JP2015512255A - ざ瘡の高速診断および個人化された治療 - Google Patents

ざ瘡の高速診断および個人化された治療 Download PDF

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Abstract

ニキビに罹患している患者を診断し、かつ治療する方法であって、個人がＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を有する場合、個人がざ瘡を有すると診断することを含む、方法。ざ瘡を治療するための方法は、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、ファージ、ワクチン、またはそれらの組み合わせなどの、ＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む。【選択図】図５

Description

連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＵＨ２ＡＲ０５７５０３およびＲ０１ＧＭ０９９５３０の下、米国政府の支援によって行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６１２，２９０号の優先権を主張する。
ざ瘡は、吹き出物または「ニキビ」を引き起こす皮膚の状態である。これには、白色面皰、黒色面皰、赤い炎症を起こした皮膚の斑点（嚢胞など）が含まれる。皮膚の表面の小さな毛穴が詰まると、ざ瘡が生じる。各毛穴は、小胞へと開く。小胞は、毛および油腺を含む。この腺によって放出される油分は、古い皮膚細胞を除去するのに役立ち、皮膚を柔らかく保つ。腺があまりにも多くの油分を生成すると、毛穴が塞がれる場合がある。汚れ、細菌、および細胞が蓄積する。この遮断が、栓または面皰と呼ばれる。栓の頂部が白色である場合は、白色面皰と呼ばれる。栓の頂部が暗色である場合は、黒色面皰と呼ばれる。栓が突然開いた場合、腫れおよび赤い隆起が生じる。皮膚の深部にあるざ瘡は、激しい痛みを伴う嚢胞を引き起こし得る。これは、嚢胞性ざ瘡と呼ばれる。
ざ瘡は、１０代において最も一般的であるが、誰もがざ瘡を有し得る。１０代の８５％がざ瘡を有する。ホルモンの変化が、皮膚をより油性にし得る。ざ瘡は、遺伝する傾向がある。それは、思春期、月経、妊娠、避妊薬、もしくはストレスと関連するホルモンの変化、脂っこいもしくは油性の化粧品およびヘア製品、（ステロイド、テストステロン、エストロゲン、およびフェニトインなどの）ある種の薬剤、または高レベルの湿度および発汗によって引き起こされ得る。
様々な治療法が、ざ瘡の治療のために存在する。一般的に、ざ瘡治療は、油分の生成を低減すること、皮膚細胞の代謝回転を高速化すること、細菌感染に取り組むこと、炎症を軽減すること、または４つ全てを行うことによって有効である。これらの種類のざ瘡治療は、店頭の局所治療剤、抗生物質、経口避妊薬、および化粧品処置を含む。ざ瘡化粧水は、油分を乾燥させ、細菌を殺し、死んだ皮膚細胞の脱落を促進し得る。店頭（ＯＴＣ）の化粧水は、一般的に、軽度であり、それらの活性成分として、過酸化ベンゾイル、硫黄、レゾルシノール、サリチル酸または硫黄を含む。研究では、経口抗生物質と共に局所過酸化ベンゾイルを使用することが、抗生物質耐性の発症リスクを低減し得ることが見てとれた。抗生物質は、胃の不調、眩暈、または皮膚の変色などの副作用を引き起こし得る。これらの薬剤はまた、肌の太陽への感度を高め、経口避妊薬の有効性を低減し得る。深い嚢胞の場合、抗生物質は十分ではない。イソトレチノイン（Ａｍｎｅｓｔｅｅｍ、Ｃｌａｒａｖｉｓ、Ｓｏｔｒｅｔ）は、瘢痕嚢胞性ざ瘡または他の治療法に反応しないざ瘡に利用できる強力な薬である。しかし、イソトレチノインは、乾燥肌、うつ病、重度の胃痛、および筋肉／関節／背中の痛みなどの多くの副作用を有し、母親がイソトレチノインを使用した乳幼児における出生時欠損を引き起こし得る。ノルゲスチメートおよびエチニルエストラジオールの組み合わせ（Ｏｒｔｈｏ Ｔｒｉ−Ｃｙｃｌｅｎ、Ｐｒｅｖｉｆｅｍ、その他）を含む経口避妊薬は、女性のざ瘡を改善し得る。しかし、経口避妊薬は、頭痛、乳房の圧痛、嘔気、およびうつ病など他の副作用を引き起こし得る。化学剥離および微小皮膚剥離は、ニキビを制御するのに有用であり得る。従来、小じわ、日焼けによる損傷、および小さな顔の傷跡の外観を軽減するために使用されてきたこれらの化粧品処置は、他のざ瘡治療と組み合わせて使用されるときに最も効果的である。それらは、一時的に、皮膚の重度の赤み、スケーリングおよび水疱形成、ならびに長期的な変色を引き起こし得る。
現在利用可能な治療によって引き起こされる負の副作用に加えて、個人レベルでざ瘡を引き起こす特定の細菌を標的化するために、患者に個人化された利用可能な治療法はない。加えて、皮膚科医は、ざ瘡治療を個人化するために、診断時にどの菌株が患者の皮膚上で優勢であるかを知ることが有用であろう。従って、ざ瘡の個人化された診断および治療の方法の当技術分野における必要性が存在する。
本発明は、ざ瘡に罹患した患者における診断および個人化された治療方法を対象とする。
一実施形態では、本発明は、個人がざ瘡を有するかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、個人から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、前述の試料における１６ＳリボソームＤＮＡを増幅することと、前述の増幅されたＤＮＡ生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の１０個の主要なリボタイプ（ＲＴ）、ＲＴ１〜ＲＴ１０（配列番号１〜１０）のうちの１個以上に基づいた個人のＤＮＡをタイプ分類することとを含み、前述のタイプ分類が、個人がＲＴ１〜ＲＴ１０のうちの１個以上を有するかどうかを判定することによって生じ、前記個人がＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を有する場合、個人はざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の個人がＲＴ４（配列番号４）、ＲＴ５（配列番号５）、またはＲＴ８（配列番号８）を有する場合、前述の個人がざ瘡を有すると診断され得る。
別の実施形態では、本発明は、異なる種類のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、前述の試料における１６ＳリボソームＤＮＡを増幅することと、前述の増幅されたＤＮＡ生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の５個の主要なマイクロバイオーム型のうちの１個以上に基づいて対象のＤＮＡをタイプ分類することとを含み、前述の対象がマイクロバイオームＩＶまたはＶにタイプ分類された場合、前述の対象はざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、１個以上のプライマーセットを使用して前述のＤＮＡを増幅することとを含み、前述の増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在について解析され、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９９％の相同性を有する配列の存在について解析され得、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９９％の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。別の例として、前述の増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個の存在について解析され得、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。
別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、１個以上のプライマーセットを使用して前述のＤＮＡを増幅することと、１個以上のプローブを使用して前述の増幅されたＤＮＡを検出することと、遺伝子座１（配列番号２９および８２〜９７のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、遺伝子座２（配列番号３０および９８〜１８６のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、遺伝子座３（配列番号３１および１８７〜４２３のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、および／または遺伝子座４（配列番号３２および４２４〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）の存在について、前述のプローブ信号を解析することとを含み、遺伝子座１〜４のうちの１個以上が存在する場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、この信号は、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性に基づいて、遺伝子座１、遺伝子座２、遺伝子座３、および／または遺伝子座４の存在について解析され得る。
前述の方法において、前述のプライマーセットのプライマーが、（遺伝子座１について）配列番号１１、１２、１７、および１８、（遺伝子座２について）配列番号１３、１４、２０、および２１、（遺伝子座３について）配列番号１５、１６、２３、および２４、（遺伝子座４について）配列番号２６および２７からなる群から選択され得る。前述の方法において、前述のプローブが、（遺伝子座１について）配列番号１９、（遺伝子座２について）配列番号２２、（遺伝子座３について）配列番号２５、（遺伝子座４について）配列番号２８であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および／または治療のためのワクチンを提供し、前述の菌株が、ＲＴ４菌株、ＲＴ５菌株、ＲＴ７菌株、ＲＴ８菌株、ＲＴ９菌株、またはＲＴ１０菌株である。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析に基づき、前述の対象に特異的であることが特定された、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および／または治療のためのワクチンを提供する。
ワクチンに関して、前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、ざ瘡菌の菌株について特定された固有のゲノムの遺伝子座、領域、または配列のうちの少なくとも１個に特異的であり得る。前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、遺伝子座１（配列番号２９および８２〜９７）、遺伝子座２（配列番号３０および９８〜１８６）、遺伝子座３（３１および１８７〜４２３）、および遺伝子座４（３２および４２４〜４３４）のうちの少なくとも１個に特異的であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡の個人化された治療のための方法を提供し、該方法は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株を判定することと、少なくとも１個の検出されたざ瘡菌の菌株を対象とした活性成分を用いて前述の対象を治療することとを含み、前述の活性成分が、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化する薬剤を含み、前述の標的化薬剤が、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して特異的なゲノム要素を標的化する、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、およびそれらの組み合わせを含む。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、ざ瘡菌の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡに基づいて健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも１個のざ瘡菌の菌株を含む有効量のプロバイオティクスを投与することを含む。前述の菌株は、ＲＴ６菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性、例えば、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌によって生成された有効量の代謝産物を投与することを含み、前述の代謝産物は、細菌培養上清、細胞溶解物、タンパク質、核酸、脂質、および他の細菌分子からなる群から選択される。前述の菌株は、ＲＴ６菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性、例えば、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、対象のざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、前述の対象がそれぞれ、ＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を有すると判定されたとき、ＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む。上に記載された方法は、薬剤の投与前に実施され得る。前述の薬剤が、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、またはそれらの組み合わせであり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも１個のざ瘡菌の菌株を含む組成物を提供する。前述の菌株は、ＲＴ６菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性、例えば、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ＩＢ−３系のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、１個以上のプライマーセットを使用して前述のＤＮＡを増幅することと、配列番号５５〜８１のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在について、前述の増幅されたＤＮＡを解析することとを含み、配列番号５５〜８１のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がＩＢ−３系のざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡の菌株（複数可）を判定することと、前述の菌株（複数可）を特異的に対象とした有効量の少なくとも１個のファージを前述の対象に投与することとを含むざ瘡の個人化された治療のための方法を提供する。例えば、前述の対象は、ＲＴ４菌株、ＲＴ５菌株、ＲＴ７菌株、ＲＴ８菌株、ＲＴ９菌株、および／またはＲＴ１０菌株を対象としたファージで治療され得る。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、ＩＢ−３菌株を伴うマイクロバイオームＩ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）およびＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＩ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、およびＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＩＩ型または優勢なＲＴ８のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＶ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＶ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、プロピオニバクテリウムフメルシイ（ｈｕｍｅｒｕｓｉｉ）に関連した病気を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、およびＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号１１〜１８、２０、２１、２３、２４、２６、および２７からなる群から選択される少なくとも１個のプライマー、および使用説明書を含む。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号１１〜１８、２０、２１、２３、２４、２６、および２７からなる群から選択される少なくとも１個のプライマー、配列番号１９、２２、２５、および２８からなる群から選択される少なくとも１個のプローブ、および使用説明書を含む。
この出願書類は、カラーで作成された少なくとも１個の図面を含む。カラー図面（複数可）を伴うこの出願の写しは、必要な料金の請求および支払いに応じて特許庁により提供されるであろう。
ざ瘡菌が、クローンの８７％を占める毛包脂腺単位の微生物叢を支配することを示す。ざ瘡菌は、ざ瘡患者および正常な皮膚を有する個人の両方における毛包脂腺単位で優勢であった。１６Ｓ ｒＤＮＡを配列決定することにより、ざ瘡菌の配列は、全てのクローンの８７％を占めた。０．３５％を上回る相対的存在量を有する種は、相対的存在量の順に列挙される。正常な個人からプールされた試料のメタゲノムのショットガン配列による種の分布は、右の列に示されるように、毛包脂腺単位におけるざ瘡菌の高い存在量を確認した。 ざ瘡菌のリボタイプの存在量の順位が、より高い分類学的レベルで見られるものと同様の分布を示すことを明らかにする。少数の非常に豊富なリボタイプおよびいくつかの珍しいリボタイプが、試料中で観察された。いくつかのリボタイプは、ざ瘡患者において非常に富化されていた。上位３０位の最も豊富なリボタイプのみが、図２に反映されている。 毛包脂腺単位で最も豊富なざ瘡菌のリボタイプはまた、他の身体部位でも豊富であったことを示す。ざ瘡患者および正常な個人において見られる主要なリボタイプは、ＨＭＰおよびＧｒｉｃｅら（２００９年）のデータセットと比較された。上位３位のリボタイプは、異なるデータセットにおいて最も豊富なものである。Ｇｒｉｃｅら（２００９年）のデータセットに見られる過剰なＲＴ４およびＲＴ５は、１個の対象、ＨＶ４に起因し、そのざ瘡菌の菌株集団は、試料とされた全ての皮膚部位におけるこれら２個のリボタイプによって支配されていた。この対象を除去した後、リボタイプの分布は、ＨＭＰ試料および研究された正常な皮膚試料に類似する。ＲＴ６はまたは、健康な個人から収集されたＨＭＰデータセットに豊富に見られる。 ざ瘡菌集団の構造は、ざ瘡および正常な皮膚で異なることを示す。試料のざ瘡菌集団は、上位１０位の最も豊富なリボタイプために重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離行列の元本座標解析を使用してクラスタ化された。主要な座標１（Ｐ１）が４３．６４％の変化を説明し、Ｐ２が２０．０７％の変化を説明する。解析は、ＱＩＩＭＥ（Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ．２０１０）を用いて実施された。 ざ瘡患者および正常な皮膚を有する個人における上位１０位の最も豊富なざ瘡菌のリボタイプの分布を表す。各列は、各対象において特定された上位１０位のリボタイプの割合を表す。対象毎の平均ざ瘡菌クローン数は２６２であり、上位１０位のリボタイプの平均クローン数は１００であった。ざ瘡菌の菌株レベルでの５個の主要なマイクロバイオーム型がデータで観察された。ＩＶおよびＶ型は、主にざ瘡患者に見られた。５０未満のざ瘡菌１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を有する２個の試料（ざ瘡から１個、正常な皮膚から１個）は、表示されない。 ざ瘡および正常な皮膚の２個の群を分離することなく、全ての試料中の上位１０位の最も豊富なざ瘡菌のリボタイプの分布を示す。各列は、各試料において特定された上位１０位のリボタイプの割合を表す。全ての試料をクラスタ化したとき、ざ瘡菌の菌株レベルで同じ５個の主要なマイクロバイオーム型が観察され、マイクロバイオームの分類は、疾患の状態に依存しないことを示した。９９個の試料のうちの３個のみが、（アスタリスクでマークされた）図５に示すものと比較して、異なるようにクラスタ化された。５０未満のざ瘡菌１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を有する２個の試料（ざ瘡から１個、正常な皮膚から１個）は、示されない。 同じ５個の主要なマイクロバイオーム型が複数のデータセットにおいて観察されたことを示す。研究、ＨＭＰ、およびＧｒｉｃｅら（２００９）の試料は、上位１０位の最も豊富なざ瘡菌のリボタイプに基づいて共にクラスタ化された。合計で、２８４個の試料が含まれた。各列は、各試料において特定された上位１０位のリボタイプの割合を表す。ＨＭＰ試料およびＧｒｉｃｅらの試料（２００９）の両方は、健康な個人から採取され、従って、マイクロバイオームＩＶおよびＶ型の割合は、解析では過小評価されている。上位１０位のリボタイプの１０個未満の配列を有する試料は、含まれていなかった。 ７１個のざ瘡菌の菌株のゲノム比較が、ＲＴ４およびＲＴ５のゲノムが他のものと異なることを示したことを明示する。２個の染色体の領域、遺伝子座１および２は、分岐群ＩＡ−２および他の１個のゲノムＨＬ０８６ＰＡ１に固有である。分岐群ＩＡ−２は、ざ瘡内で非常に富化されたＲＴ４およびＲＴ５から主に成る。プラスミド（遺伝子座３）の存在はまた、ＲＴ４およびＲＴ５の特徴である。各行は、リボタイプに従って着色されたざ瘡菌のゲノムを表す。行は、ざ瘡菌のコアゲノム中のＳＮＰに基づいて算出される系統発生によって順序付けられる。トポロジのみが示される。分岐群は、そのｒｅｃＡ型（ＩＡ、ＩＢ、およびＩＩ）に基づいて命名された。列は、ゲノム中の予測されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表し、５５Ｋｂプラスミドをコードする完成したゲノムＨＬ０９６ＰＡ１に沿って、ＯＲＦの位置によって順序付けられる。染色体（左側）上の最初の３００個のＯＲＦのみと、プラスミド（右側）上の全てのＯＲＦとが示される。着色されたプラスミドの領域は、ＨＬ０９６ＰＡ１プラスミド領域に排他的に一致するコンティグ上の遺伝子を表す。プラスミドの領域を越えて明確に延在するコンティグ上に落ちる遺伝子が染色体に位置する可能性が高く、灰色に着色されている。リボタイプのざ瘡指数は、表１の列５に示されるざ瘡内に見られる各リボタイプのクローンの割合に基づいて算出された。 ざ瘡菌のコアゲノムにおける９６，８８７個のＳＮＰに基づいて構築された系統樹を示し、これは、７１個のゲノムがざ瘡菌の菌株を分類するために使用されてきたｒｅｃＡ型と一致する異なる分岐群にクラスタ化されることを示す。ゲノムの１６Ｓリボタイプは、かなりの程度で系統の関係を表す。樹の一方の端部では、分岐群ＩＡ−２およびＩＢ−１がざ瘡内で富化されたリボタイプから主に成り、樹の他方の端部では、分岐群ＩＩ内のＲＴ６が健康な対象において主に見られた。１０００個の複製を伴うブートストラップ試験が実施された。分岐間の距離は、コアゲノムにおけるＳＮＰに基づいて算出され、各ゲノムの非コア領域を表すものではない。拡大された分岐は、図８に示すように１６Ｓリボタイプに従って着色された。 ７１個のざ瘡菌の菌株のゲノム比較を提供し、ＲＴ４およびＲＴ５のゲノムが他のものと異なっていることを示す。染色体上でコードされた予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全てが示される。各行は、リボタイプに従って着色されたざ瘡菌のゲノムを表す。行は、ざ瘡菌のコアゲノム中のＳＮＰに基づいて算出される系統発生によって順序付けられる。トポロジのみが示される。列は、ゲノム中のＯＲＦを表し、完成したゲノムＨＬ０９６ＰＡ１に沿ってそれらの位置によって順序付けられる。主にＲＴ４とＲＴ５菌株に固有である遺伝子座１および２、ならびに主にＲＴ８菌株に固有である遺伝子座４を図中に見ることができる。 推定上のプラスミドを保有する全てのゲノムにおける染色体とプラスミド領域との間の配列カバレッジ比較を提供し、これはプラスミドのコピー数が、ゲノム当たり１個〜３個の範囲であることを示す。Ｘ軸は、プラスミド配列が後に続く、完成したゲノムＨＬ０９６ＰＡ１の座標に基づいて染色体に沿ったＤＮＡ配列を表す。Ｙ軸は、配列カバレッジを表す。ゲノムは、（陰性対照としての）ＨＬ０５６ＰＡ１以外は、図８と同じ順番であった。 定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、各ゲノムにおけるプラスミドのコピー数が配列カバレッジ比較から予測されるように１個〜３個であることを確認したことを反映している。ＰａｋおよびＲｅｃＡは、染色体上に位置するハウスキーピング遺伝子であり、ＴａｄＡは、プラスミド上に位置するＴａｄ遺伝子座における保存された遺伝子である。ＴａｄＡとＰａｋとの間のコピー数の比率は、ゲノム中において１〜３の範囲であるが、一方、ＲｅｃＡとＰａｋとの間の比率は、全てのゲノム中において１である。ＨＬ０７８ＰＡ１およびＨＬ０４５ＰＡ１におけるＴａｄＡ遺伝子は、ｑＰＣＲの後期サイクルで増幅した。従来のＰＣＲは、これらの２個の菌株にＴａｄＡの増幅を確認したが、一方、プラスミドを有さない他の菌株は増幅を示さなかった（データには示さず）。 新たなゲノム配列（Ｎ）に加えて発見された新しい遺伝子（ｎ）についてべき乗則回帰を示す。円は、２００個のシミュレーションのｎ個の中央値である。エラーバーは、２００個のシミュレーションについて標準偏差を示す。 新たなゲノム配列（Ｎ）に加えて蓄積された全ての遺伝子（ｎ）についてべき乗則回帰を示す。円は、２００個のシミュレーションのｎ個の中央値である。エラーバーは、２００個のシミュレーションについて標準偏差を示す。 ｒｅｃＡのＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ型に特異的なコア領域における１２３，２２３個のＳＮＰの割合を示す。 コア領域（２．２０Ｍｂ）において１２３，２２３個のＳＮＰに基づいて構築された８２個のざ瘡菌の菌株の系統樹を示す。菌株間の距離は、縮尺バーに従って着色された全てのＳＮＰ部位でのヌクレオチド置換率として算出された。同じ系統に属する同じ個人（ＳＳＩ）の菌株が「＋」で印付けされた。 ＩＡ（Ａ）、ＩＢ（Ｂ）、およびＩＩ（Ｃ）型菌株のパンゲノムを示す。円は、２００個のシミュレーションのｎ個の中央値である。エラーバーは、２００個のシミュレーションについて標準偏差である。 コア領域中のＳＮＰの分布を示す。図１８ａは、コア領域中の遺伝子のＳＮＰ頻度（多型部位の割合）を示す。図１８ｂは、２個を超える標準偏差（ＳＤ）を伴うより高いＳＮＰ頻度を有した遺伝子についてＫＳ統計を提供する。図１８ｃは、コア領域における遺伝子の非同義的突然変異頻度を反映している。図１８ｄは、２個を超える標準偏差を伴うより高い非同義的な突然変異頻度を有した遺伝子についてＫＳ統計を提供する。 コア領域中のＳＮＰの分布を示す。図１８ａは、コア領域中の遺伝子のＳＮＰ頻度（多型部位の割合）を示す。図１８ｂは、２個を超える標準偏差（ＳＤ）を伴うより高いＳＮＰ頻度を有した遺伝子についてＫＳ統計を提供する。図１８ｃは、コア領域における遺伝子の非同義的突然変異頻度を反映している。図１８ｄは、２個を超える標準偏差を伴うより高い非同義的な突然変異頻度を有した遺伝子についてＫＳ統計を提供する。 同じ系統（図１９ａ）および異なる系統（図１９ｂ）におけるざ瘡菌の菌株間の距離を提供する。 各系統内のざ瘡菌の菌株が、固有の非コアゲノム領域を共有することを反映している。行は８２個のざ瘡菌ゲノムを表し、列は５００ｂｐより長い３１４個の非コア領域を表す。ゲノムおよび非コア領域はそれぞれ、類似性に基づいてクラスタ化された。プロットされた各ブロックの幅は、各非コア領域のゲノムの長さに比例しない。非コア領域の存在は、黄色に着色され、不在は、青色に着色されている。ＲＴおよび分岐群に使用されるカラースキームは、図１６と同じである。 ＲＴ２およびＲＴ６菌株におけるＣＲＩＳＰＲスペーサ配列を提供する。４８個のＣＲＩＳＰＲスペーサ配列の合計が、１１個のざ瘡菌ゲノムに見られ、そのうちの２９個が固有であった。いくつかのＣＲＩＳＰＲスペーサは、複数の菌株に見られた。例えば、スペーサ２（Ｓ２）は、ＨＬ０６０ＰＡ１およびＨＬ０８２ＰＡ２によって共有された。スペーサ１７（Ｓ１７）は、Ｊ１３９、ＡＴＣＣ１１８２８、ＨＬ１１０ＰＡ３、ＨＬ１１０ＰＡ４、ＨＬ０４２ＰＡ３、およびＨＬ２０２ＰＡ１によって共有された。スペーサ１８（Ｓ１８）は、Ｊ１３９、ＡＴＣＣ１１８２８、ＨＬ１１０ＰＡ３、ＨＬ１１０ＰＡ４、およびＨＬ２０２ＰＡ１によって共有された。この樹は、コア領域内の１２３，２２３個のＳＮＰに基づいて構築された図１６のものであった。 ざ瘡菌ゲノム中の推定上のリパーゼ活性を有する遺伝子を反映している。図２２ａは、ＫＰＡ１７１２０２およびＳＫ１３７ゲノムの注釈に基づいて、推定上のリパーゼ活性を有する１３個の遺伝子の概要を示す。図２２ｂは、ＯＲＦ ＨＭＰＲＥＦ０６７５−４８５６において観察された挿入／削除およびフレームシフトを反映している。 ざ瘡菌ゲノム中の推定上のリパーゼ活性を有する遺伝子を反映している。図２２ａは、ＫＰＡ１７１２０２およびＳＫ１３７ゲノムの注釈に基づいて、推定上のリパーゼ活性を有する１３個の遺伝子の概要を示す。図２２ｂは、ＯＲＦ ＨＭＰＲＥＦ０６７５−４８５６において観察された挿入／削除およびフレームシフトを反映している。 遺伝子座１、２、および３を標的化する多重ＰＣＲを使用したざ瘡菌の菌株と関連するざ瘡の迅速な検出を反映している。 ハウスキーピング遺伝子Ｐａｋと比較して、遺伝子座１および遺伝子座２の相対的存在量を示す。 ざ瘡菌遺伝子座１、遺伝子座３、Ｐａｋの増幅を示す臨床試料＃１（図２５Ａ）、＃２（図２５Ｂ）についてのｑＰＣＲの三重増幅プロットを反映している。 ３２個のファージの進化的関係／系統樹を示す。 ざ瘡の診断および治療の個人化のための本発明の方法の図を示す。 ざ瘡の診断および治療の個人化のための本発明の方法のフローチャートを示す。 ざ瘡菌のファージゲノムおよび注釈を提供する。１５個全てのファージのゲノム組織が示される。以前に発表されたゲノムにおける平行矢印は、新たに注釈付きの提案されたＯＲＦを表す。イタリック体の凡例の項目は、新たに注釈を付けられたまたは改訂されたＯＲＦを参照する。 コア領域における６，１４８個のＳＮＰに基づいて構築された、２９個の配列決定されたファージのゲノムの系統樹を提供する。（２００個の再サンプリングに基づく）８０個未満のブートストラップ値を有する分岐が、崩壊した。 ゲノム配列に基づく系統樹を提供する。図３１ａは、１６個全てのファージの全体のゲノム配列に基づいて構築された系統樹を提供する。ＰＨＬ１１２Ｎ００を除いて、ファージ間の系統発生関係は、図３０に示すコア領域を使用するものと同じままである。図３１ｂは、ファージ間に高度に保存されているゲノムの左腕のみを使用して構築された系統樹を示す。図３１ｓは、右腕のコーディング領域のみを使用して構築された系統樹を示す。図３０のＩおよびＩＩ群はまた、樹に示されている。（５，０００個の再サンプリングに基づく）８０個未満のブートストラップ値を有する分岐が、崩壊した。 Ｌｏｏｄらの配列を含む、アミダーゼのヌクレオチド配列（図３２ａ）および全てのファージの頭部タンパク質（図３２ｂ）に基づいて構築された系統樹を示す。以前の研究からファージ間の系統発生関係は、これらの樹で同じままである。ＩおよびＩＩ群は、図３０に示すゲノムと同じままである。 密接に関連するファージのＩおよびＩＩ群のゲノムのために生成された複数の位置合わせを反映している。ヌクレオチド変異の部位は、各群のメンバーにマッピングされる。ゲノムの各５０ヌクレオチドのウィンドウでの変数部位の密度は、赤で表示され、１００％密度は、ウィンドウ内の５０個の部位全てが群のメンバーの間で様々であることを示す。図３３ａは、ＰＨＬ０１０Ｍ０４ゲノムにマッピングされたＩ群のファージ（ＰＨＬ０１０Ｍ０４、ＰＨＬ０６６Ｍ０４、ＰＨＬ０７３Ｍ０２）間の変化を提供する。図３３ｂは、ＰＨＬ１１５Ｍ０２ゲノムにマッピングされたＩＩ群のファージ（ＰＨＬ１１５Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｍ０１、ＰＨＬ０８５Ｎ００、ＰＨＬ０３７Ｍ０２）間の変化を提供する。灰色の矢印は、各ゲノム中のＯＲＦを表す。 ざ瘡菌ファージの宿主範囲および特異性を示す。６６個のざ瘡菌の菌株、３個のフメルシイ菌の菌株、および１５個の新たに配列決定されたファージに対する１個の顆粒菌の菌株の罹病性／耐性が示されている。上および左の樹状図は、ファージおよびざ瘡菌の菌株のそれぞれの系統樹を表す（トポロジのみが示される）。「Ｓ」は、試験されたプロピオニバクテリウム菌株が試験されたファージに罹病性であったことを示す。赤の数字は、ざ瘡菌の菌株ＡＴＣＣ６９１９に相対的なファージに対するプロピオニバクテリア菌株の耐性の増加倍率を表す。 ファージに対するざ瘡菌の耐性と、一致したＣＲＩＳＰＲスペーサの存在との相関関係を提供する。各セルの着色された画素は、（行に示される）各ざ瘡菌の菌株でコードされたＣＲＩＳＰＲスペーサを表す。各赤色の画素は、このスペーサが（列に示される）対応するファージ内に正確なプロトスペーサの一致を有することを意味する。各オレンジ色の画素は、このスペーサが、対応するファージ内に部分的に一致するプロトスペーサ（１〜２の不一致）を有することを意味する。灰色の画素は、一致したプロトスペーサが全くないことを意味する。ピンクの細胞は、ファージに対する細菌の耐性を示す。 １５個の配列決定されたファージの各々が、ざ瘡菌の菌株内で特定された８個のＣＲＩＳＰＲスペーサアレイ全てに位置合わせされ、完全一致（赤）、または２個までの不一致（オレンジ）を有する各ファージのゲノム内でプロトスペーサ配列を特定することを反映している。プラスおよびマイナス鎖プロトスペーサはそれぞれ、ゲノムの上および下に示される。 プロトスペーサおよびＰＡＭ中の配列保存を反映している。菌株ＨＬ０４２ＰＡ３中でコードされたＣＲＩＳＰＲスペーサおよびそれらと関連するＰＡＭ配列に厳密に一致するプロトスペーサが示される。ＨＬ０４２ＰＡ３が耐性である、ファージのプロトスペーサのモチーフ間の配列保存が（Ａ）に示され、罹病性のものが（Ｂ）に示される。
一実施形態では、本発明は、個人がざ瘡を有するかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、個人から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、前述の試料における１６ＳリボソームＤＮＡを増幅することと、前述の増幅されたＤＮＡ生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の１０個の主要なリボタイプ（ＲＴ）、ＲＴ１〜ＲＴ１０（配列番号１〜１０）のうちの１個以上に基づいた個人のＤＮＡをタイプ分類することとを含み、前述のタイプ分類が、個人がＲＴ１〜ＲＴ１０のうちの１個以上を有するかどうかを判定することによって生じ、前記個人がＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を有する場合、個人はざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の個人がＲＴ４（配列番号４）、ＲＴ５（配列番号５）、またはＲＴ８（配列番号８）を有する場合、前述の個人がざ瘡を有すると診断され得る。
別の実施形態では、本発明は、異なる種類のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、前述の試料における１６ＳリボソームＤＮＡを増幅することと、前述の増幅されたＤＮＡ生成物を配列決定することと、ざ瘡菌の菌株の５個の主要なマイクロバイオーム型のうちの１個以上に基づいて対象のＤＮＡをタイプ分類することとを含み、前述の対象がマイクロバイオームＩＶまたはＶにタイプ分類された場合、前述の対象はざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、１個以上のプライマーセットを使用して前述のＤＮＡを増幅することとを含み、前述の増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在について解析され、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、前述の増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９９％の相同性を有する配列の存在について解析され得、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９９％の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。別の例として、前述の増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個の存在について解析され得、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個の存在がある場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。
別の実施形態では、本発明は、迅速にざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、１個以上のプライマーセットを使用して前述のＤＮＡを増幅することと、１個以上のプローブを使用して前述の増幅されたＤＮＡを検出することと、遺伝子座１（配列番号２９および８２〜９７のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、遺伝子座２（配列番号３０および９８〜１８６のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、遺伝子座３（配列番号３１および１８７〜４２３のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、および／または遺伝子座４（配列番号３２および４２４〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）の存在について、前述のプローブ信号を解析することとを含み、遺伝子座１〜４のうちの１個以上が存在する場合、前述の対象がざ瘡を有すると診断される。例えば、この信号は、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性に基づいて、遺伝子座１、遺伝子座２、遺伝子座３、および／または遺伝子座４の存在について解析され得る。
前述の方法において、前述のプライマーセットのプライマーが、（遺伝子座１について）配列番号１１、１２、１７、および１８、（遺伝子座２について）配列番号１３、１４、２０、および２１、（遺伝子座３について）配列番号１５、１６、２３、および２４、（遺伝子座４について）配列番号２６および２７からなる群から選択され得る。前述の方法において、前述のプローブが、（遺伝子座１について）配列番号１９、（遺伝子座２について）配列番号２２、（遺伝子座３について）配列番号２５、（遺伝子座４について）配列番号２８であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および／または治療のためのワクチンを提供し、前述の菌株が、ＲＴ４菌株、ＲＴ５菌株、ＲＴ７菌株、ＲＴ８菌株、ＲＴ９菌株、またはＲＴ１０菌株である。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析に基づき、前述の対象に特異的であることが特定された、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前述の菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および／または治療のためのワクチンを提供する。
ワクチンに関して、前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、ざ瘡菌の菌株について特定された固有のゲノムの遺伝子座、領域、または配列のうちの少なくとも１個に特異的であり得る。前述の熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、遺伝子座１（配列番号２９および８２〜９７）、遺伝子座２（配列番号３０および９８〜１８６）、遺伝子座３（３１および１８７〜４２３）、および遺伝子座４（３２および４２４〜４３４）のうちの少なくとも１個に特異的であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡の個人化された治療のための方法を提供し、該方法は、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株を判定することと、少なくとも１個の検出されたざ瘡菌の菌株を対象とした活性成分を用いて前述の対象を治療することとを含み、前述の活性成分が、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化する薬剤を含み、前述の標的化薬剤が、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して特異的なゲノム要素を標的化する、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、およびそれらの組み合わせを含む。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、ざ瘡菌の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡに基づいて健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも１個のざ瘡菌の菌株を含む有効量のプロバイオティクスを投与することを含む。前述の菌株は、ＲＴ６菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性、例えば、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌によって生成された有効量の代謝産物を投与することを含み、前述の代謝産物は、細菌培養上清、細胞溶解物、タンパク質、核酸、脂質、および他の細菌分子からなる群から選択される。前述の菌株は、ＲＴ６菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性、例えば、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、対象のざ瘡を治療するための方法を提供し、該方法は、前述の対象がそれぞれ、ＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を有すると判定されたとき、ＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む。上に記載された方法は、薬剤の投与前に実施され得る。前述の薬剤が、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、またはそれらの組み合わせであり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも１個のざ瘡菌の菌株を含む組成物を提供する。前述の菌株は、ＲＴ６菌株であり得る。前述の菌株は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性、例えば、少なくとも９９％の相同性または１００％の相同性を有し得る。
更に別の実施形態では、本発明は、ＩＢ−３系のざ瘡を診断するための方法を提供し、該方法は、対象から皮膚試料を得ることと、前述の試料から細菌ＤＮＡを単離することと、１個以上のプライマーセットを使用して前述のＤＮＡを増幅することと、配列番号５５〜８１のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在について、前述の増幅されたＤＮＡを解析することとを含み、配列番号５５〜８１のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在がある場合、前述の対象がＩＢ−３系のざ瘡を有すると診断される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象に影響を与えているざ瘡の菌株（複数可）を判定することと、前述の菌株（複数可）を特異的に対象とした有効量の少なくとも１個のファージを前述の対象に投与することとを含むざ瘡の個人化された治療のための方法を提供する。例えば、前述の対象は、ＲＴ４菌株、ＲＴ５菌株、ＲＴ７菌株、ＲＴ８菌株、ＲＴ９菌株、および／またはＲＴ１０菌株を対象としたファージで治療され得る。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、ＩＢ−３菌株を伴うマイクロバイオームＩ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）およびＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＩ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、およびＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＩＩ型または優勢なＲＴ８のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＶ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＶ型のざ瘡を患う前述の個人を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、個人に有効量のファージを投与することを含む、プロピオニバクテリウムフメルシイ（ｈｕｍｅｒｕｓｉｉ）に関連した病気を治療するための方法を提供し、前述のファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、およびＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号１１〜１８、２０、２１、２３、２４、２６、および２７からなる群から選択される少なくとも１個のプライマー、および使用説明書を含む。
更に別の実施形態では、本発明は、対象におけるざ瘡を診断するためのキットを提供し、前述のキットは、配列番号１１〜１８、２０、２１、２３、２４、２６、および２７からなる群から選択される少なくとも１個のプライマー、配列番号１９、２２、２５、および２８からなる群から選択される少なくとも１個のプローブ、および使用説明書を含む。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列は、単量体および二量体の形態の二本鎖または一本鎖のＤＮＡと、前述のＤＮＡの転写生成物との両方を意味すると理解されるであろう。
相同のヌクレオチド配列は、少なくとも８０％、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の本発明に従うヌクレオチド配列の塩基を伴う少なくともある割合の同一性を有するヌクレオチド配列を意味する。この割合は、統計的であり、２個のヌクレオチド配列間の違いは、無作為にまたはその長さ全体にわたって判定され得る。
本発明は、本発明に従うヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含み、その配列が断片によって表されるポリペプチドを含む。本明細書において、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は同義的である。
ポリペプチドは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を調製することを可能にし、それらは、それらがポリペプチドを特異的に認識することを特徴としている。本発明は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片、またはキメラ抗体に関し、それらは、ポリペプチドを特異的に認識することができることを特徴とする。
本発明に従うワクチン組成物において使用されるポリペプチドは、例えば、Ｔ細胞を刺激し、例えば、それらの増殖またはインターロイキンの分泌によって翻訳され、前述のポリペプチドを対象とする抗体の生成をもたらす前述のポリペプチドの能力に応じて、当業者に既知の技術によって選択され得る。ワクチンの組み合わせは、好ましくは、薬学的に許容されるビヒクル、および必要な場合は、適切な免疫の１個以上のアジュバントと組み合わされるであろう。薬学的に許容されるビヒクルは、二次反応を引き起こさず、例えば、活性化合物の投与の円滑化、体内でのその生存期間および／もしくはその有効性の増加、溶液中のその溶解度の増大、またはその保全の改善を可能にする化合物または化合物の組み合わせを意味する。
出願人らは、ざ瘡が発生する人間の毛包脂腺単位（「毛穴」）にプロピオニバクテリウムざ瘡の１０個の主要な系統、および５個の主要なマイクロバイオーム型を特定した。ざ瘡菌の系統およびマイクロバイオーム型のいくつかは、ざ瘡患者において非常に富化され、いくつかは、健康な皮膚に関連している。ざ瘡と関連する系統に固有のものである線状プラスミドを含む各主要な系統の固有のゲノム構成要素は、特定されている。この情報は、例えば、以下の目的に使用される：（１）下流解析のために毛包脂腺単位から細菌ＤＮＡ／ＲＮＡを単離するための方法／キットのため、（２）影響を受けた対象のマイクロバイオーム型、および影響を受けた対象の毛穴内に存在するざ瘡菌の主要な菌株を迅速かつ正確に検出／診断し／特定する、（３）ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対するワクチンを開発する、（４）局所クリーム、溶液などの中の健康的な皮膚と関連する菌株を用いて、プロバイオティクスを開発する、（５）ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に固有の遺伝的要素および生物学的経路を標的化する、小分子、生物製剤、および抗体を含む薬剤を開発する、（６）ざ瘡を治療するためのバクテリオファージに基づく菌株に特異的な治療を開発する。
一旦ざ瘡に罹患した対象のマイクロバイオーム型が診断されると、以下に説明するいくつかの手法が、効果的な治療計画の策定に使用され得る。例えば、対象がマイクロバイオームＩＶまたはＶ型を有しているか、またはざ瘡菌ＲＴ１０菌株によって支配されている場合、これらの菌株が、抗生物質耐性であるため、抗生物質による治療が成功する可能性は低くなる。しかし、レチノイドなどの他の方法での治療が、依然として可能である。
本発明の一実施形態に従うと、対象がＲＴ４、ＲＴ５、およびＲＴ８を含む悪性のリボタイプを有する場合には、小分子、生物製剤、および抗体を含む標的特異的薬物がより効果的な治療であり得る。本発明の好ましい実施形態では、このような患者は、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に固有の遺伝的要素および生物学的経路を標的化する抗体で治療され得る。
本発明の別の実施形態に従うと、対象に影響を与えている優勢なざ瘡菌の菌株が、１組のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを保有しない場合、ファージ療法の追加の治療がより効果的であり得る。
本発明はまた、健康と関連する菌株の増殖を促進することにより、ざ瘡菌の菌株の相対的存在量のバランスを取るためのざ瘡治療のための代替治療戦略に関する。
本発明は、下流の遺伝子解析のための、影響を受けた対象の毛穴から細菌ＤＮＡ／ＲＮＡを単離するための方法およびキットに関する。より具体的には、本発明は、微小面皰の試料から細菌ゲノムのＤＮＡおよびＲＮＡを抽出するためのプロトコルに関する。本発明の特定の一実施形態では、Ｂｉｏｒｅ（登録商標）ディープクレンジングポアストリップが、対象から細菌をサンプリングするために使用され得る。ゲノムＤＮＡは、当該分野で既知の方法に従って抽出され得る。例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）は、ビードビータを用いて細胞／微小面皰を溶解することによって得られた上清からゲノムＤＮＡを抽出するために使用され得る市販のキットである。
本発明はまた、影響を受けた対象におけるマイクロバイオーム型の検出および／または診断のための迅速かつ正確な方法およびキットに関する。マイクロバイオームのタイプ分類／マイクロバイオームに特異的な治療は、１０個の主要なざ瘡菌の菌株系統、および全長１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定を使用した総合的なメタゲノム解析で見られた人間の毛包脂腺単位の５個の主要なマイクロバイオーム型に基づく。
実際に、試料は、以下の配列を有する１６Ｓ ｒＤＮＡの特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅された：２７ｆ−ＭＰ ５’ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’および１４９２ｒ−ＭＰ ５’−ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＹＧＡＣＴＴ−３’。任意に、ゲル精製後、１．４Ｋｂの製品が切除され、例えば、Ｑｕｉｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて更に精製される。精製された生成物は、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットを使用してＯｎｅＳｈｏｔ大腸菌細胞内にクローニングされる。配列決定は、ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（順方向）、ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ（逆方向）、およびＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ（９０７Ｒ）の配列で、サブセットの内部１６Ｓ ｒＤＮＡのプライマー９０７Ｒのために、ユニバーサルフォワード、ユニバーサルリバースで行われる。配列反応は、長い読み取り実行モジュールを用いて５０ｃｍのアレイ上でＡＢＩのＡＢＩ３７３０機上にロードされた。
ざ瘡菌の各系統は、固有のゲノムの遺伝子座、領域、および配列を有する。従って、特異的なプライマーは、各系統の存在または不在と、ＰＣＲ／ｑＰＣＲなどの当技術分野で既知の方法を使用した各系統の相対的な量とを検出するように系統特異的なゲノムの領域を標的化するように生成され得る。これは、試料の取得の数時間以内に起こる。出願人らの発明以前に、これは、培養に基づく方法を使用して多くの時間、多くの場合、数週間を必要とした。本発明の一実施形態に従って、影響を受けた対象は、これらの診断に基づいてマイクロバイオームの特異的な治療のためにグループ化される。
本発明の方法に従って、リボタイプ４および５の菌株の固有のゲノム遺伝子座１、２、および３は、ざ瘡と関連していることが示されている。遺伝子座１、２および３を標的化する特異的なプライマーを用いて、これらの遺伝子座を含有する系統は、これらの遺伝子座を欠く系統と区別することができる。加えて、ＰＣＲ／ｑＰＣＲ技術を用いて、各菌株の相対的存在量もまた、検出され得る。模擬群集の解析は、マイクロバイオーム７．５％以上の存在量における遺伝子座１、２、および３を有する分離株が、これらの技術を用いて検出され得ることを示す。ｑＰＣＲの感度を考慮すると、少数のＤＮＡのコピーより低い存在量レベルもまた、検出され得る。
ざ瘡菌の熱失活は、ざ瘡菌に基づくワクチンを開発する効果的な手段であり得ることが、以前に報告されている。Ｔ．Ｎａｋａｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，１２８（１０）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２４５１−２４５７（Ｏｃｔ．２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、ワクチンが、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して開発されている。本発明の別の態様では、個人化されたワクチンが、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して開発されている。本発明の更に別の態様では、ワクチンが、不活性なざ瘡菌の菌株または熱弱毒化されたタンパク質を使用してざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して開発されている。ワクチンとして使用するのに好適な菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定に基づいて特定され得る、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株の系統、および健康な皮膚と関連する菌株ではない、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株を特異的に標的化するように各系統についての固有のゲノム遺伝子座、領域、配列を特定する。
上で説明した方法に従って、リボタイプ４、５、７、８、９、および１０を有するざ瘡菌の菌株が、ざ瘡と非常に関連していることが発見された。本発明の一実施形態では、ワクチンは、これらの個別の菌株に対して別々にまたは組み合わせて惹起される。同様に、遺伝子座１、２、および３における遺伝子は、これらの遺伝子座がリボタイプ４および５に固有であり、利共生菌株には見られないため、ワクチン接種の標的であり得る。リボタイプ８に固有の遺伝子座４はまた、ワクチン療法のための潜在的標的として機能し得る。遺伝子座１、２、３、および４でコードされた遺伝子のリストは、表２に示される。
本発明はまた、医薬品、組成物、局所クリーム、溶液、または他の化粧品において、健康な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用して開発されたプロバイオティクスと関連する。プロバイオティクスは、過去において、局所クリームに使用されている。ＰＲＯＢＩＯＴＩＣ ＬＡＢ（商標）は、細菌の１４個の特定の菌株の混合物が嚢胞性ざ瘡の治療に使用されたと発表した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ−ｌａｂ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔｕｓｐｒｏｂｉｏｔｉｃｌａｂ．ｈｔｍｌ）。プロバイオティックスキンケア／ＤＥＲＭＢＩＯＴＩＸは、皮膚の老化防止効果を狙ったと主張される製品ライン、プロバイオティクスコラーゲンコンプレックス（ＰＣ３）を有する。しかし、これは、ざ瘡治療を標的化していない。プロバイオティクスコラーゲン複合体（ＰＣ３）は、効果的に外部要因によって引き起こされる過剰陰性細菌と闘い、根絶するために必要な陽性細菌を皮膚に注入する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｒｍｂｉｏｔｉｘ．ｃｏｍ）。しかし、本発明以前には、健康な／正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用したざ瘡治療のための、報告されたスキンプロバイオティクス製品が存在しなかった。本発明の一実施形態では、スキンプロバイオティクスが、健康な／正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用したざ瘡治療のために開発された。本発明の別の態様では、スキンプロバイオティクスが、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定に基づいて健康な／正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株を使用したざ瘡治療のために開発された。
本発明の特定の一実施形態では、ざ瘡菌のおよび健康な皮膚と関連するＲＴ６系統は、局所製品として使用されている。本発明の更に別の実施形態では、ざ瘡菌のＲＴ６系統は、ざ瘡に関連する菌株に対抗するために、人間の皮膚にこの分離株を接種することによって使用される。別の実施形態では、タンパク質、核酸、脂質、および他の代謝産物、培養の上清、および／またはこれらの菌株の細胞溶解物を含む分子は、プロバイオティクスで使用され得る。
本発明はまた、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株を標的化する薬剤に関する。これは、１６Ｓ ｒＤＮＡのメタゲノム解析と組み合わせたざ瘡菌の複数のゲノムの比較に基づき、それによって、ある種の菌株およびざ瘡と関連するゲノムの変化を特定する。ざ瘡と関連するざ瘡菌を標的化するように意図された薬剤は、カスタム設計された小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、生物製剤、およびざ瘡と関連する菌株に特異的なゲノムの要素を標的化する抗体を含む。アンチセンスＲＮＡ、抗体、または小分子は、遺伝子座１、２、３、および４を標的化するように設計することができる。リボタイプ４、５、および１０を有する菌株は、抗生物質耐性である。従って、リボタイプ４、５、および１０を標的化する新しい抗生物質が当技術分野において必要である。
本発明はまた、ざ瘡菌のある種の菌株に特異的なファージからなるざ瘡を用いた影響を受けた対象のための個人化されたファージ療法に関する。一部の企業は、Ｐｈａｇｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣｅｎｔｅｒＴＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｇｅｔｈｅｒａｐｙｃｅｎｔｅｒ．ｃｏｍ／ｐｉｉ／ＰａｔｉｅｎｔＳｅｒｖｌｅｔ？ｃｏｍｍａｎｄ＝ｓｔａｔｉｃ＿ｈｏｍｅ）などのざ瘡患者のためのファージ療法を提供する。しかし、このような企業は、治療のために使用されたファージの細菌宿主特異性についての情報を提供しない。ざ瘡菌は利共生であり、いくつかの菌株は宿主に対する防御の役割を果たしている。本発明の一実施形態では、個人化されたファージ療法は、ざ瘡の影響を受けた対象のための保護的役割を欠くことが示されているざ瘡菌の菌株を標的化する選択されたファージを含む。本発明の更に別の実施形態では、個人化されたファージ療法は、健康と関連する菌株を変化させずに、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化するファージのそれらの細菌宿主の特異性に応じて開発され得る。加えて、影響を受けた対象のざ瘡菌系統の構造を特定し、ファージ感染またはプラスミド接合に対する耐性を予測するようにその構造を使用して標的の特異的なファージ療法をより良くすることが可能である。例えば、ざ瘡菌系統ＲＴ２およびＲＴ６は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの構造を有し、それらが、ある種のファージ感染およびプラスミド接合に対する耐性を有することを示す。表５は、特異的なざ瘡菌ファージに対する特異的なざ瘡菌の菌株の感度および耐性を示す。
本発明は、以下に図示される実施例においてより詳細に記載されている。実施例は、本発明の選択された実施形態のみを表し得るが、以下の実施例は、例示に過ぎず、決してこれらに限定されない。
実施例１−ざ瘡と関連する人間の皮膚のマイクロバイオームにおけるプロピオニバクテリウムざ瘡の菌株集団の解析
人間の皮膚のマイクロバイオームは、皮膚の健康および疾患に重要な役割を果たしている。しかし、出願の発明以前は、菌株レベルでの細菌集団の構造および多様性があまり理解されていなかった。発明者らは、鼻の毛包脂腺単位をサンプリングすることによって、４９人のざ瘡患者と５２人の健康な個人との間で、菌株レベルおよびプロピオニバクテリウムざ瘡のゲノムレベルでの肌のマイクロバイオーム、優勢な皮膚の利共生を比較した。メタゲノム解析は、ざ瘡菌の相対的存在量は類似している一方で、菌株集団構造が２個のコホートにおいて大幅に異なるということを実証した。ある種の菌株は、ざ瘡と非常に関連し、他の菌株は、健康な皮膚内で富化されていた。６６個の新規のざ瘡菌の菌株を配列決定すること、および７１個のざ瘡菌のゲノムを比較することによって、本発明者らは、ざ瘡または健康と関連する様々なざ瘡菌の菌株の潜在的な遺伝的決定を特定した。この解析は、取得されたＤＮＡ配列および細菌免疫要素が、ざ瘡菌の菌株のビルレンス特性を判定する際に役割を果たし得、いくつかは、治療的介入のための標的となり得ることを示す。この研究は、人間の疾患の病原を説明する利共生菌株集団の以前に報告されていないパラダイムを実証する。それは、健康および疾患における利共生の役割を定義するために人間のマイクロバイオームの菌株レベルの解析の重要性を強調している。
背景技術
菌株レベルでの人間の微生物叢の多様性ならびに人間の健康および疾患との関連は不明な点が多い。しかし、多くの研究は、微生物関連の人間の疾患は、多くの場合、一定の種の菌株ではなく、病原である全ての種によって引き起こされることを示した。例えば、ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｌｅｏ，２００９；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈａｎｓｒａ ａｎｄ Ｓｈｉｎｋａｉ）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７（Ｃｈａｓｅ−Ｔｏｐｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）が挙げられる。（一般的にざ瘡と呼ばれる）尋常性ざ瘡は、最高で１０代の８５％および大人の１１％の有病率を伴う最も一般的な皮膚疾患の１つである（Ｗｈｉｔｅ，１９９８）。ざ瘡の病因および病原は未だ不明であるが、微生物の関与はざ瘡の発症に寄与する主な機構の１つと考えられている（Ｂｏｊａｒ ａｎｄ Ｈｏｌｌａｎｄ，２００４；Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，２００２）。具体的には、プロピオニバクテリウムざ瘡が重要な病原要因であると仮定されてきた（Ｗｅｂｓｔｅｒ，１９９５）。ざ瘡菌を標的化する抗生物質療法は、３０年以上にわたり主力の治療である（Ｌｅｙｄｅｎ，２００１）。しかし、数十年の研究にも関わらず、ざ瘡菌が、正常な皮膚の叢の主要な利共生でありながら、ざ瘡の病原にどのように寄与するかに関しては不明のままである（Ｂｅｋ−Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｆｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｇｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ざ瘡菌が、利共生細菌として人間の皮膚を保護するか、またはざ瘡内の病原要因として機能するか、またはその両方かは、未解明のままである。
このように、出願人らは、メタゲノミクスおよびゲノム配列決定の組み合わせを使用して４９人のざ瘡患者および５２人の正常な個人における菌株レベルおよびゲノムレベルで皮膚のマイクロバイオームを比較した。最初に、各試料について、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡの）が増幅され、約４００個のクローンが配列決定され、３１１個のほぼ完全長の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の平均が解析された。ざ瘡菌の菌株の集団構造が、各試料において判定された。第２に、各ざ瘡菌の菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡのメタゲノムのデータに基づいて、ざ瘡患者においてその有病率を算出することにより、「ざ瘡指数」が割り当てられた。ざ瘡患者群と関連するざ瘡菌の菌株、ならびに正常な皮膚を有する個人において富化された菌株が特定された。このメタゲノム手法は、疾患の関連を判定することにおいて従来の手法とは根本的に異なり、それは、菌株の単離および培養における偏りおよび選択を避けることにより、従来の方法よりもより強力でかつより偏りが少ない。最後に、６６個の新規のざ瘡菌の菌株が配列決定され、皮膚の微生物叢中に見られるざ瘡菌の主要な系統をカバーする７１個のざ瘡菌のゲノムが比較された。この主要な皮膚利共生の皮膚マイクロバイオームおよびゲノム配列決定のメタゲノム研究を組み合わせることによって、出願人らの研究では、ざ瘡の病原内での細菌の遺伝的決定の洞察を提供し、健康および疾患における利共生の役割を理解するために人間のマイクロバイオームの菌株レベル解析の重要性を強調している。
結果
ざ瘡菌は、毛包脂腺単位を支配する
出願人らは、４９人のざ瘡患者および正常な皮膚を有する５２人の個人から収集された鼻上の毛包脂腺単位（「毛穴」）のマイクロバイオームを特徴付けた。ほぼ完全長の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、菌株レベルでざ瘡菌を解析することを許可したサンガー法を用いて取得された。品質のフィルタリングの後、最終的なデータセットは、位置２９から位置１４８３の範囲の３１，４６１個の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含有した。配列の２７，３５８個は、９９％を超える同一性を有するざ瘡菌に一致した。データは、ざ瘡菌が、クローンの８７％を占める毛包脂腺単位の微生物叢を支配することを実証した（図１）。毛包脂腺単位中の他の一般的に見られる種は、表皮ブドウ球菌、プロピオニバクテリウムフメルシイおよびプロピオニバクテリウム顆粒を含み、各々が、総クローンの１％〜２．３％を表す。４２属および６門に属する５３６種のレベル操作分類単位の合計（ＳＬＯＴＵ）が、試料中で特定された（表Ｓ１）。
ＰＣＲの増幅に起因し、かつ異なる種間の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子コピーの不均一な数に起因する潜在的な偏りを避けるために、全てのＤＮＡのメタゲノムショットガン配列決定は、２２個の追加の正常な個人の単位試料が実施されるまで、毛包脂腺からプールされる。微生物種は、ゲノムを参照するようにメタゲノムの配列をマッピングすることにより特定された。結果では、ざ瘡菌が最も豊富な種（８９％）であることが確認された（図１）。これは、１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定（８７％）から取得された結果と一致している。
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のために、位置２７〜１４９２は、ＰＣＲ増幅された。しかし、配列を解析するとき、位置２９〜１４８３のみが研究されている。位置の番号付けは、命名法の大腸菌システムに基づいている。このように、２９〜１４８３の間の配列は、リボタイプを判定するために重要である（１０個のみではなく、多くのリボタイプがある）。上位１０位のリボタイプについては、１６Ａ ｒＲＮＡの位置５２９〜１３３６の間の配列が十分である。
ざ瘡菌内の異なるざ瘡菌の菌株の集団
ざ瘡患者および正常な個人を比較するとき、ざ瘡菌の相対的存在量の統計的に有意差は認められなかった。その後、広範囲にざ瘡菌１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を解析することにより、ざ瘡菌の菌株レベルでの違いがあったかが検査された。本明細書において、１６Ｓ ｒＤＮＡの対立遺伝子型として各固有の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、リボタイプ（ＲＴ）と呼ばれる。最も豊富なざ瘡菌の配列は、リボタイプ１（ＲＴ１）（配列番号１）として定義された。他の全ての定義されたリボタイプは、ＲＴ１に対して９９％以上の配列同一性を有する。より高い分類学的レベルで見られる分布（Ｂｉｋら）と同様に、菌株レベルで、少数のリボタイプが、相当数の希少なリボタイプを有する試料において非常に豊富であった（図２）。配列クロマトグラムの慎重な検査および配列の手動補正の後、合計１１，００９個のリボタイプが、ざ瘡菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に割り当てられた。小さなリボタイプのほとんどは、シングルトンであった。平均して、各個人は、３個以上のクローンを有する３±２ざ瘡菌のリボタイプを保有した。下記に説明するゲノム配列に基づいて、全ての配列決定されたざ瘡菌の菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡの遺伝子の３個の同一コピー（下記の注を参照）を有する。これは、比較される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づいて、個人におけるざ瘡菌の菌株集団を可能にした。６０個以上のクローンを有する、複数の対象に見られる上位１０位の主要なリボタイプが表１に示される。
上位１０位のリボタイプの解析は、疾患特異的なおよび健康特異的な関連の両方を示した。３個の最も豊富なリボタイプ（ＲＴ１、ＲＴ２、およびＲＴ３）は、ざ瘡および正常な個人の間にかなり均等に分布した。しかし、次の７個の主要なリボタイプは、その分布に大幅な偏りがあった（表１）。リボタイプ４、５、７、８、９、および１０は、ざ瘡内に統計的に大幅に富化されたこれらの６個のうちの４個を有するざ瘡患者に主に見られた（ｐ＜０．０５、ウィルコクソン検定）。リボタイプ４、５、および１０は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列内にヌクレオチド置換Ｇ１０５８Ｃを含有し、これは、テトラサイクリンに増大した耐性を付与することが以前示された（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。しかし、これらのリボタイプを保有する本研究のわずかな割合の対象のみが、抗生物質で治療され（図３）、従って、ざ瘡群内におけるこれらの３個のリボタイプの富化は、抗生物質治療と相関していなかった。これは、抗生物質の以前の使用が抗生物質耐性菌株の存在と常に関連していなかったことと、以前に抗生物質で治療されなかった何人かの患者が抗生物質に対して耐性を既に保有していることとを示した以前の研究と一致している（Ｃｏａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。１個のリボタイプＲＴ６は、わずか１１個の対象において検出されたに過ぎないが、正常な皮膚に強く関連していた（ｐ＝０．０２５、ウィルコクソン検定）（表１）。正常群におけるその相対的存在量は、Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＭＰ）の健康的なコホートのデータに見られるものと同様であった（図３を参照されたい）。陽性の対象の割合（１１／５２）も同様であった。１４個のＨＭＰ対象うちの３個は、ＲＴ６が前鼻孔に見られ、１個の追加の対象は、左側の耳介後方の折り目にＲＴ６を有していた。
上位１０位のリボタイプの分布に基づいて、いくつかの異なる試験を用いた統計解析が、ざ瘡と正常な皮膚（図４）との間にざ瘡菌の集団構造において有意差を示した。これは、ざ瘡試料および正常な皮膚試料が、それぞれ４４％および２０％の変化を説明する、主に主要な座標１および２（図４）によって分離された主要な座標解析と一致する。
異なる個人が類似のざ瘡菌の集団構造を共有するかを検査するために、試料は、上位１０位のリボタイプの相対的存在量に基づいてクラスタ化された。５個の主要なマイクロバイオーム型が、ざ瘡菌の菌株レベルで観察された（マイクロバイオームＩ〜Ｖ型）。ざ瘡菌ＲＴ４およびＲＴ５によって支配されているＩＶおよびＶ型はそれぞれ、主にざ瘡患者に見られた（図５および６）。同じ５個の主要なマイクロバイオーム型が、ＨＭＰデータおよびＧｒｉｃｅらのデータ（Ｇｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）で観察された（図７を参照されたい）。
７１個のざ瘡菌株のゲノム配列解析
上位１０位の最も豊富なリボタイプの全てが、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列において１個または２個のみのヌクレオチドの変化によってＲＴ１とは異なる（表１）。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列におけるこのような小さな変化が、ゲノムレベルでの系統および進化の歴史を反映しているかどうかを判定するために、主要なリボタイプ１、２、３、４、５、６、および８を表す６６個のざ瘡菌の分離株、ならびに２個の小さなリボタイプ１６および５３２が、ゲノムの配列決定のために選択された。これらの６６個の分離株のゲノムは、完全に配列決定され、５０倍以上のカバレッジの高品質のドラフトまたは完全なゲノムに対して組み立てられた。他の５個のざ瘡ゲノム、ＫＰＡ１７１２０２（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、Ｊ１６５、Ｊ１３９、ＳＫ１３７、およびＳＫ１８７は、公的に利用可能であり、解析に含められた。これらの７１個のざ瘡菌のゲノムから取得されたコアゲノムにおける９６，８８７個の固有の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の位置に基づいた系統樹が構築された。同じリボタイプを有するゲノムのほとんどは、共にクラスタ化した。樹は、１６Ｓ ｒＤＮＡリボタイプが、かなりの程度まで系統の関係を表し、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列が、主要なざ瘡菌系統を区別するために有用な分子マーカーであることを示す（図８および９）。
ざ瘡菌において検出された遺伝的要素
リボタイプによってグループ化された７１個のゲノム全ての間での比較ゲノム解析が実施された。解析は、ざ瘡と関連する菌株がざ瘡病原に寄与し得る遺伝的要素、および健康と関連する菌株が皮膚の健康を維持することに寄与し得る要素を明らかにした。具体的には、ざ瘡と強い関連を有するＲＴ４およびＲＴ５、ならびに正常な皮膚において富化されたことが見てとれたＲＴ６の固有のゲノム領域が、現在知られている。３個の異なる領域、遺伝子座１、２、および３は、系統樹中の分岐群ＩＡ−２に属する菌株においてほぼ排他的に見られた。分岐群ＩＡ−２は、ＲＴ４およびＲＴ５から主になる（図８および１０）。遺伝子座１および２は、染色体上に位置している。遺伝子座１は、プロファージと関連する遺伝子を含み、ゲノムアイランドであるように見える。遺伝子座２は、プラスミド組み込み部位を有し、プラスミド配列から誘導され得る。遺伝子座３は、大きな可動性遺伝要素、おそらくプラスミド上にあるように見える。プラスミドは、約５５Ｋｂの長さで、完成したゲノムＨＬ０９６ＰＡ１に従って逆方向末端反復をした。配列データは、プラスミドが線状で、おそらくファージに由来することを示唆している（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｉｌｌｙ（１９９３））。ＲＴ４およびＲＴ５の１５個のゲノムのうちの１個を除く全てが、代表されるプラスミドの遺伝子の少なくとも６０％を有し、それらの全ては、プラスミド中の逆方向末端反復に相同である領域を有し、それらが同一または類似の線状プラスミド（図８）を保有することを示唆している。ゲノム中のプラスミドのコピー数は、定量ＰＣＲによって確認されたゲノム配列決定カバレッジに基づき１個〜３個の範囲である（図１１および図１２）。
ざ瘡が富化されたＲＴ４およびＲＴ５菌株が、線状プラスミドおよびゲノムアイランドの２個の固有の遺伝子座を運ぶという事実は、これらのプラスミドおよび染色体の領域が、ざ瘡病原においてある役割を果たすことを示す。実際には、線状プラスミドは、他の生物におけるビルレンスにおいて役割を果たすことが示唆されている密着性（Ｔａｄ）遺伝子座をコードする（Ｋａｃｈｌａｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。完全なＴａｄ遺伝子座は、ＲＴ４およびＲＴ５の１５個のゲノムの１個を除く全てに見られ、時々他のリボタイプに見られるに過ぎない。加えて、遺伝子座２において、サグ遺伝子クラスタがコードされたが、これは、病原における溶血活性に寄与するように示された（Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｎｉｚｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。図６は、ＲＴ４およびＲＴ５にほぼ固有である遺伝子をまとめ、そのうちのいくつかは、他の生物におけるビルレンスにおいて重要な役割を果たしている。ＲＴ４およびＲＴ５中でコードされたこれらの遺伝子のいくつかは、ビルレンスを増加させる、人間宿主へのより強い粘着を促進する、または病原の宿主免疫応答を誘発する。
ゲノムの比較解析では、ＲＴ２およびＲＴ６の全てのゲノムが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）をコードすることが分かった。配列決定されたゲノムの中では、ＲＴ２およびＲＴ６は、ＣＲＩＳＰＲをコードする唯一のリボタイプである。ＣＲＩＳＰＲは、ウイルス、ファージ、プラスミドに対する防御的「免疫」を付与することを示す（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ざ瘡菌でコードされたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（図Ｓ１０）で報告されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびストレプトコッカスサーモフィルス中のＣＲＩＳＰＲ４遺伝子座と相同である、一連のｃａｓ遺伝子、−ｃａｓ３、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃｓｅ４、ｃａｓ５ｅ、ｃｓｅ３、ｃａｓ１、およびｃａｓ２からなる（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０）。
ＣＲＩＳＰＲアレイは、類似した長さで、異なるヌクレオチド配列を伴うスペーサ配列によって分離された同一の反復配列のクラスタで構成される。スペーサ配列は、同一であるか、またはファージもしくはプラスミドＤＮＡ配列に対する１個または２個の不一致を伴うことが分かった。３９個のスペーサ配列の合計が、８個のざ瘡菌の菌株に見られ、そのうちの２５個が、表２に示すように固有であった。
予想されるように、特定可能なスペーサのほとんどは、既知のざ瘡菌ファージ配列を標的化する。しかし、固有のＣＲＩＳＰＲスペーサ配列の間で、１個は、染色体上の遺伝子座２と一致し、３個は、主にＲＴ４およびＲＴ５のざ瘡菌ゲノム内のプラスミド領域（遺伝子座３）に一致した。これは、これらの遺伝子座は、ＲＴ４およびＲＴ５の菌株によって取得され得たが、ＲＴ２およびＲＴ６のゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ機構を介したプラスミドまたは他の外来のＤＮＡの侵入から守られることが可能である場合があることを示唆する。
考察
ざ瘡に関連した人間の皮膚のマイクロバイオームの前述の研究は、細菌菌株レベルでの毛包脂腺単位の微生物叢の第１の肖像を提供する。ざ瘡菌は、ざ瘡および健康な皮膚の両方に見られる主要な皮膚の利共生細菌であるため、この菌株レベルでの解析は、ざ瘡の病原および健康な皮膚において、ざ瘡菌の役割を理解するのに役立つため、重要である。ざ瘡を伴うＲＴ４およびＲＴ５の菌株間の強い関連、およびＲＴ６の菌株と健康な皮膚との間の強い関連が、各々が固有の遺伝的要素を伴い示される。リボタイプ７、８、９、および１０、または異なる菌株間での相互作用を含む他のざ瘡菌の菌株が、疾患の発症に寄与し得る。加えて、ホルモンレベル、皮脂生成、および毛包脂腺単位の物理的変化などの宿主要因もまた、ざ瘡病原において役割を果たし得る。
ざ瘡菌の菌株と疾患または健康との関連を明らかにする前述のメタゲノム手法は、従来の方法を用いた以前の研究よりも強力である（Ｌｏｍｈｏｌｔ ａｎｄ Ｋｉｌｉａｎ，２０１０；ＭｃＤｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。各個人および各皮膚部位の皮膚微生物叢が、インビトロ培養条件の下で異なる成長速度を有し得る、同時に「良い」「中間」「悪い」菌株を保有し得るため、疾患の病変または健康な皮膚部位からの少数の分離株を培養することは、菌株と病気または健康との関連の正確で公平な測定を提供しない場合がある。前述の研究におけるサンプリング技術および疾患との関連は、サンプリング位置、サンプリング分野での病変の存在、または本来的に偏った培養技術に依存しない。病変皮膚のサンプリングは、意図的に興味深い結果をもたらし得るが、一方で、これらの結果は、公平なサンプリングを行い得る疾患との関連を定義することができないであろう。ざ瘡の基礎となる菌株の差を特定するための前述の研究に用いられるメタゲノム手法はまた、利共生または病原細菌と他の疾患／健康との関連の研究に適用され得る。
材料および方法
対象
ざ瘡を有する対象および正常な皮膚を有する対象が、集団の多様性および医療の歴史を最良に提示するために、個人開業、マネージドケア、公立病院の場、ならびに皮膚科診療所外を含む南カリフォルニアの様々なクリニックで募集された。対象データは、ｄｂＧａＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇａｐ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｔｕｄｙ．ｃｇｉ？ｓｔｕｄｙ＿ｉｄ＝ｐｈｓ０００２６３．ｖ１．ｐ１）で入手可能である。ざ瘡の診断は、委員会による認可を受けた皮膚科医によって行われた。ざ瘡の存在は、Ｇｌｏｂａｌ Ａｃｎｅ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃａｌｅ（Ｄｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）と密接に関連した０〜５の段階で等級付けされた。等級は、顔および鼻の両方に別々に記録され、０が正常な皮膚を表し、５が最も深刻な炎症性嚢胞性ざ瘡を表す。ざ瘡の患者では、顔の等級は、平均２．１で、１〜５までの範囲であり、鼻の等級は平均０．３で、０〜２の範囲であった。瘢痕の存在もまた認められた。正常な皮膚を有する対象は、委員会による認可を受けた皮膚科医によって判定され、顔、胸、または背中にざ瘡の病変を有していない者と定義された。研究者らがサンプリングまたは皮膚上の微生物集団に影響を与えるであろうと感じた他の皮膚の問題を彼らが抱えていた場合は、彼らは除外されもした。１０１人の対象の中で、５９人が女性（３１人のざ瘡患者および２８人の正常な対象）であり、４２人が男性（１８人のざ瘡患者および２４人の正常な対象）であった。ざ瘡のコホートの平均年齢は２２．２歳であり、通常のコホートの平均年齢は２９．６歳であった。ざ瘡と正常な集団との間の民族性に有意差はなかった。対象は、対象と共に各質問に目を通した医師または十分な訓練を受けた研究コーディネーターによって管理された書面の調査票に回答した。対象のほとんどは、試料を採取したとき、過去にざ瘡の治療を受けたことがなかったか、治療されていなかった（図３）。治療情報を提供した７８人の対象のうちの９人のみが、試料が採取されたとき、ざ瘡の治療がされていた。９人の対象の中で、２人は抗生物質で治療され、５人は局所レチノイドで治療され、１人は抗生物質およびレチノイドの両方で治療され、１人は治療が列挙されていなかった。対象は、過去（彼らの一生のうちのいつでもよい）にざ瘡の治療履歴が求められた。治療履歴を提供した７３人の対象のうちの１８人が、過去にざ瘡の治療をしたことがあった。彼らの中で、７人は抗生物質で治療され、８人は局所レチノイドで治療され、２人は抗生物質およびレチノイドの両方で治療され、１人は治療が列挙されていなかった。全ての対象は、書面でインフォームドコンセントを提供した。全てのプロトコルおよび同意書は、ＵＣＬＡおよびＬｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＩＲＢｓの両方によって承認された。この研究は、ヘルシンキガイドラインを遵守した。
試料
皮膚の微小面皰（白色面皰または黒色面皰）の試料は、製造者の指示に従ってＢｉｏｒe Ｄｅｅｐ Ｃｌｅａｎｓｉｎｇ Ｐｏｒｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｋａｏ Ｂｒａｎｄｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を使用して対象の鼻から採取された。清潔な手袋が、各サンプリングのために使用された。鼻から除去された後、ストリップは、５０ｍＬの無菌管内に直ちに配置され、氷上でまたは４℃で保持された。細胞は、ほとんどの場合４時間以内に溶解した。
メタゲノムＤＮＡ抽出、１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅、クローニング、および配列決定
個別の微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻ストリップから単離された。ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出された。１６Ｓ ｒＤＮＡは、補足情報に詳細に記載されたＨＭＰによるプロトコルに従って増幅され、クローニングされた。ほぼ完全長の配列は、サンガー法によって取得された。
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析
ベースコールおよび品質は、Ｐｈｒｅｄを用いて判定された（Ｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，１９９８；Ｅｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。双方向読み取りは、組み立てられ、ＡｍｏｓＣｍｐ１６ＳｐｉｐｅｌｉｎｅおよびＮＡＳＴ−ｉｅｒを使用してＮＡＳＴでフォーマットされた配列（ｒＲＮＡ１６Ｓ．ｇｏｌｄ）のコアセットに位置合わせされた（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。疑われるキメラは、ＣｈｉｍｅｒａＳｌａｙｅｒおよびＷｉｇｅｏＮを用いて特定された（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、広範に手動で検査された。クロマトグラムは、Ｐｈｒｅｄ品質スコアが３０未満の全ての塩基で視覚的に検査された。適切な補正が適用された。ＱＩＩＭＥ（Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）は、ＯＴＵ中で配列をクラスタ化するために使用された。
ざ瘡菌単離および遺伝子型判定
ざ瘡菌の巨視的特徴を持つコロニーが各試料プレートから採取され、２回渡された。各分離株のリボタイプは、ＰＣＲ増幅およびサンガー法による１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の完全長の配列決定により判定された。
全てのゲノムショットガン配列決定、アセンブリ、および注釈
ゲノムＨＬ０９６ＰＡ１はＲｏｃｈｅ／４５４ ＦＬＸを用いて配列決定され、ＣＯＮＳＥＤの大規模な手動編集を伴い、ＰＨＲＡＰ／ＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびＧＳＭＡＰＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）の組み合わせを用いて組み立てられた。残りの６５個のゲノムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ ＧＡＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定された。配列データセットは、品質トリミングによって処理され、Ｖｅｌｖｅｔ（Ｚｅｒｂｉｎｏ ａｎｄ Ｂｉｒｎｅｙ，２００８）を用いて組み立てられた。コード配列は、ＧｅｎｅＭａｒｋ（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ＭｃＩｎｉｎｃｈ，１９９３）およびＧＬＩＭＭＥＲ（Ｓａｌｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を使用して予測された。最終的な遺伝子セットは、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ、ｐｓｏｒｔ−ｂ、およびＫＥＧＧからなる一連のタンパク質の分類ツールを介して処理された。より詳細なプロトコルは、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｐｄａｃｃ．ｏｒｇ／ｄｏｃ／ｓｏｐｓ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ＷＵＧＣ＿ＳＯＰ＿ＤＡＣＣ．ｐｄｆ．で閲覧できる。
比較ゲノム解析
７１個のざ瘡菌のゲノム配列が、Ｎｕｃｍｅｒを用いて比較された（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００４）。系統発生解析は、ＭＥＧＡ５を用いて実施された（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ（Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２００７）が、ＣＲＩＳＰＲ反復スペーサ配列を特定するために使用された。
補足情報
ＫＰＡ１７１２０２の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列
全ての配列決定されたざ瘡菌ゲノムは、ＫＰＡ１７１２０２を除き、各分離株内で同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３個のコピーをコードする。ＫＰＡ１７１２０２ゲノム（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）に基づいて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１個のコピーは、ＲＴ１の他の２個の同一のコピーから異なる１個のヌクレオチドを有する。しかし、この突然変異は、１６Ｓ ｒＤＮＡデータセット内で観察されなかった。ＫＰＡ１７１２０２から１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の複数のクローンが増幅され、クローンされ、配列決定され、この突然変異を保有する配列は見られなかった。このように、ＫＰＡ１７１２０２はまた、１６Ｓ ｒＤＮＡの３個の同一のコピーを有する。
他の人間のマイクロバイオームデータセットとざ瘡菌の菌株分布との比較
この研究で測定されたざ瘡菌のリボタイプおよびそれらの相対的存在量が、毛包脂腺単位に固有であるかどうかを判定するために、Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＭＰ）およびＧｒｉｃｅら（２００９）のデータからのマイクロバイオーム１６Ｓ ｒＤＮＡデータと類似した解析が適用された。両方のデータセットは、健康な対象から取得された。本研究からの健康な対象の主要なリボタイプの相対的存在量は、それらが異なる解剖学的部位からサンプリングされたという事実にも関わらず、これらの２個のデータセットで見られるものに非常に類似していた（図３）。ＲＴ６（６．３％）は、通常のコホートにおいて見られるものと同様に、ＨＭＰデータ中のＲＴ４およびＲＴ５を合わせたもの（２．８％）よりもより豊富であることが分かり、ＲＴ６は４．８％を表し、ＲＴ４およびＲＴ５を合わせものは、クローンの１．２％を表す。同じ５個の主要なマイクロバイオーム型が、２個のデータセットで観察された（図７）。
ゲノムクラスタ化および系統樹
ｒｅｃＡ遺伝子は、４個の既知の型、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩ、およびＩＩＩにざ瘡菌の菌株を広く分類するために使用されている（ＭｃＤｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；ＭｃＤｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）。コアゲノム中のＳＮＰに基づく７１個のゲノムの系統樹は、１個の分離株、ＨＬ０９７ＰＡ１を除いて、完全にｒｅｃＡ型と一致した。リボタイプ１、４、５、および５３２を有するゲノムのほとんどは、ｒｅｃＡのＩＡ型分岐群に対して分類され、これらは、更に下位分岐群ＩＡ−１、ＩＡ−２に分けることができる。分岐群ＩＡ−２は、ＲＴ４およびＲＴ５で主に構成されている。ＲＴ４およびＲＴ５ゲノムのほとんどは、非常に類似したゲノム配列と同じ系統に属しているように見える。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子内のＴ１００７Ｃの変異を共有するリボタイプ３、８、および１６を有する全ての分離株は、ｒｅｃＡのＩＢ型分岐群に分類された。ＲＴ３のほとんどは、下位分岐群ＩＢ−２を形成し、ＲＴ８ゲノムは、自ら下位分岐群ＩＢ−１を形成し、これは非常にざ瘡と関連していた。注目すべきは、Ｔ８５４Ｃ突然変異を共有するＲＴ２およびＲＴ６は、他のリボタイプより遠い系統発生的関係を有し、ｒｅｃＡのＩＩ型分岐群に分類された。これは以前の研究と一致している（Ｌｏｍｈｏｌｔ ａｎｄ Ｋｉｌｉａｎ，２０１０；ＭｃＤｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ｒｅｃＡのＩＩＩ型のざ瘡菌の分離株は、試料中に見られなかった。
健康および疾患の状態のざ瘡菌系統の関連が、更に解析された。系統樹に沿って分岐群のざ瘡との関連の強さの明確なシフトがあった（図９）。ざ瘡（ＲＴ４、ＲＴ５、およびＲＴ８）に強く関連すると特定された３個の配列決定されたリボタイプは、ＩＡ−２およびＩＢ−１分岐群中の樹の一方の端部に見られたが、一方、正常な皮膚と関連すると特定されたＲＴ６は、分岐群ＩＩの先端の樹の他方の端部にあった（図９）。
抗生物質耐性
ざ瘡のリボタイプ４、５、および１０は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列内に単一のヌクレオチド置換Ｇ１０５８Ｃを含有し、これは、テトラサイクリンに増大した耐性を付与することが以前示された（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列における置換に加えて、配列決定されたＲＴ４およびＲＴ５の全ての菌株が、２３Ｓ ｒＤＮＡ配列中にヌクレオチド置換を有すると判定され、これは、異なる等級の抗生物質、エリスロマイシン、およびクリンダマイシンに増大した耐性を付与する（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ）。培養できなかった２個を除き、これらの分離株は、テトラサイクリン、エリスロマイシン、クリンダマイシンに耐性であることが、実験的に確認された。
ざ瘡群におけるこれらのリボタイプの富化が抗生物質治療に起因し得るか否かもまた検査された。しかし、研究では、リボタイプ４、５、または１０を保有するわずかな割合の対象のみが、抗生物質で治療された（表Ｓ２）。
これら３個のリボタイプのうちのいずれかを保有する２９個の対象のうちの１８個は、過去および現在の治療の両方に関する報告がなされた。かれらのうち、対象の５０％（９／１８）は全く治療されず、３３％（６／１８）はレチノイドで治療され、１１％（２／１８）は、過去に抗生物質で治療され、５．６％（１／１８）は、過去に抗生物質およびレチノイドの両方で治療された。抗生物質治療による選択の理論は、この研究によって支持されていない。ざ瘡患者における抗生物質耐性菌株の以前の調査は、抗生物質の以前の使用が耐性菌株の存在下で常には生じなかったこと、抗生物質を以前使用していない何人かの患者が耐性菌株を保有していることを実証した（Ｃｏａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。本研究における観察は、以前の研究と一致している。
ＣＲＩＳＰＲスペーサ配列
ざ瘡菌ゲノムのＧＣ含有量により類似しているが、ＲＴ２およびＲＴ６の菌株内で見られた４個の固有のスペーサ配列は、クロストリジウムレプタム、腸内微生物叢における利共生細菌ゲノムに最も一致するものを有する（表２）。ＨＬ０９６ＰＡ１ならびに他のＲＴ４およびＲＴ５ゲノムで保有される５５Ｋｂのプラスミドでは、Ｔａｄ遺伝子座を含む、Ｃ．レプタムで見られた遺伝子と同一の３５個の遺伝子の大型クラスタもまた存在する。
材料および方法
メタゲノムＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、クローニング、および１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定メタゲノムＤＮＡ抽出
個別の微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻ストリップから単離され、ＡＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）および直径０．１ｍｍのガラスビーズで充填された２ｍＬの無菌の微量遠心管内に配置された（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）。細胞を室温にて４，８００ｒｐｍで３分間ビードビータを用いて溶解した。５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清が回収され、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたゲノムＤＮＡ抽出のために使用された。チューインガムからＤＮＡを抽出するための製造業者のプロトコルが使用された。ゲノムＤＮＡの濃度は、ナノドロップ１０００分光光度計で判定された。
１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定
メタゲノム試料のほとんどは、以下の配列を有する１６Ｓ ｒＤＮＡの特異的なプライマーを用いて三重に増幅された：２７ｆ−ＭＰ ５’ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’および１４９２ｒ−ＭＰ ５’−ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＹＧＡＣＴＴ−３’。ＰＣＲ反応は、０．５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｆａｉｌ−Ｓａｆｅ ＰＣＲシステムからの１Ｘ事前混合Ｅ ＰＣＲ緩衝液、０．１２μＭ濃度の各プライマー２７ｆ−ＭＰ、１４９２ｒ−ＭＰ、およびシグマＰＣＲグレード水を含有する。１マイクロリットルのＤＮＡ（０．２に至るまで、合計１０ｎｇ）が、各反応に添加された。Ｇ−ストームＧＳ４サーモサイクラー条件は以下の通りであった：５分間９６℃で初期変性、３０秒間９４℃で３０サイクルの変性、１分間５７℃でアニーリング、２分間７２℃で延長、７分間７２℃で最終延長。増幅に続いて、Ａ−テーリング反応は、増幅反応物に１ＵのＧＯＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの直接添加、および１０分間７２℃でサーモサイクラー中でのインキュベーションにより実施された。
各ソースＤＮＡから３個のＰＣＲ増幅反応物がプールされ、ゲル精製された（ＳＹＢＲグリーン蛍光色素で染色された１．２％アガロースゲル）。１．４Ｋｂの生成物が切除され、Ｑｕｉｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて更に精製された。精製された生成物は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットを使用してＯｎｅＳｈｏｔ大腸菌細胞中にクローニングされた。
白色コロニーが、Ｑｐｉｘピッキングロボットを用いて、テリフィックブロス、グリセロール、およびカナマイシンを含有する３８４ウェルトレイ内に拾われた。各トレイは、Ａｇｉｌｅｎｔの磁気ビーズプレップを使用して配列決定のために調製され、ＡＢＩの１／１６ｔｈ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いて配列決定された。配列決定は、ユニバーサルフォワード、ユニバーサルリバースで、かつサブセットについては、ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（順方向）、ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ（逆方向）、およびＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ（９０７Ｒ）の配列を有する内部１６Ｓ ｒＤＮＡのプライマー９０７Ｒで行われた。配列反応は、長い読み取り実行モジュールを用いて５０ｃｍのアレイ上でＡＢＩのＡＢＩ３７３０機上にロードされた。
自動化を伴わないわずかに異なるＰＣＲおよびクローニングプロトコルが、以下に説明するように、いくつかの初期試料のために使用された。１６Ｓ ｒＤＮＡは、ユニバーサルプライマー８Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）および１５１０Ｒ（５’−ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いて増幅された（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。サーモサイクラー条件は以下の通りであった：５分間９４℃で初期変性ステップ、４５秒間９４℃で３０サイクルの変性、３０秒間５２℃でアニーリング、９０秒間７２℃で伸長、２０分間７２℃で最終伸長ステップ。
ＰＣＲ生成物は、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製された。続いて、１６Ｓ ｒＤＮＡの単位複製配列は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングされた。Ｏｎｅ−Ｓｈｏｔ ＴＯＰ−１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、ベクターで形質転換され、選択培地上でめっきされた。個別の陽性コロニーが拾われ、選択的なＬＢ液体培地内に接種された。１４時間のインキュベーション後、プラスミドは、ＰｒｅｐＥａｓｅ ＭｉｎｉＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＺｙｐｐｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して抽出および精製された。クローンは、ＡＢＩ３７３０シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて、８分の１の化学的性質を伴うサンガー配列決定法を用いて、双方向に配列決定された。
ざ瘡菌単離および培養
試料培養プレート
鼻ストリップの内面上の微小面皰は、すりつぶされ、無菌ループ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて掻き取られ、血液寒天プレート上でプレーティングされた（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ａｇａｒ Ｐｌａｔｅ ｗｉｔｈ Ｈｅｍｉｎ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ， Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ）。プレートは、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて５〜７日間３７℃で嫌気的にインキュベートされた。
単離および個別の菌株の培養
ざ瘡菌の巨視的特徴を持つコロニーが各試料プレートから採取され、Ａ培地プレート上に画線された（カシン膵臓ディガス（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｉｇａｓｅ ｏｆ Ｃａｓｉｎｅ）、ディフコ酵母抽出物、グルコース、ＫＨ２ＰＯ４、硫酸マグネシウム、ディフコ寒天、および水）。これらの第１の通過プレートは、次いで、５〜７日間３７℃で嫌気的にインキュベートされた。第２の通過として、単一の単離されたコロニーが第１の通過プレートから採取され、新しいＡ培地プレート上に画線された。これらのプレートは、次いで、５〜７日間３７℃で嫌気的にインキュベートされた。これらのプレート上のコロニーは、サブ配列のステップにおける培養、遺伝子型判定、およびゲノム配列決定のために採取された。
ざ瘡菌分離株の遺伝子型判定
各分離株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅によって解析された。リボタイプは、完全長の配列に基づいて判定された。所望のリボタイプの分離株は、将来の培養およびゲノム配列決定のために選択された。
ざ瘡菌の分離株のゲノムＤＮＡ抽出
分離株を５〜７日間３７℃で嫌気条件下において５ｍＬのクロストリジウム培地中で成長させた。培養物は、遠心分離によりペレット化され、３ｍＬのリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で洗浄された。メタゲノムＤＮＡ抽出に使用されたものと同じプロトコルが、分離株のゲノムＤＮＡを抽出するために使用された。
メタゲノムショットガン配列決定および解析
正常な皮膚を有する２２人の個人の微小面皰試料のメタゲノムのＤＮＡ試料がプールされ、Ｒｏｃｈｅ／４５４ＦＬＸを用いて配列決定された。平均読み取り長は、２３６ｂｐであった。配列決定は、１３，２９１個の配列読み取りによって制限された。配列読み取りは、ＢＬＡＳＴを用いてＮＣＢＩの非冗長データベースに対して位置合わせされた。種の割り当ては、９７％の同一性および１００％の位置合わせされた読み取り長に基づいた。
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のアセンブリ、位置合わせ、および編集
アセンブリおよび位置合わせ
ベースコールおよび品質は、既定のパラメータを使用して、Ｐｈｒｅｄを用いて判定された（Ｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，１９９８；Ｅｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。双方向読み取りは、組み立てられ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ Ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｕｔｉｌ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）のＡｍｏｓＣｍｐ１６ＳｐｉｐｅｌｉｎｅおよびＮＡＳＴ−ｉｅｒを使用してＮＡＳＴでフォーマットされた配列（ｒＲＮＡ１６Ｓ．ｇｏｌｄ）のコアセットに位置合わせされた。これらのツールとしては、順に、Ａｍｏｓｃｍｐ（Ｐｏｐ ｅｔ ａｌ．，２００４）、Ｍｕｍｍｅｒ（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００４）、Ｌｕｃｙ（Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｈｏｌｍｅｓ，２００１）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、およびＣｄｂＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔｇｉ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）を使用する。疑われるキメラは、ＣｈｉｍｅｒａＳｌａｙｅｒおよびＷｉｇｅｏＮを用いて特定された（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。少なくとも９０％のブートストラップを有する配列は、キメラブレークポイント（ＣｈｉｍｅｒａＳｌａｙｅｒ）を裏付け、そうでなければ予想される変化（ＷｉｇｅｏＮ）の９９％を超える分位で変化する領域を含むことが、更なる解析から除去された。
品質スクリーニング
ざ瘡菌集団の多様性解析のために、ざ瘡菌ＫＰＡ１７１２０２（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）１６Ｓ ｒＤＮＡに対して１，４００個のヌクレオチドにわたって少なくとも９９％の同一性を有する配列が、位置２９〜１４８３（命名法の大腸菌システムに基づく番号付け（Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９７８））にトリミングされた。この領域を完全にカバーしない配列は、更なる菌株レベルの解析から除外された。キメラスクリーニングは、上で説明するように、配列の０．３５％未満の除去をもたらした。大多数の配列がほんの１個または２個のヌクレオチドによって異なるので、これはキメラの過小評価であり得る。低品質の配列は、除外され、１５未満のＰｈｒｅｄ品質スコアを有する、位置７９と１４３３との間の５０個を超えるヌクレオチドとして定義された。詳細な菌株レベルの解析を可能にするために、データが広範囲に手動で編集された。クロマトグラムは、Ｐｈｒｅｄ品質スコアが３０未満の全ての塩基で視覚的に検査され、適切な修正が適用された。種レベルでの解析において、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は手動で編集されなかった。組み立てられた配列のキメラスクリーニングは、配列の０．６５％未満の除去をもたらした。位置合わせされた配列は、位置２９〜１４８３に同等である大腸菌にトリミングされた（Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９７８）。この領域を完全にカバーしない配列は、更なる解析から除外された。
配列編集
２６，４４６の組み立てられたざ瘡菌配列を表す６２，０００個近くのサンガー配列読み取りは、ＣＯＮＳＥＤ中のＲＴ１配列にマッピングされた（Ｇｏｒｄｏｎ，２００３；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。多数の配列の包括的な半手動での編集が、その非常に高いペア毎の類似性によって実現可能となった：配列毎のＲＴ１からわずか１個のヌクレオチドの変化の中央値（編集前の３個のヌクレオチドの変化）。編集は、スクリプトの使用と、シングルクリックが検査を必要とする部位にジャンプすることを可能にするＣＯＮＳＥＤのカスタムナビゲーション機能とによって促進された。クロマトグラムは、ＲＴ１と異なった全ての低品質（Ｐｈｒｅｄが３０未満）の塩基について検査され、多くの一般的に発生する配列エラーを含め、必要に応じて修正された。塩基誤取り込みおよびキメラの効果を最小限にするために、４個未満の配列（周波数が０．０００１５未満）内で発生したＲＴ１と異なる特異的な塩基は、信頼できないと考えられ、対応するＲＴ１塩基に戻された。リボタイプは、１００％の同一性に基づいて結果として得た配列に割り当てられた。
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析
ＯＴＵおよび分類の割り当て
ＱＩＩＭＥ（Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ）は、９９％の同一性遮断、最も遠い近隣、およびＵＣＬＵＳＴ（Ｅｄｇａｒ，２０１０）を用いてＯＴＵ内に配列をクラスタ化するために使用された。代表的な配列（最も豊富）が選択され、緑遺伝子のデータベースにＰＹＮＡＳＴ（Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ）を使用して位置合わせされた。分類は、ＲＤＰ法を使用して割り当てられた（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。位置合わせは、緑遺伝子によって提供されるレーンマスクで濾過され、系統樹は、ＦａｓｔＴｒｅｅ（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使用して構築された。
上位１０位のリボタイプ上でのウィルコクソン検定
各試料について、上位１０位のリボタイプの各々のクローン数は、試料のざ瘡菌クローンの総数によって正規化された。正規化された総数を使用して、ざ瘡群と正常群との間の富化の重要性を試験した。Ｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）中の関数ｗｉｌｃｏｘ＿ｔｅｓｔは、ｐ値を計算するために用いられた。
マイクロバイオーム型の割り当て
マイクロバイオーム型は、試料がＭＯＴＨＵＲ（Ｓｃｈｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）（図５および６）または階層的クラスタリング（Ｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（図７）中のｔｈｅｔａｙｃ類似性を用いてクラスタ化されたとき、観察された最大の分岐群に基づいて割り当てられた。
ＨＭＰおよびＧｒｉｃｅら（２００９）のデータセットにリボタイプを割り当てる
配列は、以下の基準を満たした場合にリボタイプに割り当てられた。第一に、単一の最適な一致であった。第二に、それは、上位４５位のリボタイプ（５８〜１３８８）の間で区別するために必要とされる範囲をカバーした。第三に、差別的な位置にＮｓは全くなかった。最後に、１０個以下の無差別的な差はなかった。
ＨＭＰ１６Ｓ ｒＤＮＡのサンガー配列データセットは、ＨＭＰ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒの許可を得てダウンロードされた。それは、１４個の対象および９個の本体部位（耳介後方折り目、前鼻孔、硬口蓋、頬粘膜、喉、口蓋骨扁桃腺、肘前窩、唾液、および歯肉縁下歯垢）の８，４９２個のざ瘡菌配列を有する。データセットに関する更なる詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇａｐ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｔｕｄｙ．ｃｇｉ？ｓｔｕｄｙ＿ｉｄ＝ｐｈｓ０００２２８．ｖ２．ｐ１．で閲覧できる。このデータセットでは、低品質の塩基（Ｐｈｒｅｄ品質が２０未満）はＮｓに変換され、２６％の配列は、過度のＮｓまたはリボタイプの差別的部位でのＮｓのため、割り当てられなかった。１％未満は、最良の一致に等しい、またはＲＴ１に対して１０個を超える不一致があるために、未解決である。
Ｇｒｉｃｅらのデータセット（２００９）は、ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＱ０００００１〜ＧＱ１１６３９１）で入手可能である。それは、１０個の対象の２２，３７８個のざ瘡菌配列および２１個の皮膚部位（臀部、肘、小指球の掌、掌側の前腕、前腕前部窩、腋窩ボールト、臀部折り目、鼠径折り目、指間の趾間、鼻孔、足底の踵、膝窩、爪先の趾間、臍、翼状の折り目、背中、外耳道、眉間、胸骨柄、後頭部、および耳介後方の折り目）を有する。配列の３％が、ＲＴ１に対する１０個を超える不一致のために割り当てられなく、１．６％が、最良の一致に等しいために割り当てられなかった。
比較のために、未編集の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、上で説明したものと同様の方法によりリボタイプに割り当てられ、結果は図３に示されている。配列の０．６％未満が、ＲＴ１に対する１０個を超える不一致のために割り当てられなく、１．７％が、最良の一致に等しいために割り当てられなかった。
６６個のざ瘡菌の分離株の全てのゲノムショットガン配列決定、アセンブリ、および注釈
ゲノムＨＬ０９６ＰＡ１
ゲノムは、ＵＣＬＡ遺伝子型判定および配列決定コアでＲｏｃｈｅ／４５４ＦＬＸを用いて配列決定された。５９０，０５４個の配列読み取りの合計は、２３０ｂｐの平均読み取り長で生成された。これらのうち、４３３，８９６個が組み立てられ、２個のコンティグ、２，４９４，１９０ｂｐの円形の主要染色体、および５５，５８５ｂｐの線状プラスミドとなった。アセンブリは、ＣＯＮＳＥＤの大規模な手動編集を伴い、ＰＨＲＡＰ／ＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびＧＳＭＡＰＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ）の組み合わせによって達成された。ＧｅｎｅＭａｒｋ ｖ２．６ｒ（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ＭｃＩｎｉｎｃｈ，１９９３）およびＧＬＩＭＭＥＲ ｖ２．０（Ｓａｌｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）が、遺伝子予測をコードした実施されたアブイニシオタンパク質に使用された。ｔＲＮＡＳｃａｎ−ＳＥ１．２３は、ｔＲＮＡの特定のために使用され、ＲＮＡｍｍｅｒは、リボソームＲＮＡ遺伝子（５Ｓ、１６Ｓ、および２３Ｓ）を予測するために使用された。ゲノム注釈の結果は、Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｊｏｕｙ．ｉｎｒａ．ｆｒ／）、ＫＥＧＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ）、およびＣＯＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／）を含む、公開データベースにおける自動化された検索に基づいていた。注釈の手動検査もまた、実施された。
他の６５個の分離株のゲノム
ゲノムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘを使用して配列決定され、セントルイスのワシントン大学のゲノムセンターによって注釈付けされた。
アセンブリ
各ゲノムＤＮＡ試料は、無作為に剪断され、指数付けされたライブラリは、標準イルミナプロトコルを用いて構築された。１２個の一意的にタグ付けされたライブラリがプールされ、ＧＡＩＩｘフローセルの１個のレーン上で実行され、ペアエンド配列が生成された。別個の試料へのタグ付き読み取りのデコンボリューションに続き、データセットが、ｑ１０閾値でＢＷＡ（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，２００９）品質トリミングを用いて処理された。長さが３５ｂｐ未満にトリミングされた読み取りは廃棄され、残りの読み取りは、ｏｎｅＢｕｔｔｏｎＶｅｌｖｅｔ、ユーザが提供したＫ−ｍｅｒの範囲にわたりＶｅｌｖｅｔアセンブラ（Ｚｅｒｂｉｎｏ ａｎｄ Ｂｉｒｎｅｙ，２００８）を何度も実行するオプティマイザプログラムを用いて組み立てられたが、一方、アセンブラのパラメータセットのいくつかを変更し、最長のＮ５０コンティグの長さをもたらすアセンブリパラメータセットを最適化した。
注釈
コード配列は、ＧｅｎｅＭａｒｋ ｖ３．３（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ＭｃＩｎｉｎｃｈ，１９９３）およびＧＬＩＭＭＥＲ ｖ２．１３（Ｓａｌｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を使用して予測された。ＧｅｎｅＭａｒｋおよびＧＬＩＭＭＥＲに跨らない遺伝子間領域は、ＮＣＢＩの非冗長データベースに対してＢＬＡＳＴを使用して位置合わせされ、予測は、タンパク質の位置合わせに基づいて生成された。ｔＲＮＡ遺伝子は、ｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ１．２３を用いて判定され、非コーディングＲＮＡ遺伝子は、ＲＮＡｍｍｅｒ−１．２およびＲｆａｍ ｖ８．０によって判定された。最終的な遺伝子セットは、一連のＩｎｔｅｒｐｒｏ、ｐｓｏｒｔ−ｂ、およびＫＥＧＧからなるタンパク質の分類ツールを介して処理された。遺伝子生成物の命名は、ＢＥＲパイプライン（ＪＣＶＩ）に由来する。より詳細な標準操作プロトコル（ＳＯＰ）は、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｐｄａｃｃ．ｏｒｇ／ｄｏｃ／ｓｏｐｓ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ＷＵＧＣ＿ＳＯＰ＿ＤＡＣＣ．ｐｄｆ．で閲覧できる。
７１ざ瘡菌ゲノムの解析および比較
ざ瘡菌ゲノムのコア領域の特定
「コア」領域は、７１個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義された。ざ瘡菌ＫＰＡ１７１２０２は、参照ゲノムとして使用された。他の７０個のゲノム配列（ほとんどのゲノムおよび２個の完全なゲノム内の一連のコンティグ）の各々は、Ｎｕｃｍｅｒを使用して参照ゲノムにマッピングされた（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００４）。Ｎｕｃｍｅｒプログラムの７０個の「．ｃｏｏｒｄｓ」出力ファイルは全て、Ｐｅｒｌスクリプトを使用したＫＰＡ１７１２０２座標に基づいて重複領域を特定するために解析された。最後に、「コア」配列は、上で算出された座標を有するＫＰＡ１７１２０２のゲノム配列に基づいて抽出された。平均して、ゲノムの９０％（８８％〜９２％の範囲）が、コア領域に含まれていた。
コア領域におけるＳＮＰの特定
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、デフォルトの設定でＮｕｃｍｅｒプログラム（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００４）のユーティリティオプション「ｓｈｏｗ−ｓｎｐｓ」を用いて特定された。ざ瘡菌ＫＰＡ１７１２０２のゲノム配列は、参照ゲノムとして使用された。Ｎｕｃｍｅｒプログラムの７０個の「．ｓｎｐｓ」出力ファイルは全て、Ｐｅｒｌスクリプトを使用したＫＰＡ１７１２０２座標に基づいて、固有のＳＮＰ位置を特定するために解析された。コア領域中のＳＮＰは、系統樹を構築するために更に解析された。
系統樹の構築
コア領域における９６，８８７個のＳＮＰヌクレオチドのうちの７１個の連結配列が、ざ瘡菌ゲノムの系統樹を構築するために使用された。ゲノムの中のコア領域の進化的距離は、近隣結合法（Ｓａｉｔｏｕ ａｎｄ Ｎｅｉ，１９８７）を用いて推測された。１，０００個の複製から推測されたブートストラップ樹が採取された。８０％未満のブートストラップ複製で再現されたパーティションに対応する分岐は、崩壊した。図８は、トポロジのみを示す。図９では、樹は、系統樹を推測するために使用される進化的距離のものと同じ単位の分岐長を有する一定の縮尺で描かれた。進化的距離は、ｐ距離法を用いて計算され、部位毎のヌクレオチド相違数単位中に存在する。この樹は、コア領域に基づく比較を示す。距離は、各ゲノムの非コア領域が本明細書では考慮されていなかったため、異なるゲノム間の真の進化的距離を表していない。隙間および不足しているデータを含有する全ての位置が解消された。進化解析は、ＭＥＧＡ５（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）を用いて行われた。
遺伝子の含有量の比較
７１個のゲノムにわたる遺伝子含量の保全を評価するために、全てのゲノム中の遺伝子をコードするタンパク質は、それがその全長にわたって少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する場合、長さを低減することにより第１の選別によりＵＣＬＵＳＴ（Ｅｄｇａｒ，２０１０）を使用してクラスタ化され、その後、既存のシード配列に各配列をクラスタ化し、それ以外の場合は、新しいシードとなった。可視化のために、データはそれぞれ、遺伝子およびゲノムを表す列および行に再フォーマットされた。ゲノム中に１個以上の遺伝子のコピーが存在するように処理された。遺伝子の列は、ＨＬ０９６ＰＡ１ゲノム、５５Ｋｂプラスミドを有する完全に完成したゲノムの座標に基づいて、その位置によって分類された。ゲノムの行は、上で説明されたＳＮＰ系Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ樹内のそれらの位置によって分類された。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの特定
ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ（Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２００７）が、ＣＲＩＳＰＲ反復スペーサ配列を特定するために使用された。ＨＬ１１０ＰＡ３の注釈は、ＨＬ００１ＰＡ１、ＨＬ０６０ＰＡ１、ＨＬ０８２ＰＡ２、ＨＬ１０３ＰＡ１、ＨＬ１０６ＰＡ１、ＨＬ１１０ＰＡ４、およびＪ１３９の菌株におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの構造とＣＲＩＳＰＲ反復スペーサ配列の存在とを特定するために、ＢＬＡＳＴの位置合わせのために使用された。各スペーサ配列は、ＮＣＢＩの非冗長ヌクレオチドデータベースおよび参照ゲノム配列データベース（ｒｅｆｓｅｑ＿ｇｅｎｏｍｉｃ）に対するＢＬＡＳＴの位置合わせによって注釈付けされた。
配列カバレッジ解析
ＭＡＱ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｒｏｃｈｅプラットフォームから参照ゲノムに純粋な配列の読み取りをマッピングするために使用された。簡単に説明すると、「マップ」コマンドは、マッピングのために使用され、「組み立てる」コマンドは、読み取りマッピングからコンセンサス配列を呼び出すために使用され、その後、「ｃｎｄ２ｗｉｎ」コマンドが、耕耘ウィンドウで平均化された情報を抽出するために使用された。１，０００ｂｐのウィンドウサイズが使用された。無作為に選択された百万の読み取りが、マッピングのために使用された。これは、約５５倍〜７５倍の適用範囲を有するＨＬ０９６ＰＡ２、ＨＬ０９６ＰＡ３、ＨＬ０９７ＰＡ１、およびＨＬ０９９ＰＡ１以外の全てのゲノムについて約４０倍のカバレッジを占めた。ＢＷＡ（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，２０１０）は、Ｒｏｃｈｅ／４５４プラットフォームから参照ゲノムＨＬ０９６ＰＡ１に純粋な配列の読み取りをマッピングするために使用された。平均カバレッジは、１，０００ｂｐのウィンドウで算出された。
定量ＰＣＲ
プラスミド（遺伝子座３）上のＴａｄＡ、ならびに染色体上のハウスキーピング遺伝子ＰａｋおよびＲｅｃＡを標的化する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ざ瘡菌の分離株から抽出されたゲノムＤＮＡを用いて実施された。ＬｉｇｈｔＣｙｌｅｒ ４８０ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒキットが使用された（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。各１０μＬの反応液は、５μＬのマスターミックス（２倍濃縮）、１μＬで２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５μＬで４μＭの順方向および逆方向プライマー、ならびにＤＮＡテンプレートからなっていた。４回のｑＰＣＲ実行は、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０上で実施された。ＴａｄＡのためのプライマー配列は、５’−ＧＡＴＡＡＴＣＣＧＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧ−３’（順方向）および５’−ＡＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴ−３’（逆方向）である。ｐａｋのためのプライマー配列は、５’−ＣＧＡＣＧＣＣＴＣＣＡＡＴＡＡＣＴＴＣＣ−３’（順方向）および５’−ＧＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣ−３’（逆方向）である。ｒｅｃＡのためのプライマー配列は、５’−ＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＧＧＴ−３’（順方向）および５’−ＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’（逆方向）である。全ての試料は、複製されなかった２回目の実行を除く、各ｑＰＣＲの実行で二連で実行された。サーモサイクラー条件は以下の通りであった：９５ｏＣで１０分間の初期活性化ステップ、９５ｏＣで１０秒間、（各々が、各後続のサイクル毎に段階的に０．５ｏＣの低減を伴う第１のサイクルにおいて）６５ｏＣで１５秒間、７２ｏＣで３０秒間からなる５０増幅サイクル、０．０２ｏＣ／秒のランプ速度および２５／ｏＣの取得率を伴い６５ｏＣで開始し、９９ｏＣで終了する最終的な融解曲線ステップ。ＤＮＡ濃度標準は、二連で実行された。遺伝子のコピー数の比は、プラスミドおよび染色体上の遺伝子の濃度に基づいて算出された。
データの可用性
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、プロジェクトＩＤ４６３２７下でＧｅｎＢａｎｋにおいて堆積された。ざ瘡菌の菌株の全てのゲノムショットガン配列および注釈は、受託番号ＡＤＷＢ００００００００、ＡＤＷＣ００００００００、ＡＤＷＦ００００００００、ＡＤＷＨ００００００００、ＡＤＷＩ００００００００、ＡＤＸＰ００００００００、ＡＤＸＱ００００００００、ＡＤＸＲ００００００００、ＡＤＸＳ００００００００、ＡＤＸＴ００００００００、ＡＤＸＵ００００００００、ＡＤＸＷ００００００００、ＡＤＸＸ００００００００、ＡＤＸＹ００００００００、ＡＤＸＺ００００００００、ＡＤＹＡ００００００００、ＡＤＹＢ００００００００、ＡＤＹＣ００００００００、ＡＤＹＤ００００００００、ＡＤＹＥ００００００００、ＡＤＹＦ００００００００、ＡＤＹＧ００００００００、ＡＤＹＩ００００００００、ＡＤＹＪ００００００００、ＡＤＹＫ００００００００、ＡＤＹＬ００００００００、ＡＤＹＭ００００００００、ＡＤＹＮ００００００００、ＡＤＹＯ００００００００、ＡＤＹＰ００００００００、ＡＤＹＱ００００００００、ＡＤＹＲ００００００００、ＡＤＹＳ００００００００、ＡＤＹＴ００００００００、ＡＤＹＵ００００００００、ＡＤＹＶ００００００００、ＡＤＹＷ００００００００、ＡＤＹＸ００００００００、ＡＤＹＹ００００００００、ＡＤＹＺ００００００００、ＡＤＺＡ００００００００、ＡＤＺＢ００００００００、ＡＤＺＣ００００００００、ＡＤＺＤ００００００００、ＡＤＺＥ００００００００、ＡＤＺＦ００００００００、ＡＤＺＧ００００００００、ＡＤＺＨ００００００００、ＡＤＺＩ００００００００、ＡＤＺＪ００００００００、ＡＤＺＫ００００００００、ＡＤＺＬ００００００００、ＡＤＺＭ００００００００、ＡＤＺＮ００００００００、ＡＤＺＯ００００００００、ＡＤＺＰ００００００００、ＡＤＺＱ００００００００、ＡＤＺＲ００００００００、ＡＤＺＳ００００００００、ＡＤＺＴ００００００００、ＡＤＺＶ００００００００、ＡＤＺＷ００００００００、ＣＰ００３２９３、およびＣＰ００３２９４下でＧｅｎＢａｎｋにおいて堆積された。
実施例２−プロピオニバクテリウムざ瘡の汎ゲノムおよび比較ゲノム解析
プロピオニバクテリウムざ瘡は、主要な人間の皮膚細菌である。異なる菌株が異なる悪性の特性を有し、よって、健康および疾患において異なる役割を果たすかどうかを理解するために、ざ瘡の皮膚または健康な皮膚から単離されたものがほとんどである８２個のざ瘡菌の菌株のゲノムが比較された。健康利共生として、および疾患における病原体としてざ瘡菌の表現型および機能の違いを説明し得る系統特異的な遺伝的要素が特定された。多数の配列決定された菌株を解析することにより、菌株レベルおよび分子レベルでの生物の遺伝配列景観および多様性についてのより良い理解がもたらされる。
導入
プロピオニバクテリウムざ瘡は、人間の皮膚の主要な利共生である。それは、黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌などの一般的な病原体の侵入を阻害することにより皮膚の健康を維持することに寄与する。それは、トリグリセリドを加水分解し、皮膚表面の酸性ｐＨに寄与する遊離脂肪酸を放出することによってそうする（１）。一方、ざ瘡菌は、８５％を超える青年および若年成人に影響を与える毛包脂腺単位の慢性炎症性疾患、尋常性ざ瘡に歴史的に関連している（２）。メタゲノム研究は、ざ瘡菌が健康な個人およびざ瘡患者の両方における毛包脂腺単位中の優勢な細菌であることを以前に実証した（３、４）。しかし、菌株レベルでは、ざ瘡菌の集団構造は、２個の群の間で異なっていた。これらの知見は、他の疾患についての研究に従って、微生物関連の人間の疾患が、多くの場合、菌株全体ではなく種の一定の菌株によって引き起こされることを示唆した（５、６）。
ざ瘡菌は、３個の異なる型に分類されている。ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｕｍｍｉｎｓによる研究（７）は最初に、血清学的凝集試験および細胞壁糖解析に基づいて区別することができた、ＩおよびＩＩ型として知られる２個の異なるざ瘡菌の表現型を明らかにした。ＭｃＤｏｗｅｌｌら（８）は、モノクローナル抗体タイプ分類によって、ＩおよびＩＩ型ざ瘡菌を分化した。更に、ｒｅｃＡ遺伝子の塩基配列およびより可変的な溶血素／細胞毒素遺伝子（ｔｌｙ）に基づくざ瘡菌の菌株のそれらの系統解析は、ＩおよびＩＩ型が異なる系統を表すことを実証した。それらの調査はまた、Ｉ型系統内の菌株は、ＩＡおよびＩＢ型として知られる２個の分岐群に更に分割することができることを明らかにした（８、９）。ＩＩＩ型として知られているざ瘡菌、追加の系統発生群については、後述する（１０）。多座の配列タイプ分類（ＭＬＳＴ）に基づく最近の研究は、密接に関連したクラスタに更に細分化され、そのうちのいくつかは、ざ瘡を含む様々な疾患と関連していた（１１〜１３）。
ざ瘡菌、ＫＰＡ１７１２０２、ＩＢ型菌株の第１の完全なゲノム配列は、このグラム陽性菌（１４）の病原の可能性について見識を提供した。ゲノムは２．５６Ｍｂｐで、６０％のＧＣ含有量を有する。シアリダーゼ、ノイラミニダーゼ、エンドグリコセラミダーゼ（ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｃｅｒａｍｉｄａｓｅｓ）、リパーゼ、および毛穴形成要因などの宿主分子の分解に関与する複数の遺伝子生成物を含む２，３３３個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。しかし、単一のゲノムの配列が、生物の遺伝配列景観、および菌株間の遺伝的変異がそれらの多様な表現型および病原特性をどのように判定するかを反映していない。
菌株レベルで人間のマイクロバイオームの変化をより良く理解するために、人間マイクロバイオームプロジェクト（ＨＭＰ）（１５、１６）の一部として、以前、健康な対象およびざ瘡患者（４）のコホートから単離された１，０００個以上の菌株の集合から選択された６６個のざ瘡菌の菌株の参照ゲノム配列が生成された。これらの６６個の菌株は、ＩＡ、ＩＢ、およびＩＩ型を含む人間の皮膚上で見つかったざ瘡菌の主要な系統を表している。解析における全ての主要なざ瘡菌系統をカバーするために、最初に入手可能なＩＩＩ型ざ瘡菌ゲノムを含め３個の追加のざ瘡菌の菌株が、配列決定された。他の研究グループ（１４、１７〜２２）によって配列決定された１３個のざ瘡菌のゲノムはまた、解析時に入手可能であった。全部で８２個のゲノムを用いて、ざ瘡菌の汎ゲノム、異なる系統間の系統発生関係、同じ個人の菌株のマイクロバイオームの小進化、各系統に固有の遺伝的要素ならびに健康および疾患とそれらとの関連性を特徴付けるために比較ゲノム解析が行われた。
結果
ざ瘡菌の菌株および一般ゲノムの特徴
菌株レベルでこの重要な皮膚の利共生のゲノムの多様性を理解するために、６９個の配列決定されたざ瘡菌の菌株のゲノムが解析された。これらのうち、６７個のざ瘡菌の菌株は、健康な個人およびざ瘡患者の皮膚から単離され（３、４）、２個のざ瘡菌の菌株、ＨＬ２０１ＰＡ１およびＨＬ２０２ＰＡ１は、難治性歯内病変から単離された（２３）（表２−１）。
これらの６９個の菌株は、これまでに単離された全ての既知のざ瘡菌系統をカバーする。菌株は、それらの１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡの）配列に基づいて分類された。各固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、リボタイプ（ＲＴ）として定義された。全ての配列決定されたざ瘡のゲノムは、１６Ｓ ｒＲＮＡの３個の同一のコピーを有した。ざ瘡（４）と関連する皮膚マイクロバイオームのメタゲノム研究に基づいて、上位１０位の主要なリボタイプの中で、ＲＴ１、ＲＴ２、およびＲＴ３は、最も豊富で、健康な個人およびざ瘡患者の両方において有意差がないことが見てとれた。ＲＴ４、ＲＴ５、およびＲＴ８は、ざ瘡患者において富化され、ＲＴ６は、健康な個人に主に見られた。６９個の菌株には、１９個のＲＴ１菌株、５個のＲＴ２菌株、１５個のＲＴ３菌株、８個のＲＴ４菌株、７個のＲＴ５菌株、４個のＲＴ６菌株、６個のＲＴ８菌株、４個の小さなリボタイプの菌株、および１個のＩＩＩ型菌株が含まれていた。平均ゲノムサイズは２．５０Ｍｂ（２．４６〜２．５８Ｍｂの範囲）であり、ＧＣ含有量は６０％であった。平均で、各ゲノムは２，６２６個（２，３９３〜２，８０６個までの範囲）のＯＲＦをコードした（表２−１）。
解析には、公的に入手可能であった１３個の追加のざ瘡菌ゲノムが含まれていた（１４、１７〜２２）（表２−１）。これらの１３個のざ瘡菌の菌株の平均ゲノムサイズは２．５１Ｍｂ（２．４８〜２．５６Ｍｂの範囲）であり、ＧＣ含有量は６０％であり、平均して２，３１９個（２，２３３〜２，４１２個の範囲）のＯＲＦをコードした。これらの１３個のゲノムには、６個のＲＴ１菌株、２個のＲＴ２菌株、４個のＲＴ３菌株、および１個のＲＴ５菌株が含まれるが、しかし、ＲＴ４、ＲＴ６、ＲＴ８およびＩＩＩ型の菌株のゲノムは全く入手できなかった。配列決定努力が、各ざ瘡菌の系統のためのゲノム数だけでなく、カバーされる系統数も大幅に増加させた。
ざ瘡菌汎ゲノム
ざ瘡菌の遺伝配列景観を判定するために、８２個のざ瘡菌ゲノムに基づいた汎ゲノムが推定された。べき乗則回帰解析ｎ＝κＮγ（２４）を使用して、追加のざ瘡菌ゲノムを配列決定することによって発見されるであろう新たな遺伝子の数が推定された（図１３）。解析は、αは０．７８８であると特定した。新たなゲノムによって追加された新しい遺伝子の平均数は、８２番目のゲノムが添加されたとき、３個であった。べき乗則回帰解析ｎ＝κＮγを使用して、追加のざ瘡菌ゲノムを配列決定することによって蓄積されるであろうざ瘡菌の汎ゲノムの数が推定された（図１４）。指数γは０．０６７であり、ざ瘡菌は、３，１３６個の汎遺伝子（Ｎ＝８２）を有していた。これらの結果に基づいて、指数αが１未満であり、γがゼロを超える（２４）とき、ざ瘡菌の汎ゲノムは、オープンとして定義される。αが１に近く、γがゼロに近かったため、この生物は、大きく拡張することなく、緊密に進化したと考えられている。
ざ瘡菌のゲノム間の系統発生関係
８２個のざ瘡菌の菌株のゲノムの比較は、２．２０Ｍｂ（平均ゲノムの８８％）が全てのざ瘡菌ゲノムによって共有される（これは、本明細書では「コア領域」と称される）ことを明らかにした。コア領域内で、１２３，２２３個の固有の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、菌株間で検出された。ＳＮＰの２７パーセントは、Ｉ型に固有であり、２２％はＩＩ型に固有であり、２２％はＩＩＩ型に固有であった（図１５）。コア領域内の１２３，２２３個のＳＮＰに基づく系統樹が構築された（図１６）。樹は、菌株のｒｅｃＡ型の分類がゲノムに基づいた主要な分岐群と一致することを示した。ｒｅｃＡのＩＡ、ＩＢ、およびＩＩ型の菌株はすべて、ＨＬ０９７ＰＡ１およびＰＲＰ−３８を除いて、それぞれ各型内で共にクラスタ化された。ｒｅｃＡＩＩＩ型の菌株、ＨＬ２０１ＰＡ１のみ、Ｉ型およびＩＩ型の菌株とは別個の分岐を形成した。樹はまた、菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡのリボタイプがゲノム配列から推測される系統発生関係と一致したことを示した。ＲＴ１菌株のほとんどが分岐群ＩＡ−１にクラスタ化されたが、一方、全てのＲＴ４およびＲＴ５菌株のほとんどが分岐群ＩＡ−２にクラスタ化された。６個すべてのＲＴ８菌株は、分岐群ＩＢ−１で共にクラスタ化された。すべてのＲＴ３およびＲＴ１６菌株は、ＳＫ１８７を除いて、分岐群ＩＢ−２で共にクラスタ化された。ＨＬ０３０ＰＡ１およびＫＰＡ１７１２０２は、異なるＩＢ−３分岐群として、６６０９と共にクラスタ化された。ＨＬ０９７ＰＡ１およびＰＲＰ−３８は、共にクラスタ化され、ＭｃＤｏｗｅｌｌらによって最近命名された新しい型ＩＣとして分類された（２２）。全てのＲＴ２菌株は、ＲＴ６菌株と共に分岐群Ｉから離れた分岐群ＩＩにクラスタ化された。ＲＴ６菌株であり、経口部位から単離されたＨＬ２０２ＰＡ１は、皮膚のＲＴ６分離株と大差はなく、共にクラスタ化された。全ての菌株の配列型は、２個の公表されたＭＬＳＴスキーム（１１、１３）に基づいて割り当てられ、表Ｓ１に示されている。コアゲノム領域に基づいた系統樹は、１６Ｓのリボタイプ分類をざ瘡菌の菌株の特定および分類のために使用することができることを実証した。ｒｅｃＡのタイプ分類よりもはるかに高い解像度を提供し、一方で、それは一般的に７〜９個の遺伝子を必要とする煩雑なプロセスであるＭＬＳＴよりも１個の遺伝子のみを必要として、はるかに簡単および迅速である。
多数の生成されたゲノム配列は、分岐群レベルでざ瘡の汎ゲノムの解析を可能にした。分岐群ＩＡ、ＩＢおよびＩＩはそれぞれ、３６個、３３個、および１２個のゲノムを有していた。上で説明したべき乗則回帰解析に基づいて、分岐群レベルでざ瘡菌はまた、ｒｅｃＡのＩＡ型分岐群、ＩＢ型分岐群、および限られた拡張を伴うＩＩ型分岐群のためのオープン汎ゲノムを有することが判定された（図１７）。拡張率は、分岐群間で大幅に異なることはなく、種レベルでのものと類似していた。これは、ざ瘡菌の全ての主要な系統が同様の速度で進化したことを示唆している。
コアゲノム領域におけるＳＮＰの分布
ざ瘡菌のゲノムにおける突然変異および／または組み換えのための「ホットスポット」があるかどうかを理解するために、ＳＮＰが無作為にゲノム全体に分布していたか、または特定の領域で富化されたかどうかを判定した。コア領域中の遺伝子をコードする各タンパク質におけるＳＮＰの頻度が計算された。コア領域中の多型部位の平均速度は、５．３％、すなわち、１００ｂｐ毎に一意の５．３ＳＮＰであった。この速度は、複数の腸内細菌ゲノム（２５）に見られるものに匹敵する。コア領域でコードされた１，８８８個の遺伝子のうち、５５個の遺伝子は３個以上の標準偏差（ＳＤ）でより高いＳＮＰ周波数を有し、４７個の遺伝子は４個以上のＳＤであった（図１８ａ）。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ（Ｋ−Ｓ）試験を用いて、これらの１０２個の高度に突然変異した遺伝子が無作為にゲノム全体に分布していないことを実証した（Ｐ＜０．０１）（図１８Ｂ）。これは、ざ瘡菌が進化のリスク管理戦略を有することを示唆している。Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ（ＣＯＧ）のカテゴリに基づいて、これらの１０２個の遺伝子の機能は、コア領域内の１，８８８個の遺伝子全てのものと類似の分布を示した。これらの頻繁に変異する遺伝子における特定の機能カテゴリの富化は存在しなかった。
コア領域内の突然変異が、１，８８８個の遺伝子についての非同義（ＮＳ）に対する同義（Ｓ）ＳＮＰの割合を計算することにより、選択下にあるかどうかが更に判定された。ＮＳ突然変異の平均率は３８％であった。１，８８８個の遺伝子のうち、５４個の遺伝子は３個以上のＳＤと高いＮＳ突然変異率を有し、１３個の遺伝子は４個以上のＳＤを有した（図１８Ｃ）。これらの６７個の遺伝子は、ゲノム中に無作為に分布し、一部の領域で特に富化されてはいなかった（Ｋ−Ｓ試験でＰ＞０．０５）（図１８ｄ）。高いＳＮＰの頻度を伴う１０２個の遺伝子のほとんどは、これらの６７個の遺伝子と重複しておらず、独立した進化的イベントがこれらの遺伝子の変更につながり得ることを示唆している。１０個の遺伝子のみが、全てが仮想タンパク質として注釈付けされた、高いＳＮＰ頻度および高いＮＳ突然変異率の両方を有していた。
同じ個人から単離された菌株の進化的関係
ざ瘡患者および健康な個人のコホートから単離された多数のざ瘡菌の菌株は、同じ個人の毛包内のざ瘡菌の菌株がクローン性であるかの調査を可能にした。以前のメタゲノム解析に基づいて、ほとんどの個人が異なる系統（４）の複数のざ瘡菌の菌株を保有することが実証された。しかし、同じ個人の同じ系統の菌株が同じ祖先に由来するかは不明であった。同じ試料から単離された菌株のゲノム配列は、同じ個人の菌株（ＳＳＩ）がクローン拡張を介して同じ起源から進化したかを検査することを可能にした。６９個の配列決定されたざ瘡菌の菌株は、４９個のＳＳＩを含む：１３組のデュエット（すなわち、１３人の個人から単離された菌株の１３組のペア）、５組のトリオ、および２組のカルテット。２３個のＳＳＩは、同じ分岐群中（分岐群ＩＡ−１中に９個、分岐群ＩＡ−２中に４個、分岐群ＩＢ−１中に２個、分岐群ＩＢ−２中に６個、分岐群ＩＩ中に２個）でクラスタ化された。ＳＳＩの各ペア間の距離（コア領域内の１２３，２２３個のＳＮＰ部位における置換率）が算出された（図１６）。分岐群ＩＡ−１のＳＳＩの平均距離は、０．００１４であったが、一方、分岐群ＩＡ−１内の異なる個人の菌株の平均距離は、０．００６４（Ｐ＜０．００１）であった。一貫した結果が、ＩＡ−２、ＩＢ−１、ＩＢ−２、およびＩＩを含む他の分岐群中に観察された（図１９ａ）。これは、同じ系統のＳＳＩが、異なる個人から単離された菌株よりも互いに大幅により類似することを実証し、それらが各個人においてクローン性であることを示唆した。しかし、分岐群ＩＡ−２内のＲＴ４およびＲＴ５菌株の中で、ＳＳＩの間の平均距離（０．０００４）は、異なる個人（０．００１７）（Ｐ＝０．０７２）の菌株の間の平均距離から大幅に異なることはなかった。更に、異なる個人のＲＴ４／ＲＴ５菌株間の平均距離（０．００１７）は、分岐群ＩＡ−１内のＳＳＩ間の平均距離（０．００１４）に類似しており、分岐群ＩＢ−１（０．００５９）、ＩＢ−２（０．００１９）、およびＩＩ（０．００２２）内のＳＳＩ間の平均距離よりなお短い（図Ｓ３Ａ）。これは、異なる個人から単離されているが、これらのＲＴ４およびＲＴ５菌株はクローン性であるように見え、同じ最近の祖先から進化したことを示唆している。分岐群ＩＣ内の２個のＲＴ５菌株間の同様の関係が認められ、異なる個人から単離されたＨＬ０９７ＰＡ１およびＰＲＰ−３８は、０．００１２の距離で密接に互いに関連していた。メタゲノム研究は、ざ瘡とＲＴ４およびＲＴ５の菌株の強い関連性を実証した（４）。異なる個人から単離されたこれらの菌株のクローンは、ＲＴ４およびＲＴ５菌株が個人間で伝染され得ることを示唆している。この知見は、抗生物質耐性プロピオニバクテリアは、抗生物質耐性ざ瘡菌の菌株のほとんどがＲＴ４およびＲＴ５（４、１３）に属しているので、皮膚科医を含め、ざ瘡を起こしやすい個人（２６）間で伝染性であったという以前の臨床報告と一致している。ＳＳＩの解析は、ＲＴ４およびＲＴ５菌株がざ瘡中の病原要因であり得るという理論を更に裏付けている。
同じ個人からであるが異なる系統に属する菌株のペア間の距離がランダムな菌株のペアとは異なっているかどうかを判定するために、異なる分岐群の任意のペアのＳＳＩの距離が計算された。分岐群ＩＡ−１およびＩＡ−２の間のＳＳＩの平均距離（すなわち、ＨＬ００５ＰＡ３対ＨＬ００５ＰＡ１、ＨＬ００５ＰＡ２対ＨＬ００５ＰＡ１、ＨＬ０９６ＰＡ３対ＨＬ０９６ＰＡ１、およびＨＬ０９６ＰＡ３対ＨＬ０９６ＰＡ２）は、０．０３９であり、異なる個人（０．０４０）からの分離株のそれに類似していた。同様の結果が、他の全ての分岐群ペアの比較について取得された（図１９ｂ）。
これらの結果は、異なる分岐群のＳＳＩが、異なる個人の菌株と同様に互いに異なっているということを実証した。この解析は、各個別のマイクロバイオーム中でざ瘡菌の菌株は、同じ集団におけるクローン拡張を経験するが、一方、複数の菌株集団は、多くの場合、ほとんど組み換えせずに同じ群集に共存できることを示唆している。
Ｉ型菌株における非コアゲノム領域
８２個のざ瘡菌の菌株のゲノム配列を比較することにより、８２個すべての菌株によって共有されなかった非コアゲノム領域が特定された。非コア領域の全長は約０．９０Ｍｂであった。非コア領域の平均ＧＣ含有量は、コア領域のそれ（５８％±６．９％）よりもわずかに低く、非コア領域の一部が、水平遺伝子伝達を介して他の種に由来し得ることを示唆していた。
ざ瘡菌の菌株の異なる系統が、異なる非コア領域を有する。非コア領域の階層的クラスタリングを使用して、同じリボタイプの菌株が分岐群間で異なる分離を伴いクラスタ化されたことが示された（図２０）。非コア領域の中で、各系統に特異的な遺伝的要素が特定され、これは、表現型ならびに健康および疾患における菌株の機能的違いを説明し得る。分岐群ＩＡ−２中でゲノム遺伝子座１、２および３が特定され、これは、主にＲＴ４およびＲＴ５菌株（４）に固有であった。これらの遺伝子座は、可動要素に由来するように見え、いくつかの悪性の遺伝子をコードし、これらの菌株のビルレンスに寄与し得る。一方で、ゲノムアイランド様クラスタ２（ＧＩ２）（１８）は、この分岐群内の菌株のほとんどで一意に不在であった。全てのＲＴ８菌株からなる分岐群ＩＢ−１はまた、我々のメタゲノム研究（４）に基づいたざ瘡に高度に関連していた。それらは全て、長さ２０Ｋｂの固有のゲノムアイランド（遺伝子座４）を有し、一連の非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードし、これは、これらの菌株の増大したビルレンスに寄与し得る。ほとんどのＲＴ３およびＲＴ１６菌株が、分岐群ＩＢ−２に属し、他の分岐群内の菌株よりも少ない非コア領域を有する。これは、全体の再編成ホットスポット（ＲＨＳ）ファミリータンパク質の欠如によって説明され得、これは、以前に大腸菌（２７）に関与したようにゲノム再編成において機能する。ＫＰＡ１７１２０２を含む３個の菌株からなる分岐群ＩＢ−３。以前に説明した４個のゲノムアイランドのうちの３個（１８）、ＧＩ１、ＧＩ３、およびＧＩ４は、この分岐群に固有であり、他の全ての菌株には存在しなかった。この解析は、ＫＰＡ１７１２０２はざ瘡菌の最初に配列決定された完全なゲノムであったが、主要な系統の１系統を表す一般的な皮膚のざ瘡菌の菌株には見えなかったことを示唆している。この結果は、ＭＬＳＴ（１１〜１３）を使用した以前の研究と一致している。分岐群ＩＣの菌株はＲＴ５に属する。それらはまた、分岐群ＩＡ−２のＲＴ４およびＲＴ５菌株の遺伝子座３に高い相同性を有し、クロストリジウムレプタム（４）に由来する粘着遺伝子座をコードする遺伝子座３、線状プラスミドを含む。一般に、異なる系統における菌株は、類似の遺伝物質の取得および喪失を伴い類似のゲノムサイズを有していたが、それらは、異なるビルレント特性を生じさせ得る異なる遺伝的要素を保有する。
ＩＩ型菌株における非コアゲノム領域
分岐群ＩＩにおける菌株、主にＲＴ２およびＲＴ６は、より離れて分岐群Ｉの菌株に関連していた。メタゲノム研究に基づき、ＲＴ２がざ瘡患者および健康な個人の間で均等に分布していたとき、分岐群ＩＩ中の菌株はざ瘡と関連していなかったが、一方、ＲＴ６は健康な個人（４）に大幅に富化されていた。Ｉ型の菌株と比較して、ＲＴ２およびＲＴ６菌株のゲノムは、長さが合計約９２Ｋｂで、１０７個のＯＲＦをコードするいくつかの領域を欠いている。ＲＴ２およびＲＴ６ゲノムは、９３個のＯＲＦをコードする類似のサイズの追加のゲノム領域を有する（図２０）。ＣＯＧ分類に基づいて、１０７個のＩ型に特異的なＯＲＦおよび９３個のＩＩ型に特異的なＯＲＦの間の機能的カテゴリの分布に有意差はなかった。
ＲＴ２およびＲＴ６菌株の最も固有のゲノム機能は、クラスタ化された定期的な間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＡＳ遺伝子座（４）によって表される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、配列特異的に核酸を標的化することによって、ウイルスおよびプラスミドに対する獲得された細菌の耐性を提供する（２８）。すべての配列決定されたＲＴ２およびＲＴ６の菌株は、完全な１組のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子ならびに少なくとも１個の反復およびスペーサ配列をコードしたが、他のリボタイプの菌株は全くしなかった。その完全なゲノム配列（２０）に基づいて、菌株ＡＴＣＣ１１８２８は、例外であるように見え、末端配列のみを有し、スペーサ配列は全く有さなかった。しかし、ＰＣＲおよび配列決定を使用して、ＡＴＣＣ１１８２８が１個の反復スペーサ配列を有することが判定された（表Ｓ２）。
４８個のスペーサ配列の合計が、１１個のＲＴ２およびＲＴ６の菌株に見られ、そのうちの２９個が固有であった。他の細菌種において、リーダ近位端のスペーサはより多様化される一方で、リーダ遠位端のスペーサは菌株間でより保存されることが実験的に計算によって確立された。ＲＴ２およびＲＴ６の菌株の共有スペーサ配列に基づいたＲＴ２およびＲＴ６の菌株間の進化的関係が解析された。分岐群ＩＩに緊密にクラスタ化されたＨＬ０６０ＰＡ１およびＨＬ０８２ＰＡ２は、同じスペーサＳ２を共有した（図２１）。Ｊ１３９、ＡＴＣＣ１１８２８、ＨＬ１１０ＰＡ４、ＨＬ１１０ＰＡ３、およびＨＬ２０２ＰＡ１は、同じスペーサＳ１７およびＳ１８を共有した（図２１）。これらの結果は、菌株のこれらの群が、おそらく追加のスペーサを獲得する前に同じ祖先から進化したことを示唆している。共有されるＣＲＩＳＰＲスペーサに基づく菌株間の関係は、コア領域におけるＳＮＰに基づいて算出された系統発生関係と一致している。加えて、複数のＩＩ型菌株は、主にざ瘡と関連するＲＴ４およびＲＴ５の菌株（４）に固有であった遺伝子座２および３中の配列に一致するスペーサ配列を保有した。遺伝子座２および３中の配列は、Ｃ．レプタムに由来するように見え、潜在的なビルレンス要因（図Ｓ４）をコードする。これらの遺伝子座は、ＲＴ４およびＲＴ５の菌株によって取得され得たが、これらのスペーサをコードするＲＴ２およびＲＴ６のゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ機構を介した外来のＤＮＡの侵入を防ぐことができる場合がある。
多数の高品質のドラフトゲノム配列が大きなゲノムの変異のみならず、小さいが不可欠なゲノムの変化をも検出することを可能にした。ＩＩ型の菌株が低減されたリパーゼ活性（１０）を示したことが以前報告された。リパーゼは、トリグリセリドを加水分解するおよび遊離脂肪酸を放出するように機能し、これは、ざ瘡菌のビルレンスに不可欠であると考えられている。ゲノム注釈に基づいて、１３個の遺伝子は、リパーゼの潜在的な機能を特定した（図２２ａ）。これらのうち、１個のヌクレオチドから１３個のヌクレオチドの範囲で検出された挿入／削除は、ＩＩ型菌株において減少したリパーゼ活性を説明し得る。２つのトリアシルグリセロールリパーゼは、ざ瘡菌のゲノム、ＨＭＰＲＥＦ０６７５−４８５５およびＨＭＰＲＥＦ０６７５−４８５６中で相前後して（ＳＫ１３７の注釈に従って）エンコードされた。すべてのＩＩ型の菌株およびＩＢ−３菌株が、第２のリパーゼ遺伝子ＨＭＰＲＥＦ０６７５−４８５６の開始コドンの「ＴＡＴＡボックス」２０ｂｐ上流の削除を有していた（図２２ｂ）。加えて、フレームシフトおよび中途終止コドンの導入につながる第２のリパーゼ遺伝子の１２４Ｇの位置に１個のヌクレオチド削除が存在した。これら２つの削除は、低減したリパーゼ活性を潜在的に説明し得、従って、以前の研究（４、１０）においてＩＩ型の菌株中で観察されたざ瘡のビルレンスを低減させた。
ＩＩＩ型の菌株における非コアゲノム領域
ＩＩＩ型の菌株は、皮膚表面上にほとんど見られない。難治性歯内病変、ＨＬ２０１ＰＡ１から分離されたＩＩＩ型ざ瘡菌の菌株は、配列決定された。この最初の入手可能なＩＩＩ型ゲノムは、この系統に特異的な遺伝的要素の特定を可能にした。ＩおよびＩＩ型菌株型に比べ、ＨＬ２０１ＰＡ１のゲノムは、長さが合計４３Ｋｂで、少数の領域を欠いている（図２０）。嫌気性ジメチルスルホキシドレダクターゼ（ＰＰＡ０５１６−ＰＰＡ０５１７）、鉄（ＩＩＩ）ジクエン酸塩伝達システムパーミアーゼ（ＰＰＡ０７９２−ＰＰＡ０７９３）、３−イソプロピルりんご酸デヒドラターゼ（ＰＰＡ１３６１−ＰＰＡ１３６３）、およびマルトース伝達系パーミアーゼ（ＰＰＡ１５５３−ＰＰＡ１５５４）を含む、これらの領域でコードされた４２個のＯＲＦが存在した。
考察
ハイスループットゲノム配列決定および大多数の関連する菌株の比較解析は、菌株レベルでのいくつかの病原体の広がりおよび小進化を研究するために使用され、これには、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（２９）、ストレプトコッカスニューモニエ（３０）、ハイチでのコレラ菌流行（３１）を含み、細菌性病原体の理解を改善させることで複数の菌株の比較ゲノム解析の力を実証している。しかし、この手法は、異なる菌株の間でのそれらの多様なビルレント可能性ならびに健康および疾患の両方におけるそれらの役割を理解するように利共生種を研究するためにほとんど適用されていない。
本研究では、多数の配列決定された菌株に基づく主要な皮膚利共生のざ瘡菌の比較ゲノム解析を提示する。この菌株の収集は、健康な皮膚またはざ瘡のいずれかと関連する菌株のみならず、同じ個人の単離された多数の菌株のペアをも含む。これは、病気対疾患に関連したざ瘡の菌株ならびに同じ個人のマイクロバイオームにおける菌株の系統発生関係および小進化の比較を可能にした。
８２個のざ瘡菌のゲノムを比較することにより、全てのざ瘡菌の菌株は、類似のＧＣ含有量と類似のゲノムサイズを有し、平均で２，５７７個のＯＲＦをコードしたことが示された（表１）。ざ瘡菌は、他の多くのオープンゲノム種（２４）とは異なり、オープン汎ゲノムを有しているが、それはゲノム当たりに添加される少数の新しい遺伝子のみを用いてゲノムの拡張を制限している（図１３および１４）。ゲノムの拡張率は、主要な系統内で類似している（図１７）。異なったざ瘡菌の菌株間の制限された組み換えが存在し、従って、１６Ｓ ｒＲＮＡリボタイプは、ざ瘡菌の菌株の特定および分類のためのプロキシとして使用することができる（図１６）。他のタイプ分類方法に比べて、１６Ｓリボタイプ分類は、ｒｅｃＡタイプ分類よりもはるかに高い解像度を有しており、従来のＭＬＳＴ法よりもはるかに簡単で高速である。この方法は、次世代配列決定と組み合わせることにより、ハイスループット方法で適用することができ、従って、菌株レベル（４）でマイクロバイオームの変化を検出することを可能にする。人間のマイクロバイオームの菌株レベルの変動を特定し理解することが医学的に重要であるので、これは、有利であり、重要である。
同じ個人の試料から単離された数組の菌株のゲノムが比較された（図１６および１９）。このゲノムデータの収集は固有のものであり、本研究のような種類のものは、個人のマイクロバイオーム内の人間の利共生の小進化を調査するために実施されていない。複数のざ瘡菌の菌株集団は、同じ個人のマイクロバイオーム内に共存していたが、一方、クローン拡張は、異なる集団間でほとんど組み換えなしに各集団内で発生することが分かった。各系統内では、同じ個人から単離された菌株は、疾患と関連する菌株、ＲＴ４およびＲＴ５の菌株を除いて、異なる個人の菌株よりも互いにかなり多く類似していた（図１９）。異なる個人から単離されたが、それらはクローン性で、同じビルレント祖先菌株から進化したように見えた（図１６）。これは、これらの菌株は、伝染性であったこと（２６）、それらはざ瘡病原（４）においてある役割を果たし得るという観察を裏付ける。この知見は重要であり、抗生物質耐性菌株の広がりを制御して、かつざ瘡のための新しい標的療法を開発するのに役立つであろう。
非コア領域を解析することにより、各系統に特異的なゲノム要素および変更が特定された（図２０）。これらの系統特異的要素は、菌株に異なる生理的および機能的特性をレンダリングし得、従って、健康における利共生として、または疾患における病原体としての異なる役割につながる。ざ瘡と関連する菌株のうち、ＲＴ４およびＲＴ５菌株は、可動要素に由来する３つの異なる遺伝子座をコードし、ＲＴ８の菌株は、１組のＮＲＰを含有する異なる領域をコードする。これらの菌株に特異的な領域内でコードされたビルレント遺伝子は、ざ瘡とこれらの菌株の関連を説明し得、これらの菌株を標的化した新薬の開発に役立ち得る。ざ瘡に関連せず、健康な皮膚で富化されたＲＴ２およびＲＴ６の菌株はそれぞれすべて、ＣＲＩＳＰＲは／ｃａｓ要素をコードする。ＣＲＩＳＰＲ機構は、これらの菌株が、外来の可動要素に侵入することでビルレント遺伝子を取得することを妨げ得る。加えて、これらの菌株は、脂質代謝を変化させ得、それらのビルレンス（図２２）を低減し得るリパーゼにおけるゲノムの変化を含有する。
結論として、多数のゲノムを有するざ瘡菌の遺伝的景観および多様性を特徴づけることにより、ざ瘡菌の菌株の多様な表現型を説明し得るゲノムの証拠と人間の皮膚の健康および疾患における利共生の二重の役割への新たな洞察とが提供される。この比較ゲノム解析からの知見は、人間のマイクロバイオームにおける菌株の多様性および利共生の進化に関する新たな視点を提供する。多くの現在のマイクロバイオームの研究は、健康および疾患を有する微生物群集の関連に焦点を当てているが、本研究は、菌株レベル（２５）での利共生マイクロバイオームを理解することの重要性を強調する。この研究の知見はまた、ざ瘡のための新しい菌株特異的治療薬および疾患と関連する他のざ瘡菌に光を当てる。
材料および方法
ざ瘡菌の菌株
配列決定された６９個のざ瘡菌の菌株のうち、６７個は、ざ瘡患者および健康な個人（４）からの皮膚の微小面皰試料から単離された。他の２個の菌株、ＨＬ２０１ＰＡ１およびＨＬ２０２ＰＡ１は、Ｋｉｎｇ’ｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ＬｏｎｄｏｎでＤａｖｉｄ Ｂｅｉｇｈｔｏｎ氏が提供する難治性歯内病変（２３）から単離された。
全てのゲノムショットガン配列決定、アセンブリ、および注釈
ＨＬ０４２ＰＡ３のゲノムは、Ｒｏｃｈｅ／４５４ＦＬＸを用いて配列決定され、ＰＨＲＡＰ／ＣＯＮＳＥＤ（３２）およびＧＳＭＡＰＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ）の組み合わせを用いて組み立てられた。ＨＬ２０１ＰＡ１およびＨＬ２０２ＰＡ１は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（２５０ｂｐ、ペアエンド）を使用して配列決定され、Ｖｅｌｖｅｔ（３３）を使用して組み立てられた。残りの６６個のゲノムは、説明したように以前に配列決定された（４）。コード配列は、ＧｅｎｅＭａｒｋ（３４）およびＧＬＩＭＭＥＲ（３５）を用いて予測された。
コア領域、非コア領域、および汎ゲノムの算出
コア領域は、８２個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義されたが、一方、非コア領域は、すべてのゲノム中に存在しなかったゲノム配列として定義された。ＫＰＡ１７１２０２は、参照ゲノムとして使用された。他の８１個のゲノム配列（ほとんどのゲノムおよび１０個の完全なゲノム内の一連のコンティグ）の各々は、Ｎｕｃｍｅｒ（３６）を使用して参照ゲノムにマッピングされた。Ｎｕｃｍｅｒプログラムの８１個の「．ｃｏｏｒｄｓ」出力ファイルは全て、Ｐｅｒｌスクリプトを使用したＫＰＡ１７１２０２座標に基づいて重複領域を特定するために解析された。次いで、コア配列は、上で算出された座標を有するＫＰＡ１７１２０２のゲノム配列に基づいて抽出された。
各ゲノムの固有の領域は、元の配列に加えて固有のゲノム配列を含有する「改訂」参照ゲノムを作るように参照ゲノムに添加された。全てのゲノムの全て固有の領域が汎ゲノムに含まれるまで、このプロセスは、全てのゲノムについて繰り返された。
最後に、コア領域が、汎ゲノムから差し引かれた。残りの領域は、すべての菌株によって共有されない非コア領域として定義された。タンパク質をコードする配列は、参照ファイルとしてＫＰＡ１７１２０２を使用してＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍによって予測された。
コア領域におけるＳＮＰの特定
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、デフォルトの設定（３６）でＮｕｃｍｅｒプログラムのユーティリティオプション「ｓｈｏｗ−ｓｎｐｓ」を用いて特定された。ＫＰＡ１７１２０２のゲノム配列は、参照ゲノムとして使用された。Ｎｕｃｍｅｒプログラムの８１個の「．ｓｎｐｓ」出力ファイルは全て、Ｐｅｒｌスクリプトを使用したＫＰＡ１７１２０２座標に基づいて固有のＳＮＰ位置を特定するために解析された。
系統樹の構築
コア領域における１２３，２２３個のＳＮＰヌクレオチドのうちの８２個の連結配列が、ざ瘡菌ゲノムの系統樹を構築するために使用された。ＭＥＧＡ５（３７）が、近隣結合法およびｐ距離法を用いてコア領域内のＳＮＰに基づいて距離を算出するために使用された。２００個の複製から推測されたブートストラップ樹が採取された。
ＭＬＳＴスキームに基づいた配列のタイプ解析
８２個の分離株の配列型は、以前に公開されたＭＬＳＴスキームに基づいて判定された（１１〜１３）。ＭＬＳＴ遺伝子配列は、２個のＭＬＳＴスキームで使用された全ての対立遺伝子に対してＢＬＡＳＴを使用して位置合わせされた。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの特定
ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ（３８）が、ＣＲＩＳＰＲ反復スペーサ配列を特定するために使用された。ＨＬ１１０ＰＡ３の注釈は、ＨＬ００１ＰＡ１、ＨＬ０６０ＰＡ１、ＨＬ０４２ＰＡ３、ＨＬ０８２ＰＡ２、ＨＬ１０３ＰＡ１、ＨＬ１０６ＰＡ１、ＨＬ１１０ＰＡ４、ＨＬ２０２ＰＡ１、Ｊ１３９、およびＡＴＣＣ１１８２８の菌株におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの構造とＣＲＩＳＰＲ反復スペーサ配列の存在とを特定するために、ＢＬＡＳＴの位置合わせのために使用された。各スペーサ配列は、ＮＣＢＩの非冗長ヌクレオチドデータベースおよび参照ゲノム配列データベース（ｒｅｆｓｅｑ＿ｇｅｎｏｍｉｃ）に対してＢＬＡＳＴ（３９）によって注釈付けされた。
非コア領域の階層的クラスタリング解析
１，６８５個の非コア断片（合計８９５，９０５ｂｐ）のうち、５００ｂｐを超える長さの３１４個の非コア断片（合計７４７，１８９ｂｐ、すべての非コア領域の８３％に相当）が抽出され、非コア領域の階層的クラスタリングに使用された。クラスタ３．０プログラム（４０）および平均リンケージ法が使用された。クラスタリング行列は３１４行および８２列で構成され、その中で、１は非コア領域の存在を示し、０は非コア領域の不在を示す。Ｊａｖａ（登録商標） ＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（４１）が、クラスタリング結果を表示するために使用された。
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８． ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｖａｌａｎｎｅ Ｓ， Ｒａｍａｇｅ Ｇ， Ｔｕｎｎｅｙ ＭＭ， Ｇｌｅｎｎ ＪＶ， ＭｃＬｏｒｉｎａｎ ＧＣ， Ｂｈａｔｉａ Ａ， Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ ＪＦ， Ｌｏｄｅｓ Ｍ， Ｐｅｒｓｉｎｇ ＤＨ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ． ２００５． Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｔｙｐｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｒｏｕｐｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４３：３２６−３３４．
９． Ｖａｌａｎｎｅ Ｓ， ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｒａｍａｇｅ Ｇ， Ｔｕｎｎｅｙ ＭＭ， Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ ＧＧ， Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｓ， Ｗｉｓｄｏｍ ＧＢ， Ｆａｉｒｌｅｙ Ｄ， Ｂｈａｔｉａ Ａ， Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ ＪＦ， Ｌｏｄｅｓ Ｍ， Ｐｅｒｓｉｎｇ ＤＨ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ． ２００５． ＣＡＭＰ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ： ａ ｎｅｗ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｙｐｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５１：１３６９−１３７９．
１０． ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｐｅｒｒｙ ＡＬ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＰＡ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ． ２００８． Ａ ｎｅｗ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：２１８−２２４．
１１． Ｌｏｍｈｏｌｔ ＨＢ， Ｋｉｌｉａｎ Ｍ． ２０１０． Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｃｌｏｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｎｅ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１２２７７．
１２． ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｇａｏ Ａ， Ｂａｒｎａｒｄ Ｅ， Ｆｉｎｋ Ｃ， Ｍｕｒｒａｙ ＰＩ， Ｄｏｗｓｏｎ ＣＧ， Ｎａｇｙ Ｉ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＰＡ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ． ２０１１． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５７：１９９０−２００３．
１３． ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｂａｒｎａｒｄ Ｅ， Ｎａｇｙ Ｉ， Ｇａｏ Ａ， Ｔｏｍｉｄａ Ｓ， Ｌｉ Ｈ， Ｅａｄｙ Ａ， Ｃｏｖｅ Ｊ， Ｎｏｒｄ ＣＥ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ． ２０１２． Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ： Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ’Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ’， ’Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ’ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔｒａｉｎｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４１４８０．
１４． Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｈ， Ｈｅｎｎｅ Ａ， Ｈｏｓｔｅｒ Ｆ， Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ Ｈ， Ｗｉｅｚｅｒ Ａ， Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ Ａ， Ｈｕｊｅｒ Ｓ， Ｄｕｒｒｅ Ｐ， Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｇ． ２００４． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ， ａ ｃｏｍｍｅｎｓａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：６７１−６７３．
１５． Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． ２０１２． Ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｎａｔｕｒｅ ４８６：２１５−２２１．
１６． Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． ２０１２． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４８６：２０７−２１４．
１７． Ｎｅｌｓｏｎ ＫＥ， Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ ＧＭ， Ｈｉｇｈｌａｎｄｅｒ ＳＫ， Ｗｏｒｌｅｙ ＫＣ， Ｃｒｅａｓｙ ＨＨ， Ｗｏｒｔｍａｎ ＪＲ， Ｒｕｓｃｈ ＤＢ， Ｍｉｔｒｅｖａ Ｍ， Ｓｏｄｅｒｇｒｅｎ Ｅ， Ｃｈｉｎｗａｌｌａ ＡＴ， Ｆｅｌｄｇａｒｄｅｎ Ｍ， Ｇｅｖｅｒｓ Ｄ， Ｈａａｓ ＢＪ， Ｍａｄｕｐｕ Ｒ， Ｗａｒｄ ＤＶ， Ｂｉｒｒｅｎ ＢＷ， Ｇｉｂｂｓ ＲＡ， Ｍｅｔｈｅ Ｂ， Ｐｅｔｒｏｓｉｎｏ ＪＦ， Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ＲＬ， Ｓｕｔｔｏｎ ＧＧ， Ｗｈｉｔｅ ＯＲ， Ｗｉｌｓｏｎ ＲＫ， Ｄｕｒｋｉｎ Ｓ， Ｇｉｇｌｉｏ ＭＧ， Ｇｕｊｊａ Ｓ， Ｈｏｗａｒｔｈ Ｃ， Ｋｏｄｉｒａ ＣＤ， Ｋｙｒｐｉｄｅｓ Ｎ， Ｍｅｈｔａ Ｔ， Ｍｕｚｎｙ ＤＭ， Ｐｅａｒｓｏｎ Ｍ， Ｐｅｐｉｎ Ｋ， Ｐａｔｉ Ａ， Ｑｉｎ Ｘ， Ｙａｎｄａｖａ Ｃ， Ｚｅｎｇ Ｑ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｂｅｒｌｉｎ ＡＭ， Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｈｅｐｂｕｒｎ ＴＡ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊ， ＭｃＣｏｒｒｉｓｏｎ Ｊ， Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ， Ｍｉｎｘ Ｐ， Ｎｕｓｂａｕｍ Ｃ， Ｒｕｓｓ Ｃ， Ｓｙｋｅｓ ＳＭ， Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＣＭ， Ｙｏｕｎｇ Ｓ， Ｗａｒｒｅｎ ＷＣ， Ｂａｄｇｅｒ Ｊ， Ｃｒａｂｔｒｅｅ Ｊ， Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ＶＭ， Ｏｒｖｉｓ Ｊ， Ｃｒｅｅ Ａ， Ｆｅｒｒｉｅｒａ Ｓ， Ｆｕｌｔｏｎ ＬＬ， Ｆｕｌｔｏｎ ＲＳ， Ｇｉｌｌｉｓ Ｍ， Ｈｅｍｐｈｉｌｌ ＬＤ， Ｊｏｓｈｉ Ｖ， Ｋｏｖａｒ Ｃ， Ｔｏｒｒａｌｂａ Ｍ， Ｗｅｔｔｅｒｓｔｒａｎｄ ＫＡ， Ａｂｏｕｅｌｌｌｅｉｌ Ａ， Ｗｏｌｌａｍ ＡＭ， Ｂｕｈａｙ ＣＪ， Ｄｉｎｇ Ｙ， Ｄｕｇａｎ Ｓ， ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＭＧ， Ｈｏｌｄｅｒ Ｍ， Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ Ｊ， Ｃｌｉｆｔｏｎ ＳＷ， Ａｌｌｅｎ−Ｖｅｒｃｏｅ Ｅ， Ｅａｒｌ ＡＭ， Ｆａｒｍｅｒ ＣＮ， Ｌｉｏｌｉｏｓ Ｋ， Ｓｕｒｅｔｔｅ ＭＧ， Ｘｕ Ｑ， Ｐｏｈｌ Ｃ， Ｗｉｌｃｚｅｋ−Ｂｏｎｅｙ Ｋ， Ｚｈｕ Ｄ． ２０１０． Ａ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８：９９４−９９９．
１８． Ｂｒｚｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚ Ｅ， Ｗｅｉｎｅｒ Ｊ， Ｗｏｌｌｈｅｒｒ Ａ， Ｔｈｕｒｍｅｒ Ａ， Ｈｕｐｅｄｅｎ Ｊ， Ｌｏｍｈｏｌｔ ＨＢ， Ｋｉｌｉａｎ Ｍ， Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｇ， Ｄａｎｉｅｌ Ｒ， Ｍｏｌｌｅｎｋｏｐｆ ＨＪ， Ｍｅｙｅｒ ＴＦ， Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｈ． ２０１１． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２１５８１．
１９． Ｈｕｎｙａｄｋｕｒｔｉ Ｊ， Ｆｅｌｔｏｔｉ Ｚ， Ｈｏｒｖａｔｈ Ｂ， Ｎａｇｙｍｉｈａｌｙ Ｍ， Ｖｏｒｏｓ Ａ， ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ， Ｕｒｂａｎ Ｅ， Ｎａｇｙ Ｉ． ２０１１． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｔｙｐｅ ＩＢ ｓｔｒａｉｎ ６６０９． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９３：４５６１−４５６２．
２０． Ｈｏｒｖａｔｈ Ｂ， Ｈｕｎｙａｄｋｕｒｔｉ Ｊ， Ｖｏｒｏｓ Ａ， Ｆｅｋｅｔｅ Ｃ， Ｕｒｂａｎ Ｅ， Ｋｅｍｅｎｙ Ｌ， Ｎａｇｙ Ｉ． ２０１２． Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ １１８２８． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９４：２０２−２０３．
２１． Ｖｏｒｏｓ Ａ， Ｈｏｒｖａｔｈ Ｂ， Ｈｕｎｙａｄｋｕｒｔｉ Ｊ， ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｂａｒｎａｒｄ Ｅ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ， Ｎａｇｙ Ｉ． ２０１２． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＡ（２） ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９４：１６２１−１６２２．
２２． ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ａ， Ｈｕｎｙａｄｋｕｒｔｉ Ｊ， Ｈｏｒｖａｔｈ Ｂ， Ｖｏｒｏｓ Ａ， Ｂａｒｎａｒｄ Ｅ， Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ， Ｎａｇｙ Ｉ． ２０１２． Ｄｒａｆｔ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ， ＰＲＰ−３８， ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ ＩＣ ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９４：３２６０−３２６１．
２３． Ｎｉａｚｉ ＳＡ， Ｃｌａｒｋｅ Ｄ， Ｄｏ Ｔ， Ｇｉｌｂｅｒｔ ＳＣ， Ｍａｎｎｏｃｃｉ Ｆ， Ｂｅｉｇｈｔｏｎ Ｄ． ２０１０． Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ａｎｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｒｅ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４８：３８５９−３８６９．
２４． Ｔｅｔｔｅｌｉｎ Ｈ， Ｒｉｌｅｙ Ｄ， Ｃａｔｔｕｔｏ Ｃ， Ｍｅｄｉｎｉ Ｄ． ２００８． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ： ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｎ−ｇｅｎｏｍｅ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１：４７２−４７７．
２５． Ｓｃｈｌｏｉｓｓｎｉｇ Ｓ， Ａｒｕｍｕｇａｍ Ｍ， Ｓｕｎａｇａｗａ Ｓ， Ｍｉｔｒｅｖａ Ｍ， Ｔａｐ Ｊ， Ｚｈｕ Ａ， Ｗａｌｌｅｒ Ａ， Ｍｅｎｄｅ ＤＲ， Ｋｕｌｔｉｍａ ＪＲ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ， Ｋｏｔａ Ｋ， Ｓｕｎｙａｅｖ ＳＲ， Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ ＧＭ， Ｂｏｒｋ Ｐ． ２０１３． Ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４９３：４５−５０．
２６． Ｒｏｓｓ ＪＩ， Ｓｎｅｌｌｉｎｇ ＡＭ， Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｅ， Ｃｏａｔｅｓ Ｐ， Ｃｕｎｌｉｆｆｅ ＷＪ， Ｂｅｔｔｏｌｉ Ｖ， Ｔｏｓｔｉ Ｇ， Ｋａｔｓａｍｂａｓ Ａ， Ｇａｌｖａｎ Ｐｅｒｅｚ Ｄｅｌ Ｐｕｌｇａｒ ＪＩ， Ｒｏｌｌｍａｎ Ｏ， Ｔｏｒｏｋ Ｌ， Ｅａｄｙ ＥＡ， Ｃｏｖｅ ＪＨ． ２００３． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｎｅ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｅｕｒｏｐｅ． Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １４８：４６７−４７８．
２７． Ｊａｃｋｓｏｎ ＡＰ， Ｔｈｏｍａｓ ＧＨ， Ｐａｒｋｈｉｌｌ Ｊ， Ｔｈｏｍｓｏｎ ＮＲ． ２００９． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ （ｒｈｓ） ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：５８４．
２８． Ｈｏｒｖａｔｈ Ｐ， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ Ｒ． ２０１０． ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ， ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−１７０．
２９． Ｈａｒｒｉｓ ＳＲ， Ｆｅｉｌ ＥＪ， Ｈｏｌｄｅｎ ＭＴ， Ｑｕａｉｌ ＭＡ， Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ＥＫ， Ｃｈａｎｔｒａｔｉｔａ Ｎ， Ｇａｒｄｅｔｅ Ｓ， Ｔａｖａｒｅｓ Ａ， Ｄａｙ Ｎ， Ｌｉｎｄｓａｙ ＪＡ， Ｅｄｇｅｗｏｒｔｈ ＪＤ， ｄｅ Ｌｅｎｃａｓｔｒｅ Ｈ， Ｐａｒｋｈｉｌｌ Ｊ， Ｐｅａｃｏｃｋ ＳＪ， Ｂｅｎｔｌｅｙ ＳＤ． ２０１０． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＭＲＳＡ ｄｕｒｉｎｇ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ ｓｐｒｅａｄ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：４６９−４７４．
３０． Ｃｒｏｕｃｈｅｒ ＮＪ， Ｈａｒｒｉｓ ＳＲ， Ｆｒａｓｅｒ Ｃ， Ｑｕａｉｌ ＭＡ， Ｂｕｒｔｏｎ Ｊ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ Ｍ， ＭｃＧｅｅ Ｌ， ｖｏｎ Ｇｏｔｔｂｅｒｇ Ａ， Ｓｏｎｇ ＪＨ， Ｋｏ ＫＳ， Ｐｉｃｈｏｎ Ｂ， Ｂａｋｅｒ Ｓ， Ｐａｒｒｙ ＣＭ， Ｌａｍｂｅｒｔｓｅｎ ＬＭ， Ｓｈａｈｉｎａｓ Ｄ， Ｐｉｌｌａｉ ＤＲ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＴＪ， Ｄｏｕｇａｎ Ｇ， Ｔｏｍａｓｚ Ａ， Ｋｌｕｇｍａｎ ＫＰ， Ｐａｒｋｈｉｌｌ Ｊ， Ｈａｎａｇｅ ＷＰ， Ｂｅｎｔｌｅｙ ＳＤ． ２０１１． Ｒａｐｉｄ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３１：４３０−４３４．
３１． Ｃｈｉｎ ＣＳ， Ｓｏｒｅｎｓｏｎ Ｊ， Ｈａｒｒｉｓ ＪＢ， Ｒｏｂｉｎｓ ＷＰ， Ｃｈａｒｌｅｓ ＲＣ， Ｊｅａｎ−Ｃｈａｒｌｅｓ ＲＲ， Ｂｕｌｌａｒｄ Ｊ， Ｗｅｂｓｔｅｒ ＤＲ， Ｋａｓａｒｓｋｉｓ Ａ， Ｐｅｌｕｓｏ Ｐ， Ｐａｘｉｎｏｓ ＥＥ， Ｙａｍａｉｃｈｉ Ｙ， Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ ＳＢ， Ｍｅｋａｌａｎｏｓ ＪＪ， Ｓｃｈａｄｔ ＥＥ， Ｗａｌｄｏｒ ＭＫ． ２０１１． Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｉｔｉａｎ ｃｈｏｌｅｒａ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｓｔｒａｉｎ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６４：３３−４２．
３２． Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ， Ａｂａｊｉａｎ Ｃ， Ｇｒｅｅｎ Ｐ． １９９８． Ｃｏｎｓｅｄ： ａ ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８：１９５−２０２．
３３． Ｚｅｒｂｉｎｏ ＤＲ， Ｂｉｒｎｅｙ Ｅ． ２００８． Ｖｅｌｖｅｔ： ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｕｓｉｎｇ ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ ｇｒａｐｈｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １８：８２１−８２９．
３４． Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ Ｍ， ＭｃＩｎｉｎｃｈ Ｊ． １９９３． Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３０：１６１−１７１．
３５． Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ， Ｄｅｌｃｈｅｒ ＡＬ， Ｋａｓｉｆ Ｓ， Ｗｈｉｔｅ Ｏ． １９９８． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６：５４４−５４８．
３６． Ｋｕｒｔｚ Ｓ， Ｐｈｉｌｌｉｐｐｙ Ａ， Ｄｅｌｃｈｅｒ ＡＬ， Ｓｍｏｏｔ Ｍ， Ｓｈｕｍｗａｙ Ｍ， Ａｎｔｏｎｅｓｃｕ Ｃ， Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ． ２００４． Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｏｐｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ５：Ｒ１２．
３７． Ｔａｍｕｒａ Ｋ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｄ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｎ， Ｓｔｅｃｈｅｒ Ｇ， Ｎｅｉ Ｍ， Ｋｕｍａｒ Ｓ． ２０１１． ＭＥＧＡ５： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ， ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｓｔａｎｃｅ， ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ２８：２７３１−２７３９．
３８． Ｇｒｉｓｓａ Ｉ， Ｖｅｒｇｎａｕｄ Ｇ， Ｐｏｕｒｃｅｌ Ｃ． ２００７． ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ： ａ ｗｅｂ ｔｏｏｌ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５：Ｗ５２−５７．
３９． Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ， Ｇｉｓｈ Ｗ， Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ， Ｍｙｅｒｓ ＥＷ， Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ． １９９０． Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０．
４０． ｄｅ Ｈｏｏｎ ＭＪ， Ｉｍｏｔｏ Ｓ， Ｎｏｌａｎ Ｊ， Ｍｉｙａｎｏ Ｓ． ２００４． Ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：１４５３−１４５４．
４１． Ｓａｌｄａｎｈａ ＡＪ． ２００４． Ｊａｖａ Ｔｒｅｅｖｉｅｗ−−ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：３２４６−３２４８．
実施例３−皮膚試料から微生物ＤＮＡの抽出
皮膚の微小面皰サンプリング
皮膚の微小面皰（白色面皰または黒色面皰）の試料が、特殊な粘着テープを使用して被験者の皮膚から採取された。粘着テープが上に置かれる前に、皮膚を水で湿らせた。テープは、乾燥するまで１５〜２０分間皮膚上に放置された。清潔な手袋が各サンプリングのために使用された。皮膚から取り外された後、テープは、５０ｍＬの無菌管内に配置された。これは、鼻、額、顎、および背中などの多くの皮膚部位に適用することができる。
細菌ＤＮＡ抽出
微小面皰が、無菌鉗子を用いて粘着鼻テープから個別に単離されまたは掻き取られ、緩衝液ＡＴＬ（Ｑｉａｇｅｎ）および直径０．１ｍｍのガラスビーズで充填された２ｍＬの無菌の微量遠心管内に配置された（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）。細胞を室温にて４，８００ｒｐｍで３分間ビードビータを用いて溶解した。５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清が回収され、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたゲノムＤＮＡ抽出のために使用された。チューインガムからＤＮＡを抽出するための製造業者のプロトコルが使用された。ゲノムＤＮＡの濃度は、分光光度計で判定された。
実施例４−マイクロバイオーム型検出
１６Ｓ ｒＤＮＡに基づく皮膚のマイクロバイオーム型を正確に検出するための詳細なプロトコル
ＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定
１６Ｓ ｒＤＮＡは、ユニバーサルプライマー８Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）および１５１０Ｒ（５’−ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いて増幅された。サーモサイクラー条件は以下の通りであった：５分間９４℃で初期変性ステップ、４５秒間９４℃で３０サイクルの変性、３０秒間５２℃でアニーリング、９０秒間７２℃で伸長、２０分間７２℃で最終伸長ステップ。ＰＣＲ生成物は、列ベース方法を使用して精製された。続いて、１６Ｓ ｒＤＮＡの単位複製配列は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングされた。Ｏｎｅ−Ｓｈｏｔ ＴＯＰ−１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、ベクターで形質転換され、選択培地上でめっきされた。個別の陽性コロニーが拾われ、選択的なＬＢ液体培地内に接種された。１４時間のインキュベーションの後、列ベースのプラスミド抽出キットまたは従来の方法のいずれかを使用して、プラスミドが抽出され、精製された。クローンは、サンガー配列決定法を使用して、双方向に配列決定された。各個人のマイクロバイオーム型は、上位１０位の主要リボタイプの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列データに基づいて判定された。図５および配列番号１〜１０を参照されたい。
ＰＣＲおよびｑＰＣＲに基づく皮膚のマイクロバイオーム型を迅速に検出するための詳細なプロトコル
６９個の新しいざ瘡菌のゲノムを配列決定するおよび注釈付けすることにより、かつ合計８２個のざ瘡菌のゲノムを比較することにより、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に固有であるいくつかのゲノム遺伝子座が特定された（すなわち、遺伝子座１〜４）。図８を参照されたい。全ての配列のざ瘡菌の菌株からの遺伝子座１、２、３、および４のゲノム配列、およびそれらの配列類似性（９５％〜１００％の範囲）はそれぞれ、配列番号１５〜１８として列挙される。
検出方法１
患者におけるＲＴ４およびＲＴ５の菌株の存在または不在を迅速に検出するために、遺伝子座１、２、および３を標的化する多重ＰＣＲが設計され、ざ瘡菌の菌株および皮膚試料から抽出したゲノムＤＮＡ上で実施された。図２３は、遺伝子座１、２、および３が、ゲノムデータに基づいて予測されるように様々なざ瘡菌の菌株から増幅されたことを示す。
ＰＣＲプライマー配列は表１に示される。
これらの遺伝子座を標的化する追加のプライマーは、遺伝子座１〜４（それぞれ、配列番号１５〜１８）のゲノム配列に基づいて設計することができる。各２０μＬの反応物は、１２．７μＬの分子グレードＨ２Ｏ、２μＬの１０Ｘハイフィデリティ緩衝液、０．６μＬで５０ｍＭの硫酸マグネシウム、０．４μＬで１０ｎＭのｄＮＴＰ、０．８μＬの各プライマー（最終プライマー濃度は、４００ｎＭである）、０．１μＬのプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ（すべての試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、および１μＬのｇＤＮＡテンプレート（約４０ｎｇのｇＤＮＡ）を含有する。サーモサイクラー条件は以下の通りである：１０分間９５℃で初期変性ステップ、各々が４５秒間９５℃、３０秒間６５℃、４５秒間７２℃から成る３５サイクル、１０分間７２℃で最終伸長ステップ。
皮膚試料のざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株の存在量を定量的に測定するために、遺伝子座１、２、および３を標的化した定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ざ瘡菌の菌株から抽出されたゲノムＤＮＡ上で実施された。図１２を参照されたい。ＬｉｇｈｔＣｙｌｅｒ ４８０ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒキットが使用された（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。各１０μＬの反応液は、５μＬのマスターミックス（２倍濃縮）、１μＬで２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５μＬで４μＭの順方向および逆方向プライマー、１μＬ〜３．５μＬのＤＮＡテンプレート（約２．５ｎｇのＤＮＡ）、およびその容量に至るまで分子グレードＨ２Ｏを含有する。サーモサイクラー条件は以下の通りであった：９５℃で１０分間の初期活性化ステップ、９５℃で１０秒間、（各々が、各後続のサイクル毎に段階的に０．５℃の低減を伴うが、第１のサイクルにおいて）６５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間からなる４０増幅サイクル、０．０２℃／秒のランプ速度および２５／℃の取得率を伴い６５℃で開始し、９９℃で終了する最終的な融解曲線ステップ。
プロトコルは、模擬試料を用いて試験され、異なるざ瘡菌の菌株は、実際の試料中に菌株集団分布を模倣するように異なる割合で混合していた。表２を参照されたい。
各遺伝子座の濃度は、遺伝子座１、遺伝子座２、Ｐａｋ ＰＣＲ単位複製配列から誘導される標準から定量化された。各遺伝子のコピー数は、従来のＰＣＲを用いてＴａｄＡ（遺伝子座３）およびＰａｋ単位複製配列から誘導されたゲノムＤＮＡ標準から定量化された。図２４を参照されたい。
検出方法２
ざ瘡菌タックマンｑＰＣＲアッセイ
プライマーおよびプローブ設計
ざ瘡菌の菌株および臨床試料中に遺伝子座１、２、３、および４を検出するためのプライマーおよびプローブが、表３に列挙されるように設計された。
三重タックマンｑＰＣＲは、すべてのざ瘡菌に存在する遺伝子座１、遺伝子座３、および内部統制、Ｐａｋを標的化するようにプロピオニバクテリウムに特異的なプライマーを用いて設計され、試験された。
遺伝子座１、遺伝子座３、およびＰａｋ増幅
ベンチトップ増幅は、設計されたプライマーの特異性を評価し、多重にする前に最適なサイクリング条件を判定するために実施された。増幅は、ＢｉｏＲａｄ Ｃ１０００熱サイクラーを用いて実施された。シングルプレックスＰＣＲの反応物は、０．２μＭの標的特異的なプライマー、１０Ｘ白金Ｔａｑ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＰＴ、０．５Ｕ／μｌのプラチナＴａｑポリメラーゼ、１μｌのＤＮＡテンプレートを含有し、最終容量１０μｌを構成した。サイクリングは以下の通りであった：５分間９４℃で初期変性、続いて３０秒間９４℃で３０サイクルの変性、３０秒間６０℃でアニーリング、３０秒間７２℃で延長、５分間７２℃で最終延長サイクル。増幅生成物は、標的の正確な増幅およびプライマー標的との種間反応を確認するように１％のアガロース／ＴＢＥゲル上で電気泳動的に解析された。
タックマン三重ＰＣＲ
三重ｑＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００ＨＴ機器を用いて実施された。１〜２μｌの試料ＤＮＡが、Ｘ２ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ多重ＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）、０．２μＭのプライマー、遺伝子座１＿Ｆ、遺伝子座１＿Ｒ、Ｐａｋ＿Ｆ、Ｐａｋ＿Ｒ、０．２μＭのプローブ、遺伝子座１＿プローブおよびＰａｋ＿プローブ、０．１μＭのプライマー遺伝子座３＿Ｆおよび遺伝子座３＿Ｒ、ならびに０．１μＭの遺伝子座３＿プローブを含有するマスターミックスに追加された。反応混合物は、無菌のＰＣＲグレード水で２０μｌの最終容積を構成した。ＰＣＲプログラムは、２分間５０℃での１サイクル、続いて、多重マスターミックスの活性化を可能にするための１５分間９５℃での１サイクル、その後、６０秒間９４℃でおよび９０秒間５７℃での４５サイクルからなっていた。各実行は、培養物から抽出されたざ瘡菌のＤＮＡの校正器、ならびに非鋳型制御（ＮＴＣ）および水制御を含有した。定量ＰＣＲは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲマスターミックスで供給される受動的参照、ＲＯＸで実行された。データは、ＳＤＳ ｖ２．４ソフトウェアを用いて解析された。
アッセイの較正、感度、および特異性
ざ瘡菌標的遺伝子座１およびＰａｋのための較正曲線は、純粋な培養物のざ瘡菌から抽出された定量化されたゲノムＤＮＡ標準の一連のログ希釈についての平均Ｃｔ値をプロットすることによって構築された。ゲノム同等物が推定された。ざ瘡菌の校正器の５個の複製を使用して、Ｃｔ値および標準偏差を計算した。これらのデータを使用して、アッセイの感度および検出限界（ＬＯＤ）を判定した。較正プロットは、ゲノム当たりの遺伝子座１およびＰａｋ標的のうちの１個のコピーを用いて、臨床試料中でざ瘡菌のゲノムの数を判定するために使用された。ＤＮＡ濃度およびコピー数が判定され、精製した生成物の連続１０倍希釈が、遺伝子座３較正プロットを構築するための標準として使用された。遺伝子座１および遺伝子座３の存在および不在の可能な組み合わせを表示する菌株が、遺伝子座１およびＰａｋ較正のために使用された：ＨＬ０３８ＰＡ１（遺伝子座１＋、遺伝子座３＋）、ＨＬ０８３ＰＡ１（遺伝子座１＋、遺伝子座３−）ＨＬ０７８ＰＡ１（遺伝子座１−、遺伝子座３＋）およびＨＬ０６３ＰＡ１（遺伝子座１−、遺伝子座３−）。アッセイは、臨床試料に適用される前に、既知の遺伝子座を有する純粋培養の配列決定されたざ瘡菌の菌株を使用して検証された。各標的についてのアッセイの特異性が、皮膚利共生および他のプロピオニバクテリアを含む他の細菌種を使用して試験された。
アッセイの検証
遺伝子座１および遺伝子座３を伴うまたは伴わない可能な組み合わせを含む、合計２４個の配列決定されたざ瘡菌の菌株（ＨＬ０６３ＰＡ１，ＨＬ０７８ＰＡ１，ＨＬ０８３ＰＡ１，ＨＬ０３８ＰＡ１，ＨＬ０３７ＰＡ１，ＨＬ０８２ＰＡ１，ＨＬ０２０ＰＡ１，ＨＬ００１ＰＡ１，ＨＬ０４６ＰＡ２，ＨＬ０４３ＰＡ１，ＨＬ０８６ＰＡ１，ＨＬ１１０ＰＡ３，ＨＬ１１０ＰＡ４，ＨＬ００７ＰＡ１，ＨＬ０８７ＰＡ３，ＨＬ０２７ＰＡ１，ＨＬ０５６ＰＡ１，ＨＬ０６７ＰＡ１，ＨＬ０７４ＰＡ１，ＨＬ０４５ＰＡ１，ＨＬ０５３ＰＡ１，ＨＬ００５ＰＡ１，ＨＬ０７２ＰＡ１，ＨＬ０４３ＰＡ２）が、三重ｑＰＣＲのアッセイを検証するために使用された。ｑＰＣＲ三重アッセイは、以前にこれらの遺伝子座を保有するために全ゲノム配列決定により示された菌株における遺伝子座１および遺伝子座３を首尾よく特定した。
臨床試料への適用
２つの臨床試料＃１および＃２から抽出されたゲノムＤＮＡは、タックマンｑＰＣＲ三重アッセイを用いて解析された。増幅プロットは、両方の試料におけるざ瘡菌の存在（Ｐａｋ）を明らかにした（図６）。遺伝子座１および遺伝子座３の標的はまた、試料＃２と比較して、１μｌの試料＃１中に存在するはるかに大きな割合のざ瘡菌の遺伝子座１陽性および遺伝子座３陽性菌株を伴い両方の試料で検出された。
実施例５−ざ瘡ワクチン
１６Ｓ ｒＤＮＡリボタイプ（ＲＴ）４、５、７、８、９、および１０を有する菌株が、高度にざ瘡と関連すると特定された。ワクチンは、これらの菌株に対して惹起され得る。Ｔ．Ｎａｋａｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，１２８（１０）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２４５１−２４５７（Ｏｃｔ．２００８）を参照されたい。
実施例６−化粧品および他の製品のための局所クリーム、溶液等の中の健康な皮膚と関連する菌株を利用したプロバイオティクスの開発
ＲＴ６は、健康な皮膚に主に見られる。これらの菌株はざ瘡の予防および治療のための局所生成物中のプロバイオティクスとして使用することができる。ＨＬ１１０ＰＡ３、ＨＬ１１０ＰＡ４、ＨＬ０４２ＰＡ３、およびＨＬ２０２ＰＡ１を含む４個のＲＴ６菌株が単離され、配列決定された。
加えて、細菌の代謝物を含め、細菌の培養上清および／または細胞溶解物は、ざ瘡と関連する菌株の増殖を防止するためにクリーム、溶液、および他の化粧品に使用することができる。配列番号５１〜５４と少なくとも９５％の相同性を共有する配列は、プロバイオティクス等の開発のために使用され得る。
実施例７−ざ瘡と関連する特異的な菌株を標的化する薬剤の開発
ざ瘡菌のコアおよび非コア領域の特定
ざ瘡の「コア」ゲノム領域は、８２個のゲノム全ての中に存在するゲノム配列として定義されたが、一方、非コア領域は、すべてのゲノム中に存在しなかったゲノム配列として定義された。Ｓ．Ｔｏｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｎ−ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｉｔｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ（印刷中）を参照されたい、実施例２も参照されたい。ＲＴ４および５（例えば、遺伝子座１、２および３）の菌株に特異的な非コア領域が、前述したように特定された。（遺伝子座４と表記された）ＲＴ８の菌株に特異的な非コア領域はまた、ＨＬ０７８ＰＡ１、ＨＬ０３０ＰＡ２、ＨＬ０６３ＰＡ２、Ｐ．ａｃｎ１７、ＨＬ０９７ＰＡ１、およびＰＲＰ３８などのいくつかの他の菌株と同様に特定された。図２０を参照されたい。遺伝子座４のゲノム配列は、配列番号１８として記載される。ざ瘡と関連する菌株ＲＴ４、ＲＴ５、およびＲＴ８にほぼ固有である以下の遺伝子座１〜４の遺伝子（表４−１、４−２、および４−３）が、以下に列挙される。非コア配列もまた、記載されている。これらの遺伝子座にコードされた遺伝子は、薬剤標的である。
実施例８−標的化されたファージ療法
バクテリオファージは、人間の皮膚の微生物叢を含め、組成物および微生物群集の動態の調節に重要な役割を果たしている。プロピオニバクテリウムざ瘡のバクテリオファージ、主要な皮膚の利共生は、以前に単離され、ざ瘡菌の異なる血清型を区別するためにタイプ分類システムとして使用された。しかし、これらのファージの分子特徴付けが欠けていた。ゲノム配列決定における最近の努力により、ざ瘡菌ファージおよび細菌宿主とそれらの相互作用における我々の理解が改善された。
バクテリオファージは、地球上で最も豊富な生物であり（Ｍｃ Ｇｒａｔｈ＆ｖａｎ Ｓｉｎｄｅｒｅｎ，２００７）、多くの多様な生態系において１０：１で細菌数を上回ると考えられている（Ｒｏｈｗｅｒ，２００３）。微生物群集の重要な構成要素、バクテリオファージは、多様性を生み出す要素（Ｒｏｈｗｅｒ＆Ｔｈｕｒｂｅｒ，２００９）の蓄積であり、捕食による存在量（Ｓｕｔｔｌｅ，Ｃｈａｎ，＆Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，１９９０）および微生物宿主の多様性の両方を制御する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖａｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。人間の皮膚には、細菌、真菌、およびウイルスを含む何百もの微生物種が生息している（Ｇｒｉｃｅ＆Ｓｅｇｒｅ，２０１１）。この生態系の恒常性は、皮膚上での病原の侵入とコロニー形成に対するバリアとしての機能にとって重要である。しかし、皮膚の微生物群集内の微生物間で動態の性質および駆動力について学ぶべきことが多く残されている。具体的には、皮膚上でのバクテリオファージと細菌宿主との間の相対的存在量および相互作用は、未解明のままである。
皮膚の毛包脂腺単位での微生物群集は、プロピオニバクテリウムざ瘡によって支配され、これは、微生物叢の約９０％を占める（“（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ Ｐａｐｅｒ）”日付不明）。ざ瘡菌は、最も一般的な人間の皮膚疾患の１つ、尋常性ざ瘡の発症における病原要因として示唆されている（Ｂｏｊａｒ＆Ｈｏｌｌａｎｄ，２００４；Ｌｅｙｄｅｎ，２００１）。上記の詳細な研究は、それらの１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に基づいたリボタイプ（ＲＴ）にざ瘡菌を分類し、毛包脂腺単位中のざ瘡菌の菌株集団構造が健康な皮膚とざ瘡の影響を受けた皮膚との間で異なることを実証した。
ざ瘡菌のバクテリオファージは、人間の皮膚上に存在する。１９６８年にＺｉｅｒｄｔら（Ｚｉｅｒｄｔ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，＆Ｒｕｄｅ，１９６８）は、（ファージ１７４と命名された）このようなファージを（コリネバクテリウムざ瘡として知られていた時に）ざ瘡菌の分離株の自発性プラークから単離した。ファージ１７４は、研究で試験されたほぼすべてのざ瘡菌の菌株を溶解することができた［１０］。続いて、溶解性のものから温暖なものの範囲に渡り多様なライフサイクルを示したより多くのざ瘡菌のファージが単離された［１１、１２］。しかし、過去数十年に渡り、ざ瘡菌のバクテリオファージの研究は、ざ瘡菌［１３、１４］＿ＥＮＲＥＦ＿４の異なる血清型を区別するためにファージタイプ分類システムの開発に限定され、ファージの広範囲の分子特徴付けが欠けていた。
ざ瘡菌のバクテリオファージの最近のゲノム配列決定（Ｆａｒｒａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｏｏｄ＆Ｃｏｌｌｉｎ，２０１１；Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）は、ざ瘡菌のファージの多様性に新たな洞察を提供した。ざ瘡菌ファージは、形態学的および遺伝的の両方においてマイコバクテリオファージに類似するが、はるかに小さいゲノムを有する。現在、１４個のファージゲノム配列が入手可能である。追加のファージ分離株の配列決定が、多様性を更に特徴付けるために必要とされる。これらの最近の配列決定の努力にも関わらず、人間の皮膚のマイクロバイオーム中のざ瘡菌ファージのゲノムレベルでの多様性、ならびにざ瘡菌および他のプロピオニバクテリアとの相互作用は、未解明のままである。ざ瘡菌ファージは、ざ瘡菌の菌株の異なる系統間の多様な宿主特異性を有する［１４］。ファージの宿主特異性は、これらのファージが群集内でざ瘡菌集団の組成物および動態をどのように調節するかを判定する上で重要である。一方で、ある種のざ瘡菌の菌株はまた、クラスタ化され等間隔に互いに離間された短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）配列アレイの転写に基づいた細菌免疫システムなどの、それらの抗ウイルス機構を通じてファージ集団に影響を与え得る。ＣＲＩＳＰＲアレイは、ファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡに由来するオリゴヌクレオチド「スペーサ」を含有する。ＲＮＡ干渉に類似する方法で、転写された一本鎖のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの要素は、外来のＤＮＡの相補的「プロトスペーサ」配列を含有するＤＮＡ標的の分解を対象とするようにＣＲＩＳＰＲと関連する（Ｃａｓ）タンパク質と相互作用する［１６］。ざ瘡菌のゲノムの多様性を特徴付けるが、出願人らは、ＲＴ２およびＲＴ６のざ瘡菌の菌株がＣＲＩＳＰＲアレイを保有することを発見した。ＣＲＩＳＰＲ機構はファージまたはプラスミドの侵入に対する防御において役割を果たし得る。
人間の皮膚マイクロバイオーム中の細菌とバクテリオファージとの間の相互作用、および皮膚の健康および疾患へのその寄与をより良く理解するために、ざ瘡患者および健康な個人から単離されたざ瘡菌ファージの多様性および宿主特異性が調査された。１５個のファージ分離株のゲノムが調査され、それらの宿主範囲がおよび特異性を判定するために配列決定された６９個のプロピオニバクテリア菌株のパネルに対してスクリーニングされた。
ファージの単離および一般的なゲノムの特徴
皮膚マイクロバイオーム中のざ瘡菌ファージの遺伝的多様性および存在量を特徴付けるために、正常な個人から１０９個の試料およびざ瘡患者から９４個を含め、１７９人の個人から２０３個の毛包脂腺単位の皮膚試料が収集された。全ての試料は、嫌気性条件下でざ瘡菌のために培養された。４９個の試料においてファージプラークが観察された：正常な個人から３５個およびざ瘡患者から１４個。ざ瘡菌ファージは、統計的有意性（ｐ＝０．００５、フィッシャーの正確確率検定）を有するざ瘡患者からよりも正常な個人からの試料においてより頻繁に見られた。これらの試料から得られた９３個のファージ分離株のうち、ざ瘡患者から５個のファージおよび正常な個人から１０個が、４５４またはイルミナプラットフォームを用いて全ゲノム配列決定のために選択された（表３−１）。
全てのファージのゲノムは、組み立てられ、完成され、注釈付けされた（図２９）。これらの１５個のファージのゲノムは、同程度のサイズ（２９．１〜２９．５Ｋｂ）およびＧＣ含有量（５３．８〜５４．５％）を有し、公開されたざ瘡菌ファージゲノムに類似する。平均して、４４個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、各ゲノム中に予測された。以前に報告されたゲノム構成と一致して［１１、１５］、ＯＲＦが、各ゲノムの左右の腕領域内にぎっしりと配設された。ゲノムの左腕および右腕は、転写のそれらの反対方向によって区別することができる。ゲノムの任意のペアの間の配列同一性は、７８．２〜９９．９％の範囲で適度に高い（表３−１）。
ざ瘡菌ファージは、遺伝子変異の異なる部位を有する高度と関連する菌株のサブグループで多様である
ざ瘡菌ファージのゲノムの多様性を調査するために、出願人らの１５個のファージのゲノムおよび１４個の公開されたものを含め、２９個の配列決定されたファージのゲノム全てが比較された（Ｆａｒｒａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｏｏｄ＆Ｃｏｌｌｉｎ，２０１１；Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。２９個のゲノム全てによって共有されるコアゲノム領域は、２４，４７５ｂｐ（平均のゲノムの長さの８３％）を組み合わせた長さを有し、６，８１２の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含有している。これらの６，８１２個のＳＮＰから構成された系統樹（図３０）は、今日までの全ての研究から単離されたファージゲノムのほとんどが、平均距離０．３０１（ＳＮＰ部位での置換率）で互いから同程度の分岐を示すことを明らかにする。しかし、はるかにより短い系統発生距離と緊密に関連しているＩ群およびＩＩ群（図３０）と命名された２個のファージ群も見つかった。（コアおよび非コア領域を含む）全てのゲノム配列が、系統発生関係の算出に用いたとき、同じ結果が取得された（図３１）。
我々は、次に、新たに配列決定されたファージが以前に発見された系統発生群に属しているかを判定した。Ｌｏｏｄらは、頭部タンパク質またはファージの分離株のアミダーゼをコードするヌクレオチド配列に基づいてざ瘡菌ファージの系統発生的多様性を以前に調査した［１２］。３個の主要な系統発生群が報告された。出願人らのデータは、Ｌｏｏｄらのデータと組み合わされ、出願人らは、頭部タンパク質およびアミダーゼ遺伝子配列の系統樹を再構築した。更新された系統樹は、以前の研究の菌株間の関係を再現した（図３２）。しかし、出願人らのファージは、別個の分岐群にグループ分けられた。更に、現在の研究の遺伝子配列を含むことによって、全ての研究されたファージ間で最長の系統発生距離が、頭部タンパク質遺伝子について０．０７７から０．１０２に、アミダーゼ遺伝子について０．１４０から０．１８２増加した。これらの距離は、最も近い外集団（０．９３９、マイコバクテリオファージＣｈｅ９ｄからの頭部タンパク質、０．７６４、ざ瘡菌ＫＰＡ１７１２０２アミダーゼ）のものよりもなお大幅に短いが［１２］、解析はざ瘡菌ファージの多様性が以前に記載されたものよりも広範囲であることを示唆している。
以前に示したようにざ瘡菌ファージのいくつかは、密接に関連する菌株であるように見える［１２］。２９個の配列決定されたゲノムの中でも、２個の密接に関連した菌株群が観察された（図３０）。Ｉ群は、ＰＨＬ０６６Ｍ０４、ＰＨＬ０１０Ｍ０４、およびＰＨＬ０７３Ｍ０２からなり、これは、ゲノムレベルでの０．００２の平均系統発生的距離によって分離される。ＩＩ群は、０．００４の平均系統発生的距離を有するＰＨＬ０８５Ｍ０１、ＰＨＬ０８５Ｎ００、ＰＨＬ１１５Ｍ０２、およびＰＨＬ０３７Ｍ０２からなる。コア領域、または全てのゲノムもしくは左腕または右腕コード領域のみが系統発生の算出に使用されたとき、これらの２つの群は、統計的に堅牢である（図３０および３１）。
Ｉ群ファージまたはＩＩ群ファージ間での遺伝的変異がゲノムの特定の領域に位置されているかが、調査された。Ｉ群ファージ間の配列変異の部位は、推定上のＩＩ型ホリンおよびペプチドグリカンアミダーゼをコードする領域内に主に位置する（ＰＡ６に注釈付けされたＧｐ２０およびＧｐ２１、図３３）。これらのエンドリシンは、膜を透過し、細菌宿主からの新しいファージ粒子を放出するように細胞外ペプチドグリカン層を劣化させる。Ｉ群ファージゲノム間でこれらの２個の遺伝子における配列変異の大半は、ほとんど同義であり、タンパク質の機能に影響を与えるように見えない。ＰＨＬ０１０Ｍ０２およびＰＨＬ０６６Ｍ０２のゲノムは、１１個の部位のみで異なり、そのうち９個が予測されたコード領域で発生する。
ＩＩ群のメンバー間の遺伝的変異は、ＰＡ６においてＧＰ１６、ＧＰ１７、およびＧＰ１８の相同物をコードする領域内に存在する（図３３）。構造タンパク質と溶解タンパク質との間の左腕の３’端部に近いこれらのタンパク質の位置は、それらのウイルスタンパク処理およびパッケージングに関与する後期作用型遺伝子であり得る。
ざ瘡菌ファージゲノムの代替的注釈
多数の新たに配列決定されざ瘡ファージの菌株は、ざ瘡菌ファージゲノムの初期注釈を検証し、精製する機会を提供する。解析に基づいて、ファージのゲノムのいくつかの代替的注釈が確認された。
配列決定された１５個のファージのゲノム全ては、２個のＯＲＦ、Ｇｐ２２、およびＧｐ２３として以前に注釈付けされ、ＰＡ６ゲノムにおけるプラス鎖上にコードされたＧＰ２２／２３遺伝子座の代替的注釈を裏付ける。相同体の多くは、これらの遺伝子の予想されるプラス鎖の位置での一貫性のないコドン開始および停止位置を有するので、ＰＡ６遺伝子ＧＰ２２およびＧＰ２３の相同体は、ゲノム中で一貫して特定されなかった。しかし、マイナス鎖上で、全てのゲノムは、５１３〜５２２ｂｐの長さ有する単一のＯＲＦをコードするように見える。この注釈は、本明細書においてＧｐ２２／２３と称されるＭａｒｉｎｅｌｌｉらによって報告された注釈と一致している（Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）（図２９）。既知の関数は、元のプラス鎖注釈のＧＰ２２またはＧＰ２３に割り当てられなかったが、ＰＨＬ１１２Ｎ００およびＰＨＬ１１１Ｍ０１におけるＧｐ２２／２３のマイナス鎖注釈は、アルスロデルマのジプセウムからジンクフィンガータンパク質にささやかな類似性を示した（Ｅ−値はそれぞれ、１．０ｅ−４、５．７ｅ−４）。ＰＨＬ１１１Ｍ０１注釈はまた、ストレプトマイセスアルブス（Ｅ−値２．６ｅ−５）からのポリプレニル二リン酸シンターゼおよびフランキア属（Ｅ−値２．５ｅ−４）からのポリケチドシンターゼに類似性を示した。ほとんどのゲノムのマイナス鎖Ｇｐ２２／２３のＯＲＦは、ＰＨＬ０６７Ｍ１０およびＰＨＬ１１４Ｌ００のものを除いて、互いの相同体である。これらの２つのゲノム中のＧｐ２２／２３のＯＲＦは、別個のグループを形成し、ゲノム中の同じ遺伝子座に存在しているにも関わらず、他のＧｐ２２／２３のＯＲＦに対してヌクレオチド類似性をほとんど共有しない。このＯＲＦがマイナス鎖上の全てのファージゲノムに現れるという観察は、この領域が右腕の一部であり得ることを示唆している。これは、ＰＡ６、ＰＡＤ２０、およびＰＡＳ５０における左腕の残りの部分からＧＰ２２／２３を分離するプラス鎖転写終結因子の以前の報告と一致している［１１］。
〜１ｋｂの非コード領域に近いゲノムの右腕で起こるＰＡ６のＯＲＦのＧｐ４２、Ｇｐ４５、およびＧｐ４６の相同体は、一貫して特定されなかった。ファージゲノムにおけるこれらの右腕ＯＲＦの各々の予想される位置は、多数の停止コドンをしばしば含有し、ＰＡ６ゲノムの対応する領域に制限された相同性を示した。これは、非コード領域付近の一般的に高度なヌクレオチド変異と一致しており、これらのＯＲＦが異なるファージの菌株間で異なって存在する遺伝子を表し得ることを示唆している。
配列決定データは、ファージゲノムの端部が１１ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングによって隣接していることを実証した（表３−１）。１０個のファージゲノムの配列決定データでは、ゲノムの３’および５’端部の両方に及ぶ１〜３個の読み取りが見てとれた。これらの読み取りにおけるゲノムの端部は、以前に報告された１１ヌクレオチドの一本鎖延長と一致する配列によって一貫して分離された（Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。しかし、配列決定データに基づいて、１５個のゲノムのうちの３個（ＰＨＬ０１０Ｍ０４、ＰＨＬ０７３Ｍ０２、およびＰＨＬ０７１Ｎ０５）にオーバーハングの存在は、示されなかった。オーバーハングを含有する読み取りが一般にはほとんど観察されなかったので、単にそれらは検出されなかったということがあり得る（１０，０００読み取り毎に２．３オーバーハング読み取り）。それにも関わらず、データは、以前に提案されているようにファージＤＮＡがそのライフサイクルのある時点で環状化し得ることを示唆する［１１］。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、３’一本鎖拡張を消化して、かつ５’一本鎖拡張の補数を延長することによって断片化したライブラリＤＮＡを「研磨」するために使用されるとき、ゲノムの一端のみにマップする読み取りにおけるオーバーハング配列の存在は、サンプル処理のアーティファクトであり得る（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，２００９）。もしそうであれば、オーバーハングがゲノムの３’末端に存在し得ることがわずかな根拠で推論できる。
ざ瘡菌ファージの宿主範囲および特異性
ざ瘡菌ファージの宿主範囲および特異性を調査するために、１５個の配列決定されたファージが、６５個のざ瘡菌の菌株、３個のフメルシイ菌の菌株、および１個の顆粒菌の菌株を含む、６９個のプロピオニバクテリウム菌株のパネルに対してスクリーニングされた。ざ瘡菌の菌株ＫＰＡ１７１２０２およびＡＴＣＣ１１８２８を除いて、これらのプロピオニバクテリウム菌株の全てがファージについてサンプリングされた対象の同じコホートから単離された。６５個のざ瘡菌の菌株および３個のフメルシイ菌の菌株全てのゲノムが配列決定された。それらのコアゲノム領域におけるＳＮＰに基づく６５個のざ瘡菌の菌株の系統樹が構築された（図３３、左の系統樹）。それらのＲｅｃＡ遺伝子配列［７］によってざ瘡菌の菌株の以前に確立されたタイプ分類に基づいて、細菌の収集は、各タイプ（ＩＡ−１、ＩＡ−２、ＩＢ−１、ＩＢ−２、ＩＢ−３、およびＩＩ）を表す複数の菌株で、人間の皮膚に見られるざ瘡菌のすべての主要な系統を含んだ。我々の１５個の配列決定されたファージの各々に対して６９個の細菌の菌株の各々の罹病性／耐性が、クロスストリーク法を使用して判定された。全体で、１，０３５個の細菌ファージの相互作用が判定された。各実験は、少なくとも５回反復された。ファージに対する耐性を示した細菌の菌株について、プラーク形成効率（ＥＯＰ）における倍数変化は、試験されたすべての菌株に罹病性であることが知られているざ瘡菌の菌株ＡＴＣＣ６９１９に対して判定された。
ファージに対する罹病性／耐性がざ瘡菌系統と相関することが見てとれた。６９個のプロピオニバクテリウムの菌株のうち５個が、少なくとも１個のファージに対する耐性において１００倍以上の増加を示した。ＩＡ−１、ＩＡ−２、ＩＢ−１、およびＩＢ−２型のざ瘡菌の菌株は全て、全ての試験されたファージに罹病性であった。しかし、ＩＢ−３型（ＫＰＡ１７１２０２およびＨＬ０３０ＰＡ１）の２個の菌株は、ファージのいくつかに非常に耐性であった（図３４）。ＩＢ−３型の菌株は、ＩＩＩ型の制限修飾システムの成分（ＫＰＡ１７１２０２中の遺伝子ＰＰＡ１６１１およびＰＰＡ１６１２）をコードする。これは、ファージに対するそれらの耐性を説明し得る。ＫＰＡ１７１２０２は、ゲノム中の隠されたプロファージをコードする［１７］。しかし、プロファージの配列は、配列決定されたざ瘡菌ファージのいずれにも関係せず、従って、隠れたプロファージの存在は、ファージに対する耐性を説明する可能性が低い。３個のＩＩ型の菌株はまた、ファージのいくつかに非常に耐性であった。これは、この型の菌株が、より頻繁にファージに耐性であったという以前の観察と一致している［１４］。
一方で、ファージに対するざ瘡菌の菌株の罹病性／耐性は、ファージの系統と相関しなかった（ｒ＝０．１３４３、ｐ値＝０．１１５、マンテル検定）。Ｉ群またはＩＩ群において密接に関連するファージ菌株間の範囲にある宿主は、異なる（図３４）。一例としては、同じ群内の他のファージにほとんど類似性を示さなかったが、ＩＩ群ファージＰＨＬ１１５Ｍ０２およびＰＨＬ０３７Ｍ０２に類似する細菌ファージ相互作用パターンを有したＩ群ファージのＰＨＬ０６６Ｍ０４が挙げられる。これらの結果は、細菌要因がファージ宿主範囲および特異性を判定する上で重要な役割を果たし得ることを示唆している。
これらのファージがざ瘡菌のみに特異的であるかどうかを判断するために、またはそれらが他のプロピオニバクテリアと相互作用することが可能である場合、細菌ファージ相互作用実験に１個の顆粒菌の菌株および３個のフメルシイ菌の菌株が含まれた。顆粒菌は、毛包脂腺単位中で約１．１％の存在量を有する一般的な皮膚利共生である［７］。フメルシイ菌は新たに定義された種である［１８］。研究コホートでは、フメルシイ菌は、毛包脂腺単位において１．９％の存在量で皮膚に見られる主要な種の一つである［７］。それは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列における９８％を超える同一性を有するざ瘡菌に密接に関連している［１８］。顆粒菌の菌株は、試験された全てのファージに強い耐性を示したが、一方、２個のフメルシイ菌の菌株、ＨＬ０３７ＰＡ２およびＨＬ０３７ＰＡ３は、すべてのファージに罹病性であった。第３のフメルシイ菌の菌株ＨＬ０４４ＰＡ１は、試験された１５個のファージのうちの１０個によって溶解された。これは、ざ瘡菌ファージの宿主範囲がざ瘡菌に限定されず、フメルシイ菌およびおそらく他の密接に関連するプロピオニバクテリウム種をも含むことを示唆している。
バクテリオファージに対する耐性は、ざ瘡菌の菌株における一致するＣＲＩＳＰＲスペーサの存在と相関しない
６５個のざ瘡菌の分離株のうち、８個の菌株は、ＲＴ２およびＲＴ６（ＲｅｃＡＩＩ型）に属し、外来のＤＮＡに対する細菌の適応免疫機構として機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの遺伝子をコードする。これらのＲＴ２およびＲＴ６の菌株は各々、ＣＲＩＳＰＲアレイ内に３３個のヌクレオチドの長さで１〜９個のスペーサを有する。合計では、それらは４２個のスペーサをコードし、それらのうちの２８個が固有である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの機構は、ＲＴ２およびＲＴ６菌株中のファージの罹病性／耐性を説明できるかが調査された。ＲＴ２およびＲＴ６ざ瘡菌の菌株からのスペーサ配列と一致する１５個のファージゲノムにおけるプロトスペーサが特定された。最大２個の不一致が、配列位置合わせにおいて許容された。すべてのファージにおいて、少なくとも２個のざ瘡菌の菌株中のスペーサと一致するプロトスペーサが特定された（図３５）。これらプロトスペーサは全て、ファージゲノム中で単一コピーされたものであり、左腕に主に位置している（図３６）。それらの位置は、一般的に、同じプロトスペーサ配列を保有する他のすべてのファージのゲノム間で保存されている。
８個のＲＴ２およびＲＴ６ざ瘡菌の菌株の罹病性／耐性パターンは、プロトスペーサ一致（ｒ＝０．２０７）を有する各アレイ内のスペーサ数、または少なくとも１個の一致が一般的にＣＲＩＳＰＲアレイに対して見てとることができるかどうか（ｒ＝０．２０２）のいずれともほとんど相関関係を示さなかった。ファージに対する罹病性／耐性はまた、いずれかの特異的スペーサが一致したパターンと相関しなかった（最大絶対相関関係０．０５１）。
ファージは、プロトスペーサ認識に関与する部位を変異することによって、ＣＲＩＳＰＲ防御機構を回避できる。プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られているプロトスペーサの短いヌクレオチドモチーフ下流は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的間で高度に保存されている［１９］。これらのヌクレオチドの変異は、プロトスペーサ配列中の完全な相補性にも関わらず、ＣＲＩＳＰＲ媒介性耐性を破壊することが見てとれる［２０−２２］。細菌の罹病性／耐性と一致するスペーサ配列の存在との間の相関関係の欠如が、ＰＡＭ配列内の変異に起因するかを判定するために、ＨＬ０４２ＰＡ３中でコードされたスペーサ配列に正確に一致する９個のプロトスペーサのうちのＰＡＭが調査された。これらプロトスペーサのうちの６個は、ＨＬ０４２ＰＡ３が耐性であるファージからのものであるが、一方、他の３個のプロトスペーサは、ＨＬ０４２ＰＡ３を溶解することができたファージからのものである。６個のプロトスペーサの中で、それらの３３個のヌクレオチドの長さ内およびＰＡＭを含むと予想される１０個の下流のヌクレオチド内のいくつかの部位で配列保存が、観察された（図３７）。これは、これらのプロトスペーサモチーフが保存され、ＨＬ０４２ＰＡ３のＣＲＩＳＰＲｓによって標的化することができることを示唆している。しかし、これらの同じヌクレオチド位置はまた、ＨＬ０４２ＰＡ３を溶解することができた他のファージ（ＰＨＬ１１３Ｍ０１、ＰＨＬ１１２Ｎ００、およびＰＨＬ０８５Ｍ０１）の３個のプロトスペーサ中に保存されている（図３７）。従って、ＰＡＭを含むプロトスペーサモチーフの保存は、細菌の罹病性／耐性と一致するスペーサ配列の存在との間の相関の欠如を説明できない。
要約すると、データは、侵入ファージのゲノムに対して一致するＣＲＩＳＰＲスペーサをコードすることが、効果的な防御には十分でないことを示し、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよびＣａｓ遺伝子発現の転写ならびに／または翻訳調節もまた、ＣＲＩＳＰＲ媒介性耐性に必要な場合があることを示唆する。これらの細菌とファージとの間の相互作用はまた、ファージの結合、移入、複製、または放出に関与する追加のファージおよび細菌成分に依存し得る。
人間の皮膚上に存在するざ瘡菌バクテリオファージの多様な群が明らかにされた。配列決定されたファージのほとんどは、密接に関連する群を構成するある種の菌株と適度に高い遺伝的類似性を示す。これらのファージは、ざ瘡菌およびフメルシイ菌の菌株との相互作用の様々なパターンを示しているが、これらのパターンは、ファージ系統発生と相関しない。それは、ファージに対する耐性または罹病性がざ瘡菌系統と良好に相関することを判定した。ＩＡ−１、ＩＡ−２、ＩＢ−１、およびＩＢ−２型は全て、全ての試験されたファージに罹病性であったが、一方、ＩＢ−３およびＩＩ型のある種の菌株は、いくつかファージに耐性であった。ＩＩ型のざ瘡菌の菌株におけるファージ耐性は、ファージプロトスペーサに一致するＣＲＩＳＰＲスペーサの存在と相関せず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび／または他の抗ウイルス機構の調節などの追加の機構が、ファージ耐性の付与に必要であることを示唆している。
本研究は、皮膚のマイクロバイオームにおけるざ瘡菌バクテリオファージの重要な調節役割を示唆している。菌株特異的宿主範囲は、ざ瘡菌の群およびフメルシイ菌集団の特定のサブセットを調節するためにこれらのファージの能力を実証する。プロピオニバクテリウム集団のこれらのサブセットのうち、ファージはまた、ＬｏｏｄおよびＣｏｌｌｉｎ［１１］または競争によって示唆されるように、ビルレンスを潜在的に修正する遺伝子を広め、いくつかのファージ中でコードされたｇｐ２２／２３は、ポリケチド抗菌薬の生成に潜在的に関与し得ることが示唆された。両方のファージによるざ瘡菌の菌株の選択的溶解および変更は、潜在的に皮膚上のざ瘡菌の利共生および病原性株の相対的存在量を調節する。利共生と病原との間のこの微妙なバランスは、ざ瘡菌が支配する部位で皮膚の健康および疾患のために特に重要である。メタゲノムショットガン配列決定データに基づいて、毛包脂腺単位中でのざ瘡菌ファージとざ瘡菌と間の比は、ファージからはるかに異なる１：２０であることが推定される［７］：ウイルスが細菌数を通常上回る環境微生物群集において推定される細菌比率［２３］。これは、人間の宿主はまた、マイクロバイオームの組成および多様性の選択および調節においてある役割を果たすことを示唆している。
材料および方法
プロピオニバクテリア培養
ざ瘡菌、フメルシイ菌、および顆粒菌の菌株は、４〜６日間３７℃でクロストリジウム培地（Ｏｘｏｉｄ）における嫌気条件下で培養された。プロピオニバクテリウム培養は、培地プレート上のファージ培養のための上層寒天オーバーレイを調製するために使用された（１２ｇ／Ｌの膵臓カゼインダイジェスト、１２ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ酵母抽出、２２．２ｍＭのＤ−ブドウ糖、２９．４ｍＭのｇ／Ｌの一塩基リン酸カリウム、８ｍＭの硫酸マグネシウム七水化物、２０ｇ／Ｌのディフコ寒天）。
ファージの単離およびＤＮＡ抽出
皮膚試料培養プレート上で見つかったプラークは、ピペットの先端で寒天を穿刺すること、および５０μＬのＳＭ緩衝液（０．１Ｍの塩化ナトリウム、８ｍＭの硫酸マグネシウム七水和物、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２％のゼラチン、１ｍＭの塩化カルシウム）に再懸濁することにより単離された。ファージの再懸濁は、ざ瘡菌の菌株ＡＴＣＣ６９１９を含有する上層寒天と共に培地プレート上に広がった。２日間３７℃でインキュベートした後、ファージは、室温で８ｍＬのＳＭ緩衝液で溶出され、０．２２ｕＭ ＰＥＳフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過され、４℃で保存された。ファージ力価は、プラークアッセイにより判定された。
ファージＤＮＡの抽出は、以下の変更を伴いラムダミニキット（Ｌａｍｂｄａ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施された。ファージ粒子を１時間２０，０００ｇで遠心分離によって緩衝液Ｌ２中に沈殿させた。抽出されたＤＮＡを緩衝液ＱＦで溶出し、遠心分離の前に−２０℃で一晩イソプロパノールを用いて沈殿させた。
ファージゲノム配列および注釈
ファージゲノムは、Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ＦＬＸ ＴｉｔａｎｉｕｍまたはＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍプラットフォームを使用して、多重に配列決定された。新規の読み取りアセンブリは、ＭＩＲＡを用いて実施され［２４］、結果として得られたコンティグは、Ｃｏｎｓｅｄで手動で仕上げられた［２５］。２０，０００個以上の読み取りによってカバーされたファージのために、アセンブリは、４５４個のデータについての１０，０００個の読み取り、またはＭｉＳｅｑデータについての２０，０００個の読み取りのランダムに選択されたサブセット上で実施された。完全に組み立てられたファージゲノムは、Ｇｅｎｅｍａｒｋ．ｈｍｍ［２６］およびグリマーｖ３．０２［２７］を使用して注釈を付けされた。
ゲノム配列位置合わせおよび系統樹構築
１６個のファージゲノム全ての中に存在する配列は、ファージゲノムのコア領域として定義された。これらのコア領域を特定するために、位置合わせは、Ｎｕｃｍｅｒを使用して、ＰＡ６ゲノムと他の１５個のファージゲノムの各々との間にまず生成された［２８］。これは、所定のファージゲノムに位置合わせされたＰＡ６ゲノム内の間隔を記述する１５組の開始および終了座標をもたらした。コア領域が、１５組の座標組全ての間で重複する間隔を判定することによって、全てファージについて算出された。コア領域の配列は、後続の多重配列位置合わせのために連結された。コア領域の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、デフォルトの設定でＮｕｃｍｅｒのオプション「ｓｈｏｗ−ｓｎｐｓ」を用いて特定された。ＭＥＧＡ５［２９］を使用して、系統樹が、ＳＮＰ部位に基づいてｐの距離の近隣接合方法により構築された。ブートストラッピングは、２００個の複製に基づいていた。
完全長のファージゲノムの多重配列位置合わせ、左および右腕コード領域、頭部タンパク質配列、およびアミダーゼ配列は各々、ＭＡＦＦＴ［３０］またはＭｕｓｃｌｅ［３１］を用いて生成された。系統樹は、配列間のジュークスカントール（Ｊｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ）距離に適用されるＢｉｏＮＪ法に基づいてシービュ（Ｓｅａｖｉｅｗ）［３２］で構築された。全ての樹が、５，０００個の複製のためにブートストラッピングされた。
変異部位の決定
Ｉ群およびＩＩ群ファージの多重配列位置合わせは、ＭＡＦＦＴ［３０］を使用して生成された。これらの位置合わせの各々において、全ての不一致および隙間（相違）の位置は、無作為に選択された参照ゲノムに対して相対的に記録された。参照ゲノムにおける隣接する隙間は、単一の相違として数えられた。参照ゲノムは、５０個のヌクレオチドウィンドウに分割され、各配列ウィンドウの相違密度が、それが含む相違の総数として計算された。密度は、Ａｒｔｅｍｉｓ［３３］にプロットされた。
各菌株内の単一ヌクレオチド変異を判定するために、新規のゲノムアセンブリに最初に含まれていない読み取りを含めて、各ファージのための全ての読み取りデータが、各ファージゲノムのアセンブリ中の部位としてＭｉｒａを使用して対応するゲノムにマッピングされた。
細菌耐性試験
１５個のファージに対するプロピオニバクテリウム菌株の罹病性／耐性が、変更されたクロスストリークアッセイを用いて判定された。細菌菌株が培養され、培地プレートに並列に画線された（制御としてＡＴＣＣ６９１９に沿って〜１ｃｍ離れて、各プレートに５〜６個の分離株）。約１０６ｐｆｕ／ｍＬのうちの５μＬのファージ懸濁液が、各ストリークに適用され、その後、プレートを２日間嫌気的に３７℃でインキュベートされた。各クロスストリーク実験の少なくとも５つの反復が、菌株が溶解に基づいて判断される罹病性または耐性であったかを判定するために実施された。細菌菌株の耐性は、ざ瘡菌の菌株ＡＴＣＣ６９１９に相対的なファージのプラーク形成の効率をアッセイすることによって更に定量化され、以下のように計算された。
プラーク形成の効率における１００倍以上の増加は、耐性の証拠であると考えられた。
ファージ相互作用の相関関係
遺伝的に類似したファージが、類似の宿主範囲および特異性を有するかどうかを判定するために、それらの系統発生と表現型との間の相関関係が算出され、後者は、細菌の耐性試験の結果に基づいた。所定のファージの宿主範囲を表す細菌の耐性表の各列は、耐性のインスタンスに１、罹病性のインスタンスに０を割り当てることによって、バイナリ形式に変換された。各列間のユークリッド距離は、全てのファージ間の表現型距離行列を計算するために使用された。ファージゲノム間の系統発生距離行列は、ＭＥＧＡ５を用いて計算された［２９］。Ｒにおけるａｄｅ４パッケージ［３４］を用いて、マンテル検定が、２つの間の相関関係を判定するために表現型および系統発生距離行列上で実施された。１０，０００の順列が実施された。
ＣＲＩＳＰＲ検索
ＣＲＩＳＰＲスペーサ配列は、ＣＲＩＳＰＲファインダー［３５］を使用して、ざ瘡菌のゲノム中で特定された。抽出されたスペーサ配列は、ＢＬＡＳＴｎを使用して全てのファージ配列に対して位置合わせされた。最大２個の不一致を伴うプロトスペーサが特定された。
結果
人間の皮膚から単離された１５個のざ瘡菌ファージのゲノムが配列決定された。ファージゲノムは、適度に高い配列類似性を示し、サイズ、組織において同程度であった。ゲノムの比較に基づいて、ほとんどのファージは互いから分岐しているが、一方、それらのいくつかは、以前に記載されていない密接に関連する群を形成している。６９個のプロピオニバクテリウムの菌株のパネルに対して試験されたとき、これらのファージは、ＩＢ−３およびＩＩ型からいくつかの菌株を除くすべてのざ瘡菌の菌株を溶解した。ファージのいくつかは、プロピオニバクテリウムフメルシイの菌株を溶解することができた。ファージに対する細菌の罹病性／耐性は、ファージ系統発生、またはファージゲノム中のプロトスペーサと一致するＩＩ型ざ瘡菌の菌株におけるＣＲＩＳＰＲスペーサの存在と有意な相関関係がないことが分かった。
結論
１５個の新しいファージゲノムを用いて、ざ瘡菌ファージの多様性が、追加された新規の群を伴い以前説明したものよりも広範囲であることが判定された。宿主範囲および特異性は、ファージ間で異なるが、ファージゲノムの系統発生と相関していない。ファージゲノムに一致するＣＲＩＳＰＲスペーサをコードすることは、ファージにざ瘡菌の耐性を付与するのに十分ではないことが分かった。本研究では、ざ瘡および他のざ瘡菌と関連する疾患の治療におけるファージの潜在的な適用に新たな洞察を提供する。
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（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ Ｐａｐｅｒ）． （ｎ．ｄ．）． Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／５３０５／ｖｅｒｓｉｏｎ／１
Ｂｏｊａｒ， Ｒ． ａ， ＆ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｋ． Ｔ． （２００４）． Ａｃｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， ２２（５）， ３７５−９． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｌｉｎｄｅｒｍａｔｏｌ．２００４．０３．００５
Ｆａｒｒａｒ， Ｍ． Ｄ．， Ｈｏｗｓｏｎ， Ｋ． Ｍ．， Ｂｏｊａｒ， Ｒ． ａ， Ｗｅｓｔ， Ｄ．， Ｔｏｗｌｅｒ， Ｊ． Ｃ．， Ｐａｒｒｙ， Ｊ．， Ｐｅｌｔｏｎ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２００７）． Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １８９（１１）， ４１６１−７． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００１０６−０７
Ｇｒｉｃｅ， Ｅ． ａ， ＆ Ｓｅｇｒｅ， Ｊ． ａ． （２０１１）． Ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ９（４）， ２４４−５３． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ２５３７
Ｌｅｙｄｅｎ， Ｊ． Ｊ． （２００１）． Ｔｈｅ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｉｎ ａｃｎｅ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｓｕｒｇｅｒｙ， ２０（３）， １３９−４３． ｄｏｉ：１０．１０５３／ｓｄｅｒ．２００１．２８２０７
Ｌｏｏｄ， Ｒ．， ＆ Ｃｏｌｌｉｎ， Ｍ． （２０１１）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｐｈａｇｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｐｓｅｕｄｏｌｙｓｏｇｅｎｙ． ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １２（１）， １９８． ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−１２−１９８
Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ， Ｌ． Ｊ．， Ｆｉｔｚ−ｇｉｂｂｏｎ， Ｓ．， Ｈａｙｅｓ， Ｃ．， Ｂｏｗｍａｎ， Ｃ．， Ｉｎｋｅｌｅｓ， Ｍ．， Ｌｏｎｃａｒｉｃ， Ａ．， ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ａ． （２０１２）． Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｂｒｏａｄ Ｋｉｌｌｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｋｉｎ Ｉｓｏｌａｔｅｓ． ｍＢｉｏ， ３（５）， １−１３． ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００２７９−１２．Ｅｄｉｔｏｒ
Ｍｃ Ｇｒａｔｈ， Ｓ．， ＆ ｖａｎ Ｓｉｎｄｅｒｅｎ， Ｄ． （ｅｄｓ）． （２００７）． Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ： Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎｏｒｆｏｌｋ， ＵＫ： Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． （２００９）． ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ Ｍａｎｕａｌ． Ｍａｎｎｈｅｉｍ： Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖａｌｅｒａ， Ｆ．， Ｍａｒｔｉｎ−Ｃｕａｄｒａｄｏ， Ａ．−Ｂ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｒｉｔｏ， Ｂ．， Ｐａｓｉｃ， Ｌ．， Ｔｈｉｎｇｓｔａｄ， Ｔ． Ｆ．， Ｒｏｈｗｅｒ， Ｆ．， ＆ Ｍｉｒａ， Ａ． （２００９）． Ｅｘｐｌａｉｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈａｇｅ ｐｒｅｄａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７（１１）， ８２８−３６． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ２２３５
Ｒｏｈｗｅｒ， Ｆ． （２００３）． Ｇｌｏｂａｌ ｐｈａｇｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｃｅｌｌ， １１３（２）， １４１．
Ｚｉｅｒｄｔ， Ｃ． Ｈ．， Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｃ．， ＆ Ｒｕｄｅ， Ｗ． Ｓ． （１９６８）． Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １８， ３３−４７．
ＲＴ４、ＲＴ５、およびＲＴ８の全ての菌株が、表５に示されたファージの全てに感度を示す。従って、ざ瘡患者は、表５に列挙されたファージ菌株を使用してファージで治療され得る。
ＩＢ−３系統における菌株は、試験したファージのほとんどに対して耐性を示す。従って、これらの菌株を有する患者は、ファージ療法から同じくらい恩恵を受けない場合がある。配列番号５５〜８１は、ＩＢ−３系統における菌株のための、およびＩＢ−３−ｓ１（ＩＢ−３およびＳＫ１８７）、ＩＢ−３−ｓ２（ＩＢ−３およびＨＬ０２５ＰＡ１）、ＩＢ−３−ｓ３（ＩＢ−３およびＨＬ２０１ＰＡ１）、ＩＢ−３−ｓ４（ＩＢ−３およびＨＬ２０１ＰＡ１）などの他のいくつかの菌株のための４個の固有の遺伝子配列を含む。配列の類似性は、９５％〜１００％の範囲である。これらの配列を標的化するプライマーを使用して、ファージ療法の有効性を推定し、予測することができる。
図２６は、１８個の配列決定されたファージを含む３２個のファージの系統樹を示す。ＩおよびＩＩ群におけるものなど、互いに非常に類似したファージ菌株が存在する。これは、同じファージを異なる個人に見つけることができることを示唆し、特定のファージ菌株を異なる個人のための一般的な治療剤として使用することができることを裏付ける。配列番号３３〜５０は、表５に示した１５個のファージを含む、１８個の配列決定されたファージのゲノム配列を反映する。
マイクロバイオームＩ型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む：
ＰＨＬ１１３Ｍ０１、ＰＨＬ１１１Ｍ０１、ＰＨＬ０８２Ｍ００、ＰＨＬ０６０Ｌ００、ＰＨＬ０６７Ｍ１０、ＰＨＬ０７１Ｎ０５、ＰＨＬ１１２Ｎ００、ＰＨＬ０３７Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｎ００、ＰＨＬ１１５Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｍ０１、ＰＨＬ１１４Ｌ００、ＰＨＬ０７３Ｍ０２、ＰＨＬ０１０Ｍ０４、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４。
ＩＢ−３菌株を伴うマイクロバイオームＩ型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む：
ＰＨＬ０８２Ｍ００およびＰＨＬ０７１Ｎ０５。
マイクロバイオームＩＩ型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む：
ＰＨＬ１１３Ｍ０１、ＰＨＬ０６０Ｌ００、ＰＨＬ１１２Ｎ００、およびＰＨＬ０８５Ｍ０１。
マイクロバイオームＩＩＩ型または優勢なＲＴ８を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む：
ＰＨＬ１１３Ｍ０１、ＰＨＬ１１１Ｍ０１、ＰＨＬ０８２Ｍ００、ＰＨＬ０６０Ｌ００、ＰＨＬ０６７Ｍ１０、ＰＨＬ０７１Ｎ０５、ＰＨＬ１１２Ｎ００、ＰＨＬ０３７Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｎ００、ＰＨＬ１１５Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｍ０１、ＰＨＬ１１４Ｌ００、ＰＨＬ０７３Ｍ０２、ＰＨＬ０１０Ｍ０４、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４。
マイクロバイオームＩＶ型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む：
ＰＨＬ１１３Ｍ０１、ＰＨＬ１１１Ｍ０１、ＰＨＬ０８２Ｍ００、ＰＨＬ０６０Ｌ００、ＰＨＬ０６７Ｍ１０、ＰＨＬ０７１Ｎ０５、ＰＨＬ１１２Ｎ００、ＰＨＬ０３７Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｎ００、ＰＨＬ１１５Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｍ０１、ＰＨＬ１１４Ｌ００、ＰＨＬ０７３Ｍ０２、ＰＨＬ０１０Ｍ０４、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４。
マイクロバイオームＶ型を有する患者のための潜在的な治療ファージは以下を含む：
ＰＨＬ１１３Ｍ０１、ＰＨＬ１１１Ｍ０１、ＰＨＬ０８２Ｍ００、ＰＨＬ０６０Ｌ００、ＰＨＬ０６７Ｍ１０、ＰＨＬ０７１Ｎ０５、ＰＨＬ１１２Ｎ００、ＰＨＬ０３７Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｎ００、ＰＨＬ１１５Ｍ０２、ＰＨＬ０８５Ｍ０１、ＰＨＬ１１４Ｌ００、ＰＨＬ０７３Ｍ０２、ＰＨＬ０１０Ｍ０４、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４。
プロピオニバクテリウムフメルシイとざ瘡菌ファージとの間の特異的相互作用
ざ瘡菌ファージの菌株のいくつかは、密接に関連するプロピオニバクテリウム種、フメルシイ菌を溶解することができ、これは、人工器官における感染と関連していることが仮定されている。フメルシイ菌の菌株を溶解することができるざ瘡菌ファージの菌株は、フメルシイ菌と関連する疾患のための治療剤として潜在的に使用することができる。
フメルシイ菌と関連する疾患のための潜在的な治療ファージは以下を含む：
ＰＨＬ１１３Ｍ０１、ＰＨＬ１１１Ｍ０１、ＰＨＬ０８２Ｍ００、ＰＨＬ０６７Ｍ１０、ＰＨＬ０７１Ｎ０５、ＰＨＬ０８５Ｎ００、ＰＨＬ０８５Ｍ０１、ＰＨＬ１１４Ｌ００、ＰＨＬ０７３Ｍ０２、およびＰＨＬ０１０Ｍ０４。
それらのＰＡ６相同体に８５％以下の同一性を示すファージゲノム中のＯＲＦ
実施例９−薬剤開発
上記に基づいて、現在は、いくつかのざ瘡菌の菌株はざ瘡に関連していることが知られている。従って、診断時に、皮膚科医は、患者の皮膚上でどの菌株が優勢かを知ることが有用であろう。これを行うためには、最初に患者の皮膚試料からの細菌ＤＮＡを抽出する必要がある。上に詳述の下流解析のために皮膚からの細菌ＤＮＡを単離するための方法／キットが、実際に実装され得る。細菌ＤＮＡが抽出された後、上記に詳述した患者のマイクロバイオーム型を特定するために迅速かつ正確な検出／診断方法／キットが、診断のために実装され得る。一旦患者のマイクロバイオーム型が診断されると、いくつかの手法を用いて、患者を治療することができる。
例えば、患者がマイクロバイオームＩＶまたはＶ型を有するか、またはざ瘡菌ＲＴ１０菌株によって支配されている場合、これらの菌株が、抗生物質耐性であるため、抗生物質による治療が成功する可能性は低くなる。これらの患者は、レチノイドまたはこれらの方法などの他の療法を用いて治療されるべきである。患者が、ＲＴ４、ＲＴ５、およびＲＴ８を含めビルレントリボタイプを有している場合、ＲＴ４、ＲＴ５、およびＲＴ８に特異的な標的薬剤を使用することができる。例えば、上に詳述し、ざ瘡に関連したざ瘡菌の菌株に特有の遺伝的要素および生物学的経路を標的にした、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、またはこれらの組み合わせを使用することができる。
実施例１０−追加の治療
患者の優勢なざ瘡菌の菌株が、１組のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを保有しない場合、前述に基づくファージ療法の追加の治療が用いられる。例えば、ざ瘡を治療するためのバクテリオファージに基づく菌株特異的療法が適用され得る。代替治療戦略は、健康と関連する菌株の増殖を促進することにより、ざ瘡菌の菌株の相対的存在量のバランスを取ることである。健康と関連する菌株は、プロバイオティクスとして使用することができる。これらは、局所クリーム、溶液、または他の化粧品であり得る。
予防目的のために、ワクチンは、ざ瘡菌のビルレント菌株に対して開発され得る。
縦断的研究は、マイクロバイオーム型が経時的に変化するか、ならびにある種の菌株が治療後の対象上に残るかを判定する。
ビルレントおよび健康な菌株を接種する接種実験により、ざ瘡菌の菌株集団が変化するかどうかを判定する。
ざ瘡菌の菌株とファージとの間の特異的相互作用は、研究され得る。
ざ瘡菌の異なる菌株に対する人間の細胞における免疫応答もまた測定され得る。
以下の刊行物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書および配列表で参照される他の全ての出版物においても同様である。
Ｅ． Ｇｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ３２４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１９０−１１９２ （２００９）．

Claims (46)

  1. 個人がざ瘡を有しているかどうかを判定する方法であって、
    個人から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌ＤＮＡを単離することと、
    前記試料中の１６ＳリボソームＤＮＡを増幅することと、
    前記増幅されたＤＮＡ生成物を配列決定することと、
    ざ瘡菌株の１０個の主要なリボタイプ（ＲＴ）であるＲＴ１〜ＲＴ１０（配列番号１〜１０）のうちの１個以上に基づいて、前記個人のＤＮＡをタイプ分類することと、を含み、
    前記タイプ分類が、前記個人がＲＴ１〜ＲＴ１０のうちの１個以上を有するかどうかを判定することによって生じ、前記個人がＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を有する場合、前記個人がざ瘡を有すると診断される、方法。
  2. 前記個人がＲＴ４（配列番号４）、ＲＴ５（配列番号５）、またはＲＴ８（配列番号８）を有する場合、前記個人がざ瘡を有すると診断される、請求項１に記載の方法。
  3. 異なる種類のざ瘡を診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌ＤＮＡを単離することと、
    前記試料中の１６ＳリボソームＤＮＡを増幅することと、
    前記増幅されたＤＮＡ生成物を配列決定することと、
    ざ瘡菌の菌株の５個の主要なマイクロバイオームのうちの１個以上に基づいて前記対象のＤＮＡをタイプ分類することと、を含み、
    前記対象がマイクロバイオームＩＶまたはＶにタイプ分類された場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。
  4. ざ瘡を迅速に診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌ＤＮＡを単離することと、
    １個以上のプライマーセットを使用して前記ＤＮＡを増幅することと、
    配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在について、前記増幅されたＤＮＡを解析することと、を含み、
    配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。
  5. 前記増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９９％の相同性を有する配列の存在について解析され、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９９％の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記増幅されたＤＮＡが、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個の存在について解析され、配列番号２９〜３２および８２〜４３４のうちの少なくとも１個の存在がある場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、請求項４に記載の方法。
  7. ざ瘡を迅速に診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌ＤＮＡを単離することと、
    １個以上のプライマーセットを使用して前記ＤＮＡを増幅することと、
    １個以上のプローブを使用して前記増幅されたＤＮＡを検出することと、
    遺伝子座１（配列番号２９および８２〜９７のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、遺伝子座２（配列番号３０および９８〜１８６のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、遺伝子座３（配列番号３１および１８７〜４２３のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）、および／または遺伝子座４（配列番号３２および４２４〜４３４のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１個の配列）の存在について、前記プローブ信号を解析することと、を含み、
    遺伝子座１〜４のうちの１個以上が存在する場合、前記対象がざ瘡を有すると診断される、方法。
  8. 前記信号が、少なくとも９９％の相同性に基づいて遺伝子座１、遺伝子座２、遺伝子座３、および／または遺伝子座４の存在について解析される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記信号が、１００％の相同性に基づいて遺伝子座１、遺伝子座２、遺伝子座３、および／または遺伝子座４の存在について解析される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記プライマーセットのプライマーが、（遺伝子座１について）配列番号１１、１２、１７、および１８、（遺伝子座２について）配列番号１３、１４、２０、および２１、（遺伝子座３について）配列番号１５、１６、２３、および２４、ならびに（遺伝子座４について）配列番号２６および２７からなる群から選択される、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記プライマーセットのプライマーが、（遺伝子座１について）配列番号１１、１２、１７、および１８、（遺伝子座２について）配列番号１３、１４、２０、および２１、（遺伝子座３について）配列番号１５、１６、２３、および２４、ならびに（遺伝子座４について）配列番号２６および２７からなる群から選択され、前記プローブが、（遺伝子座１について）配列番号１９、（遺伝子座２について）配列番号２２、（遺伝子座３について）配列番号２５、および（遺伝子座４について）配列番号２８である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 熱失活させたざ瘡菌の菌株、前記菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および／または治療のためのワクチンであって、前記菌株が、ＲＴ４菌株、ＲＴ５菌株、ＲＴ７菌株、ＲＴ８菌株、ＲＴ９菌株、またはＲＴ１０菌株である、ワクチン。
  13. 対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析に基づき、前記対象に特異的であることが特定された、熱失活させたざ瘡菌の菌株、前記菌株の弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、ざ瘡菌に起因するざ瘡の予防および／または治療のためのワクチン。
  14. 熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、ざ瘡菌の菌株について特定された固有のゲノムの遺伝子座、領域、または配列のうちの少なくとも１個に特異的である、請求項１２または請求項１３に記載のワクチン。
  15. 熱失活させたざ瘡菌の菌株、弱毒化されたタンパク質、またはそれらの組み合わせが、遺伝子座１（配列番号２９および８２〜９７）、遺伝子座２（配列番号３０および９８〜１８６）、遺伝子座３（３１および１８７〜４２３）、ならびに遺伝子座４（３２および４２４〜４３４）のうちの少なくとも１個に特異的である、請求項１２または請求項１３に記載のワクチン。
  16. ざ瘡の個人化された治療のための方法であって、対象に影響を与えているざ瘡菌の菌株を判定することと、少なくとも１個の検出されたざ瘡菌の菌株を対象とした活性成分を用いて前記対象を治療することとを含み、前記活性成分が、ざ瘡菌の特定の菌株を標的化する薬剤を含み、前記標的化薬剤が、ざ瘡と関連するざ瘡菌の菌株に対して特異的なゲノム要素を標的化する、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、およびそれらの組み合わせを含む、方法。
  17. ざ瘡を治療するための方法であって、
    ざ瘡菌の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡに基づいて健康なまたは正常な皮膚と関連する少なくとも１個のざ瘡菌の菌株を含む有効量のプロバイオティクスを投与することを含む、方法。
  18. 前記菌株が、ＲＴ６菌株である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９９％の相同性を有する、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と１００％の相同性を有する、請求項１７に記載の方法。
  22. ざ瘡を治療するための方法であって、
    健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌の菌株によって生成される有効量の代謝産物を投与することを含み、
    前記代謝産物が、細菌培養上清、細胞溶解物、タンパク質、核酸、脂質、および他の細菌分子からなる群から選択される、方法。
  23. 前記菌株が、ＲＴ６菌株である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性を有する、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９９％の相同性を有する、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と１００％の相同性を有する、請求項２２に記載の方法。
  27. 対象のざ瘡を治療するための方法であって、
    前記対象がそれぞれ、ＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を有すると判定されたとき、ＲＴ４、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ８、ＲＴ９、またはＲＴ１０を特異的に標的化する有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
  28. 前記薬剤の投与の前に、請求項１、請求項２、請求項４、または請求項７に記載の方法を実施することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記薬剤が、小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、生物製剤、抗体、またはそれらの組み合わせである、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
  30. 健康なまたは正常な皮膚と関連するざ瘡菌のうちの少なくとも１個の菌株を含む、組成物。
  31. 前記菌株が、ＲＴ６菌株である、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９５％の相同性を有する、請求項３０に記載の組成物。
  33. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも９９％の相同性を有する、請求項３０に記載の組成物。
  34. 前記菌株が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４と１００％の相同性を有する、請求項３０に記載の組成物。
  35. ＩＢ−３系のざ瘡を診断するための方法であって、
    対象から皮膚試料を取得することと、
    前記試料から細菌ＤＮＡを単離することと、
    １個以上のプライマーセットを使用して前記ＤＮＡを増幅することと、
    配列番号５５〜８１のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在について、前記増幅されたＤＮＡを解析することと、
    配列番号５５〜８１のうちの少なくとも１個と少なくとも９５％の相同性を有する配列の存在がある場合、前記対象がＩＢ−３系のざ瘡を有すると診断される、方法。
  36. ざ瘡の個人化された治療のための方法であって、対象に影響を与えているざ瘡の菌株（複数可）を判定することと、前記菌株（複数可）を特異的に対象とした有効量の少なくとも１個のファージを前記対象に投与することと、を含む、方法。
  37. 前記対象が、ＲＴ４菌株、ＲＴ５菌株、ＲＴ７菌株、ＲＴ８菌株、ＲＴ９菌株、および／またはＲＴ１０菌株を対象としたファージで治療される、請求項３６に記載の方法。
  38. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩ型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される、方法。
  39. 個人に有効量のファージを投与することを含む、ＩＢ−３菌株を伴うマイクロバイオームＩ型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）およびＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）からなる群から選択される、方法。
  40. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＩ型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、およびＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）からなる群から選択される、方法。
  41. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＩＩ型または優勢なＲＴ８のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される、方法。
  42. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＩＶ型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される、方法。
  43. 個人に有効量のファージを投与することを含む、マイクロバイオームＶ型のざ瘡を患う前記個人を治療するための方法であって、前記ファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６０Ｌ００（配列番号３４）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ１１２Ｎ００（配列番号３５）、ＰＨＬ０３７Ｍ０２（配列番号４５）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ１１５Ｍ０２（配列番号４３）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、ＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）、およびＰＨＬ０６６Ｍ０４（配列番号３９）からなる群から選択される、方法。
  44. 個人に有効量のファージを投与することを含む、プロピオニバクテリウムフメルシイと関連する病気を治療するための方法であって、前記ファージが、ＰＨＬ１１３Ｍ０１（配列番号３６）、ＰＨＬ１１１Ｍ０１（配列番号３３）、ＰＨＬ０８２Ｍ００（配列番号４７）、ＰＨＬ０６７Ｍ１０（配列番号４２）、ＰＨＬ０７１Ｎ０５（配列番号４１）、ＰＨＬ０８５Ｎ００（配列番号４６）、ＰＨＬ０８５Ｍ０１（配列番号４４）、ＰＨＬ１１４Ｌ００（配列番号３７）、ＰＨＬ０７３Ｍ０２（配列番号４０）、およびＰＨＬ０１０Ｍ０４（配列番号３８）からなる群から選択される、方法。
  45. 対象のざ瘡を診断するためのキットであって、
    配列番号１１〜１８、２０、２１、２３、２４、２６、および２７からなる群から選択される少なくとも１個のプライマーと、
    使用説明書と、を含む、キット。
  46. 対象のざ瘡を診断するためのキットであって、
    配列番号１１〜１８、２０、２１、２３、２４、２６、および２７からなる群から選択される少なくとも１個のプライマーと、
    配列番号１９、２２、２５、および２８からなる群から選択される少なくとも１個のプローブと、
    使用説明書と、を含む、キット。

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