospinning, emulsione e liofilizzazione (Ma, Wang et al. 2001, Kumbar, James et al. 2008, Hutmacher 2001, Ho, Kuo et al. 2004, Madihally, Matthew 1999) .

Una delle tecniche più comunemente utilizzate è quella del solvent casting. Mediante tale tecnica, un manufatto è ottenuto da una soluzione del polimero in opportuno solvente e la successiva evaporazione in stampo. Questa tecnica può essere modificata per ottenere una porosità aggiungendo un agente porogeno, non solubile nel solvente del polimero e solubile in non-solventi del polimero stesso. Dopo l’evaporazione del solvente si esegue l’estrazione del porogeno per immersione in soluzioni non solventi per il polimero. La dimensione e la forma dei pori dipendono dall’agente porogeno. Nel caso l’agente porogeno sia un gas, la tecnica prende il nome di gas foaming.

Per esempio, strutture porose in Chitosano sono state realizzate da Ma e collaboratori (2001). Questo approccio, ancorché interessante per l’alta versatilità e per la possibilità di utilizzare i materiali ottenuti per comprendere l’effetto microstrutturale sulla risposta dei tessuti biologici a contatto, non consente tuttavia la produzione di grandi quantità di materiale.

Un’altra tecnica comunemente utilizzata per la realizzazione di scaffold è la liofilizzazione. Madihally et al. (1999), hanno mostrato come strutture a densità variabile e controllata possano essere preparate a partire da una soluzione di chitosano in acido acetico. La liofilizzazione è una tecnica che consente l’eliminazione totale dell’acqua (o più in generale del solvente) da campioni che vengono ridotti in polveri disidratate (o solidi porosi). La liofilizzazione avviene a bassissime temperature ed in alto vuoto in modo che l’acqua contenuta (o il solvente) si trasformi in ghiaccio e sublimi passando dallo stato solido a quello di vapore. Questi aspetti rendono tuttavia fortemente limitante, dal punto di vista tecnologico, l’effettiva implementazione industriale se si vogliono ottenere superfici continue di dimensioni significative.

L’electrospinning è una tecnica che permette l’ottenimento di matrici aventi fibre micrometriche o nanometriche grazie all’impiego di forze elettrostatiche. Una soluzione polimerica è fatta gocciolare tramite pompa a siringa: sulla superficie della goccia si formano cariche di segno uguale che danno luogo alla nascita di forze elettrostatiche di repulsione. Quando queste forze sono tali da superare la tensione superficiale della goccia, si forma un jet polimerico. Una volta formato, il jet subisce l’attrazione del campo elettrico verso il collettore. Il jet, durante il tragitto tra spinneret e collettore, attraversa una zona d’instabilità in cui viene stirato in maniera decisiva per la formazione della nanofibra. Questa andrà poi a depositarsi sul sistema di raccolta (collettore). Questa tecnica costituisce uno strumento semplice e poco costoso perché richiede ridotte quantità di materiale ed è applicabile ad una vasta gamma di polimeri. Permette di controllare il diametro e le proprietà delle fibre agendo sui parametri del deposito. Tra i principali svantaggi vi è l’impossibilità di realizzare strutture che presentino un pattern regolare in disposizione spaziale dei fori passanti e dimensione degli stessi. Analogo problema presentano le tecniche più convenzionali per la realizzazione di tessuti non tessuti. Desai et al (2008) hanno ottenuto delle fibre in chitosano tramite electrospinning.

Un’altra tecnica largamente utilizzata per la produzione di strutture 3D a porosità e morfologia controllate è la stampa 3D. Questa tecnologia è basata sull’erogazione di un agglomerante, attraverso un ugello per stampa, su un letto di polimero in polvere. Senza l’utilizzo di lavorazioni con utensili, l’oggetto è costruito sequenzialmente strato su strato: l’agglomerante liquido (solvente, soluzione di solventi) a bassa viscosità viene erogato da un ugello per stampa su un letto sottile di polvere; le gocce, legandosi alla polvere, la compattano e formano uno strato 2D. Dopo aver stampato uno strato e averlo fatto asciugare, si abbassa la piattaforma ad una distanza fissata, viene depositato un nuovo strato di polvere e il processo di stampa è ripetuto. Dopo aver completato la stampa di tutta la struttura, si elimina la polvere non legata. È una tecnica che può essere condotta a temperatura ambiente e consente di incorporare agenti biologici, come cellule e fattori di crescita se l'agglomerante non è tossico (ad esempio acqua). Hutmacher (2001) riporta l’ottenimento di scaffolds biodegradabili tramite stampa 3D di polveri di miscele di chitosano e amido e di chitosano, amido e idrossiapatite.

Quest’ultima tecnologia presenta però grossi limiti sui relativi tempi di applicabilità a livello industriale, alquanto impraticabili, rendendo detta tecnologia non competitiva.

A fronte di quanto sopra richiamato, era fortemente sentita la necessità di realizzare un processo in grado di superare tutti i limiti propri dello stato dell’arte al fine di conseguire in modo semplice, veloce, richiedendo apparecchiature non complesse e tempi di lavorazione minimi, film polimerici self standing caratterizzati da micro-pattern a porosità controllata. Tali prodotti possono quindi essere impiegati come componenti per la realizzazione di bendaggi, supporti alla rigenerazione e riparazione di tessuti biologici, di biosensori e per la trasduzione di segnali, per la biofunzionalizzazione di superfici e per creare vescicole e coating compositi per l’ingegneria tessutale anche di superfici complesse.

Sommario dell’invenzione

I richiedenti, sorprendentemente ed inaspettatamente, hanno realizzato un processo di preparazione di film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzati da micro-pattern a porosità passante controllata a base di macromolecole polielettrolite di origine naturale o sintetica pH-dipendenti, processo comprendente: a) la deposizione catodica e/o anodica per via elettrochimica/elettroforetica di dette macromolecole di origine naturale o sintetiche, in particolare polisaccaridi e/o proteine di origine naturale, più in particolare chitosano e/o alginato e/o collagene considerati singolarmente o in combinazione tra loro, su un elettrodo di lavoro in forma di “templante conduttivo micropatternato”, avente opportune dimensioni del lume delle maglie, preferibilmente in materiale conduttivo quale grafite o metallo in particolare titanio o acciaio, preferibilmente in forma di griglia, elettrodo immerso in soluzione elettrolitica, preferibilmente soluzione acquosa, comprendente dette macromolecole; b) rimozione per asportazione meccanica dall’elettrodo di lavoro del film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzato da micro-pattern a porosità passante controllata ottenuto nella fase a).

I film ottenuti/ottenibili secondo il processo oggetto della presente invenzione sono caratterizzati da pori o porosità passante (canali passanti) orientati secondo la direzione perpendicolare al piano del film e con geometria regolare e ordinata nel piano stesso (Micro-pattern), detti pori o porosità passante controllata e controllabile nella forma, nella distribuzione e nelle dimensioni micrometriche dei canali e della loro spaziatura. Il materiale costituente i film ottenuti/ottenibili secondo il processo oggetto della presente invenzione essendo inoltre caratterizzato da una porosità casuale, non passante (porosità secondaria), con pori di dimensioni inferiori ai canali o pori passanti, detta porosità secondaria conseguenza del processo di deposizione del film secondo la presente invenzione.

Descrizione delle figure

Figura 1. Microscopia elettronica a scansione del chitosano depositato su dischetti di titanio.

Figura 2. Microscopia ottica di chitosano depositato su griglie metalliche.

Figura 3. Microscopia elettronica a scansione di chitosano depositato su griglie metalliche

Figura 4. Morfologia dei depositi di chitosano ottenuti su griglie con dimensione del lume pari a 700 μm al variare del tempo di deposizione (tempo) e della densità di corrente utilizzati. Immagini ottenute in microscopia ottica.

Figura 5. Morfologia dei depositi di chitosano ottenuti su griglie con dimensione del lume pari a 700 μm al variare del tempo di deposizione (tempo) e della densità di corrente utilizzati. Immagini ottenute in microscopia ottica.

Figura 6. Morfologia dei depositi di chitosano ottenuti su griglie con dimensione del lume pari a 560 μm al variare del tempo di deposizione (tempo) e della densità di corrente utilizzati. Immagini ottenute in microscopia ottica.

Figura 7. Morfologia dei depositi di chitosano ottenuti su griglie con dimensione del lume pari a 430 μm al variare del tempo di deposizione (tempo) e della densità di corrente utilizzati. Immagini ottenute in microscopia ottica.

Figura 8. Morfologia dei depositi di chitosano ottenuti su griglie con dimensione del lume pari a 280 μm al variare del tempo di deposizione (tempo) e della densità di corrente utilizzati. Immagini ottenute in microscopia ottica.

Figura 9. Morfologia dei depositi di chitosano ottenuti su griglie con dimensione del lume pari a 140 μm al variare del tempo di deposizione (tempo) e della densità di corrente utilizzati. Immagini ottenute in microscopia ottica.

Figura 10. Diametro medio dei pori passanti osservati per depositi di chitosano su griglie con dimensioni del lume da 140 a 700 μm al variare della densità di corrente. I dati sono stati ottenuti mediando 15 misure. Sono riportati valori medi e deviazione standard.

Figura 11. Diametro medio dei pori passanti osservati per depositi di chitosano su griglie con dimensioni del lume pari a 430 μm al variare della densità di corrente e del tempo di deposizione. I dati sono stati ottenuti mediando 15 misure. Sono riportati valori medi e deviazione standard.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

In accordo con ciò, costituisce oggetto della presente invenzione un processo di preparazione di film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzati da micro-pattern a porosità passante controllata a base di macromolecole polielettrolite di origine naturale o sintetica pH-dipendenti, processo comprendente: a) la deposizione catodica e/o anodica per via elettrochimica/elettroforetica di dette macromolecole di origine naturale o sintetica, in particolare polisaccaridi e/o proteine di origine naturale, più in particolare chitosano e/o alginato e/o collagene considerati singolarmente o in combinazione tra loro, su un elettrodo di lavoro in forma di “templante conduttivo micropatternato”, avente opportune dimensioni del lume delle maglie, preferibilmente in materiale conduttivo quale grafite o metallo, in particolare titanio o acciaio, preferibilmente in forma di griglia, elettrodo di lavoro immerso in soluzione elettrolita, preferibilmente acquosa, comprendente dette macromolecole;

b) rimozione per asportazione meccanica dall’elettrodo di lavoro del film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzato da micro-pattern a porosità passante controllata ottenuto nella fase a).

Per “template conduttivo micropatternato”, quale elettrodo di lavoro secondo la presente invenzione si intende un substrato conduttivo avente superficie discontinua, preferibilmente in cui detta discontinuità è costituita da fori, preferibilmente passanti, equidistanti tra loro.

Preferibilmente l’elettrodo di lavoro secondo la presente invenzione è in materiale conduttivo quale grafite o metallo, in particolare in titanio o acciaio, preferibilmente in forma di griglia. In particolare tale elettrodo di lavoro quando in forma di griglia si intende di preferenza in forma di griglia ottenuta per tessitura e/o lavorazione meccanica e/o lavorazione laser e/o elettrochimica e/o water-jet. Preferibilmente l’elettrodo di lavoro secondo la presente invenzione comprende delle maglie il cui lume è almeno uguale a o superiore a 1 µm, più preferibilmente almeno compreso tra 50 e 1000 µm.

Più in generale si è riscontrato che, per le varie macromolecole depositate, quale ad esempio il chitosano, un aumento della relativa concentrazione nella soluzione elettrolita consente una riduzione del valore della densità di corrente applicata, dei tempi di deposizione e del lume delle maglie dell’elettrodo di lavoro.

L’elettrodo di lavoro può essere polarizzato a voltaggi compresi tra 1 mV e 100 V se in condizioni potenziostatiche ovvero a densità di corrente comprese nell’intervallo 0.1 - 100 mA/cm<2>, preferibilmente comprese tra 1 E 30 mA/cm2 in condizioni galvanostatiche, mediante generatore di corrente o tensione DC o AC.

La polarizzazione della superficie dell’elettrodo di lavoro consente la formazione di un micro-pattern self standing a porosità controllata, il cui spessore è modulato dalla densità di corrente applicata e dal tempo di deposizione, pertanto dalla carica totale passata.

Per effetto dei processi d’interfaccia allo strato limite, le molecole in soluzione coagulano a contatto con la superficie esterna dell’elettrodo di lavoro, il “template conduttivo micropatternato”, depositandosi fisicamente sulla superficie dell’elettrodo di lavoro.

I tempi di deposizione secondo il processo oggetto della presente invenzione al fine di conseguire un micro-pattern self standing a porosità controllata comprendente macromolecole di origine naturale o sintetica pH-dipendenti, in particolare chitosano, sono almeno uguali a o superiori a 1 minuto, preferibilmente almeno compresi tra i 4 e 40 minuti. Le soluzioni elettrolitiche che possono essere utilizzate convenientemente per gli scopi del processo oggetto della presente invenzione sono soluzioni acquose ad opportuno pH e/o soluzioni con solvente organico, eventualmente contenenti un elettrolita di supporto atto a modificare la conducibilità della soluzione e le sovratensioni dell’elettrodo di lavoro (acida nel caso del chitosano, contenente anioni quale acetato, citrato, maleico).

Quali macromolecole polielettrolite con solubilità pH-dipendente di origine naturale o sintetica che possono convenientemente essere utilizzate per gli scopi secondo il processo della presente invenzione preferiti sono i polisaccaridi e le proteine di origine naturale, in particolare tra questi il chitosano e/o l’alginato e/o il collagene, tutti considerati singolarmente o in combinazione tra loro. Le concentrazioni delle macromolecole all’interno della soluzione elettrolitica secondo la presente invenzione sono comprese da 0.01 a 10 g/L.

Particolarmente preferita è la soluzione elettrolitica acquosa acida con pH nell’intervallo da 2 a 5 contenete chitosano in concentrazione 1-5 g/L. Il processo secondo la presente invenzione può essere realizzato in modalità discontinua (batch) o in modalità continua.

Il processo dell’invenzione consente di modulare la velocità di deposizione delle macromolecole, le dimensioni dei pori ed il grado di interconnessione in relazione allo sviluppo di idrogeno in condizioni catodiche e di ossigeno in condizioni anodiche. Il meccanismo di deposizione è inoltre basato sulla dipendenza dal pH della solubilità di tali molecole e dalla variazione del pH che viene indotta allo strato limite sulla superficie di materiali conduttori opportunamente polarizzati.

Operando secondo il processo elettrochimico dell’invenzione si possono realizzare film self standing caratterizzati da micro-pattern a porosità passante controllata a base di macromolecole di origine naturale o sintetica pH-dipendenti a spessore variabile, quali il chitosano e/o alginato e/o collagene considerati singolarmente o in combinazione tra loro, che possono essere funzionalizzati con farmaci, sali organici e inorganici, micro- e nanoparticelle per l’inserimento di ulteriori funzionalità (farmacologiche, antibatteriche, etc.) mediante co-deposizione e/o successiva deposizione. Il processo oggetto della presente invenzione consente, grazie alla duttilità e facilità di variazione e gestione dei parametri propri del processo: lume delle maglie dell’elettrodo di lavoro, pH e natura dei soventi della soluzione elettrolita, concentrazione della/e macromolecola/e da depositare, densità di corrente da impiegarsi, consente, ai fini della funzionalizzazione ed additivazione dei film ottenuti/ottenibili tramite il processo della presente invenzione, l’impiego delle tecniche già note nel settore della funzionalizzazione ed additivazione di strutture tridimensionali porose e/o di film sottili di macromolecole polielettrolite quali chitosano e suoi derivati. Tecniche da potersi impiegare sia nella fase di formatura, che a valle delle formatura, del film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzati da micropattern a porosità passante controllata a base di macromolecole polielettrolite di origine naturale o sintetica pH-dipendenti.

In particolare, si possono depositare strati micropatternati con porosità passante aventi spessore a secco compreso tra 1 µm e 1 mm, con geometria dei pori passanti circolare, rettangolare o di altra forma geometrica, con dimensioni superiori a 1 µm. le dimensioni dei pori passanti (canali passanti) che caratterizzano il micro-pattern del film self standing ottenuto/ottenibile con il processo secondo la presente invenzione, è compreso nell’intervallo di 50-500 µm, ed è di forte interesse per i processi di interazione con tessuti biologici durante la fase di guarigione.

I film così depositati possono inoltre essere ulteriormente reticolati mediante reticolazione di tipo chimico o fisico, al fine di modulare la cinetica di dissoluzione o realizzare idrogeli dall’alto potere assorbente.

Vantaggiosamente, secondo il processo oggetto della presente invenzione, in presenza di polielettrolita cationico, quale preferibilmente il chitosano l’elettrodo di lavoro funziona come catodo, in presenza di polielettrolita, quale preferibilmente alginato, l’elettrodo di lavoro funziona come anodo. I film ottenuti/ottenibili secondo il processo oggetto della presente invenzione sono caratterizzati da pori o porosità passante (canali passanti) orientati secondo la direzione perpendicolare al piano del film e con geometria regolare e ordinata nel piano stesso (Micro-pattern), detti pori o porosità passante controllata e controllabile nella forma, nella distribuzione e nelle dimensioni micrometriche dei canali e della loro spaziatura. Il materiale costituente i film ottenuti/ottenibili secondo il processo oggetto della presente invenzione essendo inoltre caratterizzato da una porosità casuale, pori non passanti (porosità secondaria), di dimensioni inferiori ai canali o pori passanti e inferiori al 50% dello spessore del film , detta porosità secondaria conseguenza del processo di deposizione del film secondo la presente invenzione. Costituisce per tanto ulteriore oggetto della presente invenzione un Film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzato da micropattern a porosità passante controllata a base di macromolecole polielettrolite di origine naturale o sintetica pH-dipendenti, preferibilmente dette macromolecole scelte tra polisaccaridi e/o proteine di origine naturale, ancora più preferibilmente scelte tra chitosano e/o alginato e/o collagene considerati singolarmente o in combinazione tra loro, in cui detti pori o porosità passante (canali passanti) sono orientati secondo la direzione perpendicolare al piano del film e con geometria regolare e ordinata nel piano stesso (Micro-pattern), detti pori o porosità passante (porosità primaria) controllata e controllabile nella forma, nella distribuzione e nelle dimensioni micrometriche dei canali e della loro spaziatura, essendo il materiale costituente il film caratterizzato da una porosità casuale, pori non passanti (porosità secondaria), di dimensioni inferiori ai canali o pori passanti, in cui il rapporto tra il numero di pori passanti (porosità primaria) e pori non passanti (porosità secondaria) porti preferibilmente a una densità relativa compresa tra 0,3 e 1 rispetto al materiale costituente il film, in particolare quando detto materiale comprende o è costituito da chitosano.

Vantaggiosamente secondo il processo oggetto della presente invenzione tra la fase a) di deposizione e la fase b) di rimozione è prevista, opzionalmente, una fase di neutralizzazione per lavaggi successivi dell’elettrodo di lavoro, su cui è depositato il film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzato da micro-pattern a porosità passante controllata, per immersione in bagni tipicamente a pH neutro, eventualmente preceduto da lavaggio a pH basico se la deposizione è avvenuta in ambiente acido e viceversa, seguita dall’eventuale eliminazione del solvente dei lavaggi.

Secondo il processo oggetto della presente invenzione, nel caso in cui la macromolecola polielettrolita sia il chitosano, questi è insolubile in acqua ed in solventi organici, tuttavia il chitosano protonato, può essere sciolto in acqua a bassi pH. La protonazione dei gruppi amminici del chitosano può avvenire in soluzioni acide:

Chit-NH2+ H3O+ Chit-NH+

3+ H2O (Eq.1) A bassi pH il chitosano diventa un polielettrolita cationico. La sua solubilità pH-dipendente consente di lavorare in soluzioni acquose mentre un modesto incremento del pH verso la neutralità consente di ottenere diverse forme (ad esempio membrane o film) tramite processi come la deposizione elettroforetica: sotto l’azione di un campo elettrico, le macromolecole cariche di chitosano si muovono verso il catodo.

Le reazioni catodiche di seguito avvengono a pH alcalini sulla superficie dell’elettrodo:

2H2O 2e- H2+ 2OH-O2+ 2H2O 4e- 4OH-NO-3+ 7H2O 8e- NH+

4+ 10OH-

In queste condizioni il chitosano protonato perde la sua carica in prossimità del catodo:

Chit-NH+

3+ OH- Chit-NH2+ H2O

La variazione di pH è causata dalla elettrolisi dell’acqua: le reazioni catodiche in soluzioni acquose provocano una produzione netta di ioni OH- e quindi un gradiente di pH. Se l’elettrolisi avviene in presenza di chitosano, le catene polimeriche lontane dall’elettrodo sperimentano un pH basso (minore di 6) e quindi sono protonate e solubili, mentre le catene che si trovano più vicino al catodo sperimentano un pH più alto e quindi sono meno protonate e meno solubili; le catene in prossimità dell’elettrodo sono deprotonate e quindi insolubili poiché il pH è maggiore di 7. Queste catene si depositano sotto forma di un film di idrogelo. Questo è stabile in assenza di un potenziale applicato e a pH maggiori di 6.5.

Lo spessore, la risoluzione spaziale e la morfologia del chitosano elettrodepositato sono controllabili tramite le condizioni di deposizione quali la concentrazione di chitosano nella soluzione elettrolitica, il voltaggio applicato agli elettrodi e il tempo. Al variare della densità di corrente si possono ottenere sottili film o idrogeli di chitosano e si può controllare la porosità del deposito.

La conoscenza dell’elettromobilità delle molecole di chitosano è necessaria per controllare la velocità di deposizione e per avere flessibilità nella manipolazione microstrutturale dei rivestimenti di chitosano. L’elettromigrazione delle D-glucosamine e degli oligomeri di chitosano dipende dal pH che influenza il peso del deposito per area e la velocità di deposizione. Anche la conducibilità della soluzione elettrolitica dipende dal pH in quanto da esso dipende il grado di dissociazione del chitosano che è solubile o insolubile in base alle cariche esposte dai gruppi amminici che si presentano protonati o deprotonati se il pH è più basso o più alto del loro pKa. Non solo lo spessore o il peso del deposito sono influenzati dal pH, ma anche la sua porosità. Infatti all’aumentare della velocità di deposizione, la reazione di evoluzione di idrogeno al catodo procede più velocemente causando la formazione di pori nel deposito di chitosano.

L’elettrodeposizione di chitosano costituisce un metodo semplice, veloce, che richiede apparati semplici e brevi tempi di processo per assemblare componenti per biosensori e per la trasduzione di segnali, per la biofunzionalizzazione di superfici e per creare vescicole e coating compositi per l’ingegneria tessutale anche di superfici complesse. Allo scopo di meglio comprendere la presente invenzione e per mettere in pratica la stessa vengono di seguito riportati alcuni esempi illustrativi da non ritenersi comunque in alcun modo restrittivi della portata dell’invenzione stessa.

ESEMPI

Esempio di confronto.

Film omogeneo di chitosano depositato su catodo in substrato continuo in titanio.

Si è proceduto al deposito elettrochimico di chitosano su catodo utilizzando un substrato continuo in titanio operando con tempi di deposizione pari a 4 minuti, densità di corrente pari a 20 mA/cm2 , concentrazione di chitosano pari a 1g/l e pH della soluzione elettrolitica acquosa contenente il chitosano pari a 3.5. Il deposito ottenuto in queste condizioni su dischetti di titanio continui è illustrato in Figura 1, nella quale è possibile osservare come in condizioni controllate si possa ottenere un deposito poroso. La disposizione dei pori sul substrato, sebbene uniforme, è casuale e non ordinata

Tutte le immagini acquisite e qui riportate sia in microscopia elettronica a scansione che in microscopia ottica sono state ottenute rispettivamente tramite microscopio elettronico a scansione Cambridge StereoScan 360, ingradimenti 200x-5000x, microscopio ottico LEICA DM LM Ingrandimenti 50x-500x e stereo microscopio WILD M8 ingrandimenti 5x-50x.

Esempi secondo l’invenzione.

Micro-pattern self standing a porosità controllata depositato su catodo in forma di griglie metalliche in acciaio a differenti lumi di maglia.

La preparazione di questa serie di campioni di micropattern self standing a porosità controllata è stata effettuata su catodi in forma di griglie metalliche in acciaio a differenti lumi di maglia, lumi rispettivamente di 140 µm, 280 µm, 430 µm ,560 µm e 700 µm. Sono stati variati per ogni tipo di griglia sia la densità di corrente applicata che il relativo tempo di applicazione, mentre sono rimasti identici per tutte le prove le condizioni di concentrazione del chitosano: 1g/l e di pH:3,5 della soluzione elettrolita a base acquosa contenete il chitosano e nella quale gli elettrodi di lavoro sono stati immersi.

Un esempio dei micro-pattern self standing a porosità controllata ottenuti utilizzando griglie metalliche è illustrato in Figura 2 (microscopia ottica) e Figura 3 (microscopia elettronica a scansione). Dalle figure 2 e 3 si osserva che il deposito di chitosano è poroso. I canali passanti sono organizzati in maniera ordinata replicando la griglia metallica sottostante. Dalle immagini di microscopia elettronica si osserva la presenza di una porosità secondaria caratterizzata da pori di dimensioni inferiori interposti tra i pori di dimensioni maggiori con disposizione ordinata. Per quanto riguarda la deposizione sulle griglie metalliche, sono stati mantenuti invariati i parametri riguardanti la soluzione elettrolitica (pH e concentrazione di chitosano) mentre sono stati fatti variare i parametri di densità di corrente e tempo di deposizione. È stato studiato l’effetto di questi due parametri sulla massa depositata e sulla morfologia e porosità dei depositi ottenuti al variare della dimensione del lume del substrato.

I depositi ottenuti sulle griglie sono stati osservati al microscopio ottico per verificare la morfologia degli stessi al fine di comprendere come i parametri di deposizione influiscano su questa.

I risultati possono essere semplicemente schematizzati in matrici di immagini. In ascissa viene riportato il tempo impiegato per la deposizione (in minuti) mentre in ordinata si riporta la variazione della densità di corrente (mA/cm2).

Dalla Figura 4 si osserva una buona distribuzione del deposito sulla superficie del catodo: al crescere del tempo di deposizione aumenta la quantità di chitosano depositata. Inoltre, tale comportamento può essere evidenziato anche all’aumentare della densità della corrente.

Nelle figure da 4 a 9 sono riportate le matrici di immagini ottenute allo stereo microscopio per osservare nel dettaglio la morfologia dei depositi sulle griglie al variare delle dimensioni del lume. Dalla Figura 5 si osserva che il chitosano depositato aumenta in funzione del tempo di deposizione e della densità di corrente. I pori sono presenti su tutti i substrati tranne che per deposizioni di due minuti a 4.5 e 8 mA/cm2.

In Figura 6 è riportata la matrice di immagini che descrive le deposizioni ottenute su griglie metalliche con lume di dimensioni pari a 560 μm. Dalla Figura 6 si osserva che il chitosano depositato aumenta al crescere della densità di corrente fino a 9.5 mA/cm<2>. A 12.5 mA/cm<2>la quantità di chitosano depositata sembra diminuire. Si nota su tutti i substrati sia la presenza di pori passanti che di pori chiusi.

In Figura 7 è riportata la matrice di immagini che descrive i depositi ottenuti su griglie metalliche con dimensione del lume pari a 430 μm. In Figura 7 si osserva che è possibile riscontrare la presenza di pori passanti solo per densità di corrente pari a 8 e 9.5 mA/cm2 e tempi di deposizione inferiori di 16 minuti. Negli altri casi il deposito di chitosano appare come un film continuo.

In Figura 8 si riporta la matrice di immagini che descrive i depositi di chitosano ottenuti su griglie metalliche con dimensione del lume pari a 280 μm. Dalla Figura 8 si osserva che è possibile riscontrare la presenza di pori passanti solo per deposizioni di 8 minuti e densità di corrente pari a 8 o 9.5 mA/cm2. Per tempi di deposizione maggiori si osserva un film continuo di chitosano. Per tempi di deposizione inferiori il deposito, se presente, non presenta pori passanti.

In Figura 9 è riportata la matrice di immagini di depositi di chitosano su griglie metalliche con lume di dimensioni pari a 140 μm. Dalla Figura 9 si osserva che per tempi di deposizione pari a 2 minuti e densità di corrente pari a 4.5 mA/cm<2>non si ha deposito di chitosano. Negli altri casi il coating appare come un film continuo e non come una superficie dotata di pori passanti.

Dalle figure 4, 5, 6, 7, 8 e 9 è possibile osservare che:

1. al decrescere della dimensione del lume, decrescono anche le dimensioni dei pori ed in particolare, mentre questi sono facilmente osservabili per i substrati con lume fino a 560 μm, dimensioni inferiori richiedono una più attenta ottimizzazione del processo

2. in tutti i casi si osserva che per tempi di deposizione maggiori i film risultano continui mentre per tempi di deposizione minore il chitosano depositato sembrerebbe solo ricoprire la griglia metallica e non formare dei veri e propri pori passanti

3. in tutti i casi è possibile osservare una gerarchia di porosità: quella primaria data dai pori passanti ed una porosità secondaria con dimensione dei pori che sembra essere minore e meno uniforme di quella dei pori passanti probabilmente ascrivibile allo sviluppo catodico di idrogeno durante la deposizione del chitosano.

4. per basse densità di corrente o bassi tempi di deposizione, il chitosano sembra rivestire la griglia e i pori non hanno forma circolare.

5. all’aumentare della quantità di chitosano depositato i pori tendono dapprima ad assumere aspetto cilindrico per mantenere poi diametro costante.

Per l’analisi statistica della dimensione dei pori, sono stati osservati i campioni sottoposti a trattamento elettroforetico al microscopio ottico in fluorescenza. Sono state acquisite 5 immagini per ogni campione e per ogni immagine sono state effettuate 3 misure. I grafici correlano la dimensione media dei pori di ciascun deposito con l’intensità di corrente al variare della dimensione del lume del substrato.

Dal grafico in Figura 10 si osserva come la misura media dei pori sia influenzata dalla dimensione del lume del substrato. Inoltre, a seconda della dimensione della griglia, sembra esserci un diverso comportamento al variare della densità di corrente. In particolare per maglie più piccole la dimensione dei pori decresce all’aumentare della densità apparente di corrente. Per maglie di 430 e 560 μm, dopo un’iniziale diminuzione della dimensione dei pori si ha un aumento, mentre per 700 μm non sembra esserci influenza della densità di corrente. In tutti i casi è possibile comunque osservare una diminuzione della dimensione dei canali rispetto alla dimensione del lume della griglia (valore 0). Non è stato possibile effettuare la misura su griglie con dimensione del lume pari a 140 μm con intensità di corrente pari a 4.5 mA/cm2 perché il chitosano non si è depositato sul substrato. Viene quindi riportato nel grafico il valore iniziale del lume della griglia.

Al fine di indagare la dimensione dei pori al variare del tempo di deposizione, è stata condotta un’analisi su griglie di lume pari a 430 μm a titolo esemplificativo. I risultati sono riportati nel grafico in Figura 11. Dalla Figura 11 si osserva che per ogni intensità di corrente, la dimensione dei pori diminuisce all’aumentare del tempo. La dimensione dei pori non sembra essere influenzata dalla densità di corrente mentre diminuisce all’aumentare del tempo di deposizione.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Processo di preparazione di film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzati da micro-pattern a porosità passante controllata a base di macromolecole polielettrolite di origine naturale o sintetica pH-dipendenti, processo comprendente: a) la deposizione catodica e/o anodica per via elettrochimica/elettroforetica di dette macromolecole di origine naturale o sintetica, su un elettrodo di lavoro in forma di “templante conduttivo micropatternato”, avente opportune dimensioni del lume delle maglie, elettrodo di lavoro immerso in soluzione elettrolita comprendente dette macromolecole; b) rimozione per asportazione meccanica dall’elettrodo di lavoro del film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzato da micro-pattern a porosità passante controllata ottenuto nella fase a).
2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui le macromolecole polielettrolite sono scelte tra polisaccaridi e/o proteine di origine naturale.
3. 3. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui le macromolecole polielettrolite sono scelte tra chitosano e/o alginato e/o collagene considerati singolarmente o in combinazione tra loro.
4. 4. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui l’elettrodo di lavoro è in materiale conduttivo quale grafite o metallo, in particolare titanio o acciaio.
5. 5. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui l’elettrodo di lavoro è in forma di griglia.
6. 6.Processo secondo la rivendicazione 1 in cui la soluzione elettrolita è una soluzione acquosa.
7. 7. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui la densità di corrente è compresa nell’intervallo 0.1 -100 mA/cm2.
8. 8. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui la concentrazione delle macromolecole è compresa da 0.01 a 10 g/L.
9. 9. Film self standing a spessore variabile e controllato caratterizzato da micro-pattern a porosità passante controllata a base di macromolecole polielettrolite di origine naturale o sintetica pH-dipendenti, in cui detti pori o porosità passante (canali passanti) sono orientati secondo la direzione perpendicolare al piano del film e con geometria regolare e ordinata nel piano stesso (Micro-pattern), detti pori o porosità passante (porosità primaria) controllata e controllabile nella forma, nella distribuzione e nelle dimensioni micrometriche dei canali e della loro spaziatura, essendo il materiale costituente il film caratterizzato da una porosità casuale, pori non passanti (porosità secondaria), di dimensioni inferiori ai canali o pori passanti, in cui il rapporto tra il numero di pori passanti (porosità primaria) e pori non passanti (porosità secondaria) porti preferibilmente a una densità relativa compresa tra 0,3 e 1 rispetto al materiale costituente il film.
10. 10. Film secondo la rivendicazione 9 in cui le macromolecole polielettrolite sono scelte tra polisaccaridi e/o proteine di origine naturale.
11. 11. Film secondo la rivendicazione 9 in cui le macromolecole polielettrolite sono scelte tra chitosano e/o alginato e/o collagene considerati singolarmente o in combinazione tra loro.