ES2326469T3 - Uso de hepcidina para preparar un medicamento para tratar trastornos de la homeostasis del hierro. - Google Patents
Uso de hepcidina para preparar un medicamento para tratar trastornos de la homeostasis del hierro. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un polipéptido que comprende una secuencia de 20 aminoácidos que tiene: - al menos el 50% de identidad con la secuencia SEC ID Nº: 1; - restos de cisteína en las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 14, 17 y 18; y la misma actividad funcional que las formas maduras de hepcidina de un vertebrado; o de un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, para preparar un medicamento para reducir la sobrecarga de hierro.
Description
Uso de hepcidina para preparar un medicamento
para tratar trastornos de la homeostasis del hierro.
La invención se refiere al diagnóstico y la
terapia de trastornos de la homeostasis del hierro.
El hierro es un elemento esencial necesario para
el crecimiento y la supervivencia de casi todos los organismos. En
mamíferos, el equilibrio del hierro se regula principalmente a nivel
de la absorción duodenal del hierro alimenticio. Después de la
absorción, el hierro férrico se carga en la
apo-transferrina en la circulación y se transporta
a los tejidos, incluyendo precursores eritroides, donde se capta por
endocitosis mediada por el receptor de transferrina. Los macrófagos
reticuloendoteliales desempeñan un papel importante en el reciclaje
de hierro de la degradación de hemoglobina de eritrocitos
senescentes, mientras que los hepatocitos contienen la mayor parte
de las reservas de hierro del organismo en polímeros de ferritina.
Durante los últimos cinco años, ha surgido un importante conjunto
de información con respecto a las proteínas implicadas en la
absorción del hierro y en la regulación de la homeostasis del
hierro a partir del estudio de defectos hereditarios, tanto en
seres humanos como en ratones, que conducen a distintos trastornos
del hierro (para una revisión véase ANDREWS, Nat. Rev. Genet., 1,
208-217, 2000). En el caso de deficiencia de hierro,
las consecuencias fisiopatológicas de defectos génicos
identificados se comprenden bien, ya que habitualmente dan como
resultado la pérdida de función de proteínas directamente
implicadas en la ruta de la absorción del hierro. Las proteínas
incluyen los transportadores de hierro DMT1 (también denominados
Nramp2 o DCT1) (FLEMING et al., Nat. Genet., 16,
383-386, 1997; GUNSHIN et al., Nature, 388,
482-488, 1997), ferroportina (también denominada
IREG1 o MTP1) (DONOVAN et al., Nature, 403,
776-781, 2000) y oxidasas de cobre acopladas a
ferroportina, concretamente ceruloplasmina (HARRIS, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 96, 10812-10817, 1999; YOSHIDA et
al., Nat. Genet., 9, 267-272, 1995) y hefastina
(VULPE et al., Nat. Genet., 21, 195-199,
1999).
Por el contrario, varias anomalías asociadas con
la sobrecarga de hierro genética han identificado diversas
proteínas cuyo papel funcional en el control de la homeostasis del
hierro continúa sin comprenderse bien. En seres humanos, la
hemocromatosis hereditaria (HH) es una enfermedad genética
autosómica recesiva común causada por hiperabsorción de hierro
alimenticio, que conduce a una sobrecarga de hierro en el plasma y
múltiples órganos, incluyendo en particular el páncreas, el hígado
y la piel y dando como resultado lesiones en estos órganos y tejidos
debido a los depósitos de hierro.
La hemocromatosis se debe habitualmente a una
mutación en el gen de la hemocromatosis (denominado HFE)
asociado a HLA localizado en el cromosoma 6p y la mayoría de los
pacientes son homocigóticos para la mutación C282Y en HFE
(FEDER et al., Nat. Genet., 13, 399-408,
1996). Además, se han implicado otros loci en diferentes familias
con HH: se ha descrito una mutación sin sentido en el gen del
receptor 2 de la transferrina (TRF2) en 7q en dos familias
con HH no asociadas a HLA (CAMASCHELLA et al., Nat. Genet.,
25, 14-15, 2000) y recientemente se ha mapeado un
locus para hemocromatosis juvenil en el brazo cromosómico 1q
(HFE2). Finalmente, aunque se conoce desde hace tiempo que
la absorción del hierro se regula en respuesta al nivel de las
reservas de hierro del cuerpo y a la cantidad de hierro necesaria
para la eritropoyesis (ROY et al., FEBS Lett., 484,
271-274, 2000), todavía se tiene que
identificar
la naturaleza molecular de las señales que programan las células intestinales para regular la absorción del hierro.
la naturaleza molecular de las señales que programan las células intestinales para regular la absorción del hierro.
Recientemente se han descrito la alteración del
gen murino que codifica el factor de transcripción USF2 y sus
consecuencias en la regulación génica dependiente de glucosa en el
hígado (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272,
21944-21949, 1997).
Los inventores han observado ahora que,
sorprendentemente, los ratones Usf2 -/- desarrollan
sobrecarga de hierro multivisceral que evita solamente el bazo cuyo
contenido de hierro es extraordinariamente inferior en animales
knock-out que en controles. Estos trastornos
metabólicos del hierro se parecen a los observados en
hemocromatosis hereditaria. Sin embargo, no se observó alteración en
genes identificados previamente por su implicación en esta
patología, por ejemplo, HFE o TFR2. Por tanto, los
inventores buscaron nuevos genes candidatos que puedan explicar las
anomalías de la homeostasis del hierro en ratones Usf2 -/-
mediante hibridación sustractiva supresora entre hígados de ratones
Usf2 -/- y ratones de tipo silvestre. Esto permitió aislar un
ADNc que codifica el péptido hepcidina.
La hepcidina (también denominada
LEAP-1, por péptido antimicrobiano expresado en
hígado) se purificó recientemente de ultrafiltrado de sangre humana
y de orina y se observó que era un péptido unido por enlaces
disulfuro que muestra actividad antimicrobiana (KRAUSE et
al., FEBS Lett., 480, 147-150, 2000; PARK et
al., J. Biol. Chem., 276, 7806-7810, 2001). La
proteína se sintetiza en el hígado en forma de un propéptido que
contiene 83 aminoácidos y se convierte en péptidos maduros de 20,
22 ó 25 aminoácidos (PARK et al., J. Biol. Chem., 276,
7806-7810, 2001; PIGEON et al., J. Biol.
Chem., 276, 7811-7819, 2001). También se describió
recientemente que la hepcidina se sintetiza de manera elevada en
hígados de ratones sobrecargados con hierro experimentalmente o
espontáneamente (PIGEON et al., J. Biol. Chem., 276,
7811-7819, 2001). Aunque se cuestionó la relación
de esta sobre-expresión con la sobrecarga de hierro,
se indicó que probablemente se producía como resultado de
inflamación relacionada con sobrecarga crónica de hierro.
Por el contrario, los Inventores han demostrado
ahora que un defecto completo en la expresión de hepcidina conduce
a sobrecarga progresiva de hierro en los tejidos en ratones Usf2
-/-. Además, han obtenido ratones transgénicos que tienen un
transgén que expresa hepcidina bajo el control de un promotor
constitutivo específico del hígado y han observado que dichos
ratones transgénicos estaban gravemente anémicos.
Estos hallazgos permiten proponer nuevos medios
de regulación de la homeostasis del hierro, en particular mediante
la regulación de la captura del hierro alimenticio por el intestino
o del transporte del hierro materno-fetal a través
de la barrera placentaria y del reciclaje del hierro por macrófagos
reticuloendoteliales.
Por consiguiente, la presente invención propone
el uso de un polipéptido que comprende una secuencia de 20
aminoácidos que tiene restos de cisteína en las posiciones 2, 5, 6,
8, 9, 14, 17 y 18 y al menos el 50% de identidad o el 60% de
similitud, preferiblemente al menos el 60% de identidad o al menos
el 70% de similitud, con la siguiente secuencia:
(SEC ID Nº: 1), y que tiene la
misma actividad funcional que las formas naturales de hepcidina de
un vertebrado, o el uso de un ácido nucleico que codifica dicho
polipéptido, para preparar un medicamento útil para reducir la
sobrecarga de
hierro.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos o ácidos nucleicos preferidos
para el uso de acuerdo con la invención son las formas maduras de
hepcidina humana, representadas, por ejemplo, por un polipéptido de
20 aminoácidos que tiene la secuencia SEC ID Nº: 1, o por un
polipéptido de 22 aminoácidos que tiene la secuencia:
(SEC ID Nº:2), o por un polipéptido
de 25 aminoácidos que tiene la
secuencia:
(SEC ID Nº:3), o ácidos nucleicos
que codifican dichos
polipéptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
También pueden usarse precursores de dichas
formas maduras de hepcidina, es decir, pro-hepcidina
y prepro-hepcidina y ácidos nucleicos que codifican
dichos precursores.
Otros ejemplos de polipéptidos o ácidos
nucleicos adecuados para el uso de acuerdo con la invención son
homólogos de vertebrados, preferiblemente de mamífero, de formas
maduras de hepcidina humana o precursores de la misma o ácidos
nucleicos que codifican dichos polipéptidos. Los homólogos conocidos
de vertebrados de hepcidina humana incluyen, por ejemplo, hepcidina
de rata, hepcidina de ratón, hepcidina de trucha.
También pueden usarse polipéptidos quiméricos,
que comprenden la secuencia de una forma madura de hepcidina, (y
finalmente, toda de parte de la secuencia pro o prepro).
La invención también incluye el uso de
equivalentes funcionales de los polipéptidos que se han definido
anteriormente. Los equivalentes funcionales se definen en este
documento como variantes peptídicas, que tienen la misma actividad
funcional que las formas maduras de hepcidina.
Todos estos polipéptidos y ácidos nucleicos
pueden obtenerse por métodos clásicos conocidos por sí mismos. Por
ejemplo, las formas de hepcidina de 20 aminoácidos y 25 aminoácidos
pueden obtenerse de plasma o de orina, como se describe por KRAUSE
et al. o PARK et al. Como alternativa, pueden
obtenerse cultivando células que expresan hepcidina y recuperando
dicho polipéptido del cultivo celular.
De acuerdo con una realización particular,
dichas células son células hospedadoras transformadas por un ácido
nucleico que codifica uno de los polipéptidos que se han definido
anteriormente.
También puede usarse la síntesis química, en
particular en el caso de los derivados peptídicos.
Puede obtenerse un ácido nucleico que codifica
hepcidina a partir de, por ejemplo, una genoteca genómica o de ADNc
de un vertebrado, usando cebadores adecuados capaces de hibridar
selectivamente con dichos ácidos nucleicos. También puede obtenerse
mediante las técnicas clásicas de síntesis de polinucleótidos.
La presente invención también proporciona
métodos para explorar equivalentes funcionales de hepcidina capaces
de reducir la absorción del hierro.
\newpage
Pueden explorarse fácilmente equivalentes
funcionales que tienen las propiedades biológicas de hepcidina en
la regulación de la homeostasis del hierro con mamíferos no humanos
que carecen de hepcidina.
En particular, se proporcionan medios para
explorar equivalentes funcionales de hepcidina capaces de reducir la
absorción del hierro: puede administrarse un compuesto a ensayar
para su capacidad para reducir la absorción de hierro a un animal
knock-out deficiente en expresión de hepcidina.
Puede determinarse el efecto de dicho compuesto
en la sobrecarga de hierro en dicho animal.
Los medicamentos obtenidos de acuerdo con la
invención son útiles para prevenir y/o tratar:
- -
- todas las formas de hemocromatosis;
- -
- la sobrecarga de hierro secundaria, relacionada, por ejemplo, con anemias hereditarias y/o congénitas tales como talasemia;
y enfermedades asociadas con las mismas. Estas
últimas enfermedades incluyen, por ejemplo, hepatocarcinoma,
cardiomiopatía o diabetes.
De acuerdo con otro aspecto, la invención
también propone el uso de un inhibidor de la expresión de hepcidina
o de la actividad de hepcidina para preparar un medicamento útil
para aumentar la absorción de hierro mediante el aumento de la
captura de hierro alimenticio por el intestino y/o el aumento del
reciclaje del hierro por los macrófagos. Dicho medicamento es útil
para tratar anemia o enfermedades relacionadas con anemia. Esto
incluye en particular anemia asociada con enfermedades agudas o
crónicas que se produce en condiciones tales como infección o
inflamación, por ejemplo, enfermedades osteoarticulares tales como
poliartritis reumatoide o tumores malignos, especialmente cuando
están asociadas con un síndrome inflamatorio.
Los inhibidores de la expresión de hepcidina se
seleccionan de moléculas de ARN o ADN antisentido, ribozimas o
anticuerpos.
Los inhibidores de la actividad de hepcidina
incluyen anticuerpos anti-hepcidina, en particular
anticuerpos dirigidos contra las formas maduras de hepcidina.
La presente invención también proporciona medios
para explorar otros inhibidores de actividad de la hepcidina, por
ejemplo, con animales transgénicos, en particular mamíferos
transgénicos no humanos tales como ratones transgénicos que tienen
un transgén que expresa hepcidina, induciendo dicha expresión anemia
en dicho animal.
Por ejemplo, un método para explorar inhibidores
de la actividad de hepcidina capaces de aumentar la absorción de
hierro comprende los siguientes pasos:
Puede administrarse un compuesto a ensayar para
su capacidad de aumentar la absorción de hierro mediante la
inhibición de la actividad de hepcidina a un animal transgénico que
tiene un transgén que expresa hepcidina.
Puede determinarse el efecto de dicho compuesto
sobre la anemia en dicho animal.
Los medicamentos obtenidos de acuerdo con la
invención pueden administrarse de diversas maneras, dependiendo de
su naturaleza:
Por ejemplo, los polipéptidos de hepcidina según
la reivindicación 1, así como los inhibidores de hepcidina como se
definen en la reivindicación 6, tales como anticuerpos
anti-hepcidina, pueden administrase por sí solos o
mezclados con transportadores o excipiente o excipientes adecuados.
Pueden usarse por vía sistémica o por vía local. Una vía de
administración preferida es la vía parenteral, que incluye, por
ejemplo, inyecciones intramusculares, subcutáneas, intravenosas o
intraperitoneales.
La vía oral también puede usarse, a condición de
que el medicamento esté en una forma adecuada para administración
oral, capaz de proteger el principio activo de las enzimas gástricas
e intestinales.
Como se ha indicado anteriormente, también puede
usarse una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un ácido
nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de hepcidina
que se han mencionado anteriormente, para permitir la expresión de
dicho polipéptido en las células o de un ácido nucleico transcrito
en un ARN antisentido, para suprimir la expresión de hepcidina en
las células de un sujeto a tratar.
En este caso, dicha molécula de ácido nucleico
se introduce en las células diana mediante las técnicas clásicas de
transferencia de genes.
Típicamente, dicha molécula de ácido nucleico se
pone bajo control transcripcional de un promotor apropiado. La
elección del promotor depende del uso deseado del medicamento y/o
del órgano o tejido diana. Por tanto, puede elegirse un promotor
constitutivo o inducible y/o ubicuo o específico de tejido.
El casete de expresión obtenido de esta manera
puede transferirse directamente a las células como ADN desnudo, o
ponerse en un vector apropiado, tal como un vector viral, por
ejemplo, un vector obtenido de adenovirus.
La elección del método de transferencia y/o del
vector depende del órgano o tejido diana y/o de si se desea una
expresión a corto plazo (expresión transitoria) o una expresión
estable.
La transferencia de genes puede realizarse ex
vivo en células extraídas del sujeto a tratar y reimplantadas
posteriormente en dicho sujeto, o puede realizarse por
administración directa del ácido nucleico a dicho sujeto.
La invención también proporciona animales no
humanos modificados genéticamente, en los que la modificación
genética da como resultado una anomalía en la expresión de
hepcidina; como se define en las reivindicaciones 8 y 9. La
invención también incluye material biológico, tal como células,
tejidos y órganos obtenidos de dichos animales modificados
genéticamente.
Esto comprende en particular animales
knock-out, preferiblemente mamíferos
knock-out y en particular ratones
knock-out que no expresan hepcidina funcional. Esta
falta de expresión de hepcidina induce una sobrecarga de hierro en
dichos animales. Los ratones knock-out conocidos,
descritos por VALLET et al. (J. Biol. Chem., 272,
21944-21949, 1997), en los que el gen que codifica
el factor de transcripción USF2 está inactivado, están
excluidos.
Los animales knock-out de la
invención pueden obtenerse por inactivación total o parcial del gen
o los genes de la hepcidina, dando como resultado dicha inactivación
la ausencia de producción de hepcidina o una pérdida de
funcionalidad de la misma.
La inactivación del gen de hepcidina puede tener
como objetivo:
- -
- la secuencia que codifica hepcidina, dando como resultado la ausencia de producción de dicha proteína o una pérdida de funcionalidad de la misma y/o
- -
- al menos una de las secuencias reguladoras que controlan la expresión de hepcidina, dando como resultado una falta de producción de hepcidina o una drástica disminución de la cantidad de hepcidina producida.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros animales modificados genéticamente de la
invención que tienen una anomalía en la expresión de hepcidina son
animales transgénicos, preferiblemente mamíferos transgénicos y en
particular ratones transgénicos, que tienen un transgén que expresa
hepcidina, produciendo dicha expresión anemia en dichos
animales.
Se conocen bien en la técnica los métodos
adecuados para la preparación de animales transgénicos o
knock-out, descritos, por ejemplo, en: Manipulating
the Mouse Embryo, 2a Ed., de HOGAN et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1994; Transgenic Animal Technology, editado por
C. PINKERT, Academic Press Inc., 1994; Gene Targeting: A Practical
Approach, editado por A. L. JOYNER, Oxford University Press, 1995;
Strategies in Transgenic Animal Science, editado por G. M.
MONASTERSKY y J. M. ROBL, ASM Press, 1995; Mouse Genetics: Concepts
and Applications, de Lee M. SILVER, Oxford University Press,
1995.
Los animales knock-out que
expresan hepcidina no funcional, así como los animales transgénicos
que tienen un transgén que expresa hepcidina, pueden usarse como
modelos para estudiar los mecanismos de la homeostasis del hierro.
También pueden usarse, como se ha descrito anteriormente, para
explorar compuestos que tienen el mismo efecto que la hepcidina
sobre la absorción del hierro, o para explorar compuestos capaces de
inhibir el efecto de la hepcidina sobre la absorción del hierro.
La invención también proporciona métodos de
diagnóstico para determinar si una anomalía de la absorción del
hierro está asociada con una mutación en hepcidina o con una
producción anormal de hepcidina.
Por ejemplo, la invención proporciona:
- -
- un método para detectar si una anomalía de la absorción del hierro proviene de una producción anormal de hepcidina, en el que dicho método comprende determinar la cantidad de hepcidina en una muestra biológica de un sujeto que padece dicha anomalía;
- -
- un método para detectar si una anomalía de la absorción del hierro está asociada con una mutación que altera la producción de hepcidina funcional, en el que dicho método comprende detectar una mutación en el gen de hepcidina en una muestra de ácido nucleico obtenida de un sujeto que padece dicha anomalía.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras biológicas adecuadas para
determinar la cantidad de hepcidina incluyen, por ejemplo, muestras
de sangre, orina o líquido amniótico o biopsias de órganos, en
particular biopsias de hígado o biopsias de placenta.
Las muestras de ácido nucleico adecuadas para
detectar una mutación que altera la producción de hepcidina
funcional incluyen ARN, ADNc o ADN genómico.
La cantidad de hepcidina en una muestra
biológica puede determinarse fácilmente mediante métodos bien
conocidos, tales como, a modo de ejemplo, cromatografía HPLC,
espectroscopía de masas o mediante inmunoensayo usando anticuerpos
anti-hepcidina.
Las mutaciones en el gen de hepcidina pueden
detectarse fácilmente secuenciando dicho gen o una parte del mismo,
previamente aislado de la muestra de ADN a ensayar, y comparando la
secuencia con la secuencia o las secuencias de tipo silvestre
correspondientes, que puede obtenerse de uno o varios sujetos que no
tienen anomalías de la homeostasis del hierro.
La presente invención se ilustrará
adicionalmente mediante la siguiente descripción adicional, que se
refiere a ejemplos que ilustran los efectos de la falta de
producción de hepcidina en animales knock-out o de
la super-producción de hepcidina en animales
transgénicos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se
proporcionan solamente a modo de ilustración de la invención y no
constituyen de ningún modo una limitación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La alteración del gen Usf2 se ha descrito
anteriormente (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272,
21944-21949, 1997). El alelo mutado contiene el
casete IRES\betageo sin promotor en el exón 7 del gen USF2
murino. Todos los ratones estudiados tienen un fondo genético mixto
que incluía contribuciones de las cepas C57BL/6 y 129/Sv. Los
ratones se alimentaron con pienso para ratón de laboratorio
convencional (AO3, UAR, Francia) que contenía 280 mg de carbonato
férrico por kg. Se eutanasiaron ratones de 2,5 meses hasta 19 meses
de edad. Se realizó el genotipado del ADN de cola de ratón usando
una única reacción de PCR para identificar los alelos de tipo
silvestre (TS) y knock-out para USF2. Se usó
ADN genómico (0,5-1 \mug) en una reacción de 50
\mul que incluía 3 cebadores: el alelo de USF2 de tipo
silvestre se amplificó usando los siguientes cebadores:
El alelo knock-out para
USF2 se amplificó usando los siguientes cebadores:
La PCR se realizó del siguiente modo: 37 ciclos
(consistiendo cada ciclo en 30 s a 94ºC, 30 s a 56ºC y 40 s a 72ºC)
con un paso de desnaturalización inicial a 94ºC durante 4 min y un
paso de elongación final a 72ºC durante 5 min en
Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM,
W-I al 0,05%, MgCl_{2} 2 mM, glicerol al 5%, azul
de bromofenol al 0,04%, cada dNTP 0,2 mM, cada cebador 0,2 \muM,
2 unidades de Taq polimerasa (Gibco). La reacción se analizó en gel
de agarosa al 1,5-2% que contenía bromuro de etidio.
Se observó que este método de PCR para genotipado de ratón
proporciona los mismos resultados que el método de transferencia de
Southern que se ha descrito anteriormente (VALLET et al., J.
Biol. Chem., 272, 21944-21949, 1997).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó ARN total como se ha descrito
anteriormente (CHOMCZYNSKI y SACCHI, Anal. Biochem., 162,
156-159, 1987). Se aisló ARN poliadenilado usando
oligo (dT) celulosa (Boehringer Mannheim Biochemica). La SSH se
realizó entre 3 ARN de hígado combinados de ratones deficientes en
USF2 homocigóticos de 5 meses de edad ('de control') y ARN
de hígado de un ratón de tipo silvestre de 5 meses de edad ('de
ensayo') usando el kit de sustracción de ADNc
PCR-select^{TM} (Clontech) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante para todos los pasos. En resumen, se
mezclaron 14 ng de ADNc de ensayo ligado y 420 ng de control no
ligado, se desnaturalizaron y se dejaron
re-hibridar. Después de la hibridación sustractiva,
se amplificó 1 \mul de ADNc mediante dos rondas de PCR. La
genoteca de ADNc sustraída se clonó en el vector
pT-Adv usando el kit de clonación de PCR
AdvanTAgeTM (Clontech). Después de la PCR secundaria (15 ciclos) con
la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech), la mezcla de
ADNc sustraído para PCR se incubó durante 10 min adicionales a 72ºC
con 1 unidad de ADN polimerasa de Taq (Gibco BRL) para
maximizar la eficacia de clonación y se purificó con el kit de
purificación de PCR QIAquick (Quiagen). La mezcla de ligación se
introdujo en la cepa bacteriana Electromax DH10B (Gibco BRL) por
electroporación (1,8 kV) usando un Cell-Porator®
(Gibco BRL). La genoteca se sembró en placas de agar de 22 x 22 cm
que contenían ampicilina (100 \mug/ml) y se propagó con 40 \mul
de X-gal (40 mg/ml) y 40 \mul de IPTG (0,1 M).
Las bacterias se cultivaron a 37ºC hasta que las colonias fueron
visibles y se mantuvieron a 4ºC hasta que la tinción azul/blanco
pudiera distinguirse claramente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió un total de 400 clones individuales,
se resuspendieron en 30 \mul de agua, se calentaron a 100ºC
durante 10 min, después se pusieron en hielo durante 5 min y se
centrifugaron durante 5 min. Se realizó PCR usando 3 \mul de
sobrenadante limpio con los siguientes cebadores:
Los productos de PCR se transfirieron a filtros
Hybond-N+ (Amersham Pharmacia). Las transferencias
se hibridaron durante una noche a 72ºC con ADNc bicatenario marcado
con ^{32}P-dCTP (RTS RadPrime DNA Labeling System,
Gibco) sintetizado con 2 \mug de ARN poliadenilado de hígado de
ratón de tipo silvestre o Usf2 -/, como se describe más
adelante. Las transferencias se lavaron cuatro veces en SSC 2X/SDS
al 0,1% a 68ºC durante 20 min y dos veces en SSC 0,2X/SDS al 0,1% a
68ºC durante 20 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó ADNc bicatenario en 20 \mul, con
2 \mug de ARN total (o ARN poliA para la genoteca sustraída), en
presencia de 0,25 mM de cada dNTP, 200 ng de cebadores
hexanucleotídicos aleatorios, 20 unidades de RNAsin (Promega), DTT
10 mM y 200 unidades de transcriptasa inversa M-MLV
(Gibco). Después de la desnaturalización del ARN a 70ºC durante 10
min en un termociclador (Perkin Elmer Cetus), se realizó la reacción
durante 1 hora a 42ºC antes de que se inactivara la transcriptasa
inversa durante 6 min a 96ºC. Al final de la reacción se añadieron
80 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 0,1 mM
(pH 8,0). La amplificación por PCR se realizó con 5 \mul de
mezcla de reacción de transcriptasa inversa en 50 \mul de
Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2
mM, W-1 al 0,05% (v/v), 0,2 mM de cada dNTP, 1 pmol
de cebadores específicos directos e inversos (enumerados más
adelante), 1 pmol de cebadores de \beta-actina de
control directos e inversos y 2 unidades de Taq polimerasa
(Gibco). Las condiciones de PCR eran 25 ciclos de desnaturalización
a 94ºC durante 20 s, hibridación a 50ºC durante 20 s y extensión
con cebador a 72ºC durante 20 s. Después de la PCR, se separaron los
productos amplificados (171 pb para HEPC1 o HEPC2 y
250 pb para \beta-actina) mediante electroforesis
en gel de agarosa al 1,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de los cebadores eran las
siguientes:
* HEPC1:
\vskip1.000000\baselineskip
* HEPC2:
\vskip1.000000\baselineskip
* \beta actina:
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores usados para la amplificación de
DMT1 eran los siguientes:
* isoforma de DMT1 sin IRE:
\vskip1.000000\baselineskip
* DMT1 con IRE:
\vskip1.000000\baselineskip
* Normalización con 14S:
\newpage
Los cebadores usados para la amplificación de
las sondas usadas para detectar los ARNm específicos eran:
* para amplificación de ADNc (1080 pb) de
hemocromatosis (HFE) de ratón:
\vskip1.000000\baselineskip
* para amplificación de ADNc (285 pb) del
receptor de transferrina (TfR) de ratón:
\vskip1.000000\baselineskip
* para amplificación de ADNc (333 pb) del
receptor 2 de transferrina (TFR2) de ratón:
\vskip1.000000\baselineskip
* para amplificación de ADNc (350 pb) de
ceruloplasmina de ratón:
\vskip1.000000\baselineskip
* para amplificación de ADNc (258 pb) de hemo
oxigenasa 1 (HmoxI) de ratón:
\newpage
Cada fragmento se amplificó usando Taq
polimerasa y ADNc total hepático, se purificó de gel de agarosa
(kit de purificación de PCR QIAquick, Qiagen) y se subclonó en el
vector TA (kit de clonación AdvanTAge, Clontech). El plásmido
recombinante se seleccionó de acuerdo con el protocolo y se
amplificó en medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se
purificó (QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). Cada ADNc se purificó del
vector después de la digestión con EcoRI y migración en gel de
agarosa. La sonda usada para detectar ARNm de HEPC1 se
preparó a partir de la digestión con EcoRI del
pT-Adv/HEPC1 aislado mediante hibridación
sustractiva supresora. Se desnaturalizaron veinte microgramos de
ARN de cada fuente en tampón que contenía formaldehído y se
sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1%, formaldehído
2,2 M. La transferencia de Northern se realizó como se ha descrito
anteriormente (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272,
21944-21949, 1997). Se separó cada transferencia y
se resondó con ADNc 18 S ribosómico, para comprobar la integridad y
la cantidad de los ARN cargados.
\vskip1.000000\baselineskip
Las transferencias de Southern se realizaron
como se ha descrito anteriormente (VALLET et al., J. Biol.
Chem., 272, 21944-21949, 1997). La sonda de
HEPC1 se preparó a partir de un fragmento de ADN genómico de
ratón de 1437 pb amplificado con los siguientes cebadores:
Después de la digestión con PvuII, se purificó
un fragmento de 545 pb del gel de agarosa y se usó como sonda para
la transferencia de Southern. Esta sonda de HEPC1 mostró una
identidad del 95% con la región de HEPC2 homóloga.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo sangre por flebotomía
retro-orbital antes de la eutanasia de los ratones y
se recogió en tubos heparinizados (T-MLH
capiject^{TM}, Terumo® medical corporation). Los hemogramas y
parámetros de los eritrocitos se determinaron usando un analizador
automático MaxM coulter.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación del nivel de hierro se realizó
como se ha descrito anteriormente por Torrance y Bothwell (1968) en
fragmentos u órganos enteros usando IL test^{TM} (Instrumentation
Laboratory). Para la histología, se fijaron los tejidos en
formaldehído al 4%, se incluyeron en parafina, se montaron sobre
portaobjetos y se tiñeron con azul de Prusia y tinción de contraste
con rojo nuclear usando procedimientos convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los ratones USF2 -/- presentan
después del tercer mes de vida una densa pigmentación marrón del
hígado y una pigmentación bronce más o menos pronunciada del
páncreas. Dado que este rasgo fenotípico es característico de la
hemocromatosis, el trastorno hereditario de la absorción del hierro,
se decidió analizar el estado del hierro de los ratones Usf2
-/-. En primer lugar, para evaluar el nivel de acumulación de
hierro, se realizó tinción con azul de Prusia de Perls en hígado y
páncreas de ratones de tipo silvestre y Usf2 -/- alimentados
con una dieta convencional.
Los resultados se muestran en la Figura 1 (de A
a D):
Leyenda: sección de hígado de (A) ratones de
tipo silvestre de 8 meses de edad (x 50), (B) miembro de la misma
camada Usf2 -/- de 8 meses de edad y (C) ratón Usf2
-/- de 19 meses de edad (x 10). La sección del páncreas en (D)
es de un ratón Usf2 -/- de 8 meses de edad (x 12,5). Las
puntas de flecha en C indican hierro en el núcleo del hepatocito.
Las puntas de flecha en D señalan los islotes de Langerhans
dispersos por todo el tejido exocrino.
Mientras que los ratones de control mostraron
muy poca o ninguna tinción de hierro positiva en el hígado (Fig.
1A), los ratones Usf2 -/- presentaron acumulación de hierro
en los hepatocitos (Fig. 1B-C). Este depósito de
hierro se limitó principalmente a los hepatocitos periportales y
después, con la edad, el número de hepatocitos teñidos aumentó. A
los 19 meses de edad, como se muestra en la Fig. 1C, la acumulación
de hierro era considerable y la tinción era homogénea por todo el
parénquima hepático. Además, en algunos hepatocitos se detectó una
intensa acumulación de hierro nuclear (Fig 1B). Para el páncreas, se
obtuvieron resultados similares, es decir, ninguna tinción en el
tejido de control y una intensa acumulación de hierro en el páncreas
exocrino de ratones Usf2 -/- (Fig. 1D).
Para cuantificar más exactamente la sobrecarga
de hierro durante la vida de los animales, se midieron los niveles
de hierro en hígado y páncreas de ratones de 2,5 a 19 meses de
edad.
Los resultados se muestran en la Figura 1 (E y
F):
Leyenda: concentración de hierro no hemo
(microgramos de hierro por gramo de tejido seco) hepática (E) y
pancreática (F) dependiente de la edad cuando se mide en ratones de
control (ratones de tipo silvestre y heterocigóticos, \ding{115})
y Usf2 -/- (\Box).
Como se muestra en la Fig. 1E, el hierro se
acumula en el hígado de ratones entre 60 y 100 días después del
nacimiento y alcanzó un nivel correspondiente aproximadamente a un
contenido de hierro 10 veces mayor que en ratones de tipo
silvestre. En el páncreas (Fig. 1F), la acumulación de hierro fue
más progresiva, con niveles en ratones Usf2 -/- un máximo de
20 veces superior que en ratones de tipo silvestre. La acumulación
de hierro también se midió en riñón y corazón mostrando una
acumulación de 2 y 4 veces, respectivamente. Finalmente, se observó
un nivel de hierro 1,7 veces superior en el suero de ratones Usf2
-/- en comparación con ratones de control (3.550 \pm 259
\mug de hierro/l en controles [n=15] frente a 6.274 \pm 514
\mug de hierro/l en ratones Usf2 -/- [n=13] P<(0,0001),
pero este aumento no pareció ser dependiente de la edad. Este
aumento del nivel de hierro en suero en ratones Usf2 -/- se
correlacionó con un aumento de 1,6 veces de la saturación de
transferrina (61 \pm 9% de saturación en controles [n=6] frente al
95 \pm 9% de saturación en ratones Usf2 -/- [=6]
P<0,0004). Finalmente, en la hembra de más edad analizada hasta
ahora (19 meses), la sobrecarga de hierro se extendió con un nivel
de hierro aumentado en todos los tejidos ensayados incluyendo
músculo, útero, pulmón e hipófisis (no mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Figura 2:
Leyenda de la Figura 2:
(A) Concentración de hierro no hemo esplénico
dependiente de la edad (microgramos de hierro por gramo de tejido
seco) cuando se mide en ratones de control (ratones de tipo
silvestre y heterocigóticos, \ding{115}) y Usf2 -/-
(\Box). Sección de b1azo de (B) un ratón de tipo silvestre de 8
meses de edad (x 20) representativo y (C) un miembro de la misma
camada de Usf2 -/- de 8 meses de edad (x 20) teñido con la
tinción de Perls para hierro. RP: pulpa roja; WP pulpa blanca.
A diferencia de todos los demás tejidos
ensayados, se observó una acumulación de hierro dependiente de la
edad en el bazo de ratones de tipo silvestre, como se muestra (Fig.
2A).
Se observaron gránulos que dieron una reacción
positiva con tinción con azul de Prusia de Perls, principalmente
dispersos entre células de la pulpa roja (Fig. 2B). Se observó que
esta acumulación fluctuaba enormemente entre ratones, sugiriendo
que puede depender del fondo de cepa híbrida (129/Sv x C57BL/6) de
cada animal. Este depósito de hierro natural se ha comunicado
anteriormente en ratones C57BL/6 y se describió que se producía
principalmente en macrófagos esplénicos (VENINGA et al., Lab.
Anim., 23, 16-20, 1989). De manera sorprendente, en
el bazo de ratones Usf2 -/-, los niveles de hierro
permanecieron muy bajos (Fig. 2A), con una ausencia completa de
tinción con azul de Prusia de Perls.
\vskip1.000000\baselineskip
Para descartar la posibilidad de que la
acumulación de hierro aumentada en ratones Usf2 -/- pudiera
ser el resultado de anemia diseritropoyética, se midieron los
parámetros eritroides en ratones de control y Usf2 -/- a
diferentes edades. Los valores del recuento de glóbulos rojos (RCB,
10^{6}/ml), concentración de hemoglobina (Hb, g/dl) y volumen
corpuscular medio (MCB, fl) eran normales: RBC, Hb y MCB de 10,3
\pm 0,3, 16,73 \pm 0,49 y 48,27 \pm 0,67 para ratones de tipo
silvestre (n=3); 10,0 \pm 0,3, 15,67 \pm 0,06 y 48,63 \pm 1,63
para ratones Usf2 -/- (n=3), respectivamente.
Por tanto, de manera interesante, las anomalías
del hierro observadas en ratones Usf2 -/-, incluyendo la
resistencia del bazo a la acumulación de hierro y los parámetros
hematológicos normales, se parecen notablemente al fenotipo de
ratones HFE -/ (LEVY et al., Blood, 94,
9-11, 1999; ZHOU et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 95, 2492-2497, 1998), el modelo murino de
hemocromatosis hereditaria.
\newpage
Puesto que USF2 es un factor de transcripción,
se determinó si USF2 podría estar implicado en la regulación de
genes que codifican proteínas relacionadas con el metabolismo del
hierro. Debido a la similitud entre ratones HFE -/- y el
modelo Usf2 -/-, se comprobó en primer lugar la expresión del
gen HFE. También se examinó el gen que codifica el receptor
2 de la transferrina, del cual se ha descrito recientemente una
mutación en HH (CAMASCHELLA et al., Nat. Genet., 25,
14-1, 2000).
Los resultados se muestran en la Figura 3:
Leyenda de la Figura 3:
Veinte microgramos de ARN total de hígado de
ratones de tipo silvestre y ratones Usf2 -/- (de 3 a 11 meses
de edad) se sometieron a electroforesis y transferencia. Las
transferencias se hibridaron con una sonda marcada con 32P
(generada por PCR, como se describe en Materiales y Métodos) para
HFE (A) y RTf2 (B).
Como se muestra en la transferencia de Northern
de la Fig. 3A, la abundancia de ARNm de HFE en el hígado de
ratones Usf2 -/- es comparable a la de ratones de tipo
silvestre. El análisis de transferencia de Northern también
demostró que la expresión hepática del gen RTf2 no se
modificó en ratones Usf2 -/- en comparación con ratones de
tipo silvestre (Fig. 3B).
También se controló el nivel de ARNm de
ceruloplasmina, hemo oxigenasa 1 y receptor de transferrina en
ratones Usf2 -/-, ya que se había descrito que la abundancia
de estos ARNm se modificaba en trastornos que alteran el equilibrio
del hierro (para una revisión véase ANDREWS et al., Nutr.
Rev., 57, 114-123, 1999). Se observó de nuevo que
el nivel de estos ARNm era comparable en ratones Usf2 -/- y
de control.
Finalmente, se analizó la expresión del gen
DMT1 (denominado también Nramp2), la principal proteína
transmembrana de captación de hierro que transporta activamente el
hierro alimenticio reducido al interior de eritrocitos
intestinales. Se analizó la expresión duodenal de DMT1 por
cuantificación relativa usando RT-PCR (7 ratones
Usf2 -/-
frente a 6 de control). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de ratones (no mostrados).
frente a 6 de control). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de ratones (no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar genes cuyo nivel de expresión
está modificado en ratones Usf2 -/-, se realizó una genoteca
de ADNc sustraída entre hígado de ratones Usf2 -/- (de
control) y de tipo silvestre (de ensayo) (DIATCHENKO, Proc. Natl.
Sci. USA, 93, 6025-6030, 1996). Entre los 400 clones
analizados, varios clones estaban regulados negativamente en el
hígado de ratones Usf2 -/- como se analiza por transferencia
de Northern inversa (no mostrado). Uno de estos clones contenía un
ADNc de longitud completa que codifica el péptido hepcidina
caracterizado recientemente (KRAUSE et al., FEBS Lett., 480,
147-150, 2000; PARK et al., J. Biol. Chem.,
276, 7806-7810, 2001; PIGEON et al., J. Biol
Chem., 276, 7811-7819, 2001).
\vskip1.000000\baselineskip
El genoma murino contiene dos genes de hepcidina
estrechamente relacionados que se con-localizan en
el mismo clon genómico de ratón (clon de Genbank, número de acceso
AC020841). PIGEON et al. (J. Biol Chem., 276,
7811-7819, 2001) denominaron estos genes
HEPC1 y HEPC2. De manera interesante, el clon genómico
CT7-8N15 también mostró que HEPC1 se sitúa
en estrecha proximidad del gen Usf2 en el cromosoma 7 murino.
PIGEON et al. describieron que HEPC1 se localizaba
directamente cadena abajo del gen Usf2 (PIGEON et al.
J. Biol. Chem., 276, 7811-7819, 2001). Analizando
otro clon genómico, RP23-22G9 (Genbank, número de
acceso AC87143), se observó que parte del gen Usf2
(incluyendo los exones 8, 9 y 10) también estaba duplicado y que, de
hecho, HEPC1 se sitúa cadena abajo del gen Usf2
truncado.
La organización genómica de los genes
Usf2 y de hepcidina se muestra en la Figura 4.
Leyenda de la Figura 4:
Representación esquemática (no a escala) de la
región del locus que incluye los genes Usf2 y hepcidina. El
alelo dirigido se representa con la inserción del casete betageo en
el exón 7 (VALLET et al. J. Biol. Chem., 272,
21944-21949, 1997). Los datos se obtienen del clon
genómico RP23-22G9 (Genbank). Hasta ahora, no se
disponía de datos con respecto a la orientación y la distancia entre
los dos genes de hepcidina. La transferencia de Southern a la
derecha de la Figura es de ADN de cola de ratones heterocigotos y
homocigotos, de tipo silvestre, digerido con BglII e hibridado con
la sonda de HEPC1. Se detectaron dos bandas del tamaño
esperado, 12,4 kpb y 5,1 kpb, cualquiera que fuese el genotipo.
Usando la sonda de USF2 se mostraron las mismas bandas.
El gen HEPC2 se localiza cadena abajo del
gen Usf2 funcional completo y el gen HEPC1 se localiza
cadena abajo del gen Usf2 parcial. En la actualidad, no
existe información disponible con respecto a la orientación
relativa 5'-3' de los genes HEPC1 y HEPC2 ni
la distancia entre los mismos.
Debido a la proximidad del gen Usf2 y del
locus de hepcidina, se determinó si el acontecimiento de
recombinación en el intrón 7 del alelo de Usf2 dirigido
podría haber eliminado o truncado los genes HEPC1 y HEPC2.
Para comprobar esta hipótesis, se realizó transferencia de Southern
en ADN de cola genómico de ratones Usf2 +/- o Usf2
-/-, de tipo silvestre, con una sonda de HEPC1 (Fig. 4).
El ADN genómico se digirió con BglII. Basándose en el análisis del
locus AC087143, se predijo que esta digestión genera dos fragmentos
de 5,1 y 12,4 kpb, que contienen los genes HEPC1 y HEPC2,
respectivamente. Debido a la estrecha similitud (más del 95%) entre
la región de hibridación de HEPC1 y HEPC2, se esperaba que
ambas bandas se mostrasen mediante la sonda de HEPC1. Esto
es lo que se observó, como se muestra en la transferencia de
Southern en la Fig. 4. Se observó el mismo patrón con ADN de
ratones Usf2 -/- indicando que los genes de hepcidina están
presentes en ratones Usf2-/ y que no han experimentado una
redisposición importante. Finalmente, las dos bandas también
hibridaron con una sonda de USF2 que se extiende desde el
exón 8 al exón 10, demostrando que los exones 8 a 10 de USF2
están efectivamente duplicados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió el nivel de expresión de los genes de
hepcidina mediante análisis de transferencia de Northern. De hecho,
el ARNm de hepcidina era totalmente indetectable en el hígado de
ratones Usf2-/- (Fig. 5). Cabe señalar que el hígado de
ratones Usf2 +/ contenía una cantidad reducida de ARNm de
hepcidina en comparación con la de ratones de tipo silvestre. Para
evaluar adicionalmente el nivel específico de mensajeros de
HEPC1 y HEPC2, se diseñaron cebadores específicos
para los transcritos de HEPC1 y HEPC2. Mediante
RT-PCR se demostró que ambos genes se transcribían
activamente en el hígado de ratones de tipo silvestre (Fig.
5B-C) mientras que los transcritos tanto de
HEPC1 como de HEPC2 estaban totalmente ausentes en el
hígado de ratones Usf2 -/- (Fig. 5B-C).
Leyenda de la Figura 5:
(A) Veinte microgramos de ARN total de hígado de
animales de tipo silvestre, Usf2 +/- y Usf2 -/- (entre
3 y 11 meses de edad) se sometieron a electroforesis y
transferencia. La transferencia se hibridó con una sonda de
HEPC marcada con 32P (preparada como describe en
"Materiales y Métodos") que más probablemente reconocía los
transcritos tanto de HEPC1 como de HEPC2. (B) Se
midieron los niveles específicos de HEPC1 y HEPC2
mediante RT-PCR como se describe en Materiales y
Métodos. Después de la PCR, los productos amplificados (171 pb para
HEPC1 o HEPC2 y 250 pb para
\beta-actina) se separaron mediante electroforesis
en gel de agarosa al 1,5%. Ninguno de los cebadores específicos de
HEPC1 ni de HEPC2 fueron capaces de reamplificar los
productos PCR de HEPC2 y HEPC1, respectivamente,
demostrando la elevada especificidad de cada par de cebadores (no
mostrado).
La similitud de las alteraciones en el
metabolismo del hierro entre ratones knock-out para
HFE y los ratones Usf2-/ deficientes en hepcidina
sugiere que la hepcidina puede funcionar en la misma ruta reguladora
que HFE. Se ha demostrado que HFE interacciona físicamente con el
receptor de transferrina en células crípticas de la mucosa duodenal
(WAHEED et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,
1579-1584, 1999). Sin quedar ligado a la teoría,
puede postularse que esta interacción modula el estado del hierro de
estas células que, a su vez, controlan la expresión de los
transportadores apicales y basolaterales en células maduras en las
puntas de las vellosidades. La hepcidina puede ser necesaria para
la actividad de HFE quizás mediante la interacción directa con el
complejo HFE/beta2 microglobulina/receptor de transferrina. De
manera similar, la hepcidina puede ser necesaria para la regulación
del depósito de hierro en macrófagos. La presencia de una proteína
de HFE mutada o un defecto completo en la expresión de hepcidina
puede ser responsable de absorción de hierro intestinal aumentada y
de reservas de hierro reducidas en macrófagos, de acuerdo con el
modelo mostrado en la Figura 6.
En este modelo, la hepcidina evita la sobrecarga
de hierro reduciendo el transporte de hierro al enterocito y
programando los macrófagos para retener el hierro. En ratones
Usf2 -/-, la deficiencia de hepcidina sería responsable del
transporte de hierro intestinal aumentado y de reservas de hierro
reducidas en macrófagos.
En ambas condiciones, el hierro plasmático
supera la capacidad de unión de transferrina y el hierro no unido a
transferrina se acumula en diversos tejidos incluyendo corazón y
páncreas.
De acuerdo con la función propuesta de la
hepcidina en la homeostasis del hierro, la producción de hepcidina
puede depender de la captación de hierro unido a transferrina
mediada por TFR2 en hepatocitos. Esto podría explicar por qué el
defecto de TFR2 es responsable de una forma de hematocromatosis
genética humana si este defecto conduce a una disminución en la
secreción de hepcidina que, a su vez, da como resultado una
absorción de hierro aumentada. Esta hipótesis se podrá ensayar
midiendo la hepcidina en plasma en pacientes con deficiencia de TFR2
o en ratones knock-out para TFR2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó ADNc de longitud completa de ADNc
de hepc1 murino usando los cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
Ambos cebadores contienen un sitio Stul
(subrayado).
El fragmento de PCR de hepc1 se introdujo entre
el promotor de transtiretina (TTR) de ratón (que consiste en el
primer exón, primer intrón y la mayor parte del segundo exón) y el
casete de señal poli (A) T pequeño de SV40. La construcción lleva 3
kb de secuencias de ADN de TTR de ratón 5' al sitio cap (YAN et
al., EMBO J., 9, 869-879, 1990). El transgén de
TTR-hepc1 de 4,7 kpb se separó de la secuencia
plasmídica mediante digestión con HindIII y se usó para
microinyección pronuclear.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó transferencia de Southern de acuerdo
con métodos convencionales (SAMBROOK et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press: 1989). Se preparó ADN genómico a partir de cola como se
indica a continuación: se cortó un trozo de 5 mm de cola de cada
ratón y se puso en 500 \mul de mezcla de digestión (Tris 50 mM,
pH 8/EDTA 100 mM /NaCl 100 mM/SDS al 1%). Se añadió proteinasa K
(200 \mug) y se realizó la digestión a 55ºC durante una noche. Las
muestras se extrajeron directamente añadiendo 500 \mul de
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (1/24/25). Después de agitación
vorticial y centrifugación, se precipitó la fase acuosa
transparente con un volumen de isopropanol. Para la transferencia de
Southern, el ADN se digirió con BamHI, que cortó dos veces el
transgén. Después de la electroforesis, el ADN se transfirió a una
membrana de nylon (Hybond N+, Amersham). La sonda se corresponde al
fragmento de BglII-HindIII de 1,7 kpb del plásmido
TTR que se ha descrito anteriormente (YAN et al., EMBO J., 9,
869-878, 1990). La sonda se marcó con dCTP ^{32}P
con cebado aleatorio, usando un kit disponible en el mercado (DNA
Labeling System, Gibco). El fragmento marcado de 5,3 kpb
corresponde al gen de TTR endógeno y el fragmento marcado de 4,7 kpb
se corresponde al transgén.
Para la reacción de PCR, se utilizó ADN genómico
(0,5-1 \mug) en reacciones de 25 \mul que
incluían dos cebadores: el transgén de TTR-hepc1 se
amplificó usando los cebadores:
La reacción de PCR se realizó del siguiente
modo: 25 ciclos (cada ciclo consiste en 40 segundos a 94ºC, 40
segundos a 50ºC y 40 segundos a 72ºC) con un paso de
desnaturalización inicial a 94ºC durante 4 minutos y un paso de
elongación final a 72ºC durante 5 minutos en
Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM,
W-I al 0,05%, MgCl_{2} 2 mM, cada dNTP 0,2 mM,
cada cebador 0,2 \muM, 2 unidades de Taq polimerasa (Gibco). El
producto específico de 612 pb se amplificó con un fragmento no
específico del mismo tamaño. La presencia del transgén se muestra
después de la digestión del producto de PCR con 10 unidades de Stul
durante 2 horas que produce 268 pb y 344 pb. La reacción se analizó
en gel de agarosa al 1,5-2% que contenía bromuro de
etidio. La amplificación del fragmento no específico garantiza que
la ausencia del transgén no se debe a la falta o degradación de ADN
genómico. Se observó que este método de PCR para genotipado de ratón
daba los mismos resultados que el método de transferencia de
Southern.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron un total de nueve ratones
fundadores transgénicos independientes por el método clásico de
microinyección de una construcción linealizada.
La construcción se representa esquemáticamente
en la Figura 7A.
La Figura 7B muestra una transferencia de
Southern con los diferentes fundadores.
Tres fundadores de ratones transgénicos (TH27,
TH 37 y TH52) eran indistinguibles de los miembros de su misma
camada de ratones tipo silvestre (Ts). Tres fundadores de ratones
transgénicos nacieron con una piel pálida y murieron a las pocas
horas del nacimiento (bb2, 3 y 5). Finalmente, el fenotipo de los
tres últimos fundadores de ratones transgénicos (TH5, 35 y 44) era
inequívoco: tenían pérdida de pelo en todo el cuerpo y su piel
estaba arrugada. Se realizaron frotis de sangre de estos animales y
se encontraron pruebas de poiquilocitosis intensa e hipocromía en
los tres ratones con la piel arrugada.
Los anteriores ejemplos destacan el papel de la
hepcidina como un regulador clave en la homeostasis del hierro. La
hepcidina se propone como un nuevo gen candidato que, cuando muta,
podría estar implicado en la regulación anormal del metabolismo del
hierro y el desarrollo de HH. Finalmente, el nuevo modelo murino de
enfermedad de sobrecarga de hierro que se ha descrito anteriormente
parece ser un modelo animal adecuado para ensayar nuevos enfoques
terapéuticos para la prevención y corrección del depósito del hierro
en HH así como para la comprensión de la homeostasis del hierro.
<110> INSERM
\vskip0.400000\baselineskip
<120>USO DE LA HEPCIDINA COMO UN REGULADOR
DE LA HOMEOSTASIS DEL HIERRO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPcb598-54
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 01401377,5
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<151>
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<160> 37
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
\newpage
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<400> 4
\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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<400> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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<400> 6
\hskip1cm
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<210> 7
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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<400> 7
\hskip1cm
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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\hskip1cm
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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<400> 9
\hskip1cm
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
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<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 23
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<212> ADN
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<400> 11
\hskip1cm
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<210> 12
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 20
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<212> ADN
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<400> 15
\hskip1cm
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<211> 18
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<212> ADN
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<211> 24
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<212> ADN
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1cm
<10> 18
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 20
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<212> ADN
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\hskip1cm
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<210> 20
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<211> 19
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<212> ADN
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<400> 20
\hskip1cm
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
Claims (13)
1. Uso de un polipéptido que comprende una
secuencia de 20 aminoácidos que tiene:
- -
- al menos el 50% de identidad con la secuencia SEC ID Nº: 1;
- -
- restos de cisteína en las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 14, 17 y 18; y la misma actividad funcional que las formas maduras de hepcidina de un vertebrado;
o de un ácido nucleico que codifica dicho
polipéptido, para preparar un medicamento para reducir la sobrecarga
de hierro.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicho polipéptido comprende una secuencia de 20 aminoácidos que
tiene al menos el 60% de identidad con la secuencia SEC ID Nº: 1 y
que tiene restos de cisteína en las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 14, 17
y 18.
3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que
dicho vertebrado es un mamífero.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, en el que dicho medicamento es útil para prevenir y/o tratar
hemocromatosis.
5. El uso de la reivindicación 4, en el que
dicho medicamento es útil para prevenir y/o tratar una enfermedad
que se produce por hemocromatosis, seleccionada entre
hepatocarcinoma, cardiomiopatía o diabetes.
6. Uso de un inhibidor de la expresión de
hepcidina o de la actividad de hepcidina, seleccionado entre el
grupo que comprende anticuerpos, moléculas de ADN o ARN antisentido
o ribozimas, para preparar un medicamento para aumentar la absorción
de hierro.
7. El uso de la reivindicación 6, en el que
dicho medicamento es útil para tratar anemia o una enfermedad que se
produce por la misma.
8. Un animal no humano knock-out
en el que se ha inactivado el gen o los genes de hepcidina,
excluyendo ratones knock-out en los que el gen que
codifica el factor de transcripción de USF2 también está
inactivado.
9. Un animal no humano transgénico que comprende
un transgén que expresa hepcidina.
10. Uso de un animal no humano
knock-out en el que se ha inactivado el gen o los
genes de hepcidina, para la exploración de compuestos para reducir
la absorción de hierro.
11. Uso de un animal no humano transgénico de la
reivindicación 9 para la exploración de compuestos capaces de
inhibir el efecto de hepcidina sobre la absorción del hierro.
12. Un método de diagnóstico para detectar si
una anomalía de la absorción del hierro se produce por una
producción anormal de hepcidina, en el que dicho método comprende
determinar la cantidad de hepcidina en una muestra biológica de un
sujeto que padece dicha anomalía.
13. Un método de diagnóstico para detectar si
una anomalía de la absorción del hierro está asociada con una
mutación que altera la producción de hepcidina funcional, en el que
dicho método comprende detectar una mutación en el gen de hepcidina
en una muestra de ácido nucleico de un sujeto que padece dicha
anomalía.
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