CN102245626A - 微型铁调素肽及其使用方法 - Google Patents

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CN102245626A CN2009801489671A CN200980148967A CN102245626A CN 102245626 A CN102245626 A CN 102245626A CN 2009801489671 A CN2009801489671 A CN 2009801489671A CN 200980148967 A CN200980148967 A CN 200980148967A CN 102245626 A CN102245626 A CN 102245626A
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Abstract

本发明提供了具有铁调素活性的肽及其制备和使用方法。

Description

微型铁调素肽及其使用方法
交叉参考
本申请要求2008年12月5日提交的美国临时申请61/120,277的优先权，通过引用将该申请全文纳入本发明。FPIC
政府资助声明
本发明得到由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号为DK 075378和DK 065029的政府支持。政府在本发明中拥有一定的权益。
技术领域
本发明涉及一种具有铁调素活性的肽。
背景技术
铁调素，一种由肝脏产生的肽类激素，是一种人类和其它哺乳动物的铁稳态调节剂。铁调素通过与其受体铁输出通道铁转运蛋白结合，并引起其内化和降解，从而发挥作用。人铁调素是一种25-氨基酸的肽(Hep25)。参见Krause等(2000)FEBS Lett 480：147-150，和Park等(2001)J Biol Chem276：7806-7810。如Jordan等(2009)J Biol Chem 284：24155-67所描述，该具有生物活性的25-氨基酸形式的铁调素的结构为由8个半胱氨酸形成4个二硫键的单一的发夹结构。
铁调素活性异常与包括遗传性血色病和铁负荷性贫血的铁超负荷疾病相关。遗传性血色病(HH)是一种遗传性铁超负荷疾病，主要是由铁调素不足引起，或极少数由铁调素耐受性引起。这些使得饮食中铁离子的过量吸收和铁超负荷的形成。HH的临床表现可以包括肝病(肝硬化，肝癌)，糖尿病和心脏衰竭。目前，HH的唯一治疗方法是定期放血，这种方法非常有效，但使病人非常苦恼。
铁负荷贫血是一种无效红细胞生成的遗传性贫血症，如β-地中海贫血，并伴有严重的铁超负荷。铁超负荷的并发症是这些患者发病和死亡的主要原因。铁调素缺乏是未输血患者铁超负荷的主要原因，并且促使输血患者的铁超负荷。对于这些患者，目前治疗铁超负荷的方法是铁螯合，这种方法非常繁重，有时无效，并且伴有频繁的副作用。
发明内容
本发明涉及一种具有铁调素活性的肽及其使用方法。
本发明提供了一种肽，该肽可以是分离的和/或纯化的，含有下述结构式、主要由以下结构式构成或者由以下结构式构成
A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10
其中
A1是Asp、Glu、焦谷氨酸(pyroglutamate)、Gln、Asn、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A2是Thr、Ser、Val、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A3是His、Asn、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A4是Phe、Leu、Ile、Trp、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；
A5是Pro、Ser、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A6是Ile、Leu、Val、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A7是Cys、Ser、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括S-叔丁基-半胱氨酸；
A8是Ile、Leu、Thr、Val、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A9是Phe、Leu、Ile、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；并且
A10是Cys、Ser、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
其中，羧基末端氨基酸是酰胺或羧基形式；
至少一个巯基氨基酸作为氨基酸之一存在于序列中；并且
A1、A2、A3、A1至A2、A1至A3、A10、A9至A10、A8至A10、或者它们的组合可选择性地缺失。
条件是所述肽不含有Hep25的氨基酸残基1至6。
在一些实施方式中，本发明的所述肽不是Hep4-7、Hep3-7、Hep1-7、Hep9C7-tBut、Hep9-C7A、Hep9-7CS、(D)Pen、Cyc-2、Cyc-3、Cyc-4、或者Pr26。
在一些实施方式中，本发明的所述肽只含有一个氨基酸残基，所述氨基酸残基含有能够形成二硫键的巯基。
在一些实施方式中，本发明的所述肽只含有两个氨基酸残基，所述氨基酸残基各自含有能够形成二硫键的巯基。
在一些实施方式中，
A1是D-Asp、D-Glu、D-焦谷氨酸、D-Gln、D-Asn、bhAsp、Ida、或者N-MeAsp；
A2是D-Thr、D-Ser、D-Val、Tle、Inp、Chg、bhThr、或者N-MeThr；
A3是D-His、D-Asn、DArg、Dpa、(D)Dpa、或者2-氨基茚；
A4是D-Phe、D-Leu、D-Ile、D-Trp、Phg、bhPhe、Dpa、Bip、1Nal、bhDpa、Amc、PheF5、hPhe、Igl、或者环己基丙氨酸；
A5是D-Pro、D-Ser、Oic、bhPro、反式-4-PhPro、顺式-4-PhPro、顺式-5-PhPro、Idc；
A6是D-Ile、D-Leu、Phg、Chg、Amc、bhIle、Ach、和MeIle；
A7是D-Cys、D-Ser、D-Ala、Cys(S-tBut)、homoC、Pen、(D)Pen、Dap(AcBr)、和Inp；
A8是D-Ile、D-Leu、D-Thr、D-Val、D-Arg、Chg、Dpa、bhIle、Ach、或者MeIle；
A9是D-Phe、D-Leu、D-Ile、PheF5、N-MePhe、苄酰胺、bhPhe、Dpa、Bip、1Nal、bhDpa、环己基丙氨酸；或者
A10是D-Cys、D-Ser、D-Ala；
或者它们的组合。
在一些实施方式中，
A1是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Phe、D-Phe、Asp或者连接于Cys或者DCys的D-Asp、Phe或者连接于聚乙二醇分子的D-Phe、或者Dpa或者连接于棕榈酰的(D)Dpa，所述聚乙二醇分子连接于鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、或者棕榈酰；
A2是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Pro、D-Pro、Gly、或者D-Gly；
A3是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Dpa、Asp或者连接于Dpa或者(D)Dpa的D-Asp；
A4是Ala、D-Ala、Pro、或者D-Pro；
A5是Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Arg、D-Arg；
A6是Ala、D-Ala、Phe、D-Phe、Arg、D-Arg、Cys、D-Cys；
A7是His、或者D-His；
A8是Cys、或者D-Cys；或者
A9是连接于RA的Phe或者D-Phe、Asp、D-Asp、连接于RB的Asp或者D-Asp、连接于RC的bhPhe、或者巯基乙胺，其中，所述RA是-CONH2-CH2-CH2-S、连接于Pro-Lys或者Pro-Arg的-D-Pro、连接于与Pro-Lys或者Pro-Arg连接的Pro的-bhPro、连接于bhPro-Lys或者bhPro-Arg的-D-Pro，RB是-PEG11-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、-(PEG11)-(GPHyp)10，并且，RC是连接于Pro-Lys或者Pro-Arg的-D-Pro、连接于bhPro-Lys或者bhPro-Arg的-DPro；
或者它们的组合物。
在一些实施方式中，A1是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Ala，A8是Ile，A9是Phe，并且A10是酰胺形式的Cys，其中A1或者A1至A2可选择性地缺失。
在一些实施方式中，A1是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是Ile；A9是酰胺形式的Phe，并且A10缺失。
在一些实施方式中，A1和A2缺失，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是酰胺形式的Ile，并且A9和A10缺失。
在一些实施方式中，A1和A2缺失，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或者酰胺形式的非天然巯基氨基酸，并且A8至A10缺失。
在一些实施方式中，所述肽是环肽。
在一些实施方式中，所述肽是倒序的(retroinverted)，使得A1是酰胺的C-末端并且A10是N-末端，所有的氨基酸是D-型氨基酸而不是天然L-型氨基酸。
在一些实施方式中，所述肽在N-末端、C-末端、或者两端含有一个加成。
在一些实施方式中，所述肽选自由Hep3-8、Hep3-9、Hep1-8、Hep1-9、Hep1-10C7A、Hep9F4A、Hep9C7-SStBut、(D)C、homoC、Pen、(D)Pen、Cyc-1、Pr10、Pr11、Pr12、riHep7ΔDT、Pr23、Pr24、Pr25、Pr27、Pr28、F4bhPhe、F4Dpa、F4Bip、F41Nal、F4bhDpa、F9bhPhe、F9Dpa、F9Bip、F91Nal、F9bhDpa、Pr39、Pr40、Pr41、Pr42、Pr43、Pr44、Pr45、Pr46、Pr13、Pr14、Pr15、Pr16、Pr17、Pr18、Pr19、Pr20、Pr21、Pr22、Pr-1、Pr-2、Pr-3、和Pr-4组成的组。
在一些实施方式中，所述肽具有铁调素活性。在一些实施方式中，所述肽与铁转运蛋白结合，优选为人铁转运蛋白。
在一些实施方式中，本发明提供了含有至少一种本发明所述的肽的组合物和药物制剂。在一些实施方式中，本发明提供了含有至少一种本发明所述的肽的药物制剂的制备方法，该药物制剂用于治疗铁代谢疾病，如铁超负荷疾病。还提供了治疗患者铁代谢疾病的方法，如哺乳动物患者，优选为人类患者，该方法包括给予患者至少一种本发明所述的肽或者组合物。在一些实施方式中，所述肽以治疗有效量进行给药。
在一些实施方式中，本发明提供了结合铁转运蛋白或诱导铁转运蛋白内化和降解的方法，该方法包括将铁转运蛋白与本发明所述的至少一种肽或组合物接触。
在一些实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括与试剂、装置、指导材料、或者它们的组合一起包装的本发明所述的至少一种肽或组合物。
在一些实施方式中，本发明提供了一种复合物，该复合物含有本发明所述的至少一种肽与铁转运蛋白结合，优选为人铁转运蛋白，或者与抗体相结合，例如该抗体可特异性地结合于本发明所述肽，Hep25，或者与它们的组合。
无论是以上的概述还是以下的详细说明都仅是典型和解释，旨在为权利要求所述的发明做进一步的解释。附图旨在对本发明提供进一步的理解，全部包含在本说明书中并构成本说明书的一部分，对本发明的多个实施方式进行说明，并与说明书一起来解释说明本发明的原理。
附图说明
本发明可通过参考附图进一步理解。
图1为表示Hep25中丙氨酸替代物的相对铁调素活性的图；
图2A为表示Hep25中F4替代物的相对铁调素活性的图；
图2B为表示Hep25中F9替代物的相对铁调素活性的图；
图3A为表示Hep1-9和Hep1-10C7A相对于Hep25(A)的铁调素活性的图；
图3B为表示Hep1-7和Hep1-8相对于Hep1-9或者Hep25的铁调素活性的图；
图3C为表示Hep4-7、Hep3-7、Hep3-8和Hep3-9相对于Hep1-9的铁调素活性的图；
图4为表示C7修饰肽相对于Hep25的铁调素活性的图；
图5为表示与Hep25，或者对照组(PBS)相比，微型铁调素Hep1-9、Pr6和Pr12的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，每只小鼠腹腔注射50μg肽；
图6为表示腹腔注射微型铁调素Pr27(20和200nmoles)的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，Hep25的注射剂量为20nmoles；
图7为表示腹腔注射微型铁调素riHep7ΔDT(20和200nmoles)的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，Hep25的注射剂量为20nmoles；
图8为表示腹腔注射微型铁调素Pr27和Pr28(20nmoles)的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，腹腔注射前预先与脂质体混合，Hep25的注射剂量为20nmoles；
图9为表示口服强制给予微型铁调素Pr27(200nmoles)后的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)。
具体实施方式
本发明提供了一种肽，该肽可应用于铁代谢疾病的研究和治疗。
本发明所用的“铁代谢疾病”，包括铁代谢异常直接引起的疾病，或者血液中铁水平失调引起的疾病，或者是由另一种疾病引起的铁失调的疾病，或者可以通过调节铁水平治疗的疾病，等等。更具体地说，根据该权利要求所述，铁代谢疾病包括铁超负荷疾病，铁缺乏症，铁生物分布紊乱症，其它铁代谢紊乱症及其它与铁代谢潜在相关的紊乱症，等等。铁代谢疾病包括血色病、HFE突变的血色病、铁转运蛋白突变的血色病、转铁蛋白受体2突变的血色病、血幼素(hemojuvelin)突变血色病、铁调素突变的血色病、青少年血色病、新生儿血色病、铁调素缺乏症、输血性铁超负荷、地中海贫血、中度地中海贫血、α地中海贫血、铁粒幼细胞性贫血、卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、非洲铁超负荷、高铁蛋白血症、铜蓝蛋白缺乏症、无转铁蛋白血症、先天性红细胞生长不良性贫血、慢性贫血疾病、炎症性贫血、感染性贫血、低色性小球性贫血、缺铁性贫血、难治性缺铁性贫血、慢性肾病性贫血、促红细胞生成素障碍、缺铁性肥胖、其它贫血、过量产生铁调素或诱导其过量产生的良性或恶性的肿瘤、铁调素过剩症、弗里德(Friedreich)共济失调、纤细综合征、苍白球色素性退变综合征、威尔森氏症、肺含铁血黄素沉着病、肝癌、癌症、肝炎、肝硬化、异食癖、慢性肾功能衰竭、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、多发性硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病。
在某些情况下，“铁代谢性疾病”的定义所包括的疾病和紊乱通常未被明确确定为与铁相关。例如，铁调素在小鼠胰腺的过高表达表明糖尿病(I型或II型)、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受和其它紊乱可能通过治疗根本上的铁代谢疾病来改善。参见Ilyin，G.等(2003年)FEBS Lett.54222-26，其在此处作为参考。因此，这些疾病都包含在广义的定义中。根据本发明使用的本领域公知的方法，本领域技术人员很容易就能确定给定的疾病是否是一种“铁代谢疾病”，包括本发明所参考的WO2004092405所述的方法，以及本领域公知的监测铁调素、血幼素或铁水平和表达的方法，例如本发明引用的美国专利No.7,534,764所述。
在本发明的优选的实施方式中，铁代谢疾病是指铁超负荷疾病，其中包括遗传性血色病、铁负荷性贫血、酒精性肝疾病和慢性丙型肝炎。
本发明所使用的术语“蛋白”，“多肽”和“肽”可以互换使用，指两个或两个以上相连的氨基酸。除了如表2所示的罕见或非天然氨基酸的缩写之外，在本发明中使用本领域常用的三个字母和一个字母的缩写来表示氨基酸残基。除前面标明“D-”外，所述氨基酸是L-氨基酸。氨基酸缩写群组或字符串用来表示肽。除非特别注明外，所述肽以N-末端在左侧表示，并且其序列是从N-末端写到C-末端。
本发明所述肽可以用本领域公知的方法制备，包括化学合成、生物合成或用DNA重组方法体外合成，以及固相合成。例如，参见Kelly和Winkler(1990)Genetic Engineering Principles and Methods，vol.12，J.K.Setlow ed.，Plenum Press，NY，pp.1-19；Merrifield(1964)J Amer Chem Soc 85：2149；Houghten(1985)PNAS USA 82：5131-5135；和Stewart&Young(1984)SolidPhase Peptide Synthesis，2ed.Pierce，Rockford，IL，本发明将它们引入作为参考。本发明所述肽可以用本领域公知的蛋白纯化技术纯化，诸如反相高效液相色谱法(HPLC)、离子交换或免疫亲和层析、滤过或尺寸排阻色谱法、或电泳法。参见Olsnes，S.和A.Pihl(1973)Biochem.12(16)：3121-3126；和Scopes(1982)Protein Purification，Springer-Verlag，NY，本发明将它们引入作为参考。另外，本发明所述肽可用本领域公知的重组DNA技术制备。因此，在此处引入编码本发明所述多肽的多聚核苷酸。在优选的实施方式中，多聚核苷酸是分离的。本发明使用的“分离的多聚核苷酸”是指存在于不同于多聚核苷酸自然产生的环境中的核苷酸。
在一些实施方式中，本发明所述肽进行了大致纯化。此处使用的“大致纯化”的化合物是指一种从该化合物的天然环境提取的化合物，并且有最少约60％，优选约75％，最优选约90％的该化合物从与该化合物相关的其它大分子化合物相游离。
本发明所使用的“分离的”化合物是指将其从自然环境中分离。例如，相对于全链多肽，分离肽是在其N-末端、C-末端、或两端的侧链上不含天然氨基酸的多肽。例如，分离的Hep1-9是指Hep25的氨基酸残基1-9组成的分离肽，该分离肽可以再在其N-末端、C-末端、或两端含有非天然氨基酸，但在C-末端的第九个氨基酸残基之后无半胱氨酸的氨基酸残基。如本发明所规定，本发明涉及的氨基酸位置与Hep25的氨基酸残基一致。例如，所述氨基酸位置9，对应于Hep25的第九个氨基酸残基。
本发明所述肽可结合于铁转运蛋白，优选为人铁转运蛋白。本发明优选的肽可特异性结合于人铁转运蛋白。此处所使用的“特异性结合”是指与样品中其它试剂相比、特异性结合剂可与样品中给定配体优先作用。例如，能特异性结合给定配体的特异性结合剂，在合适条件下，其结合于给定的配体，在量或程度上，明显超过与样品中其它组分的非特异性结合。所述合适条件是指能够允许给定特异性结合剂和给定配体相互作用的条件。所述条件包括pH值、温度、浓度、溶剂、孵化时间等等，这些条件可能在不同的给定的特异性结合剂和配体对间有差异，但本领域技术人员可以容易地测得。
本发明的所述肽，以下简称“微型铁调素”，模拟Hep25即生物活性的人类25-氨基酸形式的铁调素活性。本发明中所使用的具有“铁调素活性”的化合物是指该化合物在给予(如肠外注射或口服)患者后，能够呈剂量依赖性和时间依赖性降低患者(如小鼠或人)的血浆铁水平。例如参见Rivera等(2005)，blood 106：2196-9。
在一些实施方式中，本发明的所述肽具有体外活性，根据文献Nemeth等(2006)Blood 107：328-33，其可以通过测定铁转运蛋白表达细胞株内铁转运蛋白的内化和降解来测定。体外活性可以通过将铁转运蛋白标记为绿色荧光蛋白，测定细胞中剂量依赖性荧光损失来测定。参见Nemeth等(2006)Blood107：328-33。按参比制剂Hep25或微型铁调素浓度梯度，将等份细胞培养24小时。如此处所述，EC50值是指能够引起参比Hep25制剂产生最大荧光损失的50％所需的给定化合物浓度(如肽)。在测定中Hep25的EC50值在5至15nM范围内，在体外活性测定中优选微型铁调素的EC50值约为1000nM或更低。
根据本发明，本领域其它已知方法也可以用于计算铁调素活性和肽体外活性。例如，可以通过测定其导致铁转运蛋白细胞内化的能力来测定化合物体外活性，它是采用能识别细胞外铁转运蛋白抗原决定簇的抗体，应用免疫组织化学或流式细胞仪测定。另外，如Nemeth等(2006)Blood 107：328-33所述，可预先用铁的放射性同位素或稳定同位素使铁转运蛋白表达细胞超负荷，测定化合物抑制铁转运蛋白表达细胞铁外流的剂量依赖性抑制能力，来测定化合物体外活性。
微型铁调素设计
以往研究表明，Hep25的N-末端区段对其铁调素活性非常重要，并有可能形成与铁转运蛋白的接触界面。然而，每个N-末端氨基酸对铁调素活性的重要性仍不明确。因此，对Hep25的残基1-6进行丙氨酸扫描诱变，以测定每个N-末端氨基酸对铁调素活性的影响。如图1所示，T2A替代物对铁调素活性无实质性影响。苯丙氨酸替代物(F4A或F9A)引起铁调素活性下降幅度最大，高达70％以上。其余丙氨酸替代物也可测得其使铁调素活性下降，但不如F4A或F9A替代物影响显著。
为确定高度保留的并且结构上极为重要的F4位苯丙氨酸对铁调素活性是否有重要作用，本发明用其它氨基酸系统地替代Hep25的F4位氨基酸。如图2A所示，侧链极性增加(F4Y)可以导致铁调素活性明显降低，即用D-型苯丙氨酸(f)或带电氨基酸(D、K和Y)替代。然而，用非芳香族环己基丙氨酸替代F4位残基时，铁调素活性未变化，从而表明，大量疏水性残基有助于提高铁调素活性。
为确定高度保留的并且结构上极为重要的F9位苯丙氨酸对铁调素活性是否有重要作用，本发明用其它氨基酸替代Hep25的F9位氨基酸。如图2B所示，当F9位不论是用丙氨酸替代还是用非芳香族环己基丙氨酸替代时，铁调素活性均降低，从而表明，芳香族残基对铁调素活性有重要影响。
基因突变研究表明，C326，即人铁转运蛋白326位半胱氨酸残基，是参与铁调素结合的关键氨基酸残基。因此，本发明化学合成、重组了多种包含巯基的Hep25N-末端片段，如Hep4-7、Hep3-7、Hep3-8、Hep3-9、Hep1-7、Hep1-8、Hep1-9和Hep1-10C7A，它们相对于Hep25的相对活性采用流式细胞仪定量测定铁转运蛋白-GFP的降解、基于细胞铁蛋白测定方法的铁外排评价、以及放射性同位素铁外流研究进行测定。这些序列和这些N-末端片段的EC50值如表1所示。
显著的并且出乎意料的是，如图3所示，在流式细胞仪测定铁转运蛋白-GFP中，Hep1-9和Hep1-10 C7A显示相当强的活性。与Hep25相比，在质量水平上，Hep1-9和Hep1-10 C7A只有大约4倍以下活性，在摩尔水平上，大约10倍以下活性。因此，Hep1-9和Hep1-10 C7A被用作构建其它具有铁调素活性的肽的基底。
为确定半胱氨酸巯基对Hep1-9的铁调素活性的重要作用，将Hep1-9的C7位用具有相似形状但不能形成二硫键的氨基酸替代，得到Hep9-C7S(丝氨酸替代物)和Hep9C7-tBut(叔丁基阻断半胱氨酸)，或用叔丁基耦合二硫键修饰的半胱氨酸(可以作为保留基团参与HS-叔丁基的二硫键交换)替代，得到Hep9C7-SStBut。如图4所示，能够切断二硫键形成或交换的氨基酸替代物可以导致铁调素活性完全丧失，从而表明，二硫键形成是铁调素活性的必需条件。其它C7氨基酸替代物及其铁调素活性见表1。
基于Hep1-9和Hep1-10 C7A的其它肽构建成二硫键环化肽，所述肽含有非天然氨基酸替代物，是经后逆转录的，包含修饰F4和F9位残基，或带有一个正电荷。其C-末端氨基酸是酰胺形式。修饰后和相应的铁调素活性如表1所示。
如表1所示，除Pr40和Pr41之外，EC50约为1000nM或以下的微型铁调素包含至少6个相邻的氨基酸残基，相对于Hep25的残基3-8(参见Hep3-8)。因此，在一些实施方式中，优选微型铁调素至少含有6个相邻的氨基酸残基，相对于Hep1-9的6个相邻氨基酸残基，优选残基3-8。氨基酸残基可以是非天然或稀有氨基酸、L-型或D-型氨基酸残基、修饰残基、或它们的组合。
在一些实施方式中，本发明所述微型铁调素至少有一个氨基酸替代物、修饰、或加成。氨基酸替代物实例包括将用D-型氨基酸残基替代其相应的L-型氨基酸残基，用homoC、Pen、D-型Pen、Inp、或类似氨基酸替代半胱氨酸，用bhPhe、Dpa、bhDpa、Bip、1Nal、以及其类似氨基酸替代Phe。替代残基的名称和结构在表2中列出。其它合适的替代物在表1中列出。修饰的实例包括修饰一个或多个氨基酸残基的肽使肽形成一个环状结构、后倒序(retroinversion)、以及修饰一个残基使形成二硫键。如表1所示，加成的实例包括在N-末端、C-末端、或两端增加至少一个氨基酸残基或至少一个化合物。
如表1所示，大多数微型铁调素的EC50约100nM或以下，至少包含一个Dpa或bhDPA氨基酸替代物。因此，在一些实施方式中，本发明所述微型铁调素至少有一个Dpa或bhDPA氨基酸替代物。
由图1丙氨酸取代数据来看，在一些实施方式中，本发明所述微型铁调素可以在7位氨基酸位置含有Ala，而不是在4位和9为氨基酸位置，因为在7位氨基酸位置含有可以形成二硫键的巯基。见表1中Hep9F4A和Hep9C-SStBut。
由图2和表1中4位氨基酸取代数据来看，本发明的所述微型铁调素在4位可以有氨基酸替代物，与Hep25、Hep1-9或Hep1-10 C7A相比，该替代物不会导致其荷电性质或极性的实质性变化。Hep1-9或Hep1-10 C7A的4位的优选氨基酸替代物包括Phe、D-Phe、bhPhe、Dpa、bhDpa、Bip、1Nal、或类似氨基酸。
根据本发明的微型铁调素，具有以下结构式
A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10
其中
A1是Asp、Glu、焦谷氨酸、Gln、Asn、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A2是Thr、Ser、Val、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A3是His、Asn、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A4是Phe、Leu、Ile、Trp、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，其中，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；
A5是Pro、Ser、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A6是Ile、Leu、Val、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A7是Cys、Ser、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，其中，所述非天然氨基酸包括S-叔丁基-半胱氨酸；
A8是Ile、Leu、Thr、Val、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A9是Phe、Leu、Ile、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，其中，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；并且
A10是Cys、Ser、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
其中，羧基末端氨基酸是酰胺或羧基形式；
Cys或不同的巯基氨基酸作为氨基酸之一存在于序列中；并且
A1、A2、A3、A1至A2、A1至A3、A10、A9至A10、A8至A10、或者它们的组合可选择性地缺失。
在一些实施方式中，A1是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Phe，；A5是Pro，A6是Ile，A7是Ala，A8是Ile，A9是Phe，并且A10是酰胺形式的Cys，其中，A1或A1至A2可选择性地缺失。
在一些实施方式中，A1是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或非天然巯基氨基酸，A8是Ile，A9是酰胺形式的Phe，并且A10缺失。
在一些实施方式中，A1和A2缺失，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或非天然巯基氨基酸，A8是酰胺形式的Ile，并且A9和A10缺失。
在一些实施方式中，A1和A2缺失，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或非天然巯基氨基酸，并且A8至A10缺失。
在一些实施方式中，非天然氨基酸A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、或者它们的组合是指相应的D-型氨基酸。例如，对A1来说，其非天然氨基酸可以是D-Asp、D-Glu、D-Gln、D-Asn、或其它等等。
在一些实施方式中，所述非天然氨基酸为：
A1是D-Asp、D-Glu、D-焦谷氨酸、D-Gln、D-Asn、bhAsp、Ida、或者N-MeAsp；
A2是D-Thr、D-Ser、D-Val、Tle、Inp、Chg、bhThr、或者N-MeThr；
A3是D-His、D-Asn、DArg、Dpa、(D)Dpa、或者2-氨基茚；
A4是D-Phe、D-Leu、D-Ile、D-Trp、Phg、bhPhe、Dpa、Bip、1Nal、bhDpa、Amc、PheF5、hPhe、Igl、或者环己基丙氨酸；
A5是D-Pro、D-Ser、Oic、bhPro、反式-4-PhPro、顺式-4-PhPro、顺式-5-PhPro、Idc；
A6是D-Ile、D-Leu、Phg、Chg、Amc、bhIle、Ach、和MeIle；
A7是D-Cys、D-Ser、D-Ala、Cys(S-tBut)、homoC、Pen、(D)Pen、Dap(AcBr)、和Inp；
A8是D-Ile、D-Leu、D-Thr、D-Val、D-Arg、Chg、Dpa、bhIle、Ach、或MeIle；
A9是D-Phe、D-Leu、D-Ile、PheF5、N-MePhe、苄酰胺、bhPhe、Dpa、Bip、1Nal、bhDpa、环己基丙氨酸；并且
A10是D-Cys、D-Ser、D-Ala。
在一些实施方式中，所述氨基酸替代物(以及加成物，如有说明)为：
A1是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Phe、D-Phe、Asp或者连接于Cys或者DCys的D-Asp、Phe或者连接于聚乙二醇分子的D-Phe、或者Dpa或者连接于棕榈酰的(D)Dpa，所述聚乙二醇分子连接于鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、或者棕榈酰；
A2是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Pro、D-Pro、Gly、或者D-Gly；
A3是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Dpa、Asp或者连接于Dpa或者(D)Dpa的D-Asp；
A4是Ala、D-Ala、Pro、或者D-Pro；
A5是Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Arg、D-Arg；
A6是Ala、D-Ala、Phe、D-Phe、Arg、D-Arg、Cys、D-Cys；
A7是His、或者D-His；
A8是Cys、或者D-Cys；并且
A9是连接于RA的Phe或者D-Phe、Asp、D-Asp、连接于RB的Asp或者D-Asp、连接于RC的bhPhe、或者巯基乙胺，其中，所述RA是-CONH2-CH2-CH2-S、连接于Pro-Lys或者Pro-Arg的-D-Pro、连接于与Pro-Lys或者Pro-Arg连接的Pro的-bhPro、连接于bhPro-Lys或者bhPro-Arg的-D-Pro，RB  是-PEG11-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、-(PEG11)-(GPHyp)10，并且，RC是连接于Pro-Lys或者Pro-Arg的-D-Pro、连接于bhPro-Lys或者bhPro-Arg的-DPro。
在一些实施方式中，所述微型铁调素是10部分序列，其中A7是Ala，并且A10是Cys。
在一些实施方式中，所述微型铁调素通过二硫键形成环状结构。
在一些实施方式中，所述肽是倒序的(retroinverted)，使A1为C-末端并且A10为N-末端，并且氨基酸残基是D-型氨基酸。在一些实施方式中，所述倒序(retroinverted)肽在N-末端、C-末端、或两端至少包含一个加成。在一些实施方式中，所述倒序(retroinverted)肽至少包含一个L-型氨基酸。
在一些实施方式中，所述微型铁调素在4位、9位、或两个位置含有氨基酸替代物。在一些实施方式中，所述氨基酸替代物是Phg、Phe、D-Phe、bhPhe、Dpa、Bip、1Nal、Dpa、bhDpa、Amc、或巯乙胺。
在一些实施方式中，所述微型铁调素在7位含有氨基酸替代物。在一些实施方式中，所述氨基酸替代物是Cys(S-tBut)、Ala、D-Ala、Ser、D-Ser、homoC、Pen、(D)Pen、His、D-His、或Inp。
根据本发明，一些优选的微型铁调素在表1中列出。
Figure BPA00001387435000181
Figure BPA00001387435000211
Figure BPA00001387435000221
Figure BPA00001387435000231
Figure BPA00001387435000241
在一些实施方式中，本发明所述的一个或多个肽，是以组合物的形式提供的，该组合物含有适合于预期目标的载体。该组合物还可以含有适合于预期目标的一个或多个添加剂。例如，在分析测定中，这些成分可以包括脂质体、氯硝柳胺、SL220溶解剂(NOF，日本)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)(Sigma)、乙醇和二甲基亚砜。在治疗铁超负荷疾病时，这些成分可以包括不同的吸收促进剂和蛋白酶抑制剂、用于包裹多肽的固体微粒或纳米粒(如壳聚糖和水凝胶)、共轭高分子、脂质制剂和其它化学修饰。
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括与试剂、装置、指导材料、或其组合一起包装的本发明所述的一种或多种肽和/或组合物。例如，该试剂盒可以包括测定用的试剂，诊断、治疗、或监测铁代谢紊乱用的药物和组合物，获取待测样本的装置，混合试剂和进行测定的装置，等等。
由于本发明的所述肽具有铁调素活性，可以用作铁转运蛋白降解的激动剂，用于治疗铁负荷疾病。例如，根据本发明，所述的一个或多个肽(优选至少一个微型铁调素)可以给予患者，以改善铁负荷性贫血(尤其是β-地中海贫血)患者与铁超负荷相关的症状和/或病状，对于上述疾病，禁止放血治疗，服用铁螯合剂是其主要治疗手段，但通常该法耐受性差。根据本发明，所述的一个或多个肽，优选至少一个微型铁调素，可用于治疗遗传性血色病，尤其是那些不能耐受放血治疗的患者。根据本发明，所述的一个或多个肽，优选至少一个微型铁调素，可用于治疗急性铁中毒。
因此，本发明所述的一个或多个肽可以给予患者，优选为哺乳动物，如人类。在一些实施方式中，所述肽以药物组合物形式进行给药。在一些实施方式中，所述肽以其治疗有效量进行给药。本发明所使用的“治疗有效量”是指与对照组，如安慰剂相比，能够改善特定铁代谢疾病的症状和/或病状的剂量。
应用本领域公知的标准方法可以很容易的测得治疗有效量。给药剂量可根据疾病的临床严重程度、患者年龄和体重、或患者铁暴露量使用本领域常用的方法之一来确定。对于非胃肠道制剂，本发明化合物的优选有效治疗量范围为约0.01至10mg/kg体重，优选约0.1至3mg/kg体重，更优选0.5至2mg/kg体重。对于口服给药，优选有效治疗量可高达约10倍以上。此外，本发明所述给予患者一种肽或组合物，可以包括单次给药或，最好，包括一系列给药。实际给药剂量优选能够根据特定肽或组合物、特定制剂、给药方式、给药部位、宿主、以及治疗疾病的不同有所变化。也应该意识到，用于治疗的有效剂量对某一特定疗程可能会增加或减少。对于一个给定条件的最佳剂量，可以采用传统剂量确定实验，根据给予肽或组合物后的实验数据来确定。用本领域公知的标准诊断方法测定，药物剂量变化可以很明显。在某些情况下，可能需要长期给药。
本发明所述药物组合物可以以一个单位剂量形式制备，以适合所需的给药方式。本发明所述组合物在治疗时可以用任意适当的途径给药包括口服、直肠、鼻腔、外用(包括口腔和舌下)、阴道和肠外(包括皮下、肌肉注射、静脉注射和皮内注射)。需要指明的是，优选途径可根据受试者状态和年龄、治疗状态的性质、所选肽和组合物而变化。
本发明所述药物组合物包括至少一种本发明所述的治疗有效量的多肽、和一种惰性的、药学上可接受的载体或稀释剂。本发明中所使用的语言“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、衣膜、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等，可与给药方式匹配，并且在本领域公知。除与活性化合物不相配伍的任何常规介质和试剂外，组合物中成分的使用均经过仔细选择。
组合物中还可加入增补活性化合物。所述增补活性化合物包括氯硝柳胺、脂质体、SL220溶解剂(NOF，日本)、聚氧乙烯蓖麻油(Sigma)，乙醇和二甲基亚砜。
本发明所述肽和组合物的毒性和治疗效果可通过细胞培养或实验动物的标准药学上的方法来测定，例如，确定其LD50(动物死亡量50％所需剂量的人口)和其ED50(动物有效治疗量为50％时所需剂量)。毒性剂量与有效剂量之间比值是治疗指数，它可以用LD50/ED50来表示。优选治疗指数大的多肽。当使用具有毒副作用的肽时，应设计一种可以将此类肽靶向于感染组织部位的传递系统，以尽量降低对潜在未感染细胞的损害，从而降低副作用。
从细胞培养实验和动物实验获得的数据可用于确定人使用的剂量范围。本发明所述肽的剂量优选在一个可循环浓度范围内，其中包括具有很小或根本没有毒性的ED50。剂量可能会在此范围内有所不同，这取决于采用的剂量形式和所用给药途径。对于在本发明的方法中使用的任何肽，治疗有效剂量可根据细胞培养实验初步估算。可以制定一个剂量，使其在动物模型中达到循环血药浓度范围，包括细胞培养测得的IC50(即待测化合物浓度可达到症状最大抑制效果一半)。这些信息可以用来更准确地确定人用的有效剂量。血浆浓度可通过高效液相色谱法进行测定。
多肽合成
Hep25是由加州大学洛杉矶分校(UCLA)多肽合成中心实验室采用固相9-芴甲氧羰基(fmoc)化学反应合成。具体来说，多肽是用fmoc氨基酸、Wang树脂(AnaSpec，San Jose，CA)在ABI 431A肽合成器中(PE Biosystems，Applied Biosystems，Foster City，CA)，并且双耦合所有残基而合成。经卵裂，将30mg原肽用过量1000倍摩尔的二硫苏糖醇(DTT)在0.5M的Tris缓冲液(pH 8.2)、6M的盐酸胍、以及20mM的EDTA在52℃简化2小时。加入新鲜的DDT(过量500摩尔)，在52摄氏度继续孵化1小时。简化肽10-gC18 Sep-Pak填充柱(Waters，Milford，MA)纯化，填充柱在0.1％TFA中平衡，并用50％乙腈洗脱。将洗脱液冻干，用0.1％醋酸再分散。简化肽用反相高效液相色谱(RP-HPLC)VYDAC C18柱(218TP510；Waters)进一步纯化，用0.1％三氟乙酸平衡，并用乙腈梯度洗脱。将洗脱液冻干，0.1％醋酸，20％DMSO溶解至浓度约0.1mg/ml(pH8)，室温下搅拌18小时空气氧化。复性肽依次用10-g C18 Sep-Pak填充柱和RP-HPLC Vydac C18柱使用乙腈梯度纯化。洗脱液冻干，0.016％盐酸再分散。采用12.5％酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)确证铁调素复性合成衍生物的构象，采用基质辅助激光解吸附/电离时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS；UCLA质谱实验室，LosAngeles，CA)测定多肽分子量。
表1中其它多肽是采用固相方法合成，可使用Symphony
Figure BPA00001387435000281
自动肽合成器(Protein Technologies Inc.，Tucson，AZ)或CEM的自由自动微波肽合成器(CEM Corporation Inc.，Matthews，NC)，应用9-芴甲氧羰基(fmoc)化学(Fields&Noble(1990)Int J Pept Protein Res 35：161-214))和市售氨基酸衍生物和试剂(EMD Biosciences，San Diego，CA and Chem-Impex International，Inc.，Wood Dale，IL)合成。多肽用改性剂K(TFA 94％(v/v)；苯酚，2％(w/v)，水，2％(v/v)；TIS，2％(v/v)；2小时)从树脂中分离，加入冰冷乙醚沉淀。随后，肽用制备反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)纯化至＞95％，其纯度用基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS，UCLA Mass SpectrometryFacility，Los Angeles，CA)以及分析RP-HPLC测定，RP-HPLC采用VarianProStar 210 HPLC系统，ProStar 325双波长紫外可见检测器，波长为220nm和280纳米(Varian Inc.，Palo Alto，CA)。流动相组成为：溶剂A，0.1％TFA水溶液，和溶剂B，0.1％TFA的乙腈溶液。使用反相C18柱(Vydac 218TP54，4.6x250mm，Grace，Deerfield，IL)分析多肽，使用线性梯度洗脱，溶剂B100分钟内从0％线性增加至100％(流速：1ml/min)。
本发明所述肽可以通过本领域其它公知方法合成或获得。所有多肽均被合成为羧基酰胺酶(-CONH2)，所述羧基酰胺酶可以产生一个电荷中性的末端，与负电荷性质的-COOH端更类似于肽键。然而，具有带负电荷-COOH端的多肽也在本发明中涉及。
活性测定
流式细胞仪。本发明所述肽活性，是采用如前所述的流式细胞仪测定。参见Nemeth等(2006)Blood 107：328-333，本发明将此引入作为参考。所采用的ECR293/Fpn-GFP，是一种用松甾酮可诱导的铁转运蛋白转染的细胞系，其中膜转运蛋白的C-末端用绿色荧光蛋白标记。参见Nemeth等(2004)Science 306：2090-2093，本发明将此引入作为参考。简言之，将细胞接种于聚D-型赖氨酸涂层平板上，平板上加入20μM的FAC，也可加入或不加10μM的松甾酮。24小时后，清洗掉松甾酮，并将细胞用肽处理24小时。然后胰酶消化细胞，然后以1×106cells/ml的比例重新悬浮，并用流式细胞仪测定绿色荧光强度。流式细胞方法采用FACScan(荧光激活细胞扫描仪)分析流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)，和与CELLQUEST3.3软件(Becton Dickinson)分析。未经松甾酮诱导表达Fpn-GFP的细胞作为空白用于扣除背景荧光。经松甾酮诱导，但未经任何肽处理的细胞作阳性对照。每种肽在一定浓度范围内进行研究(0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μM)。每种肽分别反复处理3至6次。对于每个浓度，结果均用占Hep25的最大活性(FHep25)的比例来表示(在0.01-10μM剂量范围内)，该结果根据公式1-((Fx-FHep25)/(Funtreated-FHep25))，式中F是指绿色荧光均值，X为多肽。其IEC50浓度已列于表1中。
铁蛋白测定。用具有铁调素活性的肽处理的细胞会阻留铁和铁蛋白含量高。因此，下述铁蛋白测定可用于识别本发明所述的微型铁调素。简言之，将HEK293-Fpn细胞在20μM的FAC中孵化，可以含有或不含10μM的松甾酮。24小时后，清洗掉松甾酮，在20μM的FAC存在条件下加入铁调素衍生物处理24小时。用150mM的NaCl、10mM的EDTA、10mM的Tris(pH7.4)、1％Triton X-100、以及蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)提取细胞蛋白。根据制造商说明采用酶联免疫吸附法(ELISA)(RamcoLaboratories，Stafford，TX，or Biotech Diagnostic，Laguna Niguel，CA)测定铁蛋白水平，并用每个样品的总蛋白浓度标准化，总蛋白浓度通过二喹啉甲酸(BCA)法(Pierce，Rockford，IL)测定。
体内测定。血清铁测定。铁调素活性测定的原理是给予多肽后血清中铁减少。因此，根据本发明所述，本发明所选多肽铁调素活性的测定是通过测定受试者体内血清铁水平来测得的。简单地说，采用美国国立卫生研究院(NIH)31啮齿动物食谱(333ppm铁；Harlan Teklad，Indianapolis，IN)饲养小鼠。实验开始前两个星期，小鼠食谱更改为约2-4ppm的铁(HarlanTeklad，Indianapolis，IN)，以抑制内源性铁调素。如下所述，多肽贮备液用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)或其它稀释剂稀释至所需浓度稀释液。小鼠经以下治疗：(a)腹腔注射100μlPBS(对照组)或含有50μg多肽的100μlPBS；(b)注射混有500μg脂质体COATSOME EL系列(NOF，Tokyo，Japan)的100μl的肽(或PBS)(按制造商的建议制备)；(c)注射用SL220溶解剂(NOF，Tokyo，Japan)溶解的100μl的肽(或PBS)；(d)灌胃给予250μl肽(或PBS)的1x溶剂(聚氧乙烯蓖麻油(Sigma)/乙醇/PBS；(12.5∶12.5∶75))。4小时后处死小鼠，心脏穿刺采血，用MICROTAINER试管(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)分离血清。血清铁采用比色法测定(DiagnosticChemicals，Oxford，CT)，该法已被改进为微量培养板，因此，每次测定只需要10μl血清。结果是以PBS给药的小鼠血清铁浓度均值为参比，用血清铁降低百分比来表示。
如图5所示，每只鼠腹腔注射(i.p.)50μg Pr12的PBS溶液，与给予PBS相比，4小时后导致血清铁显著降低，在显着降低血清铁相比，知识产权政府的PBS。血清铁下降与腹腔注射50μgHep25引起的血清铁降低相似。腹腔注射Hep9没有导致血清铁减少。Pr12是Hep9的一种倒序形式，并由于该倒序结构能抵抗蛋白酶水解作用。实验表明，增加抗蛋白酶水解能力，可以提高微型铁调素的活性。
如图6所示，腹腔注射200纳摩尔riHep7ΔDT的PBS，其血清铁浓度显著低于注射PBS后的血清铁浓度，并且还低于腹腔注射20纳摩尔的Hep25后的血清铁浓度。给予20纳摩尔riHep7ΔDT可以轻微降低血清铁浓度，但并不明显。实验表明，腹腔注射7个氨基酸的小肽后，其可以发挥与Hep25相当的活性。
如图7所示，腹腔注射20纳摩尔Pr27的PBS，可降低血清铁浓度，与腹腔注射20纳摩尔的Hep25后相当，这表明，微型铁调素可在体内达到与Hep25相当的功效。高浓度的Pr27(200纳摩尔)可以更多的降低血清铁浓度。
如图8所示，腹腔注射20纳摩尔Pr27的脂质体溶液也可以降低血清铁浓度，与腹腔注射20纳摩尔的Hep25后相当。单独给与脂质体溶液本身后，不影响血清铁水平。脂质体溶液是将100μl PBS与500μg空白脂质体COATSOME EL系列(NOF，Tokyo，Japan)混合所得(按制造商的建议制备)。然而，将微型铁调素Pr28溶解在脂质体溶液后，与Pr27相比，降低血清铁水平的能力减弱。实验表明，将多肽混悬在脂质体中不影响其活性。因此，根据本发明，脂质体可用于多肽的口服给药。
如图8所示，经灌胃口服200纳摩尔Pr27的聚氧乙烯蓖麻油溶液后，与口服给予PBS的相同处方相比，可降低小鼠的血清铁水平。聚氧乙烯蓖麻油可增加化合物的溶解度，并在药物中常用作辅料和添加剂。聚氧乙烯蓖麻油溶液是将聚氧乙烯蓖麻油(Sigma)、乙醇和PBS按12.5∶12.5∶75的比例进行混合而制备。灌胃给予小鼠250μl的该溶液。
因此，本发明可用于降低受试者的血清铁水平。根据本发明，优选微型铁调素是倒序肽，其中包括聚乙二醇分子，如PEG11，连接到其N-末端氨基酸。在一些实施方案中，聚乙二醇分子连接到棕榈酰基团或二氨基丙酸链接一个或多个棕榈酰基团。
除了测定对血清铁浓度的影响外，也需要进行在本领域已知的体内实验，以鉴定本发明所述的微型铁调素和/或确定本发明所述的一种给定的肽或微型铁调素的有效治疗量。这类测定实例包括以下内容：
组织铁含量测定。作为上述血清铁测定的补充或替代，组织铁分布可通过采集给药小鼠肝脏和脾脏切片的增强的Perl’s着色来测定。简单地说，组织切片用4％多聚甲醛/PBS固定，在Perl’s溶液(1∶1，2％盐酸和2％亚铁氰化钾)和二氨基联苯的0.015％过氧化氢的溶液中孵化。组织非血红素铁可用Rebouche等的微量法定量测定。参见Rebouche J Biochem BiophysMethods.2004 Mar 31；58(3)：239-51.；Pak等Blood.2006 Dec 1；108(12)：3730-5。将100mg肝和脾匀浆，加入酸以释放非血红素铁结合的铁，使用菲咯嗪(ferrozine)比色法进行测定，并与对照进行比较。用微型铁调素进行治疗，预期可使铁由其它组织再分配到脾脏。在数周到数月，给予微型铁调素预计可以降低所有组织的组织铁含量，因为它可以减少饮食中铁的吸收。
血液学测定。血液学检测可用于鉴定本发明所述的微型铁调素和/或确定本发明所述的给定的肽或微型铁调素的有效治疗量。简单地说，从治疗的受试者收集血液至含肝素试管中。血红蛋白、红细胞(RBC)、红细胞平均容积(MCV)、促红细胞生成素(EPO)、白细胞参数、网织红细胞计数，以及网织红细胞血红蛋白含量使用本领域已知的方法测定，并与对照组相比较。使用微型铁调素治疗，预期将导致在MCV的减少并降低网织红细胞血的红蛋白含量。过量给予微型铁调素，预期将减少血红蛋白。
铁输出测定。本领域熟知的铁(55Fe)输出测定，是应用原代肝细胞和巨噬细胞测定，可用于鉴定本发明所述的微型铁调素和/或确定本发明所述的一种给定的肽或微型铁调素的有效治疗量。具有铁调素活性的多肽会削弱或减少55Fe从细胞中释放。简单地说，将细胞同55Fe-NTA或55Fe-Tf培养36小时。洗掉未包裹的55Fe后，细胞用给定多肽或对照处理。在铁转运蛋白突变的情况下，转染是在加入55Fe之前进行，并且在36小时的铁超负荷期间允许进行表达。在1、4、8、24、36、48和72小时后收集等量的介质，并用放射性闪烁计数器测定放射强度。细胞的放射性可用本领域已知方法测定，将细胞在硅油中离心，以降低放射性铁和细胞的非特异性结合的影响。
为确定给定肽是否改变了内源性铁转运蛋白的内化和降解，给予多肽后，蛋白水平和铁转运蛋白在肝细胞和巨噬细胞的细胞分布，可以用本领域已知的免疫印迹法(Western blotting)，免疫组织化学和铁转运蛋白抗体法来测定。
为了理解本发明的范围或完成本发明的公开，本申请提及的出版物、专利和专利申请均清楚地纳入本发明作为参考，并且每篇文献做同等程度引用。
尽管详细描述了本发明的具体实施方式，本领域的技术人员应注意本发明公开的仅为示例，并且在本发明范围内可以进行各种其它变换、适应性调整和修改。因此，本发明并不限于所述的的具体实施方式，仅受权利要求限制。
Figure ISB00000599271700011
Figure ISB00000599271700021
Figure ISB00000599271700031
Figure ISB00000599271700041

Claims (20)

1.一种分离的肽，该肽具有以下结构式：
A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10
其中，
A1是Asp、Glu、焦谷氨酸、Gln、Asn、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A2是Thr、Ser、Val、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A3是His、Asn、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A4是Phe、Leu、Ile、Trp、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；
A5是Pro、Ser、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A6是Ile、Leu、Val、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A7是Cys、Ser、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括S-叔丁基-半胱氨酸；
A8是Ile、Leu、Thr、Val、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A9是Phe、Leu、Ile、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；并且
A10是Cys、Ser、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
其中，羧基末端氨基酸是酰胺或羧基形式；
至少一个巯基氨基酸作为氨基酸之一存在于序列中；并且
A1、A2、A3、A1至A2、A1至A3、A10、A9至A10、A8至A10、或者它们的组合可选择性地缺失。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，A1是D-Asp、D-Glu、D-焦谷氨酸、D-Gln、D-Asn、bhAsp、Ida、或者N-MeAsp；
A2是D-Thr、D-Ser、D-Val、Tle、Inp、Chg、bhThr、或者N-MeThr；
A3是D-His、D-Asn、DArg、Dpa、(D)Dpa、或者2-氨基茚；
A4是D-Phe、D-Leu、D-Ile、D-Trp、Phg、bhPhe、Dpa、Bip、1Nal、bhDpa、Amc、PheF5、hPhe、Igl、或者环己基丙氨酸；
A5是D-Pro、D-Ser、Oic、bhPro、反式-4-PhPro、顺式-4-PhPro、顺式-5-PhPro、Idc；
A6是D-Ile、D-Leu、Phg、Chg、Amc、bhIle、Ach、和MeIle；
A7是D-Cys、D-Ser、D-Ala、Cys(S-tBut)、homoC、Pen、(D)Pen、Dap(AcBr)、和Inp；
A8是D-Ile、D-Leu、D-Thr、D-Val、D-Arg、Chg、Dpa、bhIle、Ach、或者MeIle；
A9是D-Phe、D-Leu、D-Ile、PheF5、N-MePhe、苄酰胺、bhPhe、Dpa、Bip、1Nal、bhDpa、环己基丙氨酸；或者
A10是D-Cys、D-Ser、D-Ala；
或者它们的组合。
3.根据权利要求1所述的肽，其中，
A1是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Phe、D-Phe、Asp或者连接于Cys或者DCys的D-Asp、Phe或者连接于聚乙二醇分子的D-Phe、或者Dpa或者连接于棕榈酰的(D)Dpa，所述聚乙二醇分子连接于鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、或者棕榈酰；
A2是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Pro、D-Pro、Gly、或者D-Gly；
A3是Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Dpa、Asp或者连接于Dpa或者(D)Dpa的D-Asp；
A4是Ala、D-Ala、Pro、或者D-Pro；
A5是Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Arg、D-Arg；
A6是Ala、D-Ala、Phe、D-Phe、Arg、D-Arg、Cys、D-Cys；
A7是His、或者D-His；
A8是Cys、或者D-Cys；或者
A9是连接于RA的Phe或者D-Phe、Asp、D-Asp、连接于RB的Asp或者D-Asp、连接于RC的bhPhe、或者巯基乙胺，其中，所述RA是-CONH2-CH2-CH2-S、连接于Pro-Lys或者Pro-Arg的-D-Pro、连接于与Pro-Lys或者Pro-Arg连接的Pro的-bhPro、连接于bhPro-Lys或者bhPro-Arg的-D-Pro，RB  是-PEG11-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、-(PEG11)-(GPHyp)10，并且，RC是连接于Pro-Lys或者Pro-Arg的-D-Pro、连接于bhPro-Lys或者bhPro-Arg的-DPro；
或者它们的组合。
4.根据权利要求1所述的肽，其中，A1是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Ala，A8是Ile，A9是Phe，并且A10是酰胺形式的Cys，其中A1或者A1至A2可选择性地缺失。
5.根据权利要求1所述的肽，其中，A1是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是Ile；A9是酰胺形式的Phe，并且A10缺失。
6.根据权利要求1所述的肽，其中，A1和A2缺失，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是酰胺形式的Ile，并且A9和A10缺失。
7.根据权利要求1所述的肽，其中，A1和A2缺失，A3是His，A4是Phe，A5是Pro，A6是Ile，A7是Cys或者酰胺形式的非天然巯基氨基酸，并且A8至A10缺失。
8.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽是环肽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽，其中，所述序列是倒序的，使得A1是C-末端，并且A10是N-末端。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的肽，其中，所述肽在N末端、C末端、或者两端含有一个加成。
11.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽选自由Hep3-8、Hep3-9、Hep1-8、Hep1-9、Hep1-10C7A、Hep9F4A、Hep9C7-SStBut、(D)C、homoC、Pen、(D)Pen、Cyc-1、Pr10、Pr11、Pr12、riHep7ΔDT、Pr23、Pr24、Pr25、Pr27、Pr28、F4bhPhe、F4Dpa、F4Bip、F41Nal、F4bhDpa、F9bhPhe、F9Dpa、F9Bip、F91Nal、F9bhDpa、Pr39、Pr40、Pr41、Pr42、Pr43、Pr44、Pr45、Pr46、Pr13、Pr14、Pr15、Pr16、Pr17、Pr18、Pr19、Pr20、Pr21、Pr22、Pr-1、Pr-2、Pr-3、和Pr-4组成的组。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽，其中，所述肽具有铁调素活性。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的肽，其中，所述肽与铁转运蛋白结合。
14.一种组合物，该组合物含有权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽。
15.一种结合铁转运蛋白或诱导铁转运蛋白内化和降解的方法，该方法包括将铁转运蛋白与权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽或权利要求14所述的组合物接触。
16.一种治疗患者铁代谢疾病的方法，该方法包括将权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽或者权利要求14所述的组合物给予治疗对象。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述铁代谢疾病是铁超负荷疾病。
18.一种试剂盒，该试剂盒包括与试剂、装置、指导材料、或者它们的组合一起包装的权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽或者权利要求14所述的组合物。
19.一种复合物，该复合物包括与铁转运蛋白或者抗体结合的权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽。
20.本发明如所述。
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