CN109913477A

CN109913477A - 能够表达传染性法氏囊病病毒的vp2基因及其重组大肠杆菌

Info

Publication number: CN109913477A
Application number: CN201910270876.0A
Authority: CN
Inventors: 欧阳伟; 王永山; 王晓丽; 钱晶; 夏兴霞; 王晶宇; 诸玉梅; 马孙婷
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2019-06-21

Abstract

本发明涉及一种能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因及其重组大肠杆菌，属于生物技术领域。设计IBDV VP2基因，克隆入原核表达载体pET‑28a(+)中重组VP2蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得了高效表达。用纯化的重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA与IDEXX‑ELISA(IBDV)及中和试验同时检测96份临床血清样本，重组VP2蛋白建立的IBDV抗体ELISA检测方法和IDEXX‑ELISA(IBDV)的特异性分别为91.9％和25.8％，符合率分别为93.8％和52.1％。表明本发明用于研制IBDV抗体检测试剂盒，具有巨大的生产应用价值。

Description

能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因及其重组大肠杆菌

一、技术领域

本发明涉及一种能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因及其重组大肠杆菌，属于生物技术领域。

二、背景技术

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害幼禽法氏囊为主要特征的传染病，该病是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。该病不仅引起患病动物死亡，而且还导致机体免疫抑制，使机体的免疫防御能力降低和对多种疫苗免疫接种失败。对易感鸡群实施疫苗接种是预防该病最有效的方法，但由于各地流行的IBDV毒株的毒力与抗原性的差异，每年由于IBD免疫失败或免疫抑制造成的经济损失巨大。鉴于此，进一步分析当前IBDV的分子流行病学，研制经济快捷的检测方法仍是当前IBD防控工作中亟待解决的重要课题。

检测鸡IBDV抗体的主要方法有：中和试验、琼扩、IFA及间接ELISA。中和试验虽然是评价鸡群抗体的金标准，但因其操作繁琐，耗时较长，且需要培养细胞，不适合普通养殖场的使用。琼扩实验虽然操作不复杂，但不够灵敏且耗时较长，达不到快速和灵敏的目的。IFA操作也比较繁琐，需要培养细胞，且观察需要用的荧光显微镜价格昂贵。而ELISA具备特异、简便、快速的特点。因此，目前普遍使用间接EILSA来评价鸡群内的IBDV抗体水平。但现有的商品化IBDV抗体ELISA检测试剂盒价格昂贵，不利于推广应用；国产的IBDV试剂盒其包被抗原为纯化的IBDV全病毒，而IBDV全病毒的培养需要细胞或者鸡，培养成本较高，且IBDV纯化需要比较昂贵的超速离心机，耗时较长。

因此，亟需研制一种新的包被抗原来替代来传统的IBDV包被抗原。原核表达系统因其表达外源蛋白产量高，成本低，生产方便，常用来表达外源蛋白。但IBDV VP2基因稀有密码子较多，且VP2蛋白对大肠杆菌有毒性，全长表达一直比较难，即使能表达，其表达量也比较低。虽然现在已有研究人员用原核表达系统对IBDV VP2基因进行了表达，但表达量较低，因此，需进行改进。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是针对IBDV VP2基因稀有密码子较多，且VP2蛋白对大肠杆菌有毒性，全长表达一直比较难，即使能表达，其表达量也比较低的难题，基于大肠杆菌对密码子的偏爱性，利用生物信息学和全基因合成技术对IBDV VP2基因优化设计及合成，并通过大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)进行表达，使IBDV重组VP2蛋白的获得更加简易、高效和经济，可用于IBDV抗体检测试剂盒研制和疫苗生产中的应用。

技术方案

本发明设计了一种能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因，其序列为：SEQ.ID.NO.1。

含有所述表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因的重组大肠杆菌。其制备方法为：

全基因合成权利要求1所述表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因，定向克隆入原核表达载体pET-28a(+)中，构建原核表达质粒pET28-VP2，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)获得。

所述表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因可以在IBDV抗体检测试剂盒和疫苗生产中得到应用。

所述的表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因重组大肠杆菌可以在IBDV抗体检测试剂盒和疫苗生产中得到应用。

有益效果本发明的特点和优点如下：

1、本发明针对IBDV VP2基因稀有密码子较多，且VP2蛋白对大肠杆菌有毒性，全长表达一直比较难，即使能表达，其表达量也比较低的难题，基于大肠杆菌对密码子的偏爱性，利用生物信息学和全基因合成技术对IBDV VP2基因进行优化设计及合成，并能够通过大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)进行表达。

2、本发明根据GenBank已登录的IBDV VP2序列和大肠杆菌密码子的偏爱性优化设计VP2基因，全基因合成，定向克隆入原核表达载体pET-28a(+)中，构建原核表达质粒pET28+VP2，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；经IPTG诱导后，经SDS-PAGE分析，重组VP2蛋白的分子量约为50kDa。用重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验同时检测96份临床样本，结果：重组VP2蛋白建立的IBDV抗体ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较，相对敏感性分别为97.1％和100％；相对特异性分别为91.9％和25.8％；符合率分别为93.8％和52.1％。

3、本发明构建的一株表达传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的大肠杆菌，可用于IBDV抗体检测试剂盒研制和疫苗生产中的应用。用于IBDV抗体检测试剂盒的研制，更加简易、高效和经济，具有巨大的生产应用价值。

四、附图说明

图1 VP2基因(SEQ.ID.NO.1)的优化设计

图2 双酶切分析重组质粒pET28-VP2

图3 12％SDS-PAGE分析VP2蛋白在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)₃中的表达

图4 Western blot分析IBDV VP2蛋白的表达(一抗为His单抗)

图5 Western blot分析IBDV VP2蛋白的表达(一抗为IBDV高免血清)

五、具体实施方式

1主要实验材料

E.coli Rosetta(DE)₃感受态细胞购自上海唯地生物科技有限公司；质粒纯化试剂盒购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自全式金生物科技有限公司；限制性内切酶均购自TaKaRa公司。

2实验方法

1.1 IBDV VP2基因在大肠杆菌中的表达

1.1.1 IBDV VP2基因密码子的优化

本发明针对IBDV VP2基因稀有密码子较多，且VP2蛋白对大肠杆菌有毒性，全长表达一直比较难，即使能表达，其表达量也比较低的难题，基于大肠杆菌对密码子的偏爱性，利用生物信息学和全基因合成技术对IBDV VP2基因优化设计及合成，根据GenBank已登录的IBDV VP2序列(EU417824.1)和大肠杆菌密码子的偏爱性优化设计VP2基因，将VP2基因的ATG去掉，使其融合pET28a(+)上的His标签，在大肠杆菌中进行融合表达。

1.1.2 IBDV VP2基因重组表达质粒的构建

将优化设计的VP2基因，全基因合成，在其5′端和3′端添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，优化设计的VP2基因由通用生物系统(安徽)有限公司合成(图1，下划线为优化的碱基)，并克隆于原核表达载体pET28a(+)中。用XhoI和MluI双酶切鉴定，并进行测序分析。获得的重组质粒命名为pET28-VP2。

经XhoI和MluI双酶切，用含EB的1％琼脂糖凝胶电泳分析，可见2条长度分别约4.0Kb和2.5Kb的DNA片段，与pET28a(+)和VP2基因片段的理论值相符合(图2)。

1.1.3 IBDV VP2基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒pET28-VP2(4-1350)转化E.coli Rosetta(DE)₃感受态细胞，涂布在用LB配制的1.5％琼脂平皿上，37℃培养14h，挑单菌落接种入LB，振摇培养14h。次日以1％的量分别接种LB培养基(含卡拉霉素100μg/ml)中，振荡培养，在A₆₀₀值为0.8时，分别加入终浓度为1.0mM的IPTG，分别诱导4h。取诱导的细菌培养物，5000g离心5min，用12％SDS-PAGE分析菌体中VP2片段的表达情况。试验同步设立pET28a(+)空质粒转化的E.coli Rosetta(DE)₃为对照。

经12％SDS-PAGE电泳，pET28-VP2转化E.coli Rosetta(DE)₃在分子量约50kDa处有一条目的蛋白带，而pET28a(+)转化的E.coli Rosetta(DE₃)则无50kDa大小的蛋白带。

1.1.4 Western blot分析IBDV VP2蛋白的表达水平

将诱导表达的3ml重组菌5000g离心10min，去除上清液，加入160μL去离子水重悬，再加入40μL5×SDS-Loading Buffer，按常规方法进行12％分离胶和5％浓缩胶的SDS-PAGE电泳分析，转印到硝酸纤维素膜上，转印完毕后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，然后用一抗(His单抗或鸡抗IBDV高免血清)、二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG抗体或HRP标记的兔抗鸡IgG抗体)分别与之作用，DAB底物显色，观察特异蛋白条带。试验同步设立空质粒pET28a(+)转化的E.coli Rosetta(DE₃)为对照。

经12％SDS-PAGE电泳、转印和DAB显色后，重组VP2蛋白可与His单抗(图4)或鸡抗IBDV高免血清(图5)在分子量约50kDa处有一条目的蛋白带，而pET28a(+)转化的E.coliRosetta(DE₃)则无50kDa大小的蛋白带。

1.2 IBDV抗体间接ELISA检测方法的建立

1.2.1 IBDV VP2最佳包被浓度的确定

将大肠杆菌表达的重组VP2蛋白经HisTrap HP亲和层析柱纯化。将纯化的VP2重组蛋白用包被液按照1-10μg/ml。加入到酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，用封闭液(含10％FBS的PBST)满孔封闭，37℃，2h，PBST洗涤3次，每次3min，拍干；加入不同稀释度的阳性血清(1:100-1:12800)，100μL/孔，37℃，2h，PBST洗涤3次，每次3min，拍干；加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃，1h，PBST洗涤5次，每次5min，拍干；显色。根据酶标仪测定的数据，确定重组VP2的最佳包被浓度为1μg/ml。

1.2.2 IBDV抗体间接ELISA与中和试验的相关性

间接ELISA:

将纯化的重组VP2蛋白用包被液按照1μg/ml的倍数稀释。加入到酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，用封闭液(含10％FBS的PBST)满孔封闭，37℃，2h，PBST洗涤3次，每次3min，拍干；加入1:500稀释的临床样本(96份)，100μL/孔，37℃，2h，PBST洗涤3次，每次3min，拍干；加入1:1000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG，100μL/孔，37℃，1h，PBST洗涤5次，每次5min，拍干；显色。同时将稀释好的临床血清样品用IDEXX的IBDV抗体间接ELISA试剂盒进行检测。

中和试验：

将96份临床样本分别从1∶2开始进行2倍比连续稀释，稀释到1:64；各取100μL，分别与等体积的IBDV B87细胞适应毒稀释物(病毒含量200TCID50/0.1mL)混合，置37℃反应1h，接种于含有DF-1单层的96孔培养板中，100μL/孔(病毒含量100TCID50/孔)，每份待检血清设4个重复；同时设立病毒对照、阳性血清对照、阴性血清对照、细胞对照。置37℃、5％CO2培养，每天观察病变，记录结果，按Reed-Muench法计算出每个血清样品的病毒中和抗体效价，根据国标GB/T19167-2003，中和效价>1:32则判断为阳性，反之则判断为阴性。

结果：用重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验同时检测96份临床样本，结果：重组VP2蛋白建立的IBDV抗体ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较，相对敏感性分别为97.1％和100％；相对特异性分别为91.9％和25.8％；符合率分别为93.8％和52.1％。具体结果如下(表1和2)。

表1 rVP2(1-600)-ELISA与中和试验的比较

相对敏感性：33/34×100％＝97.1％；

相对特异性：57/62×100％＝91.9％；

符合率：(33+57)/96×100％＝93.8％

表2 IDEXX-ELISA与中和试验的比较

相对敏感性：34/34×100％＝100％；

相对特异性：16/62×100％＝25.8％；

符合率：(34+16)/96×100％＝52.1％。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因及其重组大肠杆菌

<141> 2019-04-04

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctaatctgc aggatcagac ccagcagatt gtgccgttta ttcgtagtct gctgatgccg 60

accaccggcc cggccagtat tccggatgat accctggaaa aacataccct gcgcagcgaa 120

accagtacct ataatctgac cgttggtgac accggcagcg gcctgattgt tttctttccg 180

ggctttccgg gcagtattgt tggtgcacat tataccctgc agagcaatgg caattatgaa 240

tttgatcaga tgctgctgac cgcccagaat ctgccggcca gctataatta ttgccgtctg 300

gttagtcgca gtctgaccgt tcgtagcagc accctgccgg gtggtgtgta tgcactgaat 360

ggtaccatta atgcagtgac ctttcagggt agcctgagtg aactgaccga tgtgagttat 420

aatggtctga tgagtgcaac cgccaatatt aatgataaaa ttggcaatgt gctggttggt 480

gaaggcgtga ccgttctgag tctgccgacc agctatgatc tgggttatgt gcgtctgggc 540

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cgtccgcgcg tgtataccat taccgcagca gatgattatc agtttagcag ccagtatcag 660

gcaggcggcg tgaccattac cctgtttagc gccaatattg atgcaattac cagtctgagc 720

attggcggcg aactggtttt tcagaccagt gtgcagggcc tgattctggg tgcaaccatc 780

tatctgattg gctttgatgg caccgccgtg attacccgcg ccgttgcagc cgataatggc 840

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ggcgatcaga tgagttggag cgccagtggc agcctggccg ttaccattca tggtggtaat 1020

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gtggttaccg ttgccggtgt gagcaatttt gaactgattc cgaatccgga actggcaaaa 1140

aatctggtta ccgaatatgg tcgttttgat ccgggcgcaa tgaattatac caaactgatt 1200

ctgagcgaac gcgatcgtct gggcattaag accgtttggc cgacccgcga atataccgat 1260

tttcgcgaat attttatgga agtggcagat ctgaatagcc cgctgaaaat tgcaggcgca 1320

tttggtttta aagatattat tcgcgcc 1347

Claims

1.一种能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因，其序列为：SEQ.ID.NO.1。

2.含有权利要求1所述能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因的重组大肠杆菌。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其制备方法为：

4.权利要求1所述表达传染性法氏囊病病毒VP2基因在IBDV抗体检测试剂盒或疫苗生产中的应用。

5.权利要求2或3所述的的重组大肠杆菌在IBDV抗体检测试剂盒或疫苗生产中的应用。