JP2015512255A - ざ瘡の高速診断および個人化された治療 - Google Patents

ざ瘡の高速診断および個人化された治療 Download PDF

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Abstract

ニキビに罹患している患者を診断し、かつ治療する方法であって、個人がRT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有する場合、個人がざ瘡を有すると診断することを含む、方法。ざ瘡を治療するための方法は、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、ファージ、ワクチン、またはそれらの組み合わせなどの、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む。【選択図】図5

Description

連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号UH2AR057503およびR01GM099530の下、米国政府の支援によって行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、2012年3月17日に出願された米国仮特許出願第61/612,290号の優先権を主張する。
ざ瘡は、吹き出物または「ニキビ」を引き起こす皮膚の状態である。これには、白色面皰、黒色面皰、赤い炎症を起こした皮膚の斑点(嚢胞など)が含まれる。皮膚の表面の小さな毛穴が詰まると、ざ瘡が生じる。各毛穴は、小胞へと開く。小胞は、毛および油腺を含む。この腺によって放出される油分は、古い皮膚細胞を除去するのに役立ち、皮膚を柔らかく保つ。腺があまりにも多くの油分を生成すると、毛穴が塞がれる場合がある。汚れ、細菌、および細胞が蓄積する。この遮断が、栓または面皰と呼ばれる。栓の頂部が白色である場合は、白色面皰と呼ばれる。栓の頂部が暗色である場合は、黒色面皰と呼ばれる。栓が突然開いた場合、腫れおよび赤い隆起が生じる。皮膚の深部にあるざ瘡は、激しい痛みを伴う嚢胞を引き起こし得る。これは、嚢胞性ざ瘡と呼ばれる。
ざ瘡は、10代において最も一般的であるが、誰もがざ瘡を有し得る。10代の85%がざ瘡を有する。ホルモンの変化が、皮膚をより油性にし得る。ざ瘡は、遺伝する傾向がある。それは、思春期、月経、妊娠、避妊薬、もしくはストレスと関連するホルモンの変化、脂っこいもしくは油性の化粧品およびヘア製品、(ステロイド、テストステロン、エストロゲン、およびフェニトインなどの)ある種の薬剤、または高レベルの湿度および発汗によって引き起こされ得る。
様々な治療法が、ざ瘡の治療のために存在する。一般的に、ざ瘡治療は、油分の生成を低減すること、皮膚細胞の代謝回転を高速化すること、細菌感染に取り組むこと、炎症を軽減すること、または4つ全てを行うことによって有効である。これらの種類のざ瘡治療は、店頭の局所治療剤、抗生物質、経口避妊薬、および化粧品処置を含む。ざ瘡化粧水は、油分を乾燥させ、細菌を殺し、死んだ皮膚細胞の脱落を促進し得る。店頭(OTC)の化粧水は、一般的に、軽度であり、それらの活性成分として、過酸化ベンゾイル、硫黄、レゾルシノール、サリチル酸または硫黄を含む。研究では、経口抗生物質と共に局所過酸化ベンゾイルを使用することが、抗生物質耐性の発症リスクを低減し得ることが見てとれた。抗生物質は、胃の不調、眩暈、または皮膚の変色などの副作用を引き起こし得る。これらの薬剤はまた、肌の太陽への感度を高め、経口避妊薬の有効性を低減し得る。深い嚢胞の場合、抗生物質は十分ではない。イソトレチノイン(Amnesteem、Claravis、Sotret)は、瘢痕嚢胞性ざ瘡または他の治療法に反応しないざ瘡に利用できる強力な薬である。しかし、イソトレチノインは、乾燥肌、うつ病、重度の胃痛、および筋肉/関節/背中の痛みなどの多くの副作用を有し、母親がイソトレチノインを使用した乳幼児における出生時欠損を引き起こし得る。ノルゲスチメートおよびエチニルエストラジオールの組み合わせ(Ortho Tri−Cyclen、Previfem、その他)を含む経口避妊薬は、女性のざ瘡を改善し得る。しかし、経口避妊薬は、頭痛、乳房の圧痛、嘔気、およびうつ病など他の副作用を引き起こし得る。化学剥離および微小皮膚剥離は、ニキビを制御するのに有用であり得る。従来、小じわ、日焼けによる損傷、および小さな顔の傷跡の外観を軽減するために使用されてきたこれらの化粧品処置は、他のざ瘡治療と組み合わせて使用されるときに最も効果的である。それらは、一時的に、皮膚の重度の赤み、スケーリングおよび水疱形成、ならびに長期的な変色を引き起こし得る。
現在利用可能な治療によって引き起こされる負の副作用に加えて、個人レベルでざ瘡を引き起こす特定の細菌を標的化するために、患者に個人化された利用可能な治療法はない。加えて、皮膚科医は、ざ瘡治療を個人化するために、診断時にどの菌株が患者の皮膚上で優勢であるかを知ることが有用であろう。従って、ざ瘡の個人化された診断および治療の方法の当技術分野における必要性が存在する。
本発明は、ざ瘡に罹患した患者における診断および個人化された治療方法を対象とする。
一実施形態では、本発明は、個人がざ瘡を有するかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、個人から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、前述の試料における16SリボソームDNAを増幅することと、前述の増幅されたDNA生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の10個の主要なリボタイプ(RT)、RT1〜RT10(配列番号1〜10)のうちの1個以上に基づいた個人のDNAをタイプ分類することとを含み、前述のタイプ分類が、個人がRT1〜RT10のうちの1個以上を有するかどうかを判定することによって生じ、前記個人がRT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有する場合、個人はざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の個人がRT4(配列番号4)、RT5(配列番号5)、またはRT8(配列番号8)を有する場合、前述の個人がざ瘡を有すると診断され得る。
別の実施形態では、本発明は、異なる種類のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、前述の試料における16SリボソームDNAを増幅することと、前述の増幅されたDNA生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の5個の主要なマイクロバイオーム型のうちの1個以上に基づいて対象のDNAをタイプ分類することとを含み、前述の対象がマイクロバイオームIVまたはVにタイプ分類された場合、前述の対象はざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、1個以上のプライマーセットを使用して前述のDNAを増幅することとを含み、前述の増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について解析され、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在について解析され得、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。別の例として、前述の増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在について解析され得、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。
別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、1個以上のプライマーセットを使用して前述のDNAを増幅することと、1個以上のプローブを使用して前述の増幅されたDNAを検出することと、遺伝子座1(配列番号29および82〜97のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座3(配列番号31および187〜423のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、および/または遺伝子座4(配列番号32および424〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)の存在について、前述のプローブ信号を解析することとを含み、遺伝子座1〜4のうちの1個以上が存在する場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、この信号は、少なくとも99%の相同性または100%の相同性に基づいて、遺伝子座1、遺伝子座2、遺伝子座3、および/または遺伝子座4の存在について解析され得る。
前述の方法において、前述のプライマーセットのプライマーが、(遺伝子座1について)配列番号11、12、17、および18、(遺伝子座2について)配列番号13、14、20、および21、(遺伝子座3について)配列番号15、16、23、および24、(遺伝子座4について)配列番号26および27からなる群から選択され得る。前述の方法において、前述のプローブが、(遺伝子座1について)配列番号19、(遺伝子座2について)配列番号22、(遺伝子座3について)配列番号25、(遺伝子座4について)配列番号28であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチンを提供し、前述の菌株が、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、またはRT10菌株である。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株の16S rDNA配列解析に基づき、前述の対象に特異的であることが特定された、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチンを提供する。
ワクチンに関して、前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、ざ瘡菌の菌株について特定された固有のゲノムの遺伝子座、領域、または配列のうちの少なくとも1個に特異的であり得る。前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、遺伝子座1(配列番号29および82〜97)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186)、遺伝子座3(31および187〜423)、および遺伝子座4(32および424〜434)のうちの少なくとも1個に特異的であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡の個人化された治療のための方法を提供し、該方法は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株を判定することと、少なくとも1個の検出されたざ瘡菌の菌株を対象とした活性成分を用いて前述の対象を治療することとを含み、前述の活性成分が、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化する薬剤を含み、前述の標的化薬剤が、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して特異的なゲノム要素を標的化する、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、およびそれらの組み合わせを含む。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、ざ瘡菌の菌株の16S rDNAに基づいて健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも1個のざ瘡菌の菌株を含む有効量のプロバイオティクスを投与することを含む。前述の菌株は、RT6菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性、例えば、少なくとも99%の相同性または100%の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌によって生成された有効量の代謝産物を投与することを含み、前述の代謝産物は、細菌培養上清、細胞溶解物、タンパク質、核酸、脂質、および他の細菌分子からなる群から選択される。前述の菌株は、RT6菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性、例えば、少なくとも99%の相同性または100%の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、対象のざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、前述の対象がそれぞれ、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有すると判定されたとき、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む。上に記載された方法は、薬剤の投与前に実施され得る。前述の薬剤が、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、またはそれらの組み合わせであり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも1個のざ瘡菌の菌株を含む組成物を提供する。前述の菌株は、RT6菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性、例えば、少なくとも99%の相同性または100%の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、IB−3系のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、1個以上のプライマーセットを使用して前述のDNAを増幅することと、配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について、前述の増幅されたDNAを解析することとを含み、配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がIB−3系のざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡の菌株(複数可)を判定することと、前述の菌株(複数可)を特異的に対象とした有効量の少なくとも1個のファージを前述の対象に投与することとを含むざ瘡の個人化された治療のための方法を提供する。例えば、前述の対象は、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、および/またはRT10菌株を対象としたファージで治療され得る。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームI型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号40)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、IB−3菌株を伴うマイクロバイオームI型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL082M00(配列番号47)およびPHL071N05(配列番号41)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームII型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL060L00(配列番号34)、PHL112N00(配列番号35)、およびPHL085M01(配列番号44)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIII型または優勢なRT8のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIV型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームV型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、プロピオニバクテリウムフメルシイ(humerusii)に関連した病気を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL085N00(配列番号46)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、およびPHL010M04(配列番号38)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマー、および使用説明書を含む。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマー、配列番号19、22、25、および28からなる群から選択される少なくとも1個のプローブ、および使用説明書を含む。
この出願書類は、カラーで作成された少なくとも1個の図面を含む。カラー図面(複数可)を伴うこの出願の写しは、必要な料金の請求および支払いに応じて特許庁により提供されるであろう。
ざ瘡菌が、クローンの87%を占める毛包脂腺単位の微生物叢を支配することを示す。ざ瘡菌は、ざ瘡患者および正常な皮膚を有する個人の両方における毛包脂腺単位で優勢であった。16S rDNAを配列決定することにより、ざ瘡菌の配列は、全てのクローンの87%を占めた。0.35%を上回る相対的存在量を有する種は、相対的存在量の順に列挙される。正常な個人からプールされた試料のメタゲノムのショットガン配列による種の分布は、右の列に示されるように、毛包脂腺単位におけるざ瘡菌の高い存在量を確認した。 ざ瘡菌のリボタイプの存在量の順位が、より高い分類学的レベルで見られるものと同様の分布を示すことを明らかにする。少数の非常に豊富なリボタイプおよびいくつかの珍しいリボタイプが、試料中で観察された。いくつかのリボタイプは、ざ瘡患者において非常に富化されていた。上位30位の最も豊富なリボタイプのみが、図2に反映されている。 毛包脂腺単位で最も豊富なざ瘡菌のリボタイプはまた、他の身体部位でも豊富であったことを示す。ざ瘡患者および正常な個人において見られる主要なリボタイプは、HMPおよびGriceら(2009年)のデータセットと比較された。上位3位のリボタイプは、異なるデータセットにおいて最も豊富なものである。Griceら(2009年)のデータセットに見られる過剰なRT4およびRT5は、1個の対象、HV4に起因し、そのざ瘡菌の菌株集団は、試料とされた全ての皮膚部位におけるこれら2個のリボタイプによって支配されていた。この対象を除去した後、リボタイプの分布は、HMP試料および研究された正常な皮膚試料に類似する。RT6はまたは、健康な個人から収集されたHMPデータセットに豊富に見られる。 ざ瘡菌集団の構造は、ざ瘡および正常な皮膚で異なることを示す。試料のざ瘡菌集団は、上位10位の最も豊富なリボタイプために重み付けされたUniFrac距離行列の元本座標解析を使用してクラスタ化された。主要な座標1(P1)が43.64%の変化を説明し、P2が20.07%の変化を説明する。解析は、QIIME(Caporaso et al.2010)を用いて実施された。 ざ瘡患者および正常な皮膚を有する個人における上位10位の最も豊富なざ瘡菌のリボタイプの分布を表す。各列は、各対象において特定された上位10位のリボタイプの割合を表す。対象毎の平均ざ瘡菌クローン数は262であり、上位10位のリボタイプの平均クローン数は100であった。ざ瘡菌の菌株レベルでの5個の主要なマイクロバイオーム型がデータで観察された。IVおよびV型は、主にざ瘡患者に見られた。50未満のざ瘡菌16S rDNAの配列を有する2個の試料(ざ瘡から1個、正常な皮膚から1個)は、表示されない。 ざ瘡および正常な皮膚の2個の群を分離することなく、全ての試料中の上位10位の最も豊富なざ瘡菌のリボタイプの分布を示す。各列は、各試料において特定された上位10位のリボタイプの割合を表す。全ての試料をクラスタ化したとき、ざ瘡菌の菌株レベルで同じ5個の主要なマイクロバイオーム型が観察され、マイクロバイオームの分類は、疾患の状態に依存しないことを示した。99個の試料のうちの3個のみが、(アスタリスクでマークされた)図5に示すものと比較して、異なるようにクラスタ化された。50未満のざ瘡菌16S rDNAの配列を有する2個の試料(ざ瘡から1個、正常な皮膚から1個)は、示されない。 同じ5個の主要なマイクロバイオーム型が複数のデータセットにおいて観察されたことを示す。研究、HMP、およびGriceら(2009)の試料は、上位10位の最も豊富なざ瘡菌のリボタイプに基づいて共にクラスタ化された。合計で、284個の試料が含まれた。各列は、各試料において特定された上位10位のリボタイプの割合を表す。HMP試料およびGriceらの試料(2009)の両方は、健康な個人から採取され、従って、マイクロバイオームIVおよびV型の割合は、解析では過小評価されている。上位10位のリボタイプの10個未満の配列を有する試料は、含まれていなかった。 71個のざ瘡菌の菌株のゲノム比較が、RT4およびRT5のゲノムが他のものと異なることを示したことを明示する。2個の染色体の領域、遺伝子座1および2は、分岐群IA−2および他の1個のゲノムHL086PA1に固有である。分岐群IA−2は、ざ瘡内で非常に富化されたRT4およびRT5から主に成る。プラスミド(遺伝子座3)の存在はまた、RT4およびRT5の特徴である。各行は、リボタイプに従って着色されたざ瘡菌のゲノムを表す。行は、ざ瘡菌のコアゲノム中のSNPに基づいて算出される系統発生によって順序付けられる。トポロジのみが示される。分岐群は、そのrecA型(IA、IB、およびII)に基づいて命名された。列は、ゲノム中の予測されたオープンリーディングフレーム(ORF)を表し、55Kbプラスミドをコードする完成したゲノムHL096PA1に沿って、ORFの位置によって順序付けられる。染色体(左側)上の最初の300個のORFのみと、プラスミド(右側)上の全てのORFとが示される。着色されたプラスミドの領域は、HL096PA1プラスミド領域に排他的に一致するコンティグ上の遺伝子を表す。プラスミドの領域を越えて明確に延在するコンティグ上に落ちる遺伝子が染色体に位置する可能性が高く、灰色に着色されている。リボタイプのざ瘡指数は、表1の列5に示されるざ瘡内に見られる各リボタイプのクローンの割合に基づいて算出された。 ざ瘡菌のコアゲノムにおける96,887個のSNPに基づいて構築された系統樹を示し、これは、71個のゲノムがざ瘡菌の菌株を分類するために使用されてきたrecA型と一致する異なる分岐群にクラスタ化されることを示す。ゲノムの16Sリボタイプは、かなりの程度で系統の関係を表す。樹の一方の端部では、分岐群IA−2およびIB−1がざ瘡内で富化されたリボタイプから主に成り、樹の他方の端部では、分岐群II内のRT6が健康な対象において主に見られた。1000個の複製を伴うブートストラップ試験が実施された。分岐間の距離は、コアゲノムにおけるSNPに基づいて算出され、各ゲノムの非コア領域を表すものではない。拡大された分岐は、図8に示すように16Sリボタイプに従って着色された。 71個のざ瘡菌の菌株のゲノム比較を提供し、RT4およびRT5のゲノムが他のものと異なっていることを示す。染色体上でコードされた予測されるオープンリーディングフレーム(ORF)の全てが示される。各行は、リボタイプに従って着色されたざ瘡菌のゲノムを表す。行は、ざ瘡菌のコアゲノム中のSNPに基づいて算出される系統発生によって順序付けられる。トポロジのみが示される。列は、ゲノム中のORFを表し、完成したゲノムHL096PA1に沿ってそれらの位置によって順序付けられる。主にRT4とRT5菌株に固有である遺伝子座1および2、ならびに主にRT8菌株に固有である遺伝子座4を図中に見ることができる。 推定上のプラスミドを保有する全てのゲノムにおける染色体とプラスミド領域との間の配列カバレッジ比較を提供し、これはプラスミドのコピー数が、ゲノム当たり1個〜3個の範囲であることを示す。X軸は、プラスミド配列が後に続く、完成したゲノムHL096PA1の座標に基づいて染色体に沿ったDNA配列を表す。Y軸は、配列カバレッジを表す。ゲノムは、(陰性対照としての)HL056PA1以外は、図8と同じ順番であった。 定量PCR(qPCR)は、各ゲノムにおけるプラスミドのコピー数が配列カバレッジ比較から予測されるように1個〜3個であることを確認したことを反映している。PakおよびRecAは、染色体上に位置するハウスキーピング遺伝子であり、TadAは、プラスミド上に位置するTad遺伝子座における保存された遺伝子である。TadAとPakとの間のコピー数の比率は、ゲノム中において1〜3の範囲であるが、一方、RecAとPakとの間の比率は、全てのゲノム中において1である。HL078PA1およびHL045PA1におけるTadA遺伝子は、qPCRの後期サイクルで増幅した。従来のPCRは、これらの2個の菌株にTadAの増幅を確認したが、一方、プラスミドを有さない他の菌株は増幅を示さなかった(データには示さず)。 新たなゲノム配列(N)に加えて発見された新しい遺伝子(n)についてべき乗則回帰を示す。円は、200個のシミュレーションのn個の中央値である。エラーバーは、200個のシミュレーションについて標準偏差を示す。 新たなゲノム配列(N)に加えて蓄積された全ての遺伝子(n)についてべき乗則回帰を示す。円は、200個のシミュレーションのn個の中央値である。エラーバーは、200個のシミュレーションについて標準偏差を示す。 recAのI、II、およびIII型に特異的なコア領域における123,223個のSNPの割合を示す。 コア領域(2.20Mb)において123,223個のSNPに基づいて構築された82個のざ瘡菌の菌株の系統樹を示す。菌株間の距離は、縮尺バーに従って着色された全てのSNP部位でのヌクレオチド置換率として算出された。同じ系統に属する同じ個人(SSI)の菌株が「+」で印付けされた。 IA(A)、IB(B)、およびII(C)型菌株のパンゲノムを示す。円は、200個のシミュレーションのn個の中央値である。エラーバーは、200個のシミュレーションについて標準偏差である。 コア領域中のSNPの分布を示す。図18aは、コア領域中の遺伝子のSNP頻度(多型部位の割合)を示す。図18bは、2個を超える標準偏差(SD)を伴うより高いSNP頻度を有した遺伝子についてKS統計を提供する。図18cは、コア領域における遺伝子の非同義的突然変異頻度を反映している。図18dは、2個を超える標準偏差を伴うより高い非同義的な突然変異頻度を有した遺伝子についてKS統計を提供する。 コア領域中のSNPの分布を示す。図18aは、コア領域中の遺伝子のSNP頻度(多型部位の割合)を示す。図18bは、2個を超える標準偏差(SD)を伴うより高いSNP頻度を有した遺伝子についてKS統計を提供する。図18cは、コア領域における遺伝子の非同義的突然変異頻度を反映している。図18dは、2個を超える標準偏差を伴うより高い非同義的な突然変異頻度を有した遺伝子についてKS統計を提供する。 同じ系統(図19a)および異なる系統(図19b)におけるざ瘡菌の菌株間の距離を提供する。 各系統内のざ瘡菌の菌株が、固有の非コアゲノム領域を共有することを反映している。行は82個のざ瘡菌ゲノムを表し、列は500bpより長い314個の非コア領域を表す。ゲノムおよび非コア領域はそれぞれ、類似性に基づいてクラスタ化された。プロットされた各ブロックの幅は、各非コア領域のゲノムの長さに比例しない。非コア領域の存在は、黄色に着色され、不在は、青色に着色されている。RTおよび分岐群に使用されるカラースキームは、図16と同じである。 RT2およびRT6菌株におけるCRISPRスペーサ配列を提供する。48個のCRISPRスペーサ配列の合計が、11個のざ瘡菌ゲノムに見られ、そのうちの29個が固有であった。いくつかのCRISPRスペーサは、複数の菌株に見られた。例えば、スペーサ2(S2)は、HL060PA1およびHL082PA2によって共有された。スペーサ17(S17)は、J139、ATCC11828、HL110PA3、HL110PA4、HL042PA3、およびHL202PA1によって共有された。スペーサ18(S18)は、J139、ATCC11828、HL110PA3、HL110PA4、およびHL202PA1によって共有された。この樹は、コア領域内の123,223個のSNPに基づいて構築された図16のものであった。 ざ瘡菌ゲノム中の推定上のリパーゼ活性を有する遺伝子を反映している。図22aは、KPA171202およびSK137ゲノムの注釈に基づいて、推定上のリパーゼ活性を有する13個の遺伝子の概要を示す。図22bは、ORF HMPREF0675−4856において観察された挿入/削除およびフレームシフトを反映している。 ざ瘡菌ゲノム中の推定上のリパーゼ活性を有する遺伝子を反映している。図22aは、KPA171202およびSK137ゲノムの注釈に基づいて、推定上のリパーゼ活性を有する13個の遺伝子の概要を示す。図22bは、ORF HMPREF0675−4856において観察された挿入/削除およびフレームシフトを反映している。 遺伝子座1、2、および3を標的化する多重PCRを使用したざ瘡菌の菌株と関連するざ瘡の迅速な検出を反映している。 ハウスキーピング遺伝子Pakと比較して、遺伝子座1および遺伝子座2の相対的存在量を示す。 ざ瘡菌遺伝子座1、遺伝子座3、Pakの増幅を示す臨床試料#1(図25A)、#2(図25B)についてのqPCRの三重増幅プロットを反映している。 32個のファージの進化的関係/系統樹を示す。 ざ瘡の診断および治療の個人化のための本発明の方法の図を示す。 ざ瘡の診断および治療の個人化のための本発明の方法のフローチャートを示す。 ざ瘡菌のファージゲノムおよび注釈を提供する。15個全てのファージのゲノム組織が示される。以前に発表されたゲノムにおける平行矢印は、新たに注釈付きの提案されたORFを表す。イタリック体の凡例の項目は、新たに注釈を付けられたまたは改訂されたORFを参照する。 コア領域における6,148個のSNPに基づいて構築された、29個の配列決定されたファージのゲノムの系統樹を提供する。(200個の再サンプリングに基づく)80個未満のブートストラップ値を有する分岐が、崩壊した。 ゲノム配列に基づく系統樹を提供する。図31aは、16個全てのファージの全体のゲノム配列に基づいて構築された系統樹を提供する。PHL112N00を除いて、ファージ間の系統発生関係は、図30に示すコア領域を使用するものと同じままである。図31bは、ファージ間に高度に保存されているゲノムの左腕のみを使用して構築された系統樹を示す。図31sは、右腕のコーディング領域のみを使用して構築された系統樹を示す。図30のIおよびII群はまた、樹に示されている。(5,000個の再サンプリングに基づく)80個未満のブートストラップ値を有する分岐が、崩壊した。 Loodらの配列を含む、アミダーゼのヌクレオチド配列(図32a)および全てのファージの頭部タンパク質(図32b)に基づいて構築された系統樹を示す。以前の研究からファージ間の系統発生関係は、これらの樹で同じままである。IおよびII群は、図30に示すゲノムと同じままである。 密接に関連するファージのIおよびII群のゲノムのために生成された複数の位置合わせを反映している。ヌクレオチド変異の部位は、各群のメンバーにマッピングされる。ゲノムの各50ヌクレオチドのウィンドウでの変数部位の密度は、赤で表示され、100%密度は、ウィンドウ内の50個の部位全てが群のメンバーの間で様々であることを示す。図33aは、PHL010M04ゲノムにマッピングされたI群のファージ(PHL010M04、PHL066M04、PHL073M02)間の変化を提供する。図33bは、PHL115M02ゲノムにマッピングされたII群のファージ(PHL115M02、PHL085M01、PHL085N00、PHL037M02)間の変化を提供する。灰色の矢印は、各ゲノム中のORFを表す。 ざ瘡菌ファージの宿主範囲および特異性を示す。66個のざ瘡菌の菌株、3個のフメルシイ菌の菌株、および15個の新たに配列決定されたファージに対する1個の顆粒菌の菌株の罹病性/耐性が示されている。上および左の樹状図は、ファージおよびざ瘡菌の菌株のそれぞれの系統樹を表す(トポロジのみが示される)。「S」は、試験されたプロピオニバクテリウム菌株が試験されたファージに罹病性であったことを示す。赤の数字は、ざ瘡菌の菌株ATCC6919に相対的なファージに対するプロピオニバクテリア菌株の耐性の増加倍率を表す。 ファージに対するざ瘡菌の耐性と、一致したCRISPRスペーサの存在との相関関係を提供する。各セルの着色された画素は、(行に示される)各ざ瘡菌の菌株でコードされたCRISPRスペーサを表す。各赤色の画素は、このスペーサが(列に示される)対応するファージ内に正確なプロトスペーサの一致を有することを意味する。各オレンジ色の画素は、このスペーサが、対応するファージ内に部分的に一致するプロトスペーサ(1〜2の不一致)を有することを意味する。灰色の画素は、一致したプロトスペーサが全くないことを意味する。ピンクの細胞は、ファージに対する細菌の耐性を示す。 15個の配列決定されたファージの各々が、ざ瘡菌の菌株内で特定された8個のCRISPRスペーサアレイ全てに位置合わせされ、完全一致(赤)、または2個までの不一致(オレンジ)を有する各ファージのゲノム内でプロトスペーサ配列を特定することを反映している。プラスおよびマイナス鎖プロトスペーサはそれぞれ、ゲノムの上および下に示される。 プロトスペーサおよびPAM中の配列保存を反映している。菌株HL042PA3中でコードされたCRISPRスペーサおよびそれらと関連するPAM配列に厳密に一致するプロトスペーサが示される。HL042PA3が耐性である、ファージのプロトスペーサのモチーフ間の配列保存が(A)に示され、罹病性のものが(B)に示される。
一実施形態では、本発明は、個人がざ瘡を有するかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、個人から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、前述の試料における16SリボソームDNAを増幅することと、前述の増幅されたDNA生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の10個の主要なリボタイプ(RT)、RT1〜RT10(配列番号1〜10)のうちの1個以上に基づいた個人のDNAをタイプ分類することとを含み、前述のタイプ分類が、個人がRT1〜RT10のうちの1個以上を有するかどうかを判定することによって生じ、前記個人がRT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有する場合、個人はざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の個人がRT4(配列番号4)、RT5(配列番号5)、またはRT8(配列番号8)を有する場合、前述の個人がざ瘡を有すると診断され得る。
別の実施形態では、本発明は、異なる種類のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、前述の試料における16SリボソームDNAを増幅することと、前述の増幅されたDNA生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の5個の主要なマイクロバイオーム型のうちの1個以上に基づいて対象のDNAをタイプ分類することとを含み、前述の対象がマイクロバイオームIVまたはVにタイプ分類された場合、前述の対象はざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、1個以上のプライマーセットを使用して前述のDNAを増幅することとを含み、前述の増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について解析され、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在について解析され得、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。別の例として、前述の増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在について解析され得、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。
別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、1個以上のプライマーセットを使用して前述のDNAを増幅することと、1個以上のプローブを使用して前述の増幅されたDNAを検出することと、遺伝子座1(配列番号29および82〜97のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座3(配列番号31および187〜423のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、および/または遺伝子座4(配列番号32および424〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)の存在について、前述のプローブ信号を解析することとを含み、遺伝子座1〜4のうちの1個以上が存在する場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、この信号は、少なくとも99%の相同性または100%の相同性に基づいて、遺伝子座1、遺伝子座2、遺伝子座3、および/または遺伝子座4の存在について解析され得る。
前述の方法において、前述のプライマーセットのプライマーが、(遺伝子座1について)配列番号11、12、17、および18、(遺伝子座2について)配列番号13、14、20、および21、(遺伝子座3について)配列番号15、16、23、および24、(遺伝子座4について)配列番号26および27からなる群から選択され得る。前述の方法において、前述のプローブが、(遺伝子座1について)配列番号19、(遺伝子座2について)配列番号22、(遺伝子座3について)配列番号25、(遺伝子座4について)配列番号28であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチンを提供し、前述の菌株が、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、またはRT10菌株である。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株の16S rDNA配列解析に基づき、前述の対象に特異的であることが特定された、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチンを提供する。
ワクチンに関して、前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、ざ瘡菌の菌株について特定された固有のゲノムの遺伝子座、領域、または配列のうちの少なくとも1個に特異的であり得る。前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、遺伝子座1(配列番号29および82〜97)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186)、遺伝子座3(31および187〜423)、および遺伝子座4(32および424〜434)のうちの少なくとも1個に特異的であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡の個人化された治療のための方法を提供し、該方法は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株を判定することと、少なくとも1個の検出されたざ瘡菌の菌株を対象とした活性成分を用いて前述の対象を治療することとを含み、前述の活性成分が、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化する薬剤を含み、前述の標的化薬剤が、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して特異的なゲノム要素を標的化する、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、およびそれらの組み合わせを含む。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、ざ瘡菌の菌株の16S rDNAに基づいて健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも1個のざ瘡菌の菌株を含む有効量のプロバイオティクスを投与することを含む。前述の菌株は、RT6菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性、例えば、少なくとも99%の相同性または100%の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌によって生成された有効量の代謝産物を投与することを含み、前述の代謝産物は、細菌培養上清、細胞溶解物、タンパク質、核酸、脂質、および他の細菌分子からなる群から選択される。前述の菌株は、RT6菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性、例えば、少なくとも99%の相同性または100%の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、対象のざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、前述の対象がそれぞれ、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有すると判定されたとき、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む。上に記載された方法は、薬剤の投与前に実施され得る。前述の薬剤が、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、またはそれらの組み合わせであり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも1個のざ瘡菌の菌株を含む組成物を提供する。前述の菌株は、RT6菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性、例えば、少なくとも99%の相同性または100%の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、IB−3系のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌DNAを単離することと、1個以上のプライマーセットを使用して前述のDNAを増幅することと、配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について、前述の増幅されたDNAを解析することとを含み、配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がIB−3系のざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡の菌株(複数可)を判定することと、前述の菌株(複数可)を特異的に対象とした有効量の少なくとも1個のファージを前述の対象に投与することとを含むざ瘡の個人化された治療のための方法を提供する。例えば、前述の対象は、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、および/またはRT10菌株を対象としたファージで治療され得る。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームI型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号40)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、IB−3菌株を伴うマイクロバイオームI型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL082M00(配列番号47)およびPHL071N05(配列番号41)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームII型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL060L00(配列番号34)、PHL112N00(配列番号35)、およびPHL085M01(配列番号44)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIII型または優勢なRT8のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIV型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームV型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、プロピオニバクテリウムフメルシイ(humerusii)に関連した病気を治療するための方法を提供し、前述のファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL085N00(配列番号46)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、およびPHL010M04(配列番号38)からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマー、および使用説明書を含む。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマー、配列番号19、22、25、および28からなる群から選択される少なくとも1個のプローブ、および使用説明書を含む。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列は、単量体および二量体の形態の二本鎖または一本鎖のDNAと、前述のDNAの転写生成物との両方を意味すると理解されるであろう。
相同のヌクレオチド配列は、少なくとも80%、好ましくは90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の本発明に従うヌクレオチド配列の塩基を伴う少なくともある割合の同一性を有するヌクレオチド配列を意味する。この割合は、統計的であり、2個のヌクレオチド配列間の違いは、無作為にまたはその長さ全体にわたって判定され得る。
本発明は、本発明に従うヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含み、その配列が断片によって表されるポリペプチドを含む。本明細書において、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は同義的である。
ポリペプチドは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を調製することを可能にし、それらは、それらがポリペプチドを特異的に認識することを特徴としている。本発明は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片、またはキメラ抗体に関し、それらは、ポリペプチドを特異的に認識することができることを特徴とする。
本発明に従うワクチン組成物において使用されるポリペプチドは、例えば、T細胞を刺激し、例えば、それらの増殖またはインターロイキンの分泌によって翻訳され、前述のポリペプチドを対象とする抗体の生成をもたらす前述のポリペプチドの能力に応じて、当業者に既知の技術によって選択され得る。ワクチンの組み合わせは、好ましくは、薬学的に許容されるビヒクル、および必要な場合は、適切な免疫の1個以上のアジュバントと組み合わされるであろう。薬学的に許容されるビヒクルは、二次反応を引き起こさず、例えば、活性化合物の投与の円滑化、体内でのその生存期間および/もしくはその有効性の増加、溶液中のその溶解度の増大、またはその保全の改善を可能にする化合物または化合物の組み合わせを意味する。
出願人らは、ざ瘡が発生する人間の毛包脂腺単位(「毛穴」)にプロピオニバクテリウムざ瘡の10個の主要な系統、および5個の主要なマイクロバイオーム型を特定した。ざ瘡菌の系統およびマイクロバイオーム型のいくつかは、ざ瘡患者において非常に富化され、いくつかは、健康な皮膚に関連している。ざ瘡と関連する系統に固有のものである線状プラスミドを含む各主要な系統の固有のゲノム構成要素は、特定されている。この情報は、例えば、以下の目的に使用される:(1)下流解析のために毛包脂腺単位から細菌DNA/RNAを単離するための方法/キットのため、(2)影響を受けた対象のマイクロバイオーム型、および影響を受けた対象の毛穴内に存在するざ瘡菌の主要な菌株を迅速かつ正確に検出/診断し/特定する、(3)ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対するワクチンを開発する、(4)局所クリーム、溶液などの中の健康的な皮膚と関連する菌株を用いて、プロバイオティクスを開発する、(5)ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に固有の遺伝的要素および生物学的経路を標的化する、小分子、生物製剤、および抗体を含む薬剤を開発する、(6)ざ瘡を治療するためのバクテリオファージに基づく菌株に特異的な治療を開発する。
一旦ざ瘡に罹患した対象のマイクロバイオーム型が診断されると、以下に説明するいくつかの手法が、効果的な治療計画の策定に使用され得る。例えば、対象がマイクロバイオームIVまたはV型を有しているか、またはざ瘡菌RT10菌株によって支配されている場合、これらの菌株が、抗生物質耐性であるため、抗生物質による治療が成功する可能性は低くなる。しかし、レチノイドなどの他の方法での治療が、依然として可能である。
本発明の一実施形態に従うと、対象がRT4、RT5、およびRT8を含む悪性のリボタイプを有する場合には、小分子、生物製剤、および抗体を含む標的特異的薬物がより効果的な治療であり得る。本発明の好ましい実施形態では、このような患者は、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に固有の遺伝的要素および生物学的経路を標的化する抗体で治療され得る。
本発明の別の実施形態に従うと、対象に影響を与えている優勢なざ瘡菌の菌株が、1組のCRISPR/Casを保有しない場合、ファージ療法の追加の治療がより効果的であり得る。
本発明はまた、健康と関連する菌株の増殖を促進することにより、ざ瘡菌の菌株の相対的存在量のバランスを取るためのざ瘡治療のための代替治療戦略に関する。
本発明は、下流の遺伝子解析のための、影響を受けた対象の毛穴から細菌DNA/RNAを単離するための方法およびキットに関する。より具体的には、本発明は、微小面皰の試料から細菌ゲノムのDNAおよびRNAを抽出するためのプロトコルに関する。本発明の特定の一実施形態では、Biore(登録商標)ディープクレンジングポアストリップが、対象から細菌をサンプリングするために使用され得る。ゲノムDNAは、当該分野で既知の方法に従って抽出され得る。例えば、QIAamp DNAマイクロキット(Qiagen)は、ビードビータを用いて細胞/微小面皰を溶解することによって得られた上清からゲノムDNAを抽出するために使用され得る市販のキットである。
本発明はまた、影響を受けた対象におけるマイクロバイオーム型の検出および/または診断のための迅速かつ正確な方法およびキットに関する。マイクロバイオームのタイプ分類/マイクロバイオームに特異的な治療は、10個の主要なざ瘡菌の菌株系統、および全長16S rDNAの配列決定を使用した総合的なメタゲノム解析で見られた人間の毛包脂腺単位の5個の主要なマイクロバイオーム型に基づく。
実際に、試料は、以下の配列を有する16S rDNAの特異的なプライマーを用いてPCR増幅された:27f−MP 5’AGRGTTTGATCMTGGCTCAG−3’および1492r−MP 5’−TACGGYTACCTTGTTAYGACTT−3’。任意に、ゲル精製後、1.4Kbの製品が切除され、例えば、Quigen QIAquickゲル抽出キットを用いて更に精製される。精製された生成物は、例えば、InvitrogenのTOPO TAクローニングキットを使用してOneShot大腸菌細胞内にクローニングされる。配列決定は、TGTAAAACGACGGCCAGT(順方向)、CAGGAAACAGCTATGACC(逆方向)、およびCCGTCAATTCCTTTRAGTTT(907R)の配列で、サブセットの内部16S rDNAのプライマー907Rのために、ユニバーサルフォワード、ユニバーサルリバースで行われる。配列反応は、長い読み取り実行モジュールを用いて50cmのアレイ上でABIのABI3730機上にロードされた。
ざ瘡菌の各系統は、固有のゲノムの遺伝子座、領域、および配列を有する。従って、特異的なプライマーは、各系統の存在または不在と、PCR/qPCRなどの当技術分野で既知の方法を使用した各系統の相対的な量とを検出するように系統特異的なゲノムの領域を標的化するように生成され得る。これは、試料の取得の数時間以内に起こる。出願人らの発明以前に、これは、培養に基づく方法を使用して多くの時間、多くの場合、数週間を必要とした。本発明の一実施形態に従って、影響を受けた対象は、これらの診断に基づいてマイクロバイオームの特異的な治療のためにグループ化される。
本発明の方法に従って、リボタイプ4および5の菌株の固有のゲノム遺伝子座1、2、および3は、ざ瘡と関連していることが示されている。遺伝子座1、2および3を標的化する特異的なプライマーを用いて、これらの遺伝子座を含有する系統は、これらの遺伝子座を欠く系統と区別することができる。加えて、PCR/qPCR技術を用いて、各菌株の相対的存在量もまた、検出され得る。模擬群集の解析は、マイクロバイオーム7.5%以上の存在量における遺伝子座1、2、および3を有する分離株が、これらの技術を用いて検出され得ることを示す。qPCRの感度を考慮すると、少数のDNAのコピーより低い存在量レベルもまた、検出され得る。
ざ瘡菌の熱失活は、ざ瘡菌に基づくワクチンを開発する効果的な手段であり得ることが、以前に報告されている。T.Nakatsuji et al.,128(10)J.Invest.Dermatol.2451−2457(Oct.2008)を参照されたい。本発明の一態様では、ワクチンが、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して開発されている。本発明の別の態様では、個人化されたワクチンが、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して開発されている。本発明の更に別の態様では、ワクチンが、不活性なざ瘡菌の菌株または熱弱毒化されたタンパク質を使用してざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して開発されている。ワクチンとして使用するのに好適な菌株は、16S rDNAの配列決定に基づいて特定され得る、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株の系統、および健康な皮膚と関連する菌株ではない、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株を特異的に標的化するように各系統についての固有のゲノム遺伝子座、領域、配列を特定する。
上で説明した方法に従って、リボタイプ4、5、7、8、9、および10を有するざ瘡菌の菌株が、ざ瘡と非常に関連していることが発見された。本発明の一実施形態では、ワクチンは、これらの個別の菌株に対して別々にまたは組み合わせて惹起される。同様に、遺伝子座1、2、および3における遺伝子は、これらの遺伝子座がリボタイプ4および5に固有であり、利共生菌株には見られないため、ワクチン接種の標的であり得る。リボタイプ8に固有の遺伝子座4はまた、ワクチン療法のための潜在的標的として機能し得る。遺伝子座1、2、3、および4でコードされた遺伝子のリストは、表2に示される。
本発明はまた、医薬品、組成物、局所クリーム、溶液、または他の化粧品において、健康な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用して開発されたプロバイオティクスと関連する。プロバイオティクスは、過去において、局所クリームに使用されている。PROBIOTIC LAB(商標)は、細菌の14個の特定の菌株の混合物が嚢胞性ざ瘡の治療に使用されたと発表した(http://www.probiotic−lab.com/aboutusprobioticlab.html)。プロバイオティックスキンケア/DERMBIOTIXは、皮膚の老化防止効果を狙ったと主張される製品ライン、プロバイオティクスコラーゲンコンプレックス(PC3)を有する。しかし、これは、ざ瘡治療を標的化していない。プロバイオティクスコラーゲン複合体(PC3)は、効果的に外部要因によって引き起こされる過剰陰性細菌と闘い、根絶するために必要な陽性細菌を皮膚に注入する(http://www.dermbiotix.com)。しかし、本発明以前には、健康な/正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用したざ瘡治療のための、報告されたスキンプロバイオティクス製品が存在しなかった。本発明の一実施形態では、スキンプロバイオティクスが、健康な/正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用したざ瘡治療のために開発された。本発明の別の態様では、スキンプロバイオティクスが、16S rDNA配列決定に基づいて健康な/正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用したざ瘡治療のために開発された。
本発明の特定の一実施形態では、ざ瘡菌のおよび健康な皮膚と関連するRT6系統は、局所製品として使用されている。本発明の更に別の実施形態では、ざ瘡菌のRT6系統は、ざ瘡に関連する菌株に対抗するために、人間の皮膚にこの分離株を接種することによって使用される。別の実施形態では、タンパク質、核酸、脂質、および他の代謝産物、培養の上清、および/またはこれらの菌株の細胞溶解物を含む分子は、プロバイオティクスで使用され得る。
本発明はまた、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株を標的化する薬剤に関する。これは、16S rDNAのメタゲノム解析と組み合わせたざ瘡菌の複数のゲノムの比較に基づき、それによって、ある種の菌株およびざ瘡と関連するゲノムの変化を特定する。ざ瘡と関連するざ瘡菌を標的化するように意図された薬剤は、カスタム設計された小分子、アンチセンス分子、siRNA分子、生物製剤、およびざ瘡と関連する菌株に特異的なゲノムの要素を標的化する抗体を含む。アンチセンスRNA、抗体、または小分子は、遺伝子座1、2、3、および4を標的化するように設計することができる。リボタイプ4、5、および10を有する菌株は、抗生物質耐性である。従って、リボタイプ4、5、および10を標的化する新しい抗生物質が当技術分野において必要である。
本発明はまた、ざ瘡菌のある種の菌株に特異的なファージからなるざ瘡を用いた影響を受けた対象のための個人化されたファージ療法に関する。一部の企業は、Phage Therapy CenterTM(http://www.phagetherapycenter.com/pii/PatientServlet?command=static_home)などのざ瘡患者のためのファージ療法を提供する。しかし、このような企業は、治療のために使用されたファージの細菌宿主特異性についての情報を提供しない。ざ瘡菌は利共生であり、いくつかの菌株は宿主に対する防御の役割を果たしている。本発明の一実施形態では、個人化されたファージ療法は、ざ瘡の影響を受けた対象のための保護的役割を欠くことが示されているざ瘡菌の菌株を標的化する選択されたファージを含む。本発明の更に別の実施形態では、個人化されたファージ療法は、健康と関連する菌株を変化させずに、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化するファージのそれらの細菌宿主の特異性に応じて開発され得る。加えて、影響を受けた対象のざ瘡菌系統の構造を特定し、ファージ感染またはプラスミド接合に対する耐性を予測するようにその構造を使用して標的の特異的なファージ療法をより良くすることが可能である。例えば、ざ瘡菌系統RT2およびRT6は、CRISPR/Casの構造を有し、それらが、ある種のファージ感染およびプラスミド接合に対する耐性を有することを示す。表5は、特異的なざ瘡菌ファージに対する特異的なざ瘡菌の菌株の感度および耐性を示す。
本発明は、以下に図示される実施例においてより詳細に記載されている。実施例は、本発明の選択された実施形態のみを表し得るが、以下の実施例は、例示に過ぎず、決してこれらに限定されない。
実施例1−ざ瘡と関連する人間の皮膚のマイクロバイオームにおけるプロピオニバクテリウムざ瘡の菌株集団の解析
人間の皮膚のマイクロバイオームは、皮膚の健康および疾患に重要な役割を果たしている。しかし、出願の発明以前は、菌株レベルでの細菌集団の構造および多様性があまり理解されていなかった。発明者らは、鼻の毛包脂腺単位をサンプリングすることによって、49人のざ瘡患者と52人の健康な個人との間で、菌株レベルおよびプロピオニバクテリウムざ瘡のゲノムレベルでの肌のマイクロバイオーム、優勢な皮膚の利共生を比較した。メタゲノム解析は、ざ瘡菌の相対的存在量は類似している一方で、菌株集団構造が2個のコホートにおいて大幅に異なるということを実証した。ある種の菌株は、ざ瘡と非常に関連し、他の菌株は、健康な皮膚内で富化されていた。66個の新規のざ瘡菌の菌株を配列決定すること、および71個のざ瘡菌のゲノムを比較することによって、本発明者らは、ざ瘡または健康と関連する様々なざ瘡菌の菌株の潜在的な遺伝的決定を特定した。この解析は、取得されたDNA配列および細菌免疫要素が、ざ瘡菌の菌株のビルレンス特性を判定する際に役割を果たし得、いくつかは、治療的介入のための標的となり得ることを示す。この研究は、人間の疾患の病原を説明する利共生菌株集団の以前に報告されていないパラダイムを実証する。それは、健康および疾患における利共生の役割を定義するために人間のマイクロバイオームの菌株レベルの解析の重要性を強調している。
背景技術
菌株レベルでの人間の微生物叢の多様性ならびに人間の健康および疾患との関連は不明な点が多い。しかし、多くの研究は、微生物関連の人間の疾患は、多くの場合、一定の種の菌株ではなく、病原である全ての種によって引き起こされることを示した。例えば、methicillin−resistant Staphylococcus aureus(MRSA)(Chambers and Deleo,2009;Chen et al.,2010;Hansra and Shinkai)、およびEscherichia coli O157(Chase−Topping et al.,2008;Tarr et al.,2005)が挙げられる。(一般的にざ瘡と呼ばれる)尋常性ざ瘡は、最高で10代の85%および大人の11%の有病率を伴う最も一般的な皮膚疾患の1つである(White,1998)。ざ瘡の病因および病原は未だ不明であるが、微生物の関与はざ瘡の発症に寄与する主な機構の1つと考えられている(Bojar and Holland,2004;Cunliffe,2002)。具体的には、プロピオニバクテリウムざ瘡が重要な病原要因であると仮定されてきた(Webster,1995)。ざ瘡菌を標的化する抗生物質療法は、30年以上にわたり主力の治療である(Leyden,2001)。しかし、数十年の研究にも関わらず、ざ瘡菌が、正常な皮膚の叢の主要な利共生でありながら、ざ瘡の病原にどのように寄与するかに関しては不明のままである(Bek−Thomsen et al.,2008;Cogen et al.,2008;Costello et al.,2009;Dominguez−Bello et al.,2010;Fierer et al.,2008;Gao et al.,2007;Grice et al.,2009)。ざ瘡菌が、利共生細菌として人間の皮膚を保護するか、またはざ瘡内の病原要因として機能するか、またはその両方かは、未解明のままである。
このように、出願人らは、メタゲノミクスおよびゲノム配列決定の組み合わせを使用して49人のざ瘡患者および52人の正常な個人における菌株レベルおよびゲノムレベルで皮膚のマイクロバイオームを比較した。最初に、各試料について、16SリボソームDNA(rDNAの)が増幅され、約400個のクローンが配列決定され、311個のほぼ完全長の16S rDNA配列の平均が解析された。ざ瘡菌の菌株の集団構造が、各試料において判定された。第2に、各ざ瘡菌の菌株は、16S rDNAのメタゲノムのデータに基づいて、ざ瘡患者においてその有病率を算出することにより、「ざ瘡指数」が割り当てられた。ざ瘡患者群と関連するざ瘡菌の菌株、ならびに正常な皮膚を有する個人において富化された菌株が特定された。このメタゲノム手法は、疾患の関連を判定することにおいて従来の手法とは根本的に異なり、それは、菌株の単離および培養における偏りおよび選択を避けることにより、従来の方法よりもより強力でかつより偏りが少ない。最後に、66個の新規のざ瘡菌の菌株が配列決定され、皮膚の微生物叢中に見られるざ瘡菌の主要な系統をカバーする71個のざ瘡菌のゲノムが比較された。この主要な皮膚利共生の皮膚マイクロバイオームおよびゲノム配列決定のメタゲノム研究を組み合わせることによって、出願人らの研究では、ざ瘡の病原内での細菌の遺伝的決定の洞察を提供し、健康および疾患における利共生の役割を理解するために人間のマイクロバイオームの菌株レベル解析の重要性を強調している。
結果
ざ瘡菌は、毛包脂腺単位を支配する
出願人らは、49人のざ瘡患者および正常な皮膚を有する52人の個人から収集された鼻上の毛包脂腺単位(「毛穴」)のマイクロバイオームを特徴付けた。ほぼ完全長の16S rDNA配列は、菌株レベルでざ瘡菌を解析することを許可したサンガー法を用いて取得された。品質のフィルタリングの後、最終的なデータセットは、位置29から位置1483の範囲の31,461個の16S rDNA配列を含有した。配列の27,358個は、99%を超える同一性を有するざ瘡菌に一致した。データは、ざ瘡菌が、クローンの87%を占める毛包脂腺単位の微生物叢を支配することを実証した(図1)。毛包脂腺単位中の他の一般的に見られる種は、表皮ブドウ球菌、プロピオニバクテリウムフメルシイおよびプロピオニバクテリウム顆粒を含み、各々が、総クローンの1%〜2.3%を表す。42属および6門に属する536種のレベル操作分類単位の合計(SLOTU)が、試料中で特定された(表S1)。
PCRの増幅に起因し、かつ異なる種間の16S rDNA遺伝子コピーの不均一な数に起因する潜在的な偏りを避けるために、全てのDNAのメタゲノムショットガン配列決定は、22個の追加の正常な個人の単位試料が実施されるまで、毛包脂腺からプールされる。微生物種は、ゲノムを参照するようにメタゲノムの配列をマッピングすることにより特定された。結果では、ざ瘡菌が最も豊富な種(89%)であることが確認された(図1)。これは、16S rDNAの配列決定(87%)から取得された結果と一致している。
16S rRNA配列のために、位置27〜1492は、PCR増幅された。しかし、配列を解析するとき、位置29〜1483のみが研究されている。位置の番号付けは、命名法の大腸菌システムに基づいている。このように、29〜1483の間の配列は、リボタイプを判定するために重要である(10個のみではなく、多くのリボタイプがある)。上位10位のリボタイプについては、16A rRNAの位置529〜1336の間の配列が十分である。
ざ瘡菌内の異なるざ瘡菌の菌株の集団
ざ瘡患者および正常な個人を比較するとき、ざ瘡菌の相対的存在量の統計的に有意差は認められなかった。その後、広範囲にざ瘡菌16S rDNA配列を解析することにより、ざ瘡菌の菌株レベルでの違いがあったかが検査された。本明細書において、16S rDNAの対立遺伝子型として各固有の16S rDNA配列は、リボタイプ(RT)と呼ばれる。最も豊富なざ瘡菌の配列は、リボタイプ1(RT1)(配列番号1)として定義された。他の全ての定義されたリボタイプは、RT1に対して99%以上の配列同一性を有する。より高い分類学的レベルで見られる分布(Bikら)と同様に、菌株レベルで、少数のリボタイプが、相当数の希少なリボタイプを有する試料において非常に豊富であった(図2)。配列クロマトグラムの慎重な検査および配列の手動補正の後、合計11,009個のリボタイプが、ざ瘡菌の16S rDNA配列に割り当てられた。小さなリボタイプのほとんどは、シングルトンであった。平均して、各個人は、3個以上のクローンを有する3±2ざ瘡菌のリボタイプを保有した。下記に説明するゲノム配列に基づいて、全ての配列決定されたざ瘡菌の菌株は、16S rDNAの遺伝子の3個の同一コピー(下記の注を参照)を有する。これは、比較される16S rDNA配列に基づいて、個人におけるざ瘡菌の菌株集団を可能にした。60個以上のクローンを有する、複数の対象に見られる上位10位の主要なリボタイプが表1に示される。
上位10位のリボタイプの解析は、疾患特異的なおよび健康特異的な関連の両方を示した。3個の最も豊富なリボタイプ(RT1、RT2、およびRT3)は、ざ瘡および正常な個人の間にかなり均等に分布した。しかし、次の7個の主要なリボタイプは、その分布に大幅な偏りがあった(表1)。リボタイプ4、5、7、8、9、および10は、ざ瘡内に統計的に大幅に富化されたこれらの6個のうちの4個を有するざ瘡患者に主に見られた(p<0.05、ウィルコクソン検定)。リボタイプ4、5、および10は、16S rDNA配列内にヌクレオチド置換G1058Cを含有し、これは、テトラサイクリンに増大した耐性を付与することが以前示された(Ross et al.,1998;Ross et al.,2001)。しかし、これらのリボタイプを保有する本研究のわずかな割合の対象のみが、抗生物質で治療され(図3)、従って、ざ瘡群内におけるこれらの3個のリボタイプの富化は、抗生物質治療と相関していなかった。これは、抗生物質の以前の使用が抗生物質耐性菌株の存在と常に関連していなかったことと、以前に抗生物質で治療されなかった何人かの患者が抗生物質に対して耐性を既に保有していることとを示した以前の研究と一致している(Coates et al.,2002;Dreno et al.,2001)。1個のリボタイプRT6は、わずか11個の対象において検出されたに過ぎないが、正常な皮膚に強く関連していた(p=0.025、ウィルコクソン検定)(表1)。正常群におけるその相対的存在量は、Human Microbiome Project(HMP)の健康的なコホートのデータに見られるものと同様であった(図3を参照されたい)。陽性の対象の割合(11/52)も同様であった。14個のHMP対象うちの3個は、RT6が前鼻孔に見られ、1個の追加の対象は、左側の耳介後方の折り目にRT6を有していた。
上位10位のリボタイプの分布に基づいて、いくつかの異なる試験を用いた統計解析が、ざ瘡と正常な皮膚(図4)との間にざ瘡菌の集団構造において有意差を示した。これは、ざ瘡試料および正常な皮膚試料が、それぞれ44%および20%の変化を説明する、主に主要な座標1および2(図4)によって分離された主要な座標解析と一致する。
異なる個人が類似のざ瘡菌の集団構造を共有するかを検査するために、試料は、上位10位のリボタイプの相対的存在量に基づいてクラスタ化された。5個の主要なマイクロバイオーム型が、ざ瘡菌の菌株レベルで観察された(マイクロバイオームI〜V型)。ざ瘡菌RT4およびRT5によって支配されているIVおよびV型はそれぞれ、主にざ瘡患者に見られた(図5および6)。同じ5個の主要なマイクロバイオーム型が、HMPデータおよびGriceらのデータ(Grice et al.,2009)で観察された(図7を参照されたい)。
71個のざ瘡菌株のゲノム配列解析
上位10位の最も豊富なリボタイプの全てが、16S rDNA配列において1個または2個のみのヌクレオチドの変化によってRT1とは異なる(表1)。16S rDNA配列におけるこのような小さな変化が、ゲノムレベルでの系統および進化の歴史を反映しているかどうかを判定するために、主要なリボタイプ1、2、3、4、5、6、および8を表す66個のざ瘡菌の分離株、ならびに2個の小さなリボタイプ16および532が、ゲノムの配列決定のために選択された。これらの66個の分離株のゲノムは、完全に配列決定され、50倍以上のカバレッジの高品質のドラフトまたは完全なゲノムに対して組み立てられた。他の5個のざ瘡ゲノム、KPA171202(Bruggemann et al.,2004)、J165、J139、SK137、およびSK187は、公的に利用可能であり、解析に含められた。これらの71個のざ瘡菌のゲノムから取得されたコアゲノムにおける96,887個の固有の単一ヌクレオチド多型(SNP)の位置に基づいた系統樹が構築された。同じリボタイプを有するゲノムのほとんどは、共にクラスタ化した。樹は、16S rDNAリボタイプが、かなりの程度まで系統の関係を表し、16S rDNA配列が、主要なざ瘡菌系統を区別するために有用な分子マーカーであることを示す(図8および9)。
ざ瘡菌において検出された遺伝的要素
リボタイプによってグループ化された71個のゲノム全ての間での比較ゲノム解析が実施された。解析は、ざ瘡と関連する菌株がざ瘡病原に寄与し得る遺伝的要素、および健康と関連する菌株が皮膚の健康を維持することに寄与し得る要素を明らかにした。具体的には、ざ瘡と強い関連を有するRT4およびRT5、ならびに正常な皮膚において富化されたことが見てとれたRT6の固有のゲノム領域が、現在知られている。3個の異なる領域、遺伝子座1、2、および3は、系統樹中の分岐群IA−2に属する菌株においてほぼ排他的に見られた。分岐群IA−2は、RT4およびRT5から主になる(図8および10)。遺伝子座1および2は、染色体上に位置している。遺伝子座1は、プロファージと関連する遺伝子を含み、ゲノムアイランドであるように見える。遺伝子座2は、プラスミド組み込み部位を有し、プラスミド配列から誘導され得る。遺伝子座3は、大きな可動性遺伝要素、おそらくプラスミド上にあるように見える。プラスミドは、約55Kbの長さで、完成したゲノムHL096PA1に従って逆方向末端反復をした。配列データは、プラスミドが線状で、おそらくファージに由来することを示唆している(Hinnebusch and Tilly(1993))。RT4およびRT5の15個のゲノムのうちの1個を除く全てが、代表されるプラスミドの遺伝子の少なくとも60%を有し、それらの全ては、プラスミド中の逆方向末端反復に相同である領域を有し、それらが同一または類似の線状プラスミド(図8)を保有することを示唆している。ゲノム中のプラスミドのコピー数は、定量PCRによって確認されたゲノム配列決定カバレッジに基づき1個〜3個の範囲である(図11および図12)。
ざ瘡が富化されたRT4およびRT5菌株が、線状プラスミドおよびゲノムアイランドの2個の固有の遺伝子座を運ぶという事実は、これらのプラスミドおよび染色体の領域が、ざ瘡病原においてある役割を果たすことを示す。実際には、線状プラスミドは、他の生物におけるビルレンスにおいて役割を果たすことが示唆されている密着性(Tad)遺伝子座をコードする(Kachlany et al.,2000;Schreiner et al.,2003)。完全なTad遺伝子座は、RT4およびRT5の15個のゲノムの1個を除く全てに見られ、時々他のリボタイプに見られるに過ぎない。加えて、遺伝子座2において、サグ遺伝子クラスタがコードされたが、これは、病原における溶血活性に寄与するように示された(Fuller et al.,2002;Humar et al.,2002;Nizet et al.,2000)。図6は、RT4およびRT5にほぼ固有である遺伝子をまとめ、そのうちのいくつかは、他の生物におけるビルレンスにおいて重要な役割を果たしている。RT4およびRT5中でコードされたこれらの遺伝子のいくつかは、ビルレンスを増加させる、人間宿主へのより強い粘着を促進する、または病原の宿主免疫応答を誘発する。
ゲノムの比較解析では、RT2およびRT6の全てのゲノムが、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)をコードすることが分かった。配列決定されたゲノムの中では、RT2およびRT6は、CRISPRをコードする唯一のリボタイプである。CRISPRは、ウイルス、ファージ、プラスミドに対する防御的「免疫」を付与することを示す(Horvath and Barrangou,2010;Makarova et al.,2011)。ざ瘡菌でコードされたCRISPR遺伝子座は、大腸菌(図S10)で報告されたCRISPR遺伝子座およびストレプトコッカスサーモフィルス中のCRISPR4遺伝子座と相同である、一連のcas遺伝子、−cas3、cse1、cse2、cse4、cas5e、cse3、cas1、およびcas2からなる(Horvath and Barrangou,2010)。
CRISPRアレイは、類似した長さで、異なるヌクレオチド配列を伴うスペーサ配列によって分離された同一の反復配列のクラスタで構成される。スペーサ配列は、同一であるか、またはファージもしくはプラスミドDNA配列に対する1個または2個の不一致を伴うことが分かった。39個のスペーサ配列の合計が、8個のざ瘡菌の菌株に見られ、そのうちの25個が、表2に示すように固有であった。
予想されるように、特定可能なスペーサのほとんどは、既知のざ瘡菌ファージ配列を標的化する。しかし、固有のCRISPRスペーサ配列の間で、1個は、染色体上の遺伝子座2と一致し、3個は、主にRT4およびRT5のざ瘡菌ゲノム内のプラスミド領域(遺伝子座3)に一致した。これは、これらの遺伝子座は、RT4およびRT5の菌株によって取得され得たが、RT2およびRT6のゲノムは、CRISPR機構を介したプラスミドまたは他の外来のDNAの侵入から守られることが可能である場合があることを示唆する。
考察
ざ瘡に関連した人間の皮膚のマイクロバイオームの前述の研究は、細菌菌株レベルでの毛包脂腺単位の微生物叢の第1の肖像を提供する。ざ瘡菌は、ざ瘡および健康な皮膚の両方に見られる主要な皮膚の利共生細菌であるため、この菌株レベルでの解析は、ざ瘡の病原および健康な皮膚において、ざ瘡菌の役割を理解するのに役立つため、重要である。ざ瘡を伴うRT4およびRT5の菌株間の強い関連、およびRT6の菌株と健康な皮膚との間の強い関連が、各々が固有の遺伝的要素を伴い示される。リボタイプ7、8、9、および10、または異なる菌株間での相互作用を含む他のざ瘡菌の菌株が、疾患の発症に寄与し得る。加えて、ホルモンレベル、皮脂生成、および毛包脂腺単位の物理的変化などの宿主要因もまた、ざ瘡病原において役割を果たし得る。
ざ瘡菌の菌株と疾患または健康との関連を明らかにする前述のメタゲノム手法は、従来の方法を用いた以前の研究よりも強力である(Lomholt and Kilian,2010;McDowell et al.,2011)。各個人および各皮膚部位の皮膚微生物叢が、インビトロ培養条件の下で異なる成長速度を有し得る、同時に「良い」「中間」「悪い」菌株を保有し得るため、疾患の病変または健康な皮膚部位からの少数の分離株を培養することは、菌株と病気または健康との関連の正確で公平な測定を提供しない場合がある。前述の研究におけるサンプリング技術および疾患との関連は、サンプリング位置、サンプリング分野での病変の存在、または本来的に偏った培養技術に依存しない。病変皮膚のサンプリングは、意図的に興味深い結果をもたらし得るが、一方で、これらの結果は、公平なサンプリングを行い得る疾患との関連を定義することができないであろう。ざ瘡の基礎となる菌株の差を特定するための前述の研究に用いられるメタゲノム手法はまた、利共生または病原細菌と他の疾患/健康との関連の研究に適用され得る。
材料および方法
対象
ざ瘡を有する対象および正常な皮膚を有する対象が、集団の多様性および医療の歴史を最良に提示するために、個人開業、マネージドケア、公立病院の場、ならびに皮膚科診療所外を含む南カリフォルニアの様々なクリニックで募集された。対象データは、dbGaP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi−bin/study.cgi?study_id=phs000263.v1.p1)で入手可能である。ざ瘡の診断は、委員会による認可を受けた皮膚科医によって行われた。ざ瘡の存在は、Global Acne Severity Scale(Dreno et al.,2011)と密接に関連した0〜5の段階で等級付けされた。等級は、顔および鼻の両方に別々に記録され、0が正常な皮膚を表し、5が最も深刻な炎症性嚢胞性ざ瘡を表す。ざ瘡の患者では、顔の等級は、平均2.1で、1〜5までの範囲であり、鼻の等級は平均0.3で、0〜2の範囲であった。瘢痕の存在もまた認められた。正常な皮膚を有する対象は、委員会による認可を受けた皮膚科医によって判定され、顔、胸、または背中にざ瘡の病変を有していない者と定義された。研究者らがサンプリングまたは皮膚上の微生物集団に影響を与えるであろうと感じた他の皮膚の問題を彼らが抱えていた場合は、彼らは除外されもした。101人の対象の中で、59人が女性(31人のざ瘡患者および28人の正常な対象)であり、42人が男性(18人のざ瘡患者および24人の正常な対象)であった。ざ瘡のコホートの平均年齢は22.2歳であり、通常のコホートの平均年齢は29.6歳であった。ざ瘡と正常な集団との間の民族性に有意差はなかった。対象は、対象と共に各質問に目を通した医師または十分な訓練を受けた研究コーディネーターによって管理された書面の調査票に回答した。対象のほとんどは、試料を採取したとき、過去にざ瘡の治療を受けたことがなかったか、治療されていなかった(図3)。治療情報を提供した78人の対象のうちの9人のみが、試料が採取されたとき、ざ瘡の治療がされていた。9人の対象の中で、2人は抗生物質で治療され、5人は局所レチノイドで治療され、1人は抗生物質およびレチノイドの両方で治療され、1人は治療が列挙されていなかった。対象は、過去(彼らの一生のうちのいつでもよい)にざ瘡の治療履歴が求められた。治療履歴を提供した73人の対象のうちの18人が、過去にざ瘡の治療をしたことがあった。彼らの中で、7人は抗生物質で治療され、8人は局所レチノイドで治療され、2人は抗生物質およびレチノイドの両方で治療され、1人は治療が列挙されていなかった。全ての対象は、書面でインフォームドコンセントを提供した。全てのプロトコルおよび同意書は、UCLAおよびLos Angeles Biomedical Research Institute IRBsの両方によって承認された。この研究は、ヘルシンキガイドラインを遵守した。
試料
皮膚の微小面皰(白色面皰または黒色面皰)の試料は、製造者の指示に従ってBiore Deep Cleansing Pore Strips(Kao Brands Company,Cincinnati,OH)を使用して対象の鼻から採取された。清潔な手袋が、各サンプリングのために使用された。鼻から除去された後、ストリップは、50mLの無菌管内に直ちに配置され、氷上でまたは4℃で保持された。細胞は、ほとんどの場合4時間以内に溶解した。
メタゲノムDNA抽出、16S rDNA増幅、クローニング、および配列決定
個別の微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻ストリップから単離された。ゲノムDNAは、QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用いて抽出された。16S rDNAは、補足情報に詳細に記載されたHMPによるプロトコルに従って増幅され、クローニングされた。ほぼ完全長の配列は、サンガー法によって取得された。
16S rDNA配列解析
ベースコールおよび品質は、Phredを用いて判定された(Ewing and Green,1998;Ewing et al.,1998)。双方向読み取りは、組み立てられ、AmosCmp16SpipelineおよびNAST−ierを使用してNASTでフォーマットされた配列(rRNA16S.gold)のコアセットに位置合わせされた(Haas et al.,2011)。疑われるキメラは、ChimeraSlayerおよびWigeoNを用いて特定された(Haas et al.,2011)。16S rDNA配列は、広範に手動で検査された。クロマトグラムは、Phred品質スコアが30未満の全ての塩基で視覚的に検査された。適切な補正が適用された。QIIME(Caporaso et al.,2010)は、OTU中で配列をクラスタ化するために使用された。
ざ瘡菌単離および遺伝子型判定
ざ瘡菌の巨視的特徴を持つコロニーが各試料プレートから採取され、2回渡された。各分離株のリボタイプは、PCR増幅およびサンガー法による16S rDNA遺伝子の完全長の配列決定により判定された。
全てのゲノムショットガン配列決定、アセンブリ、および注釈
ゲノムHL096PA1はRoche/454 FLXを用いて配列決定され、CONSEDの大規模な手動編集を伴い、PHRAP/CONSED(Gordon et al.,1998)およびGSMAPPER(Roche,Branford,CT)の組み合わせを用いて組み立てられた。残りの65個のゲノムは、Illumina/Solexa GAIIx(Illumina, San Diego,CA)を用いて配列決定された。配列データセットは、品質トリミングによって処理され、Velvet(Zerbino and Birney,2008)を用いて組み立てられた。コード配列は、GeneMark(Borodovsky and McIninch,1993)およびGLIMMER(Salzberg et al.,1998)を使用して予測された。最終的な遺伝子セットは、Interpro、psort−b、およびKEGGからなる一連のタンパク質の分類ツールを介して処理された。より詳細なプロトコルは、http://hmpdacc.org/doc/sops/reference_genomes/annotation/WUGC_SOP_DACC.pdf.で閲覧できる。
比較ゲノム解析
71個のざ瘡菌のゲノム配列が、Nucmerを用いて比較された(Kurtz et al.,2004)。系統発生解析は、MEGA5を用いて実施された(Tamura et al.,2007)。CRISPRFinder(Grissa et al.,2007)が、CRISPR反復スペーサ配列を特定するために使用された。
補足情報
KPA171202の16S rDNA配列
全ての配列決定されたざ瘡菌ゲノムは、KPA171202を除き、各分離株内で同一である16S rRNA遺伝子の3個のコピーをコードする。KPA171202ゲノム(Bruggemann et al.,2004)に基づいて、16S rRNA遺伝子の1個のコピーは、RT1の他の2個の同一のコピーから異なる1個のヌクレオチドを有する。しかし、この突然変異は、16S rDNAデータセット内で観察されなかった。KPA171202から16S rDNA遺伝子の複数のクローンが増幅され、クローンされ、配列決定され、この突然変異を保有する配列は見られなかった。このように、KPA171202はまた、16S rDNAの3個の同一のコピーを有する。
他の人間のマイクロバイオームデータセットとざ瘡菌の菌株分布との比較
この研究で測定されたざ瘡菌のリボタイプおよびそれらの相対的存在量が、毛包脂腺単位に固有であるかどうかを判定するために、Human Microbiome Project(HMP)およびGriceら(2009)のデータからのマイクロバイオーム16S rDNAデータと類似した解析が適用された。両方のデータセットは、健康な対象から取得された。本研究からの健康な対象の主要なリボタイプの相対的存在量は、それらが異なる解剖学的部位からサンプリングされたという事実にも関わらず、これらの2個のデータセットで見られるものに非常に類似していた(図3)。RT6(6.3%)は、通常のコホートにおいて見られるものと同様に、HMPデータ中のRT4およびRT5を合わせたもの(2.8%)よりもより豊富であることが分かり、RT6は4.8%を表し、RT4およびRT5を合わせものは、クローンの1.2%を表す。同じ5個の主要なマイクロバイオーム型が、2個のデータセットで観察された(図7)。
ゲノムクラスタ化および系統樹
recA遺伝子は、4個の既知の型、IA、IB、II、およびIIIにざ瘡菌の菌株を広く分類するために使用されている(McDowell et al.,2008;McDowell et al.,2005)。コアゲノム中のSNPに基づく71個のゲノムの系統樹は、1個の分離株、HL097PA1を除いて、完全にrecA型と一致した。リボタイプ1、4、5、および532を有するゲノムのほとんどは、recAのIA型分岐群に対して分類され、これらは、更に下位分岐群IA−1、IA−2に分けることができる。分岐群IA−2は、RT4およびRT5で主に構成されている。RT4およびRT5ゲノムのほとんどは、非常に類似したゲノム配列と同じ系統に属しているように見える。16S rDNA遺伝子内のT1007Cの変異を共有するリボタイプ3、8、および16を有する全ての分離株は、recAのIB型分岐群に分類された。RT3のほとんどは、下位分岐群IB−2を形成し、RT8ゲノムは、自ら下位分岐群IB−1を形成し、これは非常にざ瘡と関連していた。注目すべきは、T854C突然変異を共有するRT2およびRT6は、他のリボタイプより遠い系統発生的関係を有し、recAのII型分岐群に分類された。これは以前の研究と一致している(Lomholt and Kilian,2010;McDowell et al.,2005)。recAのIII型のざ瘡菌の分離株は、試料中に見られなかった。
健康および疾患の状態のざ瘡菌系統の関連が、更に解析された。系統樹に沿って分岐群のざ瘡との関連の強さの明確なシフトがあった(図9)。ざ瘡(RT4、RT5、およびRT8)に強く関連すると特定された3個の配列決定されたリボタイプは、IA−2およびIB−1分岐群中の樹の一方の端部に見られたが、一方、正常な皮膚と関連すると特定されたRT6は、分岐群IIの先端の樹の他方の端部にあった(図9)。
抗生物質耐性
ざ瘡のリボタイプ4、5、および10は、16S rDNA配列内に単一のヌクレオチド置換G1058Cを含有し、これは、テトラサイクリンに増大した耐性を付与することが以前示された(Ross et al.,1998a;Ross et al.,2001)。16S rDNA配列における置換に加えて、配列決定されたRT4およびRT5の全ての菌株が、23S rDNA配列中にヌクレオチド置換を有すると判定され、これは、異なる等級の抗生物質、エリスロマイシン、およびクリンダマイシンに増大した耐性を付与する(Ross et al.,1997;Ross et al.,1998b)。培養できなかった2個を除き、これらの分離株は、テトラサイクリン、エリスロマイシン、クリンダマイシンに耐性であることが、実験的に確認された。
ざ瘡群におけるこれらのリボタイプの富化が抗生物質治療に起因し得るか否かもまた検査された。しかし、研究では、リボタイプ4、5、または10を保有するわずかな割合の対象のみが、抗生物質で治療された(表S2)。
これら3個のリボタイプのうちのいずれかを保有する29個の対象のうちの18個は、過去および現在の治療の両方に関する報告がなされた。かれらのうち、対象の50%(9/18)は全く治療されず、33%(6/18)はレチノイドで治療され、11%(2/18)は、過去に抗生物質で治療され、5.6%(1/18)は、過去に抗生物質およびレチノイドの両方で治療された。抗生物質治療による選択の理論は、この研究によって支持されていない。ざ瘡患者における抗生物質耐性菌株の以前の調査は、抗生物質の以前の使用が耐性菌株の存在下で常には生じなかったこと、抗生物質を以前使用していない何人かの患者が耐性菌株を保有していることを実証した(Coates et al.,2002;Dreno et al.,2001)。本研究における観察は、以前の研究と一致している。
CRISPRスペーサ配列
ざ瘡菌ゲノムのGC含有量により類似しているが、RT2およびRT6の菌株内で見られた4個の固有のスペーサ配列は、クロストリジウムレプタム、腸内微生物叢における利共生細菌ゲノムに最も一致するものを有する(表2)。HL096PA1ならびに他のRT4およびRT5ゲノムで保有される55Kbのプラスミドでは、Tad遺伝子座を含む、C.レプタムで見られた遺伝子と同一の35個の遺伝子の大型クラスタもまた存在する。
材料および方法
メタゲノムDNA抽出、PCR増幅、クローニング、および16S rDNAの配列決定メタゲノムDNA抽出
個別の微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻ストリップから単離され、ATL緩衝液(Qiagen)および直径0.1mmのガラスビーズで充填された2mLの無菌の微量遠心管内に配置された(BioSpec Products,Inc.,Bartlesville,OK)。細胞を室温にて4,800rpmで3分間ビードビータを用いて溶解した。5分間14,000rpmで遠心分離した後、上清が回収され、QIAamp DNAマイクロキット(Qiagen)を用いたゲノムDNA抽出のために使用された。チューインガムからDNAを抽出するための製造業者のプロトコルが使用された。ゲノムDNAの濃度は、ナノドロップ1000分光光度計で判定された。
16S rDNAのPCR増幅、クローニング、および配列決定
メタゲノム試料のほとんどは、以下の配列を有する16S rDNAの特異的なプライマーを用いて三重に増幅された:27f−MP 5’AGRGTTTGATCMTGGCTCAG−3’および1492r−MP 5’−TACGGYTACCTTGTTAYGACTT−3’。PCR反応は、0.5U/μLのPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)、Epicentre Fail−Safe PCRシステムからの1X事前混合E PCR緩衝液、0.12μM濃度の各プライマー27f−MP、1492r−MP、およびシグマPCRグレード水を含有する。1マイクロリットルのDNA(0.2に至るまで、合計10ng)が、各反応に添加された。G−ストームGS4サーモサイクラー条件は以下の通りであった:5分間96℃で初期変性、30秒間94℃で30サイクルの変性、1分間57℃でアニーリング、2分間72℃で延長、7分間72℃で最終延長。増幅に続いて、A−テーリング反応は、増幅反応物に1UのGOTaq DNAポリメラーゼの直接添加、および10分間72℃でサーモサイクラー中でのインキュベーションにより実施された。
各ソースDNAから3個のPCR増幅反応物がプールされ、ゲル精製された(SYBRグリーン蛍光色素で染色された1.2%アガロースゲル)。1.4Kbの生成物が切除され、Quigen QIAquickゲル抽出キットを用いて更に精製された。精製された生成物は、InvitrogenのTOPO TAクローニングキットを使用してOneShot大腸菌細胞中にクローニングされた。
白色コロニーが、Qpixピッキングロボットを用いて、テリフィックブロス、グリセロール、およびカナマイシンを含有する384ウェルトレイ内に拾われた。各トレイは、Agilentの磁気ビーズプレップを使用して配列決定のために調製され、ABIの1/16th Big Dye Terminatorを用いて配列決定された。配列決定は、ユニバーサルフォワード、ユニバーサルリバースで、かつサブセットについては、TGTAAAACGACGGCCAGT(順方向)、CAGGAAACAGCTATGACC(逆方向)、およびCCGTCAATTCCTTTRAGTTT(907R)の配列を有する内部16S rDNAのプライマー907Rで行われた。配列反応は、長い読み取り実行モジュールを用いて50cmのアレイ上でABIのABI3730機上にロードされた。
自動化を伴わないわずかに異なるPCRおよびクローニングプロトコルが、以下に説明するように、いくつかの初期試料のために使用された。16S rDNAは、ユニバーサルプライマー8F(5’−AGAGTTTGATYMTGGCTCAG−3’)および1510R(5’−TACGGYTACCTTGTTACGACTT−3’)を用いて増幅された(Gao et al.,2007)。サーモサイクラー条件は以下の通りであった:5分間94℃で初期変性ステップ、45秒間94℃で30サイクルの変性、30秒間52℃でアニーリング、90秒間72℃で伸長、20分間72℃で最終伸長ステップ。
PCR生成物は、DNA Clean and Concentrator Kit(Zymo Research)を用いて精製された。続いて、16S rDNAの単位複製配列は、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)内にクローニングされた。One−Shot TOP−10 Chemically Competent大腸菌細胞(Invitrogen)が、ベクターで形質転換され、選択培地上でめっきされた。個別の陽性コロニーが拾われ、選択的なLB液体培地内に接種された。14時間のインキュベーション後、プラスミドは、PrepEase MiniSpin Plasmid Kit(USB Corporation)またはZyppy Plasmid Miniprep Kit(Zymo Research)を使用して抽出および精製された。クローンは、ABI3730シーケンサー(Applied Biosystems Inc.)を用いて、8分の1の化学的性質を伴うサンガー配列決定法を用いて、双方向に配列決定された。
ざ瘡菌単離および培養
試料培養プレート
鼻ストリップの内面上の微小面皰は、すりつぶされ、無菌ループ(Fisherbrand,Pittsburgh,PA)を用いて掻き取られ、血液寒天プレート上でプレーティングされた(Teknova Brucella Agar Plate with Hemin and Vitamin K, Teknova, Hollister, CA)。プレートは、AnaeroPack System(Mitsubishi Gas Chemical Company,Tokyo,Japan)を用いて5〜7日間37℃で嫌気的にインキュベートされた。
単離および個別の菌株の培養
ざ瘡菌の巨視的特徴を持つコロニーが各試料プレートから採取され、A培地プレート上に画線された(カシン膵臓ディガス(Pancreatic Digase of Casine)、ディフコ酵母抽出物、グルコース、KH2PO4、硫酸マグネシウム、ディフコ寒天、および水)。これらの第1の通過プレートは、次いで、5〜7日間37℃で嫌気的にインキュベートされた。第2の通過として、単一の単離されたコロニーが第1の通過プレートから採取され、新しいA培地プレート上に画線された。これらのプレートは、次いで、5〜7日間37℃で嫌気的にインキュベートされた。これらのプレート上のコロニーは、サブ配列のステップにおける培養、遺伝子型判定、およびゲノム配列決定のために採取された。
ざ瘡菌分離株の遺伝子型判定
各分離株は、16S rDNA遺伝子のPCR増幅によって解析された。リボタイプは、完全長の配列に基づいて判定された。所望のリボタイプの分離株は、将来の培養およびゲノム配列決定のために選択された。
ざ瘡菌の分離株のゲノムDNA抽出
分離株を5〜7日間37℃で嫌気条件下において5mLのクロストリジウム培地中で成長させた。培養物は、遠心分離によりペレット化され、3mLのリン酸緩衝塩水(PBS)で洗浄された。メタゲノムDNA抽出に使用されたものと同じプロトコルが、分離株のゲノムDNAを抽出するために使用された。
メタゲノムショットガン配列決定および解析
正常な皮膚を有する22人の個人の微小面皰試料のメタゲノムのDNA試料がプールされ、Roche/454FLXを用いて配列決定された。平均読み取り長は、236bpであった。配列決定は、13,291個の配列読み取りによって制限された。配列読み取りは、BLASTを用いてNCBIの非冗長データベースに対して位置合わせされた。種の割り当ては、97%の同一性および100%の位置合わせされた読み取り長に基づいた。
16S rDNA配列のアセンブリ、位置合わせ、および編集
アセンブリおよび位置合わせ
ベースコールおよび品質は、既定のパラメータを使用して、Phredを用いて判定された(Ewing and Green,1998;Ewing et al.,1998)。双方向読み取りは、組み立てられ、Microbiome Utilities Portal of the Broad Institute(http://microbiomeutil.sourceforge.net/)のAmosCmp16SpipelineおよびNAST−ierを使用してNASTでフォーマットされた配列(rRNA16S.gold)のコアセットに位置合わせされた。これらのツールとしては、順に、Amoscmp(Pop et al.,2004)、Mummer(Kurtz et al.,2004)、Lucy(Chou and Holmes,2001)、BLAST(Altschul et al.,1990)、およびCdbTools(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software/)を使用する。疑われるキメラは、ChimeraSlayerおよびWigeoNを用いて特定された(Haas et al.,2011)。少なくとも90%のブートストラップを有する配列は、キメラブレークポイント(ChimeraSlayer)を裏付け、そうでなければ予想される変化(WigeoN)の99%を超える分位で変化する領域を含むことが、更なる解析から除去された。
品質スクリーニング
ざ瘡菌集団の多様性解析のために、ざ瘡菌KPA171202(Bruggemann et al.,2004)16S rDNAに対して1,400個のヌクレオチドにわたって少なくとも99%の同一性を有する配列が、位置29〜1483(命名法の大腸菌システムに基づく番号付け(Brosius et al.,1978))にトリミングされた。この領域を完全にカバーしない配列は、更なる菌株レベルの解析から除外された。キメラスクリーニングは、上で説明するように、配列の0.35%未満の除去をもたらした。大多数の配列がほんの1個または2個のヌクレオチドによって異なるので、これはキメラの過小評価であり得る。低品質の配列は、除外され、15未満のPhred品質スコアを有する、位置79と1433との間の50個を超えるヌクレオチドとして定義された。詳細な菌株レベルの解析を可能にするために、データが広範囲に手動で編集された。クロマトグラムは、Phred品質スコアが30未満の全ての塩基で視覚的に検査され、適切な修正が適用された。種レベルでの解析において、16S rDNA配列は手動で編集されなかった。組み立てられた配列のキメラスクリーニングは、配列の0.65%未満の除去をもたらした。位置合わせされた配列は、位置29〜1483に同等である大腸菌にトリミングされた(Brosius et al.,1978)。この領域を完全にカバーしない配列は、更なる解析から除外された。
配列編集
26,446の組み立てられたざ瘡菌配列を表す62,000個近くのサンガー配列読み取りは、CONSED中のRT1配列にマッピングされた(Gordon,2003;Gordon et al.,1998)。多数の配列の包括的な半手動での編集が、その非常に高いペア毎の類似性によって実現可能となった:配列毎のRT1からわずか1個のヌクレオチドの変化の中央値(編集前の3個のヌクレオチドの変化)。編集は、スクリプトの使用と、シングルクリックが検査を必要とする部位にジャンプすることを可能にするCONSEDのカスタムナビゲーション機能とによって促進された。クロマトグラムは、RT1と異なった全ての低品質(Phredが30未満)の塩基について検査され、多くの一般的に発生する配列エラーを含め、必要に応じて修正された。塩基誤取り込みおよびキメラの効果を最小限にするために、4個未満の配列(周波数が0.00015未満)内で発生したRT1と異なる特異的な塩基は、信頼できないと考えられ、対応するRT1塩基に戻された。リボタイプは、100%の同一性に基づいて結果として得た配列に割り当てられた。
16S rDNA配列解析
OTUおよび分類の割り当て
QIIME(Caporaso et al.,2010b)は、99%の同一性遮断、最も遠い近隣、およびUCLUST(Edgar,2010)を用いてOTU内に配列をクラスタ化するために使用された。代表的な配列(最も豊富)が選択され、緑遺伝子のデータベースにPYNAST(Caporaso et al.,2010a)を使用して位置合わせされた。分類は、RDP法を使用して割り当てられた(Cole et al.,2009)。位置合わせは、緑遺伝子によって提供されるレーンマスクで濾過され、系統樹は、FastTree(Price et al.,2009)を使用して構築された。
上位10位のリボタイプ上でのウィルコクソン検定
各試料について、上位10位のリボタイプの各々のクローン数は、試料のざ瘡菌クローンの総数によって正規化された。正規化された総数を使用して、ざ瘡群と正常群との間の富化の重要性を試験した。Rプログラム(http://www.R−project.org)中の関数wilcox_testは、p値を計算するために用いられた。
マイクロバイオーム型の割り当て
マイクロバイオーム型は、試料がMOTHUR(Schloss et al.,2009)(図5および6)または階層的クラスタリング(Eisen et al.,1998)(図7)中のthetayc類似性を用いてクラスタ化されたとき、観察された最大の分岐群に基づいて割り当てられた。
HMPおよびGriceら(2009)のデータセットにリボタイプを割り当てる
配列は、以下の基準を満たした場合にリボタイプに割り当てられた。第一に、単一の最適な一致であった。第二に、それは、上位45位のリボタイプ(58〜1388)の間で区別するために必要とされる範囲をカバーした。第三に、差別的な位置にNsは全くなかった。最後に、10個以下の無差別的な差はなかった。
HMP16S rDNAのサンガー配列データセットは、HMP Data Analysis and Coordination Centerの許可を得てダウンロードされた。それは、14個の対象および9個の本体部位(耳介後方折り目、前鼻孔、硬口蓋、頬粘膜、喉、口蓋骨扁桃腺、肘前窩、唾液、および歯肉縁下歯垢)の8,492個のざ瘡菌配列を有する。データセットに関する更なる詳細は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi−bin/study.cgi?study_id=phs000228.v2.p1.で閲覧できる。このデータセットでは、低品質の塩基(Phred品質が20未満)はNsに変換され、26%の配列は、過度のNsまたはリボタイプの差別的部位でのNsのため、割り当てられなかった。1%未満は、最良の一致に等しい、またはRT1に対して10個を超える不一致があるために、未解決である。
Griceらのデータセット(2009)は、NCBI(GenBank受託番号GQ000001〜GQ116391)で入手可能である。それは、10個の対象の22,378個のざ瘡菌配列および21個の皮膚部位(臀部、肘、小指球の掌、掌側の前腕、前腕前部窩、腋窩ボールト、臀部折り目、鼠径折り目、指間の趾間、鼻孔、足底の踵、膝窩、爪先の趾間、臍、翼状の折り目、背中、外耳道、眉間、胸骨柄、後頭部、および耳介後方の折り目)を有する。配列の3%が、RT1に対する10個を超える不一致のために割り当てられなく、1.6%が、最良の一致に等しいために割り当てられなかった。
比較のために、未編集の16S rDNA配列は、上で説明したものと同様の方法によりリボタイプに割り当てられ、結果は図3に示されている。配列の0.6%未満が、RT1に対する10個を超える不一致のために割り当てられなく、1.7%が、最良の一致に等しいために割り当てられなかった。
66個のざ瘡菌の分離株の全てのゲノムショットガン配列決定、アセンブリ、および注釈
ゲノムHL096PA1
ゲノムは、UCLA遺伝子型判定および配列決定コアでRoche/454FLXを用いて配列決定された。590,054個の配列読み取りの合計は、230bpの平均読み取り長で生成された。これらのうち、433,896個が組み立てられ、2個のコンティグ、2,494,190bpの円形の主要染色体、および55,585bpの線状プラスミドとなった。アセンブリは、CONSEDの大規模な手動編集を伴い、PHRAP/CONSED(Gordon et al.,1998)およびGSMAPPER(Roche)の組み合わせによって達成された。GeneMark v2.6r(Borodovsky and McIninch,1993)およびGLIMMER v2.0(Salzberg et al.,1998)が、遺伝子予測をコードした実施されたアブイニシオタンパク質に使用された。tRNAScan−SE1.23は、tRNAの特定のために使用され、RNAmmerは、リボソームRNA遺伝子(5S、16S、および23S)を予測するために使用された。ゲノム注釈の結果は、Pfam(http://pfam.jouy.inra.fr/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg)、およびCOG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)を含む、公開データベースにおける自動化された検索に基づいていた。注釈の手動検査もまた、実施された。
他の65個の分離株のゲノム
ゲノムは、Illumina/Solexa Genome Analyzer IIxを使用して配列決定され、セントルイスのワシントン大学のゲノムセンターによって注釈付けされた。
アセンブリ
各ゲノムDNA試料は、無作為に剪断され、指数付けされたライブラリは、標準イルミナプロトコルを用いて構築された。12個の一意的にタグ付けされたライブラリがプールされ、GAIIxフローセルの1個のレーン上で実行され、ペアエンド配列が生成された。別個の試料へのタグ付き読み取りのデコンボリューションに続き、データセットが、q10閾値でBWA(Li and Durbin,2009)品質トリミングを用いて処理された。長さが35bp未満にトリミングされた読み取りは廃棄され、残りの読み取りは、oneButtonVelvet、ユーザが提供したK−merの範囲にわたりVelvetアセンブラ(Zerbino and Birney,2008)を何度も実行するオプティマイザプログラムを用いて組み立てられたが、一方、アセンブラのパラメータセットのいくつかを変更し、最長のN50コンティグの長さをもたらすアセンブリパラメータセットを最適化した。
注釈
コード配列は、GeneMark v3.3(Borodovsky and McIninch,1993)およびGLIMMER v2.13(Salzberg et al.,1998)を使用して予測された。GeneMarkおよびGLIMMERに跨らない遺伝子間領域は、NCBIの非冗長データベースに対してBLASTを使用して位置合わせされ、予測は、タンパク質の位置合わせに基づいて生成された。tRNA遺伝子は、tRNAscan−SE1.23を用いて判定され、非コーディングRNA遺伝子は、RNAmmer−1.2およびRfam v8.0によって判定された。最終的な遺伝子セットは、一連のInterpro、psort−b、およびKEGGからなるタンパク質の分類ツールを介して処理された。遺伝子生成物の命名は、BERパイプライン(JCVI)に由来する。より詳細な標準操作プロトコル(SOP)は、http://hmpdacc.org/doc/sops/reference_genomes/annotation/WUGC_SOP_DACC.pdf.で閲覧できる。
71ざ瘡菌ゲノムの解析および比較
ざ瘡菌ゲノムのコア領域の特定
「コア」領域は、71個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義された。ざ瘡菌KPA171202は、参照ゲノムとして使用された。他の70個のゲノム配列(ほとんどのゲノムおよび2個の完全なゲノム内の一連のコンティグ)の各々は、Nucmerを使用して参照ゲノムにマッピングされた(Kurtz et al.,2004)。Nucmerプログラムの70個の「.coords」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて重複領域を特定するために解析された。最後に、「コア」配列は、上で算出された座標を有するKPA171202のゲノム配列に基づいて抽出された。平均して、ゲノムの90%(88%〜92%の範囲)が、コア領域に含まれていた。
コア領域におけるSNPの特定
単一ヌクレオチド多型(SNP)は、デフォルトの設定でNucmerプログラム(Kurtz et al.,2004)のユーティリティオプション「show−snps」を用いて特定された。ざ瘡菌KPA171202のゲノム配列は、参照ゲノムとして使用された。Nucmerプログラムの70個の「.snps」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて、固有のSNP位置を特定するために解析された。コア領域中のSNPは、系統樹を構築するために更に解析された。
系統樹の構築
コア領域における96,887個のSNPヌクレオチドのうちの71個の連結配列が、ざ瘡菌ゲノムの系統樹を構築するために使用された。ゲノムの中のコア領域の進化的距離は、近隣結合法(Saitou and Nei,1987)を用いて推測された。1,000個の複製から推測されたブートストラップ樹が採取された。80%未満のブートストラップ複製で再現されたパーティションに対応する分岐は、崩壊した。図8は、トポロジのみを示す。図9では、樹は、系統樹を推測するために使用される進化的距離のものと同じ単位の分岐長を有する一定の縮尺で描かれた。進化的距離は、p距離法を用いて計算され、部位毎のヌクレオチド相違数単位中に存在する。この樹は、コア領域に基づく比較を示す。距離は、各ゲノムの非コア領域が本明細書では考慮されていなかったため、異なるゲノム間の真の進化的距離を表していない。隙間および不足しているデータを含有する全ての位置が解消された。進化解析は、MEGA5(Tamura et al.,2007)を用いて行われた。
遺伝子の含有量の比較
71個のゲノムにわたる遺伝子含量の保全を評価するために、全てのゲノム中の遺伝子をコードするタンパク質は、それがその全長にわたって少なくとも90%のヌクレオチド同一性を有する場合、長さを低減することにより第1の選別によりUCLUST(Edgar,2010)を使用してクラスタ化され、その後、既存のシード配列に各配列をクラスタ化し、それ以外の場合は、新しいシードとなった。可視化のために、データはそれぞれ、遺伝子およびゲノムを表す列および行に再フォーマットされた。ゲノム中に1個以上の遺伝子のコピーが存在するように処理された。遺伝子の列は、HL096PA1ゲノム、55Kbプラスミドを有する完全に完成したゲノムの座標に基づいて、その位置によって分類された。ゲノムの行は、上で説明されたSNP系Neighbor Joining樹内のそれらの位置によって分類された。
CRISPR/Casの特定
CRISPRFinder(Grissa et al.,2007)が、CRISPR反復スペーサ配列を特定するために使用された。HL110PA3の注釈は、HL001PA1、HL060PA1、HL082PA2、HL103PA1、HL106PA1、HL110PA4、およびJ139の菌株におけるCRISPR/Casの構造とCRISPR反復スペーサ配列の存在とを特定するために、BLASTの位置合わせのために使用された。各スペーサ配列は、NCBIの非冗長ヌクレオチドデータベースおよび参照ゲノム配列データベース(refseq_genomic)に対するBLASTの位置合わせによって注釈付けされた。
配列カバレッジ解析
MAQ(Li et al.,2008)は、Illumina/Rocheプラットフォームから参照ゲノムに純粋な配列の読み取りをマッピングするために使用された。簡単に説明すると、「マップ」コマンドは、マッピングのために使用され、「組み立てる」コマンドは、読み取りマッピングからコンセンサス配列を呼び出すために使用され、その後、「cnd2win」コマンドが、耕耘ウィンドウで平均化された情報を抽出するために使用された。1,000bpのウィンドウサイズが使用された。無作為に選択された百万の読み取りが、マッピングのために使用された。これは、約55倍〜75倍の適用範囲を有するHL096PA2、HL096PA3、HL097PA1、およびHL099PA1以外の全てのゲノムについて約40倍のカバレッジを占めた。BWA(Li and Durbin,2010)は、Roche/454プラットフォームから参照ゲノムHL096PA1に純粋な配列の読み取りをマッピングするために使用された。平均カバレッジは、1,000bpのウィンドウで算出された。
定量PCR
プラスミド(遺伝子座3)上のTadA、ならびに染色体上のハウスキーピング遺伝子PakおよびRecAを標的化する定量PCR(qPCR)は、ざ瘡菌の分離株から抽出されたゲノムDNAを用いて実施された。LightCyler 480 High Resolution Melting Masterキットが使用された(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。各10μLの反応液は、5μLのマスターミックス(2倍濃縮)、1μLで25mMのMgCl2、0.5μLで4μMの順方向および逆方向プライマー、ならびにDNAテンプレートからなっていた。4回のqPCR実行は、Roche LightCycler 480上で実施された。TadAのためのプライマー配列は、5’−GATAATCCGTTCGACAAGCTG−3’(順方向)および5’−ACCCACCACGATGATGTTT−3’(逆方向)である。pakのためのプライマー配列は、5’−CGACGCCTCCAATAACTTCC−3’(順方向)および5’−GTCGGCCTCCTCAGCATC−3’(逆方向)である。recAのためのプライマー配列は、5’−CCGGAGACAACGACAGGT−3’(順方向)および5’−GCTTCCTCATACCACTGGTCATC−3’(逆方向)である。全ての試料は、複製されなかった2回目の実行を除く、各qPCRの実行で二連で実行された。サーモサイクラー条件は以下の通りであった:95oCで10分間の初期活性化ステップ、95oCで10秒間、(各々が、各後続のサイクル毎に段階的に0.5oCの低減を伴う第1のサイクルにおいて)65oCで15秒間、72oCで30秒間からなる50増幅サイクル、0.02oC/秒のランプ速度および25/oCの取得率を伴い65oCで開始し、99oCで終了する最終的な融解曲線ステップ。DNA濃度標準は、二連で実行された。遺伝子のコピー数の比は、プラスミドおよび染色体上の遺伝子の濃度に基づいて算出された。
データの可用性
16S rDNA配列は、プロジェクトID46327下でGenBankにおいて堆積された。ざ瘡菌の菌株の全てのゲノムショットガン配列および注釈は、受託番号ADWB00000000、ADWC00000000、ADWF00000000、ADWH00000000、ADWI00000000、ADXP00000000、ADXQ00000000、ADXR00000000、ADXS00000000、ADXT00000000、ADXU00000000、ADXW00000000、ADXX00000000、ADXY00000000、ADXZ00000000、ADYA00000000、ADYB00000000、ADYC00000000、ADYD00000000、ADYE00000000、ADYF00000000、ADYG00000000、ADYI00000000、ADYJ00000000、ADYK00000000、ADYL00000000、ADYM00000000、ADYN00000000、ADYO00000000、ADYP00000000、ADYQ00000000、ADYR00000000、ADYS00000000、ADYT00000000、ADYU00000000、ADYV00000000、ADYW00000000、ADYX00000000、ADYY00000000、ADYZ00000000、ADZA00000000、ADZB00000000、ADZC00000000、ADZD00000000、ADZE00000000、ADZF00000000、ADZG00000000、ADZH00000000、ADZI00000000、ADZJ00000000、ADZK00000000、ADZL00000000、ADZM00000000、ADZN00000000、ADZO00000000、ADZP00000000、ADZQ00000000、ADZR00000000、ADZS00000000、ADZT00000000、ADZV00000000、ADZW00000000、CP003293、およびCP003294下でGenBankにおいて堆積された。
実施例2−プロピオニバクテリウムざ瘡の汎ゲノムおよび比較ゲノム解析
プロピオニバクテリウムざ瘡は、主要な人間の皮膚細菌である。異なる菌株が異なる悪性の特性を有し、よって、健康および疾患において異なる役割を果たすかどうかを理解するために、ざ瘡の皮膚または健康な皮膚から単離されたものがほとんどである82個のざ瘡菌の菌株のゲノムが比較された。健康利共生として、および疾患における病原体としてざ瘡菌の表現型および機能の違いを説明し得る系統特異的な遺伝的要素が特定された。多数の配列決定された菌株を解析することにより、菌株レベルおよび分子レベルでの生物の遺伝配列景観および多様性についてのより良い理解がもたらされる。
導入
プロピオニバクテリウムざ瘡は、人間の皮膚の主要な利共生である。それは、黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌などの一般的な病原体の侵入を阻害することにより皮膚の健康を維持することに寄与する。それは、トリグリセリドを加水分解し、皮膚表面の酸性pHに寄与する遊離脂肪酸を放出することによってそうする(1)。一方、ざ瘡菌は、85%を超える青年および若年成人に影響を与える毛包脂腺単位の慢性炎症性疾患、尋常性ざ瘡に歴史的に関連している(2)。メタゲノム研究は、ざ瘡菌が健康な個人およびざ瘡患者の両方における毛包脂腺単位中の優勢な細菌であることを以前に実証した(3、4)。しかし、菌株レベルでは、ざ瘡菌の集団構造は、2個の群の間で異なっていた。これらの知見は、他の疾患についての研究に従って、微生物関連の人間の疾患が、多くの場合、菌株全体ではなく種の一定の菌株によって引き起こされることを示唆した(5、6)。
ざ瘡菌は、3個の異なる型に分類されている。JohnsonおよびCumminsによる研究(7)は最初に、血清学的凝集試験および細胞壁糖解析に基づいて区別することができた、IおよびII型として知られる2個の異なるざ瘡菌の表現型を明らかにした。McDowellら(8)は、モノクローナル抗体タイプ分類によって、IおよびII型ざ瘡菌を分化した。更に、recA遺伝子の塩基配列およびより可変的な溶血素/細胞毒素遺伝子(tly)に基づくざ瘡菌の菌株のそれらの系統解析は、IおよびII型が異なる系統を表すことを実証した。それらの調査はまた、I型系統内の菌株は、IAおよびIB型として知られる2個の分岐群に更に分割することができることを明らかにした(8、9)。III型として知られているざ瘡菌、追加の系統発生群については、後述する(10)。多座の配列タイプ分類(MLST)に基づく最近の研究は、密接に関連したクラスタに更に細分化され、そのうちのいくつかは、ざ瘡を含む様々な疾患と関連していた(11〜13)。
ざ瘡菌、KPA171202、IB型菌株の第1の完全なゲノム配列は、このグラム陽性菌(14)の病原の可能性について見識を提供した。ゲノムは2.56Mbpで、60%のGC含有量を有する。シアリダーゼ、ノイラミニダーゼ、エンドグリコセラミダーゼ(endoglycoceramidases)、リパーゼ、および毛穴形成要因などの宿主分子の分解に関与する複数の遺伝子生成物を含む2,333個のオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする。しかし、単一のゲノムの配列が、生物の遺伝配列景観、および菌株間の遺伝的変異がそれらの多様な表現型および病原特性をどのように判定するかを反映していない。
菌株レベルで人間のマイクロバイオームの変化をより良く理解するために、人間マイクロバイオームプロジェクト(HMP)(15、16)の一部として、以前、健康な対象およびざ瘡患者(4)のコホートから単離された1,000個以上の菌株の集合から選択された66個のざ瘡菌の菌株の参照ゲノム配列が生成された。これらの66個の菌株は、IA、IB、およびII型を含む人間の皮膚上で見つかったざ瘡菌の主要な系統を表している。解析における全ての主要なざ瘡菌系統をカバーするために、最初に入手可能なIII型ざ瘡菌ゲノムを含め3個の追加のざ瘡菌の菌株が、配列決定された。他の研究グループ(14、17〜22)によって配列決定された13個のざ瘡菌のゲノムはまた、解析時に入手可能であった。全部で82個のゲノムを用いて、ざ瘡菌の汎ゲノム、異なる系統間の系統発生関係、同じ個人の菌株のマイクロバイオームの小進化、各系統に固有の遺伝的要素ならびに健康および疾患とそれらとの関連性を特徴付けるために比較ゲノム解析が行われた。
結果
ざ瘡菌の菌株および一般ゲノムの特徴
菌株レベルでこの重要な皮膚の利共生のゲノムの多様性を理解するために、69個の配列決定されたざ瘡菌の菌株のゲノムが解析された。これらのうち、67個のざ瘡菌の菌株は、健康な個人およびざ瘡患者の皮膚から単離され(3、4)、2個のざ瘡菌の菌株、HL201PA1およびHL202PA1は、難治性歯内病変から単離された(23)(表2−1)。
これらの69個の菌株は、これまでに単離された全ての既知のざ瘡菌系統をカバーする。菌株は、それらの16SリボソームRNA(rRNAの)配列に基づいて分類された。各固有の16S rRNA配列は、リボタイプ(RT)として定義された。全ての配列決定されたざ瘡のゲノムは、16S rRNAの3個の同一のコピーを有した。ざ瘡(4)と関連する皮膚マイクロバイオームのメタゲノム研究に基づいて、上位10位の主要なリボタイプの中で、RT1、RT2、およびRT3は、最も豊富で、健康な個人およびざ瘡患者の両方において有意差がないことが見てとれた。RT4、RT5、およびRT8は、ざ瘡患者において富化され、RT6は、健康な個人に主に見られた。69個の菌株には、19個のRT1菌株、5個のRT2菌株、15個のRT3菌株、8個のRT4菌株、7個のRT5菌株、4個のRT6菌株、6個のRT8菌株、4個の小さなリボタイプの菌株、および1個のIII型菌株が含まれていた。平均ゲノムサイズは2.50Mb(2.46〜2.58Mbの範囲)であり、GC含有量は60%であった。平均で、各ゲノムは2,626個(2,393〜2,806個までの範囲)のORFをコードした(表2−1)。
解析には、公的に入手可能であった13個の追加のざ瘡菌ゲノムが含まれていた(14、17〜22)(表2−1)。これらの13個のざ瘡菌の菌株の平均ゲノムサイズは2.51Mb(2.48〜2.56Mbの範囲)であり、GC含有量は60%であり、平均して2,319個(2,233〜2,412個の範囲)のORFをコードした。これらの13個のゲノムには、6個のRT1菌株、2個のRT2菌株、4個のRT3菌株、および1個のRT5菌株が含まれるが、しかし、RT4、RT6、RT8およびIII型の菌株のゲノムは全く入手できなかった。配列決定努力が、各ざ瘡菌の系統のためのゲノム数だけでなく、カバーされる系統数も大幅に増加させた。
ざ瘡菌汎ゲノム
ざ瘡菌の遺伝配列景観を判定するために、82個のざ瘡菌ゲノムに基づいた汎ゲノムが推定された。べき乗則回帰解析n=κNγ(24)を使用して、追加のざ瘡菌ゲノムを配列決定することによって発見されるであろう新たな遺伝子の数が推定された(図13)。解析は、αは0.788であると特定した。新たなゲノムによって追加された新しい遺伝子の平均数は、82番目のゲノムが添加されたとき、3個であった。べき乗則回帰解析n=κNγを使用して、追加のざ瘡菌ゲノムを配列決定することによって蓄積されるであろうざ瘡菌の汎ゲノムの数が推定された(図14)。指数γは0.067であり、ざ瘡菌は、3,136個の汎遺伝子(N=82)を有していた。これらの結果に基づいて、指数αが1未満であり、γがゼロを超える(24)とき、ざ瘡菌の汎ゲノムは、オープンとして定義される。αが1に近く、γがゼロに近かったため、この生物は、大きく拡張することなく、緊密に進化したと考えられている。
ざ瘡菌のゲノム間の系統発生関係
82個のざ瘡菌の菌株のゲノムの比較は、2.20Mb(平均ゲノムの88%)が全てのざ瘡菌ゲノムによって共有される(これは、本明細書では「コア領域」と称される)ことを明らかにした。コア領域内で、123,223個の固有の単一ヌクレオチド多型(SNP)が、菌株間で検出された。SNPの27パーセントは、I型に固有であり、22%はII型に固有であり、22%はIII型に固有であった(図15)。コア領域内の123,223個のSNPに基づく系統樹が構築された(図16)。樹は、菌株のrecA型の分類がゲノムに基づいた主要な分岐群と一致することを示した。recAのIA、IB、およびII型の菌株はすべて、HL097PA1およびPRP−38を除いて、それぞれ各型内で共にクラスタ化された。recAIII型の菌株、HL201PA1のみ、I型およびII型の菌株とは別個の分岐を形成した。樹はまた、菌株の16S rRNAのリボタイプがゲノム配列から推測される系統発生関係と一致したことを示した。RT1菌株のほとんどが分岐群IA−1にクラスタ化されたが、一方、全てのRT4およびRT5菌株のほとんどが分岐群IA−2にクラスタ化された。6個すべてのRT8菌株は、分岐群IB−1で共にクラスタ化された。すべてのRT3およびRT16菌株は、SK187を除いて、分岐群IB−2で共にクラスタ化された。HL030PA1およびKPA171202は、異なるIB−3分岐群として、6609と共にクラスタ化された。HL097PA1およびPRP−38は、共にクラスタ化され、McDowellらによって最近命名された新しい型ICとして分類された(22)。全てのRT2菌株は、RT6菌株と共に分岐群Iから離れた分岐群IIにクラスタ化された。RT6菌株であり、経口部位から単離されたHL202PA1は、皮膚のRT6分離株と大差はなく、共にクラスタ化された。全ての菌株の配列型は、2個の公表されたMLSTスキーム(11、13)に基づいて割り当てられ、表S1に示されている。コアゲノム領域に基づいた系統樹は、16Sのリボタイプ分類をざ瘡菌の菌株の特定および分類のために使用することができることを実証した。recAのタイプ分類よりもはるかに高い解像度を提供し、一方で、それは一般的に7〜9個の遺伝子を必要とする煩雑なプロセスであるMLSTよりも1個の遺伝子のみを必要として、はるかに簡単および迅速である。
多数の生成されたゲノム配列は、分岐群レベルでざ瘡の汎ゲノムの解析を可能にした。分岐群IA、IBおよびIIはそれぞれ、36個、33個、および12個のゲノムを有していた。上で説明したべき乗則回帰解析に基づいて、分岐群レベルでざ瘡菌はまた、recAのIA型分岐群、IB型分岐群、および限られた拡張を伴うII型分岐群のためのオープン汎ゲノムを有することが判定された(図17)。拡張率は、分岐群間で大幅に異なることはなく、種レベルでのものと類似していた。これは、ざ瘡菌の全ての主要な系統が同様の速度で進化したことを示唆している。
コアゲノム領域におけるSNPの分布
ざ瘡菌のゲノムにおける突然変異および/または組み換えのための「ホットスポット」があるかどうかを理解するために、SNPが無作為にゲノム全体に分布していたか、または特定の領域で富化されたかどうかを判定した。コア領域中の遺伝子をコードする各タンパク質におけるSNPの頻度が計算された。コア領域中の多型部位の平均速度は、5.3%、すなわち、100bp毎に一意の5.3SNPであった。この速度は、複数の腸内細菌ゲノム(25)に見られるものに匹敵する。コア領域でコードされた1,888個の遺伝子のうち、55個の遺伝子は3個以上の標準偏差(SD)でより高いSNP周波数を有し、47個の遺伝子は4個以上のSDであった(図18a)。Kolmogorov−Smirnov(K−S)試験を用いて、これらの102個の高度に突然変異した遺伝子が無作為にゲノム全体に分布していないことを実証した(P<0.01)(図18B)。これは、ざ瘡菌が進化のリスク管理戦略を有することを示唆している。Clusters of Orthologous Groups(COG)のカテゴリに基づいて、これらの102個の遺伝子の機能は、コア領域内の1,888個の遺伝子全てのものと類似の分布を示した。これらの頻繁に変異する遺伝子における特定の機能カテゴリの富化は存在しなかった。
コア領域内の突然変異が、1,888個の遺伝子についての非同義(NS)に対する同義(S)SNPの割合を計算することにより、選択下にあるかどうかが更に判定された。NS突然変異の平均率は38%であった。1,888個の遺伝子のうち、54個の遺伝子は3個以上のSDと高いNS突然変異率を有し、13個の遺伝子は4個以上のSDを有した(図18C)。これらの67個の遺伝子は、ゲノム中に無作為に分布し、一部の領域で特に富化されてはいなかった(K−S試験でP>0.05)(図18d)。高いSNPの頻度を伴う102個の遺伝子のほとんどは、これらの67個の遺伝子と重複しておらず、独立した進化的イベントがこれらの遺伝子の変更につながり得ることを示唆している。10個の遺伝子のみが、全てが仮想タンパク質として注釈付けされた、高いSNP頻度および高いNS突然変異率の両方を有していた。
同じ個人から単離された菌株の進化的関係
ざ瘡患者および健康な個人のコホートから単離された多数のざ瘡菌の菌株は、同じ個人の毛包内のざ瘡菌の菌株がクローン性であるかの調査を可能にした。以前のメタゲノム解析に基づいて、ほとんどの個人が異なる系統(4)の複数のざ瘡菌の菌株を保有することが実証された。しかし、同じ個人の同じ系統の菌株が同じ祖先に由来するかは不明であった。同じ試料から単離された菌株のゲノム配列は、同じ個人の菌株(SSI)がクローン拡張を介して同じ起源から進化したかを検査することを可能にした。69個の配列決定されたざ瘡菌の菌株は、49個のSSIを含む:13組のデュエット(すなわち、13人の個人から単離された菌株の13組のペア)、5組のトリオ、および2組のカルテット。23個のSSIは、同じ分岐群中(分岐群IA−1中に9個、分岐群IA−2中に4個、分岐群IB−1中に2個、分岐群IB−2中に6個、分岐群II中に2個)でクラスタ化された。SSIの各ペア間の距離(コア領域内の123,223個のSNP部位における置換率)が算出された(図16)。分岐群IA−1のSSIの平均距離は、0.0014であったが、一方、分岐群IA−1内の異なる個人の菌株の平均距離は、0.0064(P<0.001)であった。一貫した結果が、IA−2、IB−1、IB−2、およびIIを含む他の分岐群中に観察された(図19a)。これは、同じ系統のSSIが、異なる個人から単離された菌株よりも互いに大幅により類似することを実証し、それらが各個人においてクローン性であることを示唆した。しかし、分岐群IA−2内のRT4およびRT5菌株の中で、SSIの間の平均距離(0.0004)は、異なる個人(0.0017)(P=0.072)の菌株の間の平均距離から大幅に異なることはなかった。更に、異なる個人のRT4/RT5菌株間の平均距離(0.0017)は、分岐群IA−1内のSSI間の平均距離(0.0014)に類似しており、分岐群IB−1(0.0059)、IB−2(0.0019)、およびII(0.0022)内のSSI間の平均距離よりなお短い(図S3A)。これは、異なる個人から単離されているが、これらのRT4およびRT5菌株はクローン性であるように見え、同じ最近の祖先から進化したことを示唆している。分岐群IC内の2個のRT5菌株間の同様の関係が認められ、異なる個人から単離されたHL097PA1およびPRP−38は、0.0012の距離で密接に互いに関連していた。メタゲノム研究は、ざ瘡とRT4およびRT5の菌株の強い関連性を実証した(4)。異なる個人から単離されたこれらの菌株のクローンは、RT4およびRT5菌株が個人間で伝染され得ることを示唆している。この知見は、抗生物質耐性プロピオニバクテリアは、抗生物質耐性ざ瘡菌の菌株のほとんどがRT4およびRT5(4、13)に属しているので、皮膚科医を含め、ざ瘡を起こしやすい個人(26)間で伝染性であったという以前の臨床報告と一致している。SSIの解析は、RT4およびRT5菌株がざ瘡中の病原要因であり得るという理論を更に裏付けている。
同じ個人からであるが異なる系統に属する菌株のペア間の距離がランダムな菌株のペアとは異なっているかどうかを判定するために、異なる分岐群の任意のペアのSSIの距離が計算された。分岐群IA−1およびIA−2の間のSSIの平均距離(すなわち、HL005PA3対HL005PA1、HL005PA2対HL005PA1、HL096PA3対HL096PA1、およびHL096PA3対HL096PA2)は、0.039であり、異なる個人(0.040)からの分離株のそれに類似していた。同様の結果が、他の全ての分岐群ペアの比較について取得された(図19b)。
これらの結果は、異なる分岐群のSSIが、異なる個人の菌株と同様に互いに異なっているということを実証した。この解析は、各個別のマイクロバイオーム中でざ瘡菌の菌株は、同じ集団におけるクローン拡張を経験するが、一方、複数の菌株集団は、多くの場合、ほとんど組み換えせずに同じ群集に共存できることを示唆している。
I型菌株における非コアゲノム領域
82個のざ瘡菌の菌株のゲノム配列を比較することにより、82個すべての菌株によって共有されなかった非コアゲノム領域が特定された。非コア領域の全長は約0.90Mbであった。非コア領域の平均GC含有量は、コア領域のそれ(58%±6.9%)よりもわずかに低く、非コア領域の一部が、水平遺伝子伝達を介して他の種に由来し得ることを示唆していた。
ざ瘡菌の菌株の異なる系統が、異なる非コア領域を有する。非コア領域の階層的クラスタリングを使用して、同じリボタイプの菌株が分岐群間で異なる分離を伴いクラスタ化されたことが示された(図20)。非コア領域の中で、各系統に特異的な遺伝的要素が特定され、これは、表現型ならびに健康および疾患における菌株の機能的違いを説明し得る。分岐群IA−2中でゲノム遺伝子座1、2および3が特定され、これは、主にRT4およびRT5菌株(4)に固有であった。これらの遺伝子座は、可動要素に由来するように見え、いくつかの悪性の遺伝子をコードし、これらの菌株のビルレンスに寄与し得る。一方で、ゲノムアイランド様クラスタ2(GI2)(18)は、この分岐群内の菌株のほとんどで一意に不在であった。全てのRT8菌株からなる分岐群IB−1はまた、我々のメタゲノム研究(4)に基づいたざ瘡に高度に関連していた。それらは全て、長さ20Kbの固有のゲノムアイランド(遺伝子座4)を有し、一連の非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)をコードし、これは、これらの菌株の増大したビルレンスに寄与し得る。ほとんどのRT3およびRT16菌株が、分岐群IB−2に属し、他の分岐群内の菌株よりも少ない非コア領域を有する。これは、全体の再編成ホットスポット(RHS)ファミリータンパク質の欠如によって説明され得、これは、以前に大腸菌(27)に関与したようにゲノム再編成において機能する。KPA171202を含む3個の菌株からなる分岐群IB−3。以前に説明した4個のゲノムアイランドのうちの3個(18)、GI1、GI3、およびGI4は、この分岐群に固有であり、他の全ての菌株には存在しなかった。この解析は、KPA171202はざ瘡菌の最初に配列決定された完全なゲノムであったが、主要な系統の1系統を表す一般的な皮膚のざ瘡菌の菌株には見えなかったことを示唆している。この結果は、MLST(11〜13)を使用した以前の研究と一致している。分岐群ICの菌株はRT5に属する。それらはまた、分岐群IA−2のRT4およびRT5菌株の遺伝子座3に高い相同性を有し、クロストリジウムレプタム(4)に由来する粘着遺伝子座をコードする遺伝子座3、線状プラスミドを含む。一般に、異なる系統における菌株は、類似の遺伝物質の取得および喪失を伴い類似のゲノムサイズを有していたが、それらは、異なるビルレント特性を生じさせ得る異なる遺伝的要素を保有する。
II型菌株における非コアゲノム領域
分岐群IIにおける菌株、主にRT2およびRT6は、より離れて分岐群Iの菌株に関連していた。メタゲノム研究に基づき、RT2がざ瘡患者および健康な個人の間で均等に分布していたとき、分岐群II中の菌株はざ瘡と関連していなかったが、一方、RT6は健康な個人(4)に大幅に富化されていた。I型の菌株と比較して、RT2およびRT6菌株のゲノムは、長さが合計約92Kbで、107個のORFをコードするいくつかの領域を欠いている。RT2およびRT6ゲノムは、93個のORFをコードする類似のサイズの追加のゲノム領域を有する(図20)。COG分類に基づいて、107個のI型に特異的なORFおよび93個のII型に特異的なORFの間の機能的カテゴリの分布に有意差はなかった。
RT2およびRT6菌株の最も固有のゲノム機能は、クラスタ化された定期的な間隔を置いた短いパリンドローム反復(CRISPR)/CAS遺伝子座(4)によって表される。CRISPR/Casシステムは、配列特異的に核酸を標的化することによって、ウイルスおよびプラスミドに対する獲得された細菌の耐性を提供する(28)。すべての配列決定されたRT2およびRT6の菌株は、完全な1組のCRISPR/Cas遺伝子ならびに少なくとも1個の反復およびスペーサ配列をコードしたが、他のリボタイプの菌株は全くしなかった。その完全なゲノム配列(20)に基づいて、菌株ATCC11828は、例外であるように見え、末端配列のみを有し、スペーサ配列は全く有さなかった。しかし、PCRおよび配列決定を使用して、ATCC11828が1個の反復スペーサ配列を有することが判定された(表S2)。
48個のスペーサ配列の合計が、11個のRT2およびRT6の菌株に見られ、そのうちの29個が固有であった。他の細菌種において、リーダ近位端のスペーサはより多様化される一方で、リーダ遠位端のスペーサは菌株間でより保存されることが実験的に計算によって確立された。RT2およびRT6の菌株の共有スペーサ配列に基づいたRT2およびRT6の菌株間の進化的関係が解析された。分岐群IIに緊密にクラスタ化されたHL060PA1およびHL082PA2は、同じスペーサS2を共有した(図21)。J139、ATCC11828、HL110PA4、HL110PA3、およびHL202PA1は、同じスペーサS17およびS18を共有した(図21)。これらの結果は、菌株のこれらの群が、おそらく追加のスペーサを獲得する前に同じ祖先から進化したことを示唆している。共有されるCRISPRスペーサに基づく菌株間の関係は、コア領域におけるSNPに基づいて算出された系統発生関係と一致している。加えて、複数のII型菌株は、主にざ瘡と関連するRT4およびRT5の菌株(4)に固有であった遺伝子座2および3中の配列に一致するスペーサ配列を保有した。遺伝子座2および3中の配列は、C.レプタムに由来するように見え、潜在的なビルレンス要因(図S4)をコードする。これらの遺伝子座は、RT4およびRT5の菌株によって取得され得たが、これらのスペーサをコードするRT2およびRT6のゲノムは、CRISPR機構を介した外来のDNAの侵入を防ぐことができる場合がある。
多数の高品質のドラフトゲノム配列が大きなゲノムの変異のみならず、小さいが不可欠なゲノムの変化をも検出することを可能にした。II型の菌株が低減されたリパーゼ活性(10)を示したことが以前報告された。リパーゼは、トリグリセリドを加水分解するおよび遊離脂肪酸を放出するように機能し、これは、ざ瘡菌のビルレンスに不可欠であると考えられている。ゲノム注釈に基づいて、13個の遺伝子は、リパーゼの潜在的な機能を特定した(図22a)。これらのうち、1個のヌクレオチドから13個のヌクレオチドの範囲で検出された挿入/削除は、II型菌株において減少したリパーゼ活性を説明し得る。2つのトリアシルグリセロールリパーゼは、ざ瘡菌のゲノム、HMPREF0675−4855およびHMPREF0675−4856中で相前後して(SK137の注釈に従って)エンコードされた。すべてのII型の菌株およびIB−3菌株が、第2のリパーゼ遺伝子HMPREF0675−4856の開始コドンの「TATAボックス」20bp上流の削除を有していた(図22b)。加えて、フレームシフトおよび中途終止コドンの導入につながる第2のリパーゼ遺伝子の124Gの位置に1個のヌクレオチド削除が存在した。これら2つの削除は、低減したリパーゼ活性を潜在的に説明し得、従って、以前の研究(4、10)においてII型の菌株中で観察されたざ瘡のビルレンスを低減させた。
III型の菌株における非コアゲノム領域
III型の菌株は、皮膚表面上にほとんど見られない。難治性歯内病変、HL201PA1から分離されたIII型ざ瘡菌の菌株は、配列決定された。この最初の入手可能なIII型ゲノムは、この系統に特異的な遺伝的要素の特定を可能にした。IおよびII型菌株型に比べ、HL201PA1のゲノムは、長さが合計43Kbで、少数の領域を欠いている(図20)。嫌気性ジメチルスルホキシドレダクターゼ(PPA0516−PPA0517)、鉄(III)ジクエン酸塩伝達システムパーミアーゼ(PPA0792−PPA0793)、3−イソプロピルりんご酸デヒドラターゼ(PPA1361−PPA1363)、およびマルトース伝達系パーミアーゼ(PPA1553−PPA1554)を含む、これらの領域でコードされた42個のORFが存在した。
考察
ハイスループットゲノム配列決定および大多数の関連する菌株の比較解析は、菌株レベルでのいくつかの病原体の広がりおよび小進化を研究するために使用され、これには、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(29)、ストレプトコッカスニューモニエ(30)、ハイチでのコレラ菌流行(31)を含み、細菌性病原体の理解を改善させることで複数の菌株の比較ゲノム解析の力を実証している。しかし、この手法は、異なる菌株の間でのそれらの多様なビルレント可能性ならびに健康および疾患の両方におけるそれらの役割を理解するように利共生種を研究するためにほとんど適用されていない。
本研究では、多数の配列決定された菌株に基づく主要な皮膚利共生のざ瘡菌の比較ゲノム解析を提示する。この菌株の収集は、健康な皮膚またはざ瘡のいずれかと関連する菌株のみならず、同じ個人の単離された多数の菌株のペアをも含む。これは、病気対疾患に関連したざ瘡の菌株ならびに同じ個人のマイクロバイオームにおける菌株の系統発生関係および小進化の比較を可能にした。
82個のざ瘡菌のゲノムを比較することにより、全てのざ瘡菌の菌株は、類似のGC含有量と類似のゲノムサイズを有し、平均で2,577個のORFをコードしたことが示された(表1)。ざ瘡菌は、他の多くのオープンゲノム種(24)とは異なり、オープン汎ゲノムを有しているが、それはゲノム当たりに添加される少数の新しい遺伝子のみを用いてゲノムの拡張を制限している(図13および14)。ゲノムの拡張率は、主要な系統内で類似している(図17)。異なったざ瘡菌の菌株間の制限された組み換えが存在し、従って、16S rRNAリボタイプは、ざ瘡菌の菌株の特定および分類のためのプロキシとして使用することができる(図16)。他のタイプ分類方法に比べて、16Sリボタイプ分類は、recAタイプ分類よりもはるかに高い解像度を有しており、従来のMLST法よりもはるかに簡単で高速である。この方法は、次世代配列決定と組み合わせることにより、ハイスループット方法で適用することができ、従って、菌株レベル(4)でマイクロバイオームの変化を検出することを可能にする。人間のマイクロバイオームの菌株レベルの変動を特定し理解することが医学的に重要であるので、これは、有利であり、重要である。
同じ個人の試料から単離された数組の菌株のゲノムが比較された(図16および19)。このゲノムデータの収集は固有のものであり、本研究のような種類のものは、個人のマイクロバイオーム内の人間の利共生の小進化を調査するために実施されていない。複数のざ瘡菌の菌株集団は、同じ個人のマイクロバイオーム内に共存していたが、一方、クローン拡張は、異なる集団間でほとんど組み換えなしに各集団内で発生することが分かった。各系統内では、同じ個人から単離された菌株は、疾患と関連する菌株、RT4およびRT5の菌株を除いて、異なる個人の菌株よりも互いにかなり多く類似していた(図19)。異なる個人から単離されたが、それらはクローン性で、同じビルレント祖先菌株から進化したように見えた(図16)。これは、これらの菌株は、伝染性であったこと(26)、それらはざ瘡病原(4)においてある役割を果たし得るという観察を裏付ける。この知見は重要であり、抗生物質耐性菌株の広がりを制御して、かつざ瘡のための新しい標的療法を開発するのに役立つであろう。
非コア領域を解析することにより、各系統に特異的なゲノム要素および変更が特定された(図20)。これらの系統特異的要素は、菌株に異なる生理的および機能的特性をレンダリングし得、従って、健康における利共生として、または疾患における病原体としての異なる役割につながる。ざ瘡と関連する菌株のうち、RT4およびRT5菌株は、可動要素に由来する3つの異なる遺伝子座をコードし、RT8の菌株は、1組のNRPを含有する異なる領域をコードする。これらの菌株に特異的な領域内でコードされたビルレント遺伝子は、ざ瘡とこれらの菌株の関連を説明し得、これらの菌株を標的化した新薬の開発に役立ち得る。ざ瘡に関連せず、健康な皮膚で富化されたRT2およびRT6の菌株はそれぞれすべて、CRISPRは/cas要素をコードする。CRISPR機構は、これらの菌株が、外来の可動要素に侵入することでビルレント遺伝子を取得することを妨げ得る。加えて、これらの菌株は、脂質代謝を変化させ得、それらのビルレンス(図22)を低減し得るリパーゼにおけるゲノムの変化を含有する。
結論として、多数のゲノムを有するざ瘡菌の遺伝的景観および多様性を特徴づけることにより、ざ瘡菌の菌株の多様な表現型を説明し得るゲノムの証拠と人間の皮膚の健康および疾患における利共生の二重の役割への新たな洞察とが提供される。この比較ゲノム解析からの知見は、人間のマイクロバイオームにおける菌株の多様性および利共生の進化に関する新たな視点を提供する。多くの現在のマイクロバイオームの研究は、健康および疾患を有する微生物群集の関連に焦点を当てているが、本研究は、菌株レベル(25)での利共生マイクロバイオームを理解することの重要性を強調する。この研究の知見はまた、ざ瘡のための新しい菌株特異的治療薬および疾患と関連する他のざ瘡菌に光を当てる。
材料および方法
ざ瘡菌の菌株
配列決定された69個のざ瘡菌の菌株のうち、67個は、ざ瘡患者および健康な個人(4)からの皮膚の微小面皰試料から単離された。他の2個の菌株、HL201PA1およびHL202PA1は、King’s College LondonでDavid Beighton氏が提供する難治性歯内病変(23)から単離された。
全てのゲノムショットガン配列決定、アセンブリ、および注釈
HL042PA3のゲノムは、Roche/454FLXを用いて配列決定され、PHRAP/CONSED(32)およびGSMAPPER(Roche)の組み合わせを用いて組み立てられた。HL201PA1およびHL202PA1は、Illumina MiSeq(250bp、ペアエンド)を使用して配列決定され、Velvet(33)を使用して組み立てられた。残りの66個のゲノムは、説明したように以前に配列決定された(4)。コード配列は、GeneMark(34)およびGLIMMER(35)を用いて予測された。
コア領域、非コア領域、および汎ゲノムの算出
コア領域は、82個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義されたが、一方、非コア領域は、すべてのゲノム中に存在しなかったゲノム配列として定義された。KPA171202は、参照ゲノムとして使用された。他の81個のゲノム配列(ほとんどのゲノムおよび10個の完全なゲノム内の一連のコンティグ)の各々は、Nucmer(36)を使用して参照ゲノムにマッピングされた。Nucmerプログラムの81個の「.coords」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて重複領域を特定するために解析された。次いで、コア配列は、上で算出された座標を有するKPA171202のゲノム配列に基づいて抽出された。
各ゲノムの固有の領域は、元の配列に加えて固有のゲノム配列を含有する「改訂」参照ゲノムを作るように参照ゲノムに添加された。全てのゲノムの全て固有の領域が汎ゲノムに含まれるまで、このプロセスは、全てのゲノムについて繰り返された。
最後に、コア領域が、汎ゲノムから差し引かれた。残りの領域は、すべての菌株によって共有されない非コア領域として定義された。タンパク質をコードする配列は、参照ファイルとしてKPA171202を使用してGeneMark.hmmによって予測された。
コア領域におけるSNPの特定
単一ヌクレオチド多型(SNP)は、デフォルトの設定(36)でNucmerプログラムのユーティリティオプション「show−snps」を用いて特定された。KPA171202のゲノム配列は、参照ゲノムとして使用された。Nucmerプログラムの81個の「.snps」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて固有のSNP位置を特定するために解析された。
系統樹の構築
コア領域における123,223個のSNPヌクレオチドのうちの82個の連結配列が、ざ瘡菌ゲノムの系統樹を構築するために使用された。MEGA5(37)が、近隣結合法およびp距離法を用いてコア領域内のSNPに基づいて距離を算出するために使用された。200個の複製から推測されたブートストラップ樹が採取された。
MLSTスキームに基づいた配列のタイプ解析
82個の分離株の配列型は、以前に公開されたMLSTスキームに基づいて判定された(11〜13)。MLST遺伝子配列は、2個のMLSTスキームで使用された全ての対立遺伝子に対してBLASTを使用して位置合わせされた。
CRISPR/Casの特定
CRISPRFinder(38)が、CRISPR反復スペーサ配列を特定するために使用された。HL110PA3の注釈は、HL001PA1、HL060PA1、HL042PA3、HL082PA2、HL103PA1、HL106PA1、HL110PA4、HL202PA1、J139、およびATCC11828の菌株におけるCRISPR/Casの構造とCRISPR反復スペーサ配列の存在とを特定するために、BLASTの位置合わせのために使用された。各スペーサ配列は、NCBIの非冗長ヌクレオチドデータベースおよび参照ゲノム配列データベース(refseq_genomic)に対してBLAST(39)によって注釈付けされた。
非コア領域の階層的クラスタリング解析
1,685個の非コア断片(合計895,905bp)のうち、500bpを超える長さの314個の非コア断片(合計747,189bp、すべての非コア領域の83%に相当)が抽出され、非コア領域の階層的クラスタリングに使用された。クラスタ3.0プログラム(40)および平均リンケージ法が使用された。クラスタリング行列は314行および82列で構成され、その中で、1は非コア領域の存在を示し、0は非コア領域の不在を示す。Java(登録商標) TreeViewプログラム(41)が、クラスタリング結果を表示するために使用された。
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実施例3−皮膚試料から微生物DNAの抽出
皮膚の微小面皰サンプリング
皮膚の微小面皰(白色面皰または黒色面皰)の試料が、特殊な粘着テープを使用して被験者の皮膚から採取された。粘着テープが上に置かれる前に、皮膚を水で湿らせた。テープは、乾燥するまで15〜20分間皮膚上に放置された。清潔な手袋が各サンプリングのために使用された。皮膚から取り外された後、テープは、50mLの無菌管内に配置された。これは、鼻、額、顎、および背中などの多くの皮膚部位に適用することができる。
細菌DNA抽出
微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻テープから個別に単離されまたは掻き取られ、緩衝液ATL(Qiagen)および直径0.1mmのガラスビーズで充填された2mLの無菌の微量遠心管内に配置された(BioSpec Products,Inc.,Bartlesville,OK)。細胞を室温にて4,800rpmで3分間ビードビータを用いて溶解した。5分間14,000rpmで遠心分離した後、上清が回収され、QIAamp DNAマイクロキット(Qiagen)を用いたゲノムDNA抽出のために使用された。チューインガムからDNAを抽出するための製造業者のプロトコルが使用された。ゲノムDNAの濃度は、分光光度計で判定された。
実施例4−マイクロバイオーム型検出
16S rDNAに基づく皮膚のマイクロバイオーム型を正確に検出するための詳細なプロトコル
PCR増幅、クローニング、および配列決定
16S rDNAは、ユニバーサルプライマー8F(5’−AGAGTTTGATYMTGGCTCAG−3’)および1510R(5’−TACGGYTACCTTGTTACGACTT−3’)を用いて増幅された。サーモサイクラー条件は以下の通りであった:5分間94℃で初期変性ステップ、45秒間94℃で30サイクルの変性、30秒間52℃でアニーリング、90秒間72℃で伸長、20分間72℃で最終伸長ステップ。PCR生成物は、列ベース方法を使用して精製された。続いて、16S rDNAの単位複製配列は、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)内にクローニングされた。One−Shot TOP−10 Chemically Competent大腸菌細胞(Invitrogen)が、ベクターで形質転換され、選択培地上でめっきされた。個別の陽性コロニーが拾われ、選択的なLB液体培地内に接種された。14時間のインキュベーションの後、列ベースのプラスミド抽出キットまたは従来の方法のいずれかを使用して、プラスミドが抽出され、精製された。クローンは、サンガー配列決定法を使用して、双方向に配列決定された。各個人のマイクロバイオーム型は、上位10位の主要リボタイプの16S rDNA配列データに基づいて判定された。図5および配列番号1〜10を参照されたい。
PCRおよびqPCRに基づく皮膚のマイクロバイオーム型を迅速に検出するための詳細なプロトコル
69個の新しいざ瘡菌のゲノムを配列決定するおよび注釈付けすることにより、かつ合計82個のざ瘡菌のゲノムを比較することにより、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に固有であるいくつかのゲノム遺伝子座が特定された(すなわち、遺伝子座1〜4)。図8を参照されたい。全ての配列のざ瘡菌の菌株からの遺伝子座1、2、3、および4のゲノム配列、およびそれらの配列類似性(95%〜100%の範囲)はそれぞれ、配列番号15〜18として列挙される。
検出方法1
患者におけるRT4およびRT5の菌株の存在または不在を迅速に検出するために、遺伝子座1、2、および3を標的化する多重PCRが設計され、ざ瘡菌の菌株および皮膚試料から抽出したゲノムDNA上で実施された。図23は、遺伝子座1、2、および3が、ゲノムデータに基づいて予測されるように様々なざ瘡菌の菌株から増幅されたことを示す。
PCRプライマー配列は表1に示される。
これらの遺伝子座を標的化する追加のプライマーは、遺伝子座1〜4(それぞれ、配列番号15〜18)のゲノム配列に基づいて設計することができる。各20μLの反応物は、12.7μLの分子グレードH2O、2μLの10Xハイフィデリティ緩衝液、0.6μLで50mMの硫酸マグネシウム、0.4μLで10nMのdNTP、0.8μLの各プライマー(最終プライマー濃度は、400nMである)、0.1μLのプラチナTaq DNAポリメラーゼハイフィデリティ(すべての試薬はInvitrogen製)、および1μLのgDNAテンプレート(約40ngのgDNA)を含有する。サーモサイクラー条件は以下の通りである:10分間95℃で初期変性ステップ、各々が45秒間95℃、30秒間65℃、45秒間72℃から成る35サイクル、10分間72℃で最終伸長ステップ。
皮膚試料のざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株の存在量を定量的に測定するために、遺伝子座1、2、および3を標的化した定量PCR(qPCR)は、ざ瘡菌の菌株から抽出されたゲノムDNA上で実施された。図12を参照されたい。LightCyler 480 High Resolution Melting Masterキットが使用された(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。各10μLの反応液は、5μLのマスターミックス(2倍濃縮)、1μLで25mMのMgCl2、0.5μLで4μMの順方向および逆方向プライマー、1μL〜3.5μLのDNAテンプレート(約2.5ngのDNA)、およびその容量に至るまで分子グレードH2Oを含有する。サーモサイクラー条件は以下の通りであった:95℃で10分間の初期活性化ステップ、95℃で10秒間、(各々が、各後続のサイクル毎に段階的に0.5℃の低減を伴うが、第1のサイクルにおいて)65℃で15秒間、72℃で30秒間からなる40増幅サイクル、0.02℃/秒のランプ速度および25/℃の取得率を伴い65℃で開始し、99℃で終了する最終的な融解曲線ステップ。
プロトコルは、模擬試料を用いて試験され、異なるざ瘡菌の菌株は、実際の試料中に菌株集団分布を模倣するように異なる割合で混合していた。表2を参照されたい。
各遺伝子座の濃度は、遺伝子座1、遺伝子座2、Pak PCR単位複製配列から誘導される標準から定量化された。各遺伝子のコピー数は、従来のPCRを用いてTadA(遺伝子座3)およびPak単位複製配列から誘導されたゲノムDNA標準から定量化された。図24を参照されたい。
検出方法2
ざ瘡菌タックマンqPCRアッセイ
プライマーおよびプローブ設計
ざ瘡菌の菌株および臨床試料中に遺伝子座1、2、3、および4を検出するためのプライマーおよびプローブが、表3に列挙されるように設計された。
三重タックマンqPCRは、すべてのざ瘡菌に存在する遺伝子座1、遺伝子座3、および内部統制、Pakを標的化するようにプロピオニバクテリウムに特異的なプライマーを用いて設計され、試験された。
遺伝子座1、遺伝子座3、およびPak増幅
ベンチトップ増幅は、設計されたプライマーの特異性を評価し、多重にする前に最適なサイクリング条件を判定するために実施された。増幅は、BioRad C1000熱サイクラーを用いて実施された。シングルプレックスPCRの反応物は、0.2μMの標的特異的なプライマー、10X白金Taq緩衝液(Invitrogen)、1.0mMのMgCl2、0.2mMの各dNPT、0.5U/μlのプラチナTaqポリメラーゼ、1μlのDNAテンプレートを含有し、最終容量10μlを構成した。サイクリングは以下の通りであった:5分間94℃で初期変性、続いて30秒間94℃で30サイクルの変性、30秒間60℃でアニーリング、30秒間72℃で延長、5分間72℃で最終延長サイクル。増幅生成物は、標的の正確な増幅およびプライマー標的との種間反応を確認するように1%のアガロース/TBEゲル上で電気泳動的に解析された。
タックマン三重PCR
三重qPCRは、Applied Biosystems7900HT機器を用いて実施された。1〜2μlの試料DNAが、X2 QuantiTect多重PCRマスターミックス(Qiagen)、0.2μMのプライマー、遺伝子座1_F、遺伝子座1_R、Pak_F、Pak_R、0.2μMのプローブ、遺伝子座1_プローブおよびPak_プローブ、0.1μMのプライマー遺伝子座3_Fおよび遺伝子座3_R、ならびに0.1μMの遺伝子座3_プローブを含有するマスターミックスに追加された。反応混合物は、無菌のPCRグレード水で20μlの最終容積を構成した。PCRプログラムは、2分間50℃での1サイクル、続いて、多重マスターミックスの活性化を可能にするための15分間95℃での1サイクル、その後、60秒間94℃でおよび90秒間57℃での45サイクルからなっていた。各実行は、培養物から抽出されたざ瘡菌のDNAの校正器、ならびに非鋳型制御(NTC)および水制御を含有した。定量PCRは、Quantitect Multiplex PCRマスターミックスで供給される受動的参照、ROXで実行された。データは、SDS v2.4ソフトウェアを用いて解析された。
アッセイの較正、感度、および特異性
ざ瘡菌標的遺伝子座1およびPakのための較正曲線は、純粋な培養物のざ瘡菌から抽出された定量化されたゲノムDNA標準の一連のログ希釈についての平均Ct値をプロットすることによって構築された。ゲノム同等物が推定された。ざ瘡菌の校正器の5個の複製を使用して、Ct値および標準偏差を計算した。これらのデータを使用して、アッセイの感度および検出限界(LOD)を判定した。較正プロットは、ゲノム当たりの遺伝子座1およびPak標的のうちの1個のコピーを用いて、臨床試料中でざ瘡菌のゲノムの数を判定するために使用された。DNA濃度およびコピー数が判定され、精製した生成物の連続10倍希釈が、遺伝子座3較正プロットを構築するための標準として使用された。遺伝子座1および遺伝子座3の存在および不在の可能な組み合わせを表示する菌株が、遺伝子座1およびPak較正のために使用された:HL038PA1(遺伝子座1+、遺伝子座3+)、HL083PA1(遺伝子座1+、遺伝子座3−)HL078PA1(遺伝子座1−、遺伝子座3+)およびHL063PA1(遺伝子座1−、遺伝子座3−)。アッセイは、臨床試料に適用される前に、既知の遺伝子座を有する純粋培養の配列決定されたざ瘡菌の菌株を使用して検証された。各標的についてのアッセイの特異性が、皮膚利共生および他のプロピオニバクテリアを含む他の細菌種を使用して試験された。
アッセイの検証
遺伝子座1および遺伝子座3を伴うまたは伴わない可能な組み合わせを含む、合計24個の配列決定されたざ瘡菌の菌株(HL063PA1,HL078PA1,HL083PA1,HL038PA1,HL037PA1,HL082PA1,HL020PA1,HL001PA1,HL046PA2,HL043PA1,HL086PA1,HL110PA3,HL110PA4,HL007PA1,HL087PA3,HL027PA1,HL056PA1,HL067PA1,HL074PA1,HL045PA1,HL053PA1,HL005PA1,HL072PA1,HL043PA2)が、三重qPCRのアッセイを検証するために使用された。qPCR三重アッセイは、以前にこれらの遺伝子座を保有するために全ゲノム配列決定により示された菌株における遺伝子座1および遺伝子座3を首尾よく特定した。
臨床試料への適用
2つの臨床試料#1および#2から抽出されたゲノムDNAは、タックマンqPCR三重アッセイを用いて解析された。増幅プロットは、両方の試料におけるざ瘡菌の存在(Pak)を明らかにした(図6)。遺伝子座1および遺伝子座3の標的はまた、試料#2と比較して、1μlの試料#1中に存在するはるかに大きな割合のざ瘡菌の遺伝子座1陽性および遺伝子座3陽性菌株を伴い両方の試料で検出された。
実施例5−ざ瘡ワクチン
16S rDNAリボタイプ(RT)4、5、7、8、9、および10を有する菌株が、高度にざ瘡と関連すると特定された。ワクチンは、これらの菌株に対して惹起され得る。T.Nakatsuji et al.,128(10)J.Invest.Dermatol.2451−2457(Oct.2008)を参照されたい。
実施例6−化粧品および他の製品のための局所クリーム、溶液等の中の健康な皮膚と関連する菌株を利用したプロバイオティクスの開発
RT6は、健康な皮膚に主に見られる。これらの菌株はざ瘡の予防および治療のための局所生成物中のプロバイオティクスとして使用することができる。HL110PA3、HL110PA4、HL042PA3、およびHL202PA1を含む4個のRT6菌株が単離され、配列決定された。
加えて、細菌の代謝物を含め、細菌の培養上清および/または細胞溶解物は、ざ瘡と関連する菌株の増殖を防止するためにクリーム、溶液、および他の化粧品に使用することができる。配列番号51〜54と少なくとも95%の相同性を共有する配列は、プロバイオティクス等の開発のために使用され得る。
実施例7−ざ瘡と関連する特異的な菌株を標的化する薬剤の開発
ざ瘡菌のコアおよび非コア領域の特定
ざ瘡の「コア」ゲノム領域は、82個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義されたが、一方、非コア領域は、すべてのゲノム中に存在しなかったゲノム配列として定義された。S.Tomida et al.,Pan−genome and Comparative Genome Analyses of Propionibacterium acnes Reveal Its Genomic Diversity in the Healthy and Diseased Human Skin Microbiome(印刷中)を参照されたい、実施例2も参照されたい。RT4および5(例えば、遺伝子座1、2および3)の菌株に特異的な非コア領域が、前述したように特定された。(遺伝子座4と表記された)RT8の菌株に特異的な非コア領域はまた、HL078PA1、HL030PA2、HL063PA2、P.acn17、HL097PA1、およびPRP38などのいくつかの他の菌株と同様に特定された。図20を参照されたい。遺伝子座4のゲノム配列は、配列番号18として記載される。ざ瘡と関連する菌株RT4、RT5、およびRT8にほぼ固有である以下の遺伝子座1〜4の遺伝子(表4−1、4−2、および4−3)が、以下に列挙される。非コア配列もまた、記載されている。これらの遺伝子座にコードされた遺伝子は、薬剤標的である。
実施例8−標的化されたファージ療法
バクテリオファージは、人間の皮膚の微生物叢を含め、組成物および微生物群集の動態の調節に重要な役割を果たしている。プロピオニバクテリウムざ瘡のバクテリオファージ、主要な皮膚の利共生は、以前に単離され、ざ瘡菌の異なる血清型を区別するためにタイプ分類システムとして使用された。しかし、これらのファージの分子特徴付けが欠けていた。ゲノム配列決定における最近の努力により、ざ瘡菌ファージおよび細菌宿主とそれらの相互作用における我々の理解が改善された。
バクテリオファージは、地球上で最も豊富な生物であり(Mc Grath&van Sinderen,2007)、多くの多様な生態系において10:1で細菌数を上回ると考えられている(Rohwer,2003)。微生物群集の重要な構成要素、バクテリオファージは、多様性を生み出す要素(Rohwer&Thurber,2009)の蓄積であり、捕食による存在量(Suttle,Chan,&Cottrell,1990)および微生物宿主の多様性の両方を制御する(Rodriguez−Valera et al.,2009)。人間の皮膚には、細菌、真菌、およびウイルスを含む何百もの微生物種が生息している(Grice&Segre,2011)。この生態系の恒常性は、皮膚上での病原の侵入とコロニー形成に対するバリアとしての機能にとって重要である。しかし、皮膚の微生物群集内の微生物間で動態の性質および駆動力について学ぶべきことが多く残されている。具体的には、皮膚上でのバクテリオファージと細菌宿主との間の相対的存在量および相互作用は、未解明のままである。
皮膚の毛包脂腺単位での微生物群集は、プロピオニバクテリウムざ瘡によって支配され、これは、微生物叢の約90%を占める(“(Nature Precedings Paper)”日付不明)。ざ瘡菌は、最も一般的な人間の皮膚疾患の1つ、尋常性ざ瘡の発症における病原要因として示唆されている(Bojar&Holland,2004;Leyden,2001)。上記の詳細な研究は、それらの16SリボソームRNA(rRNA)に基づいたリボタイプ(RT)にざ瘡菌を分類し、毛包脂腺単位中のざ瘡菌の菌株集団構造が健康な皮膚とざ瘡の影響を受けた皮膚との間で異なることを実証した。
ざ瘡菌のバクテリオファージは、人間の皮膚上に存在する。1968年にZierdtら(Zierdt,Webster,&Rude,1968)は、(ファージ174と命名された)このようなファージを(コリネバクテリウムざ瘡として知られていた時に)ざ瘡菌の分離株の自発性プラークから単離した。ファージ174は、研究で試験されたほぼすべてのざ瘡菌の菌株を溶解することができた[10]。続いて、溶解性のものから温暖なものの範囲に渡り多様なライフサイクルを示したより多くのざ瘡菌のファージが単離された[11、12]。しかし、過去数十年に渡り、ざ瘡菌のバクテリオファージの研究は、ざ瘡菌[13、14]_ENREF_4の異なる血清型を区別するためにファージタイプ分類システムの開発に限定され、ファージの広範囲の分子特徴付けが欠けていた。
ざ瘡菌のバクテリオファージの最近のゲノム配列決定(Farrar et al.,2007;Lood&Collin,2011;Marinelli et al.,2012)は、ざ瘡菌のファージの多様性に新たな洞察を提供した。ざ瘡菌ファージは、形態学的および遺伝的の両方においてマイコバクテリオファージに類似するが、はるかに小さいゲノムを有する。現在、14個のファージゲノム配列が入手可能である。追加のファージ分離株の配列決定が、多様性を更に特徴付けるために必要とされる。これらの最近の配列決定の努力にも関わらず、人間の皮膚のマイクロバイオーム中のざ瘡菌ファージのゲノムレベルでの多様性、ならびにざ瘡菌および他のプロピオニバクテリアとの相互作用は、未解明のままである。ざ瘡菌ファージは、ざ瘡菌の菌株の異なる系統間の多様な宿主特異性を有する[14]。ファージの宿主特異性は、これらのファージが群集内でざ瘡菌集団の組成物および動態をどのように調節するかを判定する上で重要である。一方で、ある種のざ瘡菌の菌株はまた、クラスタ化され等間隔に互いに離間された短いパリンドローム反復(CRISPR)配列アレイの転写に基づいた細菌免疫システムなどの、それらの抗ウイルス機構を通じてファージ集団に影響を与え得る。CRISPRアレイは、ファージDNAまたはプラスミドDNAに由来するオリゴヌクレオチド「スペーサ」を含有する。RNA干渉に類似する方法で、転写された一本鎖のCRISPR RNAの要素は、外来のDNAの相補的「プロトスペーサ」配列を含有するDNA標的の分解を対象とするようにCRISPRと関連する(Cas)タンパク質と相互作用する[16]。ざ瘡菌のゲノムの多様性を特徴付けるが、出願人らは、RT2およびRT6のざ瘡菌の菌株がCRISPRアレイを保有することを発見した。CRISPR機構はファージまたはプラスミドの侵入に対する防御において役割を果たし得る。
人間の皮膚マイクロバイオーム中の細菌とバクテリオファージとの間の相互作用、および皮膚の健康および疾患へのその寄与をより良く理解するために、ざ瘡患者および健康な個人から単離されたざ瘡菌ファージの多様性および宿主特異性が調査された。15個のファージ分離株のゲノムが調査され、それらの宿主範囲がおよび特異性を判定するために配列決定された69個のプロピオニバクテリア菌株のパネルに対してスクリーニングされた。
ファージの単離および一般的なゲノムの特徴
皮膚マイクロバイオーム中のざ瘡菌ファージの遺伝的多様性および存在量を特徴付けるために、正常な個人から109個の試料およびざ瘡患者から94個を含め、179人の個人から203個の毛包脂腺単位の皮膚試料が収集された。全ての試料は、嫌気性条件下でざ瘡菌のために培養された。49個の試料においてファージプラークが観察された:正常な個人から35個およびざ瘡患者から14個。ざ瘡菌ファージは、統計的有意性(p=0.005、フィッシャーの正確確率検定)を有するざ瘡患者からよりも正常な個人からの試料においてより頻繁に見られた。これらの試料から得られた93個のファージ分離株のうち、ざ瘡患者から5個のファージおよび正常な個人から10個が、454またはイルミナプラットフォームを用いて全ゲノム配列決定のために選択された(表3−1)。
全てのファージのゲノムは、組み立てられ、完成され、注釈付けされた(図29)。これらの15個のファージのゲノムは、同程度のサイズ(29.1〜29.5Kb)およびGC含有量(53.8〜54.5%)を有し、公開されたざ瘡菌ファージゲノムに類似する。平均して、44個のオープンリーディングフレーム(ORF)が、各ゲノム中に予測された。以前に報告されたゲノム構成と一致して[11、15]、ORFが、各ゲノムの左右の腕領域内にぎっしりと配設された。ゲノムの左腕および右腕は、転写のそれらの反対方向によって区別することができる。ゲノムの任意のペアの間の配列同一性は、78.2〜99.9%の範囲で適度に高い(表3−1)。
ざ瘡菌ファージは、遺伝子変異の異なる部位を有する高度と関連する菌株のサブグループで多様である
ざ瘡菌ファージのゲノムの多様性を調査するために、出願人らの15個のファージのゲノムおよび14個の公開されたものを含め、29個の配列決定されたファージのゲノム全てが比較された(Farrar et al.,2007;Lood&Collin,2011;Marinelli et al.,2012)。29個のゲノム全てによって共有されるコアゲノム領域は、24,475bp(平均のゲノムの長さの83%)を組み合わせた長さを有し、6,812の単一ヌクレオチド多型(SNP)を含有している。これらの6,812個のSNPから構成された系統樹(図30)は、今日までの全ての研究から単離されたファージゲノムのほとんどが、平均距離0.301(SNP部位での置換率)で互いから同程度の分岐を示すことを明らかにする。しかし、はるかにより短い系統発生距離と緊密に関連しているI群およびII群(図30)と命名された2個のファージ群も見つかった。(コアおよび非コア領域を含む)全てのゲノム配列が、系統発生関係の算出に用いたとき、同じ結果が取得された(図31)。
我々は、次に、新たに配列決定されたファージが以前に発見された系統発生群に属しているかを判定した。Loodらは、頭部タンパク質またはファージの分離株のアミダーゼをコードするヌクレオチド配列に基づいてざ瘡菌ファージの系統発生的多様性を以前に調査した[12]。3個の主要な系統発生群が報告された。出願人らのデータは、Loodらのデータと組み合わされ、出願人らは、頭部タンパク質およびアミダーゼ遺伝子配列の系統樹を再構築した。更新された系統樹は、以前の研究の菌株間の関係を再現した(図32)。しかし、出願人らのファージは、別個の分岐群にグループ分けられた。更に、現在の研究の遺伝子配列を含むことによって、全ての研究されたファージ間で最長の系統発生距離が、頭部タンパク質遺伝子について0.077から0.102に、アミダーゼ遺伝子について0.140から0.182増加した。これらの距離は、最も近い外集団(0.939、マイコバクテリオファージChe9dからの頭部タンパク質、0.764、ざ瘡菌KPA171202アミダーゼ)のものよりもなお大幅に短いが[12]、解析はざ瘡菌ファージの多様性が以前に記載されたものよりも広範囲であることを示唆している。
以前に示したようにざ瘡菌ファージのいくつかは、密接に関連する菌株であるように見える[12]。29個の配列決定されたゲノムの中でも、2個の密接に関連した菌株群が観察された(図30)。I群は、PHL066M04、PHL010M04、およびPHL073M02からなり、これは、ゲノムレベルでの0.002の平均系統発生的距離によって分離される。II群は、0.004の平均系統発生的距離を有するPHL085M01、PHL085N00、PHL115M02、およびPHL037M02からなる。コア領域、または全てのゲノムもしくは左腕または右腕コード領域のみが系統発生の算出に使用されたとき、これらの2つの群は、統計的に堅牢である(図30および31)。
I群ファージまたはII群ファージ間での遺伝的変異がゲノムの特定の領域に位置されているかが、調査された。I群ファージ間の配列変異の部位は、推定上のII型ホリンおよびペプチドグリカンアミダーゼをコードする領域内に主に位置する(PA6に注釈付けされたGp20およびGp21、図33)。これらのエンドリシンは、膜を透過し、細菌宿主からの新しいファージ粒子を放出するように細胞外ペプチドグリカン層を劣化させる。I群ファージゲノム間でこれらの2個の遺伝子における配列変異の大半は、ほとんど同義であり、タンパク質の機能に影響を与えるように見えない。PHL010M02およびPHL066M02のゲノムは、11個の部位のみで異なり、そのうち9個が予測されたコード領域で発生する。
II群のメンバー間の遺伝的変異は、PA6においてGP16、GP17、およびGP18の相同物をコードする領域内に存在する(図33)。構造タンパク質と溶解タンパク質との間の左腕の3’端部に近いこれらのタンパク質の位置は、それらのウイルスタンパク処理およびパッケージングに関与する後期作用型遺伝子であり得る。
ざ瘡菌ファージゲノムの代替的注釈
多数の新たに配列決定されざ瘡ファージの菌株は、ざ瘡菌ファージゲノムの初期注釈を検証し、精製する機会を提供する。解析に基づいて、ファージのゲノムのいくつかの代替的注釈が確認された。
配列決定された15個のファージのゲノム全ては、2個のORF、Gp22、およびGp23として以前に注釈付けされ、PA6ゲノムにおけるプラス鎖上にコードされたGP22/23遺伝子座の代替的注釈を裏付ける。相同体の多くは、これらの遺伝子の予想されるプラス鎖の位置での一貫性のないコドン開始および停止位置を有するので、PA6遺伝子GP22およびGP23の相同体は、ゲノム中で一貫して特定されなかった。しかし、マイナス鎖上で、全てのゲノムは、513〜522bpの長さ有する単一のORFをコードするように見える。この注釈は、本明細書においてGp22/23と称されるMarinelliらによって報告された注釈と一致している(Marinelli et al.,2012)(図29)。既知の関数は、元のプラス鎖注釈のGP22またはGP23に割り当てられなかったが、PHL112N00およびPHL111M01におけるGp22/23のマイナス鎖注釈は、アルスロデルマのジプセウムからジンクフィンガータンパク質にささやかな類似性を示した(E−値はそれぞれ、1.0e−4、5.7e−4)。PHL111M01注釈はまた、ストレプトマイセスアルブス(E−値2.6e−5)からのポリプレニル二リン酸シンターゼおよびフランキア属(E−値2.5e−4)からのポリケチドシンターゼに類似性を示した。ほとんどのゲノムのマイナス鎖Gp22/23のORFは、PHL067M10およびPHL114L00のものを除いて、互いの相同体である。これらの2つのゲノム中のGp22/23のORFは、別個のグループを形成し、ゲノム中の同じ遺伝子座に存在しているにも関わらず、他のGp22/23のORFに対してヌクレオチド類似性をほとんど共有しない。このORFがマイナス鎖上の全てのファージゲノムに現れるという観察は、この領域が右腕の一部であり得ることを示唆している。これは、PA6、PAD20、およびPAS50における左腕の残りの部分からGP22/23を分離するプラス鎖転写終結因子の以前の報告と一致している[11]。
〜1kbの非コード領域に近いゲノムの右腕で起こるPA6のORFのGp42、Gp45、およびGp46の相同体は、一貫して特定されなかった。ファージゲノムにおけるこれらの右腕ORFの各々の予想される位置は、多数の停止コドンをしばしば含有し、PA6ゲノムの対応する領域に制限された相同性を示した。これは、非コード領域付近の一般的に高度なヌクレオチド変異と一致しており、これらのORFが異なるファージの菌株間で異なって存在する遺伝子を表し得ることを示唆している。
配列決定データは、ファージゲノムの端部が11ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングによって隣接していることを実証した(表3−1)。10個のファージゲノムの配列決定データでは、ゲノムの3’および5’端部の両方に及ぶ1〜3個の読み取りが見てとれた。これらの読み取りにおけるゲノムの端部は、以前に報告された11ヌクレオチドの一本鎖延長と一致する配列によって一貫して分離された(Marinelli et al.,2012)。しかし、配列決定データに基づいて、15個のゲノムのうちの3個(PHL010M04、PHL073M02、およびPHL071N05)にオーバーハングの存在は、示されなかった。オーバーハングを含有する読み取りが一般にはほとんど観察されなかったので、単にそれらは検出されなかったということがあり得る(10,000読み取り毎に2.3オーバーハング読み取り)。それにも関わらず、データは、以前に提案されているようにファージDNAがそのライフサイクルのある時点で環状化し得ることを示唆する[11]。T4DNAポリメラーゼが、3’一本鎖拡張を消化して、かつ5’一本鎖拡張の補数を延長することによって断片化したライブラリDNAを「研磨」するために使用されるとき、ゲノムの一端のみにマップする読み取りにおけるオーバーハング配列の存在は、サンプル処理のアーティファクトであり得る(Roche Diagnostics,2009)。もしそうであれば、オーバーハングがゲノムの3’末端に存在し得ることがわずかな根拠で推論できる。
ざ瘡菌ファージの宿主範囲および特異性
ざ瘡菌ファージの宿主範囲および特異性を調査するために、15個の配列決定されたファージが、65個のざ瘡菌の菌株、3個のフメルシイ菌の菌株、および1個の顆粒菌の菌株を含む、69個のプロピオニバクテリウム菌株のパネルに対してスクリーニングされた。ざ瘡菌の菌株KPA171202およびATCC11828を除いて、これらのプロピオニバクテリウム菌株の全てがファージについてサンプリングされた対象の同じコホートから単離された。65個のざ瘡菌の菌株および3個のフメルシイ菌の菌株全てのゲノムが配列決定された。それらのコアゲノム領域におけるSNPに基づく65個のざ瘡菌の菌株の系統樹が構築された(図33、左の系統樹)。それらのRecA遺伝子配列[7]によってざ瘡菌の菌株の以前に確立されたタイプ分類に基づいて、細菌の収集は、各タイプ(IA−1、IA−2、IB−1、IB−2、IB−3、およびII)を表す複数の菌株で、人間の皮膚に見られるざ瘡菌のすべての主要な系統を含んだ。我々の15個の配列決定されたファージの各々に対して69個の細菌の菌株の各々の罹病性/耐性が、クロスストリーク法を使用して判定された。全体で、1,035個の細菌ファージの相互作用が判定された。各実験は、少なくとも5回反復された。ファージに対する耐性を示した細菌の菌株について、プラーク形成効率(EOP)における倍数変化は、試験されたすべての菌株に罹病性であることが知られているざ瘡菌の菌株ATCC6919に対して判定された。
ファージに対する罹病性/耐性がざ瘡菌系統と相関することが見てとれた。69個のプロピオニバクテリウムの菌株のうち5個が、少なくとも1個のファージに対する耐性において100倍以上の増加を示した。IA−1、IA−2、IB−1、およびIB−2型のざ瘡菌の菌株は全て、全ての試験されたファージに罹病性であった。しかし、IB−3型(KPA171202およびHL030PA1)の2個の菌株は、ファージのいくつかに非常に耐性であった(図34)。IB−3型の菌株は、III型の制限修飾システムの成分(KPA171202中の遺伝子PPA1611およびPPA1612)をコードする。これは、ファージに対するそれらの耐性を説明し得る。KPA171202は、ゲノム中の隠されたプロファージをコードする[17]。しかし、プロファージの配列は、配列決定されたざ瘡菌ファージのいずれにも関係せず、従って、隠れたプロファージの存在は、ファージに対する耐性を説明する可能性が低い。3個のII型の菌株はまた、ファージのいくつかに非常に耐性であった。これは、この型の菌株が、より頻繁にファージに耐性であったという以前の観察と一致している[14]。
一方で、ファージに対するざ瘡菌の菌株の罹病性/耐性は、ファージの系統と相関しなかった(r=0.1343、p値=0.115、マンテル検定)。I群またはII群において密接に関連するファージ菌株間の範囲にある宿主は、異なる(図34)。一例としては、同じ群内の他のファージにほとんど類似性を示さなかったが、II群ファージPHL115M02およびPHL037M02に類似する細菌ファージ相互作用パターンを有したI群ファージのPHL066M04が挙げられる。これらの結果は、細菌要因がファージ宿主範囲および特異性を判定する上で重要な役割を果たし得ることを示唆している。
これらのファージがざ瘡菌のみに特異的であるかどうかを判断するために、またはそれらが他のプロピオニバクテリアと相互作用することが可能である場合、細菌ファージ相互作用実験に1個の顆粒菌の菌株および3個のフメルシイ菌の菌株が含まれた。顆粒菌は、毛包脂腺単位中で約1.1%の存在量を有する一般的な皮膚利共生である[7]。フメルシイ菌は新たに定義された種である[18]。研究コホートでは、フメルシイ菌は、毛包脂腺単位において1.9%の存在量で皮膚に見られる主要な種の一つである[7]。それは、16S rRNA遺伝子配列における98%を超える同一性を有するざ瘡菌に密接に関連している[18]。顆粒菌の菌株は、試験された全てのファージに強い耐性を示したが、一方、2個のフメルシイ菌の菌株、HL037PA2およびHL037PA3は、すべてのファージに罹病性であった。第3のフメルシイ菌の菌株HL044PA1は、試験された15個のファージのうちの10個によって溶解された。これは、ざ瘡菌ファージの宿主範囲がざ瘡菌に限定されず、フメルシイ菌およびおそらく他の密接に関連するプロピオニバクテリウム種をも含むことを示唆している。
バクテリオファージに対する耐性は、ざ瘡菌の菌株における一致するCRISPRスペーサの存在と相関しない
65個のざ瘡菌の分離株のうち、8個の菌株は、RT2およびRT6(RecAII型)に属し、外来のDNAに対する細菌の適応免疫機構として機能するCRISPR/Casの遺伝子をコードする。これらのRT2およびRT6の菌株は各々、CRISPRアレイ内に33個のヌクレオチドの長さで1〜9個のスペーサを有する。合計では、それらは42個のスペーサをコードし、それらのうちの28個が固有である。
CRISPR/Casの機構は、RT2およびRT6菌株中のファージの罹病性/耐性を説明できるかが調査された。RT2およびRT6ざ瘡菌の菌株からのスペーサ配列と一致する15個のファージゲノムにおけるプロトスペーサが特定された。最大2個の不一致が、配列位置合わせにおいて許容された。すべてのファージにおいて、少なくとも2個のざ瘡菌の菌株中のスペーサと一致するプロトスペーサが特定された(図35)。これらプロトスペーサは全て、ファージゲノム中で単一コピーされたものであり、左腕に主に位置している(図36)。それらの位置は、一般的に、同じプロトスペーサ配列を保有する他のすべてのファージのゲノム間で保存されている。
8個のRT2およびRT6ざ瘡菌の菌株の罹病性/耐性パターンは、プロトスペーサ一致(r=0.207)を有する各アレイ内のスペーサ数、または少なくとも1個の一致が一般的にCRISPRアレイに対して見てとることができるかどうか(r=0.202)のいずれともほとんど相関関係を示さなかった。ファージに対する罹病性/耐性はまた、いずれかの特異的スペーサが一致したパターンと相関しなかった(最大絶対相関関係0.051)。
ファージは、プロトスペーサ認識に関与する部位を変異することによって、CRISPR防御機構を回避できる。プロトスペーサ隣接モチーフ(PAM)として知られているプロトスペーサの短いヌクレオチドモチーフ下流は、CRISPR/Casシステムの標的間で高度に保存されている[19]。これらのヌクレオチドの変異は、プロトスペーサ配列中の完全な相補性にも関わらず、CRISPR媒介性耐性を破壊することが見てとれる[20−22]。細菌の罹病性/耐性と一致するスペーサ配列の存在との間の相関関係の欠如が、PAM配列内の変異に起因するかを判定するために、HL042PA3中でコードされたスペーサ配列に正確に一致する9個のプロトスペーサのうちのPAMが調査された。これらプロトスペーサのうちの6個は、HL042PA3が耐性であるファージからのものであるが、一方、他の3個のプロトスペーサは、HL042PA3を溶解することができたファージからのものである。6個のプロトスペーサの中で、それらの33個のヌクレオチドの長さ内およびPAMを含むと予想される10個の下流のヌクレオチド内のいくつかの部位で配列保存が、観察された(図37)。これは、これらのプロトスペーサモチーフが保存され、HL042PA3のCRISPRsによって標的化することができることを示唆している。しかし、これらの同じヌクレオチド位置はまた、HL042PA3を溶解することができた他のファージ(PHL113M01、PHL112N00、およびPHL085M01)の3個のプロトスペーサ中に保存されている(図37)。従って、PAMを含むプロトスペーサモチーフの保存は、細菌の罹病性/耐性と一致するスペーサ配列の存在との間の相関の欠如を説明できない。
要約すると、データは、侵入ファージのゲノムに対して一致するCRISPRスペーサをコードすることが、効果的な防御には十分でないことを示し、CRISPR RNAおよびCas遺伝子発現の転写ならびに/または翻訳調節もまた、CRISPR媒介性耐性に必要な場合があることを示唆する。これらの細菌とファージとの間の相互作用はまた、ファージの結合、移入、複製、または放出に関与する追加のファージおよび細菌成分に依存し得る。
人間の皮膚上に存在するざ瘡菌バクテリオファージの多様な群が明らかにされた。配列決定されたファージのほとんどは、密接に関連する群を構成するある種の菌株と適度に高い遺伝的類似性を示す。これらのファージは、ざ瘡菌およびフメルシイ菌の菌株との相互作用の様々なパターンを示しているが、これらのパターンは、ファージ系統発生と相関しない。それは、ファージに対する耐性または罹病性がざ瘡菌系統と良好に相関することを判定した。IA−1、IA−2、IB−1、およびIB−2型は全て、全ての試験されたファージに罹病性であったが、一方、IB−3およびII型のある種の菌株は、いくつかファージに耐性であった。II型のざ瘡菌の菌株におけるファージ耐性は、ファージプロトスペーサに一致するCRISPRスペーサの存在と相関せず、CRISPR/Casシステムおよび/または他の抗ウイルス機構の調節などの追加の機構が、ファージ耐性の付与に必要であることを示唆している。
本研究は、皮膚のマイクロバイオームにおけるざ瘡菌バクテリオファージの重要な調節役割を示唆している。菌株特異的宿主範囲は、ざ瘡菌の群およびフメルシイ菌集団の特定のサブセットを調節するためにこれらのファージの能力を実証する。プロピオニバクテリウム集団のこれらのサブセットのうち、ファージはまた、LoodおよびCollin[11]または競争によって示唆されるように、ビルレンスを潜在的に修正する遺伝子を広め、いくつかのファージ中でコードされたgp22/23は、ポリケチド抗菌薬の生成に潜在的に関与し得ることが示唆された。両方のファージによるざ瘡菌の菌株の選択的溶解および変更は、潜在的に皮膚上のざ瘡菌の利共生および病原性株の相対的存在量を調節する。利共生と病原との間のこの微妙なバランスは、ざ瘡菌が支配する部位で皮膚の健康および疾患のために特に重要である。メタゲノムショットガン配列決定データに基づいて、毛包脂腺単位中でのざ瘡菌ファージとざ瘡菌と間の比は、ファージからはるかに異なる1:20であることが推定される[7]:ウイルスが細菌数を通常上回る環境微生物群集において推定される細菌比率[23]。これは、人間の宿主はまた、マイクロバイオームの組成および多様性の選択および調節においてある役割を果たすことを示唆している。
材料および方法
プロピオニバクテリア培養
ざ瘡菌、フメルシイ菌、および顆粒菌の菌株は、4〜6日間37℃でクロストリジウム培地(Oxoid)における嫌気条件下で培養された。プロピオニバクテリウム培養は、培地プレート上のファージ培養のための上層寒天オーバーレイを調製するために使用された(12g/Lの膵臓カゼインダイジェスト、12g/LのDifco酵母抽出、22.2mMのD−ブドウ糖、29.4mMのg/Lの一塩基リン酸カリウム、8mMの硫酸マグネシウム七水化物、20g/Lのディフコ寒天)。
ファージの単離およびDNA抽出
皮膚試料培養プレート上で見つかったプラークは、ピペットの先端で寒天を穿刺すること、および50μLのSM緩衝液(0.1Mの塩化ナトリウム、8mMの硫酸マグネシウム七水和物、1MのTris−HCl、pH7.5、2%のゼラチン、1mMの塩化カルシウム)に再懸濁することにより単離された。ファージの再懸濁は、ざ瘡菌の菌株ATCC6919を含有する上層寒天と共に培地プレート上に広がった。2日間37℃でインキュベートした後、ファージは、室温で8mLのSM緩衝液で溶出され、0.22uM PESフィルター(Millipore)で濾過され、4℃で保存された。ファージ力価は、プラークアッセイにより判定された。
ファージDNAの抽出は、以下の変更を伴いラムダミニキット(Lambda Mini Kit)(Qiagen)を使用して実施された。ファージ粒子を1時間20,000gで遠心分離によって緩衝液L2中に沈殿させた。抽出されたDNAを緩衝液QFで溶出し、遠心分離の前に−20℃で一晩イソプロパノールを用いて沈殿させた。
ファージゲノム配列および注釈
ファージゲノムは、Roche GS FLX TitaniumまたはIllumina MiSeq platformプラットフォームを使用して、多重に配列決定された。新規の読み取りアセンブリは、MIRAを用いて実施され[24]、結果として得られたコンティグは、Consedで手動で仕上げられた[25]。20,000個以上の読み取りによってカバーされたファージのために、アセンブリは、454個のデータについての10,000個の読み取り、またはMiSeqデータについての20,000個の読み取りのランダムに選択されたサブセット上で実施された。完全に組み立てられたファージゲノムは、Genemark.hmm[26]およびグリマーv3.02[27]を使用して注釈を付けされた。
ゲノム配列位置合わせおよび系統樹構築
16個のファージゲノム全ての中に存在する配列は、ファージゲノムのコア領域として定義された。これらのコア領域を特定するために、位置合わせは、Nucmerを使用して、PA6ゲノムと他の15個のファージゲノムの各々との間にまず生成された[28]。これは、所定のファージゲノムに位置合わせされたPA6ゲノム内の間隔を記述する15組の開始および終了座標をもたらした。コア領域が、15組の座標組全ての間で重複する間隔を判定することによって、全てファージについて算出された。コア領域の配列は、後続の多重配列位置合わせのために連結された。コア領域の単一ヌクレオチド多型(SNP)は、デフォルトの設定でNucmerのオプション「show−snps」を用いて特定された。MEGA5[29]を使用して、系統樹が、SNP部位に基づいてpの距離の近隣接合方法により構築された。ブートストラッピングは、200個の複製に基づいていた。
完全長のファージゲノムの多重配列位置合わせ、左および右腕コード領域、頭部タンパク質配列、およびアミダーゼ配列は各々、MAFFT[30]またはMuscle[31]を用いて生成された。系統樹は、配列間のジュークスカントール(Jukes−Cantor)距離に適用されるBioNJ法に基づいてシービュ(Seaview)[32]で構築された。全ての樹が、5,000個の複製のためにブートストラッピングされた。
変異部位の決定
I群およびII群ファージの多重配列位置合わせは、MAFFT[30]を使用して生成された。これらの位置合わせの各々において、全ての不一致および隙間(相違)の位置は、無作為に選択された参照ゲノムに対して相対的に記録された。参照ゲノムにおける隣接する隙間は、単一の相違として数えられた。参照ゲノムは、50個のヌクレオチドウィンドウに分割され、各配列ウィンドウの相違密度が、それが含む相違の総数として計算された。密度は、Artemis[33]にプロットされた。
各菌株内の単一ヌクレオチド変異を判定するために、新規のゲノムアセンブリに最初に含まれていない読み取りを含めて、各ファージのための全ての読み取りデータが、各ファージゲノムのアセンブリ中の部位としてMiraを使用して対応するゲノムにマッピングされた。
細菌耐性試験
15個のファージに対するプロピオニバクテリウム菌株の罹病性/耐性が、変更されたクロスストリークアッセイを用いて判定された。細菌菌株が培養され、培地プレートに並列に画線された(制御としてATCC6919に沿って〜1cm離れて、各プレートに5〜6個の分離株)。約106pfu/mLのうちの5μLのファージ懸濁液が、各ストリークに適用され、その後、プレートを2日間嫌気的に37℃でインキュベートされた。各クロスストリーク実験の少なくとも5つの反復が、菌株が溶解に基づいて判断される罹病性または耐性であったかを判定するために実施された。細菌菌株の耐性は、ざ瘡菌の菌株ATCC6919に相対的なファージのプラーク形成の効率をアッセイすることによって更に定量化され、以下のように計算された。
プラーク形成の効率における100倍以上の増加は、耐性の証拠であると考えられた。
ファージ相互作用の相関関係
遺伝的に類似したファージが、類似の宿主範囲および特異性を有するかどうかを判定するために、それらの系統発生と表現型との間の相関関係が算出され、後者は、細菌の耐性試験の結果に基づいた。所定のファージの宿主範囲を表す細菌の耐性表の各列は、耐性のインスタンスに1、罹病性のインスタンスに0を割り当てることによって、バイナリ形式に変換された。各列間のユークリッド距離は、全てのファージ間の表現型距離行列を計算するために使用された。ファージゲノム間の系統発生距離行列は、MEGA5を用いて計算された[29]。Rにおけるade4パッケージ[34]を用いて、マンテル検定が、2つの間の相関関係を判定するために表現型および系統発生距離行列上で実施された。10,000の順列が実施された。
CRISPR検索
CRISPRスペーサ配列は、CRISPRファインダー[35]を使用して、ざ瘡菌のゲノム中で特定された。抽出されたスペーサ配列は、BLASTnを使用して全てのファージ配列に対して位置合わせされた。最大2個の不一致を伴うプロトスペーサが特定された。
結果
人間の皮膚から単離された15個のざ瘡菌ファージのゲノムが配列決定された。ファージゲノムは、適度に高い配列類似性を示し、サイズ、組織において同程度であった。ゲノムの比較に基づいて、ほとんどのファージは互いから分岐しているが、一方、それらのいくつかは、以前に記載されていない密接に関連する群を形成している。69個のプロピオニバクテリウムの菌株のパネルに対して試験されたとき、これらのファージは、IB−3およびII型からいくつかの菌株を除くすべてのざ瘡菌の菌株を溶解した。ファージのいくつかは、プロピオニバクテリウムフメルシイの菌株を溶解することができた。ファージに対する細菌の罹病性/耐性は、ファージ系統発生、またはファージゲノム中のプロトスペーサと一致するII型ざ瘡菌の菌株におけるCRISPRスペーサの存在と有意な相関関係がないことが分かった。
結論
15個の新しいファージゲノムを用いて、ざ瘡菌ファージの多様性が、追加された新規の群を伴い以前説明したものよりも広範囲であることが判定された。宿主範囲および特異性は、ファージ間で異なるが、ファージゲノムの系統発生と相関していない。ファージゲノムに一致するCRISPRスペーサをコードすることは、ファージにざ瘡菌の耐性を付与するのに十分ではないことが分かった。本研究では、ざ瘡および他のざ瘡菌と関連する疾患の治療におけるファージの潜在的な適用に新たな洞察を提供する。
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RT4、RT5、およびRT8の全ての菌株が、表5に示されたファージの全てに感度を示す。従って、ざ瘡患者は、表5に列挙されたファージ菌株を使用してファージで治療され得る。
IB−3系統における菌株は、試験したファージのほとんどに対して耐性を示す。従って、これらの菌株を有する患者は、ファージ療法から同じくらい恩恵を受けない場合がある。配列番号55〜81は、IB−3系統における菌株のための、およびIB−3−s1(IB−3およびSK187)、IB−3−s2(IB−3およびHL025PA1)、IB−3−s3(IB−3およびHL201PA1)、IB−3−s4(IB−3およびHL201PA1)などの他のいくつかの菌株のための4個の固有の遺伝子配列を含む。配列の類似性は、95%〜100%の範囲である。これらの配列を標的化するプライマーを使用して、ファージ療法の有効性を推定し、予測することができる。
図26は、18個の配列決定されたファージを含む32個のファージの系統樹を示す。IおよびII群におけるものなど、互いに非常に類似したファージ菌株が存在する。これは、同じファージを異なる個人に見つけることができることを示唆し、特定のファージ菌株を異なる個人のための一般的な治療剤として使用することができることを裏付ける。配列番号33〜50は、表5に示した15個のファージを含む、18個の配列決定されたファージのゲノム配列を反映する。
マイクロバイオームI型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL060L00、PHL067M10、PHL071N05、PHL112N00、PHL037M02、PHL085N00、PHL115M02、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、PHL010M04、およびPHL066M04。
IB−3菌株を伴うマイクロバイオームI型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む
PHL082M00およびPHL071N05。
マイクロバイオームII型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む
PHL113M01、PHL060L00、PHL112N00、およびPHL085M01。
マイクロバイオームIII型または優勢なRT8を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL060L00、PHL067M10、PHL071N05、PHL112N00、PHL037M02、PHL085N00、PHL115M02、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、PHL010M04、およびPHL066M04。
マイクロバイオームIV型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL060L00、PHL067M10、PHL071N05、PHL112N00、PHL037M02、PHL085N00、PHL115M02、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、PHL010M04、およびPHL066M04。
マイクロバイオームV型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL060L00、PHL067M10、PHL071N05、PHL112N00、PHL037M02、PHL085N00、PHL115M02、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、PHL010M04、およびPHL066M04。
プロピオニバクテリウムフメルシイとざ瘡菌ファージとの間の特異的相互作用
ざ瘡菌ファージの菌株のいくつかは、密接に関連するプロピオニバクテリウム種、フメルシイ菌を溶解することができ、これは、人工器官における感染と関連していることが仮定されている。フメルシイ菌の菌株を溶解することができるざ瘡菌ファージの菌株は、フメルシイ菌と関連する疾患のための治療剤として潜在的に使用することができる。
フメルシイ菌と関連する疾患のための潜在的な治療ファージは以下を含む
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL067M10、PHL071N05、PHL085N00、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、およびPHL010M04。
それらのPA6相同体に85%以下の同一性を示すファージゲノム中のORF
実施例9−薬剤開発
上記に基づいて、現在は、いくつかのざ瘡菌の菌株はざ瘡に関連していることが知られている。従って、診断時に、皮膚科医は、患者の皮膚上でどの菌株が優勢かを知ることが有用であろう。これを行うためには、最初に患者の皮膚試料からの細菌DNAを抽出する必要がある。上に詳述の下流解析のために皮膚からの細菌DNAを単離するための方法/キットが、実際に実装され得る。細菌DNAが抽出された後、上記に詳述した患者のマイクロバイオーム型を特定するために迅速かつ正確な検出/診断方法/キットが、診断のために実装され得る。一旦患者のマイクロバイオーム型が診断されると、いくつかの手法を用いて、患者を治療することができる。
例えば、患者がマイクロバイオームIVまたはV型を有するか、またはざ瘡菌RT10菌株によって支配されている場合、これらの菌株が、抗生物質耐性であるため、抗生物質による治療が成功する可能性は低くなる。これらの患者は、レチノイドまたはこれらの方法などの他の療法を用いて治療されるべきである。患者が、RT4、RT5、およびRT8を含めビルレントリボタイプを有している場合、RT4、RT5、およびRT8に特異的な標的薬剤を使用することができる。例えば、上に詳述し、ざ瘡に関連したざ瘡菌の菌株に特有の遺伝的要素および生物学的経路を標的にした、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、またはこれらの組み合わせを使用することができる。
実施例10−追加の治療
患者の優勢なざ瘡菌の菌株が、1組のCRISPR/Casを保有しない場合、前述に基づくファージ療法の追加の治療が用いられる。例えば、ざ瘡を治療するためのバクテリオファージに基づく菌株特異的療法が適用され得る。代替治療戦略は、健康と関連する菌株の増殖を促進することにより、ざ瘡菌の菌株の相対的存在量のバランスを取ることである。健康と関連する菌株は、プロバイオティクスとして使用することができる。これらは、局所クリーム、溶液、または他の化粧品であり得る。
予防目的のために、ワクチンは、ざ瘡菌のビルレント菌株に対して開発され得る。
縦断的研究は、マイクロバイオーム型が経時的に変化するか、ならびにある種の菌株が治療後の対象上に残るかを判定する。
ビルレントおよび健康な菌株を接種する接種実験により、ざ瘡菌の菌株集団が変化するかどうかを判定する。
ざ瘡菌の菌株とファージとの間の特異的相互作用は、研究され得る。
ざ瘡菌の異なる菌株に対する人間の細胞における免疫応答もまた測定され得る。
以下の刊行物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書および配列表で参照される他の全ての出版物においても同様である。
E. Grice et al., 324 Science 1190−1192 (2009).

Claims (46)

  1. 個人がざ瘡を有しているかどうかを判定する方法であって、
    個人から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌DNAを単離することと、
    前記試料中の16SリボソームDNAを増幅することと、
    前記増幅されたDNA生成物を配列決定することと、
    ざ瘡菌株の10個の主要なリボタイプ(RT)であるRT1〜RT10(配列番号1〜10)のうちの1個以上に基づいて、前記個人のDNAをタイプ分類することと、を含み、
    前記タイプ分類が、前記個人がRT1〜RT10のうちの1個以上を有するかどうかを判定することによって生じ、前記個人がRT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有する場合、前記個人がざ瘡を有すると診断される、方法。
  2. 前記個人がRT4(配列番号4)、RT5(配列番号5)、またはRT8(配列番号8)を有する場合、前記個人がざ瘡を有すると診断される、請求項1に記載の方法。
  3. 異なる種類のざ瘡を診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌DNAを単離することと、
    前記試料中の16SリボソームDNAを増幅することと、
    前記増幅されたDNA生成物を配列決定することと、
    ざ瘡菌の菌株の5個の主要なマイクロバイオームのうちの1個以上に基づいて前記対象のDNAをタイプ分類することと、を含み、
    前記対象がマイクロバイオームIVまたはVにタイプ分類された場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。
  4. ざ瘡を迅速に診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌DNAを単離することと、
    1個以上のプライマーセットを使用して前記DNAを増幅することと、
    配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について、前記増幅されたDNAを解析することと、を含み、
    配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。
  5. 前記増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在について解析され、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、請求項4に記載の方法。
  6. 前記増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在について解析され、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、請求項4に記載の方法。
  7. ざ瘡を迅速に診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌DNAを単離することと、
    1個以上のプライマーセットを使用して前記DNAを増幅することと、
    1個以上のプローブを使用して前記増幅されたDNAを検出することと、
    遺伝子座1(配列番号29および82〜97のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座3(配列番号31および187〜423のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、および/または遺伝子座4(配列番号32および424〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)の存在について、前記プローブ信号を解析することと、を含み、
    遺伝子座1〜4のうちの1個以上が存在する場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。
  8. 前記信号が、少なくとも99%の相同性に基づいて遺伝子座1、遺伝子座2、遺伝子座3、および/または遺伝子座4の存在について解析される、請求項7に記載の方法。
  9. 前記信号が、100%の相同性に基づいて遺伝子座1、遺伝子座2、遺伝子座3、および/または遺伝子座4の存在について解析される、請求項7に記載の方法。
  10. 前記プライマーセットのプライマーが、(遺伝子座1について)配列番号11、12、17、および18、(遺伝子座2について)配列番号13、14、20、および21、(遺伝子座3について)配列番号15、16、23、および24、ならびに(遺伝子座4について)配列番号26および27からなる群から選択される、請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記プライマーセットのプライマーが、(遺伝子座1について)配列番号11、12、17、および18、(遺伝子座2について)配列番号13、14、20、および21、(遺伝子座3について)配列番号15、16、23、および24、ならびに(遺伝子座4について)配列番号26および27からなる群から選択され、前記プローブが、(遺伝子座1について)配列番号19、(遺伝子座2について)配列番号22、(遺伝子座3について)配列番号25、および(遺伝子座4について)配列番号28である、請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
  12. 熱失活させたざ瘡菌の菌株、前記菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチンであって、前記菌株が、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、またはRT10菌株である、ワクチン。
  13. 対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株の16S rDNA配列解析に基づき、前記対象に特異的であることが特定された、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前記菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチン。
  14. 熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、ざ瘡菌の菌株について特定された固有のゲノムの遺伝子座、領域、または配列のうちの少なくとも1個に特異的である、請求項12または請求項13に記載のワクチン。
  15. 熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、遺伝子座1(配列番号29および82〜97)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186)、遺伝子座3(31および187〜423)、ならびに遺伝子座4(32および424〜434)のうちの少なくとも1個に特異的である、請求項12または請求項13に記載のワクチン。
  16. ざ瘡の個人化された治療のための方法であって、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株を判定することと、少なくとも1個の検出されたざ瘡菌の菌株を対象とした活性成分を用いて前記対象を治療することとを含み、前記活性成分が、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化する薬剤を含み、前記標的化薬剤が、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して特異的なゲノム要素を標的化する、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、およびそれらの組み合わせを含む、方法。
  17. ざ瘡を治療するための方法であって、
    ざ瘡菌の菌株の16S rDNAに基づいて健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも1個のざ瘡菌の菌株を含む有効量のプロバイオティクスを投与することを含む、方法。
  18. 前記菌株が、RT6菌株である、請求項17に記載の方法。
  19. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性を有する、請求項17に記載の方法。
  20. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも99%の相同性を有する、請求項17に記載の方法。
  21. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と100%の相同性を有する、請求項17に記載の方法。
  22. ざ瘡を治療するための方法であって、
    健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株によって生成される有効量の代謝産物を投与することを含み、
    前記代謝産物が、細菌培養上清、細胞溶解物、タンパク質、核酸、脂質、および他の細菌分子からなる群から選択される、方法。
  23. 前記菌株が、RT6菌株である、請求項22に記載の方法。
  24. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性を有する、請求項22に記載の方法。
  25. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも99%の相同性を有する、請求項22に記載の方法。
  26. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と100%の相同性を有する、請求項22に記載の方法。
  27. 対象のざ瘡を治療するための方法であって、
    前記対象がそれぞれ、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有すると判定されたとき、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
  28. 前記薬剤の投与の前に、請求項1、請求項2、請求項4、または請求項7に記載の方法を実施することを更に含む、請求項27に記載の方法。
  29. 前記薬剤が、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、またはそれらの組み合わせである、請求項27または請求項28に記載の方法。
  30. 健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌のうちの少なくとも1個の菌株を含む、組成物。
  31. 前記菌株が、RT6菌株である、請求項30に記載の組成物。
  32. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性を有する、請求項30に記載の組成物。
  33. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも99%の相同性を有する、請求項30に記載の組成物。
  34. 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と100%の相同性を有する、請求項30に記載の組成物。
  35. IB−3系のざ瘡を診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌DNAを単離することと、
    1個以上のプライマーセットを使用して前記DNAを増幅することと、
    配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について、前記増幅されたDNAを解析することと、
    配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がIB−3系のざ瘡を有すると診断される、方法。
  36. ざ瘡の個人化された治療のための方法であって、対象に影響を与えているざ瘡の菌株(複数可)を判定することと、前記菌株(複数可)を特異的に対象とした有効量の少なくとも1個のファージを前記対象に投与することと、を含む、方法。
  37. 前記対象が、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、および/またはRT10菌株を対象としたファージで治療される、請求項36に記載の方法。
  38. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームI型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号40)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
  39. 個人に有効量のファージを投与することを含む、IB−3菌株を伴うマイクロバイオームI型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL082M00(配列番号47)およびPHL071N05(配列番号41)からなる群から選択される、方法。
  40. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームII型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL060L00(配列番号34)、PHL112N00(配列番号35)、およびPHL085M01(配列番号44)からなる群から選択される、方法。
  41. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIII型または優勢なRT8のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
  42. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIV型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
  43. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームV型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
  44. 個人に有効量のファージを投与することを含む、プロピオニバクテリウムフメルシイと関連する病気を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL085N00(配列番号46)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、およびPHL010M04(配列番号38)からなる群から選択される、方法。
  45. 対象のざ瘡を診断するためのキットであって、
    配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマーと、
    使用説明書と、を含む、キット。
  46. 対象のざ瘡を診断するためのキットであって、
    配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマーと、
    配列番号19、22、25、および28からなる群から選択される少なくとも1個のプローブと、
    使用説明書と、を含む、キット。

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