CN105833249A - PDGFR-β作为筛选促进血管生成的间充质干细胞亚群的标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了PDGFR‑β作为筛选促进血管生成的间充质干细胞亚群的标志物的应用。本发明提供了表达PDGFR‑β的间充质干细胞在制备具备如下1)‑5)中至少一种功能的产品的应用:1)促进血管形成或生成;2)促进血管再生;3)促进伤口愈合;4)治疗皮肤损伤;5)提高血管生成相关因子表达量。本发明的实验证明了本发明分离筛选一群PDGFR‑β阳性表达的MSCs,并发现其在血管生成及伤口愈合方面有独特的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种PDGFR-β作为筛选促进血管生成的间充质干细胞亚群的标志物的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种成体干细胞,由于MSCs具有来源广泛、获取方法简单、体外扩增培养容易、移植后免疫反应低和组织修复速度快等优势,使其在自身免疫性疾病以及各种疾病替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。近年来干细胞移植用于皮肤伤口愈合方面的研究与日俱增,MSCs主要通过两方面的机制促进皮肤的伤口愈合:多向分化潜能和旁分泌作用。前者主要通过诱导分化成角质形成细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等参与皮肤损伤部位表皮及附属器的形成,促进皮肤伤口愈合;后者通过在损伤部位释放一系列细胞因子和生长因子,从而促进细胞增殖、迁移和血管生成,进而达到皮肤伤口愈合。
MSCs在形态、功能及生物学特性上存在异质性。目前还没有单一的方法能够鉴别间充质干细胞,对于间充质干细胞还没有特定的标志物来鉴定和定义。MSCs表面表达多种抗原,但是没有MSCs特异性表达的蛋白。不同来源的MSCs对于相同的蛋白受体的表达情况也不同,随着传代培养,MSCs对很多表面蛋白的表达也会有所改变。一些研究显示早期培养的MSCs有至少三种不同的形态:小的快速自我更新的细胞,成纤维细胞形态的梭形细胞,大的扁平状细胞。小的这一群细胞保持快速增值和强大的多向分化潜能,并具有很好的迁徙能力。研究发现,由单一的MSCs形成的克隆具有不同的三系分化的能力,MSCs的分化潜能与分离和培养方式也有很大的关系。总之,MSCs表面分子的表达和分化潜能均表现出异质性。
干细胞治疗为伤口愈合开辟了新的道路,MSCs在皮肤伤口愈合中有明显的作用,愈合效果也很理想。但是将MSCs大量应用于临床,还存在很多问题。根据目前的分离方法,MSCs存在异质性,为一群表型和功能上多样性的混合的干细胞。目前还没有单一的方法能够鉴别间充质干细胞,对于间充质干细胞还没有特定的标志物来鉴定和定义。对MSCs的鉴定和生理功能研究,都由于缺乏生物标志物而受到阻碍。这导致间充质干细胞作用的具体机制还不清楚,极大的限制了MSCs应用于临床治疗某些特定疾病的潜力。MSCs含有不同组织修复能力的亚群,通过一些特异性的标志物对MSCs进行鉴定、筛选和分群从而针对性的研究某一亚群MSCs对某些疾病的修复能力与治疗效果,这是将MSCs应用于临床研究的趋势与前景。
血小板衍生生长因子(PDGF)是由两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体,PDGF具有多种形式的二聚体结构,即PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC以及PDGF-DD。在组织受到损伤时巨噬细胞、单核细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞等可以合成并释放PDGF。PDGFR是PDGF受体,由两种亚单位α及β构成,其分子量为170~180KD。二者与PDGF结合力相差很大,α单位与PDGF A链及B链有较高的亲和力,而β亚单位仅与B链有高亲和力。所以α亚单位可与PDGF-AA、PDGF-AB及PDGF-BB结合,β亚单位仅与PDGF-BB及PDGF-AB结合。一些研究证明,在肝纤维化时,HSC表面的PDGF受体以β受体为主,与PDGF-BB具有较强的亲和力,认为PDGF-BB以及PDGFR-β在肝纤维化过程中的作用尤为突出。
血管周间质细胞、周细胞、血管平滑肌细胞、间充质干细胞等均表达PDGFR-β。很多研究表明,PDGFR-β在骨髓来源的MSCs及脂肪来源的MSCs都有很高的表达量,可是研究发现PDGFR-β在胎盘来源的MSCs表面表达量有25%左右,而且随传代培养表达量发生变化。PDGFR-β的表达受多种因素的影响,比如炎症刺激PDGFR-β的表达上调,在培养过程中PDGFR-β阴性表达的MSCs也会逐渐获得PDGF而表达PDGFR-β。
PDGF及PDGFR-β信号通路对于MSCs的增殖、迁移、分化潜能及功能上都有很强的调控作用。有研究指出PDGFR-β可以抑制MSCs的成骨分化。
发明内容
本发明的一个目的是提供表达PDGFR-β的间充质干细胞的应用。
本发明提供的表达PDGFR-β的间充质干细胞在制备具备如下1)-5)中至少一种功能的产品的应用:
1)促进血管形成或生成;
2)促进血管再生;
3)促进伤口愈合
4)治疗皮肤损伤;
5)提高血管生成相关因子表达量。
表达PDGFR-β的间充质干细胞(PDGFR-β表达阳性)提高血管生成相关因子表达量为与不表达PDGFR-β的间充质干细胞亚群(PDGFR-β表达阴性)相比,表达PDGFR-β的间充质干细胞亚群的血管生成相关因子表达量提高。
上述应用中,所述血管生成相关因子为CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-1、bFGF、PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。
上述应用中,所述表达PDGFR-β的间充质干细胞为表达PDGFR-β的离体间充质干细胞亚群。
上述应用中,所述产品为试剂盒或药物。
本发明另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品,其活性成分为表达PDGFR-β的间充质干细胞;
所述产品具有如下1)-5)中至少一种功能:
1)促进血管形成或生成;
2)促进血管再生;
3)促进伤口愈合
4)治疗皮肤损伤;
5)提高血管生成相关因子表达量。
上述产品中,所述血管生成相关因子为CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-1、bFGF、PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。
上述产品中,所述表达PDGFR-β的间充质干细胞为表达PDGFR-β的离体间充质干细胞亚群。
上述产品中,所述产品为试剂盒或药物。
PDGFR-β作为靶点或标志物在筛选具有如下1)-5)中至少一种功能的间充质干细胞中的应用也是本发明保护的范围;
或检测PDGFR-β表达的物质在筛选或分选具有如下1)-5)中至少一种功能的间充质干细胞中的应用也是本发明保护的范围;
1)促进血管形成或生成;
2)促进血管再生;
3)促进伤口愈合
4)治疗皮肤损伤;
5)提高血管生成相关因子表达量。
上述使用PDGFR-β抗体检测PDGFR-β表达的物质。
本发明的实验证明,本发明分离筛选PDGFR-β阳性表达的MSCs,分别从体外、体内两方面的实验寻找PDGFR-β阳性表达的MSCs的作用和功能;体外实验发现PDGFR-β阳性的MSCs表达血管生成相关因子水平大幅提高;体内实验通过将PDGFR-β阳性表达的MSCs和PDGFR-β阴性表达的MSCs应用于小鼠皮肤伤口模型,发现PDGFR-β阳性表达的MSCs血管生成能力明显增强,细胞在伤口中的存活性和迁徙能力都比较强,促进伤口愈合效果很好;为临床治疗烧伤等皮肤损伤提供了一种有效的方法。
附图说明
图1为PDGFR-β细胞在胎盘组织中的分布情况(标尺长度为100微米)。
图2为流式检测P4MSCs对血小板衍生生长因子受体beta(PDGFR-β)的表达情况。
图3为实时荧光定量PCR检测PDGFR-β特定表达阳性与阴性的MSCs表达血管生成相关因子水平。
图4为胎盘MSCs中PDGFR-β+的血管形成能力检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、PDGFR-β阳性细胞的发现及分选
一、PDGFR-β细胞在胎盘组织中的分布
根据捐赠者知情同意并遵循伦理委员会批准的原则,从医院取得离体的人胎盘组织。然后用预冷的生理盐水清洗胎盘组织,取小的组织块,用4%的多聚甲醛固定组织24小时以上,然后使用10%、20%、30%的蔗糖溶液梯度脱水,每次6小时以上,然后使用OCT包埋组织,将组织进行冰冻切片,切片厚度为10微米。最后做免疫荧光染色,一抗为PDGFR-β抗体(购买自德国美天旎(Miltenyi Biotec)公司,货号130-105-320),稀释浓度为1:100,4度冰箱孵育过夜;二抗为带有红色荧光染料标记的抗体(购买自Jackson Immunoresearch,货号200-022-211),室温孵育1小时;细胞核用蓝色荧光染料DAPI(购买自南京凯基生物有限公司,货号KGA215-50)标记,染完后使用共聚焦显微镜分别在低倍镜和高倍镜下拍照,观察PDGFR-β阳性的细胞在胎盘组织在中的分布。
结果如图1所示,可以看出,在胎盘组织中,只有一些区域的部分细胞表达PDGFR-β(白色虚线方框所示),这些细胞多位于血管外周围,散在分布。
二、筛选源于胎盘MSCs的PDGFR-β+细胞亚群和源于胎盘MSCs的PDGFR-β-细胞亚群
收集贴壁培养的第四代次的MSCs,取一部分细胞悬液使用流式抗体PDGFR-β-PE抗体(购买自biolegend公司,货号323605)标记,4度冰箱放置20-30分钟,然后用PBS清洗两次,最后使用流式细胞仪进行流式检测,结果如图2左边起第一个图所示,流式检测P4MSCs对血小板衍生生长因子受体beta(PDGFR-β)的表达率为18.7%;
对于使用免疫磁珠分选的具体方法为:首先配制分选缓冲液,成分为PBS(PH值为7.2)、0.5%牛血清白蛋白、2Mm EDTA;然后准备细胞悬液,使用血球计数板统计细胞数;然后加anti-PDGFR-β-biotin抗体(购买自德国美天旎(Miltenyi Biotec)公司,货号130-105-320)标记,放置于4度冰箱孵育20-30分钟;使用1-2毫升分选缓冲液清洗细胞两次,每次离心300g,10分钟;然后用分选缓冲液重悬细胞,每一千万细胞用80微升的缓冲液重悬,然后加入20微升的anti-biotin磁珠(microbeads),4度放置15分钟;再次使用1-2毫升的分选缓冲液清洗,300g,10分钟离心,去上清,得细胞沉淀;然后使用500微升的分选缓冲液重悬细胞,过分选柱,收集阴性的细胞,然后取下分选柱,将阳性的与磁珠结合的细胞洗脱下来。
分别取少量分选后的阴性和阳性的细胞悬液,用流式抗体PDGFR-β-PE抗体标记,4度冰箱放置20-30分钟,然后用PBS清洗两次,最后使用流式细胞仪进行流式检测通过免疫磁珠分选后两个亚群的间充质干细胞表面的PDGFR-β表达情况,即为检测分选效率。结果如图2左边起第2个图(分选后PDGFRβ+MSCs PDGFRβ–FITC:98.1%)和第3个图(分选后PDGFRβ-MSCs PDGFRβ–FITC:3.87%)所示,可以看出,经过培养的MSCs中只有部分细胞表达PDGFR-β,阳性细胞平均表达比例约为20%,而且免疫磁珠分选的效率很好,即:分选后的阳性细胞几乎全部表达PDGFR-β,而阴性细胞几乎完全不表达PDGFR-β;可以用于后续的体外、体内水平的实验研究。
因此可以通过流式分析和免疫磁珠分选相结合的方法得到比较纯化的源于胎盘MSCs的PDGFR-β+细胞亚群(也称为PDGFR-β阳性细胞亚群)和源于胎盘MSCs的PDGFR-β-细胞亚群(也称为PDGFR-β阴性细胞亚群)。
实施例2、源于胎盘MSCs的PDGFR-β+细胞亚群的功能研究
一、源于胎盘MSCs的PDGFR-β+细胞亚群提高血管生成相关因子的表达水平
取实施例1免疫磁珠分选后的PDGFR-β+细胞亚群和PDGFR-β-细胞亚群,分别提取mRNA,使用分光光度计检测mRNA浓度;然后使用Takara公司的RT-PCR试剂盒,将mRNA反转录为cDNA,最后做荧光定量PCR,检测两种亚群的细胞对于血管生成相关因子及促进血管生成的因子的相对表达情况。
研究中使用到的引物序列为:
CD31(Pecam1)
CAA CGA GAA AAT GTC AGA(序列1)
GGA GCC TTC CGT TCT AGA GT(序列2)
VE-cadherin
CAG CCC AAA GTG TGT GAG AA(序列3)
TGT GAT GTT GGC CGT GTT AT(序列4)
VEGF
CGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG(序列5)
TTCTGTATTCAGTCTTTCCTGGTGAG(序列6)
Ang-1(angiopoietin)
CAGCGCCGAAGTCCAGAAAAC(序列7)
CACATGTTCCAGATGTTGAAG(序列8)
bFGF
AGGCTACAAGGTCCGTTATGC(序列9)
TGCCGTACTCATTCTCCACAA(序列10)
PDGF A
CCCCTGCCCATTCGGAGGAAGAG(序列11)
TTGGCCACCTTGACGCTGCGGTG(序列12)
PDGF B
GATCCGCTCCTTTGATGATC(序列13)
GTCTCACACTTGCATGCCAG(序列14)
IL-4
TCATTTTCCCTCGGTTTCAG(序列15)
AGAACAGAGGGGGAAGCAGT(序列16)
IL-10
TCAGGGTGGGGACTCTAT(序列17)
TGGGCTTCTTCTAAATCGTTC(序列18)
结果如图3所示,每组柱形图左侧的为PDGFR-β阳性,右侧的为PDGFR-β阴性,可以看出PDGFR-β阳性的细胞群对于促进血管生成因子bFGF、VEGF、Ang1等因子的表达水平是阴性细胞群的2倍以上,而对于CD31的表达水平是阴性细胞群的9倍,对于其他一些相关因子的表达水平也较高;因此,mRNA水平结果暗示了PDGFR-β阳性的细胞群能够促进血管生成。
二、源于胎盘MSCs的PDGFR-β+细胞亚群具有血管形成能力
准备Babl/C小鼠,用脱毛膏使背部脱毛,然后使用酒精和碘酒消毒,用0.5毫米的打孔器在小鼠的背部对称的打两个伤口,在伤口周围粘上硅胶圈,得到受伤小鼠模型。
实验组1:将实施例1分选的源于胎盘MSCs的PDGFR-β+细胞亚群用matrigel(购买于Corning公司)重悬,移植到小鼠皮肤伤口床上;
实验组2:将实施例1分选的源于胎盘MSCs的PDGFR-β-细胞亚群分别用matrigel(购买于Corning公司)重悬,移植到小鼠皮肤伤口床上;
对照组(sham):小鼠只移植matrigel。
每组5只小鼠,每个伤口移植100万的间充质干细胞,7天和14天后分别给伤口拍照。
结果如图4(DAPI为细胞核的染料,中文名字为2-氨基苯基吲哚;α-SMA为α-smooth actin,α-平滑肌肌动蛋白)所示,可以看出,移植PDGFR-β+MSCs细胞亚群可以明显促进小鼠皮肤伤口愈合,实验组小鼠伤口愈合速度加快,愈合效果较好;同时取皮肤样品进行分析。分别进行HE染色和免疫荧光染色,发现移植PDGFR-β+细胞亚群的实验组小鼠伤口周围血管生成明显增多,同时,伤口愈合效果较好。表明,胎盘MSCs中PDGFR-β+细胞具有促进血管形成能力。
根据统计的三组小鼠的伤口愈合率的定量结果可见,PDGFR-β+MSCs的伤口愈合效果明显好于PDGFR-β-MSCs,伤口愈合率提高有20%;与不加细胞的对照组相比,提高有近40%。
Claims (9)
1.表达PDGFR-β的间充质干细胞在制备具备如下1)-5)中至少一种功能的产品的应用:
1)促进血管形成或生成;
2)促进血管再生;
3)促进伤口愈合;
4)治疗皮肤损伤;
5)提高血管生成相关因子表达量。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述血管生成相关因子为CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-1、bFGF、PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述表达PDGFR-β的间充质干细胞为表达PDGFR-β的离体间充质干细胞亚群。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:
所述产品为试剂盒或药物。
5.一种产品,其活性成分为表达PDGFR-β的间充质干细胞;
所述产品具有如下1)-5)中至少一种功能:
1)促进血管形成或生成;
2)促进血管再生;
3)促进伤口愈合;
4)治疗皮肤损伤;
5)提高血管生成相关因子表达量。
6.根据权利要求5所述的产品,其特征在于:所述血管生成相关因子为CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-1、bFGF、PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。
7.根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于:所述表达PDGFR-β的间充质干细胞为表达PDGFR-β的离体间充质干细胞亚群。
8.根据权利要求5-7中任一所述的应用,其特征在于:
所述产品为试剂盒或药物。
9.PDGFR-β作为靶点或标志物在筛选具有如下1)-5)中至少一种功能的间充质干细胞中的应用;
或检测PDGFR-β表达的物质在筛选或分选具有如下1)-5)中至少一种功能的间充质干细胞中的应用;
1)促进血管形成或生成;
2)促进血管再生;
3)促进伤口愈合;
4)治疗皮肤损伤;
5)提高血管生成相关因子表达量。
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