JP2015512255A - ざ瘡の高速診断および個人化された治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号UH2AR057503およびR01GM099530の下、米国政府の支援によって行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、2012年3月17日に出願された米国仮特許出願第61/612,290号の優先権を主張する。
人間の皮膚のマイクロバイオームは、皮膚の健康および疾患に重要な役割を果たしている。しかし、出願の発明以前は、菌株レベルでの細菌集団の構造および多様性があまり理解されていなかった。発明者らは、鼻の毛包脂腺単位をサンプリングすることによって、49人のざ瘡患者と52人の健康な個人との間で、菌株レベルおよびプロピオニバクテリウムざ瘡のゲノムレベルでの肌のマイクロバイオーム、優勢な皮膚の利共生を比較した。メタゲノム解析は、ざ瘡菌の相対的存在量は類似している一方で、菌株集団構造が2個のコホートにおいて大幅に異なるということを実証した。ある種の菌株は、ざ瘡と非常に関連し、他の菌株は、健康な皮膚内で富化されていた。66個の新規のざ瘡菌の菌株を配列決定すること、および71個のざ瘡菌のゲノムを比較することによって、本発明者らは、ざ瘡または健康と関連する様々なざ瘡菌の菌株の潜在的な遺伝的決定を特定した。この解析は、取得されたDNA配列および細菌免疫要素が、ざ瘡菌の菌株のビルレンス特性を判定する際に役割を果たし得、いくつかは、治療的介入のための標的となり得ることを示す。この研究は、人間の疾患の病原を説明する利共生菌株集団の以前に報告されていないパラダイムを実証する。それは、健康および疾患における利共生の役割を定義するために人間のマイクロバイオームの菌株レベルの解析の重要性を強調している。
菌株レベルでの人間の微生物叢の多様性ならびに人間の健康および疾患との関連は不明な点が多い。しかし、多くの研究は、微生物関連の人間の疾患は、多くの場合、一定の種の菌株ではなく、病原である全ての種によって引き起こされることを示した。例えば、methicillin−resistant Staphylococcus aureus(MRSA)(Chambers and Deleo,2009;Chen et al.,2010;Hansra and Shinkai)、およびEscherichia coli O157(Chase−Topping et al.,2008;Tarr et al.,2005)が挙げられる。(一般的にざ瘡と呼ばれる)尋常性ざ瘡は、最高で10代の85%および大人の11%の有病率を伴う最も一般的な皮膚疾患の1つである(White,1998)。ざ瘡の病因および病原は未だ不明であるが、微生物の関与はざ瘡の発症に寄与する主な機構の1つと考えられている(Bojar and Holland,2004;Cunliffe,2002)。具体的には、プロピオニバクテリウムざ瘡が重要な病原要因であると仮定されてきた(Webster,1995)。ざ瘡菌を標的化する抗生物質療法は、30年以上にわたり主力の治療である(Leyden,2001)。しかし、数十年の研究にも関わらず、ざ瘡菌が、正常な皮膚の叢の主要な利共生でありながら、ざ瘡の病原にどのように寄与するかに関しては不明のままである(Bek−Thomsen et al.,2008;Cogen et al.,2008;Costello et al.,2009;Dominguez−Bello et al.,2010;Fierer et al.,2008;Gao et al.,2007;Grice et al.,2009)。ざ瘡菌が、利共生細菌として人間の皮膚を保護するか、またはざ瘡内の病原要因として機能するか、またはその両方かは、未解明のままである。
ざ瘡菌は、毛包脂腺単位を支配する
出願人らは、49人のざ瘡患者および正常な皮膚を有する52人の個人から収集された鼻上の毛包脂腺単位(「毛穴」)のマイクロバイオームを特徴付けた。ほぼ完全長の16S rDNA配列は、菌株レベルでざ瘡菌を解析することを許可したサンガー法を用いて取得された。品質のフィルタリングの後、最終的なデータセットは、位置29から位置1483の範囲の31,461個の16S rDNA配列を含有した。配列の27,358個は、99%を超える同一性を有するざ瘡菌に一致した。データは、ざ瘡菌が、クローンの87%を占める毛包脂腺単位の微生物叢を支配することを実証した(図1)。毛包脂腺単位中の他の一般的に見られる種は、表皮ブドウ球菌、プロピオニバクテリウムフメルシイおよびプロピオニバクテリウム顆粒を含み、各々が、総クローンの1%〜2.3%を表す。42属および6門に属する536種のレベル操作分類単位の合計(SLOTU)が、試料中で特定された(表S1)。
ざ瘡患者および正常な個人を比較するとき、ざ瘡菌の相対的存在量の統計的に有意差は認められなかった。その後、広範囲にざ瘡菌16S rDNA配列を解析することにより、ざ瘡菌の菌株レベルでの違いがあったかが検査された。本明細書において、16S rDNAの対立遺伝子型として各固有の16S rDNA配列は、リボタイプ(RT)と呼ばれる。最も豊富なざ瘡菌の配列は、リボタイプ1(RT1)(配列番号1)として定義された。他の全ての定義されたリボタイプは、RT1に対して99%以上の配列同一性を有する。より高い分類学的レベルで見られる分布(Bikら)と同様に、菌株レベルで、少数のリボタイプが、相当数の希少なリボタイプを有する試料において非常に豊富であった(図2)。配列クロマトグラムの慎重な検査および配列の手動補正の後、合計11,009個のリボタイプが、ざ瘡菌の16S rDNA配列に割り当てられた。小さなリボタイプのほとんどは、シングルトンであった。平均して、各個人は、3個以上のクローンを有する3±2ざ瘡菌のリボタイプを保有した。下記に説明するゲノム配列に基づいて、全ての配列決定されたざ瘡菌の菌株は、16S rDNAの遺伝子の3個の同一コピー(下記の注を参照)を有する。これは、比較される16S rDNA配列に基づいて、個人におけるざ瘡菌の菌株集団を可能にした。60個以上のクローンを有する、複数の対象に見られる上位10位の主要なリボタイプが表1に示される。
上位10位の最も豊富なリボタイプの全てが、16S rDNA配列において1個または2個のみのヌクレオチドの変化によってRT1とは異なる(表1)。16S rDNA配列におけるこのような小さな変化が、ゲノムレベルでの系統および進化の歴史を反映しているかどうかを判定するために、主要なリボタイプ1、2、3、4、5、6、および8を表す66個のざ瘡菌の分離株、ならびに2個の小さなリボタイプ16および532が、ゲノムの配列決定のために選択された。これらの66個の分離株のゲノムは、完全に配列決定され、50倍以上のカバレッジの高品質のドラフトまたは完全なゲノムに対して組み立てられた。他の5個のざ瘡ゲノム、KPA171202(Bruggemann et al.,2004)、J165、J139、SK137、およびSK187は、公的に利用可能であり、解析に含められた。これらの71個のざ瘡菌のゲノムから取得されたコアゲノムにおける96,887個の固有の単一ヌクレオチド多型(SNP)の位置に基づいた系統樹が構築された。同じリボタイプを有するゲノムのほとんどは、共にクラスタ化した。樹は、16S rDNAリボタイプが、かなりの程度まで系統の関係を表し、16S rDNA配列が、主要なざ瘡菌系統を区別するために有用な分子マーカーであることを示す(図8および9)。
リボタイプによってグループ化された71個のゲノム全ての間での比較ゲノム解析が実施された。解析は、ざ瘡と関連する菌株がざ瘡病原に寄与し得る遺伝的要素、および健康と関連する菌株が皮膚の健康を維持することに寄与し得る要素を明らかにした。具体的には、ざ瘡と強い関連を有するRT4およびRT5、ならびに正常な皮膚において富化されたことが見てとれたRT6の固有のゲノム領域が、現在知られている。3個の異なる領域、遺伝子座1、2、および3は、系統樹中の分岐群IA−2に属する菌株においてほぼ排他的に見られた。分岐群IA−2は、RT4およびRT5から主になる(図8および10)。遺伝子座1および2は、染色体上に位置している。遺伝子座1は、プロファージと関連する遺伝子を含み、ゲノムアイランドであるように見える。遺伝子座2は、プラスミド組み込み部位を有し、プラスミド配列から誘導され得る。遺伝子座3は、大きな可動性遺伝要素、おそらくプラスミド上にあるように見える。プラスミドは、約55Kbの長さで、完成したゲノムHL096PA1に従って逆方向末端反復をした。配列データは、プラスミドが線状で、おそらくファージに由来することを示唆している(Hinnebusch and Tilly(1993))。RT4およびRT5の15個のゲノムのうちの1個を除く全てが、代表されるプラスミドの遺伝子の少なくとも60%を有し、それらの全ては、プラスミド中の逆方向末端反復に相同である領域を有し、それらが同一または類似の線状プラスミド(図8)を保有することを示唆している。ゲノム中のプラスミドのコピー数は、定量PCRによって確認されたゲノム配列決定カバレッジに基づき1個〜3個の範囲である(図11および図12)。
ざ瘡に関連した人間の皮膚のマイクロバイオームの前述の研究は、細菌菌株レベルでの毛包脂腺単位の微生物叢の第1の肖像を提供する。ざ瘡菌は、ざ瘡および健康な皮膚の両方に見られる主要な皮膚の利共生細菌であるため、この菌株レベルでの解析は、ざ瘡の病原および健康な皮膚において、ざ瘡菌の役割を理解するのに役立つため、重要である。ざ瘡を伴うRT4およびRT5の菌株間の強い関連、およびRT6の菌株と健康な皮膚との間の強い関連が、各々が固有の遺伝的要素を伴い示される。リボタイプ7、8、9、および10、または異なる菌株間での相互作用を含む他のざ瘡菌の菌株が、疾患の発症に寄与し得る。加えて、ホルモンレベル、皮脂生成、および毛包脂腺単位の物理的変化などの宿主要因もまた、ざ瘡病原において役割を果たし得る。
対象
ざ瘡を有する対象および正常な皮膚を有する対象が、集団の多様性および医療の歴史を最良に提示するために、個人開業、マネージドケア、公立病院の場、ならびに皮膚科診療所外を含む南カリフォルニアの様々なクリニックで募集された。対象データは、dbGaP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi−bin/study.cgi?study_id=phs000263.v1.p1)で入手可能である。ざ瘡の診断は、委員会による認可を受けた皮膚科医によって行われた。ざ瘡の存在は、Global Acne Severity Scale(Dreno et al.,2011)と密接に関連した0〜5の段階で等級付けされた。等級は、顔および鼻の両方に別々に記録され、0が正常な皮膚を表し、5が最も深刻な炎症性嚢胞性ざ瘡を表す。ざ瘡の患者では、顔の等級は、平均2.1で、1〜5までの範囲であり、鼻の等級は平均0.3で、0〜2の範囲であった。瘢痕の存在もまた認められた。正常な皮膚を有する対象は、委員会による認可を受けた皮膚科医によって判定され、顔、胸、または背中にざ瘡の病変を有していない者と定義された。研究者らがサンプリングまたは皮膚上の微生物集団に影響を与えるであろうと感じた他の皮膚の問題を彼らが抱えていた場合は、彼らは除外されもした。101人の対象の中で、59人が女性(31人のざ瘡患者および28人の正常な対象)であり、42人が男性(18人のざ瘡患者および24人の正常な対象)であった。ざ瘡のコホートの平均年齢は22.2歳であり、通常のコホートの平均年齢は29.6歳であった。ざ瘡と正常な集団との間の民族性に有意差はなかった。対象は、対象と共に各質問に目を通した医師または十分な訓練を受けた研究コーディネーターによって管理された書面の調査票に回答した。対象のほとんどは、試料を採取したとき、過去にざ瘡の治療を受けたことがなかったか、治療されていなかった(図3)。治療情報を提供した78人の対象のうちの9人のみが、試料が採取されたとき、ざ瘡の治療がされていた。9人の対象の中で、2人は抗生物質で治療され、5人は局所レチノイドで治療され、1人は抗生物質およびレチノイドの両方で治療され、1人は治療が列挙されていなかった。対象は、過去(彼らの一生のうちのいつでもよい)にざ瘡の治療履歴が求められた。治療履歴を提供した73人の対象のうちの18人が、過去にざ瘡の治療をしたことがあった。彼らの中で、7人は抗生物質で治療され、8人は局所レチノイドで治療され、2人は抗生物質およびレチノイドの両方で治療され、1人は治療が列挙されていなかった。全ての対象は、書面でインフォームドコンセントを提供した。全てのプロトコルおよび同意書は、UCLAおよびLos Angeles Biomedical Research Institute IRBsの両方によって承認された。この研究は、ヘルシンキガイドラインを遵守した。
皮膚の微小面皰(白色面皰または黒色面皰)の試料は、製造者の指示に従ってBiore Deep Cleansing Pore Strips(Kao Brands Company,Cincinnati,OH)を使用して対象の鼻から採取された。清潔な手袋が、各サンプリングのために使用された。鼻から除去された後、ストリップは、50mLの無菌管内に直ちに配置され、氷上でまたは4℃で保持された。細胞は、ほとんどの場合4時間以内に溶解した。
個別の微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻ストリップから単離された。ゲノムDNAは、QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用いて抽出された。16S rDNAは、補足情報に詳細に記載されたHMPによるプロトコルに従って増幅され、クローニングされた。ほぼ完全長の配列は、サンガー法によって取得された。
ベースコールおよび品質は、Phredを用いて判定された(Ewing and Green,1998;Ewing et al.,1998)。双方向読み取りは、組み立てられ、AmosCmp16SpipelineおよびNAST−ierを使用してNASTでフォーマットされた配列(rRNA16S.gold)のコアセットに位置合わせされた(Haas et al.,2011)。疑われるキメラは、ChimeraSlayerおよびWigeoNを用いて特定された(Haas et al.,2011)。16S rDNA配列は、広範に手動で検査された。クロマトグラムは、Phred品質スコアが30未満の全ての塩基で視覚的に検査された。適切な補正が適用された。QIIME(Caporaso et al.,2010)は、OTU中で配列をクラスタ化するために使用された。
ざ瘡菌の巨視的特徴を持つコロニーが各試料プレートから採取され、2回渡された。各分離株のリボタイプは、PCR増幅およびサンガー法による16S rDNA遺伝子の完全長の配列決定により判定された。
ゲノムHL096PA1はRoche/454 FLXを用いて配列決定され、CONSEDの大規模な手動編集を伴い、PHRAP/CONSED(Gordon et al.,1998)およびGSMAPPER(Roche,Branford,CT)の組み合わせを用いて組み立てられた。残りの65個のゲノムは、Illumina/Solexa GAIIx(Illumina, San Diego,CA)を用いて配列決定された。配列データセットは、品質トリミングによって処理され、Velvet(Zerbino and Birney,2008)を用いて組み立てられた。コード配列は、GeneMark(Borodovsky and McIninch,1993)およびGLIMMER(Salzberg et al.,1998)を使用して予測された。最終的な遺伝子セットは、Interpro、psort−b、およびKEGGからなる一連のタンパク質の分類ツールを介して処理された。より詳細なプロトコルは、http://hmpdacc.org/doc/sops/reference_genomes/annotation/WUGC_SOP_DACC.pdf.で閲覧できる。
71個のざ瘡菌のゲノム配列が、Nucmerを用いて比較された(Kurtz et al.,2004)。系統発生解析は、MEGA5を用いて実施された(Tamura et al.,2007)。CRISPRFinder(Grissa et al.,2007)が、CRISPR反復スペーサ配列を特定するために使用された。
KPA171202の16S rDNA配列
全ての配列決定されたざ瘡菌ゲノムは、KPA171202を除き、各分離株内で同一である16S rRNA遺伝子の3個のコピーをコードする。KPA171202ゲノム(Bruggemann et al.,2004)に基づいて、16S rRNA遺伝子の1個のコピーは、RT1の他の2個の同一のコピーから異なる1個のヌクレオチドを有する。しかし、この突然変異は、16S rDNAデータセット内で観察されなかった。KPA171202から16S rDNA遺伝子の複数のクローンが増幅され、クローンされ、配列決定され、この突然変異を保有する配列は見られなかった。このように、KPA171202はまた、16S rDNAの3個の同一のコピーを有する。
この研究で測定されたざ瘡菌のリボタイプおよびそれらの相対的存在量が、毛包脂腺単位に固有であるかどうかを判定するために、Human Microbiome Project(HMP)およびGriceら(2009)のデータからのマイクロバイオーム16S rDNAデータと類似した解析が適用された。両方のデータセットは、健康な対象から取得された。本研究からの健康な対象の主要なリボタイプの相対的存在量は、それらが異なる解剖学的部位からサンプリングされたという事実にも関わらず、これらの2個のデータセットで見られるものに非常に類似していた(図3)。RT6(6.3%)は、通常のコホートにおいて見られるものと同様に、HMPデータ中のRT4およびRT5を合わせたもの(2.8%)よりもより豊富であることが分かり、RT6は4.8%を表し、RT4およびRT5を合わせものは、クローンの1.2%を表す。同じ5個の主要なマイクロバイオーム型が、2個のデータセットで観察された(図7)。
recA遺伝子は、4個の既知の型、IA、IB、II、およびIIIにざ瘡菌の菌株を広く分類するために使用されている(McDowell et al.,2008;McDowell et al.,2005)。コアゲノム中のSNPに基づく71個のゲノムの系統樹は、1個の分離株、HL097PA1を除いて、完全にrecA型と一致した。リボタイプ1、4、5、および532を有するゲノムのほとんどは、recAのIA型分岐群に対して分類され、これらは、更に下位分岐群IA−1、IA−2に分けることができる。分岐群IA−2は、RT4およびRT5で主に構成されている。RT4およびRT5ゲノムのほとんどは、非常に類似したゲノム配列と同じ系統に属しているように見える。16S rDNA遺伝子内のT1007Cの変異を共有するリボタイプ3、8、および16を有する全ての分離株は、recAのIB型分岐群に分類された。RT3のほとんどは、下位分岐群IB−2を形成し、RT8ゲノムは、自ら下位分岐群IB−1を形成し、これは非常にざ瘡と関連していた。注目すべきは、T854C突然変異を共有するRT2およびRT6は、他のリボタイプより遠い系統発生的関係を有し、recAのII型分岐群に分類された。これは以前の研究と一致している(Lomholt and Kilian,2010;McDowell et al.,2005)。recAのIII型のざ瘡菌の分離株は、試料中に見られなかった。
ざ瘡のリボタイプ4、5、および10は、16S rDNA配列内に単一のヌクレオチド置換G1058Cを含有し、これは、テトラサイクリンに増大した耐性を付与することが以前示された(Ross et al.,1998a;Ross et al.,2001)。16S rDNA配列における置換に加えて、配列決定されたRT4およびRT5の全ての菌株が、23S rDNA配列中にヌクレオチド置換を有すると判定され、これは、異なる等級の抗生物質、エリスロマイシン、およびクリンダマイシンに増大した耐性を付与する(Ross et al.,1997;Ross et al.,1998b)。培養できなかった2個を除き、これらの分離株は、テトラサイクリン、エリスロマイシン、クリンダマイシンに耐性であることが、実験的に確認された。
ざ瘡菌ゲノムのGC含有量により類似しているが、RT2およびRT6の菌株内で見られた4個の固有のスペーサ配列は、クロストリジウムレプタム、腸内微生物叢における利共生細菌ゲノムに最も一致するものを有する(表2)。HL096PA1ならびに他のRT4およびRT5ゲノムで保有される55Kbのプラスミドでは、Tad遺伝子座を含む、C.レプタムで見られた遺伝子と同一の35個の遺伝子の大型クラスタもまた存在する。
メタゲノムDNA抽出、PCR増幅、クローニング、および16S rDNAの配列決定メタゲノムDNA抽出
個別の微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻ストリップから単離され、ATL緩衝液(Qiagen)および直径0.1mmのガラスビーズで充填された2mLの無菌の微量遠心管内に配置された(BioSpec Products,Inc.,Bartlesville,OK)。細胞を室温にて4,800rpmで3分間ビードビータを用いて溶解した。5分間14,000rpmで遠心分離した後、上清が回収され、QIAamp DNAマイクロキット(Qiagen)を用いたゲノムDNA抽出のために使用された。チューインガムからDNAを抽出するための製造業者のプロトコルが使用された。ゲノムDNAの濃度は、ナノドロップ1000分光光度計で判定された。
メタゲノム試料のほとんどは、以下の配列を有する16S rDNAの特異的なプライマーを用いて三重に増幅された:27f−MP 5’AGRGTTTGATCMTGGCTCAG−3’および1492r−MP 5’−TACGGYTACCTTGTTAYGACTT−3’。PCR反応は、0.5U/μLのPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)、Epicentre Fail−Safe PCRシステムからの1X事前混合E PCR緩衝液、0.12μM濃度の各プライマー27f−MP、1492r−MP、およびシグマPCRグレード水を含有する。1マイクロリットルのDNA(0.2に至るまで、合計10ng)が、各反応に添加された。G−ストームGS4サーモサイクラー条件は以下の通りであった:5分間96℃で初期変性、30秒間94℃で30サイクルの変性、1分間57℃でアニーリング、2分間72℃で延長、7分間72℃で最終延長。増幅に続いて、A−テーリング反応は、増幅反応物に1UのGOTaq DNAポリメラーゼの直接添加、および10分間72℃でサーモサイクラー中でのインキュベーションにより実施された。
試料培養プレート
鼻ストリップの内面上の微小面皰は、すりつぶされ、無菌ループ(Fisherbrand,Pittsburgh,PA)を用いて掻き取られ、血液寒天プレート上でプレーティングされた(Teknova Brucella Agar Plate with Hemin and Vitamin K, Teknova, Hollister, CA)。プレートは、AnaeroPack System(Mitsubishi Gas Chemical Company,Tokyo,Japan)を用いて5〜7日間37℃で嫌気的にインキュベートされた。
ざ瘡菌の巨視的特徴を持つコロニーが各試料プレートから採取され、A培地プレート上に画線された(カシン膵臓ディガス(Pancreatic Digase of Casine)、ディフコ酵母抽出物、グルコース、KH2PO4、硫酸マグネシウム、ディフコ寒天、および水)。これらの第1の通過プレートは、次いで、5〜7日間37℃で嫌気的にインキュベートされた。第2の通過として、単一の単離されたコロニーが第1の通過プレートから採取され、新しいA培地プレート上に画線された。これらのプレートは、次いで、5〜7日間37℃で嫌気的にインキュベートされた。これらのプレート上のコロニーは、サブ配列のステップにおける培養、遺伝子型判定、およびゲノム配列決定のために採取された。
各分離株は、16S rDNA遺伝子のPCR増幅によって解析された。リボタイプは、完全長の配列に基づいて判定された。所望のリボタイプの分離株は、将来の培養およびゲノム配列決定のために選択された。
分離株を5〜7日間37℃で嫌気条件下において5mLのクロストリジウム培地中で成長させた。培養物は、遠心分離によりペレット化され、3mLのリン酸緩衝塩水(PBS)で洗浄された。メタゲノムDNA抽出に使用されたものと同じプロトコルが、分離株のゲノムDNAを抽出するために使用された。
正常な皮膚を有する22人の個人の微小面皰試料のメタゲノムのDNA試料がプールされ、Roche/454FLXを用いて配列決定された。平均読み取り長は、236bpであった。配列決定は、13,291個の配列読み取りによって制限された。配列読み取りは、BLASTを用いてNCBIの非冗長データベースに対して位置合わせされた。種の割り当ては、97%の同一性および100%の位置合わせされた読み取り長に基づいた。
アセンブリおよび位置合わせ
ベースコールおよび品質は、既定のパラメータを使用して、Phredを用いて判定された(Ewing and Green,1998;Ewing et al.,1998)。双方向読み取りは、組み立てられ、Microbiome Utilities Portal of the Broad Institute(http://microbiomeutil.sourceforge.net/)のAmosCmp16SpipelineおよびNAST−ierを使用してNASTでフォーマットされた配列(rRNA16S.gold)のコアセットに位置合わせされた。これらのツールとしては、順に、Amoscmp(Pop et al.,2004)、Mummer(Kurtz et al.,2004)、Lucy(Chou and Holmes,2001)、BLAST(Altschul et al.,1990)、およびCdbTools(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software/)を使用する。疑われるキメラは、ChimeraSlayerおよびWigeoNを用いて特定された(Haas et al.,2011)。少なくとも90%のブートストラップを有する配列は、キメラブレークポイント(ChimeraSlayer)を裏付け、そうでなければ予想される変化(WigeoN)の99%を超える分位で変化する領域を含むことが、更なる解析から除去された。
ざ瘡菌集団の多様性解析のために、ざ瘡菌KPA171202(Bruggemann et al.,2004)16S rDNAに対して1,400個のヌクレオチドにわたって少なくとも99%の同一性を有する配列が、位置29〜1483(命名法の大腸菌システムに基づく番号付け(Brosius et al.,1978))にトリミングされた。この領域を完全にカバーしない配列は、更なる菌株レベルの解析から除外された。キメラスクリーニングは、上で説明するように、配列の0.35%未満の除去をもたらした。大多数の配列がほんの1個または2個のヌクレオチドによって異なるので、これはキメラの過小評価であり得る。低品質の配列は、除外され、15未満のPhred品質スコアを有する、位置79と1433との間の50個を超えるヌクレオチドとして定義された。詳細な菌株レベルの解析を可能にするために、データが広範囲に手動で編集された。クロマトグラムは、Phred品質スコアが30未満の全ての塩基で視覚的に検査され、適切な修正が適用された。種レベルでの解析において、16S rDNA配列は手動で編集されなかった。組み立てられた配列のキメラスクリーニングは、配列の0.65%未満の除去をもたらした。位置合わせされた配列は、位置29〜1483に同等である大腸菌にトリミングされた(Brosius et al.,1978)。この領域を完全にカバーしない配列は、更なる解析から除外された。
26,446の組み立てられたざ瘡菌配列を表す62,000個近くのサンガー配列読み取りは、CONSED中のRT1配列にマッピングされた(Gordon,2003;Gordon et al.,1998)。多数の配列の包括的な半手動での編集が、その非常に高いペア毎の類似性によって実現可能となった:配列毎のRT1からわずか1個のヌクレオチドの変化の中央値(編集前の3個のヌクレオチドの変化)。編集は、スクリプトの使用と、シングルクリックが検査を必要とする部位にジャンプすることを可能にするCONSEDのカスタムナビゲーション機能とによって促進された。クロマトグラムは、RT1と異なった全ての低品質(Phredが30未満)の塩基について検査され、多くの一般的に発生する配列エラーを含め、必要に応じて修正された。塩基誤取り込みおよびキメラの効果を最小限にするために、4個未満の配列(周波数が0.00015未満)内で発生したRT1と異なる特異的な塩基は、信頼できないと考えられ、対応するRT1塩基に戻された。リボタイプは、100%の同一性に基づいて結果として得た配列に割り当てられた。
OTUおよび分類の割り当て
QIIME(Caporaso et al.,2010b)は、99%の同一性遮断、最も遠い近隣、およびUCLUST(Edgar,2010)を用いてOTU内に配列をクラスタ化するために使用された。代表的な配列(最も豊富)が選択され、緑遺伝子のデータベースにPYNAST(Caporaso et al.,2010a)を使用して位置合わせされた。分類は、RDP法を使用して割り当てられた(Cole et al.,2009)。位置合わせは、緑遺伝子によって提供されるレーンマスクで濾過され、系統樹は、FastTree(Price et al.,2009)を使用して構築された。
各試料について、上位10位のリボタイプの各々のクローン数は、試料のざ瘡菌クローンの総数によって正規化された。正規化された総数を使用して、ざ瘡群と正常群との間の富化の重要性を試験した。Rプログラム(http://www.R−project.org)中の関数wilcox_testは、p値を計算するために用いられた。
マイクロバイオーム型は、試料がMOTHUR(Schloss et al.,2009)(図5および6)または階層的クラスタリング(Eisen et al.,1998)(図7)中のthetayc類似性を用いてクラスタ化されたとき、観察された最大の分岐群に基づいて割り当てられた。
配列は、以下の基準を満たした場合にリボタイプに割り当てられた。第一に、単一の最適な一致であった。第二に、それは、上位45位のリボタイプ(58〜1388)の間で区別するために必要とされる範囲をカバーした。第三に、差別的な位置にNsは全くなかった。最後に、10個以下の無差別的な差はなかった。
ゲノムHL096PA1
ゲノムは、UCLA遺伝子型判定および配列決定コアでRoche/454FLXを用いて配列決定された。590,054個の配列読み取りの合計は、230bpの平均読み取り長で生成された。これらのうち、433,896個が組み立てられ、2個のコンティグ、2,494,190bpの円形の主要染色体、および55,585bpの線状プラスミドとなった。アセンブリは、CONSEDの大規模な手動編集を伴い、PHRAP/CONSED(Gordon et al.,1998)およびGSMAPPER(Roche)の組み合わせによって達成された。GeneMark v2.6r(Borodovsky and McIninch,1993)およびGLIMMER v2.0(Salzberg et al.,1998)が、遺伝子予測をコードした実施されたアブイニシオタンパク質に使用された。tRNAScan−SE1.23は、tRNAの特定のために使用され、RNAmmerは、リボソームRNA遺伝子(5S、16S、および23S)を予測するために使用された。ゲノム注釈の結果は、Pfam(http://pfam.jouy.inra.fr/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg)、およびCOG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)を含む、公開データベースにおける自動化された検索に基づいていた。注釈の手動検査もまた、実施された。
ゲノムは、Illumina/Solexa Genome Analyzer IIxを使用して配列決定され、セントルイスのワシントン大学のゲノムセンターによって注釈付けされた。
各ゲノムDNA試料は、無作為に剪断され、指数付けされたライブラリは、標準イルミナプロトコルを用いて構築された。12個の一意的にタグ付けされたライブラリがプールされ、GAIIxフローセルの1個のレーン上で実行され、ペアエンド配列が生成された。別個の試料へのタグ付き読み取りのデコンボリューションに続き、データセットが、q10閾値でBWA(Li and Durbin,2009)品質トリミングを用いて処理された。長さが35bp未満にトリミングされた読み取りは廃棄され、残りの読み取りは、oneButtonVelvet、ユーザが提供したK−merの範囲にわたりVelvetアセンブラ(Zerbino and Birney,2008)を何度も実行するオプティマイザプログラムを用いて組み立てられたが、一方、アセンブラのパラメータセットのいくつかを変更し、最長のN50コンティグの長さをもたらすアセンブリパラメータセットを最適化した。
コード配列は、GeneMark v3.3(Borodovsky and McIninch,1993)およびGLIMMER v2.13(Salzberg et al.,1998)を使用して予測された。GeneMarkおよびGLIMMERに跨らない遺伝子間領域は、NCBIの非冗長データベースに対してBLASTを使用して位置合わせされ、予測は、タンパク質の位置合わせに基づいて生成された。tRNA遺伝子は、tRNAscan−SE1.23を用いて判定され、非コーディングRNA遺伝子は、RNAmmer−1.2およびRfam v8.0によって判定された。最終的な遺伝子セットは、一連のInterpro、psort−b、およびKEGGからなるタンパク質の分類ツールを介して処理された。遺伝子生成物の命名は、BERパイプライン(JCVI)に由来する。より詳細な標準操作プロトコル(SOP)は、http://hmpdacc.org/doc/sops/reference_genomes/annotation/WUGC_SOP_DACC.pdf.で閲覧できる。
ざ瘡菌ゲノムのコア領域の特定
「コア」領域は、71個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義された。ざ瘡菌KPA171202は、参照ゲノムとして使用された。他の70個のゲノム配列(ほとんどのゲノムおよび2個の完全なゲノム内の一連のコンティグ)の各々は、Nucmerを使用して参照ゲノムにマッピングされた(Kurtz et al.,2004)。Nucmerプログラムの70個の「.coords」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて重複領域を特定するために解析された。最後に、「コア」配列は、上で算出された座標を有するKPA171202のゲノム配列に基づいて抽出された。平均して、ゲノムの90%(88%〜92%の範囲)が、コア領域に含まれていた。
単一ヌクレオチド多型(SNP)は、デフォルトの設定でNucmerプログラム(Kurtz et al.,2004)のユーティリティオプション「show−snps」を用いて特定された。ざ瘡菌KPA171202のゲノム配列は、参照ゲノムとして使用された。Nucmerプログラムの70個の「.snps」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて、固有のSNP位置を特定するために解析された。コア領域中のSNPは、系統樹を構築するために更に解析された。
コア領域における96,887個のSNPヌクレオチドのうちの71個の連結配列が、ざ瘡菌ゲノムの系統樹を構築するために使用された。ゲノムの中のコア領域の進化的距離は、近隣結合法(Saitou and Nei,1987)を用いて推測された。1,000個の複製から推測されたブートストラップ樹が採取された。80%未満のブートストラップ複製で再現されたパーティションに対応する分岐は、崩壊した。図8は、トポロジのみを示す。図9では、樹は、系統樹を推測するために使用される進化的距離のものと同じ単位の分岐長を有する一定の縮尺で描かれた。進化的距離は、p距離法を用いて計算され、部位毎のヌクレオチド相違数単位中に存在する。この樹は、コア領域に基づく比較を示す。距離は、各ゲノムの非コア領域が本明細書では考慮されていなかったため、異なるゲノム間の真の進化的距離を表していない。隙間および不足しているデータを含有する全ての位置が解消された。進化解析は、MEGA5(Tamura et al.,2007)を用いて行われた。
71個のゲノムにわたる遺伝子含量の保全を評価するために、全てのゲノム中の遺伝子をコードするタンパク質は、それがその全長にわたって少なくとも90%のヌクレオチド同一性を有する場合、長さを低減することにより第1の選別によりUCLUST(Edgar,2010)を使用してクラスタ化され、その後、既存のシード配列に各配列をクラスタ化し、それ以外の場合は、新しいシードとなった。可視化のために、データはそれぞれ、遺伝子およびゲノムを表す列および行に再フォーマットされた。ゲノム中に1個以上の遺伝子のコピーが存在するように処理された。遺伝子の列は、HL096PA1ゲノム、55Kbプラスミドを有する完全に完成したゲノムの座標に基づいて、その位置によって分類された。ゲノムの行は、上で説明されたSNP系Neighbor Joining樹内のそれらの位置によって分類された。
CRISPRFinder(Grissa et al.,2007)が、CRISPR反復スペーサ配列を特定するために使用された。HL110PA3の注釈は、HL001PA1、HL060PA1、HL082PA2、HL103PA1、HL106PA1、HL110PA4、およびJ139の菌株におけるCRISPR/Casの構造とCRISPR反復スペーサ配列の存在とを特定するために、BLASTの位置合わせのために使用された。各スペーサ配列は、NCBIの非冗長ヌクレオチドデータベースおよび参照ゲノム配列データベース(refseq_genomic)に対するBLASTの位置合わせによって注釈付けされた。
MAQ(Li et al.,2008)は、Illumina/Rocheプラットフォームから参照ゲノムに純粋な配列の読み取りをマッピングするために使用された。簡単に説明すると、「マップ」コマンドは、マッピングのために使用され、「組み立てる」コマンドは、読み取りマッピングからコンセンサス配列を呼び出すために使用され、その後、「cnd2win」コマンドが、耕耘ウィンドウで平均化された情報を抽出するために使用された。1,000bpのウィンドウサイズが使用された。無作為に選択された百万の読み取りが、マッピングのために使用された。これは、約55倍〜75倍の適用範囲を有するHL096PA2、HL096PA3、HL097PA1、およびHL099PA1以外の全てのゲノムについて約40倍のカバレッジを占めた。BWA(Li and Durbin,2010)は、Roche/454プラットフォームから参照ゲノムHL096PA1に純粋な配列の読み取りをマッピングするために使用された。平均カバレッジは、1,000bpのウィンドウで算出された。
プラスミド(遺伝子座3)上のTadA、ならびに染色体上のハウスキーピング遺伝子PakおよびRecAを標的化する定量PCR(qPCR)は、ざ瘡菌の分離株から抽出されたゲノムDNAを用いて実施された。LightCyler 480 High Resolution Melting Masterキットが使用された(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。各10μLの反応液は、5μLのマスターミックス(2倍濃縮)、1μLで25mMのMgCl2、0.5μLで4μMの順方向および逆方向プライマー、ならびにDNAテンプレートからなっていた。4回のqPCR実行は、Roche LightCycler 480上で実施された。TadAのためのプライマー配列は、5’−GATAATCCGTTCGACAAGCTG−3’(順方向)および5’−ACCCACCACGATGATGTTT−3’(逆方向)である。pakのためのプライマー配列は、5’−CGACGCCTCCAATAACTTCC−3’(順方向)および5’−GTCGGCCTCCTCAGCATC−3’(逆方向)である。recAのためのプライマー配列は、5’−CCGGAGACAACGACAGGT−3’(順方向)および5’−GCTTCCTCATACCACTGGTCATC−3’(逆方向)である。全ての試料は、複製されなかった2回目の実行を除く、各qPCRの実行で二連で実行された。サーモサイクラー条件は以下の通りであった:95oCで10分間の初期活性化ステップ、95oCで10秒間、(各々が、各後続のサイクル毎に段階的に0.5oCの低減を伴う第1のサイクルにおいて)65oCで15秒間、72oCで30秒間からなる50増幅サイクル、0.02oC/秒のランプ速度および25/oCの取得率を伴い65oCで開始し、99oCで終了する最終的な融解曲線ステップ。DNA濃度標準は、二連で実行された。遺伝子のコピー数の比は、プラスミドおよび染色体上の遺伝子の濃度に基づいて算出された。
16S rDNA配列は、プロジェクトID46327下でGenBankにおいて堆積された。ざ瘡菌の菌株の全てのゲノムショットガン配列および注釈は、受託番号ADWB00000000、ADWC00000000、ADWF00000000、ADWH00000000、ADWI00000000、ADXP00000000、ADXQ00000000、ADXR00000000、ADXS00000000、ADXT00000000、ADXU00000000、ADXW00000000、ADXX00000000、ADXY00000000、ADXZ00000000、ADYA00000000、ADYB00000000、ADYC00000000、ADYD00000000、ADYE00000000、ADYF00000000、ADYG00000000、ADYI00000000、ADYJ00000000、ADYK00000000、ADYL00000000、ADYM00000000、ADYN00000000、ADYO00000000、ADYP00000000、ADYQ00000000、ADYR00000000、ADYS00000000、ADYT00000000、ADYU00000000、ADYV00000000、ADYW00000000、ADYX00000000、ADYY00000000、ADYZ00000000、ADZA00000000、ADZB00000000、ADZC00000000、ADZD00000000、ADZE00000000、ADZF00000000、ADZG00000000、ADZH00000000、ADZI00000000、ADZJ00000000、ADZK00000000、ADZL00000000、ADZM00000000、ADZN00000000、ADZO00000000、ADZP00000000、ADZQ00000000、ADZR00000000、ADZS00000000、ADZT00000000、ADZV00000000、ADZW00000000、CP003293、およびCP003294下でGenBankにおいて堆積された。
プロピオニバクテリウムざ瘡は、主要な人間の皮膚細菌である。異なる菌株が異なる悪性の特性を有し、よって、健康および疾患において異なる役割を果たすかどうかを理解するために、ざ瘡の皮膚または健康な皮膚から単離されたものがほとんどである82個のざ瘡菌の菌株のゲノムが比較された。健康利共生として、および疾患における病原体としてざ瘡菌の表現型および機能の違いを説明し得る系統特異的な遺伝的要素が特定された。多数の配列決定された菌株を解析することにより、菌株レベルおよび分子レベルでの生物の遺伝配列景観および多様性についてのより良い理解がもたらされる。
プロピオニバクテリウムざ瘡は、人間の皮膚の主要な利共生である。それは、黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌などの一般的な病原体の侵入を阻害することにより皮膚の健康を維持することに寄与する。それは、トリグリセリドを加水分解し、皮膚表面の酸性pHに寄与する遊離脂肪酸を放出することによってそうする(1)。一方、ざ瘡菌は、85%を超える青年および若年成人に影響を与える毛包脂腺単位の慢性炎症性疾患、尋常性ざ瘡に歴史的に関連している(2)。メタゲノム研究は、ざ瘡菌が健康な個人およびざ瘡患者の両方における毛包脂腺単位中の優勢な細菌であることを以前に実証した(3、4)。しかし、菌株レベルでは、ざ瘡菌の集団構造は、2個の群の間で異なっていた。これらの知見は、他の疾患についての研究に従って、微生物関連の人間の疾患が、多くの場合、菌株全体ではなく種の一定の菌株によって引き起こされることを示唆した(5、6)。
ざ瘡菌の菌株および一般ゲノムの特徴
菌株レベルでこの重要な皮膚の利共生のゲノムの多様性を理解するために、69個の配列決定されたざ瘡菌の菌株のゲノムが解析された。これらのうち、67個のざ瘡菌の菌株は、健康な個人およびざ瘡患者の皮膚から単離され(3、4)、2個のざ瘡菌の菌株、HL201PA1およびHL202PA1は、難治性歯内病変から単離された(23)(表2−1)。
ざ瘡菌の遺伝配列景観を判定するために、82個のざ瘡菌ゲノムに基づいた汎ゲノムが推定された。べき乗則回帰解析n=κNγ(24)を使用して、追加のざ瘡菌ゲノムを配列決定することによって発見されるであろう新たな遺伝子の数が推定された(図13)。解析は、αは0.788であると特定した。新たなゲノムによって追加された新しい遺伝子の平均数は、82番目のゲノムが添加されたとき、3個であった。べき乗則回帰解析n=κNγを使用して、追加のざ瘡菌ゲノムを配列決定することによって蓄積されるであろうざ瘡菌の汎ゲノムの数が推定された(図14)。指数γは0.067であり、ざ瘡菌は、3,136個の汎遺伝子(N=82)を有していた。これらの結果に基づいて、指数αが1未満であり、γがゼロを超える(24)とき、ざ瘡菌の汎ゲノムは、オープンとして定義される。αが1に近く、γがゼロに近かったため、この生物は、大きく拡張することなく、緊密に進化したと考えられている。
82個のざ瘡菌の菌株のゲノムの比較は、2.20Mb(平均ゲノムの88%)が全てのざ瘡菌ゲノムによって共有される(これは、本明細書では「コア領域」と称される)ことを明らかにした。コア領域内で、123,223個の固有の単一ヌクレオチド多型(SNP)が、菌株間で検出された。SNPの27パーセントは、I型に固有であり、22%はII型に固有であり、22%はIII型に固有であった(図15)。コア領域内の123,223個のSNPに基づく系統樹が構築された(図16)。樹は、菌株のrecA型の分類がゲノムに基づいた主要な分岐群と一致することを示した。recAのIA、IB、およびII型の菌株はすべて、HL097PA1およびPRP−38を除いて、それぞれ各型内で共にクラスタ化された。recAIII型の菌株、HL201PA1のみ、I型およびII型の菌株とは別個の分岐を形成した。樹はまた、菌株の16S rRNAのリボタイプがゲノム配列から推測される系統発生関係と一致したことを示した。RT1菌株のほとんどが分岐群IA−1にクラスタ化されたが、一方、全てのRT4およびRT5菌株のほとんどが分岐群IA−2にクラスタ化された。6個すべてのRT8菌株は、分岐群IB−1で共にクラスタ化された。すべてのRT3およびRT16菌株は、SK187を除いて、分岐群IB−2で共にクラスタ化された。HL030PA1およびKPA171202は、異なるIB−3分岐群として、6609と共にクラスタ化された。HL097PA1およびPRP−38は、共にクラスタ化され、McDowellらによって最近命名された新しい型ICとして分類された(22)。全てのRT2菌株は、RT6菌株と共に分岐群Iから離れた分岐群IIにクラスタ化された。RT6菌株であり、経口部位から単離されたHL202PA1は、皮膚のRT6分離株と大差はなく、共にクラスタ化された。全ての菌株の配列型は、2個の公表されたMLSTスキーム(11、13)に基づいて割り当てられ、表S1に示されている。コアゲノム領域に基づいた系統樹は、16Sのリボタイプ分類をざ瘡菌の菌株の特定および分類のために使用することができることを実証した。recAのタイプ分類よりもはるかに高い解像度を提供し、一方で、それは一般的に7〜9個の遺伝子を必要とする煩雑なプロセスであるMLSTよりも1個の遺伝子のみを必要として、はるかに簡単および迅速である。
ざ瘡菌のゲノムにおける突然変異および/または組み換えのための「ホットスポット」があるかどうかを理解するために、SNPが無作為にゲノム全体に分布していたか、または特定の領域で富化されたかどうかを判定した。コア領域中の遺伝子をコードする各タンパク質におけるSNPの頻度が計算された。コア領域中の多型部位の平均速度は、5.3%、すなわち、100bp毎に一意の5.3SNPであった。この速度は、複数の腸内細菌ゲノム(25)に見られるものに匹敵する。コア領域でコードされた1,888個の遺伝子のうち、55個の遺伝子は3個以上の標準偏差(SD)でより高いSNP周波数を有し、47個の遺伝子は4個以上のSDであった(図18a)。Kolmogorov−Smirnov(K−S)試験を用いて、これらの102個の高度に突然変異した遺伝子が無作為にゲノム全体に分布していないことを実証した(P<0.01)(図18B)。これは、ざ瘡菌が進化のリスク管理戦略を有することを示唆している。Clusters of Orthologous Groups(COG)のカテゴリに基づいて、これらの102個の遺伝子の機能は、コア領域内の1,888個の遺伝子全てのものと類似の分布を示した。これらの頻繁に変異する遺伝子における特定の機能カテゴリの富化は存在しなかった。
ざ瘡患者および健康な個人のコホートから単離された多数のざ瘡菌の菌株は、同じ個人の毛包内のざ瘡菌の菌株がクローン性であるかの調査を可能にした。以前のメタゲノム解析に基づいて、ほとんどの個人が異なる系統(4)の複数のざ瘡菌の菌株を保有することが実証された。しかし、同じ個人の同じ系統の菌株が同じ祖先に由来するかは不明であった。同じ試料から単離された菌株のゲノム配列は、同じ個人の菌株(SSI)がクローン拡張を介して同じ起源から進化したかを検査することを可能にした。69個の配列決定されたざ瘡菌の菌株は、49個のSSIを含む:13組のデュエット(すなわち、13人の個人から単離された菌株の13組のペア)、5組のトリオ、および2組のカルテット。23個のSSIは、同じ分岐群中(分岐群IA−1中に9個、分岐群IA−2中に4個、分岐群IB−1中に2個、分岐群IB−2中に6個、分岐群II中に2個)でクラスタ化された。SSIの各ペア間の距離(コア領域内の123,223個のSNP部位における置換率)が算出された(図16)。分岐群IA−1のSSIの平均距離は、0.0014であったが、一方、分岐群IA−1内の異なる個人の菌株の平均距離は、0.0064(P<0.001)であった。一貫した結果が、IA−2、IB−1、IB−2、およびIIを含む他の分岐群中に観察された(図19a)。これは、同じ系統のSSIが、異なる個人から単離された菌株よりも互いに大幅により類似することを実証し、それらが各個人においてクローン性であることを示唆した。しかし、分岐群IA−2内のRT4およびRT5菌株の中で、SSIの間の平均距離(0.0004)は、異なる個人(0.0017)(P=0.072)の菌株の間の平均距離から大幅に異なることはなかった。更に、異なる個人のRT4/RT5菌株間の平均距離(0.0017)は、分岐群IA−1内のSSI間の平均距離(0.0014)に類似しており、分岐群IB−1(0.0059)、IB−2(0.0019)、およびII(0.0022)内のSSI間の平均距離よりなお短い(図S3A)。これは、異なる個人から単離されているが、これらのRT4およびRT5菌株はクローン性であるように見え、同じ最近の祖先から進化したことを示唆している。分岐群IC内の2個のRT5菌株間の同様の関係が認められ、異なる個人から単離されたHL097PA1およびPRP−38は、0.0012の距離で密接に互いに関連していた。メタゲノム研究は、ざ瘡とRT4およびRT5の菌株の強い関連性を実証した(4)。異なる個人から単離されたこれらの菌株のクローンは、RT4およびRT5菌株が個人間で伝染され得ることを示唆している。この知見は、抗生物質耐性プロピオニバクテリアは、抗生物質耐性ざ瘡菌の菌株のほとんどがRT4およびRT5(4、13)に属しているので、皮膚科医を含め、ざ瘡を起こしやすい個人(26)間で伝染性であったという以前の臨床報告と一致している。SSIの解析は、RT4およびRT5菌株がざ瘡中の病原要因であり得るという理論を更に裏付けている。
これらの結果は、異なる分岐群のSSIが、異なる個人の菌株と同様に互いに異なっているということを実証した。この解析は、各個別のマイクロバイオーム中でざ瘡菌の菌株は、同じ集団におけるクローン拡張を経験するが、一方、複数の菌株集団は、多くの場合、ほとんど組み換えせずに同じ群集に共存できることを示唆している。
82個のざ瘡菌の菌株のゲノム配列を比較することにより、82個すべての菌株によって共有されなかった非コアゲノム領域が特定された。非コア領域の全長は約0.90Mbであった。非コア領域の平均GC含有量は、コア領域のそれ(58%±6.9%)よりもわずかに低く、非コア領域の一部が、水平遺伝子伝達を介して他の種に由来し得ることを示唆していた。
分岐群IIにおける菌株、主にRT2およびRT6は、より離れて分岐群Iの菌株に関連していた。メタゲノム研究に基づき、RT2がざ瘡患者および健康な個人の間で均等に分布していたとき、分岐群II中の菌株はざ瘡と関連していなかったが、一方、RT6は健康な個人(4)に大幅に富化されていた。I型の菌株と比較して、RT2およびRT6菌株のゲノムは、長さが合計約92Kbで、107個のORFをコードするいくつかの領域を欠いている。RT2およびRT6ゲノムは、93個のORFをコードする類似のサイズの追加のゲノム領域を有する(図20)。COG分類に基づいて、107個のI型に特異的なORFおよび93個のII型に特異的なORFの間の機能的カテゴリの分布に有意差はなかった。
III型の菌株は、皮膚表面上にほとんど見られない。難治性歯内病変、HL201PA1から分離されたIII型ざ瘡菌の菌株は、配列決定された。この最初の入手可能なIII型ゲノムは、この系統に特異的な遺伝的要素の特定を可能にした。IおよびII型菌株型に比べ、HL201PA1のゲノムは、長さが合計43Kbで、少数の領域を欠いている(図20)。嫌気性ジメチルスルホキシドレダクターゼ(PPA0516−PPA0517)、鉄(III)ジクエン酸塩伝達システムパーミアーゼ(PPA0792−PPA0793)、3−イソプロピルりんご酸デヒドラターゼ(PPA1361−PPA1363)、およびマルトース伝達系パーミアーゼ(PPA1553−PPA1554)を含む、これらの領域でコードされた42個のORFが存在した。
ハイスループットゲノム配列決定および大多数の関連する菌株の比較解析は、菌株レベルでのいくつかの病原体の広がりおよび小進化を研究するために使用され、これには、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(29)、ストレプトコッカスニューモニエ(30)、ハイチでのコレラ菌流行(31)を含み、細菌性病原体の理解を改善させることで複数の菌株の比較ゲノム解析の力を実証している。しかし、この手法は、異なる菌株の間でのそれらの多様なビルレント可能性ならびに健康および疾患の両方におけるそれらの役割を理解するように利共生種を研究するためにほとんど適用されていない。
ざ瘡菌の菌株
配列決定された69個のざ瘡菌の菌株のうち、67個は、ざ瘡患者および健康な個人(4)からの皮膚の微小面皰試料から単離された。他の2個の菌株、HL201PA1およびHL202PA1は、King’s College LondonでDavid Beighton氏が提供する難治性歯内病変(23)から単離された。
HL042PA3のゲノムは、Roche/454FLXを用いて配列決定され、PHRAP/CONSED(32)およびGSMAPPER(Roche)の組み合わせを用いて組み立てられた。HL201PA1およびHL202PA1は、Illumina MiSeq(250bp、ペアエンド)を使用して配列決定され、Velvet(33)を使用して組み立てられた。残りの66個のゲノムは、説明したように以前に配列決定された(4)。コード配列は、GeneMark(34)およびGLIMMER(35)を用いて予測された。
コア領域は、82個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義されたが、一方、非コア領域は、すべてのゲノム中に存在しなかったゲノム配列として定義された。KPA171202は、参照ゲノムとして使用された。他の81個のゲノム配列(ほとんどのゲノムおよび10個の完全なゲノム内の一連のコンティグ)の各々は、Nucmer(36)を使用して参照ゲノムにマッピングされた。Nucmerプログラムの81個の「.coords」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて重複領域を特定するために解析された。次いで、コア配列は、上で算出された座標を有するKPA171202のゲノム配列に基づいて抽出された。
単一ヌクレオチド多型(SNP)は、デフォルトの設定(36)でNucmerプログラムのユーティリティオプション「show−snps」を用いて特定された。KPA171202のゲノム配列は、参照ゲノムとして使用された。Nucmerプログラムの81個の「.snps」出力ファイルは全て、Perlスクリプトを使用したKPA171202座標に基づいて固有のSNP位置を特定するために解析された。
コア領域における123,223個のSNPヌクレオチドのうちの82個の連結配列が、ざ瘡菌ゲノムの系統樹を構築するために使用された。MEGA5(37)が、近隣結合法およびp距離法を用いてコア領域内のSNPに基づいて距離を算出するために使用された。200個の複製から推測されたブートストラップ樹が採取された。
82個の分離株の配列型は、以前に公開されたMLSTスキームに基づいて判定された(11〜13)。MLST遺伝子配列は、2個のMLSTスキームで使用された全ての対立遺伝子に対してBLASTを使用して位置合わせされた。
CRISPRFinder(38)が、CRISPR反復スペーサ配列を特定するために使用された。HL110PA3の注釈は、HL001PA1、HL060PA1、HL042PA3、HL082PA2、HL103PA1、HL106PA1、HL110PA4、HL202PA1、J139、およびATCC11828の菌株におけるCRISPR/Casの構造とCRISPR反復スペーサ配列の存在とを特定するために、BLASTの位置合わせのために使用された。各スペーサ配列は、NCBIの非冗長ヌクレオチドデータベースおよび参照ゲノム配列データベース(refseq_genomic)に対してBLAST(39)によって注釈付けされた。
1,685個の非コア断片(合計895,905bp)のうち、500bpを超える長さの314個の非コア断片(合計747,189bp、すべての非コア領域の83%に相当)が抽出され、非コア領域の階層的クラスタリングに使用された。クラスタ3.0プログラム(40)および平均リンケージ法が使用された。クラスタリング行列は314行および82列で構成され、その中で、1は非コア領域の存在を示し、0は非コア領域の不在を示す。Java(登録商標) TreeViewプログラム(41)が、クラスタリング結果を表示するために使用された。
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皮膚の微小面皰サンプリング
皮膚の微小面皰(白色面皰または黒色面皰)の試料が、特殊な粘着テープを使用して被験者の皮膚から採取された。粘着テープが上に置かれる前に、皮膚を水で湿らせた。テープは、乾燥するまで15〜20分間皮膚上に放置された。清潔な手袋が各サンプリングのために使用された。皮膚から取り外された後、テープは、50mLの無菌管内に配置された。これは、鼻、額、顎、および背中などの多くの皮膚部位に適用することができる。
微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻テープから個別に単離されまたは掻き取られ、緩衝液ATL(Qiagen)および直径0.1mmのガラスビーズで充填された2mLの無菌の微量遠心管内に配置された(BioSpec Products,Inc.,Bartlesville,OK)。細胞を室温にて4,800rpmで3分間ビードビータを用いて溶解した。5分間14,000rpmで遠心分離した後、上清が回収され、QIAamp DNAマイクロキット(Qiagen)を用いたゲノムDNA抽出のために使用された。チューインガムからDNAを抽出するための製造業者のプロトコルが使用された。ゲノムDNAの濃度は、分光光度計で判定された。
16S rDNAに基づく皮膚のマイクロバイオーム型を正確に検出するための詳細なプロトコル
PCR増幅、クローニング、および配列決定
16S rDNAは、ユニバーサルプライマー8F(5’−AGAGTTTGATYMTGGCTCAG−3’)および1510R(5’−TACGGYTACCTTGTTACGACTT−3’)を用いて増幅された。サーモサイクラー条件は以下の通りであった:5分間94℃で初期変性ステップ、45秒間94℃で30サイクルの変性、30秒間52℃でアニーリング、90秒間72℃で伸長、20分間72℃で最終伸長ステップ。PCR生成物は、列ベース方法を使用して精製された。続いて、16S rDNAの単位複製配列は、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)内にクローニングされた。One−Shot TOP−10 Chemically Competent大腸菌細胞(Invitrogen)が、ベクターで形質転換され、選択培地上でめっきされた。個別の陽性コロニーが拾われ、選択的なLB液体培地内に接種された。14時間のインキュベーションの後、列ベースのプラスミド抽出キットまたは従来の方法のいずれかを使用して、プラスミドが抽出され、精製された。クローンは、サンガー配列決定法を使用して、双方向に配列決定された。各個人のマイクロバイオーム型は、上位10位の主要リボタイプの16S rDNA配列データに基づいて判定された。図5および配列番号1〜10を参照されたい。
69個の新しいざ瘡菌のゲノムを配列決定するおよび注釈付けすることにより、かつ合計82個のざ瘡菌のゲノムを比較することにより、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に固有であるいくつかのゲノム遺伝子座が特定された(すなわち、遺伝子座1〜4)。図8を参照されたい。全ての配列のざ瘡菌の菌株からの遺伝子座1、2、3、および4のゲノム配列、およびそれらの配列類似性(95%〜100%の範囲)はそれぞれ、配列番号15〜18として列挙される。
患者におけるRT4およびRT5の菌株の存在または不在を迅速に検出するために、遺伝子座1、2、および3を標的化する多重PCRが設計され、ざ瘡菌の菌株および皮膚試料から抽出したゲノムDNA上で実施された。図23は、遺伝子座1、2、および3が、ゲノムデータに基づいて予測されるように様々なざ瘡菌の菌株から増幅されたことを示す。
ざ瘡菌タックマンqPCRアッセイ
プライマーおよびプローブ設計
ざ瘡菌の菌株および臨床試料中に遺伝子座1、2、3、および4を検出するためのプライマーおよびプローブが、表3に列挙されるように設計された。
ベンチトップ増幅は、設計されたプライマーの特異性を評価し、多重にする前に最適なサイクリング条件を判定するために実施された。増幅は、BioRad C1000熱サイクラーを用いて実施された。シングルプレックスPCRの反応物は、0.2μMの標的特異的なプライマー、10X白金Taq緩衝液(Invitrogen)、1.0mMのMgCl2、0.2mMの各dNPT、0.5U/μlのプラチナTaqポリメラーゼ、1μlのDNAテンプレートを含有し、最終容量10μlを構成した。サイクリングは以下の通りであった:5分間94℃で初期変性、続いて30秒間94℃で30サイクルの変性、30秒間60℃でアニーリング、30秒間72℃で延長、5分間72℃で最終延長サイクル。増幅生成物は、標的の正確な増幅およびプライマー標的との種間反応を確認するように1%のアガロース/TBEゲル上で電気泳動的に解析された。
三重qPCRは、Applied Biosystems7900HT機器を用いて実施された。1〜2μlの試料DNAが、X2 QuantiTect多重PCRマスターミックス(Qiagen)、0.2μMのプライマー、遺伝子座1_F、遺伝子座1_R、Pak_F、Pak_R、0.2μMのプローブ、遺伝子座1_プローブおよびPak_プローブ、0.1μMのプライマー遺伝子座3_Fおよび遺伝子座3_R、ならびに0.1μMの遺伝子座3_プローブを含有するマスターミックスに追加された。反応混合物は、無菌のPCRグレード水で20μlの最終容積を構成した。PCRプログラムは、2分間50℃での1サイクル、続いて、多重マスターミックスの活性化を可能にするための15分間95℃での1サイクル、その後、60秒間94℃でおよび90秒間57℃での45サイクルからなっていた。各実行は、培養物から抽出されたざ瘡菌のDNAの校正器、ならびに非鋳型制御(NTC)および水制御を含有した。定量PCRは、Quantitect Multiplex PCRマスターミックスで供給される受動的参照、ROXで実行された。データは、SDS v2.4ソフトウェアを用いて解析された。
ざ瘡菌標的遺伝子座1およびPakのための較正曲線は、純粋な培養物のざ瘡菌から抽出された定量化されたゲノムDNA標準の一連のログ希釈についての平均Ct値をプロットすることによって構築された。ゲノム同等物が推定された。ざ瘡菌の校正器の5個の複製を使用して、Ct値および標準偏差を計算した。これらのデータを使用して、アッセイの感度および検出限界(LOD)を判定した。較正プロットは、ゲノム当たりの遺伝子座1およびPak標的のうちの1個のコピーを用いて、臨床試料中でざ瘡菌のゲノムの数を判定するために使用された。DNA濃度およびコピー数が判定され、精製した生成物の連続10倍希釈が、遺伝子座3較正プロットを構築するための標準として使用された。遺伝子座1および遺伝子座3の存在および不在の可能な組み合わせを表示する菌株が、遺伝子座1およびPak較正のために使用された:HL038PA1(遺伝子座1+、遺伝子座3+)、HL083PA1(遺伝子座1+、遺伝子座3−)HL078PA1(遺伝子座1−、遺伝子座3+)およびHL063PA1(遺伝子座1−、遺伝子座3−)。アッセイは、臨床試料に適用される前に、既知の遺伝子座を有する純粋培養の配列決定されたざ瘡菌の菌株を使用して検証された。各標的についてのアッセイの特異性が、皮膚利共生および他のプロピオニバクテリアを含む他の細菌種を使用して試験された。
遺伝子座1および遺伝子座3を伴うまたは伴わない可能な組み合わせを含む、合計24個の配列決定されたざ瘡菌の菌株(HL063PA1,HL078PA1,HL083PA1,HL038PA1,HL037PA1,HL082PA1,HL020PA1,HL001PA1,HL046PA2,HL043PA1,HL086PA1,HL110PA3,HL110PA4,HL007PA1,HL087PA3,HL027PA1,HL056PA1,HL067PA1,HL074PA1,HL045PA1,HL053PA1,HL005PA1,HL072PA1,HL043PA2)が、三重qPCRのアッセイを検証するために使用された。qPCR三重アッセイは、以前にこれらの遺伝子座を保有するために全ゲノム配列決定により示された菌株における遺伝子座1および遺伝子座3を首尾よく特定した。
2つの臨床試料#1および#2から抽出されたゲノムDNAは、タックマンqPCR三重アッセイを用いて解析された。増幅プロットは、両方の試料におけるざ瘡菌の存在(Pak)を明らかにした(図6)。遺伝子座1および遺伝子座3の標的はまた、試料#2と比較して、1μlの試料#1中に存在するはるかに大きな割合のざ瘡菌の遺伝子座1陽性および遺伝子座3陽性菌株を伴い両方の試料で検出された。
16S rDNAリボタイプ(RT)4、5、7、8、9、および10を有する菌株が、高度にざ瘡と関連すると特定された。ワクチンは、これらの菌株に対して惹起され得る。T.Nakatsuji et al.,128(10)J.Invest.Dermatol.2451−2457(Oct.2008)を参照されたい。
RT6は、健康な皮膚に主に見られる。これらの菌株はざ瘡の予防および治療のための局所生成物中のプロバイオティクスとして使用することができる。HL110PA3、HL110PA4、HL042PA3、およびHL202PA1を含む4個のRT6菌株が単離され、配列決定された。
ざ瘡菌のコアおよび非コア領域の特定
ざ瘡の「コア」ゲノム領域は、82個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義されたが、一方、非コア領域は、すべてのゲノム中に存在しなかったゲノム配列として定義された。S.Tomida et al.,Pan−genome and Comparative Genome Analyses of Propionibacterium acnes Reveal Its Genomic Diversity in the Healthy and Diseased Human Skin Microbiome(印刷中)を参照されたい、実施例2も参照されたい。RT4および5(例えば、遺伝子座1、2および3)の菌株に特異的な非コア領域が、前述したように特定された。(遺伝子座4と表記された)RT8の菌株に特異的な非コア領域はまた、HL078PA1、HL030PA2、HL063PA2、P.acn17、HL097PA1、およびPRP38などのいくつかの他の菌株と同様に特定された。図20を参照されたい。遺伝子座4のゲノム配列は、配列番号18として記載される。ざ瘡と関連する菌株RT4、RT5、およびRT8にほぼ固有である以下の遺伝子座1〜4の遺伝子(表4−1、4−2、および4−3)が、以下に列挙される。非コア配列もまた、記載されている。これらの遺伝子座にコードされた遺伝子は、薬剤標的である。
バクテリオファージは、人間の皮膚の微生物叢を含め、組成物および微生物群集の動態の調節に重要な役割を果たしている。プロピオニバクテリウムざ瘡のバクテリオファージ、主要な皮膚の利共生は、以前に単離され、ざ瘡菌の異なる血清型を区別するためにタイプ分類システムとして使用された。しかし、これらのファージの分子特徴付けが欠けていた。ゲノム配列決定における最近の努力により、ざ瘡菌ファージおよび細菌宿主とそれらの相互作用における我々の理解が改善された。
皮膚マイクロバイオーム中のざ瘡菌ファージの遺伝的多様性および存在量を特徴付けるために、正常な個人から109個の試料およびざ瘡患者から94個を含め、179人の個人から203個の毛包脂腺単位の皮膚試料が収集された。全ての試料は、嫌気性条件下でざ瘡菌のために培養された。49個の試料においてファージプラークが観察された:正常な個人から35個およびざ瘡患者から14個。ざ瘡菌ファージは、統計的有意性(p=0.005、フィッシャーの正確確率検定)を有するざ瘡患者からよりも正常な個人からの試料においてより頻繁に見られた。これらの試料から得られた93個のファージ分離株のうち、ざ瘡患者から5個のファージおよび正常な個人から10個が、454またはイルミナプラットフォームを用いて全ゲノム配列決定のために選択された(表3−1)。
ざ瘡菌ファージのゲノムの多様性を調査するために、出願人らの15個のファージのゲノムおよび14個の公開されたものを含め、29個の配列決定されたファージのゲノム全てが比較された(Farrar et al.,2007;Lood&Collin,2011;Marinelli et al.,2012)。29個のゲノム全てによって共有されるコアゲノム領域は、24,475bp(平均のゲノムの長さの83%)を組み合わせた長さを有し、6,812の単一ヌクレオチド多型(SNP)を含有している。これらの6,812個のSNPから構成された系統樹(図30)は、今日までの全ての研究から単離されたファージゲノムのほとんどが、平均距離0.301(SNP部位での置換率)で互いから同程度の分岐を示すことを明らかにする。しかし、はるかにより短い系統発生距離と緊密に関連しているI群およびII群(図30)と命名された2個のファージ群も見つかった。(コアおよび非コア領域を含む)全てのゲノム配列が、系統発生関係の算出に用いたとき、同じ結果が取得された(図31)。
多数の新たに配列決定されざ瘡ファージの菌株は、ざ瘡菌ファージゲノムの初期注釈を検証し、精製する機会を提供する。解析に基づいて、ファージのゲノムのいくつかの代替的注釈が確認された。
ざ瘡菌ファージの宿主範囲および特異性を調査するために、15個の配列決定されたファージが、65個のざ瘡菌の菌株、3個のフメルシイ菌の菌株、および1個の顆粒菌の菌株を含む、69個のプロピオニバクテリウム菌株のパネルに対してスクリーニングされた。ざ瘡菌の菌株KPA171202およびATCC11828を除いて、これらのプロピオニバクテリウム菌株の全てがファージについてサンプリングされた対象の同じコホートから単離された。65個のざ瘡菌の菌株および3個のフメルシイ菌の菌株全てのゲノムが配列決定された。それらのコアゲノム領域におけるSNPに基づく65個のざ瘡菌の菌株の系統樹が構築された(図33、左の系統樹)。それらのRecA遺伝子配列[7]によってざ瘡菌の菌株の以前に確立されたタイプ分類に基づいて、細菌の収集は、各タイプ(IA−1、IA−2、IB−1、IB−2、IB−3、およびII)を表す複数の菌株で、人間の皮膚に見られるざ瘡菌のすべての主要な系統を含んだ。我々の15個の配列決定されたファージの各々に対して69個の細菌の菌株の各々の罹病性/耐性が、クロスストリーク法を使用して判定された。全体で、1,035個の細菌ファージの相互作用が判定された。各実験は、少なくとも5回反復された。ファージに対する耐性を示した細菌の菌株について、プラーク形成効率(EOP)における倍数変化は、試験されたすべての菌株に罹病性であることが知られているざ瘡菌の菌株ATCC6919に対して判定された。
65個のざ瘡菌の分離株のうち、8個の菌株は、RT2およびRT6(RecAII型)に属し、外来のDNAに対する細菌の適応免疫機構として機能するCRISPR/Casの遺伝子をコードする。これらのRT2およびRT6の菌株は各々、CRISPRアレイ内に33個のヌクレオチドの長さで1〜9個のスペーサを有する。合計では、それらは42個のスペーサをコードし、それらのうちの28個が固有である。
プロピオニバクテリア培養
ざ瘡菌、フメルシイ菌、および顆粒菌の菌株は、4〜6日間37℃でクロストリジウム培地(Oxoid)における嫌気条件下で培養された。プロピオニバクテリウム培養は、培地プレート上のファージ培養のための上層寒天オーバーレイを調製するために使用された(12g/Lの膵臓カゼインダイジェスト、12g/LのDifco酵母抽出、22.2mMのD−ブドウ糖、29.4mMのg/Lの一塩基リン酸カリウム、8mMの硫酸マグネシウム七水化物、20g/Lのディフコ寒天)。
皮膚試料培養プレート上で見つかったプラークは、ピペットの先端で寒天を穿刺すること、および50μLのSM緩衝液(0.1Mの塩化ナトリウム、8mMの硫酸マグネシウム七水和物、1MのTris−HCl、pH7.5、2%のゼラチン、1mMの塩化カルシウム)に再懸濁することにより単離された。ファージの再懸濁は、ざ瘡菌の菌株ATCC6919を含有する上層寒天と共に培地プレート上に広がった。2日間37℃でインキュベートした後、ファージは、室温で8mLのSM緩衝液で溶出され、0.22uM PESフィルター(Millipore)で濾過され、4℃で保存された。ファージ力価は、プラークアッセイにより判定された。
ファージゲノムは、Roche GS FLX TitaniumまたはIllumina MiSeq platformプラットフォームを使用して、多重に配列決定された。新規の読み取りアセンブリは、MIRAを用いて実施され[24]、結果として得られたコンティグは、Consedで手動で仕上げられた[25]。20,000個以上の読み取りによってカバーされたファージのために、アセンブリは、454個のデータについての10,000個の読み取り、またはMiSeqデータについての20,000個の読み取りのランダムに選択されたサブセット上で実施された。完全に組み立てられたファージゲノムは、Genemark.hmm[26]およびグリマーv3.02[27]を使用して注釈を付けされた。
16個のファージゲノム全ての中に存在する配列は、ファージゲノムのコア領域として定義された。これらのコア領域を特定するために、位置合わせは、Nucmerを使用して、PA6ゲノムと他の15個のファージゲノムの各々との間にまず生成された[28]。これは、所定のファージゲノムに位置合わせされたPA6ゲノム内の間隔を記述する15組の開始および終了座標をもたらした。コア領域が、15組の座標組全ての間で重複する間隔を判定することによって、全てファージについて算出された。コア領域の配列は、後続の多重配列位置合わせのために連結された。コア領域の単一ヌクレオチド多型(SNP)は、デフォルトの設定でNucmerのオプション「show−snps」を用いて特定された。MEGA5[29]を使用して、系統樹が、SNP部位に基づいてpの距離の近隣接合方法により構築された。ブートストラッピングは、200個の複製に基づいていた。
I群およびII群ファージの多重配列位置合わせは、MAFFT[30]を使用して生成された。これらの位置合わせの各々において、全ての不一致および隙間(相違)の位置は、無作為に選択された参照ゲノムに対して相対的に記録された。参照ゲノムにおける隣接する隙間は、単一の相違として数えられた。参照ゲノムは、50個のヌクレオチドウィンドウに分割され、各配列ウィンドウの相違密度が、それが含む相違の総数として計算された。密度は、Artemis[33]にプロットされた。
15個のファージに対するプロピオニバクテリウム菌株の罹病性/耐性が、変更されたクロスストリークアッセイを用いて判定された。細菌菌株が培養され、培地プレートに並列に画線された(制御としてATCC6919に沿って〜1cm離れて、各プレートに5〜6個の分離株)。約106pfu/mLのうちの5μLのファージ懸濁液が、各ストリークに適用され、その後、プレートを2日間嫌気的に37℃でインキュベートされた。各クロスストリーク実験の少なくとも5つの反復が、菌株が溶解に基づいて判断される罹病性または耐性であったかを判定するために実施された。細菌菌株の耐性は、ざ瘡菌の菌株ATCC6919に相対的なファージのプラーク形成の効率をアッセイすることによって更に定量化され、以下のように計算された。
遺伝的に類似したファージが、類似の宿主範囲および特異性を有するかどうかを判定するために、それらの系統発生と表現型との間の相関関係が算出され、後者は、細菌の耐性試験の結果に基づいた。所定のファージの宿主範囲を表す細菌の耐性表の各列は、耐性のインスタンスに1、罹病性のインスタンスに0を割り当てることによって、バイナリ形式に変換された。各列間のユークリッド距離は、全てのファージ間の表現型距離行列を計算するために使用された。ファージゲノム間の系統発生距離行列は、MEGA5を用いて計算された[29]。Rにおけるade4パッケージ[34]を用いて、マンテル検定が、2つの間の相関関係を判定するために表現型および系統発生距離行列上で実施された。10,000の順列が実施された。
CRISPRスペーサ配列は、CRISPRファインダー[35]を使用して、ざ瘡菌のゲノム中で特定された。抽出されたスペーサ配列は、BLASTnを使用して全てのファージ配列に対して位置合わせされた。最大2個の不一致を伴うプロトスペーサが特定された。
人間の皮膚から単離された15個のざ瘡菌ファージのゲノムが配列決定された。ファージゲノムは、適度に高い配列類似性を示し、サイズ、組織において同程度であった。ゲノムの比較に基づいて、ほとんどのファージは互いから分岐しているが、一方、それらのいくつかは、以前に記載されていない密接に関連する群を形成している。69個のプロピオニバクテリウムの菌株のパネルに対して試験されたとき、これらのファージは、IB−3およびII型からいくつかの菌株を除くすべてのざ瘡菌の菌株を溶解した。ファージのいくつかは、プロピオニバクテリウムフメルシイの菌株を溶解することができた。ファージに対する細菌の罹病性/耐性は、ファージ系統発生、またはファージゲノム中のプロトスペーサと一致するII型ざ瘡菌の菌株におけるCRISPRスペーサの存在と有意な相関関係がないことが分かった。
15個の新しいファージゲノムを用いて、ざ瘡菌ファージの多様性が、追加された新規の群を伴い以前説明したものよりも広範囲であることが判定された。宿主範囲および特異性は、ファージ間で異なるが、ファージゲノムの系統発生と相関していない。ファージゲノムに一致するCRISPRスペーサをコードすることは、ファージにざ瘡菌の耐性を付与するのに十分ではないことが分かった。本研究では、ざ瘡および他のざ瘡菌と関連する疾患の治療におけるファージの潜在的な適用に新たな洞察を提供する。
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PHL113M01、PHL060L00、PHL112N00、およびPHL085M01。
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL060L00、PHL067M10、PHL071N05、PHL112N00、PHL037M02、PHL085N00、PHL115M02、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、PHL010M04、およびPHL066M04。
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL060L00、PHL067M10、PHL071N05、PHL112N00、PHL037M02、PHL085N00、PHL115M02、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、PHL010M04、およびPHL066M04。
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL060L00、PHL067M10、PHL071N05、PHL112N00、PHL037M02、PHL085N00、PHL115M02、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、PHL010M04、およびPHL066M04。
ざ瘡菌ファージの菌株のいくつかは、密接に関連するプロピオニバクテリウム種、フメルシイ菌を溶解することができ、これは、人工器官における感染と関連していることが仮定されている。フメルシイ菌の菌株を溶解することができるざ瘡菌ファージの菌株は、フメルシイ菌と関連する疾患のための治療剤として潜在的に使用することができる。
PHL113M01、PHL111M01、PHL082M00、PHL067M10、PHL071N05、PHL085N00、PHL085M01、PHL114L00、PHL073M02、およびPHL010M04。
それらのPA6相同体に85%以下の同一性を示すファージゲノム中のORF
上記に基づいて、現在は、いくつかのざ瘡菌の菌株はざ瘡に関連していることが知られている。従って、診断時に、皮膚科医は、患者の皮膚上でどの菌株が優勢かを知ることが有用であろう。これを行うためには、最初に患者の皮膚試料からの細菌DNAを抽出する必要がある。上に詳述の下流解析のために皮膚からの細菌DNAを単離するための方法/キットが、実際に実装され得る。細菌DNAが抽出された後、上記に詳述した患者のマイクロバイオーム型を特定するために迅速かつ正確な検出/診断方法/キットが、診断のために実装され得る。一旦患者のマイクロバイオーム型が診断されると、いくつかの手法を用いて、患者を治療することができる。
患者の優勢なざ瘡菌の菌株が、1組のCRISPR/Casを保有しない場合、前述に基づくファージ療法の追加の治療が用いられる。例えば、ざ瘡を治療するためのバクテリオファージに基づく菌株特異的療法が適用され得る。代替治療戦略は、健康と関連する菌株の増殖を促進することにより、ざ瘡菌の菌株の相対的存在量のバランスを取ることである。健康と関連する菌株は、プロバイオティクスとして使用することができる。これらは、局所クリーム、溶液、または他の化粧品であり得る。
E. Grice et al., 324 Science 1190−1192 (2009).
Claims (46)
- 個人がざ瘡を有しているかどうかを判定する方法であって、
個人から皮膚試料を取得することと、
前記試料から細菌DNAを単離することと、
前記試料中の16SリボソームDNAを増幅することと、
前記増幅されたDNA生成物を配列決定することと、
ざ瘡菌株の10個の主要なリボタイプ(RT)であるRT1〜RT10(配列番号1〜10)のうちの1個以上に基づいて、前記個人のDNAをタイプ分類することと、を含み、
前記タイプ分類が、前記個人がRT1〜RT10のうちの1個以上を有するかどうかを判定することによって生じ、前記個人がRT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有する場合、前記個人がざ瘡を有すると診断される、方法。 - 前記個人がRT4(配列番号4)、RT5(配列番号5)、またはRT8(配列番号8)を有する場合、前記個人がざ瘡を有すると診断される、請求項1に記載の方法。
- 異なる種類のざ瘡を診断するための方法であって、
対象から皮膚試料を取得することと、
前記試料から細菌DNAを単離することと、
前記試料中の16SリボソームDNAを増幅することと、
前記増幅されたDNA生成物を配列決定することと、
ざ瘡菌の菌株の5個の主要なマイクロバイオームのうちの1個以上に基づいて前記対象のDNAをタイプ分類することと、を含み、
前記対象がマイクロバイオームIVまたはVにタイプ分類された場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。 - ざ瘡を迅速に診断するための方法であって、
対象から皮膚試料を取得することと、
前記試料から細菌DNAを単離することと、
1個以上のプライマーセットを使用して前記DNAを増幅することと、
配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について、前記増幅されたDNAを解析することと、を含み、
配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。 - 前記増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在について解析され、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも99%の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、請求項4に記載の方法。
- 前記増幅されたDNAが、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在について解析され、配列番号29〜32および82〜434のうちの少なくとも1個の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、請求項4に記載の方法。
- ざ瘡を迅速に診断するための方法であって、
対象から皮膚試料を取得することと、
前記試料から細菌DNAを単離することと、
1個以上のプライマーセットを使用して前記DNAを増幅することと、
1個以上のプローブを使用して前記増幅されたDNAを検出することと、
遺伝子座1(配列番号29および82〜97のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、遺伝子座3(配列番号31および187〜423のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)、および/または遺伝子座4(配列番号32および424〜434のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する少なくとも1個の配列)の存在について、前記プローブ信号を解析することと、を含み、
遺伝子座1〜4のうちの1個以上が存在する場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。 - 前記信号が、少なくとも99%の相同性に基づいて遺伝子座1、遺伝子座2、遺伝子座3、および/または遺伝子座4の存在について解析される、請求項7に記載の方法。
- 前記信号が、100%の相同性に基づいて遺伝子座1、遺伝子座2、遺伝子座3、および/または遺伝子座4の存在について解析される、請求項7に記載の方法。
- 前記プライマーセットのプライマーが、(遺伝子座1について)配列番号11、12、17、および18、(遺伝子座2について)配列番号13、14、20、および21、(遺伝子座3について)配列番号15、16、23、および24、ならびに(遺伝子座4について)配列番号26および27からなる群から選択される、請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーセットのプライマーが、(遺伝子座1について)配列番号11、12、17、および18、(遺伝子座2について)配列番号13、14、20、および21、(遺伝子座3について)配列番号15、16、23、および24、ならびに(遺伝子座4について)配列番号26および27からなる群から選択され、前記プローブが、(遺伝子座1について)配列番号19、(遺伝子座2について)配列番号22、(遺伝子座3について)配列番号25、および(遺伝子座4について)配列番号28である、請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 熱失活させたざ瘡菌の菌株、前記菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチンであって、前記菌株が、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、またはRT10菌株である、ワクチン。
- 対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株の16S rDNA配列解析に基づき、前記対象に特異的であることが特定された、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前記菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および/または治療のためのワクチン。
- 熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、ざ瘡菌の菌株について特定された固有のゲノムの遺伝子座、領域、または配列のうちの少なくとも1個に特異的である、請求項12または請求項13に記載のワクチン。
- 熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、遺伝子座1(配列番号29および82〜97)、遺伝子座2(配列番号30および98〜186)、遺伝子座3(31および187〜423)、ならびに遺伝子座4(32および424〜434)のうちの少なくとも1個に特異的である、請求項12または請求項13に記載のワクチン。
- ざ瘡の個人化された治療のための方法であって、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株を判定することと、少なくとも1個の検出されたざ瘡菌の菌株を対象とした活性成分を用いて前記対象を治療することとを含み、前記活性成分が、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化する薬剤を含み、前記標的化薬剤が、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して特異的なゲノム要素を標的化する、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、およびそれらの組み合わせを含む、方法。
- ざ瘡を治療するための方法であって、
ざ瘡菌の菌株の16S rDNAに基づいて健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも1個のざ瘡菌の菌株を含む有効量のプロバイオティクスを投与することを含む、方法。 - 前記菌株が、RT6菌株である、請求項17に記載の方法。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性を有する、請求項17に記載の方法。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも99%の相同性を有する、請求項17に記載の方法。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と100%の相同性を有する、請求項17に記載の方法。
- ざ瘡を治療するための方法であって、
健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株によって生成される有効量の代謝産物を投与することを含み、
前記代謝産物が、細菌培養上清、細胞溶解物、タンパク質、核酸、脂質、および他の細菌分子からなる群から選択される、方法。 - 前記菌株が、RT6菌株である、請求項22に記載の方法。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性を有する、請求項22に記載の方法。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも99%の相同性を有する、請求項22に記載の方法。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と100%の相同性を有する、請求項22に記載の方法。
- 対象のざ瘡を治療するための方法であって、
前記対象がそれぞれ、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を有すると判定されたとき、RT4、RT5、RT7、RT8、RT9、またはRT10を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む、方法。 - 前記薬剤の投与の前に、請求項1、請求項2、請求項4、または請求項7に記載の方法を実施することを更に含む、請求項27に記載の方法。
- 前記薬剤が、小分子、アンチセンス分子、siRNA、生物製剤、抗体、またはそれらの組み合わせである、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌のうちの少なくとも1個の菌株を含む、組成物。
- 前記菌株が、RT6菌株である、請求項30に記載の組成物。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも95%の相同性を有する、請求項30に記載の組成物。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と少なくとも99%の相同性を有する、請求項30に記載の組成物。
- 前記菌株が、配列番号51、配列番号52、配列番号53、または配列番号54と100%の相同性を有する、請求項30に記載の組成物。
- IB−3系のざ瘡を診断するための方法であって、
対象から皮膚試料を取得することと、
前記試料から細菌DNAを単離することと、
1個以上のプライマーセットを使用して前記DNAを増幅することと、
配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在について、前記増幅されたDNAを解析することと、
配列番号55〜81のうちの少なくとも1個と少なくとも95%の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がIB−3系のざ瘡を有すると診断される、方法。 - ざ瘡の個人化された治療のための方法であって、対象に影響を与えているざ瘡の菌株(複数可)を判定することと、前記菌株(複数可)を特異的に対象とした有効量の少なくとも1個のファージを前記対象に投与することと、を含む、方法。
- 前記対象が、RT4菌株、RT5菌株、RT7菌株、RT8菌株、RT9菌株、および/またはRT10菌株を対象としたファージで治療される、請求項36に記載の方法。
- 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームI型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号40)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
- 個人に有効量のファージを投与することを含む、IB−3菌株を伴うマイクロバイオームI型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL082M00(配列番号47)およびPHL071N05(配列番号41)からなる群から選択される、方法。
- 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームII型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL060L00(配列番号34)、PHL112N00(配列番号35)、およびPHL085M01(配列番号44)からなる群から選択される、方法。
- 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIII型または優勢なRT8のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
- 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームIV型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
- 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームV型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL060L00(配列番号34)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL112N00(配列番号35)、PHL037M02(配列番号45)、PHL085N00(配列番号46)、PHL115M02(配列番号43)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、PHL010M04(配列番号38)、およびPHL066M04(配列番号39)からなる群から選択される、方法。
- 個人に有効量のファージを投与することを含む、プロピオニバクテリウムフメルシイと関連する病気を治療するための方法であって、前記ファージが、PHL113M01(配列番号36)、PHL111M01(配列番号33)、PHL082M00(配列番号47)、PHL067M10(配列番号42)、PHL071N05(配列番号41)、PHL085N00(配列番号46)、PHL085M01(配列番号44)、PHL114L00(配列番号37)、PHL073M02(配列番号40)、およびPHL010M04(配列番号38)からなる群から選択される、方法。
- 対象のざ瘡を診断するためのキットであって、
配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマーと、
使用説明書と、を含む、キット。 - 対象のざ瘡を診断するためのキットであって、
配列番号11〜18、20、21、23、24、26、および27からなる群から選択される少なくとも1個のプライマーと、
配列番号19、22、25、および28からなる群から選択される少なくとも1個のプローブと、
使用説明書と、を含む、キット。
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