JP2005192409A - 体毛からrnaを抽出するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 体毛、特に毛髪からRNAを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収する方法の提供。
【解決手段】 哺乳動物や鳥類などの体毛からRNAを抽出するための方法であって、体毛を抜去してから直ちに液体窒素を用いて超低温に凍結し、次いでチオシアン酸グアニジンなどを含有するフェノールが用いられる、RNA抽出用試薬液と接触させ、しかる後にボルテックス攪拌処理することから成る、体毛からRNAを抽出する方法の提供。
【選択図】図1
【解決手段】 哺乳動物や鳥類などの体毛からRNAを抽出するための方法であって、体毛を抜去してから直ちに液体窒素を用いて超低温に凍結し、次いでチオシアン酸グアニジンなどを含有するフェノールが用いられる、RNA抽出用試薬液と接触させ、しかる後にボルテックス攪拌処理することから成る、体毛からRNAを抽出する方法の提供。
【選択図】図1
Description
本発明は、体毛からRNAを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収する方法を提供する。
生体組織からRNAを抽出する場合、組織を界面活性剤処理、酵素処理、超音波処理、物理的破壊、凍結破砕などにより破砕してから、RNase阻害剤などを含むRNA抽出試薬液中で抽出操作が行われる。毛髪や骨のような強固な構造をもった組織からの抽出の場合、細胞の破砕自体が困難であり、RNAの回収率は一般に低い。
毛髪からのRNAの抽出は、例えば毛髪をRNA抽出試薬液中に入れ、室温にてホモジナイザーで破砕し、その後ボルテックス処理にかける操作が行われている(特開2000-300298)。骨等の硬質組織からのRNAの抽出は、例えば液体窒素などの超低温環境において加圧容器及びプランジャーを用いて組織を押し潰すことで破砕し、RNA抽出試薬液に移して抽出工程にかけるなどされている。前者のようにしても、毛髪の強固な構造のため、RNAの回収率は十分ではない。超低温環境での押し潰し破砕を頼りとする後者の場合、硬質組織が十分に破砕され、RNAが比較的高収率で獲得できるが、細胞塊がプランジャー(チューブ側)に付着するため、回収の操作が面倒であるといった欠点がある。従って、毛髪などの強固な構造を有する組織からのRNAのより効率的な抽出方法の出現が所望される。
本発明は、体毛からRNAを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収する方法の提供を課題とする。
本発明者は驚くべきことに、体毛を抜去してから直ちに液体窒素などで超低温凍結後、RNA抽出用試薬液に入れ、次いでボルテックス処理するといった簡単な操作でRNAを高収率で回収できることを見出した。体毛は比較的強固な構造を有する組織であるため、凍結してから単にボルテックス処理にかけるだけでRNAを高収率で抽出できることは驚くべき事実である。
従って、本発明は、体毛からRNAを抽出するための方法であって、体毛を抜去してから直ちに凍結し、次いでRNA抽出用試薬液と接触させ、しかる後ボルテックス処理してRNAを抽出することをから成る方法を提供する。
本発明に従い、体毛、特に毛髪からRNAを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収することができる。
本発明は体毛からRNAを効率よく回収する方法を提供する。
体毛は、哺乳動物、例えばヒト、サルなどの霊長類の他、ウシなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、イヌ、ネコなどの食肉類、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類などといった如何なる動物の体毛であってもよい。さらには、体毛は鳥類の羽毛であってもよい。特に好ましくは、体毛はヒトの毛髪である。
体毛は、哺乳動物、例えばヒト、サルなどの霊長類の他、ウシなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、イヌ、ネコなどの食肉類、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類などといった如何なる動物の体毛であってもよい。さらには、体毛は鳥類の羽毛であってもよい。特に好ましくは、体毛はヒトの毛髪である。
本発明においては、RNA抽出にかける体毛を抜去してから直ちに凍結しておく。抜去してから凍結するまでの時間は、RNAの分解を最小限に抑えるために可能な限り短いのがよく、好ましくは抜去してから30秒以内、より好ましくは10秒以内に凍結させる。凍結は、好ましくは液体窒素やドライアイスなどを用いて、あるいはディープフリーザー、例えば設定温度が−30℃以下のディープフリーザーを用いて行う。特に好ましくは、凍結は液体窒素を用いて行う。次に、その凍結した体毛をRNA抽出用試薬に入れ、ボルテックスミキサーで攪拌し、抽出操作を行う。
RNA抽出用試薬としては、好ましくは一般によく使用されるRNA抽出用試薬、好ましくはRNase阻害剤、例えばチオシアン酸グアニジンなどのグアニジン系試薬を含有するフェノールが用いられる。特に好ましいRNA抽出用試薬はニッポンジーン社より製品名「ISOGEN」で市販されているものである。
ボルテックスミキサーによる攪拌処理は、1,500〜5,000rpm、より好ましくは2,000〜4,000rpm、最も好ましくは約2,500rpmの回転数において、例えば0.5〜2分、好ましくは約1分かけて行うのことが好ましい。攪拌は室温で行ってよく、必要であれば低温、例えば2〜10℃で行ってもよい。ボルテックスミキサーとしては市販のもの、例えばアズワン(株)HM−1OHが使用できる。
好適な態様においては、上記のようにして調製したRNA含有試料を例えば以下のようにして更に処理し、RNAを高純度で含む試料を調整する。
上記RNA含有試料に好ましくはクロロフォルムを加えて再度ボルテックスミキサーを用い攪拌処理を行い、遠心分離(例えば15,000rpm、15分間)し、RNAを含む水相を回収する。回収した溶液に、例えば酢酸ナトリウムとニッポンジーン社製のエタ沈メイトを添加して十分に攪拌し、さらにイソプロパノールを加えて攪拌し、遠心分離(例えば15,000rpm、20分間)し、全RNAを沈殿させる。上清を捨てた後にエタノール(例えば75%エタノール)を加え、再び遠心分離する。上清を捨てて沈殿を風乾させ、nuclease free waterに溶解させる。最後に、DNaseI処理により混在するゲノムDNAを除去し、再度エタノール沈殿により全RNAを回収して、nuclease free waterに溶解させる。
上記RNA含有試料に好ましくはクロロフォルムを加えて再度ボルテックスミキサーを用い攪拌処理を行い、遠心分離(例えば15,000rpm、15分間)し、RNAを含む水相を回収する。回収した溶液に、例えば酢酸ナトリウムとニッポンジーン社製のエタ沈メイトを添加して十分に攪拌し、さらにイソプロパノールを加えて攪拌し、遠心分離(例えば15,000rpm、20分間)し、全RNAを沈殿させる。上清を捨てた後にエタノール(例えば75%エタノール)を加え、再び遠心分離する。上清を捨てて沈殿を風乾させ、nuclease free waterに溶解させる。最後に、DNaseI処理により混在するゲノムDNAを除去し、再度エタノール沈殿により全RNAを回収して、nuclease free waterに溶解させる。
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
実験1:抜去毛髪検体からのtotal RNA 調製法
1)ボルテックスミキサーによるtotal RNAの調製(本発明に係る「液体窒素−ボルテックス法」)
毛髪を抜去してから直ちに(10秒以内に)液体窒素中で凍結し、直ちにRNA抽出液ISOGEN(ニッポンジーン)1mlの入った1.5mlチューブに入れ、ボルテックスミキサー(アズワン製)を用い、室温(約25℃)にて回転数2,500rpmで1分間攪拌を行った。これをRNA粗調製品1とした。
1)ボルテックスミキサーによるtotal RNAの調製(本発明に係る「液体窒素−ボルテックス法」)
毛髪を抜去してから直ちに(10秒以内に)液体窒素中で凍結し、直ちにRNA抽出液ISOGEN(ニッポンジーン)1mlの入った1.5mlチューブに入れ、ボルテックスミキサー(アズワン製)を用い、室温(約25℃)にて回転数2,500rpmで1分間攪拌を行った。これをRNA粗調製品1とした。
2)ガラスホモジナイザーによるtotal RNAの調製(「液体窒素−ガラスホモジナイザー法」)
毛髪を抜去してから直ちに(10秒以内)液体窒素中で凍結し、RNA抽出液ISOGEN 1mlに移し入れ、ガラスマイクロホモジナイザー(Wheaton社製;容量0.1ml)を用い、氷上にて手作業により可能な限り細かくホモジナイズした。これをRNA粗調製品2とした。
毛髪を抜去してから直ちに(10秒以内)液体窒素中で凍結し、RNA抽出液ISOGEN 1mlに移し入れ、ガラスマイクロホモジナイザー(Wheaton社製;容量0.1ml)を用い、氷上にて手作業により可能な限り細かくホモジナイズした。これをRNA粗調製品2とした。
3)クライオプレスによるtotal RNAの調整(クライオプレス法)
クライオプレス(マイクロテック・ニチオン社製)のマイクロチューブ用プレスセルを液体窒素で冷却し、さらに2.0mlマイクロチューブを装着してその内部に液体窒素を入れ、抜去した毛髪を直ちに(抜去してから10秒以内)この中で凍結した。マイクロチューブ用のプランジャーを付けて、上からエアコンプレッサーの圧力0.4MPaを加えて毛髪を粉砕した。プランジャーをRNA抽出液ISOGEN 1mlの入った50mlチューブに移して、プランジャーに付着したサンプルを回収した。抽出液が融解した後1.5mlチューブに移し、ボルテックスミキサー(アズワン社製)にて十分に攪拌して溶解させた。セルに付着したサンプルはスパチュラにて掻きとり、1.5mlチューブ中のRNA抽出液ISOGEN1mlに分散させ、ボルテックスミキサー(アズワン社製)を用い、室温(約25℃)にて回転数2,500rpmで1分間攪拌を行った。これをRNA粗調製品3とした。
クライオプレス(マイクロテック・ニチオン社製)のマイクロチューブ用プレスセルを液体窒素で冷却し、さらに2.0mlマイクロチューブを装着してその内部に液体窒素を入れ、抜去した毛髪を直ちに(抜去してから10秒以内)この中で凍結した。マイクロチューブ用のプランジャーを付けて、上からエアコンプレッサーの圧力0.4MPaを加えて毛髪を粉砕した。プランジャーをRNA抽出液ISOGEN 1mlの入った50mlチューブに移して、プランジャーに付着したサンプルを回収した。抽出液が融解した後1.5mlチューブに移し、ボルテックスミキサー(アズワン社製)にて十分に攪拌して溶解させた。セルに付着したサンプルはスパチュラにて掻きとり、1.5mlチューブ中のRNA抽出液ISOGEN1mlに分散させ、ボルテックスミキサー(アズワン社製)を用い、室温(約25℃)にて回転数2,500rpmで1分間攪拌を行った。これをRNA粗調製品3とした。
実験2:total RNAの調製
上記RNA調製品1〜3(1ml)それぞれにクロロフォルム200μlを加えて再度ボルテックスミキサーを用い、室温(約25℃)にて回転数2,500rpmで1分間攪拌を行ったに、小型微量遠心分離機により遠心分離(15,000rpm、15分間)し、RNAを含む水相約500μlを回収した。回収した溶液に50μlの3M酢酸ナトリウムと1μlのエタ沈メイト(ニッポンジーン)を添加して十分に攪拌した。さらに1mlのイソプロパノールを加えて攪拌し、小型微量遠心分離機により遠心分離(15,000rpm、20分間)して、全RNAを沈殿させた。上清を捨てた後に75%エタノールを加え、再び小型微量遠心分離機により遠心分離(15,000rpm、10分間)した。上清を捨てて沈殿を風乾させ、20μlのnuclease free waterに溶解させた。NanoDrop(Technologies, Inc.)によりRNAの濃度と純度を測定した。
次に、DNaseI処理により混在するゲノムDNAを除去し、再度エタノール沈殿により全RNAを回収して、20μlのnuclease free waterに溶解させた。NanoDropによりRNAの濃度を測定した。
上記RNA調製品1〜3(1ml)それぞれにクロロフォルム200μlを加えて再度ボルテックスミキサーを用い、室温(約25℃)にて回転数2,500rpmで1分間攪拌を行ったに、小型微量遠心分離機により遠心分離(15,000rpm、15分間)し、RNAを含む水相約500μlを回収した。回収した溶液に50μlの3M酢酸ナトリウムと1μlのエタ沈メイト(ニッポンジーン)を添加して十分に攪拌した。さらに1mlのイソプロパノールを加えて攪拌し、小型微量遠心分離機により遠心分離(15,000rpm、20分間)して、全RNAを沈殿させた。上清を捨てた後に75%エタノールを加え、再び小型微量遠心分離機により遠心分離(15,000rpm、10分間)した。上清を捨てて沈殿を風乾させ、20μlのnuclease free waterに溶解させた。NanoDrop(Technologies, Inc.)によりRNAの濃度と純度を測定した。
次に、DNaseI処理により混在するゲノムDNAを除去し、再度エタノール沈殿により全RNAを回収して、20μlのnuclease free waterに溶解させた。NanoDropによりRNAの濃度を測定した。
図1は、各試料中のRNAの絶対量(ng/μl)及びRNAの純度を示す。RNAの純度は、260nm/280nmの紫外線吸収の比を求めることにより算出した。この比が「2」に近いほど、RNAの純度は高いことを示す(ラボマニュアル遺伝子工学増補版 村松正實編199C、丸善(株)P34)。
図1から、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法により毛髪からRNAを抽出することで、液体窒素−ガラスホモジナイザー法やクライオプレス法と比べ、RNAを最も高収量且つ高純度で獲得できることが明らかとなった。特に興味深いことに、本発明の方法は、RNAの抽出法として一般に好適とされるクライオプレス法と比べ、RNAの収量の点でも、明らかに優れた結果を示した。従って、毛髪などの体毛からRNAを抽出する場合には、クライオプレスなどを使わず、単に体毛を抜去後すばやく凍結し、RNA抽出液中でボルテックス攪拌処理するだけでRNAを簡単な操作で高収量、高純度で獲得できることが判った。
図2は、抜去毛5本分について、上記と同様にし、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法(VT)又はクライオプレス法(CP)によりRNA抽出を行ってからDNase処理することで得たRNAの収量結果を、t−検定による統計学的分析結果と共に示す。この結果から、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法(VT)によるRNA抽出法は、クライオプレス法(CP)と比べ、RNAの収量において有意に優れることが明らかである。
図3は、同一人物由来の抜去毛5本の1本、1本について、上記と同様にし、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法によりRNA抽出を行ってからDNase処理することで得たRNAの収量結果を示す。この結果から、抜去毛それぞれから回収されるRNAの収量は概ね同等であることがわかる。従って、本発明に従えば、体毛、特に毛髪からのRNAの回収における操作間差も小さくなることがわかる。
本発明は、クライオプレス法や液体窒素−ガラスホモジナイザー法と比べ、簡単且つ高収量でのRNAの回収を可能とする。これにより、例えば体毛、特に毛髪が1本さえあれば、RNAを調製するのに十分とすることができるようになる。従って、本発明は体毛、特に毛髪からのmRNAの定量、定性が通常実施されるあらゆる産業、例えば臨床検査産業、医薬品産業、化粧品産業、獣医学・獣医薬産業、土壌・河川検査産業、法医学産業などにおいて利用可能である。
Claims (2)
- 体毛からRNAを抽出するための方法であって、体毛を抜去してから直ちに凍結し、次いでRNA抽出用試薬液と接触させ、しかる後にボルテックス攪拌処理してRNAを抽出することから成る方法。
- 体毛を抜去してから10秒以内に液体窒素で凍結される、請求項1記載の方法。
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