JP2018000206A - 核酸試料の調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
別の一態様において、本発明は、前記方法で調製した核酸を解析することを含む、核酸の解析方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、被験体の皮膚表上脂質の採取用具を含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製用キットを提供する。
一態様において、本発明は、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法を提供する。一実施形態において、本発明による被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法は、被験体から採取された皮膚表上脂質から核酸を分離することを含む。
本発明の方法により調製された被験体の皮膚細胞に由来する核酸は、核酸を用いる各種の解析または診断に使用することができる。したがって、本発明はまた、上記本発明による核酸の調製方法により調製した核酸を解析することを含む、核酸の解析方法を提供する。本発明により調製されたSSL中の核酸を用いて行うことができる解析や診断の例としては、以下が挙げられる:
(i)被験体の皮膚に関する遺伝子発現解析およびその他の遺伝子情報の解析、ならびにそれらの解析に基づく被験体の皮膚に関する機能解析、など;
(ii)被験体の皮膚状態の解析、例えば、皮膚の健康状態の評価もしくは将来予測、皮膚疾患の診断もしくは予後診断、皮膚外用剤の効能評価、皮膚ガンの診断もしくは予後診断、皮膚の微細変化の評価、など;
(iii)被験体の皮膚以外の部位または全身の状態の解析、例えば、全身的な健康状態の評価もしくは将来予測、および神経疾患、心血管疾患、代謝性疾患、ガン等の各種疾患の診断もしくは予後診断、など。
遺伝子発現解析
後述する実施例に示すとおり、SSLは、被験体由来のmRNA等の高分子量RNAを豊富に含んでいたが、一方、尿、血清、唾液、角層といった従来一般的に使用されている生体試料には、高分子量のRNAはほとんど存在していなかった(実施例1〜3)。SSLは、被験体から非侵襲的に採取することができるmRNAの供給源であり、遺伝子発現解析用の生体試料として有用である。さらに、SSL中のmRNAは、皮脂腺、毛包および表皮の遺伝子発現プロファイルを反映していることから(実施例4)、SSLは、皮膚、特に皮脂腺、毛包および表皮の遺伝子発現解析用の生体試料として好適である。
最近の報告によれば、ガン細胞で発現が変化するRNA群の中の約63%がタンパク質をコードするmRNAである(Cancer Res. 2016, 76, 216-226)。したがって、mRNAの発現状態を測定することにより、ガン等の疾患による細胞の生理状態の変化をより忠実に捉えることができ、より正確な身体状態の診断が可能になると考えられる。SSLは、mRNAを豊富に含んでおり、さらにガンとの関連性が報告されているSOD2のmRNAを含む(Physiol Genomics, 2003, 16, 29-37;Cancer Res, 2001, 61, 6082-6088)。したがって、SSLは、皮膚ガン等のガンの診断もしくは予後診断用の生体試料として有用である。
近年、細胞の遺伝子発現におけるmiRNA、lincRNA等のnon−coding(nc)RNAの関与が着目され、盛んに研究が進められている。また従来、尿や血清中のmiRNAを用いた非侵襲もしくは低侵襲的なガン等の診断方法が開発されている(例えば、Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105, 10513-10518;Urol Oncol, 2010, 28, 655-661)。SSLから調製されるmiRNA、lincRNA等のncRNAを、上記研究や診断のための試料に用いることができる。
SSLから調製した核酸を試料として、疾患もしくは状態の核酸マーカーのスクリーニングや検出を行うことができる。本明細書において、疾患もしくは状態の核酸マーカーとは、その発現が、所与の疾患もしくは状態の判定またはそのリスク判定のための指標となる核酸をいう。好ましくは、核酸マーカーはRNAマーカーであり、該RNAは、好ましくはmRNA、miRNA、もしくはlincRNAである。該核酸マーカーがターゲットとする疾患もしくは状態としては、例えば、各種皮膚疾患、皮膚の健康状態(光老化、乾燥、水分もしくは油分量、肌のハリ、くすみなど);ならびに、上記「病理学的診断」の項で述べた、皮膚ガン等のガン、および肥満、アルツハイマー、乳がん、心疾患等の皮膚以外の組織での疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸の発現の解析は、Real−time PCR、マイクロアレイ、次世代シーケンサーを用いたRNA発現解析等の公知の手段に従って行うことができる。
さらなる一態様において、本発明は、被験体のSSLの採取用具を含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製用キットを提供する。SSLの採取用具としては、例えば、SSL吸収性もしくは接着性素材、皮膚からSSLをこすり落とす器具、などが挙げられる。該SSL吸収性素材は、好ましくはポリプロピレン等の材料から製造された、可撓性のシート状素材である。該SSL吸収性素材の好ましい例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等が挙げられる。該SSL吸収性素材は、水溶性溶媒や水分を含まない乾燥状態であることが好ましい。該SSL接着性素材は、好ましくはシート状もしくは板状であり、必要に応じて、その表面にSSLを接着させるためのpoly―L―lysine等の接着剤が塗布されていてもよい。該SSL接着性素材の好ましい例としては、ガラス板、テープ等が挙げられる。該SSLをこすり落とす器具の好ましい例としては、スパーテル、スクレイパー等が挙げられる。
〔2〕好ましくは、前記被験体の皮膚表上脂質を採取することをさらに含む、〔1〕記載の方法。
〔3〕好ましくは、前記核酸が表皮、皮脂腺、毛包、汗腺および真皮から選択される少なくとも1部位由来の核酸であり、より好ましくは、前記核酸が表皮、皮脂腺、毛包および汗腺から選択される少なくとも1部位由来の核酸である、〔1〕又は〔2〕記載の方法。
〔4〕好ましくは、前記核酸がRNAである、〔1〕〜〔3〕のいずれか1項記載の方法。
〔5〕好ましくは、前記RNAが200nt以上の長さである、〔4〕記載の方法。
〔6〕好ましくは、前記RNAがmRNAおよびlincRNAからなる群より選択される少なくとも1種である、〔4〕又は〔5〕記載の方法。
〔7〕好ましくは、前記皮膚表上脂質の採取が皮膚表上脂質吸収性素材、皮膚表上脂質接着性素材、または皮膚から皮膚表上脂質をこすり落とす器具を用いて行われる、〔1〕〜〔6〕のいずれか1項記載の方法。
〔8〕好ましくは、前記皮膚表上脂質が、頭、顔、首、体幹もしくは手足の皮膚、疾患を有する皮膚、または創傷を有する皮膚における皮膚表上脂質である、〔1〕〜〔7〕のいずれか1項記載の方法。
〔9〕好ましくは、前記皮膚表上脂質が、手のひら、背部、足の裏、又は指の皮膚の皮膚表上脂質を含まない、〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載の方法。
〔10〕〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、核酸の解析方法。
〔11〕所定の疾患もしくは状態またはそのリスクを有する集団を被験体として、〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載の方法により核酸を調製すること、
調製された核酸の発現を対照と比較すること、
を含む、該所定の疾患もしくは状態の核酸マーカーの選択方法。
〔12〕〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載の方法により被験体の核酸を調製すること
調製された核酸から、所定の疾患もしくは状態の核酸マーカーを検出すること、
を含む、所定の疾患もしくは状態の核酸マーカーの検出方法。
〔13〕被験体の皮膚表上脂質の採取用具を含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製用キット。
〔14〕好ましくは、前記採取用具が皮膚表上脂質吸収性素材、皮膚表上脂質接着性素材、または皮膚から皮膚表上脂質をこすり落とす器具である、〔13〕記載のキット。
〔15〕好ましくは、採取した皮膚表上脂質から核酸を分離するための試薬をさらに含む、〔13〕又は〔14〕記載のキット。
〔16〕前記核酸が、好ましくは表皮、皮脂腺、毛包、汗腺及び真皮から選択される少なくとも1部位由来の核酸であり、より好ましくは表皮、皮脂腺、毛包および汗腺から選択される少なくとも1部位由来の核酸である、〔13〕〜〔15〕のいずれか1項記載のキット。
〔17〕好ましくは、前記核酸がRNAである、〔13〕〜〔16〕のいずれか1項記載のキット。
皮膚の角層、皮膚表上脂質(SSL)、血清、尿、および唾液中のRNAを解析した:
角層は、非特許文献2に記載された方法に従って、アクリルテープ(2.5cm×3.0cm)を用いて、被験者の額の角層を同一部位から深さ方向に連続で4枚採取した後、RNAを抽出した;
SSLは、あぶら取りフィルム(3Mジャパン)を用いて、被験者の顔全体から回収した。次いであぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、TRIzol(登録商標)試薬(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いて、付属のプロトコルに準じてRNAを抽出した;
ヒト血清、尿および唾液は、コスモバイオ社から購入した。唾液は、その中に混在するムチンと口腔内細胞を除去するために、15000rpmで5分間遠心した後、上清を新しいチューブに移して試料として用いた。これらの血清、尿、唾液試料から、Trizol(登録商標)LS試薬(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いて、付属のプロトコルに準じてRNAを抽出した;
次いで、抽出されたRNAを、Agilent RNA6000ピコキット(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて解析した。
SSL中に含まれる各生物種由来のRNAの割合を算出するために、SSL中における細菌に共通して存在するrRNAの配列、真菌に共通して存在するrRNAの配列、およびヒトのrRNAの配列のそれぞれのコピー数を、Real−time PCRによる絶対定量法により求めた。
ユビキタスに発現しているGAPDHとSOD2のmRNAを指標に、実施例1で用いた各種生体試料におけるmRNAの有無を評価した。
実施例1で抽出した各種生体試料のRNAを、SuperScript III First−Strand Synthesis System for RT―PCR(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いて逆転写し、得られたcDNAを鋳型としてRT−PCRを行った。陽性コントロールとして、ヒト表皮細胞から単離したRNAを用いた。RT−PCRでは、Advantage 2 PCR Kit(タカラバイオ)および表3に示すプライマーを用い、PCRプログラム(95℃、5分間→[95℃、15秒→60℃、30秒→72℃、30秒]×35サイクル→72℃、7分間)に従って、GAPDHおよびSOD2のcDNAを増幅した。PCR後、2%アガロースゲルとTrackIt 1Kb Plus DNA Ladder(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いて電気泳動を行い、目的のバンドを検出した。
(1)SSLを試料とした網羅的遺伝子発現解析の実施可能性について検証した。3名の被験者の顔面からあぶら取りフィルムを用いてSSLを採取し、テクニカルエラーを検証するためにそれを2等分した後に、それぞれからRNAを抽出した。抽出したRNAを用いて、次世代シーケンサーIon Protonシステム(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)による遺伝子発現の網羅的解析を実施した。すなわち、採取したRNAから、Ion AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression Kit(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)のプロトコルに従ってライブラリーを作製し、それを用いてIon chefシステム(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)によるエマルジョンPCRを実施した。得られたPCR産物をIon PI Chipにローディングし、Ion Protonシステムを用いてシーケンスを行って、表皮、汗腺、真皮、毛包、皮脂腺のマーカー遺伝子にマッピングされたリード数を算出した。マーカー遺伝子は、文献情報に基づいて選抜した(Int J Mol Med, 2014, 34, 997-1003;J Invest Dermatol, 1997, 108, 324-329;J Invest Dermatol, 2002, 119, 1137-1149;Development;2013, 140, 4870-4880)。
前述した非特許文献3で報告されている湿らせたスワブで採取されたヒト皮膚サンプルと本願の皮膚表上脂質との比較を行った。
額の真ん中から左右それぞれ3cm×5cmの範囲を採取範囲とし、片側からあぶら取りフィルム(ポリプロピレン、3cm×5cm、3Mジャパン)を用いて、もう片側からPBSを染み込ませて湿らせたカルチャースワブ(カルチャースワブEZ、ポリウレタン、日本BD)を用いて、採取範囲内全面を一定の力を加えながら、こすり付ける作業を3回繰り返すことにより皮膚表上物質を採取した。
採取した試料の脂質量は、皮膚表上脂質の主要な成分であるトリグリセリド量を指標として評価した。採取に用いたあぶら取りフィルムは適当な大きさに切断し、一方採取に用いたカルチャースワブは先端部分を回収して、それぞれBligh−Dyer法を用いて脂質を抽出した。具体的には、クロロホルム、メタノール、phosphate buffered saline(PBS)をサンプルに添加した後に、充分に振とうを行い脂質を抽出した。抽出物にさらにクロロホルムとPBSを添加し、充分に振とうを行った後に遠心分離機により有機相と水相に分離し、有機相を回収した。有機相を30℃の温度下で窒素ガスを吹付けて乾固させた後、1% Triton X−100(Sigma Aldrich)を含むPBS溶液1mLに溶解し、試料溶液を調製した。また、採取に用いていないあぶら取りフィルム及びカルチャースワブを同様に処理して、ブランクの試料溶液を調製した。Serum Triglyceride Quantification Kit(CELL BIOLABS,INC)を用いて、添付のプロトコルに従い、570nmの吸光度を測定し、それぞれの試料溶液のトリグリセリド量を定量した。
前記に従い額の左右からあぶら取りフィルム又はPBSで湿らせたカルチャースワブで皮膚表上物質を採取した。あぶら取りフィルムについては適当な大きさに切断し、カルチャースワブについては先端部分を回収して、それぞれRNeasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen)を用いて、付属のプロトコルに準じてRNAを抽出した。抽出されたRNAはエタノール沈殿し、10μLの水に溶解した。抽出したRNAを用いて、次世代シーケンサーIon S5/XLシステム(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)による遺伝子発現の網羅的解析を実施した。すなわち、採取したRNAからIon AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression Kit(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)のプロトコルに従ってライブラリーを作製し、それを用いてIon chefシステム(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)によるエマルジョンPCRを実施した。得られたPCR産物をIon 540 Chipにローディングし、Ion S5/XLシステムを用いてシーケンシングを実施した。
Claims (11)
- 被験体から採取された皮膚表上脂質から核酸を分離することを含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製方法。
- 前記被験体の皮膚表上脂質を採取することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記皮膚表上脂質が手のひら、背部、足の裏、又は指の皮膚の皮膚表上脂質を含まない、請求項1又は2記載の方法。
- 前記核酸がRNAである、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記RNAが200nt以上の長さである、請求項4記載の方法。
- 前記RNAがmRNAおよびlincRNAからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項4又は5記載の方法。
- 前記被験体の核酸が、表皮、皮脂腺、毛包および汗腺からなる群より選択される少なくとも1部位由来の核酸である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の方法で調製した核酸を解析することを含む、核酸の解析方法。
- 所定の疾患もしくは状態またはそのリスクを有する集団を被験体として、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法により核酸を調製すること、
調製された核酸の発現を対照と比較すること、
を含む、該所定の疾患もしくは状態の核酸マーカーの選択方法。 - 請求項1〜7のいずれか1項記載の方法により被験体の核酸を調製すること
調製された核酸から、所定の疾患もしくは状態の核酸マーカーを検出すること、
を含む、所定の疾患もしくは状態の核酸マーカーの検出方法。 - 被験体の皮膚表上脂質の採取用具を含む、被験体の皮膚細胞に由来する核酸の調製用キット。
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