TW201524996A

TW201524996A - 包含重組人凝血因子Ｘａ蛋白之異質體之組成物

Info

Publication number: TW201524996A
Application number: TW103132803A
Authority: TW
Inventors: Michael Anthony Jankowski; Keith A Johnson; Wendy Carol Piacenza; Jason C Rouse; Michael Shamashkin; Penelope Jane Sharpe; Mary Beth Switzer; Stacey B Weston
Original assignee: Pfizer
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2015-07-01
Also published as: RU2016108608A; US20150182604A1; SG11201601221XA; JP2016535071A; US20210106658A1; HK1218760A1; TWI631134B; SA516370751B1; IL279396A; WO2015044836A1; RU2648144C2; AU2014326257A1; PE20160877A1; US10660946B2; AR097732A1; JP6429885B2; CN112195169A; IL244258A0; KR101988705B1; CN105579468A

Abstract

本發明提供包含重組人凝血因子Xa(FXa)變異體之組成物。該等組成物包括FXa之多種同功型及轉譯後修飾體且可用於治療需要止血之個體。

Description

包含重組人凝血因子Xa蛋白之異質體之組成物

相關申請案之交叉參考資料

本申請案主張2013年9月24日提出申請之美國臨時申請案號61/881,834(其全文以引用方式併入本文)的權益。

序列表之參考資料

受37 CFR §1.821規範，以電腦可讀形式(CRF)經由EFS-Web隨本文同時提交之檔案名為PC72049_SEQLIST_ST25.txt的序列表以引用方式併入本文。該序列表之電子複本係在2014年9月10日創建，檔案大小為31千位元組。

對於能夠在一系列其中無法藉由醫療或外科干預適當地控制出血的臨床病況中有效控制過量出血的療法是有需求的。此種未被滿足的需求在罹患血友病的患者，尤其是在那些由於產生抑制劑抗體而使凝血因子替代療法變得較無效的患者中特別關鍵。

經活化之凝血第X因子(FXa)在內因性和外因性凝血路徑會聚的凝血級聯反應中佔據中心位置。與膜結合之FXa在其輔因子第Va因子(FVa)的存在下將凝血酶原轉化成凝血酶，此凝血酶會活化血小板並將纖維蛋白原轉化成纖維蛋白以形成血栓。原則上，直接投予FXa的替代療法可以矯正出血。然而，由於FXa之血漿半衰期非常短且可能因活化其他凝血因子而引起過度凝血，所以其治療潛力受到限制。

早期的工作鑑定出一種FXa變異體(I16L變異體)，其中白胺酸取代野生型FXa重鏈之胺基端處的異白胺酸(在胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)編號方案中的位置16)。該取代產生具有酶原樣特徵之FXa變異體。Toso,R.等人，The conformational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly.J.Biol.Chem.283.18627-18635(2008)；Ivanciu L.等人，A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia.Nat.Biotechnol.29：1028-33(2011)。

當不與其輔因子第Va因子(FVa)併入凝血酶原酶複合物中時，與野生型FXa相比較時，該FXaI16L變異體不具有顯著的催化活性且受到較好的保護而免於被血清蛋白酶抑制劑去活化。結果，與野生型FXa相比較，該變異體具有較長之血清半衰期。然而，與凝血酶原酶中之FVa結合造成該變異體從酶原樣狀態過渡到活性構形，從而恢復該變異體催化凝血酶原轉化成凝血酶，從而恢復其促凝活性的能力。在血友病A和血友病B的小鼠模型中，在受傷前投予FXa I16L變異體可在截割尾巴後以劑量依賴方式減少失血。這些實驗的結果表明FXa I16L變異體可能用來治療人血友病患者中不受控制的出血。

然而，在早期研究中所使用之FXa I16L變異體係依從經穩定轉染之HEK293細胞小量製造，再使用魯塞爾氏蝰蛇毒蛋白酶(Russell's viper venom protease)RVVX活化FX蛋白。Toso,R.,Zhu,H.& Camire,R.M.The conformational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly.J.Biol.Chem.283,18627-18635(2008)。雖然對於小規模的研究是有用的，此方法不適合用於大量製造臨床研究所需且最終供給病人的經純化之FXa變異體蛋白。因此，本技藝需要製備FXa I16L變異體蛋白，所製造之量和純度使FXa I16L變異體蛋白可在臨床試驗中進行測試且一旦被核准後可提供給需要止血的個體。

本發明經由提供FXa變異體蛋白之組成物來解決上述本技藝中未被滿足的需求，該FXa變異體蛋白係以足夠之純度和數量製造而能提供給需要止血的個體。於多種實施態樣中，這些組成物包含FXa變異體蛋白之不同的同功型及轉譯後修飾體。

於一實施態樣中，組成物包含FXa變異體蛋白之β型，其中輕鏈和重鏈蛋白序列分別由下列者所組成：SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139及146至386、胺基酸1至140及146至384、胺基酸1至140及146至386、胺基酸1至141及146至384、胺基酸1至141及146至386、胺基酸1至142及146至384、胺基酸1至142及146至386、胺基酸1至143及146至384和胺基酸1至143及146至386。

於另一實施態樣中，組成物包含FXa變異體蛋白之α型，其中輕鏈和重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139及146至398、胺基酸1至140及146至398、胺基酸1至140及146至399、胺基酸1至141及146至398、胺基酸1至141及146至399、胺基酸1至142及146至398和胺基酸1至142及146至399。

於上述之任何一或多種β和α同功型FXa變異體蛋白之實施態樣中，該蛋白之輕鏈可經修改以包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖及9、10或11個Gla殘基。於一些實施態樣中，存有9個Gla殘基。於其他實施態樣中，存有10個Gla殘基。再於其他實施態樣中，存有11個Gla殘基。

於上述之任何一或多種β同功型FXa變異體蛋白之實施態樣中，重鏈可經修改以包含一或兩個核心-1 O-連接之聚醣。

於一些實施態樣中，僅有第一、僅有第二或兩個核心-1 O-連接之聚醣可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化的。根據一些實施態樣，無唾液酸基團存在。於其他實施態樣中，存有一個唾液酸基團。於其他實施態樣中，存有二個唾液酸基團。於進一步之實施態樣中，存有三個唾液酸基團。再於更一步之實施態樣中，總共存有四個唾液酸基團。

根據一些實施態樣，FXa變異體蛋白組成物包括至少一種本發明之表2所列的FXa變異體蛋白物種。於其他實施態樣中，本發明之組成物包含至少5種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少35種、至少40種、至少45種、至少50、至少55種或至少60種表2所列出之FXa變異體蛋白之物種。

根據其他實施態樣，FXa變異體蛋白組成物包括至少一種FXa變異體蛋白，其中輕鏈為本發明之表3所列出的物種。且於其他實施態樣中，FXa變異體蛋白組成物包括至少一種其中重鏈為本發明之表4所列出之物種的FXa變異體蛋白。

於一些實施態樣中，本發明之任何一或多種 FXa變異體蛋白可以平均豐度存在於組成物中，該平均豐度會相對於可能存在的其他物種而改變。例如，相較於其他存在之物種，一種特定物種可以主要豐度、少數豐度或微量豐度存在。或者，相較於其他存在之物種，一種特定物種可以高豐度、中等豐度、低豐度或非常低之豐度存在。

本發明亦提供用於製造和純化FXa變異體蛋白之核酸、載體、宿主細胞及方法。

包含在本發明的有，例如編碼FX變異體蛋白之核酸，該FX變異體蛋白包含以PACE加工位置替換天然活化肽(AP)序列，從而允許在細胞內活化凝血因子。於一些實施態樣中，該AP序列被完全去除並被胺基酸序列Arg-Lys-Arg取代。根據一些實施態樣，編碼FX變異體蛋白之cDNA序列係由SEQ ID NO：4之核酸序列提供，而由其編碼之胺基酸序列係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列提供。本發明提供用於製造FXa變異體蛋白之相關方法，其係經由長成共同表現PACE(或類似之蛋白酶)及FX變異體蛋白的宿主細胞，然後純化該由宿主細胞製造、加工和分泌之FXa變異體蛋白來進行。本發明亦揭示根據這些方法所製造之FXa變異體蛋白。於這些方法之一些實施態樣中，宿主細胞為CHO細胞。

FXa變異體蛋白之純化可藉由色層分析法來進行，包括將包含該蛋白的溶液通過混合模式之色層分析(MMC)管柱(例如使用Capto MMC介質)，再清洗和洗提之，然後將該蛋白通過第一個離子交換色層分析柱(例如使用Q-Sepharose Fast Flow介質)，接著清洗和洗提之，再將該蛋白通過第二個不同的離子交換色層分析柱(例如使用Fractogel SO₃ ^-介質)，接著清洗和洗提之。亦可能使用其他用於純化FXa變異體蛋白的方法。

純化方法可選擇地包含病毒去活化的步驟，以及超濾和滲濾的步驟。將FXa變異體蛋白純化且在一些情況下濃縮後，可將其在隨意地含有其他成分(諸如緩衝劑或賦形劑)之醫藥上可接受的稀釋劑中稀釋。

本發明亦提供治療需要止血之個體的方法，此方法係藉由投予止血上有效量之包含一或多種本發明之FXa變異體蛋白的組成物來進行。於其他實施態樣中係在出血前投予個體止血上有效量之包含一或多種本發明之FXa變異體蛋白的組成物，以在易感個體中預防性地防止不受控制的出血。於一些實施態樣中，該個體係接受A型血友病之治療。於其他實施態樣中，該個體係接受B型血友病之治療。再於其他實施態樣中，該個體係接受創傷或其他類型之不受控制的出血之治療。

第1A圖提供成熟FX變異體蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)，其中在位置146之野生型異白胺酸殘基被該以粗體顯示之白胺酸所取代。位置146對應於胰凝乳蛋白酶編號系統中之位置16。可能之γ-羧基麩胺酸殘基(Gla)下方劃線且為斜體字。預測之鏈內和鏈間二硫鍵係藉繪於相連接之半胱胺酸之間的線表示。預測之β-羥基化位置被具有實線的框包圍。經遺傳工程處理以替代該活化肽之PACE識別和裂解位點被具有虛線的框包圍。形成β型之重鏈的羧基端胺基酸的賴胺酸(Lys³⁸⁶)被具有實線的橢圓形包圍。第1B圖提供預測之成熟FX變異體蛋白輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。第1C圖提供預測之FX變異體蛋白重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：3)。第1D圖提供編碼FX變異體蛋白，包括信號序列及前肽之cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。

第2圖提供完整FXa變異體蛋白之純化製劑在還原、烷基化反應及以Lys-C進行蛋白水解分解後所得到之肽類的質譜圖。使用根據肽類在進行RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析後所得之質譜所進行之波峰分配來確認該蛋白之胺基酸序列，並鑑定表1及他處所描述的某些轉譯後修飾體。波峰標記如下。後面跟一個數字的“L”係指源自輕鏈之特定的肽。後面跟一個數字的“H”係指源自重鏈之特定的肽。“H20¹”：C端終止於Lys³⁹⁹之H鏈的α型，含有兩個經二唾液酸化之核心-1 O-聚醣。“H20²”：C端終止於Lys³⁹⁹之H鏈的α型，含有一個經二唾液酸化之核心-1 O-聚醣。“H20³”：C端終止於Leu³⁹⁸之H鏈的α型，含有一個經二唾液酸化之核心-1 O-聚醣。“L4^1Gla”：含有1個γ-羧基麩胺酸殘基之L鏈肽# 4。“L10^glc”：含有可能之O-連接之葡萄糖(己糖)的L鏈肽# 10。“L1^2Gla”：具有2個γ-羧基麩胺酸殘基之L鏈肽# 1。“L3^6-8Gla”：具有6、7或8個γ-羧基麩胺酸殘基之L鏈肽# 3。“L8^b-OH”：含有β-羥基Asp之L鏈肽# 8。“d”：脫醯胺化。“R”：試劑峰，即，與試劑空白組一致之與緩衝劑相關的產品。“*”：過烷基化。

第3圖提供完整FXa變異體蛋白之純化製劑的HPLC色層分析圖並證明該製劑中存有不同的FXa變異體蛋白同功型。

第4圖提供完整FXa變異體蛋白之純化製劑的HPLC色層分析圖並證明該製劑中存有不同的FXa變異體蛋白同功型。亦可藉由質譜法分析該製劑。

第5圖提供來自純化之製劑的完整FXa變異體蛋白的質譜。該質譜確認兩種主要同功型，α和β，的存在，及廣泛之質量異質性，該廣泛之質量異質性可歸因於PACE裂解位點之可變的分解作用及存有不同類型之轉譯後修飾體。圖形中之主要波峰係藉由其觀察質量(以道耳吞計)鑑定出。使用根據RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析後所得之質譜所進行之波峰分配來確認該蛋白同功型之胺基酸序列，並鑑定表2及本文他處所描述的某些轉譯後修飾體。標記“*”之峰表示在輕鏈Gla結構域中存有11個Gla殘基。

第6圖提供FXa變異體蛋白之純化的製劑在藉由排除鏈間和鏈內二硫鍵以將輕鏈和重鏈分開的還原及烷基化反應後之HPLC色層分析圖。該色層分析圖證明不同FXa變異體蛋白同功型的存在。亦藉由質譜分析法分析該製劑。

第7A圖提供該蛋白之純化製劑在還原和烷基化反應後的FXa變異體蛋白輕鏈的質譜。該質譜證明可歸因於PACE裂解位點處之可變分解及存有不同類型之轉譯後修飾體的廣泛質量異質性。圖形中主要的波峰係藉由其觀察質量(以道耳吞計)來鑑別。使用根據RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析後所得之質譜進行的波峰分配來確認該蛋白同功型之胺基酸序列，並用來鑑定如表3及本文他處所描述的某些轉譯後修飾體。

第7B圖提供該純化之蛋白製劑在還原和烷基化反應後的FXa變異體蛋白重鏈的質譜。該質譜證明可歸因於存有不同類型之轉譯後修飾體的廣泛質量異質性。圖形中主要的波峰係藉由其觀察質量(以道耳吞計)來鑑別。使用根據RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析後所得之質譜進行的波峰分配來確認該蛋白同功型之胺基酸序列，並用來鑑定如表4及本文他處所描述的某些轉譯後修飾體。標記“*”之峰表示重鏈經過烷基化。

詳細說明

本發明描述包含以足以在臨床試驗中進行測試之純度和量製造之FXa變異體蛋白的組成物且該組成物係被提供給需要止血的個體。本發明亦描述製造和純化FXa變異體蛋白的方法。

於某些實施態樣中，短語“FX變異體蛋白”、“FXa變異體蛋白”及類似術語係分別指(除非從上下文中另外明確得知)人第X因子(FX)或活化之第X因子(FXa)，其中該緊接在重鏈中之活化肽序列之後的異白胺酸(Ile或I)被白胺酸(Leu或L)所取代。根據該FXa重鏈和胰凝乳蛋白酶之催化結構域之間的序列比對，當使用胰凝乳蛋白酶編號方案時此取代亦稱為I16L置換突變。此位置對應於SEQ ID NO：1中之胺基酸146及SEQ ID NO：3中之胺基酸1。如上文中所討論者，包含此突變之FXa具有允許該突變之FXa在血液中循環較野生型FXa更久之酶原性質，但當被納入凝血酶原酶複合物時，其亦能以高速率裂解凝血酶原。

根據其他實施態樣，FX變異體蛋白及FXa變異體蛋白係分別指人FX或FXa，其中該對應於SEQ ID NO：1中位置146(胰凝乳蛋白酶編號方案中之位置16)之胺基酸被Phe(F)、Asp(D)或Gly(G)所取代。根據其他實施態樣，FX變異體蛋白及FXa變異體蛋白係分別指人FX或FXa，其中該對應於SEQ ID NO：1中位置147(胰凝乳蛋白酶編號方案中之位置17)之纈胺酸(Val或V)被Leu(L)、Ala(A)或Gly(G)所取代。且，於其他實施態樣中，FX變異體蛋白及FXa變異體蛋白係分別指人FX或FXa，其中該對應於SEQ ID NO：1中位置329(胰凝乳蛋白酶編號方案中之位置194)之胺基酸被Asn(N)或Glu(E)所取代。

野生型第X因子通常以藉由二硫鍵結合在一起的非活性二鏈酶原形式在血液中循環。該二鏈酶原係在藉由蛋白水解除去以胺基酸140-142形式存在於成熟蛋白中之肽Arg-Lys-Arg之後從成熟FX(即，缺乏信號肽和前肽)形成。然而，活化需要在形成凝血塊前藉由第IXa因子或第VIIa因子，或藉由其他蛋白酶，諸如RVVX除去活化肽(AP)。該AP對應於成熟單鏈FX之胺基酸143-194。在該二鏈酶原中，其係存在於重鏈之胺基端。 M.Hertzberg,Biochemistry of factor X,Blood Rev.8(1)：56-62(1994)。

於一示例性實施態樣中，第X因子變異體蛋白序列係經由下述步驟修改：除去活化肽並以胺基酸序列Arg-Lys-Arg(單字母代碼為RKR)替換之，以創建供成對之鹼性胺基酸裂解酶(PACE；亦稱為弗林蛋白酶(furin))識別和裂解之位點。當與PACE共同表現在宿主細胞中時，替換AP可允許FX變異體蛋白在細胞內活化，而非在分開之步驟中活化FXa。這避免需要先純化由細胞製造之FX變異體，使用蛋白酶(諸如RVVX)分別活化該蛋白，然後再純化變異體FXa。經由避免這些額外的步驟，FXa變異體可以更純的形式及更大的量製造。

成熟之第X因子變異體胺基酸序列描繪於第1A圖(SEQ ID NO：1)中，其中該I16L白胺酸取代出現在胺基酸位置146(粗體)，該取代活化肽之RKR序列出現在位置143-145且該PACE加工位點出現在位置140-145(具有虛線之框)。第1B圖及第1C圖分別繪描在PACE位點裂解後之FXa變異體輕鏈(SEQ ID NO：2)和重鏈(SEQ ID NO：3)的預測之胺基酸序列。

根據本發明方法製造之FXa變異體蛋白多種製劑的分析顯示出與預測的結構相比較，在蛋白序列和轉譯後修飾體方面具有意料之外的異質性程度。然而，該等包含FXa變異體蛋白之結構上異質體的組成物能夠作為體外分析中有效的促凝血劑。如進一步描述於下文中者，該異質性係歸因於輕鏈和重鏈胺基酸序列中的變化及存在於一條鏈、另一條鏈或兩條鏈中的轉譯後修飾體。

不欲受限於任何特定之操作理論，咸信，結構異質性的一個來源係歸因於該經遺傳工程處理以替代活化肽之PACE/弗林蛋白酶識別和裂解位點處的可變裂解。於一非限制性實施態樣中，該PACE位點之胺基酸序列為經遺傳工程處理成FX變異體蛋白的RKRRKR(為單字母代碼)(SEQ ID NO：5)，此係經由以殘基RKR替代天然AP胺基酸序列，再與輕鏈之最後三個殘基一起形成蛋白水解識別位點RKRRK(SEQ ID NO：5)來達成。亦可使用其他PACE識別位點(例如單獨之RKR)作為除了PACE/弗林蛋白酶之外的蛋白酶之識別和裂解位點。

於一些實施態樣中，該PACE位點可經由蛋白水解裂解來將其從輕鏈完全除去，不留下任何殘基 (ANS...TLER¹³⁹/RKRRKR/)(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：5，分別為輕鏈和肽片段)。在本段中所描述的前述和下列實施態樣中，斜線標記(“/”)表示相鄰胺基酸之間可能的裂解位點且上標數字表示輕鏈裂解後之羧基端胺基酸的位置(根據第1A圖；SEQ ID NO：1)。於其他實施態樣中，該PACE位點經蛋白水解裂解，而使其第一個殘基留在輕鏈的C端(ANS...TLERR¹⁴⁰/KRRKR/)(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，分別為輕鏈和肽片段)。於其他實施態樣中，該PACE位點經蛋白水解裂解，而使其前二個殘基留在輕鏈的C端(ANS...TLERRK¹⁴¹/RRKR/)(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，分別為輕鏈和肽片段)。於其他實施態樣中，該PACE位點經蛋白水解裂解，而使其前三個殘基留在輕鏈的C端(ANS...TLERRKR¹⁴²/RKR/)(SEQ ID NO：11)。於其他實施態樣中，該PACE位點經蛋白水解裂解，而使其前四個殘基留在輕鏈的C端(ANS...TLERRKRR¹⁴³/KR/)(SEQ ID NO：12)。再於其他實施態樣中，該PACE位點經蛋白水解裂解，而使其前五個殘基留在輕鏈的C端(ANS...TLERRKRRK¹⁴⁴/R/)(SEQ ID NO：13)。再於其他實施態樣中，該PACE位點經蛋白水解裂解，而使其整個序列留在輕鏈的C端(ANS...TLERRKRRKR¹⁴⁵/)(SEQ ID NO：2)。

於其他實施態樣中，輕鏈中之結構異質性亦可包括Gla結構域中存在不同數目之Gla殘基，此係歸因於某些麩胺酸殘基之γ-羧基化程度的變化。於某些實施態樣中，該Gla殘基之數目為的9、10或11。第1A圖中確定Gla結構域中可能之麩胺酸γ-羧基化位點。根據其他實施態樣，額外之輕鏈結構異質性的可能來源包括在Asp⁶³處存有或不存有β羥基化天門冬胺酸殘基(第1A圖；SEQ ID NO：1)及存有或不存有O-連接之己糖。於一些實施態樣中，該O-連接之己糖為葡萄糖，但於其他實施態樣中，其可為不同的己醛糖，或環形半縮醛、酮己糖或其他O-連接之己糖。

重鏈亦可顯現出結構異質性。根據某些實施態樣，重鏈之長度可能發生變化。例如，一些重鏈為終止於K³⁹⁹之較長的α同功型(SEQ ID NO：3)(上標數字表示根據第1A圖；SEQ ID NO：1之重鏈的羧基端胺基酸之位置)，但於其他情況中該終端賴胺酸不存在，所以該蛋白終止於L³⁹⁸(SEQ ID NO：14)。於其他實施態樣中，重鏈為終止於K³⁸⁶或K³⁸⁴之較短的β形(分別為SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：45)。

而重鏈中之另一異質性來源為O-連接之糖基化程度。因此，於一些實施態樣中，重鏈為未經糖基化的。於其他實施態樣中，重鏈包含一或兩個核心-1 O-聚醣。核心-1 O-聚醣為其中N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)連接絲胺酸或蘇胺酸且半乳糖連接GalNAc之O-聚醣。於本發明之一些實施態樣中，該GalNAc糖是存在的，但Gal糖缺失。再根據其他實施態樣中，該兩個核心-1 O-連接之聚醣可各自分別為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化，從而使重鏈可擁有總計0至4個唾液酸基團。當存在唾液酸基團時，它們可以連接GalNAc或Gal，或此兩者。

根據其他實施態樣，可能有不同的輕鏈和重鏈配對，藉此產生具有不同鏈長及轉譯後修飾體之二鏈酶原的大組合組。

於其他實施態樣中，不同物種之FXa變異體蛋白的相對豐度可有不同的變化。於一實施態樣中，不同物種之豐度可經由比較完整FXa變異體蛋白之質譜中的波峰高度來檢測。或者，輕鏈和重鏈之豐度可在將完整蛋白還原和烷基化以排除鏈間和鏈內二硫鍵後藉由質譜法分別分析。如下列實施例中所描述者，不同之FXa變異體物種的豐度可藉由與質譜中之最高波峰比較而被評定為主要、次要或微量。

然而，質譜峰的高度比較並非測量豐度的唯一方法。其他用於測量結構物種之絕對或相對豐度的方法係在本技藝之一般技術人員的知識範圍內。於一用於分類相對豐度之另一方法的非限制性實例中，若有一物種之質譜峰的高度至少為該最豐富物種(即，質譜峰中之最高峰)的約50%，則該物種被認為具有高豐度。若有一物種之質譜峰的高度係在該最豐富物種之高度的約10至50%之間，則該物種被認為具有中等豐度。若有一物種之質譜峰的高度係在該最豐富物種之高度的約2至10%之間，則該物種被認為具有低豐度。若有一物種之質譜峰的高度低於該最豐富物種之高度的約2%，則該物種被認為具有非常低之豐度。亦可能使用其他用於比較物種之相對豐度的習知方法。

具體地說，FXa變異體蛋白輕鏈、重鏈及彼等之組合中的結構異質性之非限制性實施態樣描述於下文中。

本發明之實施態樣包括其中輕鏈之羧基端由於PACE位點處之可變裂解而終止於不同胺基酸的FXa變異體蛋白。相關之實施態樣包括存有可變數量之Gla殘基及轉譯後修飾體，諸如β羥基化之天門冬胺酸殘基及O-連接之己糖。下文中描述這些實施態樣中的一些實施態樣。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至 140所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至143所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

本發明之實施態樣包括其中重鏈之羧基端終止於不同胺基酸的FXa變異體蛋白。相關之實施態樣包括不同數量之包含不同唾液酸化程度的O-連接之聚醣。下文中描述這些實施態樣中的一些實施態樣。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至384所組成的FXa變異體蛋白。本發明之組成物可進一步包含本發明之任何其他FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至386所組成的FXa變異體蛋白。發明之組成物可進一步包含本發明之任何其他FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至 398所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至399所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

本發明之實施態樣包括其中輕鏈之羧基端由於PACE位點處之可變裂解而終止於不同胺基酸且重鏈之羧基端亦終止於不同胺基酸的FXa變異體蛋白。相關之實施態樣包括輕鏈中具有不同數量之Gla殘基及轉譯後修飾體，諸如β羥基化之天門冬胺酸殘基和O-連接之己糖，及重鏈中具不同數量之O-連接之聚醣，此O-連接之聚醣包含不同程度之唾液酸化。下文中描述這些實施態樣中的一些實施態樣。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至384所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至386所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至 139所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至398所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至399所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至384所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至386所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至398所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至399所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至384所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至386所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至398所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至399所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至384所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至386所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至398所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至399所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至143所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至384所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至143所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至386所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至 143所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至398所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包含其中輕鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至143所組成且重鏈係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸146至399所組成的FXa變異體蛋白。於相關之實施態樣中，輕鏈額外包含9個Gla殘基、10個Gla殘基或11個Gla殘基。於這些實施態樣之各實施態樣中，輕鏈可進一步包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖或此兩種轉譯後修飾體。於其他相關之實施態樣中，重鏈額外包含一個核心-1聚醣(其可為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)，或兩個核心-1聚醣(其可各自獨立為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化)。再於其他相關之實施態樣中係將輕鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列與重鏈之轉譯後修飾體的各種可能排列組合。本發明之組成物可包含本段中所描述之任何單獨或與本段中所描述之其他FXa變異體蛋白組合，及與本發明之任何其他FXa變異體蛋白組合的FXa變異體蛋白。

本發明進一步提供包含編碼FX變異體蛋白之核酸序列的分離出之核酸。根據示例性之非限制性實施態樣，本發明中所揭示之編碼FX變異體蛋白之互補DNA序列(cDNA)為SEQ ID NO：4。本技藝之一般技術人員將可察知鑑於遺傳密碼的簡併性，可能有許多其他編碼FX變異體蛋白的核酸序列。

於一些實施態樣中，編碼FX變異體蛋白之核酸可具有編碼信號肽及/或位在FX蛋白之胺基端的前肽(propeptide)(即，前導序列)之序列，該前肽除了其他潛在之功能外，指引新合成之蛋白到達分泌隔室。然後，進行轉譯後加工以在成熟蛋白從細胞中分泌出來前移除該前導序列。於一些實施態樣中，這些序列係源自天然人FX。可使用非天然前導序列(諸如來自人凝血酶原)者。亦可使用源自其他蛋白的前導序列(包括非人類來源者)。於SEQ ID NO：4之核酸序列的實施態樣中，該胺基端前導序列係源自人凝血酶原。

根據其他實施態樣，編碼FX變異體蛋白之核酸可經修改以允許該凝血因子在細胞內活化，以產生FXa 變異體蛋白。

如上文所指出者，FX通常係以二鏈酶原之形式循環，該FX中有一具52個胺基酸之活化肽位在FX重鏈之胺基端。形成能夠作為凝血酶原酶複合物中之促凝劑的FXa之活化作用(諸如活化之FIX或活化之FVII)需要藉由蛋白酶從內部或外部凝固系統進行蛋白水解來除去AP。在先前的研究中係使用類似之活化方法。具體地說，將FX變異體蛋白表現在細胞中，然後在分開之步驟中以魯塞爾氏蝰蛇毒(RVVX)處理以活化之，再從隨後之分析中純化FXa變異體蛋白。

雖然原則上活化之FX變異體蛋白可使用類似方法以工業規模製造，但如此做時將非常無效率且昂貴。例如，將需要嚴格的純化以排除任何殘餘之RVVX。為了避免這些缺點，可移除天然AP並以能在細胞內表現並發揮作用之蛋白酶的識別和裂解位點替換。以此方式，可能將FX變異體蛋白在細胞內活化而無需進行額外之處理步驟。然後，可將由宿主細胞分泌入生長培養基中之活化的FX變異體蛋白純化。

SEQ ID NO：4中提供一種編碼FX變異體之核酸序列的非限制性實例，該FX變異體中之AP序列被PACE識別和裂解位點替換。由此示例性cDNA序列編碼之成熟FX變異體蛋白的蛋白序列提供於SEQ ID NO：1中。於這些實施態樣中，該構成AP之胺基酸(野生型FX蛋白序列之胺基酸143至194)被序列Arg-Lys-Arg(單字母代碼為RKR)替換。此序列，與輕鏈序列之最後三個殘基(亦為RKR；SEQ ID NO：1之胺基酸140-142)結合後可創建為成對之鹼性胺基酸裂解酶(PACE)的識別和裂解位點(即，RKRRKR)(SEQ ID NO：5)。因此，共同表現在該表現經修改之FX變異體蛋白的相同宿主細胞中之可溶性PACE酶可在細胞內活化凝血因子。

於一些其中宿主細胞天然表現具有類似於 PACE之識別位點的酶之實施態樣中，可能不一定需要共同表現外源性蛋白酶。相反地，該天然蛋白酶可能足以活化表現在細胞中之FX變異體蛋白，從而產生並分泌活化之FX變異體蛋白。

於其他實施態樣中，可使用與PACE不同，但亦能在細胞內發揮作用之蛋白酶識別和裂解位點來替換該AP胺基酸序列。這類酶可共同表現在與FX變異體蛋白相同之宿主細胞中以活化該經修改的凝血因子。若能夠裂解該經遺傳工程處理之位點的天然酶在宿主細胞中的產製量足夠，則可能不需要共同表現外源性蛋白酶。

編碼本發明之FX變異體蛋白的核酸序列可使用本技藝中之一般技術人士所熟知的技術來併入載體中。

於某些實施態樣中，載體通常包括質體、細菌質體、真核游離基因、酵母人工染色體及病毒基因組。示例性非限制性病毒包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)及植物病毒，諸如花椰菜花葉病毒及煙草花葉病毒。有可能為其他類型之載體。於一些實施態樣中，載體能在合適之宿主中自主複製。於其他實施態樣中，載體被維持在宿主之染色體外或可被整合入宿主之基因組中，以允許該載體隨著宿主之基因組複製。包含足以維持基因轉錄及轉譯之基因和控制序列的載體被稱為表現載體。根據本發明之載體可根據本技藝之一般技術人士的知識來選擇或設計，以在能夠支持FX變異體蛋白之表現的任何細胞類型中發揮功能，包括細菌細胞、其他原核細胞、酵母細胞、其他真菌細胞、植物細胞、動物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、CHO細胞及人細胞，或其他細胞。

載體可隨意地含有一或多個控制序列。某些控制序列允許複製，諸如複製起源。其他控制序列控制或調節轉錄，諸如啟動子、增強子及轉錄終止位點。啟動子或增強子之非限制性實例為那些源自下列者：逆轉錄病毒LTR、巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))或多瘤病毒。另外之實例包括組織特異性啟動子及增強子、組成活性啟動子及增強子和誘導型啟動子及增強子。亦可能為其他啟動子和增強子。而其他控制序列控制或調節轉錄後之RNA加工，例如剪切及聚腺苷酸化信號，或增加或減少mRNA穩定性之信號。其他控制序列控制或調節蛋白轉譯，諸如轉譯起始序列(例如Kozak共識序列(consensus sequence))、轉譯後加工或蛋白穩定性。

載體亦可包含選擇標記基因，允許選擇已採取該載體之宿主細胞。非限制性實例包括賦予藥物抗性表型之選擇標記基因，諸如二氫葉酸還原酶基因(DHFR)(供用於DHFR^-宿主細胞中，允許使用胺甲蝶呤(methotrexate)選擇)、neo基因(允許以G418或類似藥物選擇)中、hph基因(允許以潮黴素B選擇)及麩胺酸合成酶基因(允許以甲硫胺酸碸亞胺選擇)。

包含編碼本發明之FX變異體蛋白的核酸序列之載體可被引入一或多種能夠支持FX變異體蛋白表現之宿主細胞中。用於將載體引入合適的宿主細胞中之方法為本技藝之一般技術人員所熟知為眾所周知的。非限制性實例包括瞬時及穩定轉染、轉化、轉導及病毒感染靶的宿主細胞。其他實例包括葡聚醣介導之轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將多核苷酸封裝在脂質體中及直接將該DNA顯微注射入細胞核中。用於將植物細胞、細菌及酵母細胞轉化的方法亦為本技藝所熟知。

FX或FXa變異體蛋白可與其他蛋白一起表現以優化FX或FXa變異體蛋白之表現或轉譯後處理。於一非限制性實例中係將包含編碼γ麩胺醯羧化酶之基因的載體與編碼FX變異體蛋白之載體共同轉染入宿主細胞中，以增加輕鏈Gla結構域中之麩胺酸羧基化。經由如此做可增加Gla結構域中之Gla殘基的羧基化程度和形成，從而提高由細胞製造之活性凝血因子的產量。於上述另一實施態樣中，PACE裂解位點取代天然AP胺基酸序列之經修改的FX變異體蛋白可與可溶性PACE酶共同表現在相同的宿主細胞中。然後，該共同表現之PACE可在細胞內裂解FX變異體蛋白以形成活化之FX變異體蛋白，其接著再從細胞中分泌出。如上文所指出者，此方法可避免需要在分開的步驟中活化FX變異體蛋白，否則將是非常無效率且昂貴的。

能夠表現FX變異體蛋白及用於優化活性形式之FX變異體蛋白之表現的其他蛋白之細胞包括哺乳動物細胞。適合作為用於表現蛋白之宿主的哺乳動物細胞株為本技藝所已知，包括那些源自人、大鼠、小鼠及其他哺乳動物者。示例性非限制性實施例包括某些可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)或其他來源取得之永生化的細胞株，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(例如COS、CV-1或Vero細胞)、人肝癌細胞(例如HepG2細胞)、A549細胞、A431細胞、HeLa細胞、L細胞、BHK21細胞、HL-60細胞、U937細胞、HaK細胞、Jurkat細胞，等。根據一般技術人士的知識來使用其他哺乳動物細胞作為用於表現蛋白之宿主細胞是可能的。

於其他實施態樣中，可使用來自昆蟲、植物、細菌或真菌之細胞株。示例性非限制性昆蟲細胞包括Sf9或Sf21細胞，其通常結合使用桿狀病毒載體表現系統。示例性非限制性植物細胞包括那些源自煙草屬(nicotiana)、擬南芥屬(arabidopsis)、浮萍(duckweed )、玉米、小麥及馬鈴薯品種者。示例性非限制性細菌包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和鏈黴菌屬菌株。示例性非限制性真菌包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、克魯維酵母(Kluyveromyces)菌株及假絲酵母(Candida)菌株。根據本技藝之一般技術人士的知識來使用其他昆蟲、植物、細菌和真菌細胞作為用於表現蛋白之宿主細胞是可能的。

用於培養宿主細胞以製造活化之FX變異體蛋白的方法、試劑和條件係在本技藝之一般技術人士的知識範圍內且不欲限制於此。於一非限制性實施例中，可在輔以維生素K之不含血清的培養基之500升培養中製造FXa變異體蛋白。於另一非限制性實施例中，本發明之FXa變異體蛋白可以工業規模，例如在2500升發酵槽，或甚至更大的體積中，在經過設計以優化表現和回收之條件下製造。

將宿主細胞生長在支持FX變異體蛋白表現及在細胞內活化的培養條件下後，該細胞生長培養基可經過處理以將在細胞生長期間分泌之FXa變異體蛋白分離及純化。於其他實施態樣中，尤其是，當使用哺乳動物宿主細胞以外之宿主細胞時，剩餘在細胞中之FXa變異體蛋白可，例如經由以機械力、酶或使用清洗劑打破細胞來釋出。

細胞培養基可經離心及/或過濾以去除細胞及碎片，例如藉由單獨之深層式過濾(depth filtration)或隨後藉由膜過濾，例如通過平均孔徑為0.45微米、0.2微米或一些其他孔徑尺寸的膜過濾器過濾。藉由離心及/或過濾除去細胞碎片後，可處理培養基以進一步純化FXa變異體蛋白。根據隨後之純化步驟，可能需要將該澄清之上清液或濾液稀釋及/或緩衝液交換。

用於純化蛋白之方法為本技藝所熟知。示例性非限制性的蛋白純化方法包括鹽析、尺寸排阻色層分析、離子交換色層分析及親和性色層分析。例如，可將特異識別FXa變異體蛋白之抗體固定在純化柱以可逆地從周圍培養基或緩衝劑中捕捉蛋白。清洗該親和柱以除去污染物後，可隨後將該經結合之FXa變異體蛋白洗提出。

經部分純化之FXa變異體蛋白可根據良好的製造規範或其他調控要求(包括，例如將病毒去除或去活化)來進行加工步驟。病毒可藉由超濾去除或根據本技藝之一般技術人士的知識，以酒精及/或清潔劑處理樣本來去活化。例如，可使用可從Sartorius Stedim生技取得之Virosart®牌病毒過濾器，及來自其他製造商之過濾器。亦可能使用其他用於將病毒去除或去活化的方法。

於一些實施態樣中可單獨使用混合模式之色層分析法(MMC)或與其他純化步驟組合來純化FXa變異體蛋白。MMC(亦稱為多模式色層分析法)係指使用可在配體和樣本組分之間提供一種以上之之交互作用類型的色層分析介質。示例性交互作用類型包括靜電(陰離子或陽離子交換劑)、疏水性、π-π交互作用、氫鍵結及親硫交互作用。這些交互作用可以合作或獨立工作。具體地說，MMC介質之非限制性實例包括Capto adhere、Capto adhere ImpRes、Capto MMC、Capto MMC ImpRes、Capto Core 700(其全部進一步描述於GE Healthcare Life Sciences(2013)所出版之Multimodal Chromatography Handbook中)。例如，Capto MMC提供親硫、疏水、氫鍵結以及陽離子交換靜電性質。亦可能使用來自其他來源之MMC介質。

於一些實施態樣中，可單獨使用離子交換色層分析或與其他純化步驟組合來純化FXa變異體蛋白。離子交換色層分析法係指使用根據分子之淨表面電荷的差異(其可隨著pH值、鹽及其他條件變化)來允許分子分離的色層分析介質。在高於蛋白之等電點的pH值下，該蛋白將與帶正電荷之介質(陰離子交換劑)結合，而當pH值低於其等電點時，蛋白會與帶負電荷的介質(陽離子交換劑)結合。離子交換介質和緩衝劑條件(例如鹽濃度、pH，等)可經過選擇，從而使欲純化之蛋白(例如FXa變異體蛋白)優先結合介質，允許在相同之結合條件下結合力較弱的污染物被沖洗掉，然後將所欲蛋白從色層分析柱中洗提出。關於離子交換色層分析法之額外信息進一步描述於GE Healthcare(2010)出版之Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing Principles and Methods Handbook中。

離子交換劑可被歸類為強或弱，這指出該離子交換劑在pH值改變時維持帶電的程度。強交換劑在很寬的pH範圍內維持帶電，而弱交換劑則不。陰離子交換劑官能基之實例包括為強交換劑之季銨(Q)，而二乙胺基乙基(DEAE)及二乙胺基丙基(ANX)被認為是弱交換劑。陽離子交換劑官能基之實例包括磺丙基(SP)及磺酸甲酯(S)，此兩者均被認為是強交換劑，而羧甲基(CM)為弱交換劑。

於一實施態樣中，FXa變異體蛋白可單獨使用陰離子交換色層分析步驟純化，或接著再進行陽離子交換色層分析步驟。於另一實施態樣中，FXa變異體蛋白可單獨使用陽離子交換色層分析步驟純化，或接著再進行陰離子交換色層分析步驟。

具體地說，離子交換介質之非限制性實例包括Capto DEAE、Capto Q ImpRes、Capto SP ImpRes、Capto S、Capto Q、SOURCE 15Q、SOURCE 15S、SOURCE 30Q、SOURCE 30S、MacroCap SP、MacroCap Q、Mini Q PC、Mini S PC、Mini Q PE、Mini S PE、HR Mono Q、HR Mono S、PC Mono Q、PC Mono S、Mono Q GL、Mono S GL、DEAE Sephacel、CM Sephadex C-25、CM Sephadex C-50、DEAE Sephadex A-25、DEAE Sephadex A-50、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50、SP Sephadex C-25、SP Sephadex C-50、ANX Sepharose 4 Fast Flow(High Sub)、ANX Sepharose 4 Fast Flow(Low Sub)、CM Sepharose Fast Flow、CM Sepharose High Performance、DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Big Beads、Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose High Performance、Q Sepharose XL、SP Sepharose Big Beads、SP Sepharose Big Beads Food Grade、SP Sepharose High Performance、SP Sepharose Fast Flow及SP Sepharose XL，這些可從GE Healthcare取得。其他離子交換介質可從Merck Millipore取得，包括，例如那些在Fractogel®系列或Eshmuno®系列中者。Fractogel®系列中之實例包括TMAE樹脂、TMAE Hicap樹脂、TMAE Medcap樹脂、DEAE樹脂、樹脂DMAE、SO3^-樹脂、SE Hicap樹脂及COO^-樹脂。Eshmuno®系列中之實例包括CPX，S，Q及HCX樹脂。亦可使用來自其他來源之離子交換介質。

當將FXa變異體蛋白充分純化後，可在用於包裝或進一步處理之製備方法中使用超濾和滲濾將純化之蛋白濃縮。

於一些實施態樣中，可將純化及濃縮之FXa變異體蛋白在含有緩衝劑及適合投予個體之其他成分的水溶液中稀釋，再包裝以供長期儲存，直到投遞。可使用額外之處理步驟。例如，可將包含FXa變異體蛋白、賦形劑、緩衝劑及其他醫藥上可接受之成分的組成物冷凍乾燥以供長期儲存。

本發明之FXa變異體蛋白(無論是根據下列實施例中所描述的方法製造或藉由其他方法製造者)可使用本技藝之一般技術人士所熟悉之方法分析以測定結構異質性之存在和程度。

例如，於一些實施態樣中，可藉由直接蛋白測序分析(例如利用Edman降解)由此製備之完整蛋白或蛋白水解片段。蛋白或肽亦可藉由液態色層分析法(LC)(包括逆相LC(RP-LC))及質譜(包括電噴霧離子化四極棒飛行式質譜分析(ESI-QTOF MS))分析來偵測胺基酸序列中之變化及特定之轉譯後修飾體的存在。此外，可使用陰離子交換高效液態色層分析法(AEX-HPLC)偵測帶電基團(例如γ-羧基化麩胺酸殘基(Gla))之存在。

當懷疑是否存有碳水化合物部分時，可經由以特定糖苷酶移除彼等來證實它們的存在。之後，經過處理之蛋白(其應不含該藉由糖苷酶除去之碳水化合物)可藉由，例如質譜分析來重新分析，以確認被假設為已經存在之碳水化合物的特性。

可使用本技藝之一般技術人士所熟悉之其他分析技術來偵測FXa變異體蛋白中之結構異質性的程度和特性。

可測試包含本發明之FXa變異體蛋白的組成物之促凝血活性。於一非限制性實例中，係使用缺乏第VIII因子之人血漿作為受質，藉由一段式凝血分析測凝血活性定。一種這類分析被稱為活化部分凝血酶時間(APTT)分析，但可根據本技藝之一般技術人士的知識使用其他分析測定。APTT分析在Kamal,.A.F，等人之How to interpret and pursue an abnormal prothrombin time,activated partial thromboplastin time,and bleeding time in adults,Mayo Clin Proc.82(7)：864-873(2007)中有更詳細的描述。

於某些實施態樣中，本發明之組成物包括“治療上有效量”或“預防上有效量”之FXa變異體蛋白。“治療上有效量”係指在需要之劑量和期間下能有效取得所需之治療結果(例如不受控制之出血的止血效果)的量。治療上有效量之FXa變異體可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別和體重之類的因子及FXa變異體在個體中引出所需反應之能力而變化。治療上有效量亦為其中該FXa變異體之治療有益效果勝過任何毒性或有害效果的量。“預防上有效量”係指在需要之劑量和期間下能有效取得所需之預防結果(例如預防易感個體中不受控制之出血)的量。例如，可在規劃的手術之前給予劑量。易感個體之實例包括患有血友病A或B者，包括那些製造對抗因子替代產品之抑制性抗體者。

本發明之組成物可投予需要治療之個體(包括人患者)或用於預防任何特徵在於凝血不足或出血過量之狀況。該等狀況之非限制性實例包括血友病A、血友病B、與抑制性抗體相關之血友病A或B、凝血因子缺乏症、維生素K環氧化物還原酶C1缺乏症、γ羧化酶缺乏症、與外傷相關之出血、損傷、血栓形成、血小板減少、中風、凝血病、彌散性血管內凝血(DIC)、過度抗凝血治療病症、Bernard Soulier症候群、Glanzman血小板無力症(thrombasthenia)及存儲池缺乏症。亦可能治療或預防特徵在於凝血不足或出血過量的其他病症。

劑量攝生法可經過調整以提供最佳之所需反應(例如治療或預防反應)。例如，可投予單次大劑量注射、在一段時間內投予幾個分割的劑量或可依治療情況之緊急程度指示按比例減少或增加該劑量。根據一些實施態樣，腸胃外組成物係配製成容易投予且具均勻劑量之劑量單位形式。劑量單位形式係指物理上離散的單位，以作為用於欲治療之個體的單一劑量，各單位含有經計算能與適當之醫藥載體聯合產生所需之治療效果的預定量之活性化合物。

於某些實施態樣中，治療或預防上有效量之 FXa變異體蛋白為約0.0001至50毫克/公斤，約0.001至50毫克/公斤，約0.001至5毫克/公斤，約0.001至0.5毫克/公斤，約0.001至0.05毫克/公斤，約0.01至5毫克/公斤或約0.01至0.5毫克/公斤。根據相關之實施態樣，FXa變異體蛋白之治療或預防上有效的血清濃度為約0.0003至300nM、約0.003至300nM、約0.03至300nM、約0.003至30nM、約0.03至30nM或約0.3至3nM。FXa變異體之血清濃度可藉由本技藝中已知之任何方法測量。

本發明之組成物的單位劑量可經過製備以方便地允許投予個體治療或預防上有效量之FXa變異體蛋白或在這類個體中取得此類蛋白之所需血清濃度。

對於任何特定之個體，可根據該接受治療之個體的需求及負責投藥或監督投服組成物之個人的專業判斷隨著時間調整特定之劑量攝生法或範圍。因此，本文所列出之劑量攝生法和範圍僅為示例性且不欲限制本發明之組成物的範圍或施行。

此外，本發明提供包含，例如一或多個本發明組成物之單位劑量的套組。這类具單位劑量可為液體形式或為凍乾物。若該組成物係以凍乾形式包裝，套組亦可額外包括填充用於重新懸浮該乾燥小丸之稀釋劑(諸如無菌水或生理鹽水溶液)的容器。套組亦可包含用於投藥的物品，包括，例如皮下注射器、或管及頭皮針，等。套組可額外包含使用指示、用於消毒皮膚之酒精片或其他組分。

包含FXa變異體蛋白之組成物可根據一般技術人士的知識投藥一或多次，直到出血停止或取得足夠的凝血。當使用多次投服時，可每小時、每天、每週或以其他間隔投藥。投藥可按時間表進行，例如每10分鐘、每15分鐘、每20分鐘、每30分鐘、每小時、每兩小時、每三小時、每四小時、每日三次、每日兩次、每日一次、每兩天一次、每三天一次及每週一次。亦可，例如經由微型泵連續投服FXa變異體。FXa變異體可經由腸胃外途徑(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內)投服。FXa變異體可投服一次、兩次或更多次，或至少投服取得有效凝固所需的時期。

於另一實施態樣中，包含FXa變異體蛋白之組成物可與另一種促凝劑共同投服，該另一種促凝劑包括不同的FXa變異體(例如在146號胺基酸處具有不同於白胺酸之取代的FXa變異體)、第IX因子、第XIa因子、第XIIa因子、第VIII因子、第VIIa因子、FEIBA或凝血酶原複合物濃縮物(PCC)。

包含FXa變異體蛋白之組成物可進一步包含醫藥上可接受之載體或載劑，該載體或載劑可為溶劑、分散介質、抗細菌及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及生理上相容之類似物。僅用於舉例說明，醫藥上可接受之一些載體包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝之生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇，等及彼等之組合。該組成物中亦可包含等張劑，例如鹽(例如氯化鈉)、糖(例如蔗糖)或多元醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)。醫藥上可接受之物質的另外實例有增強本發明組成物之穩定性或其他屬性的潤濕劑、乳化劑、防腐劑或緩衝劑。

根據本發明使用之組成物可為任何適合投予個體之形式，例如為用於注射或輸注之液體。該形式係取決於所欲之投服模式及治療施用。

治療組成物在製造和儲存條件下通常為無菌且穩定的。該組成物可配製成溶液、微乳劑、分散液、脂質體或其他適合高藥物濃度之有序結構。無菌注射液可經由將所需量之本發明FXa變異體蛋白與上述一種成分或成分之組合併入適當之溶劑中，再進行過濾滅菌來製備。在用於製備無菌注射液之無菌粉末的情況中，製備方法包括能產生來自活性成分加任何額外之所需成分的先前無菌過濾溶液之粉末的真空乾燥法或冷凍乾燥法(凍乾)。

下列實施例僅用於說明，而不應被解釋為以任何方式限制申請專利之範圍或本文所揭示之其他發明的範圍。

[實施例] 實施例1：表現及純化重組FXa變異體蛋白

使用標準分子生物學技術和試劑產生編碼包含I16L突變之FX變異體蛋白的cDNA，其中該天然第X因子活化肽胺基酸序列被胺基酸序列RKR(單字母代碼)替換，此胺基酸序列RKR與輕鏈C端處之RKR序列共同形成具有胺基酸序列RKRRKR(SEQ ID NO：5)之PACE蛋白水解裂解位點。該cDNA之序列和由其編碼之成熟蛋白分別描述於第1D圖(SEQ ID NO：4)及第1A圖(SEQ ID NO：1)中。以此方式，FXa變異體之FX前體可在細胞內由與凝血因子共同表現之PACE酶藉由蛋白水解裂解來活化。此外，人FX之天然信號序列及前肽被人凝血酶原之天然信號序列及前肽所替換。

在組成型啟動子之控制下，將編碼FX變異體之cDNA分殖入表現載體中。該載體亦表現新黴素抗性基因，從而允許抗生素篩選穩定之轉染株。創建第二載體以表現可溶型PACE酶。

使CHO K1宿主細胞適應於生長在不含血清之懸浮液中，並藉由脂質體轉染，以表現FXa變異體及可溶型PACE之線性化載體來共同轉染該宿主細胞。經由將細胞生長在輔以G418抗生素及維生素K1的培養基中來選擇經轉染之細胞。篩選具有重組FXa變異體蛋白之表現及活性的抗性選殖株。令顯示出具有相當高水準之重組FXa變異體蛋白表現及活性的選殖株適應生長在不含血清的懸浮培養液中。選定一選殖株並用於建立前種細胞(master cell)庫，再使用化學成分確定之不含動物或人類來源的組分之培養基建立種細胞庫。

為了製造用於進一步研究之藥物物質，使用化學成分確定之培養基，以500升(L)或2500L之規模長成表現FXa變異體之細胞。開始時，將來自細胞庫之細胞小瓶解凍、培養並藉由生長在化學成分確定且不含動物組分之培養基的體積漸增之小瓶中來逐漸擴充。一旦完成擴充後，將培養保持在小型攪拌槽生物反應器中。為了製造，持續在500升或2500升規模之生物反應器中培養，直到收穫。為了收穫，將細胞培養基離心以除去細胞和碎屑。經由深層式過濾及通過0.2微米過濾器過濾來將培養基進一步澄清。

然後，以緩衝劑將過濾之培養基稀釋並裝載到Capto混合模式色層分析(MMC)柱(GE Healthcare Life Sciences)上。清洗後，將產物從分析柱中洗提出。然後，將部分純化之產物稀釋在清潔劑溶液中以將病毒去活化。病毒去活化後，將產物裝載到Q-瓊脂糖快速流動色層分析柱(GE Healthcare Life Sciences)上，清洗並從分析柱中洗提出。然後，以緩衝劑稀釋洗提之產物並裝載在Fractogel SO₃ ^-色層分析柱(Merck Millipore)上，清洗並從分析柱中洗提出。然後，使用Virosart®CPV過濾器(Sartorius Stedim Biotech)過濾該洗提出的產物，以除去任何可能已存在之殘留的病毒。過濾病毒後，使用超濾和滲濾濃縮純化之產物。然後，測試純化之藥物物質以決定由CHO細胞製造之FXa變異體蛋白的特性。

實施例2：終端胺基酸序列

使用藉由Edman降解進行之FXa變異體的胺基端定序來確認輕鏈胺基端和重鏈胺基端二者之前十個殘基。在非還原及還原條件下藉由SDS-PAGE解析FXa變異體後，藉由自動化Edman降解進行分析並將其電印跡在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。

輕鏈胺基端序列為ANSFL(X)(X)MKK(單字母代碼)(SEQ ID NO：15)。殘基6和7(以X表示)處無信號發生，此與那些位置存有γ羧基麩胺酸(Gla)殘基相一致。重鏈胺基端序列為LVGGQE(Z) KDG(SEQ ID NO：16)。殘基7(以Z表示)處無信號發生，此與該位置存有半胱胺酸相一致。這些結果確認與理論序列相比較下，預期之輕鏈和重鏈兩者的胺基端序列。

實施例3：繪製肽圖譜以確認一級結構及鑑別轉譯後修飾體

為了確認一級胺基酸序列並檢測轉譯後修飾體，藉由繪製肽圖譜來分析依實施例1中之描述製造的FXa變異體蛋白。具體而言，將該蛋白還原、烷基化並以Lys-C賴胺醯內肽酶(lysyl endopeptidase)(無水解色桿菌(Achromobacter lyticus)蛋白酶1)分解之，然後，藉由逆相高效液相色層分析/電噴霧離子化四極棒飛行式質譜分析法(RP-HPLC/ESI-QTOF MS)分析。

所產生之肽圖譜剖面圖的實例顯示於第2圖中，其中肽類係根據彼等相關於第1B圖中所示之輕鏈及第1C圖中所示之重鏈的理論序列之推斷的相對位置標記。以字母“L”標記之波峰表示輕鏈肽，而那些以字母“H”標記者表示重鏈肽。代表與緩衝劑相關之產物的小峰被標記為“R”。代表脫醯胺化(d)或過烷基化之肽類的幾個微量級峰分別被標記為“d”和“*”。

藉由繪製肽圖譜、其理論質量和觀察質量及胺基酸序列檢測之肽類顯示於下列表1中。胺基酸編號係根據第1A圖(SEQ ID NO：1)。

以PAWS(Genomic Solutions，密西根州Ann Arbor)計算理論質量。從質譜圖中最豐富之多電荷離子計算觀察質量。所有觀察質量與理論質量的相差值在10ppm以下。輕鏈(LC)和重鏈(HC)之肽類間的序列覆蓋率分別約為94和98%。未檢測到三種來自L鏈的肽(L2、L5、L7)及兩種來自重鏈之肽(H14、H19)。理論和觀察之肽質量之間的計算差值可允許用來推斷某些轉譯後修飾體的存在。那些被發現經過修改之殘基係藉由表1第5列中之下方劃線表示。

輕鏈之N-端Gla結構域中共含有9至11個γ 羧基化麩胺酸(Gla)殘基。主要之輕鏈物種含有10個Gla殘基。雖然肽L1總是被羧基化，肽L3和L4中被檢測到異質性。具體而言，L3肽被觀察到具有6、7或8個Gla殘基而L4肽被觀察到無或具有1個Gla殘基。見表1。

使用陰離子交換高效液相色層分析法(AEX- HPLC)測量電荷異質性來確認γ-羧基化之異質性。藉由AEX-HPLC分離FXa變異體蛋白可解析含有9、10和11個γ羧基麩胺酸(Gla)殘基之同功型。在7種測試之經純化的FXa變異體蛋白製劑中，FXa變異體輕鏈內之Gla殘基數的相對頻率一致。尤其是，根據相對波峰分佈，9個Gla殘基之發生頻率係在10%至17%之範圍內(平均值=12.1%，SD=2.5%)，10個Gla殘基之發生頻率係在41%至46%之範圍內(平均值=43.0%，SD=1.8%)且11個Gla 殘基之發生頻率係在36%至46%之範圍內(平均值=42.1%，SD=3.3%)。

在以APTT為根據之凝血分析中，純化之10 和11個Gla的同功型顯示出具同等活性，而9個Gla之同功型的活性降低(當對質量正常化時，約為10和11個Gla同功型之活性的約20%)。

亦檢測輕鏈之其他轉譯後修飾體。尤其是，觀察到之肽L8的質量與位置63處存在β-羥基化天門冬胺酸殘基(Asp⁶³)(SEQ ID NO：1)相一致。此外，L10肽所觀察到之質量差表示加入O-連接之己糖。

亦將重鏈進行O-連接糖基化。在肽圖譜中，觀察到之重鏈的主要形式α同功型的C-端終止於胺基酸L³⁹⁸，而觀察到之次要形式的C端終止於胺基酸K³⁹⁹。此兩種肽被觀察到含有一或兩個經二唾液酸化的核心-1 O-聚醣，該兩種肽的主要物種含有一個經二唾液酸化的核心-1 O-聚醣。在肽圖譜之略圖中，標記“H20³”之波峰對應於終止於L³⁹⁸之H20肽，而標記“H20²”之波峰對應於終止於K³⁹⁹之H20肽，各含有一個O-連接之聚醣。標記“H20¹”之波峰對應於終止於K³⁹⁹之H20肽且含有兩個O-連接之聚醣。終止於L³⁹⁸且具有兩個O-連接之聚醣的H20肽的檢測量為微量且未標註在第2圖中。H20中之O-聚醣藉由β-排除反應及接下去之MS分裂定位在Thr³⁹⁴和Ser³⁹⁵。

實例4：藉由高效液相色層分析法測定結構異質性

使用逆相高效液相色層分析(RP-HPLC)來測量一種完整之純化FXa變異體蛋白製劑中的結構異質性。將純化之蛋白注射到逆相柱上並以酸化之乙腈梯度洗提之。與從肽圖譜繪分析的觀察相一致，該FXa變異體在重鏈C端含有結構異質性，此造成兩種主要的結構同功型，α(終止於Lys³⁹⁹)和β(終止於Lys³⁸⁶)。由於重鏈在Lys²⁸¹或Arg²⁸³後被剪短因而觀察到另外一種稱為γ之次要同功型。來自這些實驗之HPLC色層分析圖顯示於第3圖。

在7種測試之純化的FXa變異體蛋白製劑之間，該主要的結構同功型之相對頻率是一致的。尤其是，根據相對波峰分佈，該α同功型之發生頻率係在54%至74%之範圍內(平均值=66.9%，SD=7.0%)，β同功型之發生頻率係在24%至42%之範圍內(平均值=31.4%，SD=6.5%)，而γ同功型之發生頻率係在1%至3%之範圍內(平均值=2.0%，SD=0.8%)。

使用尺寸排阻HPLC將α和β同功型純化，並在標準之以APTT為基礎的凝血分析中測試活性。與α同功型(正常化為100%)相比較，該β同功型顯示出稍低之活性(79%)。次要之γ物種的活性並未進行測試。

實施例5：藉由質譜分析測定完整蛋白之結構異質性

先藉由RP-HPLC，再藉由使用高解析混合型四極棒飛行式質譜分析儀(RP-HPLC/ESI-QTOF MS)之質譜分析來分析來自一個純化之蛋白製劑的完整FXa變異體之分子量(M_r)。以Waters MaxEnt-1軟體將多電荷數據去卷積後從零電荷質譜測定M_r值。在理論及觀察到之主要和次要質量值之間的相對誤差均在60ppm內，此與Waters Q-ToF質譜儀之性能規格一致。該HPLC色層分析圖顯示於第4圖中。完整FXa變異體蛋白之質譜顯示於第5圖中，該以質譜圖為基礎之波峰分配列於下列表2中。胺基酸編號係根據第1A圖(SEQ ID NO：1)。¹ANS...LER¹³⁹對應於SEQ ID NO：6；¹ANS...ERR¹⁴⁰對應於SEQ ID NO：7；¹ANS...RRK¹⁴¹對應於SEQ ID NO：9；¹ANS...RKR¹⁴²對應於SEQ ID NO：11；¹ANS...KRR¹⁴³對應於SEQ ID NO：12；¹⁴⁶LVG...LPK³⁸⁴對應於SEQ ID NO：45；¹⁴⁶LVG...KAK³⁸⁶對應於SEQ ID NO：46；¹⁴⁶LVG...SPL³⁹⁸對應於SEQ ID NO：14；且¹⁴⁶LVG...PLK³⁹⁹對應於SEQ ID NO：3。

HPLC再次證明FXa變異體蛋白之結構異質性 (第4圖)。標記為A之波峰對應於γ物種。標記為B之波峰對應於包含二個O-聚醣之蛋白的α型。標記為C之波峰對應於包含一個O-聚醣之蛋白的α型。標記為D之波峰對應於其中重鏈終止於K³⁸⁶之β型的蛋白。標記為E之波峰對應於其中重鏈終止於K³⁸⁴之β型的蛋白。

在質譜圖中觀察到三個區域(第5圖)。在質譜圖下端(左)之第一區對應於含有β同功型重鏈之完整FXa變異體蛋白。根據相對之波峰強度，此區亦含有較其他物種更豐富之所謂的主要物種。該主要物種包括那些含有終止於K³⁸⁶之β型的重鏈，其中輕鏈之羧基端殘基為R¹³⁹、R¹⁴⁰或K¹⁴¹，這顯然是由於PACE之裂解位點處的可變裂解。其中輕鏈終止於R¹⁴²之物種(亦顯然是由於可變裂解)亦以次要物種存在。在這些主要及次要物種之中，輕鏈包含β-羥基Asp⁶³和O-連接之己糖，以及10或11個Gla殘基。

質譜圖中亦出現兩個質量較大的區域，此兩者均對應於含有α同功型重鏈(終止於L³⁹⁸或K³⁹⁹)之完整FXa變異體蛋白的次要物種。一組這類物種進一步包含單一O-聚醣，而第二組進一步包含兩個O-聚醣轉譯後修飾體(分別在第5圖之中央和右邊)。

第5圖中明確指出之分配對應於其中輕鏈含有10個Gla殘基、β-羥基Asp⁶³和O-連接之葡萄糖的完整FXa變異體蛋白物種。頻譜中標記“*”之相鄰的峰代表含有11個Gla殘基，質量增加44.0Da之物種。

表2中列出從上述質譜鑑定之主要和次要物種，以及眾多從該質譜數據鑑定出之其他次要和微量物種。表2中，具有相同之觀察的M_r值，不能與表中之類似的同量異序同功型區分的物種被指示為“*”。不同物種之表觀豐度係根據來自質譜數據之相對峰強度而被指定分配為主要、次要和微量。標題為“O-聚醣”之列中列出表中所鑑定之多種FXa變異體蛋白物種的重鏈之糖基化狀態。如本文它處所討論者，輕鏈含有O-連接之己糖。在該表中，“0”表示重鏈中沒有O-連接之聚醣存在；“1+1NeuAc”表示存有一個核心-1單唾液酸化之O-聚醣；“1+1NeuAc-Gal”表示存有一個核心-1單唾液酸化之O-聚醣，其中該終端半乳糖(Gal)不存在；“1+2NeuAc”表示存有一個核心-1二唾液酸化之O-聚醣；“2+2NeuAc”表示存有兩個核心-1 O-聚醣，其中之一為經二唾液酸化或二者均為經單唾液酸化；“2+3NeuAc”表示存有兩個核心-1 O-聚醣，其中之一為經單唾液酸化，而另一為經二唾液酸化；“2+4NeuAc”表示存有兩個核心-1 O-聚醣，每一個均為經二唾液酸化。

實施例6：藉由質譜分析測定之還原及烷基化蛋白的結構異質性

為了確認上述分析，將純化之完整FXa變異體蛋白還原及烷基化，以排除鏈間和鏈內二硫鍵。然後，藉由RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析該分開之輕鏈和重鏈，以測定其胺基酸結構和轉譯後修飾體。

HPLC色層分析圖顯示於第6圖中，其中標記輕鏈和重鏈。重鏈之α和β同功型係以多重色層分析峰之形式洗提出。在色層分析圖中約48至50分鐘處的重鏈前不久觀察到有微量之γ物種(胺基酸K²⁸¹或R²⁸³後被截短之β重鏈)洗提出。

零電荷之輕鏈質譜顯示於第7A圖中且從頻譜中鑑定之物種(包括其相對豐度為主要、次要或微量者)列於下表3中。胺基酸編號係根據第1A圖(SEQ ID NO：1)。¹ANS...LER¹³⁹對應於SEQ ID NO：6；¹ANS...ERR¹⁴⁰對應於SEQ ID NO：7；¹ANS...RRK¹⁴¹對應於SEQ ID NO：9；¹ANS...RKR¹⁴²對應於SEQ ID NO：11；且¹ANS...KRR¹⁴³對應於SEQ ID NO：12。

從完整FXa變異體蛋白可以看出，所有輕鏈物種均可觀察到包含β-羥基化之Asp⁶³及O-連接之己糖。然而，Gla結構域中之麩胺酸羧基化和PACE裂解為可變的，產生具有9、10或11個Gla殘基及由PACE位點處之不均勻的裂解所產生之羧基端異質性的輕鏈物種。

零電荷之重鏈質譜示於第7B圖中且從頻譜中鑑定之多種物種(包括其相對豐度為主要、次要或微量者)列於下表4中。胺基酸編號係根據第1A圖(SEQ ID NO：1)。¹⁴⁶LVG...LPK³⁸⁴對應於SEQ ID NO：45；¹⁴⁶LVG...KAK³⁸⁶對應於SEQ ID NO：46；¹⁴⁶LVG...SPL³⁹⁸對應於SEQ ID NO：14；且¹⁴⁶LVG...PLK³⁹⁹對應於SEQ ID NO：3。

在質譜中，觀察到之重鏈為對應於β和α同功型之三個主要區域。觀察到之最豐富的重鏈同功型的M_r(27683.9道耳吞)與全部9個半胱胺酸殘基均被烷基化的β重鏈同功型之理論質量(27684.3道耳吞；¹⁴⁶LVG...KAK³⁸⁶)相當。額外之質量異質性係由於α同功型之羧基端殘基及O-糖基化中的變化。具體地說，某些峰對應於終止於L³⁹⁸或K³⁹⁹之α同功型，而其他峰對應於帶有一或兩個核心-1 O-聚醣之重鏈，該一或兩個核心-1 O-聚醣可變化為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化。在第7B圖中，出現“*”表示該與藉由FXa變異體蛋白之肽圖譜觀察到的峰相一致之重鏈被過烷基化(參見實施例3)。

在還原和烷基化反應後在輕鏈和重鏈中所觀察到之結構異質性與使用完整FXa變異體蛋白所觀察到之結果相一致。

以PAWS軟體(2000年6月8日，Genomic Solutions，密西根州Ann Arbor)計算理論質量。觀察到之質量係在以Waters MaxEnt-1軟體將多電荷數據去卷積後從零電荷質譜測定。理論和觀測之主要和次要質量值之間的相對誤差均少於60ppm，此與用於完整糖蛋白分析之Waters Q-ToF質譜儀的性能規格一致。主要、次要及微量物種的分配係根據各別峰之強度，此與同功型豐度相關。

實施例7：體外凝血分析

使用缺乏第VIII因子之人血漿作為受質，利用一段式凝血分析測定七種不同之FXa變異體蛋白製劑的凝血活性(APTT分析)。將凝血活性(毫克/毫升)除以蛋白濃度(毫克/毫升)來測定比活性。各製劑間之平均凝血活性為1.52毫克/毫升，標準差為0.09。平均比活性為101.3%，標準差為5.9。

本發明並不受限在本文所描述之實施態樣的範圍內。的確，除了本文所描述者外，熟習本技藝之人士從前文之描述和附圖可清楚明白本揭示內容之多種修改。這類修改意欲落在所附之申請專利範圍內。

本文中列出多種參考資料，包括專利申請案、專利及技術刊物。這類參考資料之各揭示內容的全文以引用方式併入本文中。

<110> Pfizer Inc.

<120> 包含重組人凝血因子Xa蛋白之異質體之組成物

<130> PC72049

<150> US 61/881,834

<151> 2013-09-24

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 1

<210> 2

<211> 145

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 2

<210> 3

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 3

<210> 4

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 4

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PACE位點

<400> 5

<210> 6

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 6

<210> 7

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白水解片段

<400> 8

<210> 9

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 9

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白水解片段

<400> 10

<210> 11

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 11

<210> 12

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 12

<210> 13

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 13

<210> 14

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 14

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<220>

<221> misc_特性

<222> (6)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<220>

<221> misc_特性

<222> (7)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 17

<210> 18

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 19

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 21

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 22

<210> 23

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 23

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 24

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 25

<210> 26

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 26

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 27

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 28

<210> 29

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 29

<210> 30

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 30

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 31

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 32

<210> 33

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 33

<210> 34

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 34

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 35

<210> 36

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 36

<210> 37

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 37

<210> 38

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 38

<210> 39

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 39

<210> 40

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 40

<210> 41

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 41

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 42

<210> 43

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 43

<210> 44

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 44

<210> 45

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 45

<210> 46

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修改之人蛋白質序列

<400> 46

Claims

一種組成物，其包含至少一種選自由下列所組成之群組的FXa變異體蛋白之β型：其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139及146至386所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140及146至384所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140及146至386所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141及146至384所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141及146至386所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142及146至384所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142及146至386所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至143及146至384所組成的FXa變異體蛋白，及其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至143及146至386所組成的FXa變異體蛋白。
一種組成物，其包含至少一種選自由下列所組成之群組的FXa變異體蛋白之α型：其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至139及146至398所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140及146至398所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至140及146至399所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141及146至398所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至141及146至399所組成的FXa變異體蛋白，其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142及146至398所組成的FXa變異體蛋白，及其中輕鏈及重鏈蛋白序列分別由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胺基酸1至142及146至399所組成的FXa變異體蛋白。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含β-羥基Asp⁶³、O-連接之己糖及9、10或11個Gla殘基。
如申請專利範圍第3項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含9個Gla殘基。
如申請專利範圍第3項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含10個Gla殘基。
如申請專利範圍第3項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含11個Gla殘基。
如申請專利範圍第2項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含β羥基Asp⁶³、O-連接之己糖及9、10或11個Gla殘基。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含9個Gla殘基。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含10個Gla殘基。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該蛋白之輕鏈係經修改以包含11個Gla殘基。
如申請專利範圍第2項之組成物，其中該蛋白之重鏈係經修改以包含一個核心-1 O-連接之聚醣。
如申請專利範圍第11項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化。
如申請專利範圍第12項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化。
如申請專利範圍第12項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為經單唾液酸化。
如申請專利範圍第12項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為經二唾液酸化。
如申請專利範圍第2項之組成物，其中該蛋白貿之重鏈係經修改以包含兩個核心-1 O-連接之聚醣。
如申請專利範圍第16項之組成物，其中該兩個核心-1 O-連接之聚醣的第一者為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化。
如申請專利範圍第17項之組成物，其中該第一核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化。
如申請專利範圍第17項之組成物，其中該第一核心-1 O-連接之聚醣為經單唾液酸化。
如申請專利範圍第17項之組成物，其中該第一核心-1 O-連接之聚醣為經二唾液酸化。
如申請專利範圍第16項之組成物，其中該兩個核心-1 O-連接之聚醣的第二者為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化。
如申請專利範圍第21項之組成物，其中該第二核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化。
如申請專利範圍第21項之組成物，其中該第二核心-1 O-連接之聚醣為經單唾液酸化。
如申請專利範圍第21項之組成物，其中該第二核心-1 O-連接之聚醣為經二唾液酸化。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該蛋白之重鏈係經修改以包含一個核心-1 O-連接之聚醣。
如申請專利範圍第25項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化。
如申請專利範圍第26項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化。
如申請專利範圍第26項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為經單唾液酸化。
如申請專利範圍第26項之組成物，其中該核心-1 O-連接之聚醣為經二唾液酸化。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該蛋白之重鏈係經修改以包含兩個核心-1 O-連接之聚醣。
如申請專利範圍第30項之組成物，其中該兩個核心-1 O-連接之聚醣的第一者為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化。
如申請專利範圍第31項之組成物，其中該第一核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化。
如申請專利範圍第31項之組成物，其中該第一核心-1 O-連接之聚醣為經單唾液酸化。
如申請專利範圍第31項之組成物，其中該第一核心-1 O-連接之聚醣為經二唾液酸化。
如申請專利範圍第30項之組成物，其中該兩個核心-1 O-連接之聚醣的第二者為未經唾液酸化、經單唾液酸化或經二唾液酸化。
如申請專利範圍第35項之組成物，其中該第二核心-1 O-連接之聚醣為未經唾液酸化。
如申請專利範圍第35項之組成物，其中該第二核心-1 O-連接之聚醣為經單唾液酸化。
如申請專利範圍第35項之組成物，其中該第二核心-1 O-連接之聚醣為經二唾液酸化。
一種包含FXa變異體蛋白之組成物，其中該FXa變異體蛋白係選自表2所列之FXa變異體蛋白物種之群組。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少5個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少10個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少15個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少20個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少25個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少30個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少35個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少40個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少45個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少50個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少55個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物包含至少60個表2所列之FXa變異體蛋白物種。
一種包含FXa變異體蛋白之組成物，其中該FXa變異體蛋白之輕鏈係選自表3所列之輕鏈物種的群組。
如申請專利範圍第52項之組成物，其中該FXa變異體蛋白之重鏈係選自表4所列之重鏈物種的群組。
一種如申請專利範圍第1、2、39及52項中任一項之組成物於製備使個體止血之藥物之用途。
如申請專利範圍第54項之用途，其中該個體患有A型血友病。
如申請專利範圍第54項之用途，其中該個體患有B型血友病。
如申請專利範圍第54項之用途，其中該個體具有外傷。
一種用於純化因子Xa(FXa)變異體蛋白之方法，其包含下述步驟：(i)將混合模式色層分析(MMC)介質與含有FXa變異體蛋白之經過濾的細胞培養基接觸，(ii)洗提出與該MMC色層分析介質結合之FXa變異體蛋白，(iii)將陰離子交換色層分析介質與步驟(ii)中洗提出之FXa變異體蛋白接觸，(iv)洗提出與該陰離子交換色層分析介質結合之FXa變異體蛋白，(v)將步驟(iv)中洗提出之FXa變異體蛋白與陽離子交換色層分析介質接觸；及(vi)洗提出與該陽離子交換色層分析介質結合之FXa變異體蛋白。
如申請專利範圍第58項之方法，其中該混合模式色層分析介質能夠經由靜電交互作用、疏水性交互作用、氫鍵結及親硫交互作用與該蛋白交互作用。
如申請專利範圍第58項之方法，其進一步包含至少一個將病毒去活化或移除的額外步驟。
如申請專利範圍第58項之方法，其中該混合模式色層分析介質為Capto MMC，該陰離子交換色層分析介質為Q-Sepharose Fast Flow，且該陽離子交換色層分析介質為Fractogel®SO₃ ^-。
如申請專利範圍第60項之方法，其進一步包含超濾及滲濾的步驟以濃縮該經純化之FXa變異體蛋白。