ES2354715T3 - Procedimiento para mejorar el aislamiento de proteínas producidas de manera recombinante. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la producción recombinante de al menos una proteína diana, que es un factor VIII humano o una muteína con dominio B eliminado del mismo, en células de mamífero, que comprende efectuar el cultivo de células de mamífero, que son capaces de la expresión de dicha al menos una proteína diana en cultivo en suspensión, bajo condiciones libres de suero y someter una suspensión de dichas células, antes de separar la proteína de las células, a una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica seleccionada de NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCI, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada, y una peptona.

Description

La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de una proteína factor VIII producida cultivando células de mamífero bajo condiciones libres de suero y añadiendo una sustancia iónica al medio de cultivo antes de recoger la proteína. Sustancias iónicas adecuadas son NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada y peptona. 5

Antecedentes

La mayoría de las proteínas utilizadas para aplicaciones médicas, cosméticas o industriales se producen como proteínas recombinantes en células eucariotas o microbianas cultivadas. Para ello se inserta un gen que codifica la proteína de interés en el/las organismo/células elegido(as), el/las organismo/células que porta(n) dicho gen se cultiva(n) en un medio que comprende todos los nutrientes esenciales para permitir el crecimiento y la 10 expresión de dicho gen, dando como resultado la producción de la proteína de interés. Si las células secretan la proteína de interés en el medio, se separan entre sí las células del medio usando centrifugación o membranas de filtro. Entonces, el medio recuperado que contiene la proteína libre de células se procesa adicionalmente a través de etapas de purificación para retirar proteínas de células huésped, ADN y otros contaminantes.

En general, hay dos alternativas de producción diferentes para la recogida de proteínas producidas de 15 manera recombinante, recogida continua y por lotes. Si se aplica la recogida continua, los medios de cultivo se retiran continuamente de manera lenta del recipiente de cultivo celular durante la fase de producción y se añade simultáneamente el medio fresco. Se elige la recogida continua si las células crecen de manera lenta y/o si el procedimiento facilita una concentración celular alta o si el producto debe retirarse rápidamente del cultivo para protegerlo de la degradación. La recogida por lotes se realiza en un punto definido, en el que las células se retiran 20 en una etapa y a continuación se descargan normalmente. Técnicamente es más fácil llevar a cabo una recogida por lotes que una continua, pero el procedimiento de recogida óptimo se debe determinar en cada caso específico dependiendo del producto y del tipo de células. En algunos casos, en los que el producto no se secreta, debe destruirse la membrana celular para poder recuperar el producto. Sin embargo, se prefiere mantener la membrana celular intacta, si es posible, para poder evitar la contaminación del producto con ADN y con proteínas de células 25 huésped. La recogida continua proporciona normalmente una productividad total más alta en comparación con la recogida por lotes ya que las células pueden producir durante un periodo de tiempo mayor. Para minimizar la contaminación del producto, es preferible elegir el procedimiento de recogida que libere la menor cantidad de ADN y de proteínas de células huésped. En un modo especial de cultivo por lotes, en el que las membranas celulares se mantienen intactas, se puede lograr una mejora considerable de la productividad, si se puede reutilizar la célula. 30 Este procedimiento de recogida por lotes cíclico se puede aplicar especialmente para células de producción que crecen lentamente (valiosas).

Para obtener rendimientos altos de la proteína, es importante optimizar el procedimiento para lograr una productividad alta del producto. Los principales esfuerzos por el momento para mejorar el rendimiento de una proteína producida de manera recombinante se han centrado en la inserción molecular (vectores, potenciadores, 35 promotores, etc.) para optimizar el sistema de expresión, en las condiciones bajo las que se cultivan las células y en las etapas de purificación reales. Por ejemplo se añaden al medio estabilizadores tales como inhibidores de proteasa y se establecen los procedimientos de purificación en presencia de inhibidores de proteasa para reducir la pérdida de proteína de producto. Sin embargo, a menudo es muy difícil encontrar un inhibidor de proteasa que se pueda usar durante el cultivo, ya que los inhibidores de proteasa también tienden a inhibir el crecimiento celular y la 40 producción de proteínas. En cuanto se han retirado las células, es más fácil encontrar un inhibidor de proteasa adecuado. Esto se describe, por ejemplo, en el documento US 5.831.026, en el que se añade EDTA para inhibir las metaloproteasas. Además, hay que señalar que es necesario retirar de nuevo en algún punto del procedimiento de producción cualquier agente estabilizador añadido para obtener un producto de proteína recombinante puro. Por tanto, todavía hay una necesidad de mejorar los procedimientos existentes de producción de proteína recombinante 45 para conseguir rendimientos más altos de la proteína recombinante.

Otro problema que se encuentra especialmente al utilizar células de mamífero como huéspedes de producción es que la secreción de las proteínas producidas es bastante baja. Es evidente que los productos secretados a menudo se adhieren a la membrana celular y que esto tiene una influencia en la liberación de producto. En algunos casos, se puede inhibir el retraso mediante condiciones fisiológicas (es decir, el entorno en el que se 50 cultivan las células), mientras que en algunos casos deben aplicarse condiciones no fisiológicas. Debe evitarse la ruptura total de las células, si es posible, ya que esto libera ADN y proteínas de células huésped, que debe eliminarse después en el procedimiento de purificación.

Se sabe en la técnica que un incremento en las concentraciones de sales (por ejemplo, NaCl), junto con la adición de detergente y/o ajustando un pH específico puede liberar en algunos casos las proteínas unidas. Por 55 ejemplo, K. Berman et al., Mol. Cell Biol. Res. Com. 4, 337-344 (2001) destaca que en la producción de homólogos de p38 en células HEK293, las células se pueden estimular con sorbitol o con NaCl 0,7 M durante 10 minutos antes de la recogida. A. B. Vaandrager et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, n.º 12, pp. 7025-7029 (1996) da a conocer que el

cultivo de células HEK293 que expresan cGKII de rata da como resultado la recuperación del 90-95% del cGKII expresado, y que la enzima se puede liberar de las membranas mediante una combinación de detergente (Triton® X-100 al 1%) y sal en concentración alta (NaCl 0,5 M) pero no mediante detergente o sal en concentración alta solos. A. Denys et al., Biochem J., 336, 689-697 (1998) dan a conocer que se liberó una proteína a partir de células humanas linfocitos T usando un procedimiento de lavado que incluye NaCl 0,6 M. Sin embargo, no se pudo liberar 5 toda la proteína (70%) incluso si se eleva la concentración de NaCl hasta 1 M. Además, el pH bajo, tal como pH 4, no liberó toda la proteína unida (34%), mientras que una combinación de pH bajo y concentración de sal incrementada (NaCl 0,5 M, glicina 0,2 M, pH 4) liberó toda la proteína unida. G. Grasset al., Infection and Immunity, p. 213-228 (2004) da a conocer que en la expresión bacteriana de metaloproteinasas, el procedimiento de lavado con tampón de fuerza iónica alta (NaCl 3 M) no liberó la proteína. Sin embargo, la proteína pudo liberarse mediante 10 butanol o un detergente. C. M. Mounier et al., J. Biol. Chem. 279, No. 24, pp. 25024-25038 (2004) informa para las células HEK293 y CHO que las proteínas expresadas mediante dichas células se unieron a la superficie celular. Esto se pudo inhibir incrementando la concentración de sal (NaCl) en el intervalo de 0,12 a 1 M. A 1 M parecía que todas las proteínas se habían liberado. En un ejemplo con HEK293 las células se trataron con 1M de NaCl y la proteína liberada se incrementó tres veces. M. Fannon et al., Biochemistry 39, 1434-1445 (2000) informa de la unión de 15 proteínas a fibroblastos. Se compararon tres procedimientos de lavado diferentes, sal en concentración alta (NaCl 2 M, pH 7,4), pH bajo (acetato de sodio 20 mM, pH 4) y sal en concentración alta, pH bajo (NaCl 2 M, pH 4). Todos dos los tampones, bajo ciertas circunstancias, liberan la proteína. Sal en concentración alta y pH bajo es eficaz en todos los experimentos. M. E. Zuber et al., J. Cell Physiology, 170:217-227 (1997) informa que la unión de proteínas a la superficie de las células CHO puede inhibirse mediante tratamiento con sal en concentración alta/pH bajo (NaCl 20 2 M, pH 4). J. Norbeck et al., FEMS Microbiology Letters 137, p. 1-8 (1996) informa sobre células de levadura que se sometieron a NaCl 0,4 M durante un periodo de 1,5 h durante el crecimiento y sobre los efectos del mismo sobre la tasa de expresión de varias proteínas. Finalmente, P. M. Dey et al., Planta 202:179-187 informa del aislamiento de glucoproteínas ricas en hidroxiprolina de células de patata cultivadas en suspensión lavando las células de patata con una solución que contenía CaCl2 50 mM y ácido ascórbico 2 mM. 25

En vista de lo anterior, es evidente que todavía es deseable un procedimiento general para incrementar la recuperación de proteínas recombinantes en sistemas de expresión de células de mamífero o eucariotas.

De interés particular son los procedimientos para la producción libre de suero de proteínas que se necesitan para aplicaciones médicas (tales como proteínas de plasma que incluyen factores de la coagulación sanguínea que se requieren para el tratamiento de trastornos hemofílicos) y para los que el producto libre de suero es deseable por 30 razones obvias. Los hemofílicos padecen de morbilidad hemorrágica provocada por la perturbación de la función de los componentes de las proteínas de la cascada de la coagulación sanguínea. Dependiendo del factor de coagulación afectado, la hemofilia se clasifica en dos tipos, hemofilia A y B, en ambos se inhibe la conversión de fibrinógeno soluble a un coágulo de fibrina insoluble. Son trastornos genéticos recesivos unidos al cromosoma X que afectan principalmente a la población masculina. 35

La hemofilia A afecta a 1-2 individuos por cada 10.000 hombres. Este es un trastorno genético que afecta a la capacidad de la sangre para formar un coágulo eficaz y da como resultado por tanto un sangrado prolongado. Ya que la hemofilia A es un trastorno recesivo unido al cromosoma X, afecta casi exclusivamente a los hombres. Está provocada por la deficiencia o ausencia del factor VIII, una glucoproteína muy grande (Mr aproximadamente de 330 kDa (Furie B., Furie B.C., Cell (1988) 53, 505-518; la secuencia del mismo se da en la SEC ID N.º: 2)), que 40 representa un elemento importante de la cascada de la coagulación sanguínea. La secuencia de polipéptidos de FVIII se puede subdividir en tres regiones, una región N-terminal constituida por los denominados dominios A1 y A2, una región de dominio B central y una región C-terminal compuesta por los dominios A3, C1 y C2. En la coagulación sanguínea el factor VIII se produce como un precursor inactivo. Está unido fuertemente y de manera no covalente al factor von Willebrand (vWF), que actúa como una proteína portadora estabilizadora. La escisión proteolítica del 45 factor VIII mediante trombina en tres posiciones específicas (740, 1372, 1689; véase SEC ID N.º: 2) conduce a su disociación de vWF y libera la función procoagulante dentro de la cascada. En su forma activa, el factor VIII funciona como un cofactor para el factor IXa, acelerando por tanto la activación proteolítica del X mediante diversos órdenes de magnitud.

La hemofilia B se produce aproximadamente en 1 de cada 25.000 hombres. Se caracteriza por una 50 deficiencia de la serinaproteasa factor IX (factor Christmas; véase la SEC ID N.º: 11). El gen que codifica el factor IX está localizado en el cromosoma X (locus Xq27) haciendo de la hemofilia B un trastorno recesivo unido al cromosoma X. Este polipéptido de 415 aminoácidos se sintetiza en el hígado como una glucoproteína de 56 kDa. Para conseguir su función apropiada, se requiere una etapa de carboxilación postraduccional que se produce en presencia de vitamina K. 55

El tratamiento de estos tipos de trastornos de hemorrágicos implica tradicionalmente infusiones de concentrados de proteínas derivados de plasma humano del/de los factor(es) que faltaban, es decir, terapia de reemplazo. Aunque este procedimiento representa una terapia eficaz para los hemofílicos, conlleva el riesgo de transmisión de varios agentes infecciosos, tales como hepatitis provocada por virus o SIDA, o factores

tromboembólicos. Alternativamente, se han descrito diversas técnicas de ADN recombinante para la producción de factores de coagulación. Los ADNc correspondientes del factor IX y del factor VIII naturales se han aislado y se han clonado en vectores de expresión adecuados (documentos EP-A-160457; WO-A-86/01961, patentes de EE.UU. 4.770.999, 5.521.070 y 5.521.070).

En el caso del factor VIII, se conoce en la técnica la expresión recombinante de las subunidades para la 5 producción de complejos que muestran actividad coagulante (p.e., de los documentos EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, de las patentes de EE.UU 5.045.455 y 5.789.203). Además, se ha descrito la expresión de versiones de ADNc truncado que carece parcial o completamente de la secuencia que codifica el dominio B altamente glucosilado (p.e. en los documentos WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, en las patentes de EE.UU. 4.868.112 y 4.980.456, en los 10 documentos EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540, WO-91/09122 y WO 01/70968.

Los pasos siguientes proporcionan detalles sobre el factor VIII humano ya que se ha elegido como modelo de proteína recombinante para ilustrar la presente invención.

El gen que codifica la proteína factor VIII está situado en la punta del brazo largo del cromosoma X en el locus Xq28. Abarca más de 186 kb, y por tanto es uno de genes más largos conocidos. El gen del factor VIII 15 comprende 26 exones y su transcripción y su procesamiento posterior da como resultado un ARNm de 9-kb. La traducción de este ARNm conduce a una cadena de polipéptidos de 2351 aminoácidos, que contiene un péptido señal de 19 y una proteína madura de 2332 aminoácidos (véase SEC ID N.º: 1 y 2). El análisis de la estructura primaria determinada a partir del ADNc del factor VIII clonado reveló la organización en los dominios estructurales que se producen en el orden A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2. 20

Los espaciadores cortos a1, a2 y a3 se denominan regiones ácidas que contienen grupos de residuos Asp y Glu y en la bibliografía a menudo se incluyen en los dominios A dando como resultado la estructura de dominio ligeramente simplificada A1-A2-B-A3-C1-C2. Después de la traducción y modificación postraduccional, el producto de traducción primario, que tiene una masa molecular de aproximadamente 300 kDa, sufre una proteolisis intracelular cuando deja el aparato de Golgi que procesa el producto de traducción primario en una cadena pesada 25 amino terminal de 90-210 kDa (A1-a1-A2-a2-B) y en una cadena ligera carboxi terminal de 80 kDa (a3-A3-C1-C2), dando lugar a la molécula heterodimérica que circula en el plasma sanguíneo. En esta molécula heterodimérica, las cadenas pesada y ligera del factor VIII están unidas de manera no covalente mediante iones metálicos divalentes. La envergadura en los pesos moleculares de la cadena pesada es el resultado de diferentes grados de escisión proteolítica del dominio B. Los dominios B más o menos truncado permanecen unidos al dominio A2. El dominio B 30 no parece que tenga influencia sobre la actividad biológica de la molécula de FVIII. Esto está respaldado por el hecho de que durante la activación del FVIII se escinde todo el dominio B. Inmediatamente después de su liberación en el torrente sanguíneo, el heterodímero del FVIII interactúa con una proteína portadora denominada "factor von Willebrand" (vWF). Esta interacción estabiliza estructura heterodimérica del FVIII incrementando la vida media del FVIII en la circulación sanguínea. Adicionalmente, la formación de complejo con el vWF previene la unión prematura 35 del factor VIII a las membranas celulares y a los componentes del complejo tenasa. Además, en cierta medida se previene la escisión proteolítica de la molécula del FVIII uniendo la molécula de manera no covalente al vWF. Sin embargo, aún es posible la escisión por trombina del FVIII y da como resultado una pérdida de afinidad hacia vWF y la conversión del FVIII a su forma activa.

Tal como se puede ver en el párrafo precedente, el factor VIII es una glucoproteína compleja que da como 40 resultado un procedimiento de producción difícil para mantener la integridad estructural y la estabilidad de la proteína. Especialmente el dominio B que alberga completamente 19 de los 25 sitios de glucosilación unidos a N totales, hace difícil la fabricación de la proteína de longitud completa, ya que la glucosilación incorrecta siempre conlleva el riesgo de reacciones inmunogénicas contra el producto. La función del dominio B aún no se ha dilucidado completamente, pero se ha encontrado que este dominio so es esencial para la función hemostática del factor VIII (Sandberg et al., 45 Seminars in Hematology 38, Supl. 4, 24-31 (2001). Se ha hecho esta observación tanto in vitro como in vivo para el factor VIII derivado de plasma humano que carece del dominio B completo, así como para múltiples formas de las moléculas de factor VIII recombinantes que carecen del dominio B completo. Se puede purificar el factor VIII con el dominio B eliminado derivado de plasma a partir de concentrados de factor VIII derivado de plasma ya que estas concentraciones contienen múltiples formas activas del factor VIII en el intervalo de tamaño desde 170 kDa hasta 50 280 kDa que resultan más probablemente de diferencias en la longitud del dominio B contenido aún en la proteína heterodimérica, lo que respalda el hallazgo que el dominio B no es esencial para la actividad del factor VIII (Eriksson et al., Seminars in Hematology 38, Supl. 4, 24-31 (2001). Además de incrementar su estabilidad estructural, la transfección de células eucariotas con ADNc del factor VIII de dominio B eliminado también proporciona niveles de expresión mejorados de la proteína (Herlitschka et al., Journal of Biotechnology 61, 165-173 (1998)). Estas 55 características dieron como resultado un producto de factor VIII recombinante con el dominio B eliminado, que está disponible comercialmente, que muestra eficacia y seguridad comparable como factor VIII derivado de plasma y recombinante de longitud completa.

En general, la deleción del dominio B se ha llevado a cabo en el nivel del ADNc dando como resultado la

reducción del tamaño total de la molécula de factor VIII de longitud completa mediante aproximadamente el 40% desde 2332 aminoácidos hasta 1440 aminoácidos. El extremo C-terminal de la cadena pesada y el extremo N-terminal de la cadena ligera se han unido en algunos casos usando un enlazador de aminoácidos corto que reemplaza el dominio B completo con sus 908 aminoácidos (tal como se describe en los documentos WO 00/49147 y WO 01/70968). El extremo N terminal del enlazador descrito en estas referencias se deriva del extremo N terminal 5 del dominio B mientras que el extremo C terminal consta de una secuencia de enlazador especialmente diseñada. Como el factor VIII recombinante de longitud completa y el factor VIII derivado de plasma, la mayoría del factor VIII con dominio B eliminado se secreta como un heterodímero unido de manera no covalente de la cadena ligera y pesada. También se secreta una pequeña cantidad de factor VIII recombinante con dominio B eliminado monocatenario no escindido con un peso molecular de 170 kDa. Estudios extensos han mostrado que la unión al 10 factor Willebrand factor y la activación mediante escisión por trombina así como la interacción con algunas otras moléculas fisiológicamente relevantes es comparable a lo descrito para el factor VIII humano natural.

Existen productos recombinantes del factor VIII. Como la abundancia de los transcritos de ARNm es muy baja (sólo 10-5 de todo el ARNm del hígado) llevó mucho tiempo obtener el transcrito de ADNc completo de la proteína. Con este avance principal en los años 80 y la transfección exitosa de las células CHO con el ADNc, en 15 1992se introdujo en el mercado el primer producto de factor VIII recombinante. Desde entonces, las ventas anuales de preparaciones del factor VIII recombinante han alcanzado valores > 1 billón de $ americanos (Schmid: Pocket Guide to biotechnology and genetic engineering; Wiley-VCH (2003)). Actualmente están disponibles comercialmente cuatro preparaciones del factor VIII recombinante diferentes. Los fabricantes de estas cuatro preparaciones cubren aproximadamente el 60% de la demanda de preparaciones del factor VIII en los países desarrollados. Sin embargo, 20 todavía no es suficiente su capacidad y los procedimientos para incrementar el rendimiento de un procedimiento de producción para una proteína recombinante serán particularmente beneficiosos para la producción del factor VIII recombinante.

En la producción de un FVIII con dominio B eliminado recombinante de acuerdo con el documento WO 01/70968, se transformaron las células HEK con un gene para FVIII, se cultivaron las células transformadas y se 25 secretó el FVIII. Durante la recogida de las células, se separaron la molécula de FVIII y las células usando centrifugación o membranas de filtro. Entonces, los medios recuperados que contienen el factor VIII libre de células se procesaron adicionalmente a través de etapas de purificación para retirar las proteínas de células huésped, ADN y otros contaminantes. Las tasas de recuperación del FVIII expresado obtenido hasta ese momento sólo eran moderadas. Además, B. Boedeker (Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27(4), 385-394 (2001)) proporciona un 30 estudio de la producción de preparaciones del factor VIII recombinante. En general, y específicamente para la producción recombinante de las proteínas de plasma tales como FVIII, es muy importante optimizar el procedimiento para lograr una productividad alta del producto. Esto es esencial para la economía del producto ya que el procedimiento de producción recombinante es relativamente caro y sensible a perturbaciones (infecciones, etc.) debido a su origen biológico. 35

Resumen de la invención

En vista de lo anterior, es deseable establecer un procedimiento de producción libre de suero que proporcione un incremento de los rendimientos de la proteína factor VIII recombinante. De manera sorprendente, se ha encontrado que, mediante una medida muy simple, el rendimiento de una proteína factor VIII recombinante que se recoge a partir del medio de cultivo libre de suero se puede incrementar aproximadamente de 2 a 20 veces. Por 40 tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para mejorar el rendimiento de proteínas de factor VIII recombinantes producidas cultivando células de mamífero bajo condiciones libres de suero. Con más detalle, la presente invención proporciona:

(1) Un procedimiento para la producción recombinante de al menos una proteína diana, que es un factor VIII humano o una muteína con dominio B eliminado del mismo, en células de mamífero, que comprende efectuar el 45 cultivo de células de mamífero, que son capaces de la expresión de dicha al menos una proteína diana en cultivo en suspensión, bajo condiciones libres de suero y someter una suspensión de dichas células, antes de separar la proteína de las células, a una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica seleccionada de NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCI, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada, y una peptona; y 50

(2) un modo preferido del procedimiento de acuerdo con la realización (1), que comprende una o más de las etapas siguientes:

(a) cultivar las células en un medio de cultivo;

(b) separar el medio de cultivo de las células cultivadas, dando como resultado dos fracciones separadas, una fracción de células cultivadas y una fracción de medio líquido; 55

(c) poner en contacto o suspender la fracción de células cultivadas con una composición de liberación que comprende una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica tal como se

define en (1) anterior;

(d) retirar el medio de cultivo de las células, dando como resultado dos fracciones separadas, una fracción de células y una fracción de composición de liberación;

(e) aislar la proteína de plasma de la fracción de composición de liberación; y

(f) suspender la fracción de células de (d) anterior en medio de cultivo y volver a cultivar. Lo esencial de la presente 5 invención reside en el uso de una sustancia iónica, que se añade a la suspensión celular (o directamente en el medio de cultivo) inmediatamente antes de la recogida. La adición de la sustancia iónica a la suspensión celular permite tanto procedimientos de aislamiento perjudiciales (en los que se destruyen las células) como procedimientos en los que se secreta la proteína deseada. En caso de esto último, el procedimiento se puede adaptar a un procedimiento cíclico, después de someter la suspensión celular al incremento de sustancia iónica, a la separación 10 de la suspensión en fracción celular y fracción líquida y al aislamiento de una proteína deseada a partir de la fracción líquida, se puede volver a cultivar la fracción celular, por ejemplo, tal como se especifica en la realización (2) anterior.

Breve Descripción de las Figuras

Figura 1: Esquema que muestra un procedimiento de cultivo. 15

Figura 2: Diagrama de flujo del montaje experimental para experimentos a pequeña escala. En primer lugar, se mezclan la suspensión celular y la sustancia iónica en forma líquida (tampón) y se incuban durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la incubación se comprueba la viabilidad de las células, antes de separar las células del medio mediante centrifugación. Entonces, se analiza el sobrenadante (medio libre de células) para determinar la proteína recombinante o se congela para una análisis posterior. 20

La figura 3 muestra el análisis por transferencia de Western de material de investigación bruto recogido con diferentes composiciones de liberación (fig. 3A carriles de 3 a 6, fig. 3B calles de 2 a 8) que se compara con marcadores moleculares (figs. 3A y 3B carril 1, respectivamente) and producto de FVIII altamente purificado fig. 3A carril 2).

Figure 3A (procedimiento por transferencia de western 1): carril 1: Marcador de masa molecular (SeeBlue); carril 2: 25 rFVIII estándar (Refacto, Wyeth), 200 UI/ml; carril 3: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando NaCl 0,1 M (ejemplo 6A), 9 UI/ml; carril 4: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando NaCl 0,55 M, 18 UI/ml (ejemplo 6D); calle 5: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando NaCl 0,55 M, 16 UI/ml (ejemplo 6A); calle 6: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando NaCl 0,55 M, 13,6 UI/ml (ejemplo 7B)

Figura 3B (procedimiento por transferencia de western 2, alta sensibilidad): carril 1: Marcador de masa molecular; 30 calle 2: FVIII de suspensión celular de referencia 1 UI/ml; carril 3: FVIII de suspensión celular de referencia 0,2 UI/ml; carril 4: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando CaCl2 0,2 M, 1,6 UI/ml (ejemplo 6A); carril 5: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando CaCl2 0,2 M, 0,73 UI/ml (ejemplo 6A); carril 6: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando CaCl2 0,1 M, 1,73 UI/ml (ejemplo 8A); carril 7: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación usando CaCl2 0,1 M, 0,87 UI/ml (ejemplo 8A); carril 8: rFVIII a partir de un procedimiento de liberación 35 usando NaCl 0,55 M, 1,81 UI/ml (ejemplo 6A).

La figura 4 muestra la estructura molecular común de pTGF8-3 y pTGF8-2hyg-s, ADN circular de 10698 pb, las secuencias de ADN exactas de las mismas se dan en las SEC ID N.º:3 y 5, respectivamente (para la proteína factor VIII codificada por dicha secuencia de ADN véanse las SEC ID N.º:4 y 6, respectivamente).

Descripción detallada de la invención 40

El término "rendimiento" dentro del significado de la invención se define como el cambio en la liberación de FVIII en comparación con el rendimiento obtenido usando procedimientos de recogida normales (recogida sin adición de sustancias cargadas) o en comparación con procedimientos de recogida con adición de niveles de sal fisiológicos o inferiores, normalmente se añadió NaCl 0,1 M al medio de cultivo.

La expresión "libre de suero" se refiere a la transfección y cultivo de células en un medio que contiene 45 suplementos adecuados excepto cualquier clase de suero. Los suplementos se seleccionan de aminoácidos, lípidos, oligoelementos, vitaminas y otros componentes potenciadores del crecimiento. A menudo, las condiciones de cultivo “libre de suero” son incluso más restrictivas y, si no se añade proteína exógena, o ya se incluyó en el medio, el medio se denomina “libre de proteína”.

La expresión "proteína factor VIII" incluye proteínas sintetizadas de manera natural que están codificadas 50 por los genes de células cultivadas así como proteínas recombinantes secretadas por células. Proteínas recombinantes son las que están codificadas por transgenes introducidos en las células mediante técnicas de biología molecular. De acuerdo con la invención, "proteína factor VIII" incluye proteínas de origen humano y animal, pero también proteínas de otras fuentes tales como plantas, insectos, etc., y proteínas mutadas, artificiales, sintéticas, de fusión o quiméricas. En particular, "proteína factor VIII" incluye una proteína factor VIII humana (véase 55

la SEC ID N.º: 2 para la proteína de longitud completa) o una muteína con dominio B eliminado de la misma.

Una muteína del factor VIII concreta en la que el dominio B entre las posiciones Arg740 y Glu1649 se ha reemplazado por un péptido enlazador rico en Arg que tiene al menos 3 residuos de Arg y que comprende de 10 a 25 residuos de aminoácidos (en los que dicha numeración del factor VIII se refiere a la secuencia del factor VIII natural maduro mostrado en la SEC ID N.º: 2) se da a conocer en el documento WO 01/70968 que se incorpora en 5 el presente documento en su totalidad. Se prefiere que el péptido enlazador rico en Arg tenga de 14 a 20 residuos de aminoácidos, mientras que un enlazador que comprende:

la secuencia de aminoácidos SFSQNSRH (SEC ID N.º: 7), y/o

la secuencia de aminoácidos QAYRYRRG (SEC ID N.º: 8), y/o

la secuencia de aminoácidos SFSQNSRHQAYRYRRG (SEC ID N.º: 9) 10

es particularmente preferido. Lo más preferido es una muteína del factor VIII, que comprende aminoácidos de 1 a 1440 de la SEC ID N.º: 4, o incluso más, una muteína del factor VIII que tiene la SEC ID N.º:4.

La proteína factor VIII o la muteína del VIII tal como se define anteriormente en el presente documento puede tener una o más de las mutaciones siguientes (adicionales) (a), (b) y (c):

(a) Val en la posición 162 se ha reemplazado por un residuo de aminoácido neutro seleccionado de Gly, Ala, 15 Leu, Ile, Met y Pro;

(b) Ser en la posición 2011 se ha reemplazado por un residuo de aminoácido hidrofílico seleccionado de Asn, Thr y Gln; y

(c) Val en la posición 2223 se ha reemplazado por un residuo de aminoácido ácido seleccionado de Glu y Asp (de nuevo dicha numeración del factor VIII se refiere a la secuencia del factor VIII natural maduro en la SEC ID 20 N.º:2).

Se prefiere una proteína factor VIII o una muteína del factor VIII que tenga al menos una de las mutaciones (a) y (b) o que tenga las tres mutaciones (a), (b) y (c).

Adicionalmente, las mutaciones preferidas en de (a) a (c) son las siguientes: (a) Val en la posición 162 se ha reemplazado por Ala, (b) Ser en la posición 2011 se ha reemplazado por Asn, y/o (c) Val en la posición 2223 se 25 ha reemplazado por Glu.

Es particularmente preferida una muteína del factor VIII, que comprende aminoácidos del 1 a 1440 de la SEC ID N.º:6, o incluso más, una muteína del factor VIII que tiene la SEC ID N.º:6. No hay limitación en los vectores para la expresión de las proteínas de la invención. Vectores adecuados incluyen vectores de la serie pUC, tales como (MBI Fermentas) y modificaciones de los mismos tal como se utiliza en el documento WO 01/70968, que se 30 incorpora en el presente documento es su totalidad. Los vectores para las muteínas del factor VIII particularmente preferidas mencionadas anteriormente en el presente documento, son pTGF8-3 y pTGF8-2hyg-s, su estructura se muestra en la figura 4 y las secuencias de ADN exactas de los mismos se dan en las SEC ID N.º:3 y 5, respectivamente. La preparación de dichos vectores se da a conocer en el documento WO 01/70968.

La expresión "células de mamífero" y "célula de mamífero" de acuerdo con la invención incluyen células 35 aisladas o tejido aislado de mamíferos (concretamente humanos, roedores, etc.). Células de mamífero particularmente preferidas incluyen células animales y humanas que se mantienen en el medio de cultivo. Particularmente preferidas para la producción de proteínas humanas tales como proteínas de plasma humano son células humanas tales como células primarias o células inmortalizadas tales como célula de riñón, vejiga, pulmón, pulmón, músculo cardíaco, músculo liso, ovario o gastrointestinal. Las más preferidas son células de riñón fetal 40 humano tales como 293 (DSM ACC 305), 293T (DSM ACC 2494), y 293F y 293H (Invitrogen 11625-019 y 11631-017, respectivamente) etc. Otras células particularmente adecuadas son Cos, CHO, hibridoma, mieloma tales como células NSO y células de insecto. Particularmente preferidas son células mencionadas anteriormente, que están adaptadas para cultivarse bajo condiciones límites de suero.

En una realización preferida las células de mamífero, que incluyen las mencionadas anteriormente, se 45 transfectan de manera estable con un casete de expresión que porta el gen que codifica la proteína o la proteína de plasma.

El incremento (ajuste) de la concentración de la sustancia iónica en la suspensión celular se efectúa añadiendo a la suspensión celular una composición de liberación que comprende dicha al menos una sustancia iónica. La composición de liberación se puede añadir a la suspensión celular en forma sólida o líquida. Sin embargo, 50 se prefiere que la composición de liberación se añada a la suspensión celular hasta las 72 h, preferiblemente 12-24 h y lo más preferible de 1 a 120 min antes de la separación de la proteína. En un modo preferido del procedimiento de la invención, la composición de liberación se añade directamente al caldo de cultivo o se añade a las células o a una suspensión de las células aisladas a partir del caldo de cultivo. La composición de liberación se puede añadir en una etapa o se puede añadir gradualmente hasta alcanzar la concentración final dentro de 1-4300 minutos. También 55

se puede añadir la composición de liberación con una técnica de diafiltración.

"Concentración incrementada de manera no fisiológica de una sustancia iónica" se refiere a una concentración del sustrato iónico que es mayor que la concentración en la célula/en el medio de cultivo óptimo de la célula en condiciones normales (por ejemplo in vitro).

Las "sustancias iónicas" de acuerdo con la presente invención incluyen NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, 5 Na2SO4, KCl, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada, tal como aminoácidos básicos que incluyen aminoácidos seleccionados de arginina, histidina, lisina, etc., y

peptona, tal como peptona de soja, preferiblemente que tenga un peso molecular promedio por debajo de 1000 g/mol, preferiblemente entre 500 y 600 g/mol.

En una realización preferida de la invención, se añade la sustancia iónica hasta alcanzar el equilibrio en la 10 proteína y la superficie celular, lo suficiente para romper la unión iónica y liberar las proteínas unidas a la superficie celular sin destruir la célula. De acuerdo con la invención se añade al menos una sustancia iónica, preferiblemente dos y lo más preferiblemente tres o más sustancias iónicas.

Además, se prefiere que no se añadan o que se añadan sólo pequeñas cantidades de detergentes no iónicos a la suspensión y/o estén presentes en la composición de liberación. Es particularmente preferido que la 15 composición de liberación esté libre de detergentes no iónicos. La composición de liberación tal como se define anteriormente en el presente documento puede comprender además una sustancia tamponadora para estabilizar y mantener la suspensión a un cierto pH. Hay que considerar que alguna de las sustancias iónicas definidas anteriormente posee propiedades de tamponamiento excelentes. Por tanto, si se utilizan sustancias iónicas que no tienen propiedades de tamponamiento o que sólo tienen propiedades de tamponamiento bajas, se requieren 20 sustancias de tamponamiento adicionales. La elección de sustancias de tamponamiento adicionales adecuadas por supuesto depende del sistema celular y de que se mantenga el pH. Tales sustancias de tamponamiento adicional incluyen HEPES, MES, TRIS, etc. En general, el pH de la suspensión celular cuando se somete a un incremento de la concentración de al menos una sustancia iónica está en el intervalo de estabilidad para la proteína seleccionada, para FVIII es aproximadamente de 6,0 a 7,5. 25

En una realización preferida de la invención, la sustancia iónica y su concentración se seleccionan de modo que las células se puedan cultivar de manera continua bajo liberación simultánea de la proteína. Preferiblemente, se retira entonces la proteína del caldo de cultivo usando, por ejemplo, una centrífuga continua o diafiltración a través de una membrana de microfiltrado. Esto permite la protección de proteínas sensibles de la degradación proteolítica, etc., debido a la rápida retirada del caldo de cultivo. 30

En una realización particularmente preferida, la sustancia iónica y su concentración se seleccionan de modo que se mantenga la viabilidad de las células. También se mantiene la viabilidad de las células recogiendo la proteína, después de la recogida se reduce la concentración incrementada de manera no natural de la sustancia iónica o se transfieren las células en el medio de cultivo fresco, para permitir un procedimiento de producción cíclico de la proteína. Esto permite que se lleve a cabo el procedimiento reivindicado de manera cíclica tal como se 35 expone en la realización (2) anterior.

Además, el modo preferido de adición y la concentración preferida de la sustancia iónica preferida NaCl, KCl, CaCl2, arginina, histidina y lisina son los siguientes:

Puede añadirse NaCl para elevar la concentración en la suspensión hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más 40 preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M. En particular, la concentración del mismo en la suspensión puede estar en el intervalo de 0,2 M hasta la saturación de la solución, preferiblemente está en el intervalo de 0,2 a 2M, o de 0,2 a 1 M, o de 0,2 a 0,8 M, o de 0,2 a 0,6 M, o de 0,2 a 0,5 M, o de 0,4 a 1 M, o de 0,4 a 0,8 M, o es aproximadamente 0,5 M.

Se añade KCl para elevar su concentración en la suspensión hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta una 45 concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M. En particular, la concentración del mismo en la suspensión puede estar en el intervalo de 0,2 M hasta la saturación de la solución, preferiblemente está en el intervalo de 0,2 a 2 M, o de 0,2 a 1 M, o de 0,2 a 0,8 M, o de 0,2 a 0,6 M, o de 0,2 a 0,5 M, o de 0,4 a 1 M, o de 0,4 a

0,8 M, o es aproximadamente 0,5 M. 50

Puede añadirse CaCl2 para elevar su concentración en la suspensión hasta una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,5 M, más preferiblemente desde 0,05 hasta 0,2 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,1 M. En particular, la concentración del mismo en la suspensión puede estar en el intervalo de 0,01 a 0,1 M, o de 0,05 a 0,15 M, o es aproximadamente 0,1 M.

Puede añadirse arginina para elevar su concentración en la suspensión hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta 55

una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M. En particular, la concentración de la misma en la suspensión está en el intervalo de 0,2 M hasta la saturación de la solución, preferiblemente puede estar en el intervalo de 0,2 a 2 M, o de 0,4 a 1,5 M, o de 0,4 a 1,2 M, o de 0,4 a 1,0 M, o de 0,4 a 0,8 M, o de 0,6 a 0,9 M, o de 0,6 a 0,8 M, o es aproximadamente 0,75 M. 5

Puede añadirse lisina para elevar su concentración en la suspensión hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M. En particular, la concentración de la misma en la suspensión está en el intervalo de 0,2 M hasta la saturación de la solución, preferiblemente puede estar en el intervalo de 0,2 a 2 M, o de 0,4 a 1,5 M, o de 0,4 a 1,2 M, o de 0,4 a 1,0 M, o de 0,4 a 0,8 M, o de 0,6 a 0,9 M, o de 10 0,6 a 0,8 M, o es aproximadamente 0,75 M

Puede añadirse histidina para elevar su concentración en la suspensión hasta al menos 0,01 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,3 M, más preferiblemente desde 0,02 hasta 0,3 M. En particular, la concentración de la misma en la suspensión está en el intervalo de 0,02 M hasta la saturación de la solución, preferiblemente puede estar en el intervalo de 0,02 a 0,3 M, o de 0,03 a 0,3 M, o de 0,05 a 0,3 M, o de 0,1 15 a 0,3 M, o de 0,2 a 0,3 M, o es aproximadamente 0,3 M.

Se añade la mezcla de péptidos y/o aminoácidos o la peptona para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos el 0,01% (p/p), preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde el 0,1 hasta el 20% (p/p)peptona. Para un procedimiento cíclico es particularmente preferido usar una concentración de peptona del 0,2 al 10% (p/p), preferiblemente una concentración de peptona de aproximadamente el 5% (p/p). Para 20 un procedimiento no cíclico (es decir, por lotes) se prefiere usar una concentración de peptona del 10% (p/p) o mayor, preferiblemente una concentración de peptona de aproximadamente el 20% (p/p).

En una realización preferida del procedimiento de las realizaciones (1) a (2) tal como se define anteriormente, se mezclan dos o más sustancias entre sí, se divide la concentración de cada una de las sustancias iónicas añadidas por la cantidad total de sustancias iónicas añadidas, para ejercer la misma capacidad de liberación 25 que si sólo se añade una sustancia.

Es particularmente preferido en el procedimiento tal como se define anteriormente que las sustancias iónicas que se mezclan entre sí se seleccionen de al menos 3 sustancias iónicas diferentes seleccionadas de; un aminoácido con grupo R cargado (tal como arginina, histidina o lisina) en una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,2 M; NaCl y KCl en una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 0,2 M y CaCl2 en una 30 concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,05 M.

La concentración de una mezcla de sustancias iónicas necesaria para alcanzar la liberación de proteínas deseada depende principalmente de dos factores, el número de sustancias iónicas y la concentración de cada sustancia iónica. Por tanto, si se mezclan más sustancias iónicas, se necesita menos concentración de cada para alcanzar la máxima liberación de producto. En principio, esto se puede calcular sobre una base matemática. Sin 35 embargo, en casos específicos, las sustancias iónicas pueden ejercer efectos combinatorios, lo que disminuye la necesidad de concentración de sustancias iónicas en comparación con una estimación teórica.

Si se usa una combinación de NaCl y lisina en la composición de liberación, se usan preferiblemente las concentraciones siguientes: NaCl al menos 0,1 M, preferiblemente a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 1 M, más preferiblemente desde 0,2 hasta 0,5 M, lo más preferiblemente aproximadamente 0,25 M; lisina al 40 menos 0,1 M, preferiblemente a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 1 M, más preferiblemente desde 0,2 hasta 0,5 M, lo más preferiblemente aproximadamente 0,4 M.

Si se usa una combinación de NaCl, histidina y CaCl2 en la composición de liberación, se usan preferiblemente las concentraciones siguientes: NaCl al menos 0,05 M, preferiblemente a una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,6 M, más preferiblemente desde 0,075 hasta 0,35 M, lo más preferiblemente 45 aproximadamente 0,1 M; histidina al menos 0,01 M, preferiblemente a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,3 M, más preferiblemente desde 0,025 hasta 0,15 M, lo más preferiblemente aproximadamente 0,05 M; y CaCl2 al menos 0,005 M, preferiblemente a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,25 M, más preferiblemente desde 0,025 hasta 0,15 M, lo más preferiblemente aproximadamente 0,05 M.

Se ha encontrado que mediante una combinación de sustancias iónicas sólo se requiere una concentración 50 baja de cada sustancia iónica y con ello se mantienen las propiedades de liberación de la proteína de la composición y se proporcionan condiciones de cultivo aceptables para las células. En una realización preferida adicional, la composición de liberación iónica se selecciona de modo que al menos un componente actúe como estabilizador para la proteína liberada que puede activarse antes y/o después de la separación de las proteínas y las células.

En una realización preferida adicional del procedimiento de las realizaciones (1) a (2) tal como se define 55 anteriormente, el cultivo de las células se efectúa en cultivo de suspensión.

Además, se prefiere que la separación del medio a partir de las células cultivadas en las etapas (b) y (d) se efectúe mediante centrifugación, filtración, diafiltración, filtración en línea o microfiltración. Un procedimiento del que debe ser consciente el experto en la técnica se puede utilizar para el aislamiento de la proteína de plasma del medio y para su purificación. En concreto, se puede efectuar usando al menos una técnica seleccionada de cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteína, intercambio de tampón, cromatografía de 5 intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, medios de cromatografía de intercambio iónico/hidrófoba de modo mixto, cromatografía de quelación, cromatografía de afinidad a carbohidratos como de afinidad a heparina o lectina, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, diálisis, diferentes agentes de precipitación tales como polietilenglicol, sulfato de amonio, etanol, adsorción de hidroxiapatita, adsorción de membrana de filtrado, etc. Para una persona experta en la técnica, es fácilmente evidente que el soporte (la parte a la que se fija el ligando 10 activo) dentro del campo de la cromatografía, puede comprender diferentes tipos de soportes como resinas, partículas, perlas, membranas, fibra hueca, etc., y que el soporte puede constar de diferentes materiales, como sílice, polisulfona, celulosa, agarosa reticulada, etc.

En una realización preferida del procedimiento de la invención, el aislamiento de la proteína comprende una etapa de captura, en la que el producto está unido y los medios de cultivo celular y la solución de lavado se arrastran 15 por lavado, preferiblemente la etapa de captura utiliza medios de cromatografía. Además, las etapas (d) y (e) de la realización (2) pueden efectuarse mezclando la suspensión celular con un medio cromatográfico que se une al producto y después se retiran los medios de cromatografía de la suspensión celular.

Además se prefiere que el procedimiento de acuerdo con la invención se realice en condiciones estériles, en particular de buenas prácticas de fabricación (GMP) ya que el producto resultante es un material bruto 20 farmacéutico. Por la misma razón, se prefiere que el medio y/o la proteína purificada se someta a una etapa de inactivación de virus.

De acuerdo con la invención, se efectúa el cultivo bajo condiciones libres de suero, lo que facilita el tratamiento del caldo de cultivo y la solución de la proteína de plasma. En algunos ejemplos, se prefiere cultivar bajo condiciones libres de proteína. Sin embargo, otras realizaciones, por ejemplo, un procedimiento en el que la 25 sustancia iónica es una mezcla de péptidos y/o aminoácidos (peptona), requieren la adición de proteínas funcionales tales como factores de crecimiento de insulina o similares a insulina, etc.

Finalmente, se prefiere que la suspensión celular se procese con un sistema de microfiltración en el que se ha elegido el poro en el filtro para retener las células y después se procesa la suspensión celular con la solución de liberación durante el procedimiento de diafiltración en el que se incrementa gradualmente la concentración de la 30 solución de liberación y se recupera el producto en el filtrado de dicho sistema de microfiltración.

En particular la invención se refiere a un procedimiento para incrementar la recuperación de producto durante la recogida del FVIII o de FVIII con dominio B eliminado que incluye lo definido anteriormente en el presente documento (a continuación en el presente documento referido brevemente como FVIII) a partir de células cultivadas. La recuperación del FVIII se puede incrementar de manera significativa con medidas relativamente sencillas. Debido 35 a la adición de sustancias iónicas al medio antes de la separación de las células del medio de cultivo, (elevando de este modo la concentración de estas sustancias iónicas sobre el nivel fisiológico hallado en células) se ha incrementado la recuperación del FVIII en el intervalo del 200-2000% (2-20 veces).

Parece que una explicación adecuada es que los grupos iónicos sobre la membrana celular retardan las moléculas de factor VIII. Si se incrementa la concentración de iones en el medio, que está en contacto con las 40 superficies celulares, los iones contrarrestan los iones sobre la superficie celular y se libera el factor VIII.

En una primera realización particularmente preferida de las realizaciones (1) a (2) de la invención, se incrementa el cloruro de sodio hasta NaCl 0,5 M antes de retirar las células de los medios de cultivo. Se mostró que con dicha composición de liberación, la recuperación del FVIII en los medios de cultivo libre de células se incrementó 20 veces en comparación con el uso de cloruro de sodio 0,1 M, mientras que la liberación de las proteínas de células 45 huésped sólo se incrementó ligeramente. El cloruro de sodio 0,5 M no es un entorno normal para las células (las condiciones de sal fisiológicas son comparables con aproximadamente cloruro de sodio 0,15 M), pero el tratamiento no destruyó las células. Sin embargo, si además se incrementa la concentración de sal hasta cloruro de sodio 1 M, se han destruido (lisis) más del 80% de las células y casi se ha duplicado la cantidad de proteínas de células huésped, mientras que la concentración del FVIII es aproximadamente la misma que si se usa la concentración de 50 sal más baja (0,5 M).

En una segunda realización particularmente preferida de la invención, se mezclan dos o más sustancias iónicas entre sí para lograr la liberación de producto. Por ejemplo, se mostró que si se mezcla cloruro de sodio 0,25 M con 0,25 M de lisina se ejerce las mismas propiedades de liberación de producto y viabilidad celular que con NaCl 0,5 M. En otro ejemplo se usa NaCl 0,17 M, lisina 0,17 M y sorbitol 0,3 M como composición de liberación. Esta 55 composición dio una liberación de producto ligeramente más baja en comparación con NaCl 0,5 M, pero ilustra la gran cantidad de posibilidades de elegir y combinar sustancias de liberación iónicas entre sí, logrando propiedades de liberación de producto similares. Como también se mostró, se pueden añadir diferentes estabilizadores (no

iónicos) a la composición de liberación, sin inhibir las propiedades de liberación.

En una tercera realización particularmente preferida, se incrementa el CaCl2 hasta un intervalo desde 0,05 hasta 0,2 M, preferiblemente 0,1M. Se mostró en ejemplos experimentales que el CaCl2 es superior en comparación con la mayoría de las otras sustancias iónicas, con respecto a la liberación de producto, de proteína de células huésped y de ADN. Además, la concentración necesaria para la liberación de producto óptima era significativamente 5 inferior en comparación con la mayoría de las otras sustancias iónicas y esto puede tener un ventaja considerable, ya que a menudo se usa una etapa de intercambio iónico como etapa de captura para el procesamiento adicional. Por tanto, una fuerza iónica más baja significa en muchos casos menor dilución antes de aplicar las proteínas a la etapa de captura. Para la misma recuperación de producto, se han logrado valores 1-2 veces más altos para la pureza con respecto a las proteínas de células huésped y aproximadamente valores 10 veces más bajos de ADN, en 10 comparación con la composición de NaCl correspondiente (0,55M). También se mostró que el uso de CaCl2 en algunos casos ejerce efectos estabilizadores sobre el producto. Esto se mostró como la actividad de producto mantenida durante los estudios de estabilidad a temperatura ambiente durante varios días y que la relación entre la actividad biológica del producto en comparación con el contenido de antígeno del FVIII del producto era próxima a uno. 15

En una cuarta realización particularmente preferida de la invención, las excelentes propiedades de liberación de CaCl2 se combinan con las de otras sustancias de liberación. Por ejemplo, una composición de liberación que comprende CaCl2 0,05 M , histidina 0,05 M y NaCl 0,1 M mostró propiedades de liberación similares en comparación con CaCl2 0,1 M solo. Esto además destaca las posibilidades dentro de la invención de que se pueda elegir una composición deliberación óptima, dependiendo de las características de la célula y del producto. 20

La cantidad del tipo de impurezas obtenidas durante el procedimiento de recogida puede ser de importancia para el procesamiento y la purificación adicionales del producto. Por ejemplo, si se incrementa la cantidad de proteasas, puede contribuir a la degradación del producto y puede que sea necesario añadir etapas de purificación adicionales para lograr la demanda muy alta de pureza para los productos producidos de manera recombinante. Durante los experimentos, se ha mostrado que la cantidad de proteínas de ADN y de células huésped liberadas 25 también de pende de la sustancia iónica elegida.

Con el procedimiento de la invención es posible lograr la recuperación alta de la proteína, en particular la recuperación alta del FVIII sin destruir las células y limitando por tanto la cantidad de impurezas que surgen junto con el producto. Actualmente, se han logrado los mejores resultados con cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lisina y una combinación de cloruro de sodio y lisina, una combinación de cloruro de calcio e histidina y 30 una combinación de cloruro de calcio, cloruro de sodio e histidina. Especialmente, el uso de cloruro de calcio ha mostrado resultados interesantes, ya que la concentración necesaria para la liberación del FVIII es mucho más baja (aproximadamente 0,1 M) que la de las otras sustancias (aproximadamente 0,5-0,8 M). Esto puede ser útil, ya que se ha mostrado que usando cloruro de calcio se libera una cantidad más baja de ADN y de proteínas de células huésped. Otra realización importante de la invención es la posibilidad de reutilizar las células para la producción 35 adicional de proteínas, después de que se use el procedimiento de liberación de proteínas. Se retira el entorno salino y se disuelven las células en medios de cultivo ordinarios y se puede continuar con el procedimiento.

Se dan los ejemplos siguientes para ilustrar la invención. Los ejemplos que no cubre el alcance de las reivindicaciones se mantienen con fines ilustrativos.

Ejemplos 40

Materiales y Procedimientos

Factor VIII: C, procedimiento de detección selectiva basado en Coatest: El procedimiento se basa en el principio de dos fases y se realizó usando la técnica en microplaca. En la fase uno, se genera el factor activado X (Xa) por medio de la ruta intrínseca en la que el factor VIII: C actúa como un co-factor. En la fase dos, se determina entonces el factor Xa mediante el uso de un sustrato cromogénico sintético, S-2222, en presencia de un inhibidor de 45 trombina I-2581 para prevenir la hidrólisis del sustrato por trombina. Se para la reacción con ácido y se determina fotométricamente el VIII:C, que es proporcional a la liberación de pNA (para-nitroanilina), a 405 nm frente a un blanco de reactivo. El procedimiento cumple con los requerimientos de la Farmacopea Europea. La unidad del factor VIII: C se expresa en unidades internacionales (UI) tal como se define en la actual Norma internacional sobre concentrado (International Concentrate Standard, IS) establecida por la Organización mundial de la salud (OMS). Se 50 ha validado la rutina que usa tampón que contiene BSA al 1% en lugar de plasma hemofílico severo para diluciones previas. Véase también las referencias de la bibliografía (1-4) adjuntas bajo las referencias.

Proteína total (determinación de proteína mediante HPLC de fase inversa): Se usa un sistema de HPLC, equipado con un detector UV y una columna NPR-octadecilo TSK-gel (partículas no porosas de 2,5 mm, I.D. 35 x 4,6 mm, de Tosohaas, Stuttgart, Alemania) para la determinación de proteína. Se equilibra la columna, que funciona 55 a 45ºC, con acetonitrilo al 5% en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (fase móvil A). Para la elución, se usa acetonitrilo al 90% en TFA al 0,1% (fase móvil B) en el gradiente lineal (0-0,5 min B al 0%, 0,5-4 min B al 0-100%,

4-5 min B al 100%, 5-7 min B al 0%). El volumen de inyección es de 200 ml y el caudal es de 1,5 ml/min. se lleva a cabo la detección midiendo la absorbancia UV a 280 nm. Se usa albúmina de suero bovino (BSA) 10-100 mg/ml (10-20-50-100 mg/ml, n=4) para la curva estándar. Se diluye la BSA estándar en acetato de amonio 200 mM y Tween® 80 al 0,01%, y también se diluyen las muestras, si es necesario, en esta solución. Se calcula la concentración de proteína en las muestras desconocidas a partir de la curva estándar de BSA, que siempre da un 5 coeficiente de correlación lineal (r) de >0,99.

Pureza (FVIII:C/proteína total): Se calcula la pureza para una muestra tomando el valor que se logra a partir del análisis de FVIII: C y dividiéndolo por el valor que se logra a partir del análisis de proteína total.

Análisis del antígeno del Factor VIII FVIII:Ag): Se reviste una placa de microvaloración con un anticuerpo monoclonal específico para un tipo de determinante antigénico de la cadena ligera de la proteína factor VIII en la 10 muestra. Después de la incubación con muestras se añade un anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa. Este anticuerpo se une a otro determinante antigénico de la cadena ligera de la proteína factor VIII, formando así un complejo de sándwich. Entonces se determina la actividad de la enzima, que es proporcional al contenido del factor VIII:Ag en la muestra, durante la acción del sustrato de 3,3’,5,5’-Tetrametilbencidina. Se para la reacción con ácido y se lee fotométricamente el color a 450 nm frente a blanco de reactivo. 15

Actividad específica (cociente FVIII:C/FVIII:Ag): Se calcula la actividad específica de una muestra de FVIII tomando el valor que se logra a partir del análisis FVIII:C y se divide por el valor que se logra a partir del análisis de FVIII:Ag. El valor resultante muestra la relación entre la proteína FVIII biológicamente activa y la proteína FVIII total (que incluye tanto la forma activa como la inactiva). Para una proteína totalmente activa el cociente, FVIII :c/FVIII:Ag, es 1. 20

Viabilidad (células vivas/células muertas+células vivas, %): Se diluye la suspensión celular con una solución de tinción de azul trypan al 0,4% y a continuación se cuentan las células en un microscopio de contraste de fase inversa, haciendo así posible determinar la concentración celular. Debido a la apariencia de las células, también es posible hacer una distinción entre células vivas y muertas. Se calcula la viabilidad dividiendo la cantidad de células vivas con la cantidad total de células y multiplicando los resultados por 100 para obtener el valor en porcentaje de 25 viabilidad. El procedimiento de viabilidad se describe además en R.I. Freshney, Culture of animal cells, 4ª ed., p. 183-189, Wiley-Liss (2000).

Procedimiento 1 transferencia de Western, distribución de masa molecular de FVIII: Se separan las proteínas y los péptidos en las preparaciones del factor VIII de acuerdo con la masa molecular mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato de sodio (SDS) bajo condiciones de reducción. A 30 continuación, se transfieren electroforéticamente las proteínas desde la matriz de gel hasta una membrana de nitrocelulosa, que se incuba posteriormente con un agente de bloqueo. Entonces se añaden anticuerpos policlonales de oveja dirigidos a la molécula de factor VIII completa seguido de un anticuerpo secundario, que es específico para la parte Fc de los anticuerpos de cabra/oveja. Como una tercera etapa, se añaden complejos solubles de anticuerpo de cabra a peroxidasa de rábano (HRP) y HRP. Entonces se detectan los polipéptidos de FVIII mediante la aparición 35 de bandas azules después de la incubación con el sustrato 4-cloro-1-naftol.

Procedimiento 2 transferencia de Western, sensibilidad 0,5 UI/ml: Se separan las proteínas y los péptidos en las preparaciones del factor VIII de acuerdo con la masa molecular mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato de sodio (SDS) bajo condiciones de reducción. A continuación, se transfieren electroforéticamente las proteínas desde la matriz de gel hasta una membrana de nitrocelulosa, que se 40 incuba posteriormente con un agente de bloqueo. Entonces, se añade el anticuerpo policlonal de oveja dirigido a la molécula de factor VIII completa seguido de un anticuerpo secundario, que está conjugado con peroxidasa de rábano y reacciona con las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas de oveja. Se detectan los polipéptidos de FVIII después de la incubación con sustrato quimioluminiscente luminol mediante exposición a una película de rayos X sensible. 45

Actividad de proteasa: Se determinó la actividad de proteasa mediante un procedimiento basado en FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) de un conjugado de fluoresceína-caseína. La hidrólisis de caseína mediante proteasas libera pequeños fragmentos de péptido marcados con fluoresceína y se observa un incremento en la fluorescencia. Para una estimación cuantitativa de la actividad de proteasa, se usó tripsina para construir una curva estándar. Se incubaron la muestra y el sustrato sobre una microplaca y se detectó la 50 fluorescencia resultante con el uso de un fluorímetro con longitudes de onda de excitación/emisión de 485/538 nm. El límite de cuantificación de la actividad de proteasa corresponde a la actividad proteolítica de 500 pg de tripsina/ml si se usa un tiempo de incubación de 24 horas.

Análisis de ADN: Se determina el ADN total usando el ensayo de ADN Total umbral, que es un ensayo unido a enzima para el ADN monocatenario. En la primera etapa, la muestra se desnaturaliza con calor para 55 convertir todo el ADN a la forma monocatenaria. Entonces, se incuban las muestras con un reactivo de marcado de ADN, que contiene conjugados de dos proteínas de unión que tienen alta afinidad por ADN independiente de la secuencia de bases. Un conjugado es un anticuerpo monoclonal anti-ADN acoplado a ureasa. El otro conjugado es

una proteína de unión a ADN monocatenario acoplado a biotina. Después de la incubación, se transfiere el complejo de ADN marcado a una unidad de filtración en la estación de trabajo, en la que se captura bajo control a vacío sobre una barra que porta una membrana de nitrocelulosa biotinilada. Un exceso de estreptavidina en el agente de marcado de ADN se une específicamente a biotina en el complejo de ADN, y también a biotina unida a la membrana de nitrocelulosa de la barra. Un lavado subsiguiente retira cualquier enzima retenida de manera no específica de la 5 membrana y entonces, se coloca en un lector, en el que se pone en contacto con la superficie del sensor en un volumen muy pequeño de fluido que contiene la urea sustrato de enzima. La reacción de enzima cambia el pH en cada sitio de medida, lo que cambia el potencial de superficie del sensor. La tasa de cambio en el potencial de superficie es proporcional a la cantidad de ADN en cada sitio. Se monitoriza cinéticamente el potencial de superficie y entonces se cuantifican las muestras frente a una curva estándar. 10

El producto: El producto producido en el cultivo celular es una forma recombinante del FVIII que se ha modificado mediante ingeniería genética para contener los sitios activos del FVIII natural y para excluir el dominio B prescindible para la actividad del FVIII. Es un polipéptido de FVIII de 170 KDa de longitud completa del que la porción principal se procesa para dar un polipéptido de cadena pesada (HCh, 90 KDa) y de cadena ligera (LCh, 80 KDa). La deleción del dominio B reduce la complejidad estructural mientras que retiene la actividad biológica similar 15 al FVIII derivado del plasma. La secuencia de aminoácidos de la muteína de FVIII aislada en los ejemplos siguientes se da en las SEC ID N.º: 4 y 6.

Ejemplo 1: Producción de línea celular de expresión.

Línea celular: La línea celular de expresión se basa en la línea celular de HEK 293T (o brevemente 293T). Esta línea celular se generó originalmente mediante transformación de células de riñón fetal humana con ADN de 20 adenovirus de tipo 5 cizallado (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1), 59-74 (1974)). Se insertó en la línea celular resultante HEK 293 (brevemente 293) el gen sensible a la temperatura para el antígeno T de SV40. Características de la línea celular de expresión: Nombre: HEK 293T de tsA201; Fuente: Colección europea de cultivos celulares, ECACC (
http://www.ecacc.org.uk/ ) línea celular nº 9612 1229, tsA 201 (redepositado de acuerdo con el Tratado de Budapest por los Laboratorios Octagene Biomedical GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried, Alemania con el 25 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschenroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Alemania, el 3 de febrero de 2001, con el nº de depósito DSM ACC 2494; permiso para acceder a este depósito concedido por los Laboratorios Octagene Biomedical GmbH, el 17 de marzo de 2005); Especie: Humana; Tejido: Riñón fetal; Morfología: Similar a epitelial; Cariotipo: El cariotipo de células 293T (ECACC nº 96121229) no se especifica; sin embargo, se conoce el cariotipo de células 293 (ECACC nº 85120602) y se describe 30 como 2n = 46, hipotriploide, nº de cromosoma modelo: 64.

Plásmidos de expresión: Como plásmidos de expresión se usaron vectores de la familia pTGF8 tal como se puede ver en la figura 4. Los vectores pTGF8-3 y pTGF8-2hyg-s contienen el casete de expresión para el factor VIII de coagulación humano con dominio B eliminado con el péptido enlazador de SEC ID Nº:9 (SEC ID Nº:4 y 6, respectivamente). pTGF8-2hyg-s tiene además tres intercambios de residuos de aminoácidos en las posiciones 162, 35 2011 y 2223 (en relación con la secuencia de longitud completa mostrada en la SEC ID Nº:2). Los vectores contienen además un casete para la resistencia a higromicina (que codifica la higromicina-B-fosfotransferasa) y un casete para la resistencia a ampicilina (que codifica la p-lactamasa). Además, está contenido un elemento de respuesta a progesterona (PRE). Se controla la expresión del BDDrFVIII mediante un promotor de CMV. Este promotor junto con el intrón SV40 y el sitio de poli-adenilación proporciona una producción de proteína recombinante 40 de alto nivel. La resistencia frente a dos antibióticos proporciona una herramienta eficaz para la selección de clones después de la transfección.

Transfección: Inmediatamente a continuación de la revitalización de la reserva de ECACC, se transfectaron células 293T adherentes con pTGF8-3 o pTGF8-2hyg-s usando el procedimiento de fosfato de calcio (C. Chen et al., Mol. Cell Biol. 7(8), 2745-2752 (1987)). Se comenzó la selección con higromicina (200 ng/ml) 72 horas después de la 45 transfección. Después de 10 días bajo selección, se aislaron clones resistentes a higromicina individuales, se expandieron y se subclonaron dos ciclos consecutivos de clonación de células únicas. Se cuantificó la producción de FVIII recombinante en el sobrenadante de clones resistentes a higromicina usando ELISA y ensayos aPTT. Este procedimiento llevó a la selección de los clones nº. 293T 48/9 H5 y 293T 12/24E4.

Adaptación al medio de cultivo libre de suero: Se adaptaron los clones nº. 293T 48/9H5 y 293T 12/24E4 al 50 crecimiento en medio libre de suero durante un periodo de 6 semanas dando como resultado células de crecimiento en suspensión no adherentes. Después del procedimiento de adaptación. Se expandieron las células usando matraces de agitación. A partir de estas células, se estableció un, a pre-MCB congelándolas en medio de criopreservación libre de suero que contenía DMSO al 7,5%. Se almacenaron los crioviales, conteniendo cada uno 1-107 células, en nitrógeno líquido. Se llevó a cabo una prueba conforme a GMP de este pre-MCB que implicaba 55 ensayos de virus in vitro, prueba de micoplasma y de esterilidad.

Cultivo: Se realizó un cultivo estático de las células en matraces TC de diferente tamaño. Se usaron botellas y bioreactores desechables de hasta 10 l para el cultivo dinámico. Con la finalidad de agitación, se

colocaron las botellas sobre un agitador horizontal situado dentro del incubador. Se fijaron todos los incubadores a dióxido de carbono al 5%, 37ºC y humedad relativa del 95%.

Suspensión celular: (A continuación en el presente documento referido brevemente como "SC".) Tal como puede verse en los ejemplos siguientes, la suspensión celular usada para diferentes experimentos emplea diferentes cantidades de FVIII y de proteínas de células huésped. Esto refleja que el material inicial se extrajo a diferentes 5 tiempos en el ciclo de producción (véase la figura 1) y por tanto, alguna SC ha mostrado condiciones de producción más óptimas de otras.

Ejemplo 2: Liberación del FVIII usando diferentes concentraciones de NaCl y lisina como sustancias de liberación.

Se añadieron 5 ml de SC1 (1,6 x 106 células/ml, clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 ml de una solución de liberación. Las células se habían cultivado tal como se describe en el ejemplo 1 y se extrajeron antes de la 10 recogida (véase la figura 1). Se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces, se centrifugaron los tubos a 1200xg durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar FVIII:C, etc. Para una descripción esquemática general del experimento, véase también la figura 2. La composición de liberación añadida y los resultados correspondientes se muestran en las tablas 1 y 2, respectivamente. 15

Tabla 1

Componente de liberación

Sustancias tampón

Referencia (SC1)

Sin adición

NaCl 0,10 M

MES 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween® 80 al 0,01%, pH 6,5

NaCl 0,50 M

Histidina 20 mM, pH 6,0

NaCl 1,0 M

Histidina 20 mM, pH 6,0

NaCl 2,0 M

Histidina 20 mM, pH 6,0

Lisina 1,0 M

NaCl 0,10 M, MES 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween® 80 al 0,01%, pH 7,5

Tabla 2

Conc. de liberación*

FVIII:C, (UI/ml) Recuperación (%) FVIII:Cx 10-6/célula (UI) Proteasas** (u.a.)

Referencia

1,7 100 1,2 <1

NaCl 0,10 M

7,0 412 4,6 <1

NaCl 0,30 M

8,0 470 5,4 14

NaCl 0,55 M

33,2 1953 22,2 19

NaCl 1,0 M

36,4 2141 24,2 19

Lisina 0,50 M

31,8 1871 21,2 <1

* La concentración de liberación final es la mitad de la solución de liberación añadida debido a la mezcla con la SC. La conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Definición de actividad de proteasa: 1 unidad arbitraria (u.a.) de actividad de proteasa se define como la actividad correspondiente a la actividad de 1mg de tripsina/l.

Conclusión El incremento de la concentración de cloruro de sodio o lisina antes de la recogida incrementa significativamente el FVIII recuperado.

Ejemplo 3

Se añadieron 5 ml de SC2 (2,84 x 106 células/ml, clon de HEK 293T 12/24E4, vector pTGF8-2hyg-s)) a 5 ml de una solución de liberación. Las células se habían cultivado Las células tal como se describe en el ejemplo 1 y se extrajeron antes de la recogida (véase la figura 1). Se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de agitación) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces se centrifugaron los tubos a 5 1200xg durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular (FVIII:C, FVIII:Ag, viabilidad celular y proteína total). Para una descripción esquemática del experimento, véase también la figura 2. Los ejemplos 3A-3C son experimentos realizados con la misma suspensión celular en experimentos paralelos y por tanto se pueden comparar directamente entre sí.

Ejemplo 3A: Liberación con diferente concentración de cloruro de sodio. 10

Se prepararon diferentes concentraciones de NaCl y se añadieron a SC2 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar en qué intervalo de la concentración de cloruro de sodio se produce la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 3.

Tabla 3

Conc. de liberación*

FVIII: C, (UI/ml) ** FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) Viabilidad celular (%) Pureza FVIII (UI/mg prot.): relación FVIII:C/ FVIII:ag

Ref.(SC2)

0,50 100 0,36 36 3,4 0,57

NaCl 0,10 M

1,42 248 0,90 40 4,6 NA

NaCl 0,15 M

1,28 256 0,94 44 5,2 NA

NaCl 0,25 M

2,00 400 1,46 50 7,7 NA

NaCl 0,45 M

3,56 712 5,20 48 26,6 NA

NaCl 0,55 M

4,16 832 6,08 36 28,1 0,62

NaCl 1,0 M

4,28 856 6,28 8 17,8 0,50

NaCl 2,0 M

4,42 884 6,46 3 15,7 0,60

* La concentración de lavado final y la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Concentración de FVIII:C compensada por los factores de dilución. NA: no analizado.

Conclusión: El incremento de la concentración de cloruro de sodio incrementa el FVIII:C y se alcanza una 15 meseta a NaCl 0,55 M. La liberación de FVIII se logra a un nivel más bajo mediante un efecto de dilución (SC en comparación con NaCl 0,1 M NaCl en la tabla 3). Se destruye la membrana celular si se aumenta demasiado la concentración de cloruro de sodio (1,05 M y 2,00 M), mientras que la viabilidad celular parece que está aproximadamente inalterada en el intervalo de NaCl 0,1-0,55 M. La pureza de FVIII liberado alcanza un máximo en las muestras de NaCl 0,45 y 0,55 M, mientras que disminuye a las concentraciones de sal más altas debido a la 20 liberación de proteínas de células huésped intracelulares provocada por la destrucción de la membrana y/o a la liberación de proteínas localizadas sobre la membrana/los fragmentos de membrana. Por tanto, una elección óptima de las condiciones es usar la concentración más alta de cloruro de sodio, lo que no destruye la membrana celular. El cociente FVIII:C/FVIII:ag indica una actividad biológica inalterada de las moléculas de FVIII liberadas. Los resultados indican que la parte principal de FVIII que se libera durante el incremento de la concentración de cloruro de sodio, se 25 localiza principalmente fuera de la célula, unida a través de interacciones iónicas sobre la superficie celular. Esto se basa en el hecho de que la recuperación de FVIII no se incrementa significativamente si se rompe la membrana celular.

Ejemplo 3B: Estudio de diferentes pH dentro de diferentes concentraciones de NaCl.

Se ajustó el pH en el intervalo de 6,0-7,5 (intervalo de pH en el que se sabe que FVIII es estable), tanto en 30 la SC2 (NaCl 0,1 M) como en la SC2 diluida con la sustancia de lavado (concentración final NaCl 0,55 M), para estudiar cómo afectan diferentes pH a la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 4.

Tabla 4

Concentración de liberación*

pH FVIII:C (UI/ml)** FVIII:C (%)

SC2 (NaCl 0,10 M)

6,0 0,46 92

SC2 (NaCl 0,10 M)

6,5 0,50 100

SC2 (NaCl 0,10 M)

7,2 0,50 100

SC2 (NaCl 0,10 M)

7,5 0,53 106

NaCl 0,55 M

6,0 4,10 820

NaCl 0,55 M

6,5 4,34 868

NaCl 0,55 M

7,0 4,30 860

NaCl 0,55 M

7,5 3,56 712

La conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M ** Concentración de FVIII:C compensada por el factor de dilución.

Conclusión: El pH to tiene efecto significativo en la liberación de FVIII dentro del intervalo de pH sometido a prueba (que se seleccionó debido a la estabilidad de pH de la molécula de FVIII). La diferencia principal en la recuperación de FVIII entre las concentraciones de liberación alta (NaCl 0,55 M) y baja (NaCl 0,1 M) es independiente de pH. Se discute la estabilidad de pH de FVIII (pH 6-7) en la pág. 10 de Wang et al., International 5 Journal of Pharmaceutics 259, 1-15 (2003).

Ejemplo 3C: Diferente concentración de lisina como componente de liberación.

Se prepararon diferentes concentraciones de lisina y se añadieron a SC2 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar en qué intervalo de la concentración de lisina se produce la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 5. 10

Tabla 5

Conc. de liberación*

FVIII:C (UI/ml)** FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) Viabilidad celular (%) Pureza FVIII (UI/mg prot.) relación FVIII:C/ FVIII:ag

Ref.(SC2)

0,50 100 0,36 36 3,4 0,57

Lisina 0,15 M

0,82 164 0,58 33 5,9 0,53

Lisina 0,30 M

1,37 274 0,96 40 9,4 0,39

Lisina 0,5 M

2,88 576 2,03 19 16,7 0,42

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Concentración de FVIII:C compensada por el factor de dilución.

Conclusión: Lisina, un aminoácido cargado, libera el FVIII. Sin embargo, parece que el cloruro de sodio (ejemplo 3A) es un liberador más eficaz y suave de FVIII, si se compara con concentraciones similares. Parece que se dañan más las células por lisina que por cloruro de sodio, tal como se puede observar al comparar la viabilidad, la pureza y el cociente FVIII:C/ FVIII:ag. 15

Ejemplo 4: Estudio de diferentes sustancias de liberación y cinética.

Se añadieron 5 ml de SC3 (1,6 x 106 células/ml, clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 ml de una solución de liberación. Las células se habían cultivado tal como se describe en el ejemplo 1 y se extrajeron durante la fase de crecimiento (C en la figura 1). Se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces, se centrifugaron los tubos a 1200xg 5 durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar FVIII:C, etc. Para una descripción esquemática general del experimento, véase también la figura 2. los ejemplos 4A-4E son experimentos realizados con la misma SC en experimentos paralelos y por tanto se pueden comparar entre sí.

Ejemplo 4A: Estudio del tiempo necesario para la liberación de FVIII usando NaCl 0,55 M.

Se preparó una solución de liberación de cloruro de sodio 0,10 M y de cloruro de sodio 1,0 M y se añadió a 10 SC3 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se extrajeron las muestras después de 0, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos para estudiar lo rápido que se liberó FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 6.

Tabla 6

Concentración de liberación*

Tiempo (minutos) FVIII:C,** (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI)

NaCl 0,10 M

60 0,12 100 0,08

NaCl 0,55 M

0 1,26 1050 0,79

NaCl 0,55 M

5 1,30 1083 0,81

NaCl 0,55 M

10 1,36 1133 0,85

NaCl 0,55 M

20 1,26 1050 0,79

NaCl 0,55 M

40 1,34 1117 0,84

NaCl 0,55 M

60 1,26 1050 0,79

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Concentración de FVIII:C compensada por los factores de dilución.

Conclusión: El incremento de concentración de sal libera las moléculas de FVIII instantáneamente. El tiempo de incubación no tiene efecto sobre la recuperación. Este es un hallazgo importante que amplía el posible 15 uso de la invención haciendo posible el uso de diferentes técnicas (filtración en línea, filtración tangencial, centrifugación, etc.) para separar la molécula de FVIII de la célula usando el procedimiento de liberación. Una aproximación muy interesante sería la de añadir (durante un lote de perfusión (perfusión normalmente significa una suspensión celular recogida lentamente de manera continua, en la que las células se pueden usar durante meses para producir el producto)) el tampón de liberación con un incremento de la concentración iónica, retirar el tampón 20 liberado y a continuación añadir el tampón de cultivo y continuar usando las células para producir FVIII. Debido a este procedimiento, la productividad de las células se puede incrementar significativamente, en comparación con el procedimiento normal en el que o bien se descartan las células (se destruyen) después de la recogida (lleva 1-2 semanas cultivar células nuevas hasta la concentración celular deseada) o bien se usa la recogida de perfusión normal lenta con bajo contenido iónico y la recuperación más baja. 25

Ejemplo 4B: Estudio de la composición de liberación usando diferentes concentraciones de NaCl.

Se prepararon diferentes concentraciones de NaCl y se añadieron a SC3 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar en qué intervalo de la concentración de cloruro de sodio se produce la liberación de FVIII. Se resumen los resultados en la tabla 7 (véase también el ejemplo 3A para un estudio de NaCl similar con otra SC y los análisis adicionales realizados). 30

Tabla 7

Concentración de liberación*

FVIII:C** (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) viabilidad (%)

NaCl 0,10 M

0,12 100 0,08 89

NaCl 0,30 M

0,76 633 0,48 92

NaCl 0,40 M

1,03 858 0,64 93

NaCl 0,50 M

0,98 817 0,61 90

NaCl 0,55 M

1,26 1050 0,79 NA

NaCl 0,60 M

1,10 917 0,69 88

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Concentración de FVIII:C compensada por los factores de dilución. NA: no analizado.

Conclusión: La liberación de FVIII comienza aproximadamente a NaCl 0,30 M y alcanza un pico aproximadamente a NaCl 0,55 M. No existe una diferencia significativa en la viabilidad celular, dentro de la concentración de NaCl sometida a prueba. 5

Ejemplo 4C: Estudio de lisina como sustancia de liberación en comparación con NaCl.

Se prepararon concentraciones de lisina (se ajustó el pH hasta 7,0) y se añadieron a SC3 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar a qué nivel se produce la liberación máxima de FVIII en comparación con cloruro de sodio como sustancia de liberación. Los resultados están resumidos en la tabla 8.

Tabla 8

Concentración de lavado*

FVIII:C,** (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI)

NaCl 0,10 M

0,12 100 0,08

NaCl 0,55 M

1,26 1050 0,79

Lisina 0,50 M

1,08 900 0,68

Lisina 0,75 M

1,24 1033 0,78

Lisina 1,0 M

1,22 1017 0,76

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Concentración de FVIII:C compensada por los factores de dilución.

10

Conclusión: Se puede usar lisina como sustancia de liberación con el mismo grado de liberación de FVIII total en comparación con cloruro de sodio. Parece que el cloruro sódico es un poco más eficaz para liberar FVIII con respecto a la concentración (M) necesaria para lograr la misma recuperación.

Ejemplo 4D: Estudio de diferentes tipos de composiciones de liberación de potencial.

Se prepararon diferentes tampones (se ajustó el pH hasta 7,0 si era aplicable) y se añadieron a SC3 de 15 acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar si se producía la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 9.

Tabla 9

Concentración de tampón*

FVIII:C,** (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) viabilidad (%)

NaCl 0,10 M

0,12 100 0,08 NA

NaCl 0,55 M

1,26 1050 0,79 NA

Lisina 0,50 M

1,08 900 0,68 NA

Arginina 0,50 M

0,48 400 0,30 NA

Histidina 0,25 M

0,54 450 0,34 NA

Glicina 0,50 M

<0,1 <90 <0,08 NA

KCl 0,50 M

1,64 1367 1,02 NA

Acetato de amonio 0,50 M

0,92 767 0,58 NA

MgCl2 0,50 M

1,30 1083 0,81 NA

Sorbitol 0,50 M

<0,1 <90 <0,08 90

Triton® X-100 al 1%

0,86 716 0,54 0

* La conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Concentración de FVIII:C compensada por los factores de dilución. NA: no analizado.

Conclusión: Como ya se ha mostrado en ejemplos previos, se pueden usar cloruro de sodio y lisina como sustancias de liberación aproximadamente con el mismo grado de liberación de FVIII. Tal como se muestra en este ejemplo muchas sustancias cargadas pueden lograr efectos similares, pero no todas al mismo nivel. Al comparar entre sí algunos aminoácidos cargados, la lisina era un agente de liberación más eficaz de FVIII en comparación con 5 arginina y histidina (sin embargo debido a la baja solubilidad de la concentración de histidina sólo se pudo elevar hasta 0,25 M). Una observación muy interesante era que un aminoácido con un grupo R no cargado (glicina) y un azúcar (sorbitol) no liberó nada de FVIII. Esto da una indicación clara de que la fuerza principal que retiene las moléculas de FVIII es de origen iónico. El detergente, Triton® x-100 al 1%, que en la técnica anterior se sabe que rompe la membrana celular y libera todas las proteínas que están dentro de las células, se incluyó en el experimento 10 para estudiar hasta qué grado estaba atrapado el FVIII dentro de la célula. Al estudiar las células antes y después del tratamiento con detergente, no se pudieron ver células ni trazas de células después del tratamiento con detergente, por tanto se había disuelto todo el material celular. La concentración de FVIII en la muestra, que se había tratado con detergente, era en principio la misma que para los valores de 0,50 M más altos (con la parte principal de las células intacta después del tratamiento). Esto indica que al usar el procedimiento de liberación, la 15 parte principal del FVIII liberado se origina a partir de la unión a las superficies de las células fuera de la célula, esta teoría también se refuerza mediante la liberación instantánea del FVIII al usar el procedimiento de lavado (ejemplo 4A).

Ejemplo 4E: Estudio de la combinación de sustancias de liberación

Se prepararon diferentes tampones en los que se mezclaron diferentes sustancias de liberación (se ajustó el pH a 20 7,0 si era aplicable) y se añadieron a SC3 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar si se cambiaba la recuperación de FVIII en comparación con el uso de sólo una sustancia de liberación. Los resultados están resumidos en la tabla 10.

Tabla 10

Concentración de liberación*

FVIII:C,** (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) Viabilidad (%)

NaCl 0,10 M

0,12 100 0,08 89

NaCl 0,30 M

0,76 633 0,48 92

NaCl 0,60 M

1,26 1050 0,79 88

Lisina 0,50 M

1,08 900 0,68 NA

Triton® -100 al 1%

0,86 716 0,54 0

NaCl 0,60 M +Triton® 1%

0,92 766 0,57 0

NaCl 0,25 M + lisina 0, 25 M

1,12 933 0,70 NA

NaCl 0,17 M + lisina 0,17 M + sorbitol 0,33 M

0,94 783 0,59 NA

* La conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** Concentración de FVIII:C compensada por los factores de dilución. NA: no analizado.

Conclusión: Se pueden combinar diferentes sustancias de liberación para liberar la molécula de FVIII.

Ejemplo 5: Estudio de diferentes sustancias cargadas como agente de liberación.

Se añadieron 5 ml de SC4(6,37 x 106 células/ml, clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 ml de 5 una solución de liberación. Las células se habían cultivado tal como se describe en el ejemplo 1 y se extrajeron antes de la recogida (véase la figura 1). Se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml.

Entonces, se centrifugaron los tubos a 1200xg durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar FVIII:C, etc. Para una descripción esquemática general del 10 experimento, véase también la figura 2. Los ejemplos 5A-5D son experimentos realizados con la misma SC en experimentos paralelos y por tanto se pueden comparar entre sí.

Ejemplo 5A: Estudio de diferentes concentraciones de KCl como composición de liberación y comparación con NaCl

Se prepararon diferentes concentraciones de KCl y se añadieron a SC4 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar en qué intervalo de la concentración de cloruro de sodio se produce la 15 liberación de FVIII y para compararlo con NaCl. Los resultados están resumidos en la tabla 11.

Tabla 11

Conc. de liberación*

FVIII: C, (UI/ml) ** FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) Viabilidad celular (%) Pureza FVIII, UI/mg prot. Proteasas** (a.u)

KCl 0,10 M

0,26 100 0,08 87 NA 82

KCl 0,15 M

0,64 260 0,20 85 NA NA

KCl 0,20 M

1,21 480 0,38 86 NA NA

KCl 0,25 M

2,30 920 0,72 82 NA NA

KCl 0,38 M

4,47 1790 1,40 64 NA NA

KCl 0,50 M

4,42 1770 1,39 70 0,32 60

KCl 1,0 M

5,08 2030 1,60 30 0,13 92

NaCl 0,10 M

0,25 96 0,08 85 0,03 82

NaCl 0,55 M

4,96 1980 1,56 80 0,35 73

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. NA: no analizado. ** Definición de actividad de proteasa: 1 unidad arbitraria de actividad de proteasa se define como la actividad correspondiente a la actividad de 1 ug de tripsina/l. NA: no analizado correspondiente a la actividad de 1 µg de tripsina/l.

Conclusión: La capacidad de liberar FVIII a diferentes concentraciones de KCl es comparable con NaCl. Además, la viabilidad celular, la pureza y la liberación de proteasa son casi las mismas en comparación con las de NaCl. Sin embargo, existe una pequeña tendencia de que NaCl pueda ser más moderado frente a las células al comparar la viabilidad celular y la pureza en concentraciones similares. Una disminución de la pureza es indicativo 5 de daño celular tal como se puede observar para la solución de lavado de KCl 1 M, en la que la pureza ha disminuido significativamente, lo que indica en combinación con la disminución de la viabilidad celular, que se han liberado las proteínas de células huésped debido a la lisis de la membrana celular.

Ejemplo 5B: Estudio de diferentes composiciones de liberación cargadas.

Se prepararon diferentes composiciones de liberación (se ajustó el pH a 7,0 si era aplicable) y se añadieron 10 a SC4 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar si se producía la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 12.

Tabla 12

Conc. de liberación*

FVIII:C, (UI/ml) FVIII: C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) Viabilidad celular (%) Pureza FVIII, UI/mg prot. Proteasas*** (a.u)

NaCl 0,10 M

0,25 100 0,08 85 0,03 82

NaCl 0,55 M

4,96 1980 1,56 80 0,35 73

KCl 0,50 M

4,42 1768 1,39 70 0,32 60

Na2SO4 0,50 M

3,21 1284 1,01 34 NA 109

KH2PO4 0,50 M

3,62 1448 1,14 44 NA 94

CaCl2 0,25 M

5,34 2136 1,68 78** 0,53 NA

MgCl2 0,50 M

2,26 904 0,71 16** NA NA

Lisina 0,75 M

6,10 2440 1,92 75 0,20 113

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. **Dificultades dentro del análisis ya que durante la medida se precipitó la sustancia de lavado al añadir la sustancia química analítica. *** Definición de actividad de proteasa: 1 unidad arbitraria de actividad de proteasa se define como la actividad correspondiente a la actividad de 1 ug de tripsina/l. NA: no analizado.

Conclusión: Se pueden usar diferentes sustancias cargadas para liberar el FVIII (como también se muestra en el ejemplo 3D). Sin embargo, tal como se muestra en alguno de los ejemplos previos, es preferible elegir una 15 sustancia de liberación que no destruya la membrana celular, ya que eso libera proteasas y proteínas de células huésped lo que disminuye la estabilidad del producto. Además, si se destruyen las células, no se pueden usar para la producción continua del producto, lo que disminuye el rendimiento global. Se puede observar que NaCl 0,55 M, KCl 0,50 M y CaCl2 0,25 M dan todas una recuperación muy alta con viabilidad celular casi inalterada y con un producto liberado de pureza alta. 20

Ejemplo 6: Estudio de cloruro de calcio como composición de liberación y comparación con NaCl.

Se añadieron 5 ml de SC5 (3,47 x 10 células/ml, clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 ml de una

solución de liberación. Las células se habían cultivado las células tal como se describe en el ejemplo 1 y se extrajeron antes de la recogida (véase la figura 1). Se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces, se centrifugaron los tubos a 1200xg durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar FVIII:C, etc. Para una descripción esquemática general del experimento, véase también la figura 2. los ejemplos 5 6A-6E son experimentos realizados con la misma SC en experimentos paralelos y por tanto se pueden comparar entre sí.

A: Estudio de diferentes concentraciones de CaCl2 como composición de liberación y comparación con NaCl.

Se prepararon diferentes concentraciones de CaCl2 y se añadieron a SC5 de acuerdo con el procedimiento 10 descrito anteriormente, para estudiar en qué intervalo de la concentración de cloruro de calcio se produce la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 13.

Tabla 13

Concentración de liberación*

FVIII:C, (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/ célula (UI) Viabilidad celular (%) Pureza FVIII, UI/µg prot.

NaCl 0,10 M

5,06 100 2,92 94 0,22

NaCl 0,55 M

13,6 269 7,86 82 1,05

CaCl2 0,05 M

15,1 298 8,73 71** 2,16

CaCl2 0,10 M

18,0 356 10,4 77** 1,80

CaCl2 0,20 M

7,32 145 4,23 52** 0,46

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** resultados inciertos ya que CaCl2 precipita durante la adicion de reactivos analíticos.

Conclusión: Se puede usar cloruro de calcio como liberador eficaz de FVIII en el procedimiento de recogida celular. Una concentración 10 veces más baja de cloruro de calcio (0,05 M) tiene el mismo efecto liberador en 15 comparación con la concentración de cloruro de sodio más alta (0,55 M). Además, el lavado de cloruro de calcio parece que libera cantidades significativamente más bajas de otras proteínas de células huésped, dando como resultado el incremento significativo de la pureza de FVIII liberado en comparación con el uso de cloruro de sodio. La viabilidad celular de las células tratadas con cloruro de calcio parece que es ligeramente más baja en comparación con el lavado de cloruro de sodio, sin embargo, esto es incierto debido a la influencia de Ca en el procedimiento de 20 medida de viabilidad. La agregación celular y que no se produzca lisis de las células es una explicación posible reforzada por la cantidad aún baja de proteínas de células huésped liberadas (se sabe que el cloruro de calcio puede inducir la agregación dentro de las células). El análisis por transferencia de western indica que no hay diferencia significativa en el patrón de masa molecular del FVIII bruto, liberado con NaCl 0,10M, NaCl 0,55M, CaCl2 0,10 M y CaCl2 0,20M (fig. 3A y 3B) y en comparación con una preparación de FVIII altamente purificada (fig. 3A). 25

B: Estudio de medios de cultivo celular añadidos con diferentes cantidades de CaCl2 como composición de liberación. Se usó medio de cultivo celular no usado (el mismo usado durante el cultivo celular, Freestyle) como solución de tampón. Se añadieron los medios de cultivo celular (CCM) a diferentes cantidades de CaCl2, para estudiar la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 14.

Tabla 14

Composición de liberación*

FVIII:C, (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 106/ célula (UI) Viabilidad celular (%)

Referencia, NaCl 0,10 M

5,06 100 2,92 94

CC M+CaCl2 0,005 M

9,72 192% 5,60 91%

CC M+CaCl2 0,01 M

9,12 180% 5,26 70%

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M.

30

Conclusión: Un pequeño incremento (5-10 mM) en la concentración de cloruro de calcio en los CCM, incrementa significativamente la liberación de FVIII.

Ejemplo 7: Estudio de diferentes sustancias de origen no cargado y comparación con NaCl como composición de liberación

Se añadieron 5 ml de SC6 (2,96 x 106 células/ml, clon de HEK 293T 12/24E4, vector pTGF8-2hyg-s)) a 5ml 5 de una solución de liberación. Las células se habían cultivado tal como se describe en el ejemplo 1 y se extrajeron antes de la recogida (véase la figura 1). Se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces, se centrifugaron los tubos a 1200xg durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar FVIII:C, etc. Para una descripción esquemática general del experimento, véase también la figura 2. Los ejemplos 7A-7B son 10 experimentos realizados con la misma SC en experimentos paralelos y por tanto se pueden comparar entre sí.

A: Estudio de diferentes sustancias (no cargadas) y comparación con NaCl como composición de liberación. Se prepararon diferentes soluciones y se añadieron a SC6 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar si se produce la liberación de FVIII con sustancias que trabajan con diferentes principios (no iónicos). Los resultados están resumidos en la tabla 15. 15

Tabla 15

Composición de liberación*

FVIII: C (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/ célula (UI) Viabilidad celular (%)

NaCl 0,10 M

0,21 100 0,14 59

NaCl 0,55 M

0,96 457 0,65 54

polietilenglicol 4000 al 10%

0,12 57 0,08 75

etilenglicol al 5%

0,20 95 0,14 50

etilenglicol al 10%

<0,1 <50 <0,07 26

alanina 0,5M

0,18 86 0,12 62

valina 0,25M

0,25 119 0,17 68

etanol al 10%

0,11 52 0,07 32

caprilato de sodio al 5%

<0,1 <50 <0,07 Na

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M.

Conclusión: Se han sometido a prueba diferentes sustancias de origen no iónico (hidrófilo, hidrófobo, alcoholes) y se han comparado los resultados con cloruro de sodio como sustancia de liberación. El resultado muestra que las sustancias de liberación de naturaleza iónica son necesarias para la liberación del FVIII.

B: NaCl 0,155 M como sustancia de liberación, concentración y análisis por transferencia de western. Se 20 añadieron 50 ml de SC6 a 50 ml de una solución de NaCl 1 M. Se balanceó suavemente la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación se centrifugó la solución durante 5 minutos (1200xg) y se recuperó el sobrenadante. A continuación se concentró el sobrenadante celular hasta un contenido de FVIII:C de 13,6 UI/ml, usando recipientes de centrifugación que incluían una membrana de 10 kDa (Amicon, cen-triprep). La centrifugación era necesaria para poder usar el procedimiento analítico por transferencia de western como herramienta, para 25 incrementar la concentración de FVIII.

Conclusión: La distribución de masa molecular del FVIII bruto liberado con NaCl 0,55M y en comparación con una preparación de FVIII altamente purificado disponible comercialmente, muestra una distribución de masa molecular similar (fig. 3A).

Ejemplo 8: Estudio de diferentes concentraciones de CaCl2, como sustancia de liberación y comparación con NaCl 30 en concentración alta (0,55 M) y baja (0,1 M).

A: Se añadieron 5 ml de SC7 (3,41 x 106 células/ml, clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) a 5 ml de una composición de liberación. Las células se habían cultivado tal como se describe en el ejemplo 1 y se extrajeron antes de la recogida (véase la figura 1). Se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo)

durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces se centrifugaron los tubos a 1200xg durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar la actividad de FVIII:C, etc). Para una descripción esquemática general del experimento, véase también la figura 2.

Se prepararon diferentes concentraciones de CaCl2 y se añadieron a SC7 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar en qué intervalo de la concentración de CaCl2 se produce la liberación de FVIII. 5 Los resultados están resumidos en la tabla 16.

Tabla 16

Composición de liberación*

FVIII:C, (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/célula (UI) Viabilidad celular (%)

NaCl 0,10 M

3,65 100 2,14 90

CaCl2 0,075 M

9,42 258 5,52 73**

CaCl2 0,10 M

10,5 288 6,16 69**

CaCl2 0,125 M

11,7 320 6,86 67**

* La concentración de lavado, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. ** resultados inciertos ya que CaCl2 precipita durante la adición de reactivos analíticos.

Conclusión: CaCl2 es una sustancia de liberación, que libera FVIII a una concentración relativamente baja. La concentración necesaria es significativamente más baja en comparación con NaCl.

B: Estudio del tiempo necesario para la liberación de FVIII usando CaCl2 0,1 M. Se preparó una solución de 10 liberación de CaCl2 0,10 M y se añadió a la suspensión celular de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se extrajeron las muestras después de 0, 10, 30 y 60 minutos para estudiar lo rápido que se liberó FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 17.

Tabla 17

Concentración de liberación*

Tiempo, (minutos) FVIII : C, (UI/ml) FVIII:C x 10-6/ célula (UI)

Referencia, SC7

0 3,65 2,14

CaCl2 0,10 M

0 9,34 5,48

CaCl2 0,10 M

10 10,7 6,28

CaCl2 0,10 M

30 10,3 6,04

CaCl2 0,10 M

60 10,5 6,16

* La concentración de liberación final, la conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M.

Conclusión: La liberación de FVIII usando CaCl2 0,1 M se produce rápido, en minutos se ha liberado la 15 parte principal de FVIII.

Ejemplo 9: Estudio de diferentes concentraciones de CaCl2 como composición de liberación y comparación con NaCl.

Se añadieron 5 ml de SC8 (3,1 x 104 células/ml, clon de HEK 293T 12/24E4, vector pTGF8-2hyg-s)) a 5 ml de una composición de liberación. Las células se habían cultivado tal como se describe en el ejemplo 1. Se mezcló 20 suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces, se centrifugaron los tubos a 1200xg durante 1 minuto para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar FVIII:C, etc. Para una descripción esquemática general del experimento, véase también la figura 2. Se prepararon diferentes concentraciones de CaCl2 y se añadieron a la suspensión celular de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para estudiar en qué 25

intervalo de la concentración de cloruro de calcio se produce la liberación de FVIII. Los resultados están resumidos en la tabla 18.

Tabla 18

Conc. de liberación*

FVIII:C, (UI/ml) FVIII:C (%) FVIII:C x 10-6/cel (UI) Relación FVIII:C/ FVIII:Ag Pureza FVIII:C/ proteína, (UI/ug) ADN/ FVIII (ug/UI)

NaCl 0,1 M

1,48 100 0,48 0,63 0,026 0,69

NaCl 0,55 M

10,2 689 3,29 0,72 0,160 0,91

CaCl2 0,01 M

1,14 77 0,37 0,51 0,020 NA

CaCl2 0,01 M + NaCl 0,10M

2,12 143 0,68 0,56 0,050 NA

CaCl2 0,04 M

3,32 224 1,07 NA 0,072 NA

CaCl2 0,05 M

4,34 293 1,40 0,75 0,094 NA

CaCl2 0,075 M

7,70 520 2,48 0,93 0,226 NA

CaCl2 0,10 M

9,98 674 3,22 1,11 0,293 0,09

CaCl2 0,15 M

10,5 707 3,39 0,98 0,327 NA

CaCl2 0,20 M

10,5 707 3,39 NA NA NA

* La conductividad en la SC está calculada para corresponder a aproximadamente NaCl 0,1 M. NA: no analizado.

Conclusión: Se puede usar cloruro de calcio como liberador eficaz de FVIII. La condición de liberación óptima parece que es aproximadamente CaCl2 0,1 M, en comparación con NaCl, el procedimiento de liberación de 5 CaCl2 parece que produce una recogida más pura con calidad más alta. La liberación de ADN de las células disminuye significativamente (en un factor de 10) al usar el procedimiento de liberación de cloruro de calcio en comparación con el procedimiento de liberación de NaCl en concentración alta (0,55 M). Esta es una característica muy interesante del cloruro de calcio, ya que la retirada de ADN en el producto es un problema importante desde el punto de vista de la purificación si se trabaja con productos farmacéuticos producidos de manera recombinante. La 10 demanda reguladora del contenido de ADN en el producto final se ajusta muy bajo, para proteger las transmisiones no deseadas. Por tanto, un procedimiento de recogida de liberación baja de ADN es una propiedad altamente interesante del procedimiento de la invención.

Ejemplo 10: Cultivo a escala piloto, NaCl/CaCl2/liberación de His FVIII, etapa de captura.

Se filtraron 9844 g de SC9 (muestra 1), (2,4 x 106 células/ml, (clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGFB-3)) 15 a través de un filtro de perfil de 0,5 mM (0,6 m2). Entonces se lavó el filtro (con las células retiradas) con 7,5 l de una solución de NaCl 0,55 M + CaCl2 10 mM + Histidina 10 mM, pH 7, para liberar cualquier FVIII adherido. Se almacenaron el filtrado y el lavado (muestra 2). Antes de su uso, se lavó el filtro con 12 Ll de agua destilada y se equilibró con 2 l de un tampón de contenía NaCl 100 mM + CaCl2 10 mM + histidina 10 mM pH 7. Se realizó la filtración con una presión transmembrana de 20 kPa. Se usó aproximadamente la mitad del filtrado (47%) para 20 procesamiento adicional para la etapa de captura (intercambiador de cromatografía aniónico), se diluyó el material hasta una conductividad final de 13,0 mS/cm a 25ºC antes de aplicarlo a la etapa de captura. Se aplicaron 9317 g del material de partida (muestra 3) a la etapa de captura después de la elución de la etapa de captura con un incremento de la fuerza iónica, se eluyeron 3,8 g del producto (muestra 4). Los resultados están resumidos en la tabla 19. 25

Tabla 19

Nº de muestra

(g) FVIII (UI/ml) FVIII, total (UI) Rendimiento total, (%) Rendimiento en cada etapa (%)

Muestra 1 (SC)

9844 0,62 6103 100 100

Muestra 2 (filtrado celular)

12276 1,13 13845 226 226

Muestra 3 (comienzo de captura)

9317 0,68 6336 226 100

Muestra 4 (eluído de captura)

318 14,0 4452 146 70

Conclusión: El ejemplo muestra una manera diferente de usar la invención, se añade la sustancia de liberación (NaCl 0,55 M) después de la separación de células y sobrenadante celular. La ventaja es un nivel más bajo de la fuerza iónica en la solución recuperada después de la filtración. La fuerza iónica más baja puede que sea 5 importante si la solución se va a purificar en una etapa de captura basada en intercambio iónico. Un intercambiador iónico no se puede procesar con una fuerza iónica alta. Se debe diluir en esa solución de proteínas, lo que puede tener ciertas desventajas prácticas debido a los grandes volúmenes después de la dilución. Por tanto, el procedimiento de liberación descrito minimiza el volumen de dilución antes de la etapa de captura. El procedimiento descrito en escala de litros incrementó la recuperación del FVIII aproximadamente 2 veces (en comparación con c no 10 tratado). Los medios de suspensión celular se pudieron retirar exitosamente usando un intercambiador de cromatografía iónico, que también redujo el volumen en un factor de 29.

Ejemplo 11: Cultivo en escala de litros, liberación de CaCl2, etapa de captura.

Se añadieron a 7403 g de suspensión celular (se extrajo la muestra 1, se centrifugó y se analizó el sobrenadante libre de células para determinar el FVIII) que contenían 3 x 106 células/ml, clon y vector se incluirán 15 mediante SW, 370 g de una solución de CaCl2 1 M hasta una concentración final de CaCl2 50 mM. Se agitó la solución durante 10 minutos (se extrajo la muestra 2, se centrifugó y se analizó el sobrenadante libre de células para determinar el FVIII) a continuación se retiraron las células con filtración (0,4 m2, filtro de perfil de 0,5 mm). Antes de su uso, se lavó el filtro con 10 l de agua destilada y se equilibró con 5 I de un tampón que contenía NaCl 100 mM + CaCl2 50 mM + histidina 50 mM pH 7,1. Se realizó la filtración con una presión transmembrana de aproximadamente 20 20 kPa. Después de que se hubo filtrado la suspensión celular, se lavó cada filtro con 2 l de dicho tampón de equilibrio, para recuperar el FVIII absorbido. Se almacenó el filtrado y el lavado (ejemplo 3, 11856 g) y se añadió Tween® 80 hasta una concentración final del 0,01% (para evitar la adsorción de proteína durante el procesamiento adicional).

Se filtró el filtrado 1 a través de un filtro de 0,2 m2 0,5 µm/0,2 µm para proteger la resina de captura en la siguiente 25 etapa de intercambio iónico. Antes de su uso, se lavó cada filtro con 5 l de agua destilada y se equilibró con 5 I de un tampón que contenía NaCl 100 mM + CaCl2 50 mM + histidina 50 mM + Tween® 80 al 0,01%, pH 7,1. Se realizó la filtración con una presión transmembrana de 50 kPa. Después de que se hubo filtrado ese filtrado, se lavó el filtro con 4 l de dicho tampón de equilibrio, para recuperar el FVIII absorbido. Se almacenaron el filtrado y el lavado (14286 g, muestra 4). 30

Se diluyó el filtrado de 0,2 µm antes de aplicar la etapa de captura. Se aplicaron 28613 g del material de partida (comienzo de captura; muestra 5) a la etapa de captura, se eluyeron 580 g del producto (muestra 6). Los resultados están resumidos en la tabla 20.

Tabla 20

Nº de muestra

Peso (g) FVIII (UI/ml) FVIII, total (UI) Rendimiento, total (%) Rendimiento en cada etapa (%)

Muestra 1 (susp. celular)

7403 0,32 2369 100 100

Muestra 2 (susp. celular+ Ca)

7773 2,8 21764 919 919

Muestra 3 (filtrado celular)

11874 1,7 20394 861 94

Muestra 4 (filtrado 0,2 um)

14286 1,39 19905 840 98

Muestra 5 (comienzo de captura)

28613 0,61 17454 737 100

Muestra 6 (eluído)

580 22,8 13224 558 76

Conclusión: El procedimiento de liberación de la invención, usando una composición de liberación de CaCl2 50 mM, histidina 50mM y NaCl 100mM a escala piloto, incrementó la recuperación del FVIII aproximadamente en 9 veces en comparación con SC no tratada. Los medios de suspensión celular se pudieron retirar exitosamente 5 usando un intercambiador de cromatografía iónico como etapa de captura, que redujo el volumen en un factor de 50.

Ejemplo 12: Incremento (NaCl 0,4 M) y descenso (NaCl 0,1 M) del contenido de sal durante el cultivo.

Una característica muy importante de la invención sería si fuera posible usarlo en ciclos durante el cultivo. Esto incrementaría significativamente la recuperación y la productividad de la línea celular. A continuación se ha sometido a prueba esta idea con resultados prometedores. 10

A (cultivo de NaCl 0,4 M): A SC11 (1,8 ml) que contenía 2,8 x 106 células/ml (clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGF8-3)), que se había cultivado tal como se describe en el ejemplo 1, se añadieron 0,32 ml de NaCl 2,1 M (concentración final de NaCl 0,4 M). Se mezcló la solución durante 15 minutos, a continuación se centrifugó cuidadosamente la suspensión (60xg), se extrajo el sobrenadante celular y se analizó con respecto a FVIII:C, entonces se disolvieron las células restantes en los medios de cultivo hasta alcanzar el contenido normal de sal 15 (aproximadamente NaCl 0,1 M). Se dejó que la suspensión celular creciera durante 3 días, a continuación se repitió de nuevo el procedimiento anterior, con la excepción de que la duración del tratamiento salino fue de 2,5 h. De nuevo se disminuyó la concentración de NaCl debido a la dilución con el medio de cultivo hasta aproximadamente 0,1 M. De nuevo se dejó que la suspensión celular creciera, esta vez durante 4 días. Se siguió la concentración celular y de FVIII:C durante el experimento. 20

B (cultivo de NaCl 0,1 M): Se realizó el experimento como en A, con la excepción de que no se añadió NaCl. Por tanto la concentración de NaCl era aproximadamente de 0,1 M como presente en los medios de cultivo. Los resultados están resumidos en la tabla 21.

Tabla 21

Muestra

Tiempo (hora) Conc. celular (106) FVIII:C (UI/ml)

SC A 0,4 M

0 2,8 1,4

SC B 0,1 M

0 2,8 0,3

SC A 0,4 M

20 0,1 NA

SC B 0,1 M

20 0,2 0,53

SC A 0,4 M

70 0,8 0,24

SC B 0,1 M

70 0,9 NA

SC A 0,4 M

90 0,3 NA

SC B 0,1 M

90 0,4 NA

SC A 0,4 M

110 0,5 NA

SC B 0,1 M

110 1,1 NA

SC A 0,4 M

145 1,0 NA

SC B 0,1 M

145 1,3 NA

SC A 0,4 M

165 2,2 NA

SC B 0,1 M

165 2,7 NA

NA: no analizado

Conclusión: Los resultados muestran que las células que se han tratado con pulsos cortos de NaCl 0,4 M, parece que crecieron inicialmente un poco más lentamente. Sin embargo, después de 165 horas no existe diferencia significativa entre el tratamiento con sal en concentración alta y la referencia. En conclusión, parece que es una posibilidad interesante el uso de periodos cortos de concentraciones de sal incrementadas de acuerdo con la 5 invención.

Ejemplo 13: Escala de producción, etapa de captura de composición de liberación de FVIII CaCl2 / histidina / NaCl

Se añadieron 150 kg de SC12 (se retiró la muestra 1, se centrifugó y se analizó el sobrenadante libre de células para determinar el FVIII) que contenían 0,8 x 106 células/ml, (clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGF8-3), 16,7 kg de una solución de CaCl2 0,5 M hasta una concentración final de CaCl2 50 mM. Se agitó la solución durante 10 15 minutos (se extrajo la muestra 2, se centrifugó y se analizó el sobrenadante libre de células para determinar el FVIII), a continuación se retiraron las células con filtración (7 m2, filtro de perfil de 0,5 µm). Antes de su uso, se lavaron los filtrados con 400 l de agua destilada y se equilibró con 300 I de un tampón que contenía NaCl 100 mM + CaCl2 50 mM + histidina 50 mM pH 7,1. Se realizó la filtración con una presión transmembrana de aproximadamente 20 kPa. Después de que se hubo filtrado la suspensión celular, se lavaron los filtros con 2 x 100 l de dicho tampón 15 de equilibrio, para recuperar el FVIII absorbido. Se almacenaron el filtrado y el lavado (ejemplo 3, 359 kg) y se añadió Tween® 80 hasta una concentración final del 0,01% (para evitar la adsorción de proteína durante el procesamiento adicional).

Se filtró el filtrado con Tween® añadido (muestra 3) a través de un filtro de 0,6 m2 0,5 µm/0,2 mm para proteger la etapa de captura. Antes de su uso, se lavó el filtro con 50 l de agua destilada y se equilibró con 50 I de un tampón 20 que contenía NaCl 100 mM + CaCl2 50 mM + histidina 50 mM + Tween® 80 al 0,01%, pH 7,1. Se realizó la filtración con una presión transmembrana de aproximadamente 50 kPa. Se lavó el filtro con 30 l de tampón de equilibrio, para recuperar el FVIII absorbido. Se almacenó el filtrado y el lavado (38 kg, muestra 5).

Se diluyó el filtrado de 0,2 µm antes de aplicar la etapa de captura, se aplicaron 774 kg del material de partida (comienzo de captura, muestra 5) al intercambiados aniónico de captura se eluyeron 4,68 kg (muestra 6). Los 25 resultados están resumidos en la tabla 22.

Tabla 22

Nº de muestra

Peso (kg) FVIII: C UI/ml) FVIII, total (kUI) Rendimiento total, (%) Rendimiento en cada etapa (%)

Muestra 1 (susp. celular)

150 0,75 112 100 100

Muestra 2 (susp. celular + Ca)

168 5,1 857 765 765

Muestra 3 (filtrado celular)

359 2,9 1041 929 929 100

Muestra 4 (filtrado 0,2 µm)

384 2,8 1075 960 97 100

Muestra 5 (comienzo de captura)

774 1,3 1006 898 94 100

Muestra 6 (eluído de captura)

4,680 195 913 815 91

Conclusión: La realización del procedimiento de liberación, usando CaCl2 50 mM, histidina 50 mM y NaCl 100 mM no es dependiente de la escala. La recuperación de FVIII se incrementa en más de 9 veces para un tamaño de lote de 150 kg. Además, se puede concentrar adicionalmente la solución de FVIII resultante a través de un intercambiador aniónico de captura. El factor de reducción de volumen a lo largo de la etapa de captura era de 165 veces y el tiempo de procedimiento era aproximadamente de 4 h. 5

Ejemplo 14: Liberación de FVIII como función de concentración celular usando NaCl 0,1 M y 0,5 M.

Durante el cultivo celular, realizado tal como se describe en el ejemplo 1, se extrajeron de manera regular muestras a partir de SC13 (clon de HEK 293T 48/9H5, vector pTGF8-3). Se contaron las células y se dividió la muestra de S en dos tubos. En uno de los tubos se añadió una solución madre de NaCl 1 M 1+1 a la SC, hasta una concentración final de 0,5 M. Se incubó la muestra durante 15 minutos, a continuación se centrifugaron los tubos a 10 2500 r/min durante 1 minuto para retirar las células y se analizó el sobrenadante celular para determinar la actividad del FVIII:C. Los resultados están resumidos en la tabla 23.

Tabla 23

Tiempo (h)

Células viables, (104/ml) FVIII:C x 10-6/célula, contenido en sal bajo (NaCl 0,1M) FVIII:C x 10-6/célula, contenido en sal bajo (NaCl 0,5M)

0

9,7 NA NA

26

15,0 0,5 1,8

70

13,4 0,2 1,0

93

37,2 0,8 1,7

141

51,0 0,9 2,4

163

85,0 1,0 2,9

192

157 0,4 2,5

215

118 0,4 3,1

NA: no analizado.

Conclusión: El ejemplo muestra claramente que el FVIII está unido a las superficies sobre la célula durante el cultivo celular. El nivel de FVIII dentro de la recogida de sal en concentración baja casi no cambia al incrementar la 15 concentración celular. Mientras dentro de la recogida con sal en concentración alta, el incremento del FVIII sigue el incremento en la concentración celular, tal como se esperaba, si no se produce o se produce menos interacción con la membrana celular.

Ejemplo 15: Estabilidad de sobrenadante celular que contiene FVIII con diferente concentración de calcio.

Se recogió una suspensión celular (SC14) cultivada de acuerdo con el ejemplo 1 (clon de HEK 293T 20 48/9H5, vector pTGF8-3), separando las células con centrifugación. Se añadió el sobrenadante libre de células (pH 7) a diferentes cantidades de cloruro de calcio. Se almacenó la solución a temperatura ambiente y se extrajeron las muestras y se congelaron a -70ºC después de 0, 6 y 24 h. se siguió la estabilidad del FVIII analizando el FVIII:C. Los resultados están resumidos en la tabla 24.

Tabla 24

Adición

0 h 6 h 24 h 48 h

calcio 0 mM

100% 95% 67% 48%

calcio 2 mM

100% 89% 92% 85%

calcio 10 mM

100% 95% 101% 93%

calcio 50 mM

100% 98% 100% 97%

25

Conclusión: El calcio tiene un efecto estabilizador sobre FVIII en el medio sobrenadante celular. Se sabe en la bibliografía que el calcio es un componente importante para la estructura, función y estabilidad de FVIII en el intervalo de 1-50 mM (Wang et al., International Journal of Pharmaceutics 259 (2003) 1-15). Por tanto, el uso de cloruro de calcio como sustancia de liberación para el FVIII, de acuerdo con la invención tiene dobles efectos: Sustancia de liberación y estabilización del FVIII. 5

Además, tal como se puede observar a partir del análisis por transferencia de western en la figura 3B, no se detectó cambio significativo en la distribución de masa molecular del FVIII bruto, usando diferentes sustancias de liberación de la invención y en comparación con condiciones de recogida normales (aproximadamente NaCl 0,1 M).

Ejemplo 16: Producción de líneas celulares para un estudio de adsorción.

En los siguientes ejemplos del 16 al 20 se proporciona un estudio de la adsorción en el que se añade el 10 FVIII a un control (= células sin capacidad de producción de FVIII), a células HEK-293F y también a células BHK. El resultado de estos experimentos muestra que después de la adición FVIII a la suspensión celular, la cantidad de FVIII en el sobrenadante celular disminuyó con el tiempo, lo que indica su adsorción en la superficie celular. Se realizó un experimento idéntico, con la excepción de que se usó IgG en lugar de FVIII, con las células HEK-293F. Este experimento mostró que IgG se adsorbió en las células HEK 293F cultivadas bajo condiciones libres de suero. 15

Línea celular: La línea celular de expresión se basa en la línea celular de HEK 293F adaptada a libre de suero (o brevemente 293F, Invitrogen nº R790-07). Esta línea celular se generó originalmente mediante transformación de células de riñón fetal humano con ADN de adenovirus de tipo 5 cizallado (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1), 59-74 (1974)). Especie: Humana; Tejido: riñón fetal; Morfología: similar a epitelial; Cariotipo: El cariotipo de células 293F no se especifica; sin embargo, se conoce el cariotipo de células 293 (ECACC nº 85120602) 20 y se describe como 2n = 46, hipotriploide, nº de cromosoma modelo: 64.

Plásmido de expresión normal: Se usó un vector de la familia pcDNA3,1 (Invitrogen) como plásmido de expresión. El vector contiene el casete de expresión para el factor VIII de coagulación humano con dominio B eliminado con el péptido enlazador de la SEC ID Nº:9 (SEC ID Nº:4 y 6, respectivamente). Tiene tres intercambios de residuos de aminoácidos en las posiciones 162, 2011 y 2223 (en relación con la secuencia de longitud completa 25 mostrada en la SEC ID Nº:2). Se controla la expresión del BDDrFVIII mediante un promotor de CMV. Este promotor junto con el intrón SV40 y el sitio de poli-adenilación proporciona una producción de proteína recombinante de alto nivel. La resistencia frente a dos antibióticos proporciona una herramienta eficaz para la selección de clones después de la transfección. Para poder producir proteínas de células huésped sin FVIII (para el desarrollo del procedimiento analítico basado en anticuerpos para las proteínas de células huésped) se produjo una línea celular 30 denominada control en la que se excluyó del plásmido el gen del FVIII. También se usó esta línea celular que no produce FVIII para estudios de adsorción de FVIII (y IgG).

Cultivo: Se realizó un cultivo estático de las células en matraces TC de diferente tamaño. Todo el medio usado estaba libre de suero. Se usaron botellas para el cultivo dinámico. Con la finalidad de agitación, se colocaron las botellas sobre un agitador horizontal situado dentro del incubador. Se fijaron todos los incubadores a dióxido de 35 carbono al 5%, 37ºC y humedad relativa del 95%.

Descripción del análisis:

Factor VIII :C, procedimiento de detección selectiva basado en Coatest: El procedimiento se basa en el principio de dos fases y se realizó usando la técnica en microplaca. En la fase uno, se genera el factor activado X (Xa) por medio de la ruta intrínseca en la que el factor VIII: C actúa como un co-factor. En la fase dos, se determina 40 entonces el factor Xa mediante el uso de un sustrato cromogénico sintético, S-2222, en presencia de un inhibidor de trombina I-2581 para prevenir la hidrólisis del sustrato por trombina. Se para la reacción con ácido y se determina fotométricamente la actividad del VIII: C, que es proporcional a la liberación de pNA (para-nitroanilina), a 405 nm frente a un blanco de reactivo. El procedimiento cumple con los requerimientos de la Farmacopea Europea. La unidad del factor VIII: C se expresa en unidades internacionales (UI) tal como se define en la actual Norma 45 internacional de concentrado (International Concentrate Standard, IS) establecida por la Organización mundial de la salud (OMS). Se ha validado la rutina que usa tampón que contiene BSA al 1% en lugar de plasma hemofílico severo para diluciones previas.

IgG Elisa: Se determinaron las concentraciones de IgG con un procedimiento de ELISA, ELISA IgG de ratón (Roche Applied Science, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se une de manera adsortiva un 50 anticuerpo de captura especial a los pocillos de las microplacas. Después del bloqueo con el reactivo de bloqueo, se une el anticuerpo contenido en la muestra (p.e., sobrenadante de hibridoma, dilución de ascitis, etc.) al anticuerpo de captura durante una etapa de incubación adicional. Se fija POD al anticuerpo monoclonal usando una mezcla equilibrada marcada con POD de anticuerpos anti-ratón y anti-ratón (fragmentos Fab inmunoadsorbidos). Con el sistema de ABTS-perborato altamente sensible se forma un color verde oscuro en la reacción con las peroxidasas 55 fijadas. Se realiza la evaluación usando un gráfico estándar.

Ejemplo 17: Producción de una muestras de laboratorio de un FVIII con dominio B eliminado en línea celular de HEK

293F.

Línea celular: La línea celular de expresión se basa en la línea celular de HEK 293F adaptada a libre de suero (o brevemente 293F, Invitrogen nº R790-07). Esta línea celular se generó originalmente mediante transformación de células de riñón fetal humana con ADN de adenovirus de tipo 5 cizallado (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1), 59-74 (1974)). Especie: Humana; Tejido: riñón fetal; Morfología: similar a epitelial; Cariotipo: El 5 cariotipo de células 293F no se especifica; sin embargo, se conoce el cariotipo de células 293 (ECACC nº 85120602) y se describe como 2n = 46, hipotriploide, nº de cromosoma modelo: 64.

Plásmido de expresión: Se usó un vector de la familia pcDNA3,1 (Invitrogen) como plásmido de expresión. El vector contiene el casete de expresión para el factor VIII de coagulación humano con dominio B eliminado con el péptido enlazador de la SEC ID Nº:9 (SEC ID Nº:4 y 6, respectivamente). Tiene tres intercambios de residuos de 10 aminoácidos en las posiciones 162, 2011 y 2223 (en relación con la secuencia de longitud completa mostrada en la SEC ID Nº:2). Se controla la expresión del BDDrFVIII mediante un promotor de CMV. Este promotor junto con el intrón SV40 y el sitio de poli-adenilación proporciona una producción de proteína recombinante de alto nivel. La resistencia frente a dos antibióticos proporciona una herramienta eficaz para la selección de clones después de la transfección. 15

Transfección: Inmediatamente a continuación de la revitalización, se transfectaron células 293F adherentes con pcDNA3,1 usando el procedimiento de fosfato de calcio (C. Chen et al., Mol. Cell Biol. 7(8), 2745-2752 (19887)). Se comenzó la selección con higromicina (200 ng/ml) 72 h después de la transfección. Después de 10 días bajo selección, se aislaron clones resistentes a higromicina individuales, se expandieron y se subclonaron dos ciclos consecutivos de clonación de células únicas. Se cuantificó la producción de FVIII recombinante en el sobrenadante 20 de clones resistentes a higromicina usando ELISA y ensayos aPTT. Este procedimiento llevó a la selección del clon nº 293F 4/24K.

Cultivo: Se realizó un cultivo estático de las células en matraces TC de diferente tamaño. Todo el medio usado estaba libre de suero. Se usaron botellas y bioreactores desechables de hasta 10 l para el cultivo dinámico. Con la finalidad de agitación, se colocaron las botellas sobre un agitador horizontal situado dentro del incubador. Se 25 fijaron todos los incubadores a dióxido de carbono al 5%, 37ºC y humedad relativa del 95%.

Ejemplo 18: Adsorción del FVIII a células HEK 293F cultivadas libres de suero.

Se cultivó una suspensión celular de HEK 293F bajo condiciones libres de suero de acuerdo con el ejemplo 16. se añadió el FVIII tal como se describe en la tabla 25 y se cultivó la suspensión celular (1 x 106 células/ml) como antes, se tomó una muestra de sobrenadante libre de células después de 1, 5 y 24 h (controles de solución de FVIII 30 añadida al medio sin células e incubada bajo las mismas condiciones que la suspensión celular, respectivamente, se tomaron al mismo tiempo). Se congelaron las muestras y se analizaron para determinar la actividad del FVIII:C. Los resultados están resumidos en la tabla 26.

Tabla 25

Adición de FVIII

Tipo de factor

A, 100 UI/ml

FVIII derivado de plasma de longitud completa estabilizado con vWf*

B, 100 UI/ml

FVIII recombinante con dominio B eliminado**

* Octanate® (Octapharma) ** Una muestra de laboratorio de FVIII con dominio B eliminado, pureza del 90%, sin contenido en vWf, cultivado de acuerdo con el ejemplo 17

Tabla 26

FVIII

FVIII:C [UI/ml] Cambio*

A, 1h

50,1 7,5 %

A, 5h

48,5 4,0%

A, 24 h

27,4 -41,4 %

B, 1h

27,6 6,4%

B, 5h

15,0 -42,2 %

B, 24h

8,5 -48,3 %

* Después de la compensación con control

Conclusión: El FVIII se adsorbe a la superficie celular bajo premisas de cultivo. Tendencia a que el FVIII con dominio B eliminado recombinante se adsorba más rápido en comparación con el FVIII de plasma de longitud completa establecido con el factor de von Willebrandt.

Ejemplo 19: Adsorción del FVIII en las células BHK.

Se cultivaron células ABHK-21 (ATCC 13001) en Cytodex-3 en un matraz de agitación de 250 ml (Corning). 5 El medio usado era D-MEM con FBS al 10%. Antes de su uso, se intercambió el sobrenadante celular con 3 volúmenes de tampón libre de suero (PBS-A con EDTA al 0,03% p/p) para retirar los componentes de suero. Se añadió el FVIII tal como se describe en la tabla 27 y se cultivó la suspensión celular (1 x 106 células/ml) como antes, se tomó una muestra de sobrenadante libre de células después de 1,5, 5 y 24 h (controles de solución de FVIII añadida al medio sin células e incubada bajo las mismas condiciones que la suspensión celular, respectivamente, se 10 tomaron al mismo tiempo). Los resultados están resumidos en la tabla 28.

Tabla 27

Adición de FVIII addition

Tipo de factor

A, 100 UI/ml

FVIII derivado de plasma de longitud completa estabilizado con vWf*

* Octanate® (Octapharma)

Tabla 28

FVIII

FVIII:C [UI/ml] Cambio*

A, 1 h

50,6 8,4 %

A, 5 h

45,6 -2,3%

A, 24 h

30,1 -35,5 %

* Después de la compensación con control

Conclusión: El FVIII se adsorbe a la superficie celular de BHK bajo premisas de cultivo.

Ejemplo 20: Adsorción del IGG a células HEK 293F cultivadas libres de suero.

Se cultivó una suspensión celular de HEK 293F 6 días bajo condiciones libres de suero de acuerdo con el 15 ejemplo 16. A las células (0,9 x 106 células/ml) diferentes cantidades de IGG (IgG estándar liofilizada (Roche Diagnostics) diluida en PBS hasta tres diferentes soluciones de 10300, 1030 y 103 ng/ml). Se fraccionaron las diferentes soluciones madre de IgG en microtubos y se mezcló una parte (0,25 ml) de estas soluciones estándar con una parte (0,25 ml) de las células resuspendidas. Esto llevó a una dilución de 2 veces de las IgG estándar y por lo tanto las concentraciones de IgG esperadas eran de 5150, 515 y 51,5 ng/ml. Como controles positivos, se mezcló 20 una parte de cada solución de IgG estándar con una parte del medio de cultivo y como controles negativos se mezcló una parte de las células resuspendidas con una parte de PBS-A puro, que no contenía IgG. Después de 1 h de incubación, se centrifugaron las muestras a 6000 rpm y se recogieron los sobrenadantes y se analizaron. Se repitieron los experimentos de muestras 6 veces y se repitieron los experimentos de control al menos 9 veces. Se congelaron las muestras y se analizaron para determinar el contenido de IGG. 25

Resultados: Una visión general de los resultados de los experimentos en los que se incubaron IgG estándar de tres concentraciones diferentes junto con células HEK se presenta en las tablas 29 y 30. Sin embargo, la exactitud del resultado después de la incubación con solución estándar 5150 ng/ml no es la adecuada, -5,02 ± 20,0%, todos los resultados muestran una disminución en la concentración de IgG después de la incubación . Con las otras dos soluciones estándar, 515 y 51,5 ng/ml, la disminución era de -26,0 ± 9,10% y de – 15,8 ± 11,5% 30 respectivamente. Esta reducción de IgG en los sobrenadantes de las muestras, en comparación con los controles positivos, indica que IgG se ha adsorbido a las células HEK.

Tabla 29: Concentraciones de IgG promedio y desviaciones estándar para los controles y las muestras en experimentos de adsorción. Se incubaron tres concentraciones de IgG diferentes (5150 ng/ml, 515 ng/ml y 51,5 ng/ml) junto con medio fresco (en controles) y suspensión de HEK que contenía 0,9 x 106 HEK células/ml (en muestras).

Conc. de IgG antes de la incubación [ng/ml] Conc. de IgG promedio después de la incubación , µ [ng/ml] Desv. estándar

Controles positivos: (sin células)

5150 515 51,5 4860 619 49,7 945 59,1 5,57

Controles negativos: (0,9 x 106 células/ml)

0 <7,00 -

Muestras: (0,9 x 106 células/ml)

5150 515 51,5 4610 458 41,9 337 30,6 4,98

5

Tabla 30: Intervalos de confianza del 95% para µs - µc, en los que µs es la concentración de IgG promedio en las muestras y µc es la concentración de IgG promedio en los controles para cada solución madre, respectivamente.

Concentración de IgG antes de la incubación [ng/ml]

Conf. del 95% [ng/ml] interv. para µs - µc [%] Cambio en la cantidad de IgG por célula [pg/célula]

5150 515 51,5

-244 ± 970 -161 ± 56,3 -7,85 ± 5,72 -5,02 ± 20,0 -26,0 ± 9,10 -15,8 ± 11,5 -0,542 ± 2,17 -0,357 ± 0,124 -0,0174 ± 0,0131

Conclusión: IGG se une a células HEK 293 cultivadas bajo condiciones libres de suero. 10

Ejemplo 21: Producción de línea celular de expresión.

Línea celular: La línea celular de expresión se basa en la línea celular de HEK 293F adaptada a libre de suero (o brevemente 293F, Invitrogen nº R790-07). Esta línea celular se generó originalmente mediante transformación de células de riñón fetal humana con ADN de adenovirus de tipo 5 cizallado (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1), 59-74 (1974)). Especie: Humana; Tejido: riñón fetal; Morfología: similar a epitelial; Cariotipo: El 15 cariotipo de células 293F no se especifica; sin embargo, se conoce el cariotipo de células 293 (ECACC nº 85120602) y se describe como 2n = 46, hipotriploide, nº de cromosoma modelo: 64.

Plásmido de expresión: Se usó un vector de la familia pcDNA3,1 (Invitrogen) como plásmido de expresión. El vector contiene el casete de expresión para el factor VIII de coagulación humano con dominio B eliminado con el péptido enlazador de la SEC ID Nº:9 (SEC ID Nº:4 y 6, respectivamente). Tiene tres intercambios de residuos de 20 aminoácidos en las posiciones 162, 2011 y 2223 (en relación con la secuencia de longitud completa mostrada en la SEC ID Nº:2). Se controla la expresión del BDDrFVIII mediante un promotor de CMV. Este promotor junto con el intrón SV40 y el sitio de poli-adenilación proporciona una producción de proteína recombinante de alto nivel. La resistencia frente a dos antibióticos proporciona una herramienta eficaz para la selección de clones después de la transfección. 25

Transfección: Inmediatamente a continuación de la revitalización, se transfectaron células 293F adherentes con pcDNA3,1 usando el procedimiento de fosfato de calcio (C. Chen et al., Mol. Cell Biol. 7(8), 2745-2752 (19887)). Se comenzó la selección con higromicina (200 ng/ml) 72 h después de la transfección. Después de 10 días bajo selección, se aislaron clones resistentes a higromicina individuales, se expandieron y se subclonaron dos ciclos consecutivos de clonación de células únicas. Se cuantificó la producción de FVIII recombinante en el sobrenadante 30 de clones resistentes a higromicina usando ELISA y ensayos aPTT. Este procedimiento llevó a la selección del clon nº 293F 4/24K.

Cultivo: Se realizó un cultivo estático de las células en matraces TC de diferente tamaño. Todo el medio usado estaba libre de suero. Se usaron botellas y biorreactores desechables de hasta 10 l para el cultivo dinámico.

Con la finalidad de agitación, se colocaron las botellas sobre un agitador horizontal situado dentro del incubador. Se fijaron todos los incubadores a dióxido de carbono al 5%, 37ºC y humedad relativa del 95%.

Suspensión celular: El material de partida para experimentos de recogida es la suspensión celular (a continuación en el presente documento referido brevemente como "SC".). Antes de su uso, se ha inducido la suspensión celular con butirato de sodio durante, al menos, un día, para mejorar la productividad de las células. 5

Descripción del análisis, Factor VIII: C, procedimiento de detección selectiva basado en Coatest: El procedimiento se basa en el principio de dos fases y se realizó usando la técnica en microplaca. En la fase uno, se genera el factor activado X (Xa) por medio de la ruta intrínseca en la que el factor VIII: C actúa como un co-factor. En la fase dos, se determina entonces el factor Xa mediante el uso de un sustrato cromogénico sintético, S-2222, en presencia de un inhibidor de trombina I-2581 para evitar la hidrólisis del sustrato por trombina. Se para la reacción 10 con ácido y se determina fotométricamente la actividad del VIII: C, que es proporcional a la liberación de pNA (para-nitroanilina), a 405 nm frente a un blanco de reactivo. El procedimiento cumple con los requerimientos de la Farmacopea Europea. La unidad del factor VIII: C se expresa en unidades internacionales (UI) tal como se define en la actual Norma internacional de concentrado (International Concentrate Standard, IS) establecida por la Organización mundial de la salud (OMS). Se ha validado la rutina que usa tampón que contiene BSA al 1% en lugar 15 de plasma hemofílico severo para diluciones previas.

Ejemplo 22: Recogida usando diferente concentración de peptona.

Se añadieron diferentes cantidades de peptona sólida (peptona de soja A2 SC 19649, Organo Technie, La Courneuve, Francia) o sales (véase, tabla 31) a 10 ml de una suspensión celular (2,0 x 106 células/ml). Las células se habían cultivado tal como se describe en el ejemplo 21 y se retiraron antes de la recogida. Se disolvieron las 20 sustancias de lavado y se mezcló suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15 ml. Entonces, se centrifugaron los tubos a 600 r/min durante 5 minutos para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar la actividad del FVIII:C. Los resultados están resumidos en la tabla 31.

Tabla 31

Concentración de lavado

FVIII:C [UI/ml]* Liberación de FVIII [UI FVIII:C x 10-6/célula]*

Referencia, no tratada

1,1 0,55

NaCl 0,5 M

6,7 3,35

CaCl2 50 mM

7,6 3,78

NaCl 0,5 M + CaCl2 50 mM

8,5 4,25

Peptona al 2,5%

2,0 1,00

Peptona al 5%

3,3 1,65

Peptona al 10%

5,9 2,95

Peptona al 20%

6,7 3,35

* Compensado para factores de dilución

25

Conclusión: El incremento de la concentración de cloruro de sodio o cloruro de calcio o peptona antes de la recogida incrementa el FVIII recuperado en comparación con la muestra no tratada.

Ejemplo 23: Cultivo con y sin cantidad baja de peptona y a continuación adición de concentración baja de peptona para estudiar la liberación del FVIII bajo condiciones que se pueden usar durante el cultivo.

Se usaron dos suspensiones celulares cultivadas diferentes en este experimento, conteniendo ambas 5 30 mg/ml de insulina (Monotard® ,Novo Nordisk) y conteniendo una además peptona al 0,2% en el medio de cultivo libre de suero desde el comienzo. De otra manera, se cultivó la suspensión celular tal como se describe en el ejemplo 21.

Se añadieron diferentes cantidades de peptona (peptona de soja A2 SC 19649, Organo Technie, La Courneuve, Francia) o CaCl2 (concretamente una solución de 0,5 M de CaCl2 hasta alcanzar una concentración final de CaCl2 50 mM; véase la tabla 32) a 5 ml de suspensión celular (1,62 x 106 células/ml para suspensión celular 35 cultivada sin peptona y 1,38 x 106 células/ml para suspensión celular cultivada con peptona al 0,2%). La peptona añadida era una solución al 10% disuelta en medio de cultivo (con la excepción para el experimento de peptona al 18% en el que se añadió la peptona como sólido). Después de la adición de las sustancias de liberación, se mezcló

suavemente la suspensión (usando un mezclador de balanceo) durante 1 h a temperatura ambiente (21ºC), usando tubos de 15ml. Entonces, se centrifugaron los tubos a 600 r/min durante 5 minutos para retirar las células, a continuación se analizó el sobrenadante celular para determinar la actividad del FVIII:C. Los resultados están resumidos en la tabla 32.

Tabla 32

Cantidad añadida de componente de liberación en el tiempo para la recogida

FVIII:C x 10-6/ célula (cultivado con peptona al 0,2%)* FVIII: C x 10-6 / célula (cultivado con peptona al 0%)*

0 (referencia, no tratado)

0,51 0,40

peptona al 0,2%

0,51 0,41

peptona al 0,9%

0,54 0,52

peptona al 1,7%

0,70 0,50

peptona al 2,9%

0,72 0,53

peptona al 18% (ref. de con. alta)

1,71 1,57

CaCl2 50mM (referencia salina)

1,62 1,84

* Compensado para factores de dilución

5

Conclusión: El cultivo con cantidades bajas de peptona libera más FVIII de la superficie celular en comparación con el cultivo sin ninguna peptona añadida (véase la referencia de muestra, no tratada). Esto también es válido si se añade una pequeña cantidad de peptona 1 h antes de la recogida. Por tanto, la peptona contribuye a la liberación del FVIII de la superficie celular incluso en concentraciones bajas relativamente lo que se puede usar durante el procedimiento de cultivo sin efecto negativo para las células. 10

Listado de secuencias, texto libre

SEC ID N.º: 1: Secuencia de ADN del factor VIII humano.

SEC ID N.º: 2: Secuencia de aminoácidos del factor VIII humano.

SEC ID N.º: 3: Secuencia de ADN del vector pTGF8-3.

SEC ID N.º: 4: Secuencia de aminoácidos del factor VIII con dominio B eliminado como codificado mediante 5 pTGF8-3.

SEC ID N.º: 5: Secuencia de ADN del vector pTGF8-2hyg-s.

SEC ID N.º: 6: Secuencia de aminoácidos del factor VIII con dominio B eliminado como codificado mediante pTGF8-2hyg-s.

SEC ID N.os: 7 a 9: Péptidos de engarce. 10

SEC ID N.º 10: Secuencia de ADN del vector pTGF36.

SEC ID N.º 11: Secuencia de aminoácidos del factor IX humano como codificado mediante pTGF36.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Octapharma

<120> Procedimiento para mejorar el aislamiento de proteínas producidas de manera recombinante 15

<130> 060770wo/jh

<140>

<141>

<150> EP 05102475,0

<141> 2005-03-29 20

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3 2.1

<210> 1 <211> 6996

<212> ADN

<213> Homo sapiens 25

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(6996)

<400> 1

30

<210> 2

<211> 2332

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 2

<210> 3

<211> 10698

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: pTGF8-3

<220>

<221> CDS

<222> (676) .. (5052)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (733)..(5052)

<400> 3

<210> 4

<211> 1459

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: pTGF8-3

<400> 4

<210> 5

<211> 10698

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: pTGF8-2hyg-s

<220>

<221> CDS

<222> (676)..(5052)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (733)..(5052)

<400> 5

<210> 6

<211> 1459

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: pTGF8-2hyg-s

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido enlazador de dominio B

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido enlazador de dominio B

<400> 8

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido enlazador de dominio B

<400> 9

<210> 10

<211> 5753

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: pTGFG36

<220>

<221> CDS

<222> (689)..(2071)

<400> 10

<210> 11

<211> 461

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: pTGFG36

<400> 11

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la producción recombinante de al menos una proteína diana, que es un factor VIII humano o una muteína con dominio B eliminado del mismo, en células de mamífero, que comprende efectuar el cultivo de células de mamífero, que son capaces de la expresión de dicha al menos una proteína diana en cultivo en suspensión, bajo condiciones libres de suero y someter una suspensión de dichas células, antes de separar la 5 proteína de las células, a una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica seleccionada de NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCI, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada, y una peptona.

2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ajuste de la concentración de la suspensión celular se efectúa añadiendo a la suspensión celular una composición de liberación que comprende dicha al menos una sustancia 10 iónica, añadiéndose preferiblemente la composición de liberación

   (i) a la suspensión celular en forma sólida o líquida; y/o

   (ii) a la suspensión celular hasta 3 días, preferiblemente de 1 a 24 h, lo más preferiblemente de 1 a 120 min antes de la separación de la proteína; y/o

   (iii) a la suspensión celular durante los periodos de recogida y mientras tanto, intercambiada con condiciones 15 fisiológicas durante el cultivo continuo y la recogida de la proteína; y/o

   (iv) a la suspensión celular al comienzo y manteniéndose constante durante el cultivo continuo y la recogida de la proteína; y/o

   (v) directamente al caldo de cultivo o añadiéndose a las células o a una suspensión de las células aisladas a partir del caldo de cultivo; y/o 20

   (vi) gradualmente hasta alcanzar la concentración final dentro de 1-2000 minutos; y/o

   (vii) con una técnica de diafiltración.
3. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que

   (i) la proteína diana es una proteína factor VIII con dominio B eliminado, preferiblemente es la muteína del factor VIII que tiene la SEC ID Nº:4 ó 6; y/o 25

   (ii) las células de mamífero son células aisladas o células de tejido aislado de mamíferos, preferiblemente las células de mamífero son células humanas o células de roedores, más preferiblemente son células de riñón fetal humano inmortalizadas, lo más preferiblemente se seleccionan de HEK293 (ACC CLR-1573) HEK293 T (DSM ATCC 2494), 293 H y células 293 F de 293 freestyle (Invitrogen R79007), o es una CHO, Cos, hibridoma, mieloma tal como célula NSO; y/o 30

   (iii) las células de mamífero se transfectan de manera estable con un casete de expresión que porta el gen que codifica la(s) proteína(s) diana; y/o

   (iv) en la(s) sustancia(s) iónica(s) el aminoácido con una cadena lateral cargada es un aminoácido básico seleccionado de arginina, histidina y lisina, y la peptona es una peptona de soja; y/o

   (v) la(s) sustancia(s) iónica(s) se añade(n) hasta alcanzar el equilibrio en la proteína y la superficie celular, lo 35 suficiente para romper la unión iónica y liberar las proteínas unidas a la superficie celular sin destruir la célula; y/o

   (vi) se añade(n) al menos una sustancia iónica, preferiblemente dos y lo más preferiblemente tres o más sustancias iónicas; y/o

   (vii) no se añaden o se añaden sólo pequeñas cantidades de detergentes no iónicos a la suspensión y/o están presentes en la composición de liberación, preferiblemente la composición de liberación está libre de detergentes no 40 iónicos; y/o

   (viii) la composición de liberación comprende además una sustancia tamponadora para estabilizar el pH, preferiblemente la sustancia tamponadora se selecciona de sustancias tamponadoras de Goods, incluyendo HEPES, MES y TRIS; y/o

   (ix) el pH de la suspensión celular cuando se somete a un incremento de la concentración de al menos una 45 sustancia iónica está preferiblemente en el intervalo de estabilidad para la proteína seleccionada, para FVIII es de aproximadamente de 6,0 a 7,5; y/o

   (x) recogiendo la proteína se mantiene la viabilidad de las células, y después de la recogida se reduce la concentración incrementada de manera no natural de la sustancia iónica o se transfieren las células a un medio de cultivo fresco, para permitir un procedimiento de producción cíclico continuo de la proteína usando las mismas 50 células.

   (xi) la composición de liberación iónica se selecciona para contener al menos una sustancia que tenga como objetivo

   estabilizar las proteínas liberadas; y/o

   (xii) el cultivo bajo condiciones libres de suero se realiza bajo condiciones libres de proteína o el medio de cultivo comprende uno o más componentes de proteína, preferiblemente dichos componentes de proteína se selecciona de insulina, factor de crecimiento de insulina (IGF) y similar a insulina.
4. 4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: 5

   (i) se añade KCl para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M; y/o

   (ii) se añade CaCl2 para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,5 M, preferiblemente desde 0,05 hasta 0,2 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de 10 aproximadamente 0,1 M; y/o

   (iii) se añade lisina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o

   (iv) se añade arginina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,2 M, preferiblemente 15 hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o

   (v) se añade histidina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,01 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,3 M, más preferiblemente desde 0,05 hasta 0,3 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,25 M; y/o 20

   (vi) se añade una peptona para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos el 0,01% (p/p), preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde el 0,1 hasta el 20% (p/p).
5. 5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una o más de las etapas siguientes:

   (a) cultivar las células en un cultivo en suspensión en un medio de cultivo; 25

   (b) separar el medio de cultivo de las células cultivadas, dando como resultado dos fracciones separadas, una fracción de células cultivadas y una fracción de medio líquido;

   (c) poner en contacto o suspender la fracción de células cultivadas con una composición de liberación que comprende una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica tal como se define en las reivindicaciones 1 a 4; 30

   (d) retirar el medio de cultivo de las células, dando como resultado dos fracciones separadas, una fracción de células y una fracción de composición de liberación;

   (e) aislar la proteína recombinante de la fracción de composición de liberación; y

   (f) suspender la fracción de células de (d) anterior en medio de cultivo y volver a cultivar.
6. 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que 35

   (i) la separación del medio las células cultivadas en las etapas (b) y (d) se efectúa mediante centrifugación, filtración, diafiltración, filtración tangencial, filtración en línea, microfiltración, campos eléctricos, campos magnéticos y ultrafiltración; y/o

   (ii) el aislamiento de la proteína del medio y su purificación se efectúa usando al menos una técnica seleccionada de cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteína, intercambio de tampón, 40 cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, medios de cromatografía de intercambio iónico/hidrófoba de modo mezclado, cromatografía de quelación, cromatografía de afinidad a carbohidratos como de afinidad a heparina o lectina, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, diálisis, diferentes agentes de precipitación tales como polietilenglicol, sulfato de amonio, etanol, adsorción de hidroxiapatita, adsorción de membrana de filtrado, ligandos acoplados a partículas magnéticas, etc.; y/o 45

   (iii) el soporte usado para la purificación por cromatografía, se selecciona de resinas, partículas, perlas, membranas, fibra hueca o similar; y/o

   (iv) el aislamiento de la proteína comprende una etapa de captura, en la que el producto está unido y los medios de cultivo celular y la solución de liberación se arrastran por lavado, preferiblemente la etapa de captura utiliza medios de cromatografía; y/o (v) las etapas (d) y (e) se efectúan mezclando la suspensión celular con un medio 50 cromatográfico que fija el producto y después se retiran los medios de cromatografía de la suspensión celular, usando centrifugación, filtración, filtración en línea, filtración tangencial, microfiltración, campos eléctricos, campos

   magnéticos y/o ultrafiltración
7. 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

   (i) que se realiza bajo condiciones estériles; y/o

   (ii) en el que el medio y/o la proteína purificada se somete a una inactivación de virus y/o una etapa de eliminación.
8. 8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: 5

   (i) dos o más sustancias iónicas se mezclan para formar la composición de liberación; y/o

   (ii) la concentración de una mezcla de sustancias iónicas necesaria para alcanzar la liberación deseada de proteínas se determina dividiendo la cantidad teórica de sustancias iónicas, basándose en la concentración de liberación óptima para cada sustancia de liberación iónica si se usa de manera separada, por el número de sustancias; y/o

   (iii) mediante una combinación de sustancias iónicas, debido a los efectos combinatorios de las diferentes sustancias 10 iónicas, se requiere una cantidad más baja de cada sustancia iónica para lograr las propiedades de liberación de proteínas de la composición y para proporcionar simultáneamente condiciones de cultivo aceptables para las células; y/o

   (iv) la composición de liberación iónica se selecciona de modo que al menos un componente actúa como estabilizador para la proteína liberada que es activa antes y/o después de la separación de las proteínas y las 15 células.
9. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la composición de liberación comprende

   (i) CaCl2, preferiblemente en concentraciones en el intervalo desde 0,01 hasta 0,05 M; y/o

   (i) KCl, preferiblemente en concentraciones en el intervalo desde 0,1 hasta 0,2 M; y/o

   (iii) arginina, histidina o lisina, preferiblemente en una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,2 M. 20
10. 10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la suspensión celular se procesa con un sistema de microfiltración en el que el poro en el filtro se ha elegido para retener las células y eligiendo la técnica de filtración de técnicas de filtración de flujo tangencial o en línea, y en el que la composición de liberación se aplica a las células inmediatamente o con un incremento gradual usando la técnica de diafiltración y se recupera el producto libre de células en el filtrado de dicho sistema de microfiltración. 25
11. 11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que

    (i) se añade KCl para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 2 M, preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M; y/o

    (ii) se añade CaCl2 para elevar su concentración en la suspensión celular desde 0,05 hasta 0,2 M, preferiblemente 30 hasta una concentración de aproximadamente 0,1 M; y/o

    (iii) se añade lisina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 1 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o

    (iv) se añade arginina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 1 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o 35

    (v) se añade histidina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,3 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,25 M; y/o

    (vi) se añade una peptona para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde el 0,1 hasta el 20% (p/p).

12. 12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se añade NaCl para 40 elevar la concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 1 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M.

13. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que

    (i) se usa una combinación de NaCl y lisina en la composición de liberación, con NaCl a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 1 M, preferiblemente desde 0,2 hasta 0,5 M, lo más preferiblemente de aproximadamente 45 0,25 M y lisina a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 1 M, preferiblemente desde 0,2 hasta 0,5 M, lo más preferiblemente aproximadamente 0,4 M; y/o

    (ii) se usa una combinación de NaCl, histidina y CaCl2 en la composición de liberación, con NaCl a una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,6 M, preferiblemente desde 0,075 hasta 0,35 M, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1 M, histidina a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,3 M, 50

    preferiblemente desde 0,025 hasta 0,15 M, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,05 M y CaCl2 a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,25 M, preferiblemente desde 0,025 hasta 0,15 M, lo más preferiblemente a aproximadamente 0,05 M.
14. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la composición de liberación comprende CaCl2 a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,05 M, KCl, a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 5 0,2 M y arginina, histidina o lisina a una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,2 M.