WO2022050393A1 - 三次元組織体の製造方法及び三次元組織体 - Google Patents

三次元組織体の製造方法及び三次元組織体 Download PDF

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WO2022050393A1
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extracellular matrix
cells
matrix component
mixture
fragmented
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朋子 國富
史朗 北野
圭 塚本
典弥 松▲崎▼
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凸版印刷株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a three-dimensional structure and a three-dimensional structure.
  • Patent Document 1 describes step A in which cells are mixed with a cationic substance and an extracellular matrix component to obtain a mixture, and the cells are collected from the obtained mixture to form a cell aggregate on a substrate.
  • a method for producing a three-dimensional tissue is disclosed, which comprises a step B and a step C for culturing the cells to obtain a three-dimensional tissue.
  • the thickness of the three-dimensional tissue may decrease when the culture period was lengthened.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a three-dimensional structure in which a decrease in thickness is suppressed.
  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional tissue, comprising a step of mixing a cationic substance and a fragmented extracellular matrix component into a cell to obtain a mixture, and a step of culturing the cell after the step of obtaining the mixture. ..
  • the production method according to the present invention comprises a step of mixing a cationic substance and a fragmented extracellular matrix component with the cell to obtain a mixture, and a step of culturing the cell after the step of obtaining the mixture, so that the thickness is reduced. It is possible to obtain a three-dimensional structure in which is suppressed.
  • the cells may contain at least stromal cells and endothelial cells. As a result, the above-mentioned effects are more prominently exhibited.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain fragmented collagen.
  • the fragmented collagen may be defibrated collagen.
  • fragmented extracellular matrix component contains fragmented collagen (eg, defibrated collagen)
  • the above-mentioned effects are more pronounced.
  • a polymer electrolyte when a mixture is obtained, a polymer electrolyte may be further mixed with the cells in addition to the cationic substance and the fragmented extracellular matrix, and the mixture may contain the polymer electrolyte. In this case, the above-mentioned effect is more prominently exhibited.
  • the polyelectrolyte contains at least one selected from the group consisting of glycosaminoglycan, dextran sulfate, ramnan sulfate, fucoidan, caraginan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropane sulfonic acid, and polyacrylic acid. You can go out. As a result, the above-mentioned effect is more prominently exhibited.
  • the concentration of the polyelectrolyte in the mixture may be more than 0 mg / mL and 1.5 mg / mL or less.
  • the extracellular matrix component when obtaining a mixture, may be further mixed with the cells at the same time as or separately from the cationic substance and / or the fragmented extracellular matrix.
  • the extracellular matrix component may contain at least one selected from the group consisting of collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin and proteoglycan.
  • the ratio of the mass of the extracellular matrix component to the mass of the fragmented extracellular matrix component may be 2: 1 to 1:50.
  • the total content of the extracellular matrix component and the fragmented extracellular matrix component in the mixture may be 0.005 mg / mL or more and 1.5 mg / mL or less.
  • the present invention also relates to a three-dimensional tissue comprising cells, fragmented extracellular matrix components, and polyelectrolytes.
  • the polyelectrolyte contains at least one selected from the group consisting of glycosaminoglycan, dextran sulfate, ramnan sulfate, fucoidan, caraginan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropane sulfonic acid, and polyacrylic acid. You can go out.
  • the thickness retention rate represented by the following formula may be 80% or more.
  • Thickness retention rate X 1 / X 0 x 100 [In the formula, X 1 indicates the thickness at the time when the three-dimensional tissue is cultured for 4 days, and X 0 indicates the thickness at the time when the three-dimensional tissue is cultured. ]
  • the cells are mixed with a cationic substance and a fragmented extracellular matrix component to obtain a mixture (mixing step), and the cells are cultured after the step of obtaining the mixture. It comprises a step (cultivation step).
  • a three-dimensional tissue is a collection of cells in which cells are three-dimensionally arranged via an extracellular matrix component and / or a fragmented extracellular matrix component. It is a collection of cells artificially created by cell culture.
  • the shape of the three-dimensional structure is not particularly limited, and examples thereof include a sheet shape, a spherical shape, an ellipsoidal shape, and a rectangular parallelepiped shape.
  • the method for producing a three-dimensional structure according to the present embodiment it is possible to manufacture a three-dimensional structure in which the decrease in thickness is suppressed as compared with the conventional method.
  • the mechanism by which such an effect is obtained is not particularly limited, but for example, the fragmented extracellular matrix component is an aggregate of extracellular matrix molecules of a smaller size, so that it easily enters the intercellular gaps and adheres between cells. It is thought that it is easier to strengthen.
  • the cells are mixed with a cationic substance and fragmented extracellular matrix components to obtain a mixture.
  • each of the above components can be mixed with the cells simultaneously or separately.
  • at least a part of the cationic substance and the fragmented extracellular matrix component is mixed so as to be contained in the mixture.
  • other components can be further mixed with the cell so that at least a part thereof is contained in the mixture.
  • the cell When obtaining the mixture, the cell may be further mixed with a polyelectrolyte in addition to the cationic substance and the fragmented extracellular matrix, and the mixture may contain the polyelectrolyte.
  • the extracellular matrix component may be further mixed with the cells simultaneously or separately with the cationic substance and / or the fragmented extracellular matrix.
  • the order in which the above components used in the mixing step are mixed may be arbitrary. Any method can be adopted as the method for mixing the above components with the cells.
  • the method of mixing the above-mentioned components with the cells may be, for example, a method of mixing by adding the cells to a liquid containing the above-mentioned components.
  • the container may be a container having a material and shape usually used for culturing cells and microorganisms.
  • the material of the container include, but are not limited to, glass, stainless steel, plastic and the like.
  • Examples of the container include, but are not limited to, dishes, tubes, flasks, bottles, plates and the like.
  • a container provided with a base material (permeable membrane) capable of allowing the liquid to pass through without allowing the cells in the liquid to pass through can also be used.
  • Examples of the container provided with the permeable membrane include cell culture inserts such as Transwell (registered trademark) insert, Netwell (registered trademark) insert, Falcon (registered trademark) cell culture insert, and Millicell (registered trademark) cell culture insert. , Not limited to these.
  • Each component used in the mixing step may be mixed in a state of being dissolved or dispersed in an aqueous medium.
  • aqueous medium include water, physiological saline such as phosphate buffered saline (PBS), and liquid medium such as Dulvecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).
  • PBS physiological saline
  • DMEM Dulvecco's Modified Eagle's Medium
  • the cells are not particularly limited, but may be cells derived from animals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, and rats.
  • the site of origin of the cell is not particularly limited, and may be a somatic cell derived from bone, muscle, internal organs, nerve, brain, bone, skin, blood, etc., or a germ cell.
  • the cells may be induced pluripotent stem cell cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), or cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells. May be good.
  • the cells include, for example, nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells (eg, human umbilical cord vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC)), lymphatic endothelial cells, fibroblasts, and colon cancer.
  • vascular endothelial cells eg, human umbilical cord vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC)
  • LUVEC human umbilical cord vein-derived vascular endothelial cells
  • Cells eg, human colon cancer cells (HT29)
  • cancer cells such as liver cancer cells, epithelial cells (eg, human gingival epithelial cells), keratinized cells, myocardial cells (eg, human iPS cell-derived myocardial cells (iPS-) CM)), hepatocytes, pancreatic islet cells, tissue stem cells, smooth muscle cells (eg, aorta-SMC) and the like, but are not limited thereto.
  • the cells may be used alone. , Multiple types of cells may be used in combination.
  • the cells may contain stromal cells.
  • Stromal cells are cells that make up the supporting tissue of epithelial cells. Interstitial cells include fibroblasts, immune cells, pericutaneous cells, nerve cells, obesity cells, epithelial cells, myocardial cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, tissue stem cells, smooth muscle cells and the like. When the cells contain stromal cells, it becomes easier to obtain a three-dimensional tissue in which the decrease in thickness is suppressed.
  • the cells preferably contain endothelial cells.
  • Endothelial cells are cells that make up the endothelium.
  • the endothelial cells include the above-mentioned vascular endothelial cells (for example, human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC)), lymphatic endothelial cells, sinusoide endothelial cells and the like.
  • vascular endothelial cells for example, human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC)
  • lymphatic endothelial cells sinusoide endothelial cells and the like.
  • the cells may contain at least stromal cells and endothelial cells from the viewpoint that it becomes easier to obtain a three-dimensional tissue in which the decrease in thickness is suppressed.
  • the ratio of the number of stromal cells to the number of endothelial cells may be, for example, 1: 1.5 to 300: 1.
  • the mixture contains at least cells.
  • the cell density in the mixture can be appropriately determined according to the shape, thickness and the like of the target three-dimensional tissue.
  • the cell density in the mixture may be 10 3 to 10 7 cells / ml or 10 4 to 10 6 cells / ml.
  • a cationic substance is a substance having a cationic group.
  • a cationic group refers to a cationic group (a group having a positive charge) or a group that can be induced by a cationic group.
  • Examples of the cationic group include an amino group (-NH 2 ), a substituted amino group (mono-substituted amino group, di-substituted amino group, etc.), a quaternary ammonium group (quaternary ammonium cationic group), and the like.
  • cationic substance examples include trishydroxymethylaminomethane, (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, polyvinylamine, polyallylamine, polylysine, polyhistidine). , Polyarginine, but not limited to these.
  • the cationic substance in the mixing step, for example, by mixing the cationic substance itself or a buffer solution containing the cationic substance (cationic buffer solution), the cationic substance can be mixed with the above-mentioned components used in the mixing step.
  • the buffer solution containing a cationic substance include Tris-hydrochloric acid buffer solution, Tris-maleic acid buffer solution, Bis-Tris-buffer solution, and HEPES buffer solution.
  • the concentration of the cationic substance in the cationic buffer may be, for example, 10 to 100 mM, 20 to 90 mM, 30 to 80 mM, 40 to 70 mM or 45 to 60 mM, and may be 50 mM.
  • the pH of the cationic buffer solution can be set to various pH from the viewpoint of cell growth and formation of cell aggregates.
  • the pH of the cationic buffer may be 6.0-8.0 or 7.2-7.6.
  • the pH of the cationic buffer is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 or It may be 8.0.
  • the pH of the cationic buffer is preferably 7.4.
  • the extracellular matrix component is an aggregate of extracellular matrix molecules formed by a plurality of extracellular matrix molecules.
  • the extracellular matrix molecule may be a molecule that can fill the gap between cells and may be a substance existing outside the cell in a multicellular organism.
  • any substance can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the extracellular matrix molecule is preferably biocompatible. "Biocompatibility" means that when it comes into contact with a living tissue, it does not cause excessive inflammation or the like.
  • extracellular matrix molecule examples include, but are not limited to, collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin, proteoglycan and the like.
  • extracellular matrix component these extracellular matrix molecules may be used alone or in combination of two or more.
  • the extracellular matrix component may contain, for example, collagen, or may be composed of collagen.
  • collagen functions as a scaffold for cell adhesion when used as a scaffold material for cell culture, and the formation of a three-dimensional cell structure is further promoted.
  • the extracellular matrix molecule may be a variant or variant of the extracellular matrix molecule described above, or may be a polypeptide such as a chemically synthesized peptide.
  • the extracellular matrix molecule may have a repeating sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen.
  • Gly represents a glycine residue
  • X and Y each independently represent an arbitrary amino acid residue.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different from each other.
  • the proportion of the sequence represented by Gly-XY may be 80% or more of the total amino acid sequence, preferably 95%. That is all.
  • the extracellular matrix molecule may be a polypeptide having an RGD sequence.
  • the RGD sequence refers to a sequence represented by Arg-Gly-Asp (arginine residue-glycine residue-aspartic acid residue). Having an RGD sequence further promotes cell adhesion, which makes it even more suitable as a scaffold material for cell culture, for example.
  • Examples of the extracellular matrix molecule containing the sequence represented by Gly-XY and the RGD sequence include collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin and the like.
  • collagen examples include fibrous collagen and non-fibrotic collagen.
  • the fibrous collagen means collagen which is a main component of collagen fibers, and specific examples thereof include type I collagen, type II collagen, and type III collagen.
  • Examples of non-fibrotic collagen include type IV collagen.
  • proteoglycan examples include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, keratan sulfate proteoglycan, and dermatan sulfate proteoglycan.
  • the extracellular matrix component may contain at least one selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin, and preferably contains collagen, because the effect of the present invention becomes more remarkable.
  • Collagen is preferably fibrous collagen, more preferably type I collagen.
  • fibrous collagen commercially available collagen may be used, and specific examples thereof include pig skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • the extracellular matrix component may be an animal-derived extracellular matrix component.
  • animal species from which extracellular matrix components are derived include, but are not limited to, humans, pigs, and cattle.
  • As the extracellular matrix component a component derived from one kind of animal may be used, or a component derived from a plurality of kinds of animals may be used in combination.
  • the fragmented extracellular matrix component can be obtained by fragmenting the above-mentioned extracellular matrix component.
  • Fragmentation means making the aggregate of extracellular matrix molecules smaller in size. Fragmentation may be carried out under conditions that break the bonds within the extracellular matrix molecule, or may be carried out under conditions that do not break the bonds within the extracellular matrix molecule.
  • the fragmented extracellular matrix component contains a defibrated extracellular matrix component (deflated extracellular matrix component), which is a component obtained by defibrating the above-mentioned extracellular matrix component by applying a physical force. You can stay. Defibrillation is an aspect of fragmentation, for example, under conditions that do not break the bonds within the extracellular matrix molecule.
  • the method for fragmenting the extracellular matrix component is not particularly limited.
  • the extracellular matrix component may be deflated by applying a physical force such as an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, and a high-pressure homogenizer.
  • a stirring homogenizer is used, the extracellular matrix component may be homogenized as it is, or it may be homogenized in an aqueous medium such as physiological saline. It is also possible to obtain millimeter-sized and nanometer-sized defibrated extracellular matrix components by adjusting the homogenization time, number of times, and the like.
  • the defibrated extracellular matrix component can also be obtained by defibrating by repeating freezing and thawing.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain at least a part of the defibrated extracellular matrix component. Further, the fragmented extracellular matrix component may consist only of the defibrated extracellular matrix component. That is, the fragmented extracellular matrix component may be a defibrated extracellular matrix component.
  • the defibrated extracellular matrix component preferably contains a defibrated collagen component (defibrated collagen component).
  • the defibrated collagen component preferably maintains a triple helix structure derived from collagen.
  • the defibrated collagen component may be a component that partially maintains the triple helix structure derived from collagen.
  • the shape of the fragmented extracellular matrix component examples include fibrous form.
  • the fibrous form means a shape composed of a filamentous collagen component or a shape composed of filamentous extracellular matrix components cross-linked between molecules. At least some of the fragmented extracellular matrix components may be fibrous.
  • the fibrous extracellular matrix component includes fine filaments (fibrils) formed by aggregating a plurality of filamentous extracellular matrix molecules, filaments formed by further aggregating fibrils, and these filaments. Includes deflated ones.
  • the fibrous extracellular matrix component preserves the RGD sequence without disruption.
  • the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 100 nm or more and 400 ⁇ m or less, and may be 100 nm or more and 200 ⁇ m or less. In one embodiment, the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 22 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, and 100 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less. good. In other embodiments, the average length of the fragmented extracellular matrix components may be 100 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, and 30 ⁇ m or less from the viewpoint of further excellent redispersibility.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average length within the above range, and more preferably a defibrated collagen component having an average length within the above range.
  • the average diameter of the fragmented extracellular matrix component may be 10 nm or more and 30 ⁇ m or less, 30 nm or more and 30 ⁇ m or less, 50 nm or more and 30 ⁇ m or less, 100 nm or more and 30 ⁇ m or less, and 1 ⁇ m or more and 30 ⁇ m. It may be 2 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 4 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, and 5 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average diameter within the above range, and more preferably a defibrated collagen component having an average diameter within the above range.
  • the average length and average diameter of the fragmented extracellular matrix components can be determined by measuring each fragmented extracellular matrix component with an optical microscope and performing image analysis.
  • mean length means the average value of the length of the measured sample in the longitudinal direction
  • average diameter means the average value of the length of the measured sample in the direction orthogonal to the longitudinal direction. means.
  • extracellular matrix component and the like may be crosslinked between molecules or within the molecule.
  • the extracellular matrix component or the like may be cross-linked within the molecules constituting the extracellular matrix component or the like, or may be cross-linked between the molecules constituting the extracellular matrix component or the like.
  • the mode of cross-linking of extracellular matrix components and the like may be due, at least in part, to forming hydrogen bonds between the carbonicyl group of the extracellular matrix molecule and the ions of the metal element.
  • Cross-linking of extracellular matrix components and the like may also include cross-linking by, for example, physical cross-linking by application of heat, ultraviolet rays, radiation or the like, cross-linking by a cross-linking agent, chemical cross-linking by an enzymatic reaction or the like.
  • the above-mentioned used in the mixing step is used by mixing the fragmented extracellular matrix component itself or a dispersion liquid consisting of the fragmented extracellular matrix component and an aqueous solvent in which the fragmented extracellular matrix component is dispersed.
  • Fragmented extracellular matrix components can be mixed with the components.
  • the aqueous medium used for the dispersion may be a medium described later.
  • the fragmented extracellular matrix component may be mixed into the cell separately from the cationic material.
  • the fragmented extracellular matrix component may be mixed with the cell after mixing the cationic substance with the cell.
  • the mixture contains at least fragmented extracellular matrix components.
  • the content of the fragmented extracellular matrix component in the mixture can be appropriately determined according to the shape, thickness and the like of the target three-dimensional tissue.
  • the content of the fragmented extracellular matrix component in the mixture is, for example, 0.005 mg / mL or more, 0.01 mg / mL or more, 0.025 mg / mL or more, 0.05 mg / mL or more, based on the total amount of the mixture.
  • 0.10 mg / mL or more 0.15 mg / mL or more, 0.20 mg / mL, 0.25 mg / mL, 0.30 mg / mL or more, 0.35 mg / mL or more, 0.40 mg / mL or more, or 0. It may be 45 mg / mL or more, 1.5 mg / mL or less, 1.25 mg / mL or less, 1.0 mg / mL or less, 0.8 mg / mL or less, or 0.6 mg / mL or less. Increasing the content of fragmented extracellular matrix components in the mixture tends to facilitate the formation of thicker three-dimensional tissues.
  • Reducing the content of fragmented extracellular matrix components in the mixture tends to more likely suppress the reduction in the thickness of the three-dimensional tissue.
  • the content of the fragmented extracellular matrix component in the mixture is within the above range, a three-dimensional tissue having an appropriate thickness and suppressed decrease in thickness is more likely to be formed.
  • the extracellular matrix component can be mixed with the above-mentioned components used in the mixing step.
  • the extracellular matrix component may be used by dissolving it in a suitable solvent.
  • the solvent include, but are not limited to, water, buffer, acetic acid and the like.
  • the extracellular matrix component is preferably dissolved in a buffer solution or acetic acid.
  • the extracellular matrix component may be mixed with the cell at the same time as the cationic substance, for example.
  • the mixture may contain extracellular matrix components.
  • the content of the extracellular matrix component in the mixture can be appropriately determined according to the shape, thickness and the like of the target three-dimensional tissue.
  • the content of extracellular matrix components in the mixture is, for example, 0.005 mg / mL or more, 0.01 mg / mL or more, 0.02 mg / mL or more, 0.03 mg / mL or more, or 0 based on the total amount of the mixture. It may be .04 mg / mL or more, 1.5 mg / mL or less, 1.0 mg / mL or less, 0.1 mg / mL or less, 0.08 mg / mL or less, or 0.06 mg / mL or less.
  • Increasing the content of extracellular matrix components in the mixture tends to facilitate the formation of thicker three-dimensional tissues. Reducing the content of extracellular matrix components in the mixture tends to more likely suppress the reduction in the thickness of the three-dimensional tissue. When the content of the extracellular matrix component in the mixture is within the above range, a three-dimensional tissue having an appropriate thickness and suppressed decrease in thickness is more likely to be formed.
  • the ratio of the mass of the extracellular matrix component to the mass of the fragmented extracellular matrix component is, for example, 2: 1 to 1:50, 1: 1. It may be ⁇ 1:50 or 1:10 ⁇ 1:50.
  • the total content of the extracellular matrix component and the fragmented extracellular matrix component in the mixture is 0.005 mg / mL or more and 1.5 mg / mL or less, 0.01 mg / mL or more 1 based on the total amount of the mixture. .3 mg / mL, or 0.05 mg / mL or more and 1.2 mg / mL or less.
  • Increasing the total content of extracellular matrix components and fragmented extracellular matrix components in the mixture tends to facilitate the formation of thicker three-dimensional tissues. Decreasing the total content of extracellular matrix components and fragmented extracellular matrix components in the mixture tends to more likely suppress the decrease in the thickness of the three-dimensional tissue.
  • the three-dimensional structure having an appropriate thickness and suppressed decrease in thickness is further formed. It becomes easy to be formed.
  • the polyelectrolyte is a polymer compound having a polymer chain and a dissociable functional group.
  • the dissociable functional group include a sulfate group (-SO 3H ) and a carboxy group (-COOH).
  • the polyelectrolyte is, for example, a polymer containing a polysaccharide having a dissociable functional group introduced therein or a monomer having a dissociable functional group (for example, acrylic acid or styrene sulfonic acid) as a monomer unit. good.
  • the polysaccharide into which a dissociable functional group has been introduced include sulfated polysaccharides.
  • the polymer containing a monomer having a dissociable functional group as a monomer unit may be a polymer containing only a monomer having a dissociable functional group as a monomer unit, and the dissociable functional group may be used.
  • the polymer may contain other monomers as a monomer unit.
  • polymer electrolyte examples include glycosaminoglycans such as heparin, chondroitin sulfate (for example, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatane sulfate, keratane sulfate, and hyaluronic acid; dextran sulfate, ramnan sulfate, fucoidan, and the like. Examples thereof include, but are not limited to, caraginan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropanesulfonic acid, and polyacrylic acid, or derivatives thereof.
  • the polymer electrolyte may be composed of one of the above-mentioned ones, or may contain two or more kinds in combination.
  • the polyelectrolyte is preferably glycosaminoglycan, more preferably containing at least one selected from the group consisting of heparin, dextran sulfate, chondroitin sulfate, and dermatan sulfate, and further preferably heparin.
  • heparin dextran sulfate
  • chondroitin sulfate chondroitin sulfate
  • dermatan sulfate preferably heparin.
  • the polyelectrolyte may be used by dissolving it in an appropriate solvent.
  • solvents include, but are not limited to, water and buffers.
  • the polyelectrolyte may be dissolved and used together with the above-mentioned cationic substance.
  • the polyelectrolyte may be mixed with the cell at the same time as, for example, the cationic substance and the extracellular matrix component.
  • the mixture may contain a polymer electrolyte.
  • concentration of the polyelectrolyte in the mixture is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • concentration of the polyelectrolyte in the mixture may be, for example, more than 0 mg / mL and 1.5 mg / mL or less.
  • concentration of the polymer electrolyte in the mixture may be 0.005 mg / mL or higher, 0.01 mg / mL or higher, 0.02 mg / mL or higher, 0.03 mg / mL or higher, or 0.04 mg / mL or higher.
  • the concentration of the polyelectrolyte in the mixture may be, for example, 0.025 mg / mL, 0.05 mg / mL, 0.075 mg / mL, or 0.1 mg / mL.
  • the ratio of the mass of the polymer electrolyte to the mass of the extracellular matrix component (mass of the polymer electrolyte: mass of the extracellular matrix component) in the mixture may be 1: 2 to 2: 1. It may be 5 to 1.5: 1 or 1: 1.
  • the mixing step may include removing the liquid portion after mixing at least one of the above components with the cells.
  • a means for removing the liquid portion a method known to those skilled in the art can be used.
  • the liquid portion may be removed by centrifugation, filtration, or the like.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited as long as the conditions for centrifugation do not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the liquid moiety can be removed by subjecting the cells and a microtube containing at least one of the above components to centrifugation at 400 xg for 1 minute at room temperature to separate the liquid moiety from the precipitate. After forming a precipitate by natural sedimentation, the liquid portion may be removed.
  • a liquid containing a cationic substance, a polymer electrolyte, an extracellular matrix component and an aqueous medium is mixed with cells to obtain a cell-containing composition, and at least a part of a liquid portion is removed from the mixed liquid. It can be carried out by a method including removal and mixing a liquid containing a fragmented extracellular matrix component and an aqueous medium with a cell-containing composition from which at least a part of the liquid portion has been removed.
  • the step of obtaining the mixture may include supplying (seeding) the mixture into the culture vessel.
  • Examples of the culture container include the above-mentioned containers.
  • a step of collecting components other than the liquid component from the mixture to form a cell aggregate may be included between the step of obtaining the mixture and the step of culturing the cells.
  • a specific means for collecting components other than the liquid component from the mixture to form a cell aggregate a method known to those skilled in the art can be used.
  • components other than the liquid portion may be collected by centrifugation, magnetic separation, or filtration.
  • the conditions for centrifugation may be conditions that do not adversely affect the growth of cells.
  • cells can be collected by seeding the mixture in a cell culture insert and subjecting it to centrifugation at 10 ° C., 400 xg for 1 minute.
  • cells may be collected by spontaneous sedimentation.
  • the time for spontaneous sedimentation may be, for example, 1 hour to 24 hours, and may be 24 hours from the viewpoint of easiness of forming cell aggregates.
  • the cells are cultured under the condition that at least a part of the cells maintain a viable state to form a three-dimensional tissue.
  • Cell culture is usually carried out on a substrate.
  • the base material may be, for example, the above-mentioned permeable membrane.
  • a container provided with the above-mentioned permeable membrane can be used.
  • the cell culturing conditions may be any conditions as long as the cells proliferate, and the culturing conditions in the culturing step can be set to suitable culturing conditions according to the cell type.
  • the culture temperature may be 20 ° C to 40 ° C or 30 ° C to 37 ° C.
  • the pH of the medium may be 6-8 or 7.2-7.4.
  • the culture time may be 1 to 14 days, 7 to 14 days, 14 to 30 days, 30 to 60 days, 60 days. It may be up to 90 days.
  • the liquid medium is not particularly limited, and a suitable medium can be selected according to the type of cells to be cultured.
  • the medium include Eagle's MEM medium, DMEM, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the medium may be a medium to which serum is added or a serum-free medium. Further, the liquid medium may be a mixed medium in which two or more types of media are mixed.
  • the three-dimensional tissue according to the present embodiment contains at least cells, fragmented extracellular matrix components, and polyelectrolytes.
  • the three-dimensional tissue may further contain extracellular matrix components. At least a portion of the cell may be in contact with the extracellular matrix component and / or the fragmented extracellular matrix component. As one aspect of contact, it may be adhered.
  • the three-dimensional structure according to the present embodiment can be obtained, for example, by the above-mentioned method for manufacturing a three-dimensional structure.
  • cells are mixed with fragmented extracellular matrix components and polyelectrolytes simultaneously or separately to obtain a mixture, and the mixture is centrifuged to obtain a mixture, and then the above-mentioned It can be obtained by a method including culturing cells in this order.
  • the three-dimensional structure according to the present embodiment may have a thickness maintenance rate of 80% or more represented by the following formula.
  • Thickness maintenance rate (%) X 1 / X 0 ⁇ 100
  • X 1 indicates the thickness at the time when the three-dimensional tissue is cultured for 4 days (72 hours after the start of the culture of the three-dimensional tissue)
  • X 0 is the thickness at the time of the start of the culture of the three-dimensional tissue. Indicates the thickness.
  • the thickness of the three-dimensional structure means the distance between both ends in the direction perpendicular to the main surface when the three-dimensional structure is in the shape of a sheet or a rectangular parallelepiped.
  • the thickness means the distance at the thinnest part of the main surface.
  • the three-dimensional structure is spherical, it means the diameter thereof.
  • the three-dimensional structure is ellipsoidal, it means its minor axis.
  • the thickness is the distance between the two points where the straight line passing through the center of gravity of the three-dimensional structure and the surface intersect. Means the shortest distance.
  • the thickness of the three-dimensional structure can be measured by using a section obtained by cutting the three-dimensional structure along the thickness direction (direction perpendicular to the main surface).
  • the distance between the ends in the direction perpendicular to the main plane of the three-dimensional structure may be measured in a section image passing through the center of the three-dimensional structure.
  • the thickness of the three-dimensional tissue is measured, for example, using an inverted microscope.
  • the thickness X0 at the start of culturing the three-dimensional tissue forms a cell aggregate by collecting a mixture obtained by mixing a fragmented extracellular matrix component and a polyelectrolyte simultaneously or separately in a cell. It is the thickness of the three-dimensional structure at the time point 24 hours after that.
  • cell culture may be carried out in the medium under the condition of 37 ° C. Cell culture may be performed in a CO 2 incubator (5% CO 2 ). As the medium, a medium in which the cells can easily survive can be selected according to the type of cells.
  • the thickness X0 at the start of culturing the three-dimensional tissue may be 80 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, or 110 ⁇ m or more, and may be 200 ⁇ m or less, 150 ⁇ m or less, or 120 ⁇ m or less.
  • the thickness X1 at the time of culturing the three -dimensional tissue for 4 days gathers the mixture obtained by mixing the fragmented extracellular matrix component and the polyelectrolyte simultaneously or separately in the cells to form a cell aggregate. It is the thickness of the three-dimensional tissue at the time point 96 hours after the formation (72 hours after the start of culturing the three-dimensional structure).
  • the cells may be cultured under the same conditions as those for 24 hours after forming the cell aggregate.
  • cell culture may be performed in a medium at 37 ° C. for 96 hours after forming the cell aggregate.
  • Cell culture may be performed in a CO 2 incubator (5% CO 2 ).
  • As the medium a medium in which the cells can easily survive can be selected according to the type of cells.
  • the thickness X 1 at the time of culturing the three-dimensional tissue for 4 days may be 60 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, or 80 ⁇ m or more, and may be 180 ⁇ m or less, 130 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or less.
  • the thickness retention rate may be, for example, 75% or more, 80% or more, or 82% or more, and may be 100% or less, 90% or less, or 85% or less.
  • the three-dimensional tissue according to the present embodiment has a structure closer to that of a living tissue, and can be suitably used as a substitute for an experimental animal and as a transplant material.
  • NHDF human neonatal skin fibroblasts, manufacturer: Lonza, model number: CC-2509
  • RFP-HUVECs RFP-expressing human umbilical vein endothelial cells, manufacturer: ANGIO-PROTEOMIE, model number cAP-0001RFP
  • NHDF cultures contain 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS, Gibco, 10437028) and 1% (v / v%) penicillin streptomycin (P / S) (Wako, 168-23191). -The procedure was carried out using MEM (Wako, 043-30085). Culturing of RFP-HUVECs was performed using EGM-2MV basal medium (Lonza, CC-3202).
  • the number of cells input per tissue (1 well) of NHDF was 9 ⁇ 10 5 cells.
  • the number of cells input per tissue (1 well) of RFP - HUVECs was 1.35 ⁇ 105 cells.
  • a 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4) was prepared as a solution containing tris hydroxymethylaminomethane (Tris).
  • Heparin SIGMA H3149-100KU
  • 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4) was dissolved in 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4) to obtain a solution containing heparin and Tris.
  • the heparin content was 0.1 mg / mL based on the total volume of the solution.
  • Collagen (collagen type I, manufactured by Nippi) was dissolved in a 5 mM acetic acid solution to obtain a collagen solution.
  • the collagen content was 0.1 mg / mL based on the total volume of the solution.
  • Fragmented collagen was dispersed in a medium (10% FBS, 1% antibiotic-containing DMEM medium) to prepare a fragmented collagen dispersion.
  • Example 1 NHDF and HUVEC are mixed with an equal amount mixture of a solution containing heparin and tris and a collagen solution so that the final concentration of collagen and heparin is 0.05 mg / mL, respectively, and NHDF, HUVEC, collagen and tris are mixed. And heparin-containing cell suspensions were prepared. The obtained cell suspension was centrifuged at room temperature at 1000 ⁇ g for 1 minute to remove the supernatant, and then the fragmented collagen dispersion was mixed to a final concentration of 0.5 mg / mL.
  • Transwell inserts 96-well dedicated container, Corning, product number: 7369, pore size 0.4 ⁇ m, polyester membrane.
  • general-purpose medium 10% FBS, 1% antibiotic-containing DMEM medium
  • centrifugation was performed for 1 minute under the condition of 400 ⁇ g.
  • the container was placed in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ), and cell culture was carried out under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . Twenty-four hours after centrifugation was defined as the start time of culturing. 96 hours after centrifugation was defined as the end of culture. The measured three-dimensional structure used was one that did not peel off from the edge of the insert.
  • Hematoxylin and eosin staining was performed on the section specimens prepared from the cultured tissue.
  • the thickness of each of the three-dimensional tissue stained with HE at the start and end of the culture was measured using an inverted microscope (manufactured by Olympus Corporation). The thinnest part in the thickness direction of the specimen was measured as the thickness of the three-dimensional tissue.
  • Thickness retention rate (%) (thickness at the time after the end of culturing of the three-dimensional tissue (72 hours after the start of culturing) / thickness at the start of culturing of the three-dimensional tissue) ⁇ 100
  • the tissue thickness at the start of the culture was 97 ⁇ m
  • the tissue thickness at the end of the culture was 81 ⁇ m.
  • Example 2 A solution containing heparin and tris was mixed with NHDF and HUVEC so that the final concentration of heparin was 0.05 mg / mL, and a cell suspension containing NHDF, HUVEC, tris and heparin was prepared. The obtained cell suspension was centrifuged at room temperature at 1000 ⁇ g for 1 minute to remove the supernatant, and then the fragmented collagen dispersion was mixed to a final concentration of 0.5 mg / mL. Using the obtained mixture, cell culture and evaluation were carried out in the same manner as in Example 1.
  • the thickness at the start of culturing was 115 ⁇ m, and the thickness at the end of culturing was 78 ⁇ m.
  • Comparative Example 1 NHDF and HUVEC mixed with an equal amount of heparin-containing Tris solution and collagen solution, the final concentration of collagen and heparin is 0.05 mg / mL, respectively, and cells containing NHDF, HUVEC, collagen, Tris and heparin. A suspension was prepared. The obtained cell suspension was centrifuged at room temperature at 1000 ⁇ g for 1 minute to remove the supernatant, and then the medium (10% FBS, 1% antibiotic-containing DMEM medium) was mixed. Using the obtained mixture, cell culture and evaluation were carried out in the same manner as in Example 1.
  • the thickness at the start of the culture was 97 ⁇ m, and the thickness at the end of the culture was 56 ⁇ m.
  • Table 1 shows the evaluation results of the thickness maintenance rate.
  • a three-dimensional tissue (Comparative Example 1) obtained by mixing cells with heparin 0.5 mg / mL and collagen 0.5 mg / mL as a reference body, culture under the same conditions (medium, culture temperature, culture period).
  • FIG. 1 A is a photograph showing three-dimensional tissues at the start of culture of Comparative Example 1, Example 1 and Example 2.
  • B is a photograph showing three-dimensional tissues at the end of each culture of Comparative Example 1, Example 1 and Example 2. The thickness was measured at the linear white portion in the photograph shown in FIG.

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Abstract

本発明は、細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分を混合して混合物を得る工程と、前記混合物を得る工程後に前記細胞を培養する工程と、を備える、三次元組織体の製造方法に関する。

Description

三次元組織体の製造方法及び三次元組織体
　本発明は、三次元組織体の製造方法及び三次元組織体に関する。
　三次元組織体は、再生医療、薬剤のアッセイ系等の様々な技術への応用可能性を有することが示されている。三次元組織体を製造する方法として、これまでにも種々の方法が提案されている。例えば、特許文献１には、細胞をカチオン性物質及び細胞外マトリックス成分と混合して混合物を得るＡ工程と、得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成するＢ工程と、前記細胞を培養し、三次元組織体を得るＣ工程とを含む、三次元組織体を製造する方法が開示されている。
国際公開第２０１７／１４６１２４号
　従来の方法を用いて作製された三次元組織体は、培養期間を長くすると、三次元組織体の厚さが減少する場合があった。
　本発明の目的は、厚さの減少が抑制された三次元組織体を製造する方法を提供することにある。
　本発明は、細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分を混合して混合物を得る工程と、混合物を得る工程後に細胞を培養する工程と、を備える、三次元組織体の製造方法に関する。
　本発明に係る製造方法は、細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分を混合して混合物を得る工程と、混合物を得る工程後に細胞を培養する工程とを備えるため、厚さの減少が抑制された三次元組織体を得ることができる。
　本発明に係る製造方法において、細胞は、少なくとも間質細胞及び内皮細胞を含んでいてよい。これにより、上述した効果がより顕著に発揮される。
　断片化細胞外マトリックス成分は、断片化コラーゲンを含んでいてよい。断片化コラーゲンは、解繊コラーゲンであってよい。断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン（例えば、解繊コラーゲン）を含む場合、上述した効果がより顕著に発揮される。
　本発明に係る製造方法において、混合物を得る際に、細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックスに加えて更に高分子電解質を混合し、混合物に高分子電解質を含有させてよい。この場合、上述した効果がより顕著に発揮される。
　高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよい。これにより上述した効果がより顕著に発揮される。
　混合物中の高分子電解質の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超１．５ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。
　本発明に係る製造方法において、混合物を得る際に、カチオン性物質及び／又は断片化細胞外マトリックスと同時に又は別々に、細胞に細胞外マトリックス成分を更に混合してよい。
　細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン及びプロテオグリカンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよい。
　細胞外マトリックス成分の質量と断片化細胞外マトリックス成分の質量との比は、２：１～１：５０であってよい。
　混合物中の細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計含有量は、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。
　本発明はまた、細胞、断片化細胞外マトリックス成分、及び高分子電解質を含む、三次元組織体に関する。
　高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよい。
　三次元組織体において、下記式で表される厚さ維持率は８０％以上であってよい。
式：厚さ維持率＝Ｘ１／Ｘ０×１００
［式中、Ｘ１は、三次元組織体を４日間培養した時点における厚さを示し、Ｘ０は、三次元組織体の培養開始時点における厚さを示す。］
　本発明によれば、厚さの減少が抑制された三次元組織体を製造する方法を提供することが可能となる。
三次元組織体の厚さの減少効果の評価結果を示す写真である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
〔三次元組織体の製造方法〕
　本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分を混合して混合物を得る工程（混合工程）と、混合物を得る工程後に細胞を培養する工程（培養工程）と、を備える。
　本明細書において、三次元組織体（細胞構造体）は、細胞外マトリックス成分及び／又は断片化細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる細胞の集合体である。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。
　本実施形態に係る三次元組織体の製造方法によれば、従来の方法と比べて、厚さの減少が抑制された三次元組織体を製造することが可能となる。このような効果が得られるメカニズムは特に限定されないが、例えば、断片化細胞外マトリックス成分は、より小さなサイズの細胞外マトリックス分子の集合体であるため、細胞間の隙間に入り込みやすく、細胞間接着をより強固にしやすくなっていると考えられる。
＜混合工程＞
　混合工程では、細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分を混合して混合物を得る。混合工程では、上記各成分を同時に又は別々に細胞に混合することができる。混合工程では、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が混合物に含まれるように混合される。混合工程では、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分に加えて、その他の成分を少なくとも一部が混合物に含まれるように細胞に更に混合することができる。
　混合物を得る際に、細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックスに加えて更に高分子電解質を混合し、混合物に高分子電解質を含有させてもよい。
　混合物を得る際に、カチオン性物質及び／又は断片化細胞外マトリックスと同時に又は別々に、細胞に細胞外マトリックス成分を更に混合してもよい。
　混合工程で用いられる上記成分を混合する順番は任意の順番であってよい。細胞に上記成分を混合する方法は、任意の方法を採用することができる。細胞に上記成分を混合する方法は、例えば、上記成分を含む液に細胞を添加することによって混合する方法であってよい。
　混合工程で用いられる各成分の混合は、例えば、適当な容器内で行われてよい。容器としては、細胞の培養に用いるための培養容器を用いることもできる。容器は、細胞、微生物の培養に通常用いられている素材、形状を有する容器であってよい。容器の素材としては、ガラス、ステンレス、プラスチック等が挙げられるが、これらに限定されない。容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、プレート等が挙げられるが、これらに限定されない。容器として、例えば、液体中の細胞を通過させず、液体を通過させることが可能な基材（透過膜）を備える容器を用いることもできる。透過膜を備える容器としては、例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサート等のセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。
　混合工程において用いる各成分は、それぞれ水性媒体に溶解、又は分散した状態で混合されてよい。水性媒体としては、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）等の液体培地が挙げられる。
（細胞）
　細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
　具体的には、細胞として、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ））、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、一種単独で用いてもよいし、複数種類の細胞を組み合わせて用いてもよい。
　細胞は、間質細胞を含んでいてよい。間質細胞は、上皮細胞の支持組織を構成する細胞である。間質細胞には、繊維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、神経細胞、肥満細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞等が含まれる。細胞が間質細胞を含む場合、厚さの減少が抑制された三次元組織体がより一層得られやすくなる。
　細胞は、内皮細胞を含むことが好ましい。内皮細胞は、内皮を構成する細胞である。内皮細胞には、上述した血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、リンパ管内皮細胞、類洞内皮細胞等が含まれる。細胞が内皮細胞を含む場合、厚さの減少が抑制された三次元組織体がより一層得られやすくなる。
　厚さの減少が抑制された三次元組織体がより一層得られやすくなる観点から、細胞は、間質細胞及び内皮細胞を少なくとも含んでいてよい。間質細胞の細胞数と、内皮細胞の細胞数との比（間質細胞数：内皮細胞数）は、例えば、１：１．５～３００：１であってよい。
　混合物は少なくとも細胞を含むものである。混合物中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ等に応じて適宜決定できる。例えば、混合物中の細胞密度は、１０３～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよいし、１０４～１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよい。
（カチオン性物質）
　カチオン性物質は、カチオン性基を有する物質である。カチオン性基は、カチオン基（正電荷を有する基）又はカチオン基に誘導され得る基をいう。カチオン性基としては、アミノ基（－ＮＨ２）、置換アミノ基（一置換アミノ基、二置換アミノ基等）、第四級アンモニウム基（第４級アンモニウムカチオン基）等が挙げられる。
　カチオン性物質としては、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニンが挙げられるがこれらに限定されない。
　混合工程では、例えば、カチオン性物質そのもの又はカチオン性物質を含む緩衝液（カチオン性緩衝液）を混合することによって、混合工程で用いられる上記成分にカチオン性物質を混合することができる。カチオン性物質を含む緩衝液としては、例えば、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス－緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられる。カチオン性緩衝液中のカチオン性物質の濃度は、例えば、１０～１００ｍＭ、２０～９０ｍＭ、３０～８０ｍＭ、４０～７０ｍＭ又は４５～６０ｍＭであってよく、５０ｍＭであってもよい。
　カチオン性緩衝液を用いる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育及び細胞集合体の形成等の観点から種々のｐＨを設定することができる。カチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０又は７．２～７．６であってよい。例えば、カチオン性緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０であってよい。カチオン性緩衝液のｐＨは７．４であることが好ましい。
（細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分）
　細胞外マトリックス成分は、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックス分子とは、細胞間の隙間を埋めることができる分子であればよく、多細胞生物において細胞の外に存在する物質であってよい。細胞外マトリックス分子としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックス分子は、生体適合性であることが好ましい。「生体適合性」とは、生体組織に触れたときに過剰な炎症等を生じさせないことを意味する。細胞外マトリックス分子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分としては、これら細胞外マトリックス分子を１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲンを含んでいてよく、コラーゲンからなっていてもよい。また、細胞外マトリックス成分がコラーゲンを含む場合、細胞培養の際の足場材料として用いたとき、コラーゲンが細胞接着の足場として機能し、三次元的な細胞構造体の形成がより一層促進される。
　細胞外マトリックス分子は、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。細胞外マトリックス分子は、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列の繰り返しを有するものであってよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することによって、分子鎖の配置への束縛が少なくなるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としての機能がより一層優れたものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックス分子において、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックス分子は、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってもよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（アルギニン残基－グリシン残基－アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。ＲＧＤ配列を有することによって、細胞接着がより一層促進されるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としてより一層好適なものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン等が挙げられる。
　コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞外マトリックス成分は、本発明による効果がより顕著になることから、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。
　細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を断片化して得ることができる。「断片化」とは、細胞外マトリックス分子の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断する条件で行われてもよいし、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われてもよい。断片化された細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である、解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含んでいてよい。解繊は、断片化の一態様であり、例えば、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
　細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。細胞外マトリックス成分を解繊する方法としては、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を解繊してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの解繊細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。解繊細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで解繊することにより得ることもできる。
　断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分であってよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン成分（解繊コラーゲン成分）を含むことが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。
　断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状のコラーゲン成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が分子間で架橋して構成される形状を意味する。断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であってよい。線維状の細胞外マトリックス成分には、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細線維）、細線維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。線維状の細胞外マトリックス成分ではＲＧＤ配列が破壊されることなく保存されている。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均長が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均径は、１０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、３０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、５０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１μｍ以上３０μｍ以下であってよく、２μｍ以上３０μｍ以下であってよく、３μｍ以上３０μｍ以下であってよく、４μｍ以上３０μｍ以下であってよく、５μｍ以上３０μｍ以下であってよい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均径が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
　細胞外マトリックス成分及び／又は断片化細胞外マトリックス成分（以下、まとめて「細胞外マトリックス成分等」ともいう。）の少なくとも一部は、分子間又は分子内で架橋されていてもよい。細胞外マトリックス成分等は、細胞外マトリックス成分等を構成する分子内で架橋されていてもよく、細胞外マトリックス成分等を構成する分子間で架橋されていてよい。
　細胞外マトリックス成分等の架橋の態様は、少なくともその一部は、細胞外マトリックス分子のカルボシキル基等と金属元素のイオンとの間で水素結合を形成することに起因するものであってよい。細胞外マトリックス成分等の架橋はまた、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による架橋を含むものであってよい。
　混合工程では、例えば、断片化細胞外マトリックス成分そのもの、又は断片化細胞外マトリックス成分と該断片化細胞外マトリックス成分が分散した水性溶媒からなる分散液を混合することによって、混合工程で用いられる上記成分に断片化細胞外マトリックス成分を混合することができる。分散液に用いられる水性媒体は、後述する培地であってもよい。断片化細胞外マトリックス成分は、カチオン性物質と別々に細胞に混合されてよい。例えば、断片化細胞外マトリックス成分は、細胞にカチオン性物質を混合した後に、細胞に混合されてよい。
　混合物は少なくとも断片化細胞外マトリックス成分を含むものである。混合物中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ等に応じて適宜決定できる。混合物中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、例えば、混合物全量を基準として、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、０．１０ｍｇ／ｍＬ以上、０．１５ｍｇ／ｍＬ以上、０．２０ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．３０ｍｇ／ｍＬ以上、０．３５ｍｇ／ｍＬ以上、０．４０ｍｇ／ｍＬ以上、又は０．４５ｍｇ／ｍＬ以上であってよく、１．５ｍｇ／ｍＬ以下、１．２５ｍｇ／ｍＬ以下、１．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．８ｍｇ／ｍＬ以下、又は０．６ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。混合物中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量を多くすると、より厚い三次元組織体を形成しやすくなる傾向がある。混合物中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量を少なくすると、三次元組織体の厚さの減少がより抑制されやすくなる傾向がある。混合物中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量が上記範囲内であると、適度な厚さを有しつつ、厚さの減少が抑制された三次元組織体がより一層形成されやすくなる。
　混合工程では、例えば、細胞外マトリックス成分そのもの、又は細胞外マトリックス成分及び水性媒体を含む溶液を混合することによって、混合工程で用いられる上記成分に細胞外マトリックス成分を混合することができる。細胞外マトリックス成分は、適切な溶媒に溶解して用いてもよい。溶媒の例としては、水、緩衝液、酢酸等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、緩衝液又は酢酸に溶解されることが好ましい。細胞外マトリックス成分は、例えば、カチオン性物質と同時に細胞に混合されてよい。
　混合物は、細胞外マトリックス成分を含有するものであってよい。混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ等に応じて適宜決定できる。混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量は、例えば、混合物全量を基準として、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．０２ｍｇ／ｍＬ以上、０．０３ｍｇ／ｍＬ以上、又は０．０４ｍｇ／ｍＬ以上であってよく、１．５ｍｇ／ｍＬ以下、１．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．１ｍｇ／ｍＬ以下、０．０８ｍｇ／ｍＬ以下、又は０．０６ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量を多くすると、より厚い三次元組織体を形成しやすくなる傾向がある。混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量を少なくすると、三次元組織体の厚さの減少がより抑制されやすくなる傾向がある。混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量が上記範囲内であると、適度な厚さを有しつつ、厚さの減少が抑制された三次元組織体がより一層形成されやすくなる。
　細胞外マトリックス成分の質量と断片化細胞外マトリックス成分の質量との比（細胞外マトリックス成分の質量：断片化細胞外マトリックス成分の質量）は、例えば、２：１～１：５０、１：１～１：５０、又は１：１０～１：５０であってよい。
　混合工程において、混合物中の細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計含有量は、混合物全量を基準として、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．３ｍｇ／ｍＬ、又は０．０５ｍｇ／ｍＬ以上１．２ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。混合物中の細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計含有量を多くすると、より厚い三次元組織体を形成しやすくなる傾向がある。混合物中の細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計含有量を少なくすると、三次元組織体の厚さの減少がより抑制されやすくなる傾向がある。混合物中の細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計含有量が上記範囲内であると、適度な厚さを有しつつ、厚さの減少が抑制された三次元組織体がより一層形成されやすくなる。
（高分子電解質）
　高分子電解質は、高分子鎖と解離可能な官能基とを有する高分子化合物である。解離可能な官能基としては、例えば、硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）が挙げられる。高分子電解質は、例えば、解離可能な官能基が導入された多糖、又は解離可能な官能基を有する単量体（例えば、アクリル酸、スチレンスルホン酸）を単量体単位として含むポリマーであってよい。解離可能な官能基が導入された多糖としては、例えば、硫酸化多糖が挙げられる。解離可能な官能基を有する単量体を単量体単位として含むポリマーは、解離可能な官能基を有する単量体のみを単量体単位として含むポリマーであってもよく、解離可能な官能基を有する単量体に加えて、その他の単量体を単量体単位として含むポリマーであってもよい。高分子電解質としては、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン；デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸、又はこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。高分子電解質は、上述したもの１種からなるものであってよく、２種以上を組み合わせて含むものであってもよい。
　高分子電解質はグリコサミノグリカンであることが好ましく、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びデルマタン硫酸からなる群より選択される少なくとも１種を含むことがより好ましく、ヘパリンであることが更に好ましい。三次元組織体が高分子電解質を含む場合、細胞外マトリックス成分及び／又は断片化細胞外マトリックスの過度な凝集をより効果的に抑制することができ、結果として、所望の三次元組織体がより得られやすくなる。三次元組織体がヘパリンを含む場合、当該効果はより一層顕著なものとなる。高分子電解質は、例えば、上記例示した高分子電解質の誘導体を用いてもよい。
　高分子電解質は、適切な溶媒に溶解して用いてもよい。溶媒の例としては、水及び緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。高分子電解質は、上述のカチオン性物質とともに溶解して用いてもよい。高分子電解質は、例えば、カチオン性物質及び細胞外マトリックス成分と同時に、細胞に混合されてよい。
　混合物は、高分子電解質を含有するものであってよい。混合物中の高分子電解質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。混合物中の高分子電解質の濃度は、例えば、０ｍｇ／ｍＬ超１．５ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。混合物中の高分子電解質の濃度は０．００５ｍｇ／ｍＬ以上、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．０２ｍｇ／ｍＬ以上、０．０３ｍｇ／ｍＬ以上、又は０．０４ｍｇ／ｍＬ以上であってよく、１．５ｍｇ／ｍＬ以下、１．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．１ｍｇ／ｍＬ以下、０．０８ｍｇ／ｍＬ以下、又は０．０６ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。混合物中の高分子電解質の濃度は、例えば、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０７５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１ｍｇ／ｍＬであってよい。
　混合物における、高分子電解質の質量と細胞外マトリックス成分の質量との比（高分子電解質の質量：細胞外マトリックス成分の質量）は、１：２～２：１であってよく、１：１．５～１．５：１であってもよく、１：１であってもよい。
　混合工程では、細胞に上記成分の少なくとも１種を混合した後に、液体部分を除去することを含んでいてもよい。液体部分を除去する手段として、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離、ろ過等によって、液体部分を除去してもよい。遠心分離の条件は、遠心分離の条件は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞と上記成分の少なくとも１種の入ったマイクロチューブを室温、４００×ｇで１分間の遠心分離に供して液体部分を沈殿物と分離することによって、液体部分を除去することができる。自然沈降によって沈殿物を形成させた後、液体部分を除去してもよい。
　混合工程は、例えば、カチオン性物質、高分子電解質、細胞外マトリックス成分及び水性媒体を含む液を細胞に混合して細胞含有組成物を得ることと、当該混合液から液体部分の少なくとも一部を除去することと、液体部分の少なくとも一部が除去された細胞含有組成物に断片化細胞外マトリックス成分及び水性媒体を含む液を混合することとを含む方法によって行うことができる。
　混合物を得る工程は、培養容器中に混合物を供給（播種）することを含んでいてもよい。培養容器としては上述した容器が例示される。
　混合物を得る工程と、細胞を培養する工程との間に、混合物から液体成分以外の成分を集めて細胞集合体を形成する工程が含まれていてもよい。混合物から液体成分以外の成分を集めて細胞集合体を形成するための具体的手段としては、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離、磁性分離、又は濾過によって、液体部分以外の成分を集めてよい。遠心分離の条件は、細胞の生育に悪影響を及ぼさない条件であってよい。例えば、混合物をセルカルチャーインサートに播種し、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離に供することで、細胞を集めることができる。あるいは、自然沈降によって細胞を集めてもよい。自然沈降させる際の時間は、例えば１時間～２４時間であってよく、細胞集合体の形成しやすさの観点から、２４時間であってよい。
＜培養工程＞
　培養工程では、混合工程後に、少なくとも一部の細胞が生存状態を維持する条件で細胞を培養して、三次元組織体を形成させる。細胞の培養は通常基材上で行われる。基材は、例えば、上述した透過膜であってよい。細胞の培養は、例えば、上述した透過膜を備える容器を用いることができる。
　細胞の培養条件は、細胞が増殖する条件であればよく、培養工程における培養条件は、細胞の種類に応じて、好適な培養条件を設定することができる。例えば、培養温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。培養時間は、１日～１４日であってもよく、７日～１４日であってもよく、１４日～３０日であってもよく、３０日～６０日であってもよく、６０日～９０日であってもよい。
　液体培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。当該培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。
〔三次元組織体〕
　本実施形態に係る三次元組織体は、細胞、断片化細胞外マトリックス成分、及び高分子電解質を少なくとも含む。三次元組織体は、細胞外マトリックス成分を更に含んでいてよい。細胞の少なくとも一部は、細胞外マトリックス成分及び／又は断片化細胞外マトリックス成分に接触していてよい。接触の一態様として、接着していてもよい。
　本実施形態に係る三次元組織体は、例えば、上述した三次元組織体の製造方法によって得ることができる。本実施形態に係る三次元組織体は、例えば、細胞に、断片化細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を同時に、又は別々に混合して混合物を得ることと、混合物を遠心分離してから、上記細胞を培養することとをこの順に含む方法によって得ることができる。
　本実施形態に係る三次元組織体は、下記式で表される厚さ維持率が８０％以上であってよい。
式：厚さ維持率（％）＝Ｘ１／Ｘ０×１００
　式中、Ｘ１は、三次元組織体を４日間培養した時点（三次元組織体の培養開始時点から７２時間後）における厚さを示し、Ｘ０は、三次元組織体の培養開始時点における厚さを示す。
　三次元組織体の厚さは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
　三次元組織体の厚さは、三次元組織体を厚さ方向（主面に垂直な方向）に沿って切断して得られる切片を用いて測定することができる。三次元組織体の主面に垂直な方向における両端の距離は、三次元組織体の中心を通る切片画像において測定されてもよい。
　三次元組織体の厚さは、例えば、倒立顕微鏡を用いて測定される。
　三次元組織体の培養開始時点における厚さＸ０は、細胞に、断片化細胞外マトリックス成分と高分子電解質とを同時に、又は別々に混合して得られる混合物を集めて細胞集合体を形成してから２４時間後の時点における三次元組織体の厚さである。細胞集合体を形成してから２４時間は、培地中で３７℃の条件で細胞培養が行われてよい。細胞培養は、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で行われてもよい。培地としては、細胞の種類に応じて、その細胞が生存しやすい培地を選択することができる。
　三次元組織体の培養開始時点における厚さＸ０は、８０μｍ以上、１００μｍ以上、又は１１０μｍ以上であってよく、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、又は１２０μｍ以下であってよい。
　三次元組織体を４日間培養した時点における厚さＸ１は、細胞に、断片化細胞外マトリックス成分と高分子電解質とを同時に、又は別々に混合して得られる混合物を集めて細胞集合体を形成してから９６時間後（三次元組織体の培養開始時点から７２時間後）の時点における三次元組織体の厚さである。細胞集合体を形成してから９６時間は、細胞集合体を形成してから２４時間における培養条件と同条件で培養されてよい。例えば、細胞集合体を形成してから９６時間は、培地中で３７℃の条件で細胞培養が行われてよい。細胞培養は、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で行われてもよい。培地としては、細胞の種類に応じて、その細胞が生存しやすい培地を選択することができる。
　三次元組織体を４日間培養した時点における厚さＸ１は、６０μｍ以上、７０μｍ以上、又は８０μｍ以上であってよく、１８０μｍ以下、１３０μｍ以下、又は１００μｍ以下であってよい。
　厚さ維持率は、例えば、７５％以上、８０％以上、又は８２％以上であってよく、１００％以下、９０％以下、又は８５％以下であってもよい。
　本実施形態に係る三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適に用いることができる。
　以下、本発明を試験例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の試験例に限定されるものではない。
　ＮＨＤＦ（ヒト新生児由来皮膚繊維芽細胞、メーカー：Ｌｏｎｚａ社、型番：ＣＣ－２５０９）及びＲＦＰ－ＨＵＶＥＣｓ（ＲＦＰ発現ヒト臍帯静脈内皮細胞、メーカー：ＡＮＧＩＯ－ＰＲＯＴＥＯＭＩＥ、型番ｃＡＰ－０００１ＲＦＰ）を準備した。
　ＮＨＤＦの培養は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社製、１０４３７０２８）及び１％（ｖ／ｖ％）ペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｗａｋｏ、１６８－２３１９１）を含むＤ－ＭＥＭ（Ｗａｋｏ、０４３－３００８５）を用いて実施した。ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣｓの培養は、ＥＧＭ－２ＭＶ基本培地（Ｌｏｎｚａ社、ＣＣ－３２０２）を用いて実施した。
　ＮＨＤＦの１組織（１ウェル）あたりの細胞投入数は９×１０５ｃｅｌｌｓとした。ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣｓの１組織（１ウェル）あたりの細胞投入数は１．３５×１０５ｃｅｌｌｓとした。
　トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）を含む溶液として、２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を準備した。ヘパリン（ＳＩＧＭＡ　社　Ｈ３１４９－１００ＫＵ）を２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、ヘパリン及びトリスを含む溶液を得た。ヘパリンの含有量は、溶液全量を基準として、０．１ｍｇ／ｍＬであった。
　コラーゲン（コラーゲンＩ型、ニッピ製）を５ｍＭ酢酸溶液に溶解して、コラーゲン溶液を得た。コラーゲンの含有量は、溶液全量を基準として、０．１ｍｇ／ｍＬであった。
　コラーゲンＩ型（日本ハム株式会社製、ブタ皮膚由来）５０ｍｇを１×ＰＢＳ（ｐＨ７）５ｍＬに懸濁し、撹拌式ホモジナイザーを用いて室温で６分間ホモジナイズし、断片化コラーゲン（解繊コラーゲン）溶液を得た。得られた溶液中の断片化コラーゲンの平均径は、５．０３±３．１１μｍであった（Ｎ＝２５）。
　断片化コラーゲンを培地（１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地）に分散させて、断片化コラーゲン分散液を調製した。
実施例１
　ＮＨＤＦ及びＨＵＶＥＣに、ヘパリン及びトリスを含む溶液と、コラーゲン溶液との等量混合液を、コラーゲン及びヘパリンの終濃度がそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように混合し、ＮＨＤＦ、ＨＵＶＥＣ、コラーゲン、トリス及びヘパリンを含有する細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、室温、１０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、断片化コラーゲン分散液を終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合した。
　得られた混合物をトランズウェルインサート（９６穴専用容器、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、製品番号：７３６９、孔サイズ０．４μｍ、ポリエステルメンブレン）のインサート内に播種した。適量の汎用培地（１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地）をトランズウェルインサートに追加後、４００×ｇの条件で１分間遠心分離を行った。その後、容器をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に配置して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で細胞培養を実施した。遠心分離から２４時間後を培養開始時点とした。遠心分離から９６時間後を培養終了時点とした。測定した三次元組織体はインサートの縁からの剥がれがないものを用いた。
　培養した組織から作製した切片標本に対して、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。ＨＥ染色した三次元組織体の培養開始時点及び培養終了時点それぞれの三次元組織体の厚さは、倒立顕微鏡（オリンパス社製）を用いて測定した。標本の厚さ方向において最も薄い部分を三次元組織体の厚さとして測定した。
　三次元組織体の厚さの維持率評価は、下記式で算出される厚さ維持率に基づいて実施した。結果を表１に示す。
式：厚さ維持率（％）＝（三次元組織体の培養終了後（培養開始時点から７２時間後）の時点における厚さ／三次元組織体の培養開始時点における厚さ）×１００
　実施例１の方法で作製した評価用試料では、培養開始時点の組織の厚さは、９７μｍであり、培養終了時の組織の厚さは８１μｍであった。
実施例２
　ＮＨＤＦ及びＨＵＶＥＣに、ヘパリン及びトリスを含む溶液をヘパリンの終濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように混合し、ＮＨＤＦ、ＨＵＶＥＣ、トリス及びヘパリンを含む細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、室温、１０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、断片化コラーゲン分散液を終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合した。得られた混合物を用いて、実施例１と同様の方法で、細胞培養及び評価を実施した。
　実施例２の方法で作製した三次元組織体では、培養開始時点の厚さは１１５μｍであり、培養終了時点の厚さは、７８μｍであった。
比較例１
　ＮＨＤＦ及びＨＵＶＥＣに、ヘパリン含有トリス溶液及びコラーゲン溶液の等量混合液を混合し、コラーゲン及びヘパリンの終濃度がそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬであり、ＮＨＤＦ、ＨＵＶＥＣ、コラーゲン、トリス及びヘパリンを含有する細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、室温、１０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、培地（１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地）を混合した。得られた混合物を用いて、実施例１と同様の方法で、細胞培養及び評価を実施した。
　比較例１の方法で作製した三次元組織体では、培養開始時点の厚さは９７μｍであり、培養終了時点の厚さは、５６μｍであった。
　表１に厚さ維持率の評価結果が示される。細胞にヘパリン０．５ｍｇ／ｍＬ、コラーゲン０．５ｍｇ／ｍＬを混合して得られた三次元組織体（比較例１）を参照体とし、同一の条件（培地、培養温度、培養期間）で培養したときに参照体と比較して厚さ維持率が大きい場合に厚さの減少が抑制されていると判断される。図１において、Ａは比較例１、実施例１及び実施例２それぞれの培養開始時点における三次元組織体を示す写真である。図１において、Ｂは比較例１、実施例１及び実施例２それぞれの培養終了時点における三次元組織体を示す写真である。図１に示す写真中の直線状の白抜き部分において厚さを測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　断片化コラーゲンを用いた場合には、長期間培養した場合でも、厚さの減少が抑制されていた。

 

Claims (14)

  1. 　細胞に、カチオン性物質及び断片化細胞外マトリックス成分を混合して混合物を得る工程と、
    　前記混合物を得る工程後に前記細胞を培養する工程と、を備える、三次元組織体の製造方法。
  2. 　前記細胞が、少なくとも間質細胞及び内皮細胞を含む、請求項１に記載の三次元組織体の製造方法。
  3. 　前記断片化細胞外マトリックス成分が、断片化コラーゲンを含む、請求項１又は２に記載の三次元組織体の製造方法。
  4. 　前記断片化コラーゲンが、解繊コラーゲンである、請求項３に記載の三次元組織体の製造方法。
  5. 　前記混合物を得る際に、前記細胞に、前記カチオン性物質及び前記断片化細胞外マトリックスに加えて更に高分子電解質を混合し、前記混合物に前記高分子電解質を含有させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
  6. 　前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項５に記載の三次元組織体の製造方法。
  7. 　前記混合物中の前記高分子電解質の濃度が０ｍｇ／ｍＬ超１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項５又は６に記載の三次元組織体の製造方法。
  8. 　前記混合物を得る際に、前記カチオン性物質及び／又は前記断片化細胞外マトリックスと同時に又は別々に、前記細胞に細胞外マトリックス成分を更に混合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
  9. 　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン及びプロテオグリカンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項８に記載の三次元組織体の製造方法。
  10. 　前記細胞外マトリックス成分の質量と前記断片化細胞外マトリックス成分の質量との比が、２：１～１：５０である、請求項８又は９に記載の三次元組織体の製造方法。
  11. 　前記混合物中の前記細胞外マトリックス成分及び前記断片化細胞外マトリックス成分の合計含有量が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
  12. 　細胞、断片化細胞外マトリックス成分、及び高分子電解質を含む、三次元組織体。
  13. 　前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１２に記載の三次元組織体。
  14. 　下記式で表される厚さ維持率が８０％以上である、請求項１２又は１３に記載の三次元組織体。
    式：厚さ維持率＝Ｘ１／Ｘ０×１００
    ［式中、Ｘ１は、三次元組織体を４日間培養した時点における厚さを示し、Ｘ０は、三次元組織体の培養開始時点における三次元組織体の厚さを示す。］
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