PT1863920E

PT1863920E - Método para isolamento melhorado de proteínas recombinantemente produzidas

Info

Publication number: PT1863920E
Application number: PT06725404T
Authority: PT
Inventors: Stefan Winge
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2006-03-29
Publication date: 2011-01-19
Also published as: ATE490336T1; EP1863920B1; US20090088370A1; EP1863920A1; ES2354715T3; EP1707634A1; PL1863920T3; EP2258860A1; WO2006103258A1; US20170183703A1; US10626431B2; EP3467116A1; SI1863920T1; DK1863920T3; US9388402B2; DE602006018587D1

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA ISOLAMENTO MELHORADO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTEMENTE PRODUZIDAS" A presente invenção proporciona um método para o aumento do rendimento de uma proteína de factor VIII, produzida através da cultura de células de mamífero sob condições isentas de soro e adição de uma substância iónica ao meio de cultura, antes da recolha da proteína. São substâncias iónicas adequadas Acetato de NH4, MgCl2, KH2P04, Na2S04, KC1, NaCl, CaCl2, um aminoácido com uma cadeia lateral carregada e peptona.

Antecedentes A maioria das proteínas para aplicações médicas, cosméticas ou industriais é produzida como proteínas recombinantes em células cultivadas microbianas ou eucarióticas. Para tal, um gene codificando a proteína de interesse é inserido dentro do organismo/células de escolha, o organismo/células transportando o referido gene é cultivado num meio compreendendo todos os nutrientes essenciais, para permitir o crescimento e expressão do referido gene, resultando na produção da proteína de interesse. Se a proteína de interesse for segregada pelas células para no meio, as células e o meio são separados uns dos outros utilizando centrifugação ou membranas filtrantes. 0 meio recuperado contendo proteína e isento de células é, depois, adicionalmente processado através de etapas de purificação, para 1 remover proteínas de célula hospedeira, ADN e outros contaminantes.

Em geral, existem duas alternativas de produção diferentes para a recolha de proteínas recombinantemente produzidas, recolha contínua e em descontínuo. Quando se aplica a recolha contínua, os meios de cultura são continuamente e lentamente removidos do recipiente de cultura celular durante a fase de produção e, simultaneamente, é adicionado meio novo. A recolha contínua é escolhida quando as células estão em crescimento lento e/ou o processo facilita uma elevada concentração celular ou se o produto deve ser rapidamente removido da cultura, de modo a protegê-lo de degradação. A recolha em descontínuo é realizada num ponto definido, onde as células são removidas numa etapa e, a seguir, são, normalmente, descartadas. É tecnicamente mais fácil realizar uma recolha em descontínuo, em comparação com uma em contínuo, mas o processo de recolha óptimo deve ser determinado em cada caso específico, dependendo do produto e tipo de célula. Em alguns casos, se o produto não for segregado, a membrana celular deve ser destruída para recuperar o produto. É, contudo, preferido, manter a membrana celular intacta, se possível, para evitar contaminação do produto com ADN e proteínas celulares do hospedeiro. A recolha continua proporciona, normalmente, uma maio produtividade total, em comparação com recolha em descontínuo, visto que as células podem produzir durante um período de tempo mais longo. De modo a minimizar a contaminação do produto, é preferido, escolher o método de recolha que liberte a menor quantidade de ADN e proteínas celulares do hospedeiro. Num modo especial de recolha em descontínuo, onde as membranas celulares são mantidas intactas, pode ser alcançado um considerável aumento de produtividade, se a célula puder ser reutilizada. Este método de 2 recolha em descontínuo cíclico é particularmente aplicável para células de produção (valiosas) de crescimento lento.

De modo a obterem-se elevados rendimentos da proteína, é importante optimizar o processo para se alcançar uma elevada produtividade do produto. Até à data, os principais esforços para melhorar o rendimento de uma proteína recombinantemente produzida centraram-se no inserto molecular (vectores, estimuladores, promotores, etc.), de modo a optimizar o sistema de expressão, sob cujas condições as células são cultivadas e nas próprias etapas de purificação. Por exemplo, estabilizantes, tal como inibidores de protease, são adicionados ao meio e os processos de purificação são implementados na presença de inibidores de protease, para reduzir a perda do produto proteico. Contudo, é frequentemente, muito difícil encontrar um inibidor de protease que possa ser utilizado durante a cultura, visto que os inibidores de protease tendem também a inibir o crescimento celular e produção de proteína. Assim que as células sejam removidas, é mais fácil encontrar um inibidor de protease adequado. Isto está descrito, por exemplo, no documento US 5831026, onde é adicionado EDTA para inibir metaloproteases. Além do mais, deve ser notado que quaisquer agentes estabilizantes adicionados necessitam de ser removidos de novo em algum ponto do processo de produção, para se obter um produto proteico recombinante puro. Assim, existe ainda uma necessidade de melhorar os métodos de produção de proteína recombinante existentes, para ganhar elevados rendimentos da proteína recombinante.

Outro problema encontrado, especialmente quando se utilizam células de mamífero como hospedeiros de produção, é que a secreção das proteínas produzidas é bastante baixa. É evidente 3 que os produtos segregados frequentemente aderem à membrana celular e que isto tem uma influência sobre a libertação de produto. Em alguns casos, o atraso pode ser inibido por estados fisiológicos (i. e., o ambiente no qual as células são cultivadas) enquanto que, em alguns casos, devem ser aplicadas estados não fisiológicos. A disrupção total de células deve ser evitada, se possível, dado que esta liberta ADN e proteínas celulares do hospedeiro que necessitam de ser removidas mais tarde no processo de purificação. É conhecido, na técnica que um aumento nas concentrações de sal (por exemplo, NaCl), acompanhado da adição de detergente e/ou através do ajuste de um pH específico pode, em alguns casos, libertar as proteínas ligadas. Por exemplo, K. Berman et al., Mol. Cell Biol. Res. Com. 4, 337-344 (2001) enfatizam que, na produção de homólogos de p38 em células HEK293, as células poderiam ser estimuladas com sorbitol ou NaCl a 0,7 M, durante 10 minutos, antes da recolha. A. B. Vaandrager et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, N° 12, p. 7025-7029 (1996) divulgam que a cultura de células HEK293, expressando cGKII de rato, resultou na recuperação de 90-95% do cGKII expresso e que a enzima poderia ser libertada das membranas por uma combinação de detergente (Triton® X-100 a 1%) e elevado teor de sal (NaCl a 0,5 M) mas não por detergente ou elevado teor de sal isoladamente. A. Denys et al., Biochem J.r 336, 689-697 (1998) divulga que uma proteína foi libertada de células de linfócitos T humanos, utilizando um processo de lavagem incluindo NaCl a 0,6 M. Contudo, nem toda a (70%) proteína pôde ser libertada, mesmo se a concentração de NaCl fosse aumentada para 1 M. Além do mais, pH baixo, tal como pH 4, não libertou a totalidade da proteína ligada (34%), ao passo que uma combinação de pH baixo e concentração de sal aumentada (NaCl a 0,5 M, glicina a 0,2 M, 4 ρΗ 4) libertou toda a proteína ligada. G. Grass et al., Infection and Immunity, p. 213-228 (2004) divulgam que, na expressão bacteriana de metaloproteinases, o processo de lavagem com tampão de elevada força iónica (NaCl a 3 M) não libertou a proteína. Contudo, a proteína poderia ser libertada por butanol ou um detergente. C. M. Mounier et al., J. Biol. Chem. 279, N° 24, p. 25024-25038 (2004) faz referência, para células HEK293 e CHO que proteínas expressas pelas referidas células se ligam à superfície celular. Isto poderia ser inibido por concentração de sal aumentada (NaCl), na gama de 0,12 a 1 Μ. A 1 M, toda a proteína parecia ser libertada. Num exemplo com HEK293, as células foram tratadas com NaCl a 1 M e a proteína libertada aumentou três vezes. M. Fannon et al., Biochemistry 39, 1434-1445 (2000) fazem referência à ligação de proteínas a fibroblastos. Foram comparados três processos de lavagem diferentes, elevado teor de sal (NaCl a 2 M, pH 7,4), pH baixo (acetato de sódio a 20 mM, pH 4) e elevado teor de sal, pH baixo (NaCl a 2 M, pH 4). Todos os tampões, sob determinadas circunstâncias, libertam a proteína. Elevado teor de sal e pH baixo é eficaz em todas as experiências. Μ. E. Zuber et al., J. Cell Physiology, 170:217-227 (1997) faz referência que a ligação de proteína à superfície de células CHO poderia ser inibida por um tratamento de elevado teor de sal/ρΗ baixo (NaCl a 2 M, pH 4). J. Norbeck et al., FEMS Microbíology Letters 137, p. 1-8 (1996) faz referência sobre células de levedura que foram submetidas a NaCl a 0,4 M, num período de 1,5 h durante o crescimento e sobre os seus efeitos sobre a taxa de expressão de diversas proteínas. Finalmente, P. M. Dey et al., Planta 202:179-187 fazem referência ao isolamento de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina de células de batata cultivadas em suspensão, através da lavagem das células de batata com uma solução contendo CaCl2 a 50 mM e ácido ascórbico a 2 mM. 5

Considerando o acima mencionado, é evidente que um método geral para aumentar a recuperação de proteínas recombinantes em sistemas de expressão eucarióticos ou de mamífero ainda é desejável. São de particular interesse, os métodos para a produção isenta de soro de proteínas que são necessárias para aplicações médicas (tal como proteínas plasmáticas, incluindo factores de coagulação sanguínea que são requeridos para o tratamento de distúrbios hemofílicos) e, para as quais, o produto isento de soro é desejável, por razões óbvias. Os hemofílicos sofrem de morbidade hemorrágica, causada pela função perturbada de componentes proteicos da cascata de coagulação do sangue. Dependendo do factor de coagulação afectado, a hemofilia é classificada em dois tipos, hemofilia A e B, em ambos os quais, a conversão de fibrinogénio solúvel num coágulo de fibrina insolúvel é inibida. São distúrbios genéticos recessivos ligados ao cromossoma X afectando, principalmente, a população masculina. A hemofilia A afecta 1-2 indivíduos por 10000 homens. Trata-se de um distúrbio genético que afecta a capacidade do sangue formar um coágulo eficaz e resulta, desse modo, em hemorragia prolongada. Uma vez que a hemofilia A é um distúrbio recessivo ligado ao cromossoma X, são afectados, quase exclusivamente, homens. É causada pela deficiência ou ausência de factor VIII, uma glicoproteína muito grande (Mr de, aproximadamente, 330 kDa (Furie B., Furie B.C., Cell (1988) 53, 505-518; a sua sequência é proporcionada na SEQ ID N° 2)) que representa um importante elemento da cascata de coagulação do sangue. A sequência polipeptídica de fviii pode ser subdividida em três regiões, uma região N-terminal, consistindo nos denominados domínios Al e A2, uma região de domínio B central e uma região C-terminal composta pelos domínios A3, Cl e C2. Na 6 coagulação sanguínea, o factor VIII ocorre como um precursor inactivo. Está ligado fortemente e não covalentemente ao Factor de von Willebrand (vWF) que actua como uma proteína transportadora estabilizante. A clivagem proteolítica do factor VIII por trombina em três posições específicas (740, 1372, 1689; ver SEQ ID N° 2) conduz à sua dissociação de vWF e liberta a função procoagulante dentro da cascata. Na sua forma activa, o factor VIII funciona como um cofactor para o factor IXa acelerando, desse modo, a activação proteolítica do factor X em várias ordens de grandeza. A hemofilia B ocorre em cerca de 1 de 25000 de homens. É caracterizada por uma deficiência do factor IX de protease de serina (factor Christmas; ver SEQ ID N° 11). O gene codificando o factor IX está localizado no cromossoma X (lócus Xq27), fazendo a hemofilia B um distúrbio recessivo ligado ao cromossoma X. Este polipéptido de 415 aminoácidos é sintetizado no fígado como uma glicoproteína de 56 kDa. Para alcançar a sua função apropriada, é requerida uma etapa de carboxilação pós-traducional que apenas ocorre na presença de vitamina K.

Tradicionalmente, o tratamento destes tipos de distúrbios hemorrágicos envolve infusões de concentrados proteicos derivados de plasma humano do factor(es) em falta, í. e., terapia de substituição. Embora este método represente uma terapia eficiente para hemofílicos, comporta o risco de transmissão de diversos agentes infecciosos, tais como vírus causando hepatite ou SIDA, ou factores tromboembólicos. Alternativamente, foram descritas diversas técnicas de adn recombinante para a produção de factores de coagulação. Os correspondentes ADNc de factor VIII e factor IX de tipo selvagem foram isolados e clonados em vectores de expressão adequados 7 (documentos EP-A-160457; WO-A-86/01961, Patentes U.S. 4770999, 5521070 e 5521070) .

No caso do factor VIII, a expressão recombinante de subunidades para a produção de complexos mostrando actividade coagulante é conhecida na técnica (e. g., dos documentos EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, Patentes U.S. 5045455 e 5789203). Além do mais, foi descrita a expressão de versões truncadas de ADNc, parcialmente ou inteiramente desprovidas da sequência codificando para o dominio B altamente glicosilado, (e. g., nos documentos WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253 455, EP-A-254076, Patentes U.S. 4868112 e 4980456, documentos EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540, WO-91/09122 e WO 01/70968.

As seguintes passagens proporcionam detalhes sobre o factor VIII humano, em virtude de ser escolhido como um modelo de proteína recombinante para ilustrar a presente invenção. O gene codificando a proteína de factor VIII está situado na extremidade do braço comprido do cromossoma X, no lócus Xq28. Abarca mais de 186 kb e, deste modo, é um dos maiores genes conhecidos. O gene do factor VIII compreende 26 exões e a sua transcrição e subsequente processamento resulta num ARNm de 9 kb. A tradução deste ARNm conduz a uma cadeia polipeptídica de 2351 aminoácidos, contendo um péptido sinal de 19 e uma proteína madura de 2332 aminoácidos (ver SEQ ID Nos 1 e 2). A análise da estrutura primária, determinada a partir de ADNc do factor VIII clonado, revelou a organização em domínios estruturais ocorrendo na ordem Al-al-A2-a2-B-a3-A3-Cl-C2. 8

Os pequenos espaçadores al, a2 e a3 são denominados regiões acidicas contendo aglomerados de resíduos Asp e Glu e, na literatura, são frequentemente incluídos nos domínios A, resultando na estrutura ligeiramente simplificada de domínio A1-A2-B-A3-C1-C2. Após tradução e modificação pós-traducional, o produto de tradução primário, tendo uma massa molecular de, aproximadamente, 300 kDa, sofre proteólise intracelular quando abandona o aparelho Golgi, processando o produto de tradução primário numa cadeia pesada do terminal amino de 90-210 kDa (Al-al-A2-a2-B) e uma cadeia leve do terminal carboxilo de 80 kDa (a3-A3-Cl-C2), dando origem à molécula heterodimérica circulando no plasma sanguíneo. Nesta molécula heterodimérica, as cadeias pesada e leve do factor VIII estão não covalentemente ligadas por iões metálicos divalentes. A gama em pesos moleculares da cadeia pesada é o resultado de diferentes graus de clivagem proteolítica do domínio B. O domínio B mais ou menos truncado permanece conjugado ao domínio A2. O domínio B não parece ter uma influência sobre a actividade biológica da molécula FVIII. Isto é suportado pelo facto de que, durante a activação do FVIII, o domínio B integral é clivado. Imediatamente após a sua libertação para a corrente sanguínea, o heterodímero FVIII interage com uma proteína transportadora, denominada "factor de von Willebrand" (vWF). Esta interacção estabiliza a estrutura heterodimérica de FVIII, aumentando a meia-vida de FVIII na circulação sanguínea. Além disso, a formação de complexo com vWF impede a ligação prematura do factor VIII a membranas celulares e componentes do complexo tenase. Igualmente, a clivagem proteolítica da molécula FVIII é, em certa medida, impedida, com a molécula estando não covalentemente ligada a vWF. Contudo, a clivagem de trombina de FVIII é ainda possível e resulta numa perda de afinidade para vWF e na conversão de FVIII para a sua forma activa. 9

Como pôde ser verificado no parágrafo anterior, o factor VIII é uma glicoproteina complexa resultando num processo de produção dificil para manter a integridade e estabilidade estrutural da proteína. Especialmente, o domínio B albergando a totalidade de 19 de todos os 25 sítios de glicosilação ligada a N, torna a preparação da proteína de comprimento completo difícil, visto que a incorrecta glicosilação comporta sempre o risco de reacções imunogénicas contra o produto. A função do domínio B não está, ainda, completamente elucidada mas verificou-se que este domínio não é essencial para a função hemostática do factor VIII (Sandberg et al., Seminars in Hematology 38, Supl. 4, 24-31 (2001). Esta observação foi realizada tanto in vitro como in vivo para o factor VIII derivado de plasma humano que não tem o domínio B integral, assim como para múltiplas formas de moléculas de factor VIII recombinante, desprovidas do domínio B integral. O factor VIII de domínio B delecionado, derivado de plasma, pode ser purificado a partir de concentrados de factor VIII derivado de plasma, visto que estes concentrados contêm múltiplas formas activas de factor VIII cujo tamanho oscila entre 170 kDa a 280 kDa resultando, muito provavelmente, de diferenças no comprimento do domínio B ainda contido na proteína heterodimérica, suportando a verificação de que o domínio B não é essencial para a actividade biológica de factor VIII (Eriksson et al., Seminars in Hematology 38, Supl. 4, 24-31 (2001). Adicionalmente à sua estabilidade estrutural aumentada, a transfecção de células eucarióticas com ADNc do factor VIII de domínio B delecionado também produziu níveis de expressão melhorados da proteína (Herlitschka et al., Journal of Biotechnology 61, 165-173 (1998)). Estas características resultaram num produto de factor VIII recombinante de domínio B delecionado estando disponível no mercado, mostrando segurança e 10 eficácia comparáveis a factor VIII recombinante de comprimento completo e ao derivado de plasma.

Em geral, a deleção do domínio B foi realizada ao nível do ADNc, resultando na redução do tamanho global da molécula de factor VIII de comprimento completo em aproximadamente 40%, de 2332 aminoácidos para 1440 aminoácidos. A extremidade C da cadeia pesada e a extremidade N da cadeia leve foram, em alguns casos, unidas utilizando um curto adaptador de aminoácido substituindo o domínio B integral com os seus 908 aminoácidos, tal como nos documentos WO 00/49147 e WO 01/70968). A extremidade N do adaptador descrito nestas referências foi derivada da extremidade N do domínio B, ao passo que a extremidade C consiste numa sequência adaptadora especialmente concebida. À semelhança do factor VIII recombinante de comprimento completo e do factor VIII derivado de plasma, a maioria do factor VIII de domínio B delecionado é segregada como um heterodímero ligado não covalentemente das cadeias pesada e leve. Também é segregada uma pequena quantidade de factor VIII recombinante de domínio B delecionado de cadeia simples não clivado com um peso molecular de 170 kDa. Estudos extensos mostraram que a ligação a factor de von Willebrand e activação por clivagem de trombina, assim como uma interacção com diversas outras moléculas fisiologicamente relevantes, é comparável àquela descrita para o factor VIII humano natural.

Existem produtos de factor VIII recombinante. Como a abundância de transcritos de ARNm é muito baixa (apenas 10~5 do ARNm total do fígado) demorou muito a obter-se o transcrito de ADNc completo da proteína. Com esta importante inovação nos anos 1980 e a transfecção bem-sucedida de células CHO com o ADNc, o primeiro produto de factor VIII recombinante foi introduzido no 11 mercado em 1992. Desde então, as vendas anuais de preparações de factor VIII recombinante atingiram valores > 1 milhar de milhão de US$ (Schmid: Pocket Guide to biotechnology and genetic engíneeríng; Wiley-VCH (2003)). Actualmente, estão disponíveis no mercado quatro preparações de factor VIII recombinante diferentes. Os fabricantes destas quatro preparações abrangem, aproximadamente, 60% da procura para preparações de factor VIII nos países desenvolvidos. Contudo, a capacidade ainda não é suficiente e métodos para aumentarem o rendimento de um processo de produção para uma proteína recombinante serão, particularmente, benéficos para a produção de factor VIII recombinante.

Na produção de um FVIII de domínio B delecionado recombinante de acordo com o documento WO 01/70968, células HEK foram transformadas com um gene para FVIII, foram cultivadas células transformadas e FVIII foi segregado. Durante a recolha das células, a molécula FVIII e as células foram separadas utilizando centrifugação ou membranas filtrantes. O meio recuperado contendo FVIII isento de células foi, depois, adicionalmente processado através de etapas de purificação, de modo a remover proteínas de célula hospedeira, ADN e outros contaminantes. As taxas de recuperação do FVIII expresso, obtidas até agora, foram apenas moderadas. Além disso, B. Boedeker (Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27(4), 385-394 (2001)) proporciona um levantamento sobre a produção de preparações de factor VIII recombinante. Em geral, e especificamente para a produção recombinante de proteínas plasmáticas, tal como fviii, é muito importante optimizar o processo, de modo a alcançar uma elevada produtividade do produto. Isto é essencial para o custo do produto, visto que o processo de produção recombinante é relativamente honeroso e 12 sensível a perturbações (infecções, etc.), em virtude da sua origem biológica.

Sumário da Invenção

Em vista do anterior, é desejável estabelecer um método de produção isento de soro proporcionando rendimentos aumentados de proteína de factor VIII recombinante. Surpreendentemente, verificou-se que por intermédio de uma medida muito simples, o rendimento de uma proteína de factor VIII recombinante a ser recolhida do meio de cultura isento de soro pode ser aumentado, aproximadamente, 2 a 20 vezes. Deste modo, a presente invenção proporciona um método para melhorar o rendimento de proteínas de factor VIII recombinante, produzidas através da cultura de células de mamífero sob condições isentas de soro. Em maior detalhe, a presente invenção proporciona: (1) um método para a produção recombinante de, pelo menos, uma proteína alvo que é o factor VIII humano ou uma sua muteína de domínio B delecionado, em células de mamífero que compreende efectuar o cultivo de células de mamífero, sendo capazes de expressão da referida, pelo menos, uma proteína alvo em cultura em suspensão, sob condições isentas de soro e submeter uma suspensão das referidas células, antes de separação da proteína das células, a uma concentração não fisiologicamente aumentada de, pelo menos, uma substância iónica seleccionada de Acetato de NH4, MgCl2, kh2po4, Na2S04, KC1, NaCl, CaCl2, um aminoácido com uma cadeia lateral carregada e uma peptona; e 13 (2) um modo preferido, do método de acordo com a reivindicação (1) que compreende uma ou mais das seguintes etapas: (a) cultivar as células num meio de cultura; (b) separar o meio de cultura das células cultivadas, resultando em duas fracções separadas, uma fracção de células cultivadas e uma fracção de meio liquido; (c) colocar em contacto ou suspender a fracção de células cultivadas com uma composição de libertação, compreendendo uma concentração não fisiologicamente aumentada de, pelo menos, uma substância iónica, como definida acima em (1); (d) remover o meio de cultura das células, resultando em duas fracções separadas, uma fracção de células e uma fracção de composição de libertação; (e) isolar a proteína plasmática da fracção da composição de libertação; e (f) suspender a fracção de células de (d) acima em meio de cultura e recultivar. 0 âmbito da presente invenção reside na utilização de uma substância iónica que é adicionada à suspensão celular (ou directamente ao meio de cultura), imediatamente antes da recolha. A adição da substância iónica à suspensão celular permite métodos de isolamento disruptivos (onde as células são destruídas) como métodos onde a desejada proteína é segregada. No caso deste último, o método pode ser adaptado a um processo cíclico, depois de submeter a suspensão celular à substância iónica aumentada, a separação da suspensão na fracção celular e fracção líquida e o isolamento de uma desejada proteína a partir da fracção líquida, a fracção 14 como especificado celular pode ser recultivada, e. g., na forma de realização (2) acima.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Esquema mostrando um processo de cultura.

Figura 2: Fluxograma da implementação experimental para experiências de pequena escala. Primeiro, a suspensão celular e a substância iónica na forma líquida (tampão) são misturadas e incubadas, durante 1 h, à temperatura ambiente. Após a incubação, a viabilidade das células é verificada, antes das células serem separadas do meio, por meio de centrifugação. 0 sobrenadante (meio isento de células) é, depois, analisado para a proteína recombinante ou congelado para análise posterior. A Figura 3 mostra a análise de transferência de Western de material de pesquisa em bruto, recolhido com diferentes composições de libertação (Fig. 3A, pistaes 3 a 6, Fig. 3B, pistaes 2 a 8) que é comparado com marcadores moleculares (Figs. 3A e 3B, pista 1, respectivamente) e produto FVIII altamente purificado Fig. 3A, pista 2).

Figura 3A (método de Transferência de Western 1) : pista 1: Marcador de massa molecular (SeeBlue); pista 2: rFVIII padrão (Refacto, Wyeth), 200 iU/mL; pista 3: rFVIII de um processo de libertação, utilizando NaCl a 0,1 M (Exemplo 6A), 9 IU/mL; pista 4: rFVIII de um processo de libertação, utilizando NaCl a 0,55 M, 18 IU/mL (Exemplo 15 6D); pista 5: rFVIII de um processo de libertação, utilizando NaCl a 0,55 M, 16 IU/mL (Exemplo 6A); pista 6: rFVIII de um processo de libertação, utilizando NaCl a 0,55 M, 13,6 IU/mL (Exemplo 7B).

Figura 3B (método de Transferência de Western 2, elevada sensibilidade): pista 1: Marcador de massa molecular; pista 2: Suspensão celular de referência de FVIII a 1 IU/mL; pista 3: Suspensão celular de referência de FVIII a 0,2 IU/mL; pista 4: rFVIII de um processo de libertação, utilizando CaCl2 a 0,2 M, 1,6 IU/mL (Exemplo 6A); pista 5: rFVIII de um processo de libertação,

utilizando CaCl2 a 0,2 M, 0,73 IU/mL (Exemplo 6A); pista 6: rFVIII de um processo de libertação, utilizando CaCl2 a 0,1 M, 1,73 IU/mL (Exemplo 8A); pista 7: rFVIII de um processo de libertação, utilizando CaCl2 a 0,1 M, 0,87 IU/mL (Exemplo 8A); pista 8: rFVIII de um processo de libertação, utilizando NaCl a 0,55 M, 1,81 IU/mL (Exemplo 6A). A Fig. 4 mostra a estrutura molecular comum de pTGF8-3 e pTGF8-2hyg-s, ADN circular de 10698 pb, as suas sequências de ADN exactas são proporcionadas na SEQ ID Nos 3 e 5, respectivamente (para a proteína de factor VIII codificada pela referida sequência de ADN, ver SEQ ID Nos 4 e 6, respectivamente).

Descrição Detalhada da Invenção O termo "rendimento", dentro do significado da invenção, é definido como a alteração na libertação de FVIII, comparada com 16 o rendimento obtido utilizando processos de recolha normais (recolha sem adição de substâncias carregadas) ou comparada com processos de recolha com adição de niveis de sal fisiológicos ou inferiores, NaCl a 0,1 M típico foi adicionado ao meio de cultura celular. O termo "isento de soro" refere-se à transfecção e cultura de células em meio contendo suplementos adequados, excepto qualquer género de soro. Os suplementos são seleccionados de aminoácidos, lípidos, oligoelementos, vitaminas e outros componentes estimuladores do crescimento. Frequentemente, as condições de cultura "isentas de soro", são ainda mais estringentes e, se não for adicionada proteína exógena, ou já incluída no meio, o meio é denominado "isento de proteína". O termo "proteína de factor VIII" inclui proteínas sintetizadas de modo natural que são codificadas por genes da célula cultivada, assim como proteínas recombinantes segregadas por células. Proteínas recombinantes são aquelas que são codificadas por transgenes introduzidos dentro das células, por técnicas de biologia molecular. De acordo com a invenção, "proteína de factor VIII" inclui proteínas de origem humana e animal, mas também proteínas de outras fontes, tais como plantas, insectos, etc. e proteínas mutadas, artificiais, sintéticas, de fusão ou quiméricas. Em particular, "proteína de factor VIII" inclui uma proteína de factor VIII humano (ver SEQ ID N° 2 para a proteína de comprimento completo) ou uma sua muteína de domínio B delecionado.

Uma particular muteína de factor VIII, na qual o domínio B entre as posições Arg740 e Glul649 foi substituído por um péptido adaptador rico em Arg tendo, pelo menos, 3 resíduos Arg 17 e compreendendo 10 a 25 resíduos de aminoácidos (em que a referida numeração de factor VIII é relativa à sequência de factor VIII de tipo selvagem maduro, mostrada na SEQ ID N° 2) é divulgada no documento WO 01/70968 que é aqui incorporado na sua totalidade. Prefere-se que o péptido adaptador rico em Arg tenha 14 a 20 resíduos de aminoácidos, enquanto um adaptador compreendendo: a sequência de aminoácidos SFSQNSRH (SEQ ID N° 7), e/ou a sequência de aminoácidos QAYRYRRG (SEQ id n° 8), e/ou a sequência de aminoácidos SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID N° 9) é particularmente preferido. É muito preferido, uma muteina de factor viu que compreende os aminoácidos 1 a 1440 da SEQ ID N° 4 ou, ainda mais, uma muteina de factor VIII tendo a SEQ ID N° 4. A proteína de factor VIII ou muteina de factor VIII, como definidas aqui acima, podem ter uma ou mais das seguintes (adicionais) mutações (a), (b) e (c): (a) Vai na posição 162 foi substituído por um resíduo de aminoácido neutro, seleccionado de Gly, Ala, Leu, Ile, Met e Pro; (b) Ser na posição 2011 foi substituído por um resíduo de aminoácido hidrófilo, seleccionado de Asn, Thr e Gin; e (c) Vai na posição 2223 foi substituído por um resíduo de aminoácido acídico, seleccionado de Glu e Asp (novamente, a referida numeração de factor VIII é relativa à sequência de factor VIII de tipo selvagem maduro mostrada na SEQ ID N° 2) . 18 É preferido, uma proteína de factor VIII ou muteína de factor VIII que tenha, pelo menos, uma das mutações (a) e (b) ou tenha todas as três mutações (a), (b) e (c).

Além disso, são mutações preferidas em (a) a (c), as seguintes: (a) vai na posição 162 foi substituído por Ala, (b) Ser na posição 2011 foi substituído por Asn e/ou (c) Vai na posição 2223 foi substituído por Glu. É particularmente preferido, uma muteína de factor viu que compreende os aminoácidos 1 a 1440 da SEQ ID N° 6, ou ainda mais, uma muteína de factor VIII tendo a SEQ ID N° 6. Não existe limitação sobre os vectores para a expressão das proteínas da invenção. Vectores adequados incluem vectores da série pUC, tal como pUC19 (MBI Fermentas) e suas modificações, como utilizados no documento WO 01/70968 que é aqui incorporado na sua totalidade. Os vectores para as muteínas de factor VIII particularmente preferidas mencionadas aqui acima, são pTGF8-3 e pTGF8-2hyg-s, cuja estrutura é mostrada em Fig. 4 e as suas sequências de ADN exactas são proporcionadas na SEQ ID Nos 3 e 5, respectivamente. A preparação dos referidos vectores é divulgada no documento WO 01/70968.

Os termos "células de mamífero" e "célula de mamífero" de acordo com a invenção, incluem células isoladas ou tecido isolado de mamíferos (viz.r humanos, roedores, etc.). Células de mamífero particularmente preferidas incluem células animais e humanas que são mantidas em meio de cultura. São particularmente preferidas para a produção de proteínas humanas, tal como proteínas plasmáticas humanas, células humanas, tal como células primárias ou células imortalizadas, tais como células de rim, bexiga, pulmão, fígado, músculo cardíaco, músculo liso, ovário 19 ou gastrointestinais. São muito preferidas células de rim fetal humano, tais como 293 (DSM ACC 305), 293T (DSM ACC 2494) e 293F e 293H (Invitrogen 11625-019 e 11631-017, respectivamente), etc. Outras células particularmente adequadas são Cos, CHO, hibridoma, mieloma, tais como células NSO e células de insecto. São particularmente preferidas células das anteriores que são adaptadas para serem cultivadas sob condições isentas de soro.

Numa forma de realização preferida, as células de mamífero, incluindo aquelas anteriormente mencionadas, são transfectadas de modo estável com uma cassete de expressão transportando o gene codificando para a proteína ou proteína plasmática. O aumento (ajuste) da concentração da substância iónica na suspensão celular é efectuado através da adição de uma composição de libertação à suspensão celular, compreendendo a referida, pelo menos, uma substância iónica. A composição de libertação pode ser adicionada à suspensão celular na forma sólida ou liquida. Contudo, é preferido, que a composição de libertação seja adicionada à suspensão celular até 72 h, de um modo preferido, 12-24 h e, de um modo muito preferido, 1 a 120 min., antes da separação da proteína. Num modo preferido, do método da invenção, a composição de libertação é directamente adicionada ao caldo de cultura ou adicionada às células ou a uma suspensão das células isoladas a partir do caldo de cultura. A composição de libertação pode ser adicionada numa etapa ou pode ser gradualmente adicionada, de modo a alcançar a concentração final no espaço de 1-4300 minutos. A composição de libertação também pode ser adicionada com a técnica de diafiltração. "Concentração não fisiologicamente aumentada de uma substância iónica" refere-se a uma concentração do substrato 20 iónico que é superior à concentração na célula/no meio de cultura opcional da célula em condições normais (por exemplo, in vitro) .

As "substâncias iónicas", de acordo com a invenção incluem

Acetato de nh4, MgCl2, KH2P04, Na2S04, KC1, NaCl, CaCl2, um aminoácido com uma cadeia lateral carregada, tal como aminoácidos básicos, incluindo aminoácidos seleccionados de arginina, histidina, lisina, etc., e peptona, tal como uma peptona de soja, de um modo preferido, tendo um peso molecular médio abaixo de 1000 g/mol, de um modo preferido, entre 500 e 600 g/mol.

Numa forma de realização preferida da invenção, a substância iónica é adicionada de modo a alcançar-se o estado de equilíbrio dentro da proteína e superfície celular, suficiente para dissociar a ligação iónica e libertar proteínas ligadas da superfície celular, sem destruir a célula. De acordo com a invenção, pelo menos, uma substância iónica, de um modo preferido, duas e, de um modo muito preferido, três ou mais substâncias iónicas é/são adicionadas.

Além do mais, prefere-se que nenhum detergente não iónico ou apenas pequenas quantidades de detergentes não iónicos sejam adicionadas à suspensão e/ou estejam presentes na composição de libertação. É particularmente preferido, que a composição de libertação seja isenta de detergentes não iónicos. A composição de libertação, como definida aqui acima, pode compreender, adicionalmente, uma substância de tamponação adicional, de modo a estabilizar e manter a suspensão a um determinado pH. Deve ser considerado que algumas das substâncias iónicas anteriormente definidas possuem excelentes propriedades de tamponação. Deste 21 modo, se forem utilizadas substâncias iónicas não tendo nenhumas ou apenas fracas propriedades de tamponação, são requeridas tais substâncias de tamponação adicionais. A escolha de substâncias de tamponação adicionais adequadas certamente depende do sistema celular e do pH a ser mantido. Tais substâncias de tamponação adicionais incluem hepes, MES, TRIS, etc. Em geral, o pH da suspensão celular, quando submetido à concentração aumentada da, pelo menos, uma substância iónica é na gama de estabilidade para a proteína seleccionada, para FVIII é de cerca de 6,0 a 7,5.

Numa forma de realização preferida da invenção, a substância iónica e a sua concentração é seleccionada de modo que as células possam ser continuamente cultivadas sob libertação simultânea da proteína. De um modo preferido, a proteína é, depois, removida do caldo de cultura utilizando, por exemplo, uma centrífuga ou diafiltração contínua sobre uma membrana microfiltrante. Isto possibilita a protecção de proteínas sensíveis da degradação proteolítica, etc., em virtude de rápida remoção do caldo de cultura.

Numa forma de realização particularmente preferida, a substância iónica e sua concentração são seleccionadas de maneira a que a viabilidade das células seja mantida. Também através da recolha da proteína, a viabilidade das células é mantida, após recolha, a concentração não naturalmente aumentada da substância iónica é reduzida ou as células são transferidas para dentro do novo meio de cultura, de modo a possibilitar um processo de produção cíclico da proteína. Isto possibilita que o processo reivindicado seja corrido ciclicamente, como mencionado na forma de realização (2) acima. 22

Além disso, o modo preferido, de adição e a concentração preferida da substância iónica preferida de NaCl, KC1, CaCl2, arginina, histidina e lisina são os seguintes:

Pode ser adicionado NaCl, de modo a elevar a concentração na suspensão para, pelo menos, 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,2 e 2 M, de um modo mais preferido, desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,5 M. Em particular, a sua concentração na suspensão pode ser na gama de 0,2 M até saturação da solução, de um modo preferido, é na gama de 0,2 a 2 M, ou 0,2 a 1 M, ou 0,2 a 0,8 M, ou 0,2 a 0,6 M, ou 0,2 a 0,5 M, ou 0,4 a 1 M, ou 0,4 a 0,8 M ou é cerca de 0,5 M. É adicionado KC1, de modo a elevar a sua concentração na suspensão para, pelo menos, 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,2 a 2 M, de um modo mais preferido, desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,5 M. Em particular, a sua concentração na suspensão pode ser na gama de 0,2 M até saturação da solução, de um modo preferido, é na gama desde 0,2 a 2 M; ou 0,2 a 1 M, ou 0,2 a 0,8 M, ou 0,2 a 0,6 M, ou 0,2 a 0,5 M, ou 0,4 a 1 M, ou 0,4 a 0,8 M ou é cerca de 0,5 M.

Pode ser adicionado CaCl2, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,01 a 0,5 M, de um modo mais preferido, desde 0,05 a 0,2 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,1 M. Em particular, a sua 23 concentração na suspensão pode ser na gama desde 0,01 a 0,1 M, ou 0,05 a 0,15 M ou é cerca de 0,1 M.

Pode ser adicionada arginina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão para, pelo menos, 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,2 e 2 M, de um modo mais preferido, desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,8 M. Em particular, a sua concentração na suspensão é na gama de 0,2 M até saturação da solução, de um modo preferido, pode ser na gama de 0,2 a 2 M, ou 0,4 a 1,5 M, ou 0,4 a 1,2 M, ou 0,4 a 1,0 M, ou 0,4 a 0,8 M, ou 0,6 a 0,9 M, ou 0,6 a 0,8 M ou é cerca de 0,75 M.

Pode ser adicionada lisina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão para, pelo menos, 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,2 e 2 M, de um modo mais preferido, desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,8 M. Em particular, a sua concentração na suspensão é na gama de 0,2 M até saturação da solução, de um modo preferido, pode ser na gama desde 0,2 a 2 M, ou 0,4 a 1,5 M, ou 0,4 a 1,2 M, ou 0,4 a 1,0 M, ou 0,4 a 0,8 M, ou 0,6 a 0,9 M, ou 0,6 a 0,8 M ou é cerca de 0,75 M.

Pode ser adicionada histidina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão para, pelo menos, 0,01 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,01 a 0,3 M, de um modo mais preferido, desde 0,02 a 0,3 M. Em particular, a sua concentração na suspensão é na gama de 0,02 M até saturação da solução, de um modo preferido, pode ser na gama de 0,02 a 0,3 M, ou 0,03 a 24 0,3 M, ou 0,05 a 0,3 M, ou 0,1 a 0,3 M, ou 0,2 a 0,3 M ou é cerca de 0,3 M. A mistura de péptidos e/ou aminoácidos ou a peptona é adicionada, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para, pelo menos, 0,01% (p/p), de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,1 a 20% (p/p) de peptona. Para um processo cíclico é particularmente preferido, utilizar uma concentração de peptona de 0,2 a 10% (p/p), de um modo preferido, uma concentração de peptona de cerca de 5% (p/p). Para um processo não cíclico (i. e., em descontínuo), é preferido, utilizar uma concentração de peptona de 10% (p/p) ou superior, de um modo preferido, uma concentração de peptona de cerca de 20% (p/p).

Numa forma de realização preferida do método das formas de realização (1) a (2), como anteriormente definidas, duas ou mais substâncias iónicas são misturadas entre si, a concentração de cada das substâncias iónicas adicionadas é dividida com a quantidade total de substâncias iónicas adicionadas, de modo a execer a mesma capacidade de libertação que quando é adicionada apenas uma substância iónica. É particularmente preferido, no método, como anteriormente definido que as substâncias iónicas que são misturadas entre si sejam seleccionadas de, pelo menos, 3 substâncias iónicas diferentes, seleccionadas de um aminoácido com grupo R carregado (tais como arginina, histidina ou lisina) numa concentração variando desde 0,05 a 0,2 M; NaCl e KC1 numa concentração variando desde 0,1 a 0,2 M e CaCl2 numa concentração variando desde 0,01 a 0,05 M. 25 A concentração de uma mistura de substâncias iónicas necessária para se alcançar a libertação de proteínas desejada está dependente principalmente de dois factores, o número de substâncias iónicas e a concentração de cada substância iónica. Deste modo, se forem misturadas mais substâncias iónicas, é necessária uma menor concentração de cada para se alcançar a máxima libertação de produto. Em princípio, esta pode ser calculada numa base matemática. Contudo, em casos específicos, as substâncias iónicas podem exercer efeitos combinatórios que baixam a necessidade de concentração de substâncias iónicas, em comparação com uma estimativa teórica.

Se for utilizada uma combinação de NaCl e lisina na composição de libertação, são utilizadas, de um modo preferido, as seguintes concentrações: NaCl, pelo menos, 0,1 M, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 0,1 a 1 M, de um modo mais preferido, desde 0,2 a 0,5 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,25 M; lisina, pelo menos, 0,1 M, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 0,1 a 1 M, de um modo mais preferido, desde 0,2 a 0,5 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,4 M.

Se for utilizada uma combinação de NaCl, histidina e CaCl2 na composição de libertação, são utilizadas, de um modo preferido, as seguintes concentrações: NaCl, pelo menos, 0,05 M, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 0,05 a 0,6 M, de um modo mais preferido, desde 0, 075 a 0,35 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,1 M; histidina, pelo menos, 0,01 M, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 0,01 a 0,3 M, de um modo mais preferido, desde 0, 025 a 0,15 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,05 M; e CaCl2, pelo menos, 0,005 M, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 26 0,01 a 0,25 M, de um modo mais preferido, desde 0,025 a 0,15 M, de um modo muito preferido, a cerca de 0,05 M.

Verificou-se que, por intermédio de uma combinação de substâncias iónicas, é requerida apenas uma baixa concentração de cada substância iónica e, com isso, as propriedades de libertação de proteína da composição são mantidas e são proporcionadas condições de cultura aceitáveis para as células. Numa forma de realização preferida adicional, a composição de libertação iónica é seleccionada de modo a que, pelo menos, um componente actue como um estabilizador para que a proteína libertada seja activa antes e/ou após a separação de proteína e células.

Numa forma de realização preferida adicional do método das formas de realização (1) a (2), como anteriormente definidas, a cultura das células é efectuada em cultura em suspensão.

Além do mais, prefere-se que a separação do meio das células cultivadas nas etapas (b) e (d) seja efectuada por centrifugação, filtração, diafiltração, filtração convencional ou microfiltração. Pode ser utilizado um método que o especialista na técnica esteja ciente, para o isolamento da proteína plasmática do meio e sua purificação. Particularmente, este pode ser efectuado através da utilização de, pelo menos, uma técnica seleccionada de cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de afinidade, precipitação de proteína, trocas de tampão, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrófoba, meios de cromatografia hidrófoba/permuta iónica de modo misto, cromatografia quelante, cromatografia de afinidade por afinidade a hidrato de carbono como lectina ou heparina, cromatografia de exclusão de tamanho, electroforese, 27 tais como diálise, diferentes agentes de precipitação, polietilenoglicol, sulfato de amónio, etanol, adsorção sobre hidroxiapatite, adsorção sobre membrana filtrante, etc. Para um especialista na técnica, é facilmente evidente que o transportador (sobre cuja parte o ligando activo é conjugado) dentro do campo da cromatografia pode ser compreendido por diferentes tipos de transportadores como resinas, partículas, esférulas, membranas, fibra oca, etc., e que o transportador pode consistir em diferentes materiais, como agarose reticulada, celulose, polissulfona, sílica, etc.

Numa forma de realização preferida do método da invenção, o isolamento da proteína compreende uma etapa de captura, onde o produto é ligado e meios de cultura celular e solução de lavagem são removidos por lavagem, de um modo preferido, a etapa de captura utiliza meios de cromatografia. Além disso, as etapas (d) e (e) da forma de realização (2) podem ser efectuadas através da mistura da suspensão celular com um meio cromatográfico que se liga ao produto e, a seguir, os meios de cromatografia são removidos da suspensão celular.

Além do mais, é preferido, que o método de acordo com a invenção, seja realizado sob condições estéreis, em particular, boas práticas de produção (GMP), visto o produto resultante ser uma matéria-prima farmacêutica. Pela mesma razão, prefere-se que o meio e/ou a proteína purificada sejam submetidos a uma etapa de inactivação de vírus.

De acordo com a invenção, a cultura é efectuada sob condições isentas de soro que facilitam o desenvolvimento do caldo de cultura e da solução da proteína plasmática. Em alguns casos, prefere-se cultivar sob condições isentas de proteína. 28

Outras formas de realização, e. g., um processo onde a substância iónica é uma mistura de péptidos e/ou aminoácidos (peptona), contudo, requerem a adição de proteínas funcionais, tais como factores de crescimento de insulina ou semelhantes a insulina, etc.

Finalmente, é preferido que a suspensão celular seja processada com um sistema de microf iltração, onde o poro no filtro foi escolhido de modo a reter as células e a suspensão celular é, a seguir, processada com a solução de libertação através do processo de diafiltração, onde a concentração da solução de libertação é gradualmente aumentada e o produto é recuperado no filtrado do referido sistema de microfiltração.

Em particular, a invenção relaciona-se com um método para aumentar a recuperação de produto durante a recolha de FVIII ou FVIII de domínio B delecionado, incluindo aquele definido aqui acima (a seguir abreviadamente referido como FVIII), a partir de células cultivadas. A recuperação de FVIII pode ser significativamente aumentada com medidas relativamente simples. Em virtude da adição de substâncias iónicas ao meio, antes da separação das células do meio de cultura, aumentando, desse modo, a concentração daquelas substâncias iónicas acima do nível fisiológico verificado em células - a recuperação de FVIII foi aumentada na gama de 200-2000% (2-20 vezes).

Uma explicação adequada parece ser que os grupos iónicos na membrana celular retardam as moléculas de factor VIII. Quando a concentração iónica no meio está aumentada, a qual está em contacto com as superfícies celulares, os iões neutralizam os iões na superfície celular e é libertado factor VIII. 29

Numa primeira forma de realização particularmente preferida das formas de realização (1) a (2) da invenção, o cloreto de sódio é aumentado para NaCl a 0,5 M, antes da remoção das células dos meios de cultura. Mostrou-se que com tal composição de libertação, a recuperação de FVIII nos meios de cultura isentos de células, foi aumentada 20 vezes, em comparação com a utilização de cloreto de sódio a 0,1 M, enquanto a libertação de proteínas de célula hospedeira foi apenas ligeiramente aumentada. Cloreto de sódio a 0,5 M não é um ambiente normal para células (condições fisiológicas de sal são comparáveis com cerca de 0,15 M de cloreto de sódio), mas o tratamento não destruiu as células. Contudo, se a concentração de sal for, adicionalmente, aumentada até 1 M de cloreto de sódio, mais de 80% das células foram destruídas (lise) e a quantidade de proteínas de célula hospedeira foi quase duplicada, enquanto a concentração de FVIII é, aproximadamente, a mesma como quando se utiliza concentração de sal inferior (0,5 M).

Numa segunda forma de realização particularmente preferida da invenção, duas ou mais substâncias iónicas são misturadas entre si, de modo a alcançar-se a libertação de produto. Por exemplo, foi mostrado que se cloreto de sódio a 0,25 M for misturado com 0,25 M de lisina, aquele exerce as mesmas propriedades de libertação de produto e viabilidade celular que NaCl a 0,5 M. Noutro exemplo, NaCl a 0,17 M, lisina a 0,17 M e sorbitol a 0,3 M foram utilizados como composição de libertação. Esta composição proporcionou libertação de produto ligeiramente inferior, em comparação com NaCl a 0,5 M, mas ilustra a enorme quantidade de possibilidades para escolher e combinar substâncias de libertação iónicas entre si, alcançando propriedades semelhantes de libertação de produto. Como também mostrado, podem ser adicionados diferentes estabilizantes (não 30 iónicos) à composição de libertação, sem inibição das propriedades de libertação.

Numa terceira forma de realização particularmente preferida, o CaCl2 é aumentado para uma gama desde 0,05 a 0,2 M, de um modo preferido, 0,1 M. Mostrou-se, em exemplos experimentais que o CaCÍ2 é superior em comparação com a maioria das outras substâncias iónicas, no que respeita a libertação de produto, proteína de célula hospedeira e ADN. Adicionalmente, a concentração óptima necessária para libertação de produto foi significativamente inferior, em comparação com a maioria das outras substâncias iónicas e isto pode ter vantagens consideráveis, visto que uma etapa de permuta iónica é frequentemente utilizada como etapa de captura para processamento adicional. Deste modo, uma força iónica inferior significa, em muitos casos, menos diluição antes da aplicação das proteínas à etapa de captura. À mesma recuperação de produto, foram alcançados valores 1-2 vezes superiores para pureza, em relação a proteínas de célula hospedeira e valores cerca de 10 vezes inferiores de ADN, em comparação com a composição de NaCl correspondente (0,55 M) . Também foi mostrado que, em alguns casos, a utilização de CaCl2 exerceu efeitos estabilizantes sobre o produto. Isto foi mostrado como actividade de produto mantida durante estudos de estabilidade, à temperatura ambiente, durante vários dias e que a razão entre a actividade biológica do produto comparativamente com o teor antigénico de FVIII do produto, foi próxima de um.

Numa quarta forma de realização particularmente preferida da invenção, as excelentes propriedades de libertação de CaCl2 são combinadas com aquelas de outras substâncias de libertação. Por exemplo, uma composição de libertação compreendendo CaCl2 a 31 0,05 M, histidina a 0,05 Me NaCl a 0,1 M, mostrou propriedades de libertação semelhantes, em comparação a CaCl2 a 0,1 M isoladamente. Isto salienta, adicionalmente, as possibilidades no âmbito da invenção de se poder escolher uma composição de libertação óptima, dependendo das caracteristicas de produto e célula. A quantidade e tipo de impurezas obtidas durante o processo de recolha podem ter importância para o processamento e purificação adicional do produto. Por exemplo, se a quantidade de proteases for aumentada, esta pode contribuir para degradação do produto e pode ser necessário adicionar etapas adicionais de purificação, de modo a concretizar a procura muito elevada para pureza para produtos recombinantemente produzidos. Durante as experiências, mostrou-se que a quantidade de proteínas e ADN de célula hospedeira libertada, também está dependente da substância iónica escolhida.

Com o método da invenção é possível alcançar a elevada recuperação de proteína, em particular elevada recuperação de FVIII, sem destruição das células e limitando, deste modo, a quantidade de impurezas que saem em conjunto com o produto. Presentemente, os melhores resultados foram alcançados com cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lisina e uma combinação de cloreto de sódio e lisina, uma combinação de cloreto de cálcio e histidina e uma combinação de cloreto de cálcio, cloreto de sódio e histidina. Especialmente, a utilização de cloreto de cálcio mostrou resultados interessantes, visto que a concentração necessária para libertação de FVIII é muito inferior (cerca de 0,1 M) àquela das outras substâncias (cerca de 0,5-0,8 M) . Isto pode ser muito útil, visto que se mostrou que, utilizando cloreto de cálcio, se 32 liberta uma quantidade inferior de proteínas e ADN de célula hospedeira. Outra importante forma de realização da invenção é a possibilidade de reutilização das células para produção adicional de proteínas, após ter sido utilizado o processo de libertação de sal. 0 ambiente salino é removido e as células são dissolvidas em meios de cultura normais e podem continuar a produzir.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar a invenção. Os exemplos não abrangidos pelo âmbito das reivindicações são mantidos para fins ilustrativos.

Exemplos

Materiais e Métodos

Factor VIII: C, Método de rastreio baseado em Coatest: Este método é baseado no princípio de duas fases e foi realizado utilizando a técnica de microplaca. Na fase um, é produzido factor X activado (Xa) por meio da via intrínseca onde o factor VIII: C actua como um cofactor. Na fase dois, o Factor Xa é, depois, determinado através da utilização de um substrato cromogénico sintético, S-2222, na presença de um inibidor de trombina 1-2581, de modo a prevenir hidrólise do substrato por trombina. A reacção é interrompida com ácido e o VIII:C que é proporcional à libertação de pNA (para-nitroanilina), é determinado fotometricamente, a 405 nm, contra um branco. O método cumpre os requisitos da Farmacopeia Europeia. A unidade de factor VIII: C é expressa em unidades internacionais (IU), como definidas no presente International Concentrate Standard (IS) estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A 33 rotina utilizando tampão contendo BSA a 1%, em vez de plasma hemofílico grave para pré-diluições, foi validada. Ver também as referências de literatura (1-4) anexas nas referências.

Proteína total (Determinação de proteína por HPLC de fase reversa): Um sistema de HPLC, equipado com um detector de UV e uma coluna TSK-gel Octadecyl-NPR (partículas não porosas de 2,5 pm, 35 x 4,6 mm I.D., de Tosohaas, Stuttgart, Alemanha) é utilizado para determinação de proteína. A coluna, corrida a 45 °C, é equilibrada com acetonitrilo a 5% em ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% (fase móvel A). Para eluição, é utilizado acetonitrilo a 90% em TFA a 0,1% (fase móvel B) no gradiente linear (0-0,5 min. 0% B, 0,5-4 min. 0-100% B, 4-5 min. 100% B, 5-7 min. 0% B). O volume de injecção é 200 pL e o caudal é 1,5 mL/min. A detecção é efectuada através da medição da absorvência UV, a 280 nm. É utilizada albumina de soro bovino (BSA) a 10-100 pg/mL (10-20-50-100 pg/mL, n=4) para a curva-padrão. O padrão BSA é diluído em acetato de amónio a 200 mM e Tween® 80 a 0,01% e, se necessário, também as amostras são diluídas nesta solução. A concentração de proteína nas amostras desconhecidas é calculada a partir da curva-padrão de BSA que proporciona sempre um coeficiente de correlação linear (r) de > 0,99.

Pureza (FVIII:C/Proteína total): A pureza para uma amostra é calculada tomando o valor alcançado a partir da análise de fviii:C e dividindo-o com o valor alcançado a partir da análise de proteína total. 34

Análise de antigénio de Factor VIII FVIII:Ag): Uma placa de microtitulação é revestida com um anticorpo monoclonal específico para um tipo de determinante antigénico da cadeia leve da proteína de factor VIII na amostra. Após incubação com amostras, é adicionado um anticorpo monoclonal conjugado a peroxidase. Este anticorpo liga-se a outro determinante antigénico da cadeia leve da proteína de factor VIII formando, deste modo, um complexo em sanduíche. A actividade enzimática que é proporcional ao teor de factor VIII :Ag na amostra é, depois, determinada através da acção do substrato 3,3 ',5,5'-Tetrametilbenzidina. A reacção é interrompida com ácido e a cor é lida fotometricamente, a 450 nm, contra um branco.

Actividade específica (quociente FVIII:C/FVIII:Ag): A actividade específica de uma amostra de FVIII é calculada tomando o valor alcançado a partir da análise de FVIII:C e dividindo-o com o valor obtido a partir da análise de FVIII:Ag. O valor resultante mostra a relação entre FVIII biologicamente activo e proteína de FVIII total (incluindo as formas activa e inactiva). Para uma proteína totalmente activa, o quociente FVIII:c/FVIII:Ag é 1.

Viabilidade (células vivas/células mortas+células vivas, %) : A suspensão celular é diluída com uma solução de coloração de azul de tripano a 0,4% e as células são, a seguir, contadas num microscópio de contraste de fase invertida tornando, deste modo, possível determinar a concentração celular. Em virtude da aparência das células, também é possível fazer uma distinção entre células vivas e mortas. A viabilidade é calculada através 35 da divisão da quantidade de células vivas com a quantidade total de células e multiplicando os resultados por 100, de modo a receber o valor de percentagem de viabilidade. O método de viabilidade é, adicionalmente, descrito em R.I. Freshney, Culture of animal cells, 4a ed., p. 183-189, Wiley-Liss (2000). Método de transferência de Western 1, distribuição de massa molecular de FVIII: Proteínas e péptidos, em preparações de factor VIII, são separados de acordo com a massa molecular, por electroforese em gel de poliacrilamida e dodecilssulfato de sódio (SDS) (PAGE), sob condições redutoras. A seguir, as proteínas são transferidas electroforeticamente da matriz do gel para uma membrana de nitrocelulose que é, subsequentemente, incubada com um agente de bloqueio. São, depois, adicionados anticorpos policlonais de ovelha dirigidos para a molécula de factor VIII intacta, seguido de um anticorpo secundário que é especifico para a parte Fc de anticorpos de cabra/ovelha. Como uma terceira etapa, são adicionados complexos solúveis de anticorpo de cabra para peroxidase de rábano (HRP) e HRP. Os polipéptidos de FVIII são, depois, detectados por ocorrência de bandas azuis após incubação com o substrato 4-cloro-l-naftol. Método de transferência de Western 2, sensibilidade de 0,5 ΐυ/mL: Proteínas e péptidos em preparações de factor VIII são separados de acordo com a massa molecular por electroforese em gel de poliacrilamida de dodecilssulfato de sódio (SDS) (PAGE), sob condições redutoras. A seguir, as proteínas são transferidas electroforeticamente da matriz do gel para uma membrana de nitrocelulose que é, subsequentemente, incubada com um agente de bloqueio. É, depois, adicionado anticorpo

policlonal de ovelha dirigido para a molécula de factor VIII 36 intacta, seguido de um anticorpo secundário que é conjugado com peroxidase de rábano e reage com as cadeias pesada e leve de imunoglobulinas de ovelha. Os polipéptidos de FVIII são detectados após incubação com o substrato quimioluminescente luminol, por exposição a um filme sensível a raios X.

Actividade de Protease: A actividade de protease foi determinada por um método baseado em FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) de um conjugado fluoresceína-caseína. A hidrólise de caseína por proteases liberta pequenos fragmentos peptídicos marcados com fluoresceína e um aumento em fluorescência é observado. Para uma estimativa quantitativa de actividade de protease, foi utilizada tripsina para construir uma curva-padrão. Amostra e substrato foram incubados numa microplaca e a fluorescência resultante foi detectada com utilização de um fluorímetro, com comprimentos de onda de 485/538 nm de excitação/emissão. 0 limite de quantificação de actividade de protease correspondeu à actividade proteolítica de 500 pg de tripsina/mL, quando foi utilizado um tempo de incubação de 24 horas.

Análise de ADN: O ADN total é determinado utilizando o Ensaio de Limiar de ADN Total que é um ensaio enzimático para ADN de cadeia simples. Na primeira etapa, a amostra é desnaturada por aquecimento, de modo a converter todo o ADN na forma de cadeia simples. As amostras são, depois, incubadas com um reagente de marcação de ADN que contém conjugados de duas proteínas de ligação que têm elevadas afinidades para ADN, independentemente da sequência de bases. Um conjugado é um anticorpo monoclonal anti-ADN ligado a urease. O outro conjugado 37 é uma proteína de ligação de ADN de cadeia simples ligada a biotina. Após incubação, o complexo de ADN marcado é transferido para uma unidade de filtração na estação de trabalho, onde é capturado, sob controlo de vácuo, sobre uma vareta que transporta uma membrana de nitrocelulose biotinilada. Um excesso de estreptavidina no reagente de marcação de ADN liga-se especificamente a biotina no complexo de ADN e também a biotina conjugada à membrana de nitrocelulose da vareta. Uma lavagem subsequente remove qualquer enzima não especificamente retida da membrana e a vareta é, depois, colocada num leitor, onde é colocada em contacto com a superfície do sensor num volume muito pequeno de fluido que contém o substrato enzimático ureia. A reacção enzimática altera o pH local em cada sítio de medição, o que altera o potencial de superfície no sensor. A velocidade de alteração no potencial de superfície é proporcional à quantidade de ADN em cada sítio. 0 potencial de superfície é monitorizado cineticamente e as amostras são, depois, quantificadas contra uma curva-padrão. 0 produto: 0 produto produzido na cultura celular é uma forma recombinante de FVIII que foi geneticamente manipulada para conter os sítios activos de FVIII natural e para excluir o domínio B, dispensável para actividade de FVIII. É um polipéptido de FVIII de comprimento completo de 170 KDa, cuja porção principal é processada de modo a proporcionar um polipéptido de cadeia pesada (HCh, 90 KDa) e um polipéptido de cadeia leve (LCh, 80 KDa). A deleção do domínio B reduz complexidade estrutural retendo, simultaneamente, a actividade biológica semelhante àquela de FVIII derivado de plasma. A sequência de aminoácidos da muteína de FVIII isolada nos seguintes exemplos é proporcionada na SEQ ID Nos 4 e 6. 38

Exemplo 1: Produção de Linha Celular de Expressão,

Linha celular: A linha celular de expressão é baseada na linha celular HEK 293T (ou, abreviadamente, 293T) . Esta linha celular foi originalmente produzida por transformação de células de rim fetal humano com ADN de adenovírus de tipo 5 cortado (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1), 59-74 (1974)). Dentro da linha celular HEK 293 (abreviadamente 293) resultante foi inserido o gene sensível a temperatura para antigénio T de SV40. Características da linha celular de expressão: Nome: HEK 293T tsA201; Fonte: European Collection of Cell Cultures, ECACC (http://www.ecacc.org.uk/) linha celular N° 9612 1229, tsA 201 (redepositada, de acordo com o Tratado de Budapeste, pela Octagene Biomedical Laboratories GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried, Alemanha com a DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschenroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Alemanha, em 3 de Fevereiro de 2001, sob o depósito N° DSM ACC 2494; a permissão para fazer referência a este depósito foi concedia pela Octagene Biomedical Laboratories GmbH, em 17 de Março de 2005); Espécie: Humana; Tecido: rim fetal; Morfologia: Semelhante a Epitelial; Cariótipo: O cariótipo das células 293T (ECACC N° 96121229) não é especificado; o cariótipo das células 293 (ECACC N°85120602), contudo, é conhecido e descrito como 2n = 46, hipotriplóide, número de modelo de cromossoma: 64.

Plasmídeos de expressão: Como vectores de expressão, foram utilizados plasmídeos da família pTGF8, como se pode constatar na Fig. 4. Os vectores pTGF8-3 e pTGF8-2hyg-s contêm a cassete de expressão para factor VIII de coagulação humana de domínio B delecionado, com o péptido adaptador da SEQ ID N° 9 (SEQ ID Nos 4 39 e 6, respectivamente). 0 pTGF8-2hyg-s tem, adicionalmente, três trocas de resíduos de aminoácidos nas posições 162, 2011 e 2223 (em relação à sequência de comprimento completo mostrada na SEQ ID N° 2) . Os vectores contêm, adicionalmente, uma cassete para resistência a higromicina (codificando higromicina-B-fosfotransferase) e uma cassete para resistência a ampicilina (codificando p-lactamase). Além disso, está contido um elemento responsivo a progesterona (PRE). A expressão do BDDrFVIII é controlada por um promotor CMV. Este promotor, em relação ao intrão de SV40 e ao sítio de poli-adenilação, proporciona elevado nível de produção de proteína recombinante. A resistência contra dois antibióticos proporciona uma ferramenta eficiente para selecção de clone após transfecção.

Transfecção: Imediatamente após revitalização do stock de ECACC, foram transfectadas células 293T aderentes com pTGF8-3 ou pTGF8-2hyg-s, utilizando o método do fosfato de cálcio (C. Chen et al., Mol. Cell Biol. 7(8), 2745-2752 (1987)). A selecção com higromicina (200 ng/mL) começou 72 horas após transfecção. Após 10 dias sob selecção, clones individuais resistentes a higromicina foram isolados, expandidos e subclonados através de duas séries consecutivas de clonagem de célula única. A produção de FVIII recombinante foi quantificada no sobrenadante de clones resistentes a higromicina, utilizando ensaios ELISA e aPTT. Este processo conduziu à selecção dos clones N° 293T 48/9 H5 e 293T 12/24E4.

Adaptação a meio de cultura isento de soro: Os clones N° 293T 48/9H5 e 293T 12/24E4 foram adaptados a crescimento em meio isento de soro ao longo de um período de 6 semanas, 40 resultando em células não aderentes crescendo em suspensão. Após o processo de adaptação, as células foram expandidas utilizando frascos spinner. A partir destas células, foi estabelecido um pré-MCB através da sua congelação em meio de criopreservação isento de soro contendo DMSO a 7,5%. Os criofrascos, contendo cada um 1-107 células, foram armazenados em azoto liquido. Foi efectuada testagem cumprindo as GMP deste pré-MCB dizendo respeito a ensaios de virus in vitro, testagem de micoplasma e esterilidade.

Cultura: A cultura estática de células foi realizada em frascos TC de diferentes tamanhos. Para cultura dinâmica foram utilizadas garrafas e biorreactores descartáveis de 10 L. Para efeitos de agitação, as garrafas foram colocadas num agitador horizontal situado dentro da incubadora. Todas as incubadoras foram reguladas para dióxido de carbono a 5%, 37 °C e humidade relativa de 95%.

Suspensão celular: (a seguir abreviadamente referida como "CS"). Como pode ser verificado nos exemplos seguintes, a suspensão celular utilizada para diferentes experiências exerce diferentes quantidades de FVIII e proteínas de célula hospedeira. Isto reflecte que o material inicial foi retirado em tempos diferentes no ciclo de produção (ver a Figura 1) e, deste modo, algumas CS enfrentaram condições de produção mais optimizadas do que outras. 41

Exemplo 2: Libertação de FVIII utilizando concentração diferente de NaCl e lisina como substâncias de libertação.

Foram adicionados 5 mL de CS1 (1,6 x 106 células/mL, clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 mL de uma solução de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no Exemplo 1 e foram retiradas antes da recolha (ver a Figura 1) . A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para FVIII:C, etc. Para uma descrição esquemática geral da experiência, ver também a Figura 2. A composição de libertação adicionada e os resultados correspondentes são mostrados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.

Tabela 1

Componente de Substâncias tampão libertação Referência (CS1) Sem adição NaCl a 0,10 M MES a 20 mM, CaCl2 a 10 mM, Tween® 80 a 0,01%, pH 6,5 NaCl a 0,50 M Histidina a 20 mM, pH 6,0 NaCl a 1,0 M Histidina a 20 mM, pH 6,0 NaCl a 2,0 M Histidina a 20 mM, pH 6,0 Lisina a 1,0 M NaCl a 0,10 M, MES a 20 mM, CaCl2 a 10 mM, Tween® 80 a 0,01%, pH 7,5 42

Tabela 2

Cone. de libertação* FVIII:C, (IU/mL) Recuperação (%) FVIII:C x 10"6/célula (IU) Proteases** (a.u.) Referência 1,7 100 1,2 <1 NaCl a 0,10 M 7,0 412 4,6 <1 NaCl a 0,30 M 8, 0 470 5,4 14 NaCl a 0,55 M 33,2 1953 22,2 19 NaCl a 1,0 M 36,4 2141 24,2 19 Lisina a 0,50 31,8 1871 21,2 <1 M * A concentração de libertação final é metade da solução de libertação adicionada, em virtude da mistura com a CS. A condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Definição de actividade de protease: 1 unidade arbitrária (a.u.) de actividade de protease é definida como a actividade correspondendo à actividade de 1 pg de tripsina/L.

Conclusão: O aumento de concentração de cloreto de sódio ou lisina antes da recolha aumenta, significativamente, o fviii recuperado.

Exemplo 3

Foram adicionados 5 mL de CS2 (2,84 x 10 células/mL, clone HEK 293T 12/24E4, vector pTGF8-2hyg-s)) a 5 mL de uma solução de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no 43

Exemplo 1 e foram retiradas antes da recolha (ver a Figura 1). A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de onda), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado (FVIII:C, FVIII:Ag, viabilidade celular e proteína total). Para uma descrição esquemática da experiência, ver também a Figura 2. Os Exemplos 3A-3C são experiências realizadas com a mesma suspensão celular em experiências paralelas e são, deste modo, directamente comparáveis entre si.

Exemplo 3A: Libertação com concentração diferente de cloreto de sódio.

Diferentes concentrações de NaCl foram preparadas e adicionadas a CS2 de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar em que gama de concentração de cloreto de sódio a libertação de FVIII ocorre. Os resultados são resumidos na Tabela 3. 44

Tabela 3

Cone. de libertação1 FVIII: c, (IU/mL) * 1 FVIII:C (%) FVIII:C x IO"6/ célula (IU) Viabilidade Celular (%) Pureza de FVIII (IU/pg de prot.) Razão FVIII:C/ FVIII:ag Ref. (CS2) 0,50 100 0, 36 36 3,4 0,57 NaCl a 0,10 M 1, 42 248 0, 90 40 4, 6 NA NaCl a 0,15 M 1,28 256 0, 94 44 5,2 NA NaCl a 0,25 M 2, 00 400 1, 46 50 7,7 NA NaCl a 0,45 M 3,56 712 5, 20 48 26,6 NA NaCl a 0,55 M 4,16 832 6,08 36 28, 1 0, 62 NaCl a 1,0 M 4,28 856 6,28 8 17, 8 0,50 NaCl a 2,0 M 4, 42 884 6,46 3 15, 7 0, 60 45 1 A concentração de lavagem final e a condutividade na CS são

Conclusão: A concentração aumentada de cloreto de sódio aumenta o FVIII:C e é alcançado um patamar a NaCl a 0,55 Μ. A libertação de FVIII é alcançada, em menor grau, por um efeito de diluição (CS comparada com NaCl a 0,1 M na Tabela 3). A membrana celular é destruída se a concentração de cloreto de sódio for demasiado aumentada (1,05 M e 2,00 M), ao passo que a viabilidade celular parece ficar, aproximadamente, inalterada no intervalo de 0,1-0,55 M de NaCl. A pureza de FVIII libertado atinge um máximo nas amostras de NaCl a 0,45 e 0,55 M, ao passo que diminui às concentrações de sal mais elevadas, em virtude da libertação de proteínas intracelulares de célula hospedeira, causada por destruição de membrana celular e/ou libertação de proteínas localizadas na membrana/fragmentos de membrana. Deste modo, uma escolha óptima de condições é utilizar a concentração mais elevada de cloreto de sódio que não destrua a membrana celular. O quociente FVIII:C/FVIII:ag indica uma actividade biológica inalterada das moléculas de FVIII libertadas. Os resultados indicam que a parte principal de FVIII que é libertada durante o aumento da concentração de cloreto de sódio localiza-se, principalmente, fora da célula, ligada através de interacções iónicas na superfície celular. Isto é baseado no facto de a recuperação de FVIII não aumentar significativamente quando a membrana celular é dissociada.

Exemplo 3B: Estudo de pH diferente dentro de diferentes concentrações de NaCl. O pH foi ajustado na gama de 6,0-7,5 (gama de pH na qual se sabe que FVIII é estável) na CS2 (NaCl a 0,1 M) e na CS2 diluída com a substância de lavagem (concentração final de NaCl a 46 0,55 M). Estudar de que modo um pH diferente afecta a libertação de FVIII. Os resultados são resumidos na Tabela 4.

Tabela 4

Concentração de libertação* pH FVIII:C (IU/mL)** FVIII:C (%) CS2 (NaCl a 0,10 M) 6,0 0, 46 92 CS2 (NaCl a 0,10 M) 6,5 0,50 100 CS2 (NaCl a 0,10 M) 7,2 0,50 100 CS2 (NaCl a 0,10 M) 7,5 0,53 106 NaCl a 0,55 M 6,0 4,10 820 NaCl a 0,55 M 6,5 4,34 868 NaCl a 0,55 M 7,0 4,30 860 NaCl a 0,55 M 7,5 3,56 712 * A condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Concentração de FVIII:C compensada para factor de diluição.

Conclusão: O pH não tem efeito significativo sobre a libertação de fviii dentro do intervalo de pH testado (que foi seleccionado em virtude da estabilidade de pH da molécula de FVIII). A principal diferença na recuperação de FVIII entre elevado (NaCl a 0,55 M) e baixo (NaCl a 0,1 M) de concentração de libertação é independente de pH. A estabilidade de pH de FVIII (pH 6-7) é discutida na p. 10 de Wang et al., International Journal of Pharmaceutics 259, 1-15 (2003). 47

Exemplo 3C: Diferente concentração de lisina como um componente de libertação.

Diferentes concentrações de lisina foram preparadas e adicionadas a CS2, de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar em que gama de concentração de lisina a libertação de FVIII ocorre. Os resultados são resumidos na Tabela 5.

Tabela 5

Cone. de libertação* FVIII:C, (IU/mL) * * FVIII:C (%) FVIII:C x 10“6/ célula (IU) Viabilidade Celular (%) Pureza de FVIII (iu/pg de prot.) Razão FVIII:C/ FVIII:ag Ref. (CS2) 0,50 100 0,36 36 3,4 0, 57 Lisina a 0,15 M 0,82 164 0,58 33 5,9 0,53 Lisina a 0,30 M 1,37 274 0,96 40 9,4 0,39 Lisina a 0,5 M 2,88 576 2,03 19 16, 7 0,42 * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Concentração de FVIII:C compensada para factor de diluição. 48

Conclusão: Lisina, um aminoácido carregado, liberta FVIII. Contudo, o cloreto de sódio (Exemplo 3A) parece ser um libertador mais eficaz e brando de FVIII, quando comparado a concentrações semelhantes. Parece que as células são mais danificadas por lisina do que cloreto de sódio, como pode ser verificado quando se compara viabilidade, pureza e quociente FVIII:C/FVIII:ag.

Exemplo 4: Estudo de substâncias cinéticas e de libertação diferente.

Foram adicionados 5 mL de CS3 (1,6 x 106 células/mL, clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 mL de uma solução de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no

Exemplo 1 e foram retiradas durante a fase de crescimento (C na Figura 1) . A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para FVIII:C, etc. Para uma descrição esquemática geral da experiência, ver também a Figura 2. Os Exemplos 4A-4E são experiências realizadas com a mesma CS em experiências paralelas e são, deste modo, directamente comparáveis entre si.

Exemplo 4A: Estudo de tempo necessário para libertação de FVIII utilizando NaCl a 0,55 M.

Uma solução de libertação de 0,10 M e 1,0 M de cloreto de sódio foi preparada e adicionada a CS3 de acordo com o processo 49 anteriormente descrito. As amostras foram retiradas após 0, 5, 10, 20, 40 e 60 minutos, de modo a estudar quão rápido o FVIII era libertado. Os resultados são resumidos na Tabela 6.

Tabela 6

Concentração de libertação* Tempo (minutos) FVIII:C,** (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 10~6/ célula (IU) NaCl a 0,10 M 60 0,12 100 0,08 NaCl a 0,55 M 0 1,26 1050 0, 79 NaCl a 0,55 M 5 1,30 1083 0, 81 NaCl a 0,55 M 10 1,36 1133 0, 85 NaCl a 0,55 M 20 1,26 1050 0, 79 NaCl a 0,55 M 40 1,34 1117 0, 84 NaCl a 0,55 M 60 1,26 1050 0, 79 * A concentração de libertação final, a condutividade da CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Concentração de FVIII:C compensada para factores de diluição.

Conclusão: A concentração de sal aumentada liberta imediatamente as moléculas de FVIII. O tempo de incubação não tem efeito sobre a recuperação. Trata-se de uma importante verificação que alarga a possível utilização da invenção, tornando possível utilizar diferentes técnicas (filtração convencional, filtração tangencial, centrifugação, etc.) para separar a molécula de FVIII da célula, utilizando o processo de libertação. Uma abordagem muito interessante seria a adição - 50 durante uma cultura em descontínuo de perfusão (perfusão significa, normalmente, uma suspensão celular recolhida lentamente, de modo contínuo, onde as células podem ser utilizadas durante meses para produzir o produto) - do tampão de libertação com concentração iónica aumentada, remoção do tampão de libertação e, a seguir, adição do tampão de cultura e continuar a utilizar as células para produzir FVIII. Em virtude deste processo, a produtividade das células pode ser significativamente aumentada, em comparação com o processo normal, onde as células ou são descartadas (destruídas) após a recolha (leva 1-2 semanas a cultivar novas células até à concentração celular desejada) ou utilizar a recolha de perfusão lenta normal com baixo teor iónico e a recuperação inferior.

Exemplo 4B: Estudo de composição de libertação utilizando concentração diferente de NaCl.

Diferentes concentrações de NaCl foram preparadas e adicionadas a CS3 de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar em que gama de concentração de cloreto de sódio a libertação de FVIII ocorre. Os resultados são resumidos na Tabela 7 (ver também o Exemplo 3A para um estudo de NaCl semelhante com outra CS e análises adicionais realizadas). 51

Tabela 7

Concentração de libertação* FVIII:C** (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 10”6/ célula (IU) Viabilidade (%) NaCl a 0,10 M 0,12 100 0,08 89 NaCl a 0,30 M 0, 76 633 0,48 92 NaCl a 0,40 M 1,03 858 0,64 93 NaCl a 0,50 M 0,98 817 0,61 90 NaCl a 0,55 M 1,26 1050 0, 79 NA NaCl a 0,60 M 1,10 917 0,69 88 * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Concentração de FVIII:C compensada para factores de diluição. NA: não analisado.

Conclusão: A libertação de FVIII começa a cerca de 0,30 M de NaCl e atinge um máximo a cerca de 0,55 M de NaCl. Não existe diferença significativa na viabilidade celular, dentro da concentração de NaCl testada.

Exemplo 4C: Estudo de lisina como uma substância de libertação, em comparação com NaCl.

Diferentes concentrações de lisina foram preparadas (o pH foi ajustado para 7,0) e adicionadas a CS3 de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar a que nível a libertação máxima de FVIII ocorreu, em comparação com cloreto de 52 sódio como substância de libertação. Os resultados são resumidos na Tabela 8.

Tabela 8

Concentração de lavagem* FVIII:C,** (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 10 V célula (IU) NaCl a 0,10 M 0,12 100 0,08 NaCl a 0,55 M 1,26 1050 0,79 Lisina a 0,50 M 1, 08 900 co o Lisina a 0,75 M 1,24 1033 0, 78 Lisina a 1,0 M 1,22 1017 0, 76 * A concentração de libertação final, a condutividade da CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Concentração de FVIII:C compensada para factores de diluição

Conclusão: A lisina pode ser utilizada como uma substância de libertação, com o mesmo grau de libertação de FVIII total, em comparação com cloreto de sódio. Parece que o cloreto de sódio é um pouco mais eficaz a libertar FVIII, em relação à concentração (M) necessária para se alcançar a mesma recuperação.

Exemplo 4D: Estudo de diferentes tipos de potenciais composições de libertação.

Diferentes tampões foram preparados (o pH foi ajustado para 7,0, se aplicável) e adicionados a CS3 de acordo com o processo 53 anteriormente descrito, de modo a estudar se a libertação de FVIII ocorreu. Os resultados são resumidos na Tabela 9.

Tabela 9

Concentração de tampão* FVIII:C,** (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 10”6/ célula (IU) Viabilidade (%) NaCl a 0,10 M 0,12 100 0,08 NA NaCl a 0,55 M 1, 26 1050 0, 79 NA Lisina a 0,50 M 1, 08 900 0,68 NA Arginina a 0,50 M 0, 48 400 0,30 NA Histidina a 0,25 M 0, 54 450 0,34 NA Glicina a 0,50 M <0,1 <90 <0, 08 NA KC1 a 0,50 M 1, 64 1367 1, 02 NA Acetato de amónio a 0,50 M 0, 92 767 0,58 NA MgCl2 a 0,50 M 1,30 1083 0, 81 NA Sorbitol a 0,50 M <0,1 <90 <0, 08 90 Triton® x-100 a 1% 0, 86 716 0,54 0 * A condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Concentração de fviii:C compensada para factores de diluição. NA: não analisado.

Conclusão: Como foi já mostrado em exemplos anteriores, cloreto de sódio e lisina podem ser utilizados como substâncias de libertação com, aproximadamente, o mesmo grau de libertação de FVIII. Como mostrado neste exemplo, muitas substâncias 54 carregadas podem alcançar efeitos semelhantes, mas não todas com o mesmo nível. Quando alguns aminoácidos carregados foram comparados entre si, a lisina foi um agente de libertação de FVIII mais eficaz, em comparação com arginina e histidina (contudo, em virtude da concentração de histidina de baixa solubilidade, poderia ser apenas elevada para 0,25 M) . Uma observação muito interessante foi que um aminoácido com grupo R não carregado (glicina) e um açúcar (sorbitol) não libertou FVIII de modo algum. Isto proporciona uma clara indicação de que a principal força que retém a molécula de FVIII é de origem iónica. O detergente, Triton® x-100 a 1% que é conhecido na técnica anterior por dissociar a membrana celular e libertar todas as proteínas que tenham estado dentro das células, foi incluído na experiência para estudar até que ponto FVIII ficava aprisionado dentro da célula. Quando se estuda as células antes e após o tratamento com detergente, nenhumas células ou vestígios de células poderiam ser vistas após o tratamento com detergente, deste modo, todo o material celular foi dissolvido. A concentração de FVIII na amostra que tinha sido tratada com detergente era, em princípio, a mesma que para os valores de 0,50 M mais elevados (com a parte principal das células intacta após tratamento). Isto indica que quando se utiliza o processo de libertação, a parte principal do FVIII libertado tem origem em ligação a superfícies de células fora da célula, esta teoria também é reforçada pela libertação imediata de FVIII quando se utiliza o processo de lavagem (Example 4A). 55

Exemplo 4E: Estudo de combinação de substâncias de libertação

Foram preparados diferentes tampões, nos quais diferentes substâncias de libertação foram misturadas (o pH foi ajustado para 7,0, se aplicável) e adicionadas a CS3 de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar se a recuperação de FVIII era alterada, em comparação com quando se utiliza apenas uma substância de libertação. Os resultados são resumidos na Tabela 10.

Tabela 10

Concentração de libertação* FVIII:C, ** (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x IO'6/ célula (IU) Viabilidade (%) NaCl a 0,10 M 0,12 100 0,08 89 NaCl a 0,30 M 0, 76 633 0,48 92 NaCl a 0,60 M 1,26 1050 0, 79 88 Lisina a 0,50 M 1, 08 900 0,68 NA Triton® X—100 a 1% 0,86 716 0, 54 0 NaCl a 0,60 M+ Triton® a 1% 0,92 766 0,57 0 NaCl a 0,25 M+lisina a 0,25 M 1,12 933 0, 70 NA NaCl a 0,17 M + lisina a 0,17 M + sorbitol a 0,33 M 0, 94 783 0,59 NA 56 * A condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** Concentração de FVIII:C compensada para factores de diluição. NA: não analisado.

Conclusão: Diferentes substâncias de libertação podem ser combinadas para libertar a molécula de FVIII.

Exemplo 5: Estudo de diferentes substâncias carregadas como agente de libertação.

Foram adicionados 5 mL de CS4 (6,37 x 106 células/mL, clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3) ) a 5 mL de uma solução de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no Exemplo 1 e foram retiradas antes da recolha (ver a Figura 1) . A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para FVIII:C, etc. Para uma descrição esquemática geral da experiência, ver também a Figura 2. Os Exemplos 5A-5D são experiências realizadas com a mesma cultura em descontinuo de CS em experiências paralelas e são, deste modo, directamente comparáveis entre si. 57

Exemplo 5A: Estudo de diferentes concentrações de KC1 como composição de libertação e comparadas com NaCl

Diferentes concentrações de KC1 foram preparadas e adicionadas a CS4, de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar em que gama de concentração de cloreto de sódio a libertação de FVIII ocorre e compará-la com NaCl. Os resultados são resumidos na Tabela 11.

Tabela 11

Cone. de libertação* FVIII: c, (iu/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 10~6/ célula (IU) Viabilidade celular (%) Pureza de FVIII, iu/pg de prot. Proteases** (a.u.) KC1 a 0,10 M 0,26 100 0,08 87 NA 82 KC1 a 0,15 M 0,64 260 0,20 85 NA NA KC1 a 0,20 M 1,21 480 0,38 86 NA NA KC1 a 0,25 M 2,30 920 0, 72 82 NA NA KC1 a 0,38 M 4,47 1790 1,40 64 NA NA KC1 a 0,50 M 4, 42 1770 1,39 70 0,32 60 58 (continuação)

KC1 a 1,0 M 5, 08 2030 1,60 30 0,13 92 NaCl a 0,10 0,25 96 0,08 85 0,03 82 M NaCl a 0,55 4, 96 1980 1,56 80 0,35 73 M * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. NA: não analisado. ** Definição de actividade de protease: 1 unidade arbitrária de actividade de protease é definida como a actividade correspondendo à actividade de 1 pg de tripsina/L.

Conclusão: A capacidade para diferentes concentrações de KC1 libertarem FVIII é comparável com NaCl. Igualmente, a viabilidade celular, pureza e libertação de protease são quase as mesmas, em comparação com aquelas de NaCl. Contudo, existe uma pequena tendência, de que talvez o NaCl seja mais brando contra as células, quando se compara a viabilidade celular e a pureza dentro de concentrações semelhantes. Uma pureza diminuída é uma indicação de dano celular, como pode ser verificado para a solução de lavagem de KC1 a 1 M, na qual a pureza diminuiu significativamente indicando, em combinação com a viabilidade celular diminuída que as proteínas de célula hospedeira foram libertadas devido à lise da membrana celular.

Exemplo 5B: Estudo de diferentes composições de libertação carregadas.

Diferentes composições de libertação foram preparadas (o pH foi ajustado para 7,0, se aplicável) e adicionadas a CS4 de 59 acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar se a libertação de FVIII ocorreu. Os resultados são resumidos na Tabela 12.

Tabela 12

Cone. de libertação* FVIII:C, (IU/mL) FVIII: c (%) FVIII:C x 10~6/ célula (IU) Viabilidade celular (%) Pureza de FVIII, IU/pg de prot. Proteases*** (a.u.) NaCl a 0,10 M 0,25 100 0, 08 85 0, 03 82 NaCl a 0,55 M 4, 96 1980 1,56 80 0,35 73 KC1 a 0,50 M 4, 42 1768 1,39 70 0,32 60 N6.2SO4 cL 0,50 M 3,21 1284 1, 01 34 NA 109 KH2P04 a 0,50 M 3,62 1448 1,14 44 NA 94 C6.CI2 cL 0,25 M 5,34 2136 1,68 78** 0,53 NA MgCl2 a 0,50 M 2,26 904 0, 71 16** NA NA Lisina a 0, 75 M 6,10 2440 1, 92 75 0,20 113 60 * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. **Dificuldades dentro da análise, visto que foi precipitada substância de lavagem quando foi adicionado químico analítico, durante a medição. *** Definição de actividade de protease: 1 unidade arbitrária de actividade de protease é definida como a actividade correspondendo à actividade de 1 pg de tripsina/L. NA: não analisado.

Conclusão: Diferentes substâncias carregadas podem ser utilizadas para libertar FVIII (como também mostrado no Exemplo 3D) . Contudo, como mostrado em alguns dos exemplos anteriores, é preferido, escolher uma substância de libertação que não destrua a membrana celular, visto que isto liberta proteínas e proteases de célula hospedeira que diminuem a pureza e podem diminuir a estabilidade do produto. Adicionalmente, se as células forem destruídas, não podem ser utilizadas para produção contínua do produto, o que diminui o rendimento global. Pode ser notado que NaCl a 0,55 M, KC1 a 0,50 Me CaCl2 a 0,25 M proporcionam todos uma recuperação muito elevada, com viabilidade celular quase inalterada e com uma elevada pureza de produto libertado.

Exemplo 6: Estudo de cloreto de cálcio como composição de libertação e comparação com NaCl.

Foram adicionados 5 mL de CS5 (3, 47 x 106 células/mL, clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 mL de uma solução de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no Exemplo 1 e foram retiradas antes da recolha (ver a Figura 1) . A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora 61 de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para FVIII:C, etc. Para uma descrição esquemática geral da experiência, ver também a Figura 2. Os Exemplos 6A-6E são experiências realizadas com a mesma cultura em descontinuo de CS em experiências paralelas e são, deste modo, directamente comparáveis entre si. A: Estudo de diferentes concentrações de CaCl2 como composição de libertação e comparadas com NaCl

Diferentes concentrações de CaCl2 foram preparadas e adicionadas a CS5 de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar em que gama de concentração de cloreto de cálcio a libertação de FVIII ocorre. Os resultados são resumidos na Tabela 13.

Tabela 13

Concentração de libertação* FVIII:C, (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x IO-6/ célula (IU) Viabilidade Celular (%) Pureza de FVIII, iu/pg de prot. NaCl a 0,10 M 5, 06 100 2,92 94 0,22 NaCl a 0,55 M 13,6 269 7,86 82 1, 05 62 (continuação)

CaCl2 a 0,05 M 15,1 298 8, 73 2, 16 CaCl2 a 0,10 M 18,0 356 10,4 η η * * Ο co T-1 CaCl2 a 0,20 M 7,32 145 4,23 52** 0, 46 * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** resultados incertos, visto que o CaCl2 precipita durante a adição de reagentes analíticos.

Conclusão: O cloreto de cálcio pode ser utilizado como um libertador eficaz de FVIII no processo de recolha celular. Uma concentração 10 vezes mais baixa de cloreto de cálcio (0,05 M) tem o mesmo efeito de libertação em comparação com a concentração superior de cloreto de sódio (0,55 M) . Além disso, a lavagem de cloreto de cálcio parece libertar quantidades inferiores significativas de outras proteínas de célula hospedeira, resultando em que a pureza de FVIII libertado aumentou significativamente, em comparação com aquela da utilização de cloreto de sódio. A viabilidade celular das células tratadas com cloreto de cálcio parece ser ligeiramente inferior, comparada com a lavagem de cloreto de sódio, contudo isto é incerto, em virtude da influência de Ca no método de medição de viabilidade. A agregação celular, e não a lise das células, é uma explicação possível, reforçada pela ainda baixa quantidade de proteínas de células hospedeiras libertadas (sabe-se que o cloreto de cálcio pode induzir agregação dentro de células) . A análise de transferência de Western indica que não há diferença significativa no padrão de massa molecular do FVIII em bruto, libertado com NaCl a 0,10 M, NaCl a 0,55 M, CaCl2 63 a 0,10 M e CaCl2 a 0,20 M (Fig. 3A e 3B) e comparado com uma preparação de FVIII altamente purificada (Fig. 3A). B: Estudo de meios de cultura celular adicionados com diferentes quantidades de CaCl2 como composição de libertação.

Meio de cultura celular não utilizado (o mesmo que o utilizado durante a cultura celular, Freestyle) foi utilizado como solução tampão. Os meios de cultura celular (CCM) foram adicionados a diferentes quantidades de CaCl2, para estudar a libertação de FVIII. Os resultados são resumidos na Tabela 14.

Tabela 14

Composição de libertação* FVIII:C, (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 106/ célula (IU) Viabilidade Celular (%) Referência, NaCl a 0,10 M 5,06 100 2,92 94 CC M+CaCl2 â 0,005 M 9, 72 192% 5, 60 91% CC M+CaCl2 a 0,01 M 9,12 180% 5,26 70% * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. 64

Conclusão: Um pequeno aumento (5-10 mM) na concentração de cloreto de cálcio nos CCM, aumenta significativamente a libertação de FVIII.

Exemplo 7: Estudo de diferentes substâncias de origem não carregada e comparadas com NaCl como composição de libertação

Foram adicionados 5 mL de CS6 (2, 96 x 106 células/mL, clone HEK 293T 12/24E4, vector pTGF8-2hyg-s)) a 5 mL de uma solução de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no Exemplo 1 e foram retiradas antes da recolha (ver a Figura 1). A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para actividade de FVIII:C, etc. Para uma descrição esquemática geral da experiência, ver também a Figura 2. Os Exemplos 7A-7B são experiências realizadas com a mesma cultura em descontinuo de CS em experiências paralelas e são, deste modo, directamente comparáveis entre si. A: Estudo de diferentes (não carregadas) substâncias e comparadas com NaCl como composição de libertação. Foram preparadas diferentes soluções e adicionadas a CS6 de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar se a libertação de fviii ocorre com substâncias trabalhando com princípios diferentes (não iónicos). Os resultados são resumidos na Tabela 15 . 65

Tabela 15

Composição de libertação* FVIII: C (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 10' V célula (IU) Viabilidade Celular (%) NaCl a 0,10 M 0,21 100 0,14 59 NaCl a 0,55 M 0,96 457 0, 65 54 Polietilenoglicol 4000 a 10% 0,12 57 0,08 75 Etilenoglicol a 5% 0,20 95 0,14 50 Etilenoglicol a 10% <0,1 <50 <0, 07 26 Alanina a 0,5 M 0,18 86 0,12 62 Valina a 0,25 M 0,25 119 0,17 68 Etanol a 10% 0,11 52 0, 07 32 Caprilato de sódio a 5% <0,1 <50 <0, 07 Na * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl.

Conclusão: Diferentes substâncias de origem não iónica (hidrófila, hidrófoba, álcoois) foram testadas e os resultados foram comparados com cloreto de sódio como substância de libertação. O resultado mostra que substâncias de libertação de natureza iónica são necessárias para a libertação de FVIII. B: NaCl a 0,55 M como substância de libertação, concentração e análise com transferência de Western. Foram adicionados 50 mL de CS6 a 50 mL de uma solução de NaCl a 1 Μ. A mistura foi suavemente agitada, durante 1 hora, à temperatura 66 ambiente, após o que a solução foi centrifugada 5 minutos (1200xg) e o sobrenadante foi recuperado. 0 sobrenadante celular foi, subsequentemente, concentrado para um teor de FVIII:C teor de 13,6 IU/mL, utilizando recipientes de centrifugação incluindo uma membrana de 10 kDa (Amicon, centriprep). A centrifugação foi necessária para se poder utilizar o método analítico de transferência de Western 1 como uma ferramenta, de modo a aumentar a concentração de FVIII.

Conclusão: A distribuição de massa molecular do FVIII em bruto libertado com NaCl a 0,55 Me comparada com uma preparação de FVIII altamente purificada comercialmente disponível, mostra uma distribuição de massa molecular semelhante (Fig. 3A).

Exemplo 8: Estudo de diferentes concentrações de CaCl2, como uma substância de libertação e comparação com elevado (0,55 M) e baixo (0,1 M) teor de NaCl. A: Foram adicionados 5 mL de CS7 (3,41 x 106 células/mL, clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 mL de uma composição de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no Exemplo 1 e foram retiradas antes da recolha (ver a Figura 1) . A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para actividade de FVIII:C, etc. Para uma descrição esquemática geral da experiência, ver também a Figura 2. 67

Foram preparadas diferentes concentrações de CaCl2 e adicionadas a CS7 de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar em que gama de concentração de CaCl2 a libertação de FVIII ocorre. Os resultados são resumidos na Tabela 16.

Tabela 16

Concentração de libertação* FVIII:C, (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x 10' 6/célula (IU) Viabilidade Celular (%) NaCl a 0,10 M 3, 65 100 2,14 90 CaCl2 a 0,075 M 9, 42 258 5,52 73** CaCl2 a 0,10 M 10,5 288 6,16 ^ O) ~k -k CaCl2 a 0,125 M 11,7 320 6,86 67** * A concentração de lavagem final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. ** resultados incertos, visto que o CaCl2 precipita durante a adição de reagentes analíticos.

Conclusão: CaCl2 é uma substância de libertação que liberta FVIII a concentração relativamente baixa. A concentração necessária é significativamente inferior, comparada com NaCl. B: Estudo de tempo necessário para libertação de FVIII utilizando CaCl2 a 0,1 M. Uma solução de libertação de CaCl2 a 0,10 M foi preparada e adicionada à suspensão celular de acordo com o processo anteriormente descrito. As amostras foram retiradas após 0, 10, 30 e 60 minutos, de modo a estudar quão 68 rápido o FVIII era libertado. Os resultados são resumidos na Tabela 17.

Tabela 17

Concentração de libertação* Tempo, (minutos) FVIII: C, (IU/mL) FVIII:C x 10 V célula (IU) Referência, CS7 0 3, 65 2,14 CaCl2 a 0,10 M 0 9,34 5, 48 CaCl2 a 0,10 M 10 10, 7 6,28 CaCl2 a 0,10 M 30 10,3 6, 04 CaCl2 a 0,10 M 60 10,5 6,16 * A concentração de libertação final, a condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl.

Conclusão: A libertação de FVIII utilizando CaCl2 a 0,1 M ocorre rápido, no espaço de minutos, a parte principal de FVIII foi libertada.

Exemplo 9: Estudo de diferentes concentrações de CaCl2 como composição de libertação e comparação com NaCl.

Foram adicionados 5 mL de CS8 (3,1 x 104 células/mL, clone HEK 293T 12/24E4, vector pTGF8-2hyg-s) ) a 5 mL de composição de libertação. As células tinham sido cultivadas como descrito no Exemplo 1. A suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, 69 centrifugados, a 1200xg, durante 1 minuto, de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para FVIII:C. Para uma descrição esquemática geral da experiência, ver também a Fig. 2. Diferentes concentrações de CaCl2 foram preparadas e adicionadas à suspensão celular de acordo com o processo anteriormente descrito, de modo a estudar em que gama de concentração de cloreto de cálcio a libertação de FVIII ocorre. Os resultados são resumidos na Tabela 18.

Tabela 18

Cone. de libertação* FVIII:C, (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x IO"6/ célula (IU) Razão FVIII:C/ FVIII:Ag Pureza FVIII:C/ proteína, (iu/pg) ADN/ FVIII (ug/iu) NaCl a 0,1 M 1, 48 100 0,48 0,63 0, 026 0,69 NaCl a 0,55 M 10,2 689 3,29 0,72 0,160 0,91 CaCl2 a 0,01 M 1,14 77 0,37 0,51 0, 020 NA CaCl2 a 0,01 M + NaCl a 0,10 M 2,12 143 0,68 0,56 0, 050 NA CaCl2 a 0,04 M 3,32 224 1,07 NA 0, 072 NA CcLCl2 cl 0,05 M 4,34 293 1,40 0,75 0, 094 NA 70 (continuação)

Cone. de libertação* FVIII:C, (IU/mL) FVIII:C (%) FVIII:C x IO"6/ célula (IU) Razão FVIII:C/ FVIII:Ag Pureza FVIII:C/ proteina, (IU/pg) ADN/ FVIII (ug/iu) CaCl2 a 0, 075 M 7, 70 520 2,48 0,93 0, 226 NA CaCl2 a 0,10 M co 674 3,22 1,11 0,293 ΟΛ O O CcLCl2 3. 0,15 M 10,5 707 3,39 0,98 0,327 NA C3CI2 cL 0,20 M 10,5 707 3,39 NA NA NA *A condutividade na CS é calculada para corresponder a cerca de 0,1 M de NaCl. NA: não analisado

Conclusão: Cloreto de cálcio pode ser utilizado como um libertador eficaz de FVIII. A condição de libertação óptima parece ser de cerca de 0,1 M de CaCl2. Em comparação com NaCl, o processo de libertação de CaCl2 parece produzir uma recolha mais pura com qualidade superior. A libertação de ADN das células é significativamente diminuída (um factor 10) quando se utiliza o método de libertação de cloreto de cálcio, em comparação com o método de libertação de elevado teor de NaCl (0,55 M) . Esta é uma caracteristica muito interessante do cloreto de cálcio visto que, de um ponto de vista de purificação, a remoção de ADN no produto é uma questão importante quando se trabalha com medicamentos produzidos de modo recombinante. A exigência regulatória de teor de ADN no produto final é definida como muito baixa, de modo a proteger transmissões não desejadas. 71

Deste modo, um processo de recolha de baixa libertação de ADN é uma propriedade altamente interessante do método da invenção.

Exemplo 10 Cultura à escala piloto, libertação de FVIII com NaCl/CaCl2/His, etapa de captura.

Foi filtrado 9844 g de CS9 (amostra 1), 2,4 x 106 células/mL, (clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) através de um filtro de perfil de 0,5 pm (0,6 m2). O filtro (com as células removidas) foi, depois, lavado com 7,5 L de uma solução de NaCl a 0,55 M +CaCl2 a 10 mM +Histidina a 10 mM, pH 7, de modo a libertar qualquer FVIII aderente. O filtrado e a lavagem foram agregados (amostra 2) . Antes de utilização, o filtro tinha sido lavado com 12 L de água destilada e equilibrado com 2 L de um tampão contendo NaCl a 100 mM + CaCl2 a 10 mM + histidina a 10 mM, pH 7. A filtração foi realizada com uma pressão transmembranarr de 0,2 bar. Cerca de metade do filtrado (47%) foi utilizado para processamento adicional para a etapa de captura (permutador de cromatografia aniónica), o material foi diluído para uma condutividade final de 13,0 mS/cm, a 25 °C, antes de o aplicar à etapa de captura. Foi aplicado 9317 g do material de partida (amostra 3) à etapa de captura após a eluição da etapa de captura com força iónica crescente, foram eluídos 3,8 g do produto (amostra 4). Os resultados são resumidos na Tabela 19. 72

Tabela 19

Amostra N° (g) FVIII (IU/mL) FVIII, total (IU) Rendimento total, (%) Rendimento de cada etapa (%) Amostra 1 (CS) 9844 0, 62 6103 100 100 Amostra 2 (filtrado celular) 12276 1,13 13845 226 226 Amostra 3 (início de captura) 9317 0, 68 6336 226 100 Amostra 4 (eluato de captura) 318 14, 0 4452 146 70

Conclusão: 0 exemplo mostra uma forma diferente de utilização da invenção; a substância de libertação (NaCl a 0,55 M) é adicionada após a separação de células e sobrenadante celular. A vantagem é um nivel inferior de força iónica na solução recuperada após filtração. A força iónica inferior pode ser de importância se a solução deve ser, adicionalmente, purificada numa etapa de captura baseada em permuta iónica. Um permutador iónico não pode ser processado com uma força iónica demasiado elevada. Nessa proteína c, a solução deve ser diluída, o que pode ter determinadas desvantagens práticas, em virtude de grandes volumes após diluição. Deste modo, o processo de libertação descrito minimiza o volume de diluição antes da etapa de captura. O processo descrito, em escala de litro, aumentou a recuperação de FVIII cerca de 2 vezes (em comparação com c não tratada). Os meios de suspensão celular poderiam ser removidos 73 com êxito, utilizando um permutador de cromatografia aniónica, o que também reduziu o volume com um factor de 29.

Exemplo 11: Cultura em escala de litro, Libertação de CaCl2, Etapa de captura. A 7403 g de suspensão celular (a amostra 1 foi retirada, centrifugada e o sobrenadante isento de células foi analisado para FVIII) contendo 3 x 106 células/mL, clone e vector serão incluídos por SW, foram adicionados 370 g de uma solução de CaCÍ2 a 1 M para uma concentração final de 50 mM de CaCl2. A solução foi agitada, durante 10 minutos (a amostra 2 foi retirada, centrifugada e sobrenadante isento de células foi analisado para FVIII), após o que as células foram removidas com filtração (filtro de perfil de 0,4 m2, 0,5 pm) . Antes de utilização, o filtro foi lavado com 10 L de água destilada e equilibrado com 5 L de um tampão contendo NaCl a 100 mM + CaCl2 a 50 mM + histidina a 50 mM, pH 7,1. A filtração foi realizada com uma pressão transmembranar de cerca de 0,2 bar. Depois de a suspensão celular ter sido filtrada, cada filtro foi lavado com 2 L do referido tampão de equilíbrio, de modo a recuperar FVIII adsorvido. O filtrado e a lavagem foram agregados (amostra 3, 11856 g) e adicionou-se Tween® 80 para uma concentração final de 0,01% (de modo a evitar adsorção de proteína durante processamento adicional). O filtrado 1 foi filtrado através de um filtro de 0,2 m2 0,5 pm/0,2 pm, de modo a proteger a resina de captura na etapa de permuta iónica seguinte. Antes de utilização, cada filtro foi lavado com 5 L de água destilada e equilibrado com 5 L de um tampão contendo NaCl a 100 mM + CaCl2 a 50 mM + histidina a 74 50 mM, + Tween® 80 a 0,01%, pH 7,1. A filtração foi realizada com uma pressão transmembranar de 0,5 bar. Depois de esse filtrado 1 ter sido filtrado, o filtro foi lavado com 4 L do referido tampão de equilíbrio, de modo a recuperar FVIII adsorvido. O filtrado e a lavagem foram agregados (14286 g, amostra 4). O filtrado de 0,2 pm foi diluido antes de aplicação à etapa de captura. 28613 g do material de partida (início de captura; amostra 5) foram aplicados à etapa de captura, 580 g do produto foram eluídos (amostra 6). Os resultados são resumidos na Tabela 20.

Tabela 20

Amostra N° Peso (g) FVIII (IU/mL) FVIII, total (IU) Rendimento, total (%) Rendimento de cada etapa (%) Amostra 1 (susp. celular) 7403 0,32 2369 100 100 Amostra 2 (susp. Celular + Ca) 7773 2, 8 21764 919 919 Amostra 3 (filtrado celular) 11874 1,7 20394 861 94 Amostra 4 (filtrado de 0,2 pm) 14286 1,39 19905 840 98 75 (continuação)

Amostra N° Peso (g) FVIII (IU/mL) FVIII, total (IU) Rendimento, total (%) Rendimento de cada etapa (%) Amostra 5 (início de captura) 28613 0,61 17454 737 100 Amostra 6 (eluato) 580 22, 8 13224 558 76

Conclusão: 0 processo de libertação da invenção, utilizando uma composição de libertação de CaCl2 a 50 mM, histidina a 50 mM e NaCl a 100 mM à escala piloto, aumentou a recuperação de FVIII com cerca de 9 vezes, em comparação com CS não tratada. Os meios de suspensão celular poderiam ser removidos com êxito, utilizando um permutador de cromatografia aniónica como uma etapa de captura, o que reduziu o volume com um factor de 50.

Exemplo 12: Aumento (NaCl a 0,4 M) e diminuição (NaCl a 0,1 M) de teor de sal durante a cultura.

Uma caracteristica muito importante da invenção seria se fosse possível utilizá-la em ciclos durante a cultura. Isto aumentaria, significativamente, a recuperação e a produtividade da linha celular. Abaixo, esta ideia foi testada com resultados promissores. 76 A (cultura de NaCl a 0,4 M) : A CS11 (1,8 mL) contendo 2,8 x 106 células/mL (clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGF8-3)) que tinha sido cultivada como descrito no Exemplo 1, foram adicionados 0,32 mL de NaCl a 2,1 M (concentração final de NaCl a 0,4 M). A solução foi misturada durante 15 minutos, após o que a suspensão foi cuidadosamente centrifuqada (60 x g), o sobrenadante celular foi retirado e analisado em relação a FVIIIrC, as restantes células foram, depois, dissolvidas nos meios de cultura de volta ao teor de sal normal (cerca de 0,1 M de NaCl). A suspensão celular foi deixada cescer, durante 3 dias, após o que o processo anterior foi repetido de novo, com a excepção de que a duração de tratamento de sal foi 2,5 h. A concentração de NaCl foi diminuída, de novo, em virtude de diluição com meio de cultura, para cerca de 0,1 Μ. A suspensão celular foi de novo deixada crescer, desta vez durante 4 dias. A concentração celular e FVIIIrC foram seguidos durante a experiência. B (cultura de NaCl a 0,1 M) r A experiência foi realizada como em A, com a excepção de que não foi adicionado NaCl. Deste modo, a concentração de NaCl era cerca de 0,1 M, como presente nos meios de cultura. Os resultados são resumidos na Tabela 21. 77

Tabela 21

Amostra Tempo (hora) Cone. celular (106) FVIII:C (IU/mL) A CS 0,4 M 0 2, 8 1,4 A CS 0,1 M 0 2,8 0,3 A CS 0,4 M 20 0,1 NA A CS 0,1 M 20 0,2 0,53 A CS 0,4 M 70 0, 8 0,24 A CS 0,1 M 70 0, 9 NA A CS 0,4 M 90 0,3 NA A CS 0,1 M 90 0,4 NA A CS 0,4 M 110 0,5 NA A CS 0,1 M 110 1,1 NA A CS 0,4 M 145 1,0 NA A CS 0,1 M 145 1,3 NA A CS 0,4 M 165 2,2 NA A CS 0,1 M 165 2,7 NA NA: não analisado.

Conclusão: Os resultados mostram que as células que foram tratadas com curtos pulsos de NaCl a 0,4 M, parecem crescer inicialmente um pouco mais lentamente. Contudo, após 165 horas, não existe diferença significativa entre o tratamento de elevado teor de sal e a referência. Em conclusão, utilizar curtos períodos de concentrações aumentadas de sal, de acordo com a invenção, parece ser uma possibilidade interessante. 78

Exemplo 13: Escala de produção, etapa de captura de composição de libertação com CaCl2 / histidina / NaCl FVIII A 150 kg de CS12 (a amostra 1 foi retirada, centrifugada e sobrenadante isento de células foi analisado para FVIII) contendo 0,8 x 106 células/mL, (clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGF8-3) foram adicionados 16,7 kg de uma solução de CaCl2 a 0,5 M, para uma concentração final de 50 mM de CaCl2. A solução foi agitada, durante 15 minutos (a amostra 2 foi retirada, centrifugada e sobrenadante isento de células foi analisado para FVIII), após o que as células foram removidas com filtração (filtro de perfil de 7 m2, 0,5 pm) . Antes de utilização, os filtros tinham sido lavados com 400 L de água destilada e equilibrados com 300 L de um tampão contendo NaCl a 100 mM + CaCl2 a 50 mM + histidina a 50 mM, pH 7,1. A filtração foi realizada com uma pressão transmembranar de cerca de 0,2 bar. Depois de a suspensão celular ter sido filtrada, os filtros foram lavados com 2 x 100 L do referido tampão de equilíbrio, de modo a recuperar FVIII adsorvido. O filtrado e a lavagem foram agregados (amostra 3, 359 kg) e adicionou-se Tween® 80 para uma concentração final de 0,01% (de modo a evitar adsorção de proteina durante processamento adicional).

O filtrado com Tween® adicionado (amostra 3) foi filtrado através de um filtro de 0,6 m2 0,5 pm/0,2 pm, de modo a proteger a etapa de captura. Antes de utilização, o filtro foi lavado com 50 L de água destilada e equilibrado com 50 L de um tampão contendo NaCl a 100 mM + CaCl2 a 50 mM + histidina a 50 mM, + Tween® 80 a 0,01%, pH 7,1. A filtração foi realizada com uma pressão transmembranar de cerca de 0,5 bar. O filtro foi lavado com 30 L de tampão de equilíbrio, de modo a recuperar FVIII 79 adsorvido. 0 filtrado e a lavagem foram agregados (38 kg, amostra 5) . 0 filtrado de 0,2 pm foi diluído antes de aplicação à etapa de captura 774 kg do material de partida (início de captura, amostra 5) foram aplicados ao permutador aniónico de captura 4,68 kg foram eluídos (amostra 6). Os resultados são resumidos na Tabela 22.

Tabela 22

Amostra N° Peso (kg) FVIII: FVIII, Rendimento Rendimento C total total, (%) de cada IU/mL) (klU) etapa (%) Amostra 1 (susp. celular) 150 0,75 112 100 100 Amostra 2 (susp. celular + Ca) 168 5,1 857 765 765 Amostra 3 359 2,9 1041 929 929 (filtrado 100 celular) Amostra 4 384 2,8 1075 960 97 (filtrado de 100 0,2 pm) Amostra 5 774 1,3 1006 898 94 (início de 100 captura) 80 (continuação)

Amostra N° Peso (kg) FVIII: C IU/mL) FVIII, total (klU) Rendimento total, (%) Rendimento de cada etapa (%) Amostra 6 4,680 195 913 815 91 (eluato de captura)

Conclusão: 0 desempenho do processo de libertação, utilizando CaCl2 a 50 mM, histidina a 50 mM e NaCl a 100 mM não é dependente de escala. A recuperação de FVIII aumenta com mais de 9 vezes para um tamanho de cultura em descontinuo de 150 kg. Adicionalmente, a solução de FVIII resultante poderia ser adicionalmente concentrada através de um permutador aniónico de captura. O factor de redução de volume ao longo da etapa de captura foi 165 vezes e o tempo de processo foi cerca de 4 h.

Exemplo 14: Libertação de FVIII em função da concentração celular utilizando NaCl a 0,1 M e 0,5 M.

Durante a cultura celular, realizada como descrito no Exemplo 1, amostras de CS13 (clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGF8-3) foram retiradas regularmente. As células foram contadas e a amostra de CS foi dividida em dois tubos. Num dos tubos, uma solução mãe de NaCl a 1 M foi adicionada 1 + 1 à CS, para uma concentração final de 0,5 Μ. A amostra foi incubada durante 15 minutos, após o que os tubos foram centrifugados, a 2500 r/min., durante 1 minuto, de modo a remover as células e o 81 sobrenadante celular foi analisado para actividade de FVIII:C. Os resultados são resumidos na Tabela 23.

Tabela 23

Tempo Células FVIII :C x 10“6/célula, FVIII:C x 10 6/célula, (h) viáveis, baixo teor de sal (NaCl elevado teor de sal (104/mL) a 0,1 M) (NaCl a 0,5 M) 0 9,7 NA NA 26 15,0 0,5 1,8 70 13,4 0,2 1,0 93 37,2 0,8 1,7 141 51,0 0,9 2,4 163 85,0 1,0 2,9 192 157 0,4 2,5 215 118 0,4 3,1 NA: não analisado.

Conclusão: 0 exemplo mostra claramente que FVIII está ligado às superfícies na célula durante a cultura celular. 0 nível de FVIII dentro da recolha de baixo teor de sal é quase inalterado quando a concentração celular aumenta. Ao passo que dentro da recolha de elevado teor de sal, o aumento de FVIII acompanha o aumento na concentração celular, como esperado, se nenhuma ou pequena interacção ocorrer com a membrana celular. 82

Exemplo 15: Estabilidade de sobrenadante celular contendo FVIII com concentração de cálcio diferente.

Uma suspensão celular (CS14), cultivada de acordo com o Exemplo 1 (clone HEK 293T 48/9H5, vector pTGF8-3), foi recolhida separando as células com centrifugação. Ao sobrenadante isento de células (pH 7) foram adicionadas diferentes quantidades de cloreto de cálcio. A solução foi armazenada à temperatura ambiente e as amostras foram retiradas e congeladas, a -70 °C, após 0,6 e 24 h. A estabilidade de FVIII foi seguida da análise a FVIII:C. Os resultados são resumidos na Tabela 24.

Tabela 24

Adição 0 h 6 h 24 h 48 h Cálcio a 0 mM 100% 95% 67% 48% Cálcio a 2 mM 100% 89% 92% 85% Cálcio a 10 mM 100% 95% 101% 93% Cálcio a 50 mM 100% 98% 100% 97%

Conclusão: O cálcio tem um efeito estabilizante sobre FVIII em meio de sobrenadante celular. Sabe-se, da literatura que o cálcio é um importante componente para a estrutura, função e estabilidade de FVIII na gama de 1-50 mM (Wang et al., International Journal of Pharmaceutics 259 (2003) 1-15). Deste modo, a utilização de cloreto de cálcio como uma substância de libertação para FVIII, de acordo com a invenção, tem efeito duplo: substância de libertação e estabilização de FVIII. 83

Além do mais, como pode ser verificado a partir da análise de transferência de Western na Fig. 3B, não pôde ser detectada alteração significativa na distribuição de massa molecular de FVIII em bruto, utilizando diferentes substâncias de libertação da invenção e em comparação com condições de recolha normais (cerca de 0,1 M de NaCl).

Exemplo 16: Produção de linhas celulares para um estudo de adsorção.

Nos exemplos 16 a 20 seguintes é proporcionado um estudo de adsorção, onde FVIII foi adicionado a falsas (= células sem capacidade de produção de FVIII) células HEK-293F e também células BHK. O resultado destas experiências mostra que, após adição de FVIII à suspensão celular, a quantidade de FVIII no sobrenadante celular diminuiu com o tempo, indicando adsorção sobre a superfície celular. Uma experiência idêntica, com a excepção de que foi utilizado IgG em vez de FVIII, foi realizada com as células HEK-293F. Esta experiência mostrou que IgG se adsorveu sobre as células HEK 293F cultivadas sob condições isentas de soro.

Linha celular: A linha celular de expressão é baseada na linha celular HEK 293F isenta de soro adaptada (ou, abreviadamente, 293F Invitrogen N° R790-07). Esta linha celular foi originalmente produzida por transformação de células de rim fetal humano com ADN de adenovírus de tipo 5 cortado (F. L. Graham et al., J. Gen. virol. 36(1), 59-74 (1974)). Espécie:

Humana; Tecido: Rim fetal; Morfologia: Semelhante a epitelial; Cariótipo: O cariótipo das células 293F não é especificado; o cariótipo das células 293 (ECACC N° 85120602), contudo, é 84 conhecido e descrito como 2n 46, hipotriplóide, número de modelo de cromossoma: 64.

Plasmídeo de expressão normal: Como plasmídeo de expressão foi utilizado um vector da família pcDNA3.1 (invitrogen) . 0 vector contém a cassete de expressão para factor VIII de coagulação humana de domínio B delecionado, com o péptido adaptador da SEQ ID N° 9 (SEQ ID Nos 4 e 6, respectivamente) . Este tem três trocas de resíduos de aminoácidos nas posições 162, 2011 e 2223 (em relação à sequência de comprimento completo mostrada na SEQ ID N° 2) . A expressão do BDDrFVIII é controlada por um promotor CMV. Este promotor, em relação ao intrão de SV40 e ao sítio de poli-adenilação, proporciona elevado nível de produção de proteína recombinante. A resistência contra dois antibióticos proporciona uma ferramenta eficiente para selecção de clone após transfecção. De modo a se poderem produzir proteínas de célula hospedeira sem FVIII (para desenvolvimento de método analítico baseado em anticorpo para proteínas de célula hospedeira) foi produzida uma denominada falsa linha celular, onde o gene de FVIII foi excluído do plasmídeo. Esta linha celular não produzindo FVIII também foi utilizada para estudos de adsorção de FVIII (e IgG).

Cultura: A cultura estática de células foi realizada em frascos TC de diferentes tamanhos. Todo o meio utilizado era isento de soro. Foram utilizadas garrafas para cultura dinâmica. Para efeitos de agitação, as garrafas foram colocadas num agitador horizontal situado dentro da incubadora. Todas as incubadoras foram reguladas para dióxido de carbono a 5%, 37 °C e humidade relativa de 95%. 85

Descrição da análise: Método de rastreio de Factor VIII: C baseado em Coatest: Este método é baseado no principio de duas fases e foi realizado utilizando a técnica de microplaca. Na fase um, é gerado factor X activado (Xa) por meio da via intrínseca onde o factor vni: C actua como um cofactor. Na fase dois, o Factor Xa é, depois, determinado através da utilização de um substrato cromogénico sintético, S-2222, na presença de um inibidor de trombina I-2581, de modo a prevenir hidrólise do substrato por trombina. A reacção é interrompida com ácido e a actividade de VIII: C que é proporcional à libertação de pNA (para-nitroanilina), é determinada fotometricamente, a 405 nm, contra um branco reagente. O método cumpre os requisitos da Farmacopeia Europeia. A unidade de factor VIII: C é expressa em unidades internacionais (IU), como definidas no presente International Concentrate Standard (IS) estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A rotina utilizando tampão contendo BSA a 1%, em vez de plasma de hemofílico grave para pré-diluições, foi validada. ELISA de IgG: As concentrações de IgG foram determinadas com um método ELISA, ELISA IgG de Murganho (Roche Applied Science, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Um anticorpo de captura especial é ligado de modo adsortivo aos poços de microplacas. Após bloqueio com reagente de Bloqueio, o anticorpo contido na amostra (e. g., sobrenadante de hibridoma, diluição de ascite, etc.) é ligado ao anticorpo de captura durante uma etapa de incubação adicional. O POD é fixo ao anticorpo monoclonal, utilizando uma mistura equilibrada, marcada com POD, de anticorpos anti-murganho e anti-murganho 86 (fragmentos Fab imunoadsorvidos). Com o sistema altamente sensível, ABTS-perborato, é formada uma cor verde escura na reacção com as peroxidases fixadas. A avaliação é realizada utilizando um gráfico padrão.

Exemplo 17: Produção de uma amostra de laboratório de um FVIII de domínio B delecionado na Linha Celular HEK 293F.

Linha celular: A linha celular de expressão é baseada na linha celular HEK 293F isenta de soro adaptada (ou, abreviadamente, 293F Invitrogen N° R790-07) . Esta linha celular foi originalmente gerada por transformação de células de rim fetal humano com ADN de adenovírus de tipo 5 cortado (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1), 59-74 (1974)). Espécie:

Humana; Tecido: Rim fetal; Morfologia: Semelhante a epitelial; Cariótipo: 0 cariótipo das células 293F não é especificado; o cariótipo das células 293 (ECACC N° 85120602), contudo, é conhecido e descrito como 2n = 46, hipotriplóide, número de modelo de cromossoma: 64.

Plasmídeo de expressão: Como plasmídeo de expressão foi utilizado um vector da família pcDNA3.1 (Invitrogen). O vector contém a cassete de expressão para factor VIII de coagulação humana de domínio B delecionado, com o péptido adaptador da SEQ ID N° 9 (SEQ ID Nos 4 e 6, respectivamente) . Este tem três trocas de resíduos de aminoácidos nas posições 162, 2011 e 2223 (em relação à sequência de comprimento completo mostrada na SEQ ID N° 2) . A expressão do BDDrFVIII é controlada por um promotor CMV. Este promotor, em relação ao intrão de SV40 e ao sítio de poli-adenilação, proporciona elevado nível de produção de proteína recombinante. A resistência contra dois antibióticos 87 proporciona uma ferramenta eficiente para selecção de clone após transfecção.

Transfecção: Imediatamente após revitalização, células 293F aderentes foram transfectadas com pcDNA3.1 utilizando o método do fosfato de cálcio (C. Chen et al.r Mol. Cell Biol. 7(8), 2745-2752 (1987)). A selecção com higromicina (200 ng/mL) começou 72 h após transfecção. Após 10 dias sob selecção, clones individuais resistentes a higromicina foram isolados, expandidos e subclonados através de duas séries consecutivas de clonagem de célula única. A produção de FVIII recombinante foi quantificada no sobrenadante de clones resistentes a higromicina, utilizando ensaios ELISA e aPTT. Este processo conduziu à selecção do clone N° 293F 4/24K.

Cultura: A cultura estática de células foi realizada em frascos TC de diferentes tamanhos. Todo o meio utilizado era isento de soro. Para cultura dinâmica foram utilizadas garrafas e biorreactores de até 100 L. Para efeitos de agitação, as garrafas foram colocadas num agitador horizontal situado dentro da incubadora. Todas as incubadoras foram reguladas para dióxido de carbono a 5%, 37 °C e humidade relativa de 95%.

Exemplo 18: Adsorção de FVIII a células HEK 293F isentas de soro cultivadas.

Uma suspensão de células HEK 293F foi cultivada sob condições isentas de soro, de acordo com o Exemplo 16. Foi adicionado FVIII como descrito na Tabela 25 e a suspensão 88 celular (1 χ 106 células/mL) foi cultivada como anteriormente, foi retirada amostra de sobrenadante isento de células após 1, 5 e 24 h (controlos de solução de FVIII respectivamente adicionados a meio sem células e incubados sob as mesmas condições que a suspensão celular, foram retirados ao mesmo tempo). As amostras foram congeladas e analisadas para actividade de FVIII:C. Os resultados são resumidos na Tabela 26.

Tabela 25

Adição de FVIII Tipo de factor A, 100 IU/mL FVIII de comprimento completo derivado de plasma estabilizado com vWf* B, 100 IU/mL FVIII** recombinante de domínio B delecionado * Octanate® (Octapharma) ** Uma amostra de laboratório de FVIII de domínio B delecionado, pureza de 90%, sem teor de vWf, cultivada de acordo com o Exemplo 17

Tabela 26 FVIII FVIII:C [IU/mL] Alteração* A, 1 h 50,1 7,5 % A, 5 h 48,5 4,0% A, 24 h 27, 4 -41,4 % B, 1 h 27, 6 6,4% B, 5 h 15,0 -42,2 % 89 (continuação) FVIII FVIII:C [IU/mL] Alteração* B, 24 h 8, 5 -48,3 % * Após compensação com controlo

Conclusão: FVIII adsorve-se a superfície celular sob premissas de cultura. Tendência de que FVIII recombinante de domínio B delecionado adsorve mais rapidamente, em comparação com FVIII de comprimento completo de plasma estabilizado com factor de von Willebrandt.

Exemplo 19: Adsorção de FVIII a células BHK, Células ABHK-21 (ATCC 13001) foram cultivadas em Cytodex-3 em frasco spinner de 250 mL (Corning) . O meio utilizado foi D-MEM com FBS a 10%. Antes de utilização, o sobrenadante celular foi trocado com 3 volumes de tampão isento de soro (PBS-A com edta a 0,03% p/p), de modo a remover os componentes do soro. Foi adicionado FVIII como descrito na Tabela 27 e a suspensão celular (1,5 χ 106 células/mL) foi cultivada como anteriormente, foi retirada amostra de sobrenadante isento de células após 1, 5 e 24 h (controlos de solução de FVIII respectivamente adicionados a meio sem células e incubados sob as mesmas condições que a suspensão celular, foram retirados ao mesmo tempo). Os resultados são resumidos na Tabela 28. 90

Tabela 27

Adição de FVIII Tipo de factor A, 100 IU/mL FVIII de comprimento completo derivado de plasma estabilizado com vWf* * Octanate® (Octapharma)

Tabela 28 FVIII FVIII:C [IU/mL] Alteração* A, 1 h 50, 6 8,4 % A, 5 h 45, 6 -2,3% A, 24 h 30,1 -35,5 % * Após compensação com controlo

Conclusão: FVin adsorve-se a superfície de células bhk sob premissas de cultura.

Exemplo 20: Adsorção de IGG a células hek 293f isentas de soro cultivadas.

Uma suspensão de células HEK 293F foi cultivada 6 dias sob condições isentas de soro, de acordo com o Exemplo 16. Às células (0,9 x 106 células/mL) diferentes quantidades de IGG (padrão IgG liofilizado (Roche Diagnostics) diluídas em PBS a três soluções diferentes de 10300, 1030 e 103 ng/mL). As diferentes soluções estaminais de IgG foram divididas em porções 91 para dentro de microtubos e uma parte (0,25 mL) destas soluções padrão foi misturada com uma parte (0,25 mL) das células ressuspensas. isto conduziu a uma diluição de 2 vezes dos padrões IgG e, por conseguinte, as concentrações esperadas de IgG eram 5150, 515 e 51,5 ng/mL. Como controlos positivos, uma parte de cada solução padrão de IgG foi misturada com uma parte de meio de cultura e, como controlos negativos, uma parte das células ressuspendidas foi misturada com uma parte de PBS-A puro, não contendo IgG. Após 1 h de incubação, as amostras foram centrifugadas a 6000 rpm e os sobrenadantes foram recolhidos e analisados. As experiências de amostras foram repetidas 6 vezes e as experiências de controlo foram repetidas, pelo menos, 9 vezes. As amostras foram congeladas e analisadas para teor de IGG.

Resultados: Uma visão geral dos resultados das experiências, onde os padrões IgG de três concentrações diferentes foram incubados juntamente com células HEK, é apresentada nas Tabelas 29 e 30. Apesar de a exactidão do resultado, após incubação com solução padrão a 5150 ng/mL, não ser adequada, -5,02 ± 20,0%, todos os resultados mostram uma diminuição na concentração de IgG após incubação. Com as outras duas soluções padrão, 515 e 51,5 ng/mL, a diminuição foi -26,0 ± 9,10% e -15,8 ± 11,5%, respectivamente. Esta redução de IgG nos sobrenadantes de amostra, comparativamente com controlos positivos, indica que IgG se adsorveu a células HEK. 92

Tabela 29: Concentrações médias de IgG e desvios-padrão para controlos e amostras em experiências de adsorção. Três concentrações de IgG diferentes (5150 ng/mL, 515 ng/mL e 51,5 ng/mL) foram incubadas juntamente com meio novo (em controlos) e suspensão de HEK contendo 0,9 x 106 células HEK/mL (em amostras).

Cone. de IgG antes de incubação [ng/mL] Cone. média de IgG após incubação, μ [ng/mL] Desvio- padrão Controlos positivos: 5150 4860 945 (sem células) 515 619 59,1 51,5 49, 7 5,57 Controlos negativos: (0,9 x 106 células/mL) 0 <7,00 Amostras: 5150 4610 337 (0,9 x 106 células/mL) 515 458 30, 6 51,5 41,9 4,98 93

Tabela 30: Intervalos de confiança de 95% para μ3 - μπ, onde μ3 é a concentração média de igG na amostra e μα é concentração média de IgG nos controlos para cada solução estaminal, respectivamente.

Concentração de IgG antes de incubação [ng/mL] conf. de 95% [ng/mL] interv. para μ3 - hc [%] Alteração na - quantidade de IgG por célula [pg/célula] 5150 -244 ± -5,02 ± -0,542 ± 2,17 970 20,0 515 -161 ± -26,0 ± -0,357 ± 56,3 9,10 0,124 51,5 -7,85 ± -15,8 ± -0,0174 ± 5, 72 11,5 0,0131 Conclusão: IGG liga-se a células HEK 293 cultivadas sob condições isentas de soro.

Exemplo 21: Produção de Linha Celular de Expressão.

Linha celular: A linha celular de expressão é baseada na linha celular HEK 293F isenta de soro adaptada (ou, abreviadamente, 293F invitrogen N° R790-07) . Esta linha celular foi originalmente produzida por transformação de células de rim fetal humano com ADN de adenovirus de tipo 5 cortado (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1), 59-74 (1974)). Espécie:

Humana; Tecido: Rim fetal; Morfologia: Semelhante a epitelial; 94

Cariótipo: 0 cariótipo das células 293F não é especificado; o cariótipo das células 293 (ECACC N° 85120602), contudo, é conhecido e descrito como 2n = 46, hipotriplóide, número de modelo de cromossoma: 64.

Plasmídeo de expressão: Como plasmídeo de expressão foi utilizado um vector da família pcDNA3.1 (Invitrogen). O vector contém a cassete de expressão para factor VIII de coagulação humana de domínio B delecionado, com o péptido adaptador da SEQ ID N° 9 (SEQ ID Nos 4 e 6, respectivamente) . Este tem três trocas de resíduos de aminoácidos nas posições 162, 2011 e 2223 (em relação à sequência de comprimento completo mostrada na SEQ ID N° 2) . A expressão do BDDrFVIII é controlada por um promotor CMV. Este promotor, em relação ao intrão de SV40 e ao sítio de poli-adenilação, proporciona elevado nível de produção de proteína recombinante. A resistência contra dois antibióticos proporciona uma ferramenta eficiente para selecção de clone após transfecção.

Transfecção: Imediatamente após revitalização, células 293F aderentes foram transfectadas com pcDNA3.1 utilizando o método do fosfato de cálcio (C. Chen et al., Mol. Cell Biol. 7(8), 2745-2752 (1987)). A selecção com higromicina (200 ng/mL) começou 72 h após transfecção. Após 10 dias sob selecção, clones individuais resistentes a higromicina foram isolados, expandidos e subclonados através de duas séries consecutivas de clonagem de célula única. A produção de FVIII recombinante foi quantificada no sobrenadante de clones resistentes a higromicina, utilizando ensaios ELISA e aPTT. Este processo conduziu à selecção do clone N° 293F 4/24K. 95

Suspensão celular: O material de partida para experiências de recolha é a suspensão celular (a seguir, abreviadamente, referido como "CS"). Antes de utilização, a suspensão celular foi induzida com butirato de sódio durante, pelo menos, um dia, de modo a melhorar a produtividade das células.

Descrição de análise, Factor VIII: C, Método de rastreio baseado em Coatest: Este método é baseado no princípio de duas fases e foi realizado utilizando a técnica de microplaca. Na fase um, é produzido factor X activado (Xa) por meio da via intrínseca onde o factor VIII: C actua como um cofactor. Na fase dois, o Factor Xa é, depois, determinado através da utilização de um substrato cromogénico sintético, S-2222, na presença de um inibidor de trombina 1-2581, de modo a prevenir hidrólise do substrato por trombina. A reacção é interrompida com ácido e a actividade de VIII: C que é proporcional à libertação de pNA (para-nitroanilina), é determinada fotometricamente, a 405 nm, contra um branco reagente. O método cumpre os requisitos da Farmacopeia Europeia. A unidade de factor vni: C é expressa em unidades internacionais (IU), como definidas no presente International Concentrate Standard (IS) estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A rotina foi validada 96 utilizando tampão contendo BSA a 1%, em vez de plasma hemofílico grave para pré-diluições.

Exemplo 22: Recolha utilizando concentração diferente de peptona.

Diferentes quantidades de peptona sólida (Soy Peptone A2 SC 19649, Organo Technie, La Courneuve, França) ou sais (ver a Tabela 31) foram adicionadas a 10 mL de uma suspensão celular (2,0 x 106 células/mL). As células tinham sido cultivadas como descrito no Exemplo 21 e foram retiradas antes da recolha. As substâncias de lavagem foram dissolvidas e a suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C) , utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 600 r/min., durante 5 min., de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para actividade de FVIII:C. Os resultados são resumidos na Tabela 31.

Tabela 31

Concentração de FVIII:C Libertação de FVIII [IU lavagem [IU/mL]* FVIII:C x 10-6/célula]* Referência, não 1,1 0,55 tratada NaCl a 0,5 M 6,7 3, 35 CaCl2 a 50 mM 7,6 3, 78 NaCl a 0,5 M + CaCl2 8,5 4,25 a 50 mM 97 (continuação)

Concentração de lavagem FVIII:C [IU/mL]* Libertação de FVIII [IU FVIII:C x 10—6/célula]* Peptona a 2,5% O CM 1, 00 Peptona a 5% 3,3 1, 65 Peptona a 10% 5, 9 2, 95 Peptona a 20% 6,7 3, 35 * Compensada para factores de diluição

Conclusão: 0 aumento da concentração de cloreto de sódio e/ou cloreto de cálcio ou peptona, antes da recolha, aumenta significativamente o FVIII recuperado, em comparação com amostra não tratada.

Exemplo 23: Cultura com e sem baixa quantidade de peptona e, a seguir, adição de peptona a baixa concentração, de modo a estudar a libertação de FVIII sob condições que possam ser utilizadas durante a cultura.

Nesta experiência, foram utilizadas duas suspensões celulares cultivadas diferentes, ambas contendo insulina a 5 mg/mL (Monotard®, Novo Nordisk) e uma contendo também peptona a 0,2% no meio de cultura isento de soro desde o início. De outro modo, a suspensão celular foi cultivada como descrito no Exemplo 21.

Diferentes quantidades de peptona (Peptona de Soja A2 SC 19649, Organo Technie, La Courneuve, França) ou CaCl2 (nomeadamente uma solução de CaCl2 a 0,5 M para se atingir uma 98 concentração final de CaCl2 a 50 mM; ver a Tabela 32) foram adicionadas a 5 mL de suspensão celular (1, 62 x 106 células/mL para suspensão celular cultivada sem peptona e 1,38 x 106 células/mL para suspensão celular cultivada com peptona a 0,2%). A peptona adicionada era uma solução a 10% dissolvida em meio de cultura (com excepção para a experiência de peptona a 18%, na qual a peptona foi adicionada como sólido). Após adição de substâncias de libertação, a suspensão foi suavemente misturada (utilizando uma misturadora de oscilação), durante 1 h, à temperatura ambiente (21 °C), utilizando tubos de 15 mL. Os tubos foram, depois, centrifugados, a 600 r/min., durante 5 min., de modo a remover as células, após o que o sobrenadante celular foi analisado para actividade de FVIII:C. Os resultados são resumidos na Tabela 32.

Tabela 32

Quantidade adicionada de FVIII: C x 10"6/ FVIII: C x 10“6 componente de libertação a célula / célula tempo para recolha (cultivado com (cultivado com peptona a 0,2%)* peptona a 0%)* 0 (referência, não tratada) 0,51 0,40 Peptona a 0,2% 0,51 0,41 Peptona a 0,9% 0,54 0,52 Peptona a 1,7% 0, 70 0,50 Peptona a 2,9% 0, 72 0,53 Peptona a 18% (elevada conc., 1, 71 1,57 ref.) CaCl2 a 50 mM (referência 1, 62 1, 84 99 (continuação)

Quantidade adicionada de FVIII :C x 10'6/ FVIII: C x 10"6 componente de libertação a célula / célula tempo para recolha (cultivado com (cultivado com peptona a 0,2%)* peptona a 0%)* salina) * Compensada para factores de diluição

Conclusão: A cultura com baixas quantidades de peptona liberta mais FVIII da superfície celular, em comparação com cultura sem qualquer peptona adicionada (ver a amostra de referência, não tratada). Isto também é válido quando é adicionada pequena quantidade de peptona, 1 h antes de recolha. Deste modo, a peptona contribui para a libertação de FVIII da superfície celular, mesmo em concentrações relativamente baixas que possam ser utilizadas durante o processo de cultura, sem efeito negativo para as células. 100

Listagem da Sequências, Texto Livre SEQ ID N° 1: Sequência de ADN de factor VIII humano. SEQ ID N° 2: Sequência de aminoácidos de factor VIII humano. SEQ ID N° 3: Sequência de adn de vector pTGF8-3. SEQ ID N° 4: Sequência de aminoácidos de factor VIII de domínio B delecionado como codificado por pTGF8-3. SEQ ID N° 5: Sequência de ADN de vector pTGF8-2hyg-s. SEQ ID N° 6: Sequência de aminoácidos de factor vill de dominio B delecionado como codificado por pTGF8-2hyg-s. SEQ ID Nos 7 a 9: Péptidos Adaptadores. SEQ ID N° 10: Sequência de ADN de vector pTGF36. SEQ ID N° 11: Sequência de aminoácidos de factor IX como codificado por pTGF36. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Octapharma <120> Método Para Isolamento Melhorado De Proteínas Recombinantemente Produzidas <130> 060770wo/jh <140> <141> <150> Documento EP 05102475.0 <141> 2005-03-29 101 <16 0> 11 <17Ο> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 6996 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(6996) < 4 Ο Ο > 1 gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gea gtg gaa ctg tea tgg gac tat 48 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Vai Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 atg caa agt gat ctc ggt gag ctg cct gtg gac gea aga ttt cct cct 96 Met Gin Ser ASp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 aga gtg cca aaa tct ttt cca ttc aac acc tea gtc gtg tac aaa aag 144 Arg Vai Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 act ctg ttt gta gaa ttc acg gtt cac ctt ttc aac ate gct aag cca 192 Thr Leu Phe Vai Glu Phe Thr Vai His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 agg cca ccc tgg atg ggt ctg cta ggt cct acc ate cag gct gag gtt 240 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He Gin Ala Glu Val 65 70 75 80 tat gat aca gtg gtc att aca ctt aag aac atg gct tcc cat cct gtc 288 Tyr Asp Thr Vai vai Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro val 85 90 95 agt ctt cat gct gtt ggt gta tcc tac tgg aaa gct tct gag gga gct 336 Ser Leu Hls Ala Vai Gly Vai Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 gaa tat gat gat cag acc agt caa agg gag aaa gaa gat gat aaa gtc 384 Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 ttc cct ggt gga age cat aca tat gtc tgg cag gtc ctg aaa gag aat 432 Phe Pro Glv Glv Ser His Thr Tvr Vai TrD Gin Val Leu Lvs Glu Asn 130 135 140 102 ggt cca atg gee tct gac cca ctg tgc ctt acc tac tea tat ctt tct 480 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 cat gtg gac ctg gta aaa gac ttg aat tea ggc ctc att gga gee cta 528 His Vai Asp Leu Vai Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 cta gta tgt aga gaa ggg agt ctg gee aag gaa aag aca cag acc ttg 576 Leu Vai Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 180 185 190 cac aaa ttt ata cta ctt ttt gct gta ttt gat gaa 999 aaa agt tgg 624 His Lys Phe lie Leu Leu Phe Ala vai Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 cac tea gaa aca aag aac tcc ttg atg cag gat agg gat gct gea tct 672 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 gct cgg gee tgg cct aaa atg cac aca gtc aat ggt tat gta aac agg 720 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 .230 235 240 tct ctg cca ggt ctg att gga tgc cac agg aaa tea gtc tat tgg cat 768 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 gtg att gga atg ggc acc act cct gaa gtg cac tea ata ttc ctc gaa 816 Vai Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val HiS Ser ile Phe Leu Glu 260 265 270 ggt cac aca ttt ctt gtg agg aac cat ege cag gcg tcc ttg gaa ate 864 Gly His Thr Phe Leu Vai Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 tcg cca ata act ttc ctt act gct caa aca ctc ttg atg gac ctt gga 912 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 cag ttt cta ctg ttt tgt cat ate tct tcc cac caa cat gat ggc atg 960 Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gin His Asp Gly Met 305 310 315 320 gaa gct tat gtc aaa gta gac age tgt cca gag gaa ccc caa cta cga 1008 Glu Ala Tyr Vai Lys Vai Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg 325 330 335 atg aaa aat aat gaa gaa gcg gaa gac tat gat gat gat ctt act gat 1056 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 tct gaa atg gat gtg gtc agg ttt gat gat gac aac tct cct tcc ttt 1104 Ser Glu Met Asp Vai Vai Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 ate caa att ege tea gtt gee aag aag cat cct aaa act tgg gta cat 1152 lie Gin Ile Arg Ser Vai Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp val His 370 375 380 tac att gct gct gaa gag gag gac tgg gac tat gct ccc tta gtc ctc 1200 103

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 gcc ccc gat gac aga agt tat aaa agt caa tat ttg aac aat ggc cct 1248 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 cag cgg att ggt agg aag tac aaa aaa gtc cga ttt atg gca tac aca 1296 Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 gat gaa acc ttt aag act cgt gaa gct att cag cat gaa tca gga ate 1344 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gin His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 ttg gga cct tta ctt tat ggg gaa gtt gga gac aca ctg ttg att ata 1392 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu vai Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 ttt aag aat caa gca age aga cca tat aac ate tac cct cac gga ate 1440 Phe Lys Agn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 act gat gtc cgt cct ttg tat tca agg aga tta cca aaa ggt gta aaa 1488 Thr Asp Vai Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 cat ttg aag gat ttt cca att ctg cca gga gaa ata ttc aaa tat aaa 1536 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 tgg aca gtg act gta gaa gat ggg cca act aaa tca gat cct cgg tgc 1584 Trp Thr vai Thr Vai Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 ctg acc cgc tat tac tct agt ttc gtt aat atg gag aga gat cta gct 1632 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Vai Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 tca gga ctc att ggc cct ctc ctc ate tgc tac aaa gaa tct gta gat 1680 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 caa aga gga aac cag ata atg tca gac aag agg aat gtc ate ctg ttt 1728 Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 tct gta ttt gat gag aac cga age tgg tac ctc aca gag aat ata caa 177 6 Ser Vai Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gin 580 585 590 cgc ttt ctc ccc aat cca gct gga gtg cag ctt gag gat cca gag ttc 1824 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Vai Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 caa gcc tcc aac ate atg cac age ate aat ggc tat gtt ttt gat agt 1872 Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 ttg cag ttg tca gtt tgt ttg cat gag gtg gca tac tgg tac att cta 1920 Leu Gin Leu Ser Vai Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 104 age att gga gea cag act gac ttc ctt tet gtc ttc ttc tet gga tat 1968 Sec Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Vai Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa gac aca ctc acc cta ttc cca 2016 Thr Phe Lys Hls Lys Met Vai Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 ttc tea gga gaa act gtc ttc atg teg atg gaa aac cca ggt cta tgg 2064 Phe Ser Gly Glu Thr Vai Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 att ctg 999 tgc cac aac tea gac ttt cgg aac aga ggc atg acc gee 2112 Ile Leu Gly Cys Hls Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 tta ctg aag gtt tet agt tgt gac aag aac act ggt gat tat tac gag 2160 Leu Leu Lys Vai Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 gac agt tat gaa gat att tea gea tac ttg ctg agt aaa aac aat gee 2208 Asp Ser Tyr Glu Asp ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 att gaa cca aga age ttc tcc cag aat tea aga cac cct age act agg 2256 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 740 745 750 caa aag caa ttt aat gee acc aca att cca gaa aat gac ata gag aag 2304 Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys 755 760 765 act gac cct tgg ttt gea cac aga aca cct atg cct aaa ata caa aat 2352 Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gin Asn 770 775 780 gtc tcc tet agt gat ttg ttg atg ctc ttg cg a cag agt cct act cca 2400 vai Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gin Ser Pro Thr Pro 785 790 795 800 cat 999 cta tcc tta tet gat ctc caa gaa gee aaa tat gag act ttt 2448 Hls Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 805 810 815 tet gat gat cca tea cct gga gea ata gac agt aat aac age ctg tet 2496 Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 820 825 830 gaa atg aca cac ttc agg cca cag ctc cat cac agt 999 gac atg gta 2544 Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gin Leu Hls His Ser Gly Asp Met vai 835 840 845 ttt acc cct gag tea ggc ctc caa tta aga tta aat gag aaa ctg ggg 2592 Phe Thr Pro Glu ser Gly Leu Gin Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 850 855 860 aca act gea gea aca gag ttg aag aaa ctt gat ttc aaa gtt tet agt 2640 Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Vai Ser Ser 865 870 875 880 aca tea aat aat ctg att tea aca att cca tea gac aat ttg gea gea 2688 Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895 105 ggt act gat aat aca agt tcc tta gga ccc cca agt atg cca gtt cat 2736 Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 900 905 910 tat gat agt caa tta gat acc act cta ttt ggc aaa aag tca tet ccc 2784 Tyr Asp Ser Gin Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925 ctt act gag tet ggt gga cct ctg age ttg agt gaa gaa aat aat gat 2832 Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940 tca aag ttg tta gaa tca ggt tta atg aat age caa gaa agt tca tgg 2880 Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960 gga aaa aat gta teg tca aca gag agt ggt agg tta ttt aaa ggg aaa 2928 Gly Lys Asn vai Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975 aga gct cat gga cct gct ttg ttg act aaa gat aat gee tta ttc aaa 2976 Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990 gtt age ate tet ttg tta aag aca aac aaa act tcc aat aat tca gea 3024 Vai Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005 act aat aga aag act cac att gat ggc cca tca tta tta att gag aat 3072 Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn 1010 1015 1020 agt cca tca gtc tgg caa aat ata tta gaa agt gac act gag ttt aaa 3120 Ser Pro Ser val Trp Gin Asn ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys 1025 1030 1035 1040 aaa gtg aca cct ttg att cat gac aga atg ctt atg gac aaa aat gct 3168 Lys Vai Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala 1045 1050 1055 aca gct ttg agg cta aat cat atg tca aat aaa act act tca tca aaa 3216 Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys 1060 1065 1070 aac atg gaa atg gtc caa cag aaa aaa gag ggc ccc att cca cca gat 3264 Asn Met Glu Met Val Gin Gin Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp 1075 1080 1085 gea caa aat cca gat atg teg ttc ttt aag atg cta ttc ttg cca gaa 3312 Ala Gin Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu 1090 1095 1100 tca gea agg tgg ata caa agg act cat gga aag aac tet ctg aac tet 3360 Ser Ala Arg Trp Ile Gin Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser 1105 1110 1115 1120 ggg caa ggc ccc agt cca aag caa tta gta tcc tta gga cca gaa aaa 3408 Gly Gin Gly Pro Ser Pro Lys Gin Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys 1125 1130 1135 tet gtg gaa ggt cag aat ttc ttg tet gag aaa aac aaa gtg gta gta 3456 106

Ser Vai Glu Gly Gin Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val val 1140 1145 1150 gga aag ggt gaa ttt aca aag gac gta gga ctc aaa gag atg gtt ttt 3504 Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe 1155 1160 1165 cca age age aga aac cta ttt ctt act aac ttg gat aat tta cat gaa 3552 Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu 1170 1175 1180 aat aat aca cac aat caa gaa aaa aaa att cag gaa gaa ata gaa aag 3600 Asn Asn Thr His Asn Gin Glu Lys Lys Ile Gin Glu Glu Ile Glu Lys 1185 1190 1195 1200 aag gaa aca tta ate caa gag aat gta gtt ttg cct cag ata cat aca 3648 Lys Glu Thr Leu Ile Gin Glu Asn val val Leu Pro Gin Ile His Thr 1205 1210 1215 gtg act ggc act aag aat ttc atg aag aac ctt ttc tta ctg age act 3696 Vai Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr 1220 1225 1230 agg caa aat gta gaa ggt tea tat gag ggg gea tat gct cca gta ctt 3744 Arg Gin Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu 1235 1240 1245 caa gat ttt agg tea tta aat gat tea aca aat aga aca aag aaa cac 3792 Gin Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His 1250 1255 1250 aca gct cat ttc tea aaa aaa ggg gag gaa gaa aac ttg gaa ggc ttg 3840 Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu 1255 1270 1275 1280 gga aat caa acc aag caa att gta gag aaa tat gea tgc acc aca agg 3888 Gly Asn Gin Thr Lys Gin Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg 1285 1290 1295 ata tet cct aat aca age cag cag aat ttt gtc aog caa cgt agt aag 3936 He Ser Pro Asn Thr Ser Gin Gin Asn Phe val Thr Gin Arg Ser Lys 1300 1305 1310 aga gct ttg aaa caa ttc aga ctc cca cta gaa gaa aca gaa ctt gaa 3984 Arg Ala Leu Lys Gin Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu 1315 1320 1325 aaa agg ata att gtg gat gac acc tea acc cag tgg tcc aaa aac atg 4032 Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gin Trp Ser Lys Asn Met 1330 1335 1340 aaa cat ttg acc ccg age acc ctc aca cag ata gac tac aat gag aag 4080 Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gin Ile Asp Tyr Asn Glu Lys 1345 1350 1355 1360 gag aaa ggg gee att act cag tet ccc tta tea gat tgc ctt acg agg 4128 Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg 1365 1370 1375 agt cat age ate cct caa gea aat aga tet cca tta ccc att gea aag 4176 Ser His Ser Ile Pro Gin Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys 1380 1385 1390 107 gta tea tea ttt cca tct att aga cct ata tat ctg acc agg gtc cta 4224 Vai Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu 1395 1400 1405 ttc caa gac aac tct tct cat ctt cca gea gea tct tat aga aag aaa 4272 Phe Gin Asp Asn Ser ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys 1410 1415 1420 gat tct ggg gtc caa gaa age agt cat ttc tta caa gga gee aaa aaa 4320 Asp Ser Gly Val Gin Glu Ser Ser His Phe Leu Gin Gly Ala Lys Lys 1425 1430 1435 1440 aat aac ctt tct tta gee att cta acc ttg gag atg act ggt gat caa 4368 Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Me.t Thr Gly Asp Gin 1445 1450 1455 aga gag gtt ggc tcc ctg ggg aca agt gee aca aat tea gtc aca tac 4416 Arg Glu Vai Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr 1460 1465 1470 aag aaa gtt gag aac act gtt ctc ccg aaa cca gac ttg ccc aaa aca 4464 Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 tct ggc aaa gtt gaa ttg ctt cca aaa gtt cac att tat cag aag gac 4512 Ser Gly Lys val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gin Lys Asp 1490 1495 1500 cta ttc cct açg gaa act age aat ggg tct cct ggc cat ctg gat ctc 4560 Leu Phe Prc Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu 1505 1510 1515 1520 gtg gaa ggg age Ctt ctt cag gga aca gag gga gcg att aag tgg aat 4608 Vai Glu Gly Ser Leu Leu Gin Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn 1525 1530 1535 gaa gea aac aga cct gga aaa gtt ccc ttt ctg aga gta gea aca gaa 4656 Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu 1540 1545 1550 age tct gea aag act ccc tcc aag cta ttg gat cct ctt gct tgg gat 4704 Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp 1555 1560 1565 aac cac tat ggt act cag ata cca aaa gaa gag tgg aaa tcc caa gag 4752 Asn His Tyr Gly Thr Gin Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu 1570 1575 1580 aag tea cca gaa aaa aca gct ttt aag aaa aag gat acc att ttg tcc 4800 Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser 1585 1590 1595 1600 ctg aac gct tgt gaa age aat cat gea ata gea gea ata aat gag gga 4848 Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly 1605 1610 1615 caa aat aag ccc gaa ata gaa gtc acc tgg gea aag caa ggt agg act 4896 Gin Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gin Gly Arg Thr 1620 1625 1630 gaa agg ctg tgc tct caa aac cca cca gtc ttg aaa ege cat caa cgg 4944 Glu Arg Leu Cys Ser Gin Asn Pro Pro val Leu Lys Arg His Gin Arg 1635 1640 1645 108 gaa ata act cgt act act ctt Cag tea gat caa gag gaa att gac tat 4992 Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu ile Asp Tyr 1650 1655 1660 gat gat acc ata tea gtt gaa atg aag aag gaa gat ttt gac att tat 5040 Asp ASp Thr Ile Ser Vai Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr 1665 1670 1675 1680 gat gag gat gaa aat cag age ccc ege age ttt caa aag aaa aca cga 5088 Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg 1685 1690 1695 cac tat ttt att gct gea gtg gag agg etc tgg gat tat ggg atg agt 5136 His Tyr Phe Ile Ala Ala Vai Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser 1700 1705 1710 age tcc cca cat gtt cta aga aac agg gct cag agt ggc agt gtc cct 5184 Ser Ser Pro His Vai Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser Gly Ser Vai Pro 1715 1720 1725 cag ttc aag aaa gtt gtt ttc cag gaa ttt act gat ggc tcc ttt act 5232 Gin Phe Lys Lys Vai Vai Phe Gin Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr 1730 1735 1740 cag ccc tta tac cgt gga gaa cta aat gaa cat ttg gga ctc ctg ggg 5280 Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu HiS Leu Gly Leu Leu Gly 1745 1750 1755 1760 cca tat ata aga gea gaa gtt gaa gat aat ate atg gta act ttc aga 5328 Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Vai Glu Asp Asn Ile Met Vai Thr Phe Arg 1765 1770 1775 aat cag gee tet cgt CCC tat tcc ttc tat tet age ctt att tet tat 5376 Asn Gin Ala ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr 1780 1785 1790 gag gaa gat cag agg caa gga gea gaa cct aga aaa aac ttt gtc aag 5424 Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Vai Lys 1795 1800 1805 cct aat gaa acc aaa act tac ttt tgg aaa gtg caa cat cat atg gea 5472 Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Vai Gin His His Met Ala 1810 1815 1820 ccc act aaa gat gag ttt gac tgc aaa gee tgg gct tat ttc tet gat 5520 Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp 1825 1830 1835 1840 gtt gac ctg gaa aaa gat gtg cac tea ggc ctg att gga ccc ctt ctg 5568 Vai Asp Leu Glu Lys Asp Vai His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu 1845 1850 1855 gtc tgc cac act aac aca ctg aac cct gct cat ggg aga caa gtg aca 5616 vai Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin vai Thr 1860 1865 1870 gta cag gaa ttt gct ctg ttt ttc acc ate ttt gat gag acc aaa age 5664 vai Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser 1875 1880 1885 tgg tac ttc act gaa aat atg gaa aga aac tgc agg gct ccc tgc aat 5712 Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn 1890 1895 1900 109 ate cag atg gaa gat CCC act ttt aaa gag aat tat ege ttc cat gea 5760 Ile Gin Met 1905 Glu Asp Pro 1910 Thr Phe Lys Glu Asn 1915 Tyr Arg Phe His Ala 1920 ate aat ggc tac ata atg gat aca cta cct ggc tta gta atg gct cag 5808 Ile Asn Gly Tyr Ile 1925 Met Asp Thr Leu Pro 1930 Gly Leu Val Met Ala 1935 Gin gat caa agg att cga tgg tat ctg ctc age atg ggc age aat gaa aac 5B56 Asp Gin Arg Ile 1940 Arg Trp Tyr Leu Leu 1945 Ser Met Gly Ser Asn 1950 Glu Asn ate cat tet att cat ttc agt gga cat gtg ttc act gta cga aaa aaa 5904 Ile His Ser 1955 Ile His Phe Ser Gly 1960 His Vai Phe Thr Vai 1965 Arg Lys Lys gag gag tat aaa atg gea ctg tac aat ctc tat cca ggt gtt ttt gag 5952 Glu Glu Tyr 1970 Lys Met Ala Leu 1975 Tyr Asn Leu Tyr Pro 1980 Gly Val Phe Glu aea gtg gaa atg tta cca tcc aaa gct gga att tgg cgg gtg gaa tgc 6000 Thr Vai Glu 1985 Met Leu Pro 1990 Ser Lys Ala Gly Ile 1995 Trp Arg Val Glu Cys 2000 ctt att ggc gag cat cta cat gct ggg atg age aca ctt ttt ctg gtg 6048 Leu Ile Gly Glu His 2005 Leu His Ala Gly Met 2010 Ser Thr Leu Phe Leu 2015 Val tac age aat aag tgt cag act ccc ctg gga atg gct tet gga cac att 6096 Tyr Ser Aan Lya 2020 Cys Gin Thr Pro Leu 2025 Gly Met Ala Ser Gly 2030 His Ile aga gat ttt cag att aca gct tea gga caa tat gga cag tgg gee cca 6144 Arg Asp Phe 2035 Gin Ile Thr Ala Ser 2040 Gly Gin Tyr Gly Gin 2045 Trp Ala Pro aag ctg gee aga ctt cat tat tcc gga tea ate aat gee tgg age acc 6192 Lys Leu Ala 2050 Arg Leu His Tyr 2055 Ser Gly Ser Ile Asn 2060 Ala Trp Ser Thr aag gag ccc ttt tet tgg ate aag gtg gat ctg ttg gea cca atg att 6240 Lys Glu Pro 2065 Phe Ser Trp 2070 Ile Lys Vai Asp Leu 2075 Leu Ala Pro Met Ile 2080 att cac ggc ate aag acc cag ggt gee cgt cag aag ttc tcc age ctc 6288 Ile His Gly Ile Lys 2085 Thr Gin Gly Ala Arg 2090 Gin Lys Phe Ser Ser 2095 Leu tac ate tet cag ttt ate ate atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg 6336 Tyr Ile Ser Gin 2100 Phe Ile Ile Met Tyr 2105 Ser Leu Asp Gly Lys 2110 Lys Trp cag act tat cga gga aat tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc 6384 Gin Thr Tyr 2115 Arg Gly Asn Ser Thr 2120 Gly Thr Leu Met Vai 2125 Phe Phe Gly aat gtg gat tea tet ggg ata aaa cac aat att ttt aac cct cca att 6432 Asn Vai Asp 2130 Ser Ser Gly Ile 2135 Lys His Asn Ile Phe 2140 Asn Pro Pro Ile 110 att gct cga tac ate cgt ttg cac cca act cat tat age att cgc age 6480 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 2145 2150 2155 2160 act ctt cgc atg gag ttg atg ggc tgt gat tta aat agt tgc age atg 6528 Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met 2165 2170 2175 cca ttg gga atg gag agt aaa gea ata tca gat gea cag att act gct 6576 Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala 2180 2185 2190 tca tcc tac ttt acc aat atg ttt gee acc tgg tet cct tca aaa gct 6624 Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 cga ctt cac ctc caa ggg agg agt aat gee tgg aga cct cag gtg aat 6672 Arg Leu Hls Leu Gin Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gin Val Asn 2210 2215 2220 aat cca aaa gag tgg ctg caa gtg gac ttc cag aag aca atg aaa gtc 6720 Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Vai Asp Phe Gin Lys Thr Met Lys val 2225 2230 2235 2240 aca gga gta act act cag gga gta aaa tet ctg ctt acc age atg tat 6768 Thr Gly Vai Thr Thr Gin Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr 2245 2250 2255 gtg aag gag ttc ctc ate tcc age agt caa gat ggc cat cag tgg act 6816 vai Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr 2260 2265 2270 ctc ttt ttt cag aat ggc aaa gta aag gtt ttt cag gga aat caa gac 6864 Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp 2275 2280 2285 tcc ttc aca cct gtg gtg aac tet cta gac cca ccg tta ctg act cgc 6912 Ser Phe Thr Pro Vai Vai Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg 2290 2295 2300 tac ctt cga att cac ccc cag agt tgg gtg cac cag att gee ctg agg 6960 Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp val His Gin Ile Ala Leu Arg 2305 2310 2315 2320 atg gag gtt ctg ggc tgc gag gea cag gac ctc tac 6996 Met Glu Vai Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 2325 <210> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens 111 < 4 Ο Ο > 2

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Vai Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Vai Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr ile Gin Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Vai Vai Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Vai Gly Vai Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Vai Asp Leu val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Vai Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr val Asn Gly Tyr val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser val Tyr Trp His 245 250 255 Vai Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 112

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gin Phe Leu Leu Phe Gys His Ile Ser Ser His Gin His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gin Arg ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gin His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Vai Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro He Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Vai Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gin 580 585 590 113

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Vai Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Vai Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gin Leu Ser Vai Cys Leu His Glu Vai Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Vai Phe Phe ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Vai Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Vai Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Vai Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala 725 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin 740 Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr 755 760 Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg 770 775 Vai Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met 785 790 His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu 805 Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala 820 Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gin 835 840 Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gin 850 855 Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys 865 870 715 720 Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 730 735 Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 745 750 Ile Pro Glu Asn Asp lie Glu Lys 765 Thr Pro Met Pro Lys Ile Gin Asn 780 Leu Leu Arg Gin Ser Pro Thr Pro 795 800 Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 810 815 Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 825 830 Leu His His Ser Gly Asp Met Vai 845 Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 860 Lys Leu Asp Phe Lys Vai Ser Ser 875 880 114

Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Xle Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895

Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Vai. His 900 905 910

Tyr Asp Ser Gin Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925

Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940

Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960

Gly Lys Asn vai Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975

Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990

Vai Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005

Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn 1010 1015 1020

Ser Pro Ser Var Trp Gin Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys 025 1030 1035 1040

Lys val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala 1045 1050 1055

Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys 1060 1065 1070

Asn Met Glu Met Val Gin Gin Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp 1075 1080 1085

Ala Gin Asn Pro Asp Met Ser Phè Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu 1090 1095 1100

Ser Ala Arg Trp Ile Gin Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser 105 1110 1115 1120

Gly Gin Gly Pro Ser Pro Lys Gin Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys 1125 1130 1135

Ser Val Glu Gly Gin Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val 1140 1145 1150

Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe 1155 1160 1165 115

Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu 1170 1175 1180

Asn Asn Thr His Asn Gin Glu Lys Lys Ile Gin Glu Glu Ile Glu Lys 185 1190 1195 1200

Lys Glu Thr Leu Ile Gin Glu Asn Vai Vai Leu Pro Gin ile His Thr 1205 1210 1215 Vai Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr 1220 1225 1230 Arg Gin Asn Vai Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Vai Leu 1235 1240 1245 Gin Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His 1250 1255 1260 Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu 265 1270 1275 1280 Gly Asn Gin Thr Lys Gin Ile Vai Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg 1285 1290 1295 Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gin Gin Asn Phe Vai Thr Gin Arg Ser Lys 1300 1305 1310 Arg Ala Leu Lys Gin Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu 1315 1320 1325 Lys Arg Ile Ile Vai Asp Asp Thr Ser Thr Gin Trp Ser Lys Asn Met 1330 1335 1340 Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gin Ile Asp Tyr Asn Glu Lys 345 1350 1355 1360 Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg 1365 1370 1375

Ser His Ser Ile Pro Gin Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys 1380 1385 1390 Vai Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu 1395 1400 1405 Phe Gin Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys 1410 1415 1420 Asp Ser Gly Val Gin Glu Ser Ser His Phe Leu Gin Gly Ala Lys Lys 425 1430 1435 1440 Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gin 1445 1450 1455 Arg Glu Vai Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr 1460 1465 1470 116

Lys Lys Vai Glu Asn Thr vai Leu Pro Ly3 Pro A3p Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 Ser Gly Lys Vai Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gin Lys Asp 1490 1495 1500 Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu 505 1510 1515 1520 Vai Glu Gly Ser Leu Leu Gin Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn 1525 1530 1535 Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Vai Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu 1540 1545 1550 Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp 1555 1560 1565 Asn Hls Tyr Gly Thr Gin ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu 1570 1575 1580 Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr He Leu Ser 585 1590 1595 1600 Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly 1605 1610 1615 Gin Asn Lys Pro Glu Ile Glu val Thr Trp Ala Lys Gin Gly Arg Thr 1620 1625 1630 Glu Arg Leu Cys Ser Gin Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg 1635 1640 1645 Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr 1650 1655 1660 Asp Asp Thr Ile Ser Vai Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr 665 1670 1675 1680 Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg 1685 1690 1695 His Tyr Phe Ile Ala Ala Vai Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser 1700 1705 1710 Ser Ser Pro His Vai Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser Gly Ser Val Pro 1715 1720 1725 Gin Phe Lys Lys Vai Vai Phe Gin Glu Phe Thr ASp Gly Ser Phe Thr 1730 1735 1740 Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly 745 1750 1755 17.60 Pro Tyr He Arg Ala Glu Vai Glu Asp Asn Ile : Met Val Thr Phe Arg 1765 1770 1775 117

Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr 1780 1785 1790 Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Vai Lys 1795 1800 1805 Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Vai Gin His His Met Ala 1810 1815 1820 Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp 825 1830 1835 1840 Vai Asp Leu Glu Lys Asp Vai His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu 1845 1850 1855 Vai Cys HiS Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin Vai Thr 1860 1865 1870 Vai Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser 1875 1880 1885 Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn 1890 1895 1900 Ile Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala 905 1910 1915 1920 Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Vai Met Ala Gin 1925 1930 1935 Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn 1940 1945 1950 Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Vai Phe Thr Vai Arg Lys Lys 1955 1960 1965 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Vai Phe Glu 1970 1975 1980 Thr Vai Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Vai Glu Cys 985 1990 1995 2000 Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Vai 2005 2010 2015 Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile 2020 2025 2030

Arg Asp Phe Gin Ile Thr Ala Ser Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro 2035 2040 2045

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr 2050 2055 2060 118

Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Vai Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile 065 2070 2075 2080 ile His Gly Ile Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu 2085 2090 2095 Tyr Ile Ser Gin Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 2100 2105 2110 Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Vai Phe Phe Gly 2115 2120 2125 Asn Vai Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile 2130 2135 2140 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 145 2150 2155 2160 Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met 2165 2170 2175 Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala 2180 2185 2190 Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gin Vai Asn 2210 2215 2220 Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Vai Asp Phe Gin Lys Thr Met Lys Val 225 2230 2235 2240 Thr Gly Vai Thr Thr Gin Gly Vai Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr 2245 2250 2255 Vai Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr 2260 2265 2270 Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Vai Lys Vai Phe Gin Gly Asn Gin Asp 2275 2280 2285 Ser Phe Thr Pro Vai Vai Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg 2290 2295 2300 Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp Vai His Gin Ile Ala Leu Arg 305 2310 2315 2320 Met Glu Vai Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 2325 2330 119 <210> 3

<211> 10698 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da SEQuência Artificial: pTGF8-3 <220>

<221> CDS <222> (676) .. (5052) <220> <221> mat_péptido <222> (733)..(5052) <400> 3 aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 420 gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 540 aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 600 aaattaatac gactcactat agggagaccc 660 ctc tcc acc tgc ttc ttt ctg tgc Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys 711 -15 -10 cgcgttgaca ttgattattg actagttatt atagcccata tatggagttc cgcgttacat cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct acgtattagt catcgctatt accatggtga gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aagcttgacc tcgag atg caa ata gag Met Gin lie Glu ctt ttg cga ttc tgc ttt agt gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca 759

Leu Leu Arg Phe Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala -5 -11 5 120 gtg gaa ctg tca tgg gac tat atg caa agt gat ctc ggt gag ctg cct 807 vai Glu Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu i Pro 10 15 20 25 gtg gac gca aga ttt cct cct aga gtg cca aaa tet ttt cca ttc : aac 855 Vai Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe ! Asn 30 35 40 acc tca gtc gtg tac aaa aag act ctg ttt gta gaa ttc acg gat : cac 903 Thr Ser Vai Vai Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp i His 45 50 55 ctt ttc aac ate gct aag cca agg cca ccc tgg atg ggt ctg cta i ggt 951 Leu Phe Asn ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu i Gly 60 65 70 cct acc ate cag gct gag gtt tat gat aca gtg gtc att aca ctt . aag 999 Pro Thr Ile Gin Ala Glu Vai Tyr Asp Thr val Val Ile Thr Leu i Lys 75 80 85 aac atg gct tcc cat cct gtc agt ctt cat gct gtt ggt gta tcc tac 1047 Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu HiS Ala Val Gly val Ser Tyr 90 95 100 105 tgg aaa gct tet gag gga gct gaa tat gat gat cag acc agt caa agg 1095 Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp ASp Gin Thr Ser Gin Arg 110 115 120 gag aaa gaa gat gat aaa gtc ttc cct ggt gga age cat aca tat gtc 1143 Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val 125 130 135 tgg cag gtc ctg aaa gag aat ggt cca atg gee tet gac cca ctg tgc 1191 Trp Gin Vai Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys 140 145 150 ctt acc tac tca tat ctt tet cat gcg gac ctg gta aaa gac ttg aat 1239 Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Ala Asp Leu val Lys Asp Leu Asn 155 160 165 tca ggc ctc att gga gee cta cta gta tgt aga gaa ggg agt ctg gee 1287 Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala 170 175 180 185 aag gaa aag aca cag acc ttg cac aaa ttt ata cta ctt ttt gct gta 1335 Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val 190 195 200 ttt gat gaa ggg aaa agt tgg cac tca gaa aca aag aac tcc ttg atg 1383 Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met 205 210 215 cag gat agg gat gct gca tet gct cgg gee tgg cct aaa atg cac aca 1431 Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr 220 225 230 121 gtc aat ggt tat gta aac agg tct ctg cca ggt ctg att gga tgc cac 1479 Val Asn Gly Tyr val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His 235 240 245 agg aaa tca gtc tat tgg cat gtg att gga atg ggc acc act cct gaa 1527 Arg Ly3 Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu 250 255 260 265 gtg cac tca ata ttc ctc gaa ggt cac aca ttt ctt gtg agg aac cat 1575 Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu val Arg Asn His 270 275 280 cgc cag gcg tcc ttg gaa ate teg cca ata act ttc ctt act gct caa 1623 Arg Gin Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe LêU Thr Ala Gin 285 290 295 aca etc ttg atg gac ctt gga cag ttt cta ctg ttt tgt cat ate tct 1671 Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cya His Ile Ser 300 305 310 tcc cac caa cat gat ggc atg gaa gct tat gtc aaa gta gac age tgt 1719 Ser His Gin His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys val Asp Ser Cys 315 320 325 cca gag gaa ccc caa cta cga atg aaa aat aat gaa gaa gcg gaa gac 1767 Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp 330 335 340 345 tat gat gat gat ctt act gat tct gaa atg gat gtg gtc agg ttt gat 1815 Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp 350 355 360 gat gac aac tct cct tcc ttt ate caa att cgc tca gtt gee aag aag 1863 Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe ile Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys 365 370 375 cat cct aaa act tgg gta cat tac att gct gct gaa gag gag gac tgg 1911 His Pro LyS Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp 380 385 390 gac tat gct ccc tta gtc ctc gee ccc gat gac aga agt tat aaa agt 1959 Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser 395 400 405 caa tat ttg aac aat ggc cct cag cgg att ggt agg aag tac aaa aaa 2007 Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys 410 415 420 425 gtc cga ttt atg gea tac aca gat gaa acc ttt aag act cgt gaa gct 2055 Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr ASp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala 430 435 440 att cag cat gaa tca gga ate ttg gga cct tta ctt tat ggg gaa gtt 2103 Ile Gin His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val 445 450 455 122 gga gac aca ctg ttg àtt ata ttt aag aat caa gea age aga cca tat 2151 Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr 460 465 470 aac ate tac cct cac gga ate act gat gtc cgt cct ttg tat tea agg 2199 Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg 475 480 485 aga tta cca aaa ggt gta aaa cat ttg aag gat ttt cca att ctg cca 2247 Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro 490 495 500 505 gga gaa ata ttc aaa tat aaa tgg aca gtg act gta gaa gat ggg cca 2295 Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro 510 515 520 act aaa tea gat cct cgg tgc ctg acc ege tat tac tet agt ttc gtt 2343 Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val 525 530 535 aat atg gag aga gat cta gct tea gga ctc att ggc cct ctc ctc ate 2391 Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile 540 545 550 tgc tac aaa gaa tet gta gat caa aga gga aac cag ata atg tea gac 2439 Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp 555 560 565 aag agg aat gtc ate ctg ttt tet gta ttt gat gag aac cga age tgg 2487 Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp 570 575 580 585 tac ctc aca gag aat ata caa ege ttt ctc ccc aat cca gct gga gtg 2535 Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val 590 595 600 cag ctt gag gat cca gag ttc caa gee tcc aac ate atg cac age ate 2583 Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met HÍS Ser Ile 605 610 615 aat ggc tat gtt ttt gat agt ttg cag ttg tea gtt tgt ttg cát gag 2631 Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu 620 625 630 gtg gea tac tgg tac att cta age att gga gea cag act gac ttc ctt 2679 Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu 635 640 645 tet gtc ttc ttc tet gga tat acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa 2727 Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu 650 655 660 665 gac aca ctc acc cta ttc cca ttc tea gga gaa act gtc ttc atg teg 2775 Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr val Phe Met Ser 670 675 680 atg gaa aac cca ggt cta tgg att ctg ggg tgc cac aac tea gac ttt 2823 Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe 685 690 695 123 cgg aac aga ggc atg acc gee tta ctg aag gtt tet agt tgt gac aag 2871 Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys 700 705 710 aac act ggt gat tat tac gag gac agt tat gaa gat att tca gea tac 2919 Asn Thr Gly ASft Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr 715 720 725 ttg ctg agt aaa aac aat gee att gaa cca aga age ttc tcc cag aat 2967 Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn 730 735 740 745 tca aga cat caa gct tat cga tac cgt cga ggg gaa ata act cgt act 3015 Ser Arg Hls Gin Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly Glu Ile Thr Arg Thr 750 755 760 act ctt cag tca gat caa gag gaa att gac tat gat gat acc ata tca 3063 Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser 765 770 775 gtt gaa atg aag aag gaa gat ttt gac att tat gat gag gat gaa aat 3111 Vai Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn 780 785 790 cag age ccc ege age ttt caa aag aaa aca cga cac tat ttt att gct 3159 Gin Ser Pro Arg Ser Phe pln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala 795 800 805 gea gtg gag agg ctc tgg gat tat ggg atg agt age tcc cca cat gtt 3207 Ala Vai Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val 810 815 820 825 cta aga aac agg gct cag agt ggc agt gtc cct cag ttc aag aaa gtt 3255 Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser Gly Ser Vai Pro Gin Phe Lys Lys Val 830 835 840 gtt ttc cag gaa ttt act gat ggc tcc ttt act cag ccc tta tac cgt 3303 Vai Phe Gin Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg 845 850 855 gga gaa cta aat gaa cat ttg gga ctc ctg ggg cca tat ata aga gea 3351 Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr ile Arg Ala 860 865 870 gaa gtt gaa gat aat ate atg gta act ttc aga aat cag gee tet cgt 3399 Glu vai Glu Asp Asn ile Met Vai Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg 875 880 885 ccc tat tcc ttc tat tet age ctt att tet tat gag gaa gat cag agg 3447 Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg 890 895 900 905 caa gga gea gaa cct aga aaa aac ttt gtc aag cct aat gaa acc aaa 3495 Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys 910 915 920 act tac ttt tgg aaa gtg caa cat cat atg gea ccc act aaa gat gag 3543 Thr Tyr Phe Trp Lys Vai Gin His HiS Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu 925 930 935 124 ttt gac tgc aaa gcc tgg gct tat ttc tet gat gtt gac ctg gaa aaa 3591 Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Vai Asp Leu Glu Lyá 940 945 950 gat gtg cac tca ggc ctg att gga ccc ctt ctg gtc tgc cac act aac 3639 Asp Vai His Ser Gly Leu ile Gly Pro Leu Leu vai Cys His Thr Asn 955 960 965 aca ctg aac cct gct cat ggg aga caa gtg aca gta cag gaa ttt gct 3687 Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin vai Thr Val Gin Glu Phe Ala 970 975 980 985 ctg ttt ttc acc ate ttt gat gag acc aaa age tgg tac ttc act gaa 3735 Leu Phe Phe Thr lie Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 990 995 1000 aat atg gaa aga aac tgc agg gct ccc tgc aat ate cag atg gaa gat 3783 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gin Met Glu A3P 1005 1010 1015 ccc act ttt aaa gag aat tat ege ttc cat gca ate aat ggc tac ata 3831 Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile 1020 1025 1030 atg gat aca cta cct ggc tta gta atg gct cag gat caa agg att cga 3879 Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Vai Met Ala Gin Asp Gin Arg Ile Arg 1035 1040 1045 tgg tat ctg ctc age atg ggc age aat gaa aac ate cat tet att cat 3927 Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His 1050 1055 1060 1065 ttc agt gga cat gtg ttc act gta cga aaa aaa gag gag tat aaa atg 3975 Phe Ser Gly His Vai Phe Thr Vai Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1070 1075 1080 gca ctg tac aat ctc tat cca ggt gtt ttt gag aca gtg gaa atg tta 4023 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro dy Vai Phe Glu Thr val Glu Met Leu 1085 1090 1095 cca tcc aaa gct gga att tgg cgg gtg gaa tgc ctt att ggc gag cat 4071 Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Vai Glu Cys Leu Ile Gly Glu His 1100 1105 1110 cta cat gct ggg atg age aca ctt ttt ctg gtg tac age aat aag tgt 4119 Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Vai Tyr Ser Asn Lys Cys 1115 1120 1125 cag act ccc ctg gga atg gct tet gga cac att aga gat ttt cag att 4167 Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gin Ile 1130 1135 1140 1145 aca gct tca gga caa tat gga cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt 4215 Thr Ala Ser Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu 1150 1155 1160 cat tat tcc gga tca ate aat gcc tgg age acc aag gag ccc ttt tet 4263 His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser 1165 1170 1175 125 tgg ate aag gtg gat etg ttg gea cca atg att att cac ggc ate aag 4311 Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile HiS Gly Ile Lys 1180 1185 1190 acc cag ggt gee cgt cag aag ttc tcc age ctc tac ate tet cag ttt 4359 Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gin Phe 1195 1200 1205 ate ate atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg cag act tat cga gga 4407 lie Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly 1210 1215 1220 1225 aat tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat gtg gat tea tet 4455 Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 1230 1235 1240 ggg ata aaa cac aat att ttt aac cct cca att att gct cga tac ate 4503 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile 1245 1250 1255 cgt ttg cac cca act cat tat age att ege age act ctt ege atg gag 4551 Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu 1260 1265 1270 ttg atg ggc tgt gat tta aat agt tgc age atg cca ttg gga atg gag 4599 Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu 1275 1280 1285 agt aaa gea ata tea gat gea cag att act gct tea tcc tac ttt acc 4647 Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr 1290 1295 1300 1305 aat atg ttt gee acc tgg tet cct tea aaa gct cga ctt cac ctc caa 4695 Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin 1310 1315 1320 999 agg agt aat gee tgg aga cct cag gag aat aat cca aaa gag tgg 4743 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gin Glu Asn Asn Pro Lys Glu Trp 1325 1330 1335 etg caa gtg gac ttc cag aag aca atg aaa gtc aca gga gta act act 4791 Leu Gin Vai Asp Phé Gin Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr 1340 1345 1350 cag gga gta aaa tet etg Ctt acc age atg tat gtg aag gag ttc ctc 4839 Gin Gly Vai Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu 1355 1360 1365 ate tcc age agt caa gat ggc cat cag tgg acc ctc ttt ttt cag aat 4887 Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn 1370 1375 1380 1385 ggc aaa gta aag gtt ttt cag gga aat caa gac tcc ttc aca cct gtg 4935 Gly Lys Val Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Val 1390 1395 1400 126 4933 gtg aac tct cta gac cca ccg tta ctg act cgc tac ctt cga att cac

Vai Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His 1405 1410 1415 ccc cag agt tgg gtg cac cag att gcc ctg agg atg gag gtt ctg ggc 5031

Pro Gin Ser Trp Vai His Gin Ile Ala Leu Arg Met Glu Vai Leu Gly 1420 1425 1430 tgc gag gca cag gac ctc tac tgagcggccg cgactctact agaggatctt 5082

Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 1435 1440 tçtgaaggaa ccttacttct gtggtgtgac ataattggac aaactaccta cagagattta 5142 aagctctaag gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat 5202 tgtttgtgta ttttagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc 5262 ctttaatgag gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac 5322 tgctgactct caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga 5382 ctttccttca gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc 5442 ttgctttgct atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga 5502 aaaatattct gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt 5562 tcttactcca cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac 5622 ctttagcttt ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac 5682 tagaçatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 5742 cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta 5802 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 5862 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 5922 ggatcccccg aacgccagca agacgtagcc cagcgcgtcg gccccgagat gcgccgcgtg 5982 cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc 6042 acagttctcc gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg 6102 tgccgccctg cttcatcccc gtggcccgtt gctcgcgttt gctggcggtg tccccggaag 6162 aaatatattt gcatgtcttt agttctatga tgacacaaac cccgcccagc gtcttgtcat 6222 tggcgaattc gaacacgcag atgcagtcgg ggcggcgcgg tccgaggtcc acttcgcata 6282 ttaaggtgac gcgtgtggcc tcgaacaccg agcgaccctg cagcgacccg cttaacagcg 6342 tcaacagcgt gccgcagatc agcttgatat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt 6402 cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg 6462 cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa 6522 tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc 6582 127 gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga cctattgcat 6642 ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt 6702 tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag 6762 cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat 6822 atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag 6882 tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt 6942 ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat 7002 aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa 7062 catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg 7122 gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct 7182 tgaccaactc tatcagaçct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg 7242 tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgeccg 7302 cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg 7362 acgccccagc actcgtccgg atcgggagat gggggaggct aactgaaaca cggaaggaga 7422 caataccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag acagaataaa acgcacgggt 7482 gttgggtcgt ttgttcataa acgcggggtt cggtcccagg gctggcactc tgtcgatacc 7542 ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc cgcgtttctt ccttttcccc accccacccc 7602 ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca gccaacgtcg gggcggcagg ccctgccata 7662 gccactggcc ccgtgggtta gggacggggt cccccatggg gaatggttta tggttcgtgg 7722 gggttattat tttgggcgtt gcgtggggtc aggtccacga ctggactgag cagacagacc 7782 catggttttt ggatggcctg ggcatggacc gcatgtactg gcgcgacacg aacaccgggc 7842 gtctgtggct gccaaacacc cccgaccccc aaaaaccacc gcgcggattt ctggcgtgcc 7902 aagctgggta ccctctagag cgaattaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 7962 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 8022 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 8082 gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 8142 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 8202 cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 8262 aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 8322 gcgcgagacg aaaggggggg taccagcttc gtagctagaa catcatgttc tgggatatca 8382 128 gcttcgtagc tagaacatca tgttctggta cccccctcgt gatacgccta tttttatagg 8442 ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 8502 gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 8562 aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 8622 tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 8682 aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 8742 aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 8802 tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 8862 aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag B922 tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 8982 ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 9042 taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 9102 agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 9162 caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 9222 tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 9282 gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 9342 cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 9402 caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 9462 ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 9522 aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 9582 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 9642 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 9702 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 9762 gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 9822 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 9882 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 9942 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 10002 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 10062 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 10122 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 10182 129 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 10242 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 10302 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 10362 gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 10422 aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 10482 actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac 10542 cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac 10602 aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctctctaga gctctagagc 10662 tctagagctc tagagagctt gcatgcctgc aggtcg 10698

<210> 4 <211> 1459 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: pTGF8-3 <400> 4

Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe -15 -10 -5 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser -1 1 5 10 Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 15 20 25 Phe Pro Pro Arg Vai Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser val Val 30 35 40 45 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Vai Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn ile 50 55 60 Ala LyS Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gin 65 70 75 Ala Glu Vai Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 80 85 90 His Pro Vai Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 95 100 105 130

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp 110 115 120 125 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu 130 135 140 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 145 150 155 Tyr Leu Ser His Ala Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 160 165 170 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 175 180 185 Gin Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 190 195 200 205 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp 210 215 220 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 225 230 235 Vai Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 240 245 250 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 255 260 265 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser 270 275 280 285 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met 290 295 300 Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gin His 305 310 315 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 320 325 330 Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp ASp 335 340 345 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 350 355 360 365 Pro Ser Phe lie Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 370 375 380 Trp Vai His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 385 390 395 131

Leu Vai Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn 400 405 410 Asn Gly Pro Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Vai Arg Phe Met 415 420 425 Ala Tyr Thr ASp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala ile Gin His Glu 430 435 440 445 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu vai Gly ASp Thr Leu 450 455 460 Leu Ile He Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 465 470 475

His Gly Ile Thr Asp Vai Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 480 485 490 Gly vai Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 495 500 505 Lys Tyr Lys Trp Thr Vai Thr Vai Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 510 515 520 525 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 530 535 540 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 545 550 555 Ser Vai Asp Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 560 565 570 Ile Leu Phe Ser Vai Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 575 580 585 Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp 500 595 600 605 Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met HÍS Ser Ile Asn Gly Tyr Val 610 615 620 Phe Asp Ser Leu Gin Leu ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 625 630 635 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gin Thr ASp Phe Leu Ser Val Phe Phe 640 645 650 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys HiS Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 655 660 665 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 670 675 680 685 132

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 690 695 700 Met Thr Ala Leu Leu Lys val Ser Ser Cys ASp Lys Asn Thr Gly Asp 705 710 715 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 720 725 730 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Gin 735 740 745 Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser 750 755 760 765 Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys 770 775 780 Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg 785 790 795 Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg 800 805 810 Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 815 820 825 Ala Gin Ser Gly Ser Vai Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu 830 835 840 845 Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn 850 855 860 Glu Hls Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp 865 870 875 Asn Ile Met Vai Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 880 885 890 Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu 895 900 905 Pro Arg Lys Asn Phe val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp 910 915 920 925 Lys Vai Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 930 935 940 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser 945 950 955 Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 960 965 970 133

Ala Hls Gly Arg Gin Vai Thr Vai Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 975 980 985 Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg 990 995 1000 1005 Asn Cys Arq Ala Pro Cys Asn Ile Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1010 1015 1020 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr ile Met Asp Thr Leu 1025 1030 1035 Pro Gly Leu Vai Met Ala Gin Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu 1040 1045 1050 Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His 1055 1060 1065 Vai Phe Thr Vai Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 070 1075 1080 1085 Leu Tyr Pro Gly Vai Phe Glu Thr Vai Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala 1090 1095 1100 Gly Ile Trp Arg Vai Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly 1105 1110 1115 Met Ser Thr Leu Phe Leu Vai Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu 1120 1125 1130 Gly Met Ala Ser Gly HiS Ile Arg Asp Phe Gin Ile Thr Ala Ser Gly 1135 1140 1145 Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly 150 1155 1160 1165 Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Vai 1170 1175 1180 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gin Gly Ala 1185 1190 1195 Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gin Phe Ile Ile Met Tyr 1200 1205 1210 Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly 1215 1220 1225 Thr Leu Met Vai Phe Phe Gly Asn Vai Asp Ser Ser Gly Ile Lys His 230 1235 1240 1245 Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His» Pro 1250 1255 1260 134

Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys 1265 1270 1275 Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile 1280 1285 1290 Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala 1295 1300 1305 Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn 310 1315 1320 1325 Ala Trp Arg Pro Gin Glu Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin vai ASp 1330 1335 1340 Phe Gin Lys Thr Met Lys Vai Thr Gly Vai Thr Thr Gin Gly Vai Lys 1345 1350 1355 Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Vai Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser 1360 1365 1370 Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Vai Lys 1375 1380 1385 Vai Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Vai Vai Asn Ser Leu 390 1395 1400 1405 Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp 1410 1415 1420 Vai His Gin Ile Ala Leu Arg Met Glu Vai Leu Gly Cys Glu Ala Gin 1425 1430 1435

Asp Leu Tyr 1440

<210> 5 <211> 10698 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da SEQuência Artificial: pTGF8-2hyg-s <220>

<221> CDS 135 <222> (676)..(5052) <220> <221> mat_péptido <222> (733)..(5052) <400> 5 cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 420 gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480 tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 540 cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 600 ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc 660 aagcttgacc tcgag atg caa ata gag Met Gin lie Glu ctc tcc acc tgc ttc ttt ctg tgc Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys -15 -10 711 ctt ttg cga ttc tgc ttt agt gee acc aga aga tac tac ctg ggt gca 759 Leu Leu Arg Phe Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala -5 -1 1 5 gtg gaa ctg tca tgg gac tat atg caa agt gat ctc ggt gag ctg cct 807 Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro 10 15 20 25 gtg gac gca aga ttt cct cct aga gtg cca aaa tet ttt cca ttc aac 855 Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn 30 35 40 acc tca gtc gtg tac aaa aag act ctg ttt gta gaa ttc acg gat cac 903 Thr Ser Val val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr ASp His 45 50 55 ctt ttc aac ate gct aag cca agg cca ccc tgg atg ggt ctg cta ggt 951 Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly 60 65 70 136 cct acc ate cag gct gag gtt tat gat aca gtg gtc att aca ctt aag 999 Pro Thr Ile Gin Ala Glu Vai Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys 75 80 85 aac atg gct tcc cat cct gtc agt ctt cat gct gtt ggt gta tcc tac 1047 Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala val Gly val Ser Tyr 90 95 100 105 tgg aaa gct tet gag gga gct gaa tat gat gat cag acc agt caa agg 1095 Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg 110 115 120 gag aaa gaa gat gat aaa gtc ttc cct ggt gga age cat aca tat gtc 1143 Glu Lys Glu Asp Asp Lys val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val 125 130 135 tgg cag gtc ctg aaa gag aat ggt cca atg gee tet gac cca ctg tgc 1191 Trp Gin Vai Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys 140 145 150 ctt acc tac tca tat ctt tet cat gtg gac ctg gta aaa gac ttg aat 1239 Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His vai Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn 155 160 165 tca ggc ctc att gga gee cta cta gta tgt aga gaa ggg agt ctg gee 1287 Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala 170 175 180 185 aag gaa aag aca cag acc ttg cac aaa ttt ata cta ctt ttt gct gta 1335 Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val 190 195 200 ttt gat gaa ggg aaa agt tgg cac tca gaa aca aag aac tcc ttg atg 1383 Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met 205 210 215 cag gat agg gat gct gea tet gct cgg gee tgg cct aaa atg cac aca 1431 Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr 220 225 230 gtc aat ggt tat gta aac agg tet ctg cca ggt ctg átt gga tgc cac 1479 vai Asn Gly Tyr Vai Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His 235 240 245 agg aaa tca gtc tat tgg cat gtg att gga atg ggc acc act cct gaa 1527 Arg Lys Ser Vai Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu 250 255 260 265 gtg cac tca ata ttc ctc gaa ggt cac aca ttt ctt gtg agg aac cat 1575 Vai His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His 270 275 280 cgc cag gcg tcc ttg gaa ate teg cca ata act ttc ctt act gct caa 1623 Arg Gin Ala Ser Lêu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin 285 290 295 aca ctc ttg atg gac ctt gga cag ttt cta ctg ttt tgt cat ate tet 1671 Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser 300 305 310 137 tcc cac caa cat gat ggc atg gaa gct tat gtc aaa gta gac age tgt 1719 Ser His Gin His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Vai Lys Vai Asp Ser Cys 315 320 325 cca gag gaa ccc caa cta cga atg aaa aat aat gaa gaa gcg gaa gac 1767 Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp 330 335 340 345 tat gat gat gat ctt act gat tet gaa atg gat gtg gtc agg ttt gat 1815 Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Vai Val Arg Phe Asp 350 355 360 gat gac aac tet cct tcc ttt ate caa att cg c tea gtt gee aag aag 1863 ASp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys 365 370 375 cat cct aaa act tgg gta cat tac att gct gct gaa gag gag gac tgg 1911 His Pro Lys Thr Trp Vai His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp 380 385 390 gac tat gct ccc tta gtc ctc gee ccc gat gac aga agt tat aaa agt 1959 Asp Tyr Ala Pro Leu Vai Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser 395 400 405 caa tat ttg aac aat ggc cct cag cgg att ggt agg aag tac aaa aaa 2007 Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr LyS Lys 410 415 420 425 gtc cga ttt atg gea tac aca gat gaa acc ttt aag act cgt gaa gct 2055 Vai Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala 430 435 440 att cag cat gaa tea gga ate ttg gga cct tta ctt tat ggg gaa gtt 2103 lie Gin His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu val 445 450 455 gga gac aca ctg ttg att ata ttt aag aat caa gea age aga cca tat 2151 Gly Asp Thr Leu Leu Ue Ile Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr 460 465 470 aac ate tac cct cac gga ate act gat gtc cgt cct ttg tat tea agg 2199 Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp vai Arg Pro Leu Tyr Ser Arg 475 480 485 aga tta cca aaa ggt gta aaa cat ttg aag gat ttt cca att ctg cca 2247 Arg Leu Pro Lys Gly vai Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro 490 495 500 505 gga gaa ata ttc aaa tat aaa tgg aca gtg act gta gaa gat ggg cca 2295 Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Vai Thr Vai Glu Asp Gly Pro 510 515 520 act aaa tea gat cct cgg tgc ctg acc ege tat tac tet agt ttc gtt 2343 Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe val 525 530 535 138 aat atg gag aga gat cta gct tca gga ctc att ggc cct ctc ctc ate 2391 Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile 540 545 550 tgc tac aaa gaa tct gta gat caa aga gga aac cag ata atg tca gac 2439 Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp 555 560 565 aag agg aat gtc ate ctg ttt tct gta ttt gat gag aac cga age tgg 2487 Lys Arg Asn vai Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp 570 575 580 585 tac ctc aca gag aat ata caa ege ttt ctc ccc aat cca gct gga gtg 2535 Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val 590 595 600 cag ctt gag gat cca gag ttc caa gee tcc aac ate atg cac age ate 2583 Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn ile Met His Ser Ile 605 610 615 aat ggc tat gtt ttt gat agt ttg cag ttg tca gtt tqt ttg cat gag 2631 Asn Gly Tyr vai Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu 620 625 630 gtg gca tac tgg tac att cta age att gga gca cag act gac ttc ctt 2679 Vai Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu 635 640 645 tct gtc ttc ttc tct gga tat acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa 2727 Ser Vai Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu 650 655 660 665 gac aca ctc acc cta ttc cca ttc tca gga gaa act gtc ttc atg teg 2775 Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser 670 675 680 atg gaa aac cca ggt cta tgg att ctg ggg tgc cac aac tca gac ttt 2823 Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe 685 690 695 cgg aac aga ggc atg acc gee tta ctg aag gtt tct agt tgt gac aag 2871 Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys 700 705 710 aac act ggt gat tat tac gag gac agt tat gaa gat att tca gca tac 2919 Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr 715 720 725 ttg ctg agt aaa aac aat gee att gaa cca aga age ttc tcc cag aat 2967 Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn 730 735 740 745 tca aga cat caa gct tat cga tac cgt cga ggg gaa ata act cgt act 3015 Ser Arg His Gin Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly Glu Ile Thr Arg Thr 750 755 760 act ctt cag tca gat caa gag gaa att gac tat gat gat acc ata tca 3063 Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser 765 770 775 139 gtt gaa atg aag aag gaa gat ttt gac att tat gat gag gat gaa aat 3111 Vai Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn 780 785 790 cag age ccc ege age ttt caa aag aaa aca cga cac tat ttt att gct 3159 Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala 795 800 805 gea gtg gag agg etc tgg gat tat ggg atg agt age tcc cca cat gtt 3207 Ala Vai Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val 810 815 820 825 cta aga aac agg gct cag agt ggc agt gtc cct cag ttc aag aaa gtt 3255 Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val 830 835 840 gtt ttc cag gaa ttt act gat ggc tcc ttt act cag ccc tta tac cgt 3303 Vai Phe Gin Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg 845 850 855 gga gaa cta aat gaa cat ttg gga ctc ctg ggg cca tat ata aga gea 3351 Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala 860 865 870 gaa gtt gaa gat aat ate atg gta act ttc aga aat cag gee tet cgt 3399 Glu Vai Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg 875 880 885 ecc tat tcc ttc tat tet age ctt att tet tat gag gaa gat cag agg 3447 Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg 890 895 900 905 caa gga gea gaa cct aga aaa aac ttt gtc aag cct aat gaa acc aaa 3495 Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys 910 915 920 act tac ttt tgg aaa gtg caa cat cat atg gea ccc act aaa gat gag 3543 Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu 925 930 935 ttt gac tgc aaa gee tgg gct tat ttc tet gat gtt gac ctg gaa aaa 3591 Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys 940 945 950 gat gtg cac tea ggc ctg att gga ccc ctt ctg gtc tgc cac act aac 3639 Asp val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu val Cys His Thr Asn 955 960 965 aca ctg aac cct gct cat ggg aga caa gtg aca gta cag gaa ttt gct 3687 Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala 970 975 980 985 ctg ttt ttc acc ate ttt gat gag acc aaa age tgg tac ttc act gaa 3735 Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 990 995 1000 aat atg gaa aga aac tgc agg gct CCC tgc aat ate cag atg gaa gat 3783 Asn Met Glu Arg. Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gin Met Glu Asp 1005 1010 1015 140 ccc act ttt aaa gag aat tat ege ttc cat gca ate aat ggc tac ata 3831 Pro Thr Phe 1020 Lys Glu Asn Tyr Arg 1025 Phe His Ala Ile Asn 1030 Gly Tyr Ile atg gat aca cta cet ggc tta gta atg gct cag gat caa agg att cga 3879 Met Asp 1035 Thr Leu Pro Gly Leu 1040 val Met Ala Gin Asp 1045 Gin Arg Ile Arg tgg tat ctg ctc age atg ggc age aat gaa aac ate cat tet att cat 3927 Trp Tyr 1050 Leu Leu Ser Met Gly 1055 Ser Asn Glu Asn 1060 Ile His Ser Ile His 1065 ttc agt gga cat gtg ttc act gta cga aaa aaa gag gag tat aaa atg 3975 Phe Ser Gly His Val Phe Thr L070 Val Arg Lys 1075 Lys Glu Glu Tyr Lys 1080 Met gca ctg tac aat ctc tat cca ggt gtt ttt gag aca gtg gaa atg tta 4023 Ala Leu Tyr Asn 1085 Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1090 Glu Thr Val Glu 1095 Met Leu cca tcc aaa gct gga att tgg cgg gtg gaa tgc ctt att ggc gag cat 4071 Pro Ser Lys 1100 Ala Gly Ile Trp Arg 1105 Val Glu Cys Leu Ile 1110 Gly Glu His cta cat gct ggg atg age aca ctt ttt ctg gtg tac age aat aag tgt 4119 Leu His 1115 Ala Gly Met Ser Thr 1120 Leu Phe. Leu Val Tyr 1125 Ser Asn Lys Cys cag act ccc ctg gga atg gct tet gga cac att aga gat ttt cag att 4167 Gin Thr 1130 Pro Leu Gly Met Ala 1135 Ser Gly His ile 1140 Arg Asp Phe Gin Ile 1145 aca gct tea gga caa tat gga cag tgg gee cca aag ctg gee aga ctt 4215 Thr Ala Ser Gly Gin Tyr Gly 1150 Gin Trp Ala 1155 Pro Lys Leu Ala Arg 1160 Leu cat tat tcc gga tea ate aat gee tgg age acc aag gag ccc ttt tet 4263 His Tyr Ser Gly 1165 Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1170 Thr Lys Glu Pro 1175 Phe Ser tgg ate aag gtg gat ctg ttg gca cca atg att att cac ggc ate aag 4311 Trp Ile Lys 1180 Vai Asp Leu Leu Ala 1185 Pro Met Ile Ile His 1190 Gly Ile Lys acc cag ggt gee cgt cag aag ttc tcc age ctc tac ate tet cag ttt 4359 Thr Gin Gly 1195 Ala Arg Gin Lys 1200 Phe Ser Ser Leu Tyr 1205 Ile Ser Gin Phe ate ate atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg cag act tat cga gga 4407 rie Ile 1210 Met Tyr Ser Leu Asp 1215 Gly Lys Lys Trp 1220 Gin Thr Tyr Arg Gly 1225 aat tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat gtg gat tea tet 4455 Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met 1230 Val Phe Phe 1235 Gly Asn Val Asp Ser 1240 Ser ggg ata aaa cac aat att ttt aac cct cca att att gct cga tac ate 4503 Gly Ile Lys His 1245 Asn Ile Phe Asn Pro Pro 1250 Ile Ile Ala Arg Tyr 1255 Ile 141 cgt ttg cac cca act cat tat age att ege age act Ctt ege atg gag 4551 Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu 1260 1265 1270 ttg atg ggc tgt gat tta aat agt tgc age atg cca ttg gga atg gag 4599 Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu 1275 1280 1285 agt aaa gea ata tea gat gea cag att act gct tea tcc tac ttt acc 4647 Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr 1290 1295 1300 1305 aat atg ttt gee acc tgg tet cct tea aaa gct cga ctt cac ctc caa 4695 Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin 1310 1315 1320 ggg agg agt aat gee tgg aga cct cag gtg aat aat cca aaa gag tgg 4743 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gin Vai Asn Asn Pro Lys Glu Trp 1325 1330 1335 ctg caa gtg gac ttc cag aag aca atg aaa gtc aca gga gta act act 4791 Leu Gin Vai Asp Phe Gin Lys Thr Met Lys Vai Thr Gly Vai Thr Thr 1340 1345 1350 cag gga gta aaa tet ctg ctt acc age atg tat gtg aag gag ttc ctc 4839 Gin Gly Vai Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Vai Lys Glu Phe Leu 1355 1360 1365 ate tcc age agt caa gat ggc cat cag tgg acc ctc ttt ttt cag aat 4887 Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn 1370 1375 1380 1385 ggc aaa gta aag gtt ttt cag gga aat caa gac tcc ttc aca cct gtg 4935 Gly Lys Vai Lys Vai Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Vai 1390 1395 1400 gtg aac tet Cta gac cca ccg tta ctg act ege tac ctt cga att cac 4983 Vai Asn Ser Leu Asp Pro Pró Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His 1405 1410 1415 ccc cag agt tgg gtg cac cag att gee ctg agg atg gag gtt ctg ggc 5031 Pro Gin Ser Trp Vai His Gin Ile Ala Leu Arg Met Glu Vai Leu Gly 1420 1425 1430 tgc gag gea cag gac ctc tac tgagcggccg < cgactctact agaggatctt 5082 Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 1435 1440 tgtgaaggaa ccttacttct gtggtgtgac ataattggac aaactaccta cagagattta 5142 aagctctaag gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat 5202 tgtttgtgta ttttagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc 5262 ctttaatgag gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac 5322 tgctgactct caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga 5382 142 ctttccttca gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttàgtaata gaactcttgc 5442 ttgctttgct atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga 5502 aaaatattct gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt 5562 tcttactcca cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac 5622 ctttagcttt ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac 5682 tagagatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 5742 cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta 5802 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcaccac aaatttcaca aataaagcat 5862 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 5922 ggatcccccg aacgccagca agacgtagoo cagcgcgtcg gccccgagat gcgccgcgtg 5982 cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc 6042 acagttctcc gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg 6102 tgccgccctg cttcatcccc gtggcccgtt gctcgcgttt gctggcggtg tccccggaag 6162 aaatatattt gcatgtcttt agttctatga tgacacaaac cccgcccagc gtcttgtcat 6222 tggcgaattc gaacacgcag atgcagtcgg ggcggcgcgg tccgaggtcc acttcgcata 6282 ttaaggtgac gcgtgtggcc tcgaacaccg agcgaccctg cagcgacccg cttaacagcg 6342 tcaacagcgt gccgcagatc agcttgatat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt 6402 cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg 6462 cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa 6522 tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc 6582 gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga cctattgcat 6642 ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt 6702 tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag 6762 cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat 6822 atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag 6882 tgcgtccgtc gcgcaggcte tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt 6942 ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat 7002 aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa 7062 143 catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg 7122 gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct 7182 tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg 7242 tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg 7302 cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg 7362 acgccccagc actcgtccgg ategggagat gggggaggct aactgaaaca cggaaggaga 7422 caataccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag acagaataaa acgcacgggt 7482 gttgggtcgt ttgttcataa acgcggggtt cggtcccagg gctggcactc tgtcgatacc 7542 ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc cgcgtttctt ccttttcccc accccacccc 7602 ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca gccaacgtcg gggcggcagg ccctgccata 7662 gccactggcc ccgtgggtta gggacggggt cccccatggg gaatggttta tggttcgtgg 7722 gggttattat tttgggcgtt gcgtggggtc aggtccacga ctggactgag cagacagacc 7782 catggttttt ggatggcctg ggcatggacc gcatgtactg gcgcgacacg aacaccgggc 7842 gtctgtggct gccaaacacc cccgaccccc aaaaaccacc gcgcggattt ctggcgtgcc 7902 aagctgggta ccctctagag cgaattaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 7962 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 8022 ggcataatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 8082 gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 8142 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 8202 cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 8262 aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 8322 gcgcgagacg aaaggggggg taccagcttc gtagctagaa catcatgttc tgggatatca 8382 gcttcgtagc tagaacatca tgttctggta cccccctcgt gatacgccta tttttatagg 8442 ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 8502 gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 8562 aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 8622 tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 8682 aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 8742 aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 8802 144 tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg çcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 8862 aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 8922 tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 8982 ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 9042 taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 9102 agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 9162 caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 9222 tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 9282 gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 9342 cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 9402 caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 9462 ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 9522 aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 9582 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 9642 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 9702 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 9762 gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 9822 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 9882 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 9942 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 10002 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 10062 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 10122 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 10182 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 10242 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 10302 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 10362 gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 10422 aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 10482 actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac 10542 cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac 10602 145 aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctctctaga gctctagagc 10662 tctagagctc tagagagctt gcatgcctgc aggtcg 10698

<210> 6 <211> 1459 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Descrição da SEQuência Artificial: pTGF8-2hyg-s <400> 6

Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe -15 -10 -5 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala val Glu Leu Ser -1 1 5 10 Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 15 20 25 Phe Pro Pro Arg vai Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser val Val 30 35 40 45 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe vai Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 50 55 60 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gin 65 70 75 Ala Glu Vai Tyr Asp Thr val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 80 85 90 His Pro Vai Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 95 100 105 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu ASp 110 115 120 125 Asp Lys Vai Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu 130 135 140 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser ASp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 145 150 155 Tyr Leu Ser His vai Asp Leu val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 160 165 170 146

Gly Ala Leu Leu vai Cys Arg Glu Gly ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 175 180 185 Gin Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Vai Phe Asp Glu Gly 190 195 200 205 Lys Ser Trp HiS Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp 210 215 220 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Vai Asn Gly Tyr 225 230 235 Vai Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 240 245 250 Tyr Trp His vai ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 255 260 265 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Vai Arg Asn His Arg Gin Ala Ser 270 275 280 285 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met 290 295 300 Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cy3 His Ile Ser Ser His Gin His 305 310 315 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Vai Lys vai Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 320 325 330 Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp ASp Asp 335 340 345 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Vai Vai Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 350 355 360 365 Pro Ser Phe Ile Gin Ile Arg Ser Vai Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 370 375 380 Trp Vai His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu ASp Trp Asp Tyr Ala Pro 385 390 395 Leu Vai Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn 400 405 410 Asn Gly Pro Gin Arg ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 415 420 425 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gin His Glu 430 435 440 445 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Vai Gly Asp Thr Leu 450 455 460 147

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 465 470 475 Hls Gly Ile Thr Asp Vai Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 480 485 490 Gly Vai Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 495 500 505 Lys Tyr Lys Trp Thr Vai Thr Vai Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 510 515 520 525 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Vai Asn Met Glu Arg 530 535 540 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 545 550 555 Ser Vai Asp Gin Arg Gly Asn Gin ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Vai 560 565 570 Ile Leu Phe Ser Vai Phe ASp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 575 580 585 ASTl Ile Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Vai Gin Leu Glu Asp 590 595 600 605 Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Vai 610 615 620 Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Vai Cys Leu His Glu Vai Ala Tyr Trp 625 630 635 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Vai Phe Phe 640 645 650 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Vai Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 655 660 665 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr vai Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 670 675 680 685 Gly Leu Trp ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 690 695 700 Met Thr Ala Leu Leu Lys Vai Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 705 710 715 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 720 725 730 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Gin 735 740 745 Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser 750 755 760 765 Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Vai Glu Met Lys 770 775 780 148

Lys Glu ASp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg 785 790 795 Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala val Glu Arg 800 805 810 Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 815 820 825 Ala Gin Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu 830 835 840 845 Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn 850 855 860 Glu Hls Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp 865 870 875 Asn Ile Met Vai Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 880 885 890 Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu 895 900 905 Pro Arg Lys Asn Phe val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp 910 915 920 925 Lys Vai Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 930 935 940 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp val His Ser 945 950 955 Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 960 965 970 Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 975 980 985 ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg 990 995 1000 1005 Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1010 1015 1020 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu 1025 1030 1035 Pro Gly Leu Vai Met Ala Gin Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu 1040 1045 1050 Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His 1055 1060 1065 vai Phe Thr val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 070 1075 1080 1085 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala 1090 1095 1100 Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly 1105 1110 1115 149

Met Ser Thr Leu Phe Leu Vai Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu 1120 1125 1130 Gly Met Ala Ser Gly • HiS Ile Arg Asp Phe Gin Ile Thr Ala Ser Gly 1135 1140 1145 Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys LâU Ala Arg Leu HiS Tyr Ser Gly 150 1155 1160 1165 Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 1170 1175 1180 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gin Gly Ala 1185 1190 1195 Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gin Phe Ile Ile Met Tyr 1200 1205 1210 Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly 1215 1220 1225 Thr Leu Met Vai Phe Phe Gly Asn Vai Asp Ser Ser Gly Ile Lys His 230 1235 1240 1245 Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1250 1255 1260 Thr Hi3 Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys 1265 1270 1275 ASp Leu Asn Ser Cys Ser Met pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile 1280 1285 1290 Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala 1295 1300 1305 Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn 310 1315 1320 1325 Ala Trp Arg Pro Gin Vai Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Vai Asp 1330 1335 1340 Phe Gin Lys Thr Met Lys Vai Thr Gly Vai Thr Thr Gin Gly Vai Lys 1345 1350 1355 Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Vai Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser 1360 1365 1370 Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys val Lys 1375 1380 1385 Vai Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Vai Vai Asn Ser Leu 390 1395 1400 1405 Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp 1410 1415 1420 Vai His Gin Ile Ala Leu Arg Met Glu Vai Leu Gly Cys Glu Ala Gin 1425 1430 1435 Asp Leu Tyr 1440 150 < 210 > 7

<211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da SEQuência Artificial: Péptido adaptador de domínio B <400> 7

Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His 1 5

<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da SEQuência Artificial: Péptido adaptador de domínio B <400> 8

Gin Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly 1 5

<210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da SEQuência Artificial: Péptido adaptador de domínio B 151 <4Ο0> 9

Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Gin Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly 15 10 15

<210> 10 <211> 5753 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da SEQuência Artificial: pTGFG36 <220>

<221> CDS <222> (689)..(2071) <400> 10 cgcgttgaca ttgattattg actagttatt atagcccata tatggagttc cgcgttacat cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct acgtattagt catcgctatt accatggtga gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 420 gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 540 aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 600 aaattaatac gactcactat agggagaccc 660 152 712 aagcttgcat gccaattccg caaaggtt atg cag cgc gtg aac atg ate atg

Met Gin Arg Vai Asn Met Ile Met 1 5 gea gaa tea cca ggc ctc ate acc ate tgc ctt tta gga tat cta ctc Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu 10 15 20 agt gct gaa tgt aca gtt ttt ctt gat cat gaa aac gee aac aaa att Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile 25 30 35 40 ctg aat cgg cca aag agg tat aat tea ggt aaa ttg gaa gag ttt gtt Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val 45 50 55 caa ggg aac ctt gag aga gaa tgt atg gaa gaa aag tgt ag». ttt gaa Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu 60 65 70 gaa gea cga gaa gtt ttt gaa aac act gaa aga aca act gaa ttt tgg Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp 75 80 85 aag cag tat gtt gat gga gat cag tgt gag tcc aat cca tgt tta aat Lys Gin Tyr Val Asp Gly Asp Gin Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn 90 95 100 ggc ggc agt tgc aag gat gac att aat tcc tat gaa tgt tgg tgt ccc Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro 105 110 115 120 ttt gga ttt gaa gga aag aac tgt gaa tta gat gta aca tgt aac att Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn ile 125 130 135 aag aat ggc aga tgc gag cag ttt tgt aaa aat agt gct gat aac aag Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gin Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys 140 145 150 gtg gtt tgc tcc tgt act gag gga tat cga ctt gea gaa aac cag aag Vai Vai Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gin Lys 155 160 165 tcc tgt gaa cca gea gtg cca ttt cca tgt gga aga gtt tet gtt tea Ser Cys Glu Pro Ala Val pro Phe Pro Cys Gly Arg val Ser val Ser 170 175 180 caa act tet aag ctc acc cgt gct gag act gtt ttt cct gat gtg gac Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp 185 190 195 200 tat gta aat tet act gaa gct gaa acc att ttg gat aac ate act caa Tyr Vai Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gin 760 808 856 904 952 1000 1048 1096 1144 1192 1240 1288 205 210 215 153 1336 age acc caa tea ttt aat gac ttc act cgg gtt gtt ggt gga gaa gat 1384 Ser Thr Gin Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp 220 225 230 gee aaa cca ggt caa ttc cct tgg cag gtt gtt ttg aat ggt aaa gtt 1432 Ala Lys Pro Gly Gin Phe Pro Trp Gin Val Val Leu Asn Gly Lys val 235 240 245 gat gea ttc tgt gga ggc tet ate gtt aat gaa aaa tgg att gta act 1480 Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr 250 255 260 gct gee cac tgt gtt gaa act ggt gtt aaa att aca gtt gtc gea ggt 1528 Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly 265 270 275 280 gaa Cãt aat att gag gag aca gaa cat aca gag caa aag cga aat gtg 1576 Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gin Lys Arg Asn Val 285 290 295 att cga att att cct cac cac aac tac aat gea gct att aat aag tac 1624 Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr 300 305 310 aac cat gac att gee ctt etg gaa etg gac gaa ccc tta gtg cta aac 1672 Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn 315 320 325 age tac gtt aca cct att tgc att gct gac aag gaa tac acg aac ate 1720 Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile 330 335 340 ttc etc aaa ttt gga tet ggc tat gta agt ggc tgg gga aga gtc ttc 1768 Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg val Phe 345 350 355 360 cac aaa ggg aga tea gct tta gtt ctt cag tac ctt aga gtt cca ctt 1816 His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Tyr Leu Arg Val Pro Leu 365 370 375 gtt gac cga gee aca tgt ctt cga tet aca aag ttc acc ate tat aac 1864 Vai Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn 380 385 390 aac atg ttc tgt gct ggc ttc cat gaa gga ggt aga gat tea tgt caa 1912 Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gin 395 400 405 gga gat agt ggg gga ccc cat gtt act gaa gtg gaa ggg acc agt ttc 1960 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe 410 415 420 tta act gga att att age tgg ggt gaa gag tgt gea atg aaa ggc aaa 2008 Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys 425 430 435 440 tat gga ata tat acc aag gta tcc cgg tat gtc aac tgg att aag gaa 2056 Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr val Asn Trp ile Lys Glu 445 450 455 154 2111 aaa aca aag ctc act taatgggatc ggtcgagcgg ccgcgactct actagaggat Lys Thr Lys Leu Thr 460 ctttgtgaag gaaccttact tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat 2171 ttaaagctct aaggtaaata taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct 2231 aattgtttgt gtattttaga ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc agtggtggaa 2291 tgcctttaat gaggaaaacc tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg atgatgaggc 2351 tactgctgac tctcaacatt ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag aagaccccaa 2411 ggactttcct tcagaattgc taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta atagaactct 2471 tgcttgcttt gctatttaca ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca agaaaattat 2531 ggaaaaatat tctgtaacct ttataagtag gcataacagt tataatcata acatactgtt 2591 ttttcttact ccacacaggc atagagtgtc tgctattaat aactatgctc aaaaattgtg 2651 tacctttagc tttttaattt gtaaaggggt taataaggaa tatttgatgt atagtgcctt 2711 gactagagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 2771 tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 2831 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 2891 catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 2951 tctggatccc cgggtaccct ctagagcgaa ttaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 3011 gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 3071 ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 3131 tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 3191 accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 3251 gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 3311 acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 3371 cgaaacgcgc gagacgaaag ggggggtacc agcttcgtag ctagaacatc atgttctggg 3431 atatcagctt cgtagctaga acatcatgtt ctggtacccc cctcgtgata cgcctatttt 3491 tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 3551 atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 3611 tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 3671 155 aaoatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 3731 acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 3791 acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 3851 ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 3911 ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 3971 caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 4031 ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 4091 aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 4151 aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 4211 tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 4271 aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 4331 cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 4391 ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 4451 gtcaggcaac tatggatgaa cgaaacagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 4511 agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 4571 atttttaatt taaaaggatc taggtgaaqa tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4631 cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4691 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4751 cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4811 tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4871 tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4931 ctçccagtgg cgataagtcç tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4991 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 5051 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 5111 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacçaggg 5171 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 5231 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 5291 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 5351 cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 5411 gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 5471 tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 5531 156 ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 5591 aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 5651 gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctc tctagagctc 5711 tagagctcta gagctctaga gagcttgcat gcctgcaggt cg 5753

<210> 11 <211> 461 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Descrição da SEQuência Artificial: pTGFG36 <400> 11

Met Gin Arg vai Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr val Phe Leu 20 25 30 ASp HiS Glu Asn Ala Asn Lys ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phè Trp Lys Gin Tyr val ASp Gly Asp Gin 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp val Thr Cys Asn ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gin Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gin Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175 157

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Thr Vai Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gin Ser Thr Gin Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Vai Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gin Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gin Vai Vai Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Vai Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Vai Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gin Lys Arg Asn Val Ile Arg ile Ile Pro His His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu ASp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Vai Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gin Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380 Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr Glu Vai Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Arg Tyr Vai Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460

Lisboa, 12 de Janeiro de 2011 158

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção recombinante de, pelo menos, uma proteína alvo que é o factor VIII humano ou uma sua muteína de domínio B delecionado, em células de mamífero que compreende efectuar a cultura de células de mamífero, sendo capazes de expressão da referida, pelo menos, uma proteína alvo em cultura em suspensão, sob condições isentas de soro e submeter uma suspensão das referidas células, antes de separação da proteína das células, a uma concentração não fisiologicamente aumentada de, pelo menos, uma substância iónica seleccionada de Acetato de NH4, MgCl2, KH2P04, Na2S04, KC1, NaCl, CaCl2, um aminoácido com uma cadeia lateral carregada e uma peptona.
2. Método da reivindicação 1, em que o ajuste da concentração da suspensão celular é efectuado através da adição de uma composição de libertação à suspensão celular, compreendendo a referida, pelo menos, uma substância iónica, de um modo preferido, a composição de libertação (i) sendo adicionada à suspensão celular na forma sólida ou líquida; e/ou (ii) sendo adicionada à suspensão celular até 3 dias, de um modo preferido, 1 a 24 h, de um modo muito preferido, 1 a 120 min, antes da separação da proteína; e/ou (iii) sendo adicionada à suspensão celular no início e mantida constante durante a cultura contínua e recolha da proteína; e/ou (iv) sendo adicionada à suspensão celular durante períodos de recolha e, de permeio, trocada com condições 1 fisiológicas, durante a cultura continua e processo de recolha da proteína; e/ou (v) sendo directamente adicionada ao caldo de cultura ou sendo adicionada às células ou a uma suspensão das células isoladas do caldo de cultura; e/ou (vi) sendo gradualmente adicionada de modo a obter-se a concentração final no espaço de 1-2000 minutos; e/ou (vii) sendo adicionada com a técnica de diafiltração.
3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que (i) a proteína alvo é uma proteína de factor VIII de domínio B delecionado, de um modo preferido, é a muteína de factor vm, tendo a SEQ ID N° 4 ou 6; e/ou (ii) as células de mamífero são células isoladas ou células de tecidos isoladas de mamíferos, de um modo preferido, as células de mamífero são células humanas ou células de roedor, de um modo mais preferido, são células de rim fetal humano imortalizadas, de um modo muito preferido, são seleccionadas de células HEK293 (ACC CLR-1573) HEK293 T (DSM ATCC 2494), 293 H e 293 freestyle 293 F (Invitrogen R79007), ou é uma célula CHO, Cos, hibridoma, mieloma, tal como célula NSO; e/ou (iii) as células de mamífero são transfectadas, de um modo estável, com uma cassete de expressão transportando o gene codificando para a proteína(s) alvo; e/ou (iv) na substância(s) iónica, o aminoácido com uma cadeia lateral carregada, é um aminoácido básico seleccionado de arginina, histidina e lisina e a peptona é uma peptona de soja; e/ou (v) a substância(s) iónica é/são adicionada(s) de modo a obter-se o estado de equilíbrio dentro da proteína e 2 superfície celular, suficiente para dissociar a ligação iónica e libertar proteínas ligadas da superfície celular, sem destruir a célula; e/ou (vi) pelo menos, uma substância iónica, de um modo preferido, duas e, de um modo muito preferido, três ou mais substâncias iónicas é/são adicionada(s); e/ou (vii) nenhum detergente não iónico ou apenas pequenas quantidades de detergentes não iónicos, são adicionados à suspensão e/ou estão presentes na composição de libertação, de um modo preferido, a composição de libertação é isenta de detergentes não iónicos; e/ou (viii) a composição de libertação compreende, adicionalmente, uma substância de tamponação para estabilizar o pH, de um modo preferido, a substância de tamponação é seleccionada de substâncias tampão de Goods, incluindo HEPES, MES e TRIS; e/ou (ix) o pH da suspensão celular, quando submetido à concentração aumentada da, pelo menos, uma substância iónica é, de um modo preferido, na gama de estabilidade para a proteína seleccionada, para FVIII é desde cerca de 6,0 a 7,5; e/ou (x) através da recolha da proteína, a viabilidade das células é mantida e, após recolha, a concentração não naturalmente aumentada da substância iónica, é reduzida ou as células são transferidas para dentro do novo meio de cultura, de modo a possibilitar um processo de produção cíclico contínuo da proteína, utilizando as mesmas células. (xi) a composição de libertação iónica é seleccionada de modo a conter, pelo menos, uma substância tendo como objectivo estabilizar as proteínas libertadas; e/ou 3 (xii) a cultura, sob condições isentas de soro, é realizada sob condições isentas de proteína ou o meio de cultura compreende um ou mais componentes proteicos, de um modo preferido, os referidos componentes proteicos são seleccionados de insulina, factor de crescimento de insulina (IGF) e semelhante a insulina.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que: (i) é adicionado KC1, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para, pelo menos, 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,2 a 2 M, de um modo mais preferido, desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,5 M; e/ou (ii) é adicionado CaCl2, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,01 a 0,5 M, de um modo preferido, desde 0,05 a 0,2 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,1 M; e/ou (iii) é adicionada lisina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para, pelo menos, 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,2 a 2 M, de um modo mais preferido, desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,8 M; e/ou (iv) é adicionada arginina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para, pelo menos, 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,2 a 2 M, de um modo mais preferido, 4 desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,8 M; e/ou (v) é adicionada histidina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para, pelo menos, 0,01 M, de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,01 a 0,3 M, de um modo mais preferido, desde 0,05 a 0,3 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,25 M; e/ou (vi) é adicionada peptona, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para, pelo menos, 0,01% (p/p), de um modo preferido, para uma concentração variando desde 0,1 a 20% (p/p).
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 que compreende uma ou mais das seguintes etapas: (a) cultivar as células em cultura em suspensão num meio de cultura; (b) separar o meio de cultura das células cultivadas, resultando em duas fracções separadas, uma fracção de células cultivadas e uma fracção de meio liquido; (c) colocar em contacto ou suspender a fracção de células cultivadas com uma composição de libertação, compreendendo uma concentração não fisiologicamente aumentada de, pelo menos, uma substância iónica, como definida nas reivindicações 1 a 4; (d) remover o meio de cultura das células, resultando em duas fracções separadas, uma fracção de células e uma fracção de composição de libertação; (e) isolar a proteína recombinante da fracção da composição de libertação; e 5 (f) suspender a fracção de células de (d) anterior em meio de cultura e recultivar.
6. Método da reivindicação 5, em que (i) a separação do meio das células cultivadas nas etapas (b) e (d) é efectuada por centrifugação, filtração, diafiltração, filtração tangencial, filtração convencional, microfiltração, campos eléctricos, campos magnéticos e ultrafiltração; e/ou (ii) o isolamento da proteína do meio e sua purificação são efectuados através da utilização de, pelo menos, uma técnica seleccionada de cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de afinidade, precipitação de proteína, trocas de tampão, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrófoba, meios de cromatografia hidrófoba/permuta iónica de modo misto, cromatografia quelante, cromatografia de afinidade por afinidade a hidrato de carbono como lectina ou heparina, cromatografia de exclusão de tamanho, electroforese, diálise, diferentes agentes de precipitação, tais como polietilenoglicol, sulfato de amónio, etanol, adsorção sobre hidroxiapatite, adsorção sobre membrana filtrante, ligandos ligados a partículas magnéticas, etc.; e/ou (iii) o veículo utilizado para a purificação cromatográfica é seleccionado de resinas, partículas, esférulas, membranas, fibra oca ou semelhantes; e/ou (iv) o isolamento da proteína compreende uma etapa de captura, onde o produto é ligado e os meios de cultura celular e composição de libertação são removidos por lavagem, de um modo preferido, a etapa de captura utiliza meios de cromatografia; e/ou 6 (v) as etapas (d) e (e) são efectuadas através da mistura da suspensão celular com um meio cromatográfico que se liga ao produto e, a seguir, os meios de cromatografia são removidos da suspensão celular, utilizando centrifugação, filtração, filtração convencional, filtração tangencial, microfiltração, campos eléctricos, campos magnéticos e/ou ultrafiltração.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, (i) que é realizado sob condições estéreis; e/ou (ii) em que o meio e/ou a proteína purificada é submetido a um etapa de inactivação e/ou remoção de virus.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que (i) duas ou mais substâncias iónicas são misturadas, de modo a formar a composição de libertação; e/ou (ii) a concentração de uma mistura de substâncias iónicas, necessária para se alcançar a libertação de proteínas desejada, é determinada através da divisão da quantidade teórica de substâncias iónicas, sendo baseada na concentração de libertação óptima para cada substância de libertação iónica, quando utilizada separadamente, com o número de substâncias; e/ou (iii) por uma combinação de substâncias iónicas, em virtude de efeitos combinatórios das diferentes substâncias iónicas, é requerida uma quantidade inferior de cada substância iónica para se alcançarem as propriedades de libertação de proteína da composição e 7 para proporcionar, simultaneamente, condições de cultura aceitáveis para as células; e/ou (iv) a composição de libertação iónica é seleccionada de modo a que, pelo menos, um componente actue como um estabilizador para que a proteína libertada seja activa antes e/ou após a separação de proteína e células.
9. Método da reivindicação 8, em que a composição de libertação compreende (i) CaCl2, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 0,01 e 0,05 M; e/ou (ii) KC1, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 0,1 e 0,2 M; e/ou (iii) arginina, histidina ou lisina, de um modo preferido, a uma concentração variando desde 0,05 a 0,2 M.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a suspensão celular é processada com um sistema de microfiltração, onde o poro do filtro foi escolhido de modo a reter as células e a técnica de filtração sendo escolhida a partir de técnicas de filtração convencional ou de fluxo tangencial e em que a composição de libertação é aplicada às células, imediatamente ou com um aumento gradual, utilizando a técnica de diafiltração e o produto isento de células é recuperado no filtrado do referido sistema de microfiltração.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que 8 (i) é adicionado KC1, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,4 a 2 M, de um modo preferido, desde 0,4 a 1 M, de um modo muito preferido, para uma concentração de cerca de 0,5 M; e/ou (ii) é adicionado CaCl2, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular de 0,05 para 0,2 M, de um modo preferido, para uma concentração de cerca de 0,1 M; e/ou (iii) é adicionada lisina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,4 a 1 M, de um modo preferido, para uma concentração de cerca de 0,8 M; e/ou (iv) é adicionada arginina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,4 a 1 M, de um modo preferido, para uma concentração de cerca de 0,8 M; e/ou (v) é adicionada histidina, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,05 a 0,3 M, de um modo preferido, para uma concentração de cerca de 0,25 M; e/ou (vi) é adicionada peptona, de modo a elevar a sua concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,1 a 20% (p/p).
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que é adicionado NaCl, de modo a elevar a concentração na suspensão celular para uma concentração variando desde 0,4 a 1 M, de um modo preferido, para uma concentração de cerca de 0,5 M. 9
13. Método de acordo com a reivindicação 8, em que (i) é utilizada uma combinação de NaCl e lisina na composição de libertação, com NaCl a uma concentração variando desde 0,1 a 1 M, de um modo preferido, desde 0,2 a 0,5 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,25 M e lisina a uma concentração variando desde 0,1 a 1 M, de um modo preferido, desde 0,2 a 0,5 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,4 M; e/ou (ii) é utilizada uma combinação de NaCl, histidina e CaCl2 na composição de libertação, com NaCl a uma concentração variando desde 0,05 a 0,6 M, de um modo preferido, desde 0,075 a 0,35 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,1 M, histidina a uma concentração variando desde 0,01 a 0,3 M, de um modo preferido, desde 0, 025 a 0,15 M, de um modo muito preferido, cerca de 0,05 M e CaCl2 a uma concentração variando desde 0,01 a 0,25 M, de um modo preferido, desde 0,025 a 0,15 M, de um modo muito preferido, a cerca de 0,05 M.
14. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a composição de libertação compreende CaCl2, a uma concentração variando desde 0,01 a 0,05 M, KC1, a uma concentração variando desde 0,1 a 0,2 M e arginina, histidina ou lisina, a uma concentração variando desde 0,05 a 0,2 M. Lisboa, 12 de Janeiro de 2011 10 1/4 Fase de Iniciação:

Fig. 1 2/4

Sobrenadante t Análise Fig.2 3/4 Fig.3 A Mw KDa Marcadores de Peso Molecular 210

41 f3 3S ·.!&' 150 kDa 100 kDa 79 kDa Pistas I 4/4 Fig.4 10404 ,5(70 1

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