JP2016534734A - 急性骨髄性白血病の診断のための抗体 - Google Patents
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Abstract
抗体の重鎖ＶＨ及び軽鎖ＶＬの特定の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対応するポリペプチド、特に抗体又は抗体断片、並びに前記ポリペプチドを含む化合物、Ｍ２型急性骨髄性白血病用の診断薬としてのその使用、及び前記化合物を含むキットを開示する。
Description
本発明は、抗体の重鎖ＶＨ及び軽鎖ＶＬの特定の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対応するポリペプチド、特に抗体又は抗体断片、並びに前記ポリペプチドを含む化合物、診断薬としてのその使用、及び本発明の化合物を含むキットに関する。
成人性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は未成熟骨髄前駆細胞のクローン増殖を特徴とする非常に不均一な幹細胞性悪性腫瘍である。ＡＭＬは他の造血器悪性腫瘍に続いて、又は他の疾患の細胞傷害性療法の後に新しく生じることがある。過去数十年にわたって癌治療計画はかなり改善されたが、５年生存率は未だに２４％から７０％までの範囲であり、診断された亜型に強く左右される。特定の患者についての見通しは、その人が好ましい亜型、中間の亜型、又は好ましくない亜型を有しているかどうかに依存するので、ＡＭＬ亜型シグネチャの特定はＡＭＬ治療における最初の重要なステップである。
速くて正確な診断が非常に重要なため、本発明の目的の１つはＭ２型ＡＭＬ特異的診断法用の診断ツールを提供することである。
国際公開第２００５／１１１６２３（Ａ１）号パンフレットはＡＭＬのマーカー、その新たなマーカーに特異的に結合する結合性分子、それらの結合性分子をコードする核酸分子、及びそれらの結合性分子を含む組成物を開示している。そのマーカーに特異的に結合可能であるそれらの結合性分子をＡＭＬの診断において使用することができる。この参照文献はＭ２型に特異的な抗体の開示に関しては何も述べていない。
米国特許出願公開第２００８／００９５７８０（Ａ１）号明細書は腫瘍関連抗原、それらの抗原に特異的に結合する結合性分子、それらの結合性分子をコードする核酸分子、それらの結合性分子を含む組成物、及びそれらの結合性分子を特定又は生産する方法を開示している。腫瘍関連抗原は癌細胞上で発現しており、それらの抗原に特異的に結合可能である結合性分子を癌の診断、予防及び／又は治療において使用することができる。２型ＡＭＬに特異的な抗体は開示されていない。
国際公開第２０１１／０３６１８３（Ａ２）号パンフレットは腫瘍関連抗原ＣＤ３３に対する抗体、及びＣＤ３３陽性細胞を免疫ターゲティングするためのそれらの抗体の使用を開示している。それらの抗体は医学分野、薬学分野及び生物医学的研究分野での使用に適切である。それらの抗体は１０〜１０ｍｏｌ／Ｌの桁のヒトＣＤ３３に対する高い親和力を特徴とする。ＣＤＲ配列は、高い親和力を有するため、特に組換え断片（例えば、ｓｃＦｖ断片又は二重特異性抗体）の生産及び免疫ターゲティングに適切である。ＣＤ３３の発現に関連する病気、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療用途及び／又は診断用途の医薬を生産するためのその抗体の使用がさらに開示されている。Ｍ２型特異性は扱われても開示されてもいない。
米国特許出願公開第２００５／０６９９５５（Ａ１）号明細書は癌細胞に結合する抗体又はそれらの断片を開示しており、生理学的現象、例えば、細胞ローリング及び転移において重要である。それらの抗体のそのような抗体断片を使用する治療法及び診断法並びに組成物も開示されている。本発明による方法と組成物を治療薬のターゲティングに使用することができ、腫瘍増殖と転移を含む癌、白血病、自己免疫疾患、及び炎症性疾患などの病気の診断、予後予測と病期分類、及びそのような病気の治療に使用することができる。相補的結合のために多種多様な抗原結合ドメインを有する免疫グロブリンの結合ドメインのライブラリーであって、重鎖ＣＤＲ３だけに多様性を有する前記ライブラリーも提供されている。白血病に関して、Ｍ２型ＡＭＬの特異的抗体は開示されていない。
本発明の根底にある目的は、抗体又は抗体断片を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは抗体の重鎖ＶＨ及び軽鎖ＶＬの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対応しており、前記相補性決定領域が：
５アミノ酸からなる配列により規定され、前記５アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記５アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ１領域；
１７アミノ酸からなる配列により規定され、前記１７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記１７アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＰＯＮ − ＢＰ＋又はＰＯＮ − ＢＰ＋ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＡＰ− − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＢＰ＋ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ２領域；
７アミノ酸からなる配列により規定され、前記７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記７アミノ酸は式：ＮＰＮ − ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＢＰ＋又はＰＯＮ − ＮＰＮ − ＡＰ− − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ３領域；
１１アミノ酸からなる配列により規定され、前記１１アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記１１アミノ酸は式：ＢＰ＋ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ１領域；
７アミノ酸からなる配列により規定され、前記７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記７アミノ酸は式：ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＢＰ０又はＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ２領域；
９アミノ酸からなる配列により規定され、前記９アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記９アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＰＯＮ又はＢＰ＋ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ３領域
を含み、
複数の前記式の前記アミノ酸はタンパク質構成アミノ酸であり、各記号は次の意味を有する：
ＰＯＮはｐＨ７．４において側鎖の極性が極性であり側鎖の電荷が中性のアミノ酸を表し；
ＮＰＮはｐＨ７．４において側鎖の極性が無極性であり側鎖の電荷が中性のアミノ酸を表し；
ＢＰ＋はｐＨ７．４において側鎖の極性が塩基性であり側鎖の電荷が正のアミノ酸を表し；
ＢＰ０はｐＨ７．４において側鎖の極性が塩基性であり側鎖の電荷が主に中性のアミノ酸を表し；
ＡＰ−はｐＨ７．４において側鎖の極性が酸性であり側鎖の電荷が負のアミノ酸を表す、
ポリペプチド、によって達成される。
５アミノ酸からなる配列により規定され、前記５アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記５アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ１領域；
１７アミノ酸からなる配列により規定され、前記１７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記１７アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＰＯＮ − ＢＰ＋又はＰＯＮ − ＢＰ＋ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＡＰ− − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＢＰ＋ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ２領域；
７アミノ酸からなる配列により規定され、前記７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記７アミノ酸は式：ＮＰＮ − ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＢＰ＋又はＰＯＮ − ＮＰＮ − ＡＰ− − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ３領域；
１１アミノ酸からなる配列により規定され、前記１１アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記１１アミノ酸は式：ＢＰ＋ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ１領域；
７アミノ酸からなる配列により規定され、前記７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記７アミノ酸は式：ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＢＰ０又はＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ２領域；
９アミノ酸からなる配列により規定され、前記９アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記９アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＰＯＮ又はＢＰ＋ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ３領域
を含み、
複数の前記式の前記アミノ酸はタンパク質構成アミノ酸であり、各記号は次の意味を有する：
ＰＯＮはｐＨ７．４において側鎖の極性が極性であり側鎖の電荷が中性のアミノ酸を表し；
ＮＰＮはｐＨ７．４において側鎖の極性が無極性であり側鎖の電荷が中性のアミノ酸を表し；
ＢＰ＋はｐＨ７．４において側鎖の極性が塩基性であり側鎖の電荷が正のアミノ酸を表し；
ＢＰ０はｐＨ７．４において側鎖の極性が塩基性であり側鎖の電荷が主に中性のアミノ酸を表し；
ＡＰ−はｐＨ７．４において側鎖の極性が酸性であり側鎖の電荷が負のアミノ酸を表す、
ポリペプチド、によって達成される。
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドでは、
ＰＯＮはアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸を表し；
ＮＰＮはアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンからなる群より選択されるアミノ酸を表し；
ＢＰ＋はアルギニン又はリシンを表し；
ＢＰ０はヒスチジンを表し；
ＡＰ−はアスパラギン酸又はグルタミン酸を表す。
ＰＯＮはアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸を表し；
ＮＰＮはアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンからなる群より選択されるアミノ酸を表し；
ＢＰ＋はアルギニン又はリシンを表し；
ＢＰ０はヒスチジンを表し；
ＡＰ−はアスパラギン酸又はグルタミン酸を表す。
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、その：
重鎖ＣＤＲ１の中に配列番号１のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含み；
重鎖ＣＤＲ２の中に配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８５％の相同性を有するペプチドを含み；
重鎖ＣＤＲ３の中に配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８５％の相同性を有するペプチドを含む、
抗体又は抗体断片を含む。
重鎖ＣＤＲ１の中に配列番号１のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含み；
重鎖ＣＤＲ２の中に配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８５％の相同性を有するペプチドを含み；
重鎖ＣＤＲ３の中に配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８５％の相同性を有するペプチドを含む、
抗体又は抗体断片を含む。
さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、その：
軽鎖ＣＤＲ１の中に配列番号６のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含み；
軽鎖ＣＤＲ２の中に配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するペプチドを含み；
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも５０％の相同性を有するペプチドを含む、
抗体又は抗体断片を含む。
軽鎖ＣＤＲ１の中に配列番号６のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含み；
軽鎖ＣＤＲ２の中に配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するペプチドを含み；
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも５０％の相同性を有するペプチドを含む、
抗体又は抗体断片を含む。
典型的には、本発明のポリペプチドでは、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１の配列であり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２又は配列番号３の配列であり、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号４又は配列番号５の配列であり、及び／又は前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号６の配列であり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号７又は配列番号８の配列であり、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号９又は配列番号１０の配列である。
本発明の特定の実施形態において、前記ポリペプチドでは抗体の可変領域の重鎖ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と抗体の可変領域の軽鎖ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はリンカー構造を介して相互に連結している。典型的には、本発明によるとそのリンカー構造は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。
さらに特定の実施形態では前記ポリペプチドは抗体又は組換え抗体、特に単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
本発明の対象は検出可能標識を備える本発明のポリペプチドを含む化合物でもある。
本発明の化合物の特定の実施形態において、前記検出可能標識は、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及びシアニン、並びにそれらの誘導体などの蛍光色素；ガンマ線放出放射性同位元素、特にヨード−１３１、ルテチウム−１７７、イットリウム９０；重金属、特にＣｄＳｅ又はＩｎＧａＰ、から構成される量子ドット；少なくとも３個、特に８〜１２個、の金又は銀の原子から構成される貴金属ナノクラスター、又は二酸化ケイ素からできたナノ粒子内に捕捉された合成フルオロフォア；ＭＲＩベースの分子イメージングの超常磁性酸化鉄粒子；ＧＦＰ又はｄｓＲＥＤのような蛍光タンパク質、又はそれらの誘導体；アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びガラクトシダーゼなどの酵素、からなる群より選択される。
本発明の化合物のさらに別の実施形態において、本発明のポリペプチドは化学連結基によって検出可能標識と連結している。
前記検出可能標識と前記ポリペプチドドメインを結合するためにその検出可能標識と本発明のポリペプチドの間に化学連結基を配置することができる。その検出可能標識の結合は各部分を本発明のペプチドと結合することにより実施され得る。参照により援用される国際公開第２００９／０１３３５９号パンフレットの開示によって提供された技術を用いることも可能である。
国際公開第２００９／０１３３５９号パンフレットによるＳＮＡＰタグ・テクノロジーの大きな可能性はその技術の広範なインビトロ用途とインビボ用途の中にある。可溶性分子又は表面へのタンパク質の結合、画像化技術、タンパク質間相互作用の分析、又はマウスにおける薬物動態の分析にそのテクノロジーを用いることができる。ＳＮＡＰタグについて、その汎用性のため、新しい治療薬と診断薬の開発分野におけるさらなる研究は大きなインパクトをもたらすことが合理的に予想される。
診断薬、特に急性骨髄性白血病の診断のための診断薬として本発明に従って本発明の化合物を使用することができる。
以上より、本発明の対象は急性骨髄性白血病の診断における本発明による化合物の使用でもある。
本発明の対象は急性骨髄性白血病の診断において使用される本発明のポリペプチド又は本発明による化合物を含む診断キットでもある。
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、及びそれらの断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び親抗体の抗原結合機能と特異性を保持する他の断片を指す。
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は均質な抗体集団を有する抗体組成物を指す。その用語はその抗体の種又は起源に関して限定されず、その抗体が作製される方法によっても限定されない。この用語は免疫グロブリン全体並びにその抗体の抗原結合機能及び抗体特異性を保持するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び他の断片などの断片を包含する。あらゆる哺乳類種のモノクローナル抗体を本発明において使用することができる。しかしながら、モノクローナル抗体を作製するために必要な雑種細胞株、又はハイブリドーマの作製に使用されるラット細胞株若しくはマウス細胞株の入手しやすさから、実際には抗体の起源はラット又はマウスであることが典型的である。
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」という用語は免疫グロブリンのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリン配列に由来していることを意味する。
本明細書において使用される場合、「単鎖抗体断片」（ｓｃＦｖ）という用語は、結合抗体の結合ドメイン（重鎖と軽鎖の両方）を決定し、結合機能の保存を可能にする連結部分を加えることにより調製される抗体を指す。これにより、本質的に抗原への結合に必要な可変ドメインの一部だけを有する極端に省略された抗体が形成される。単鎖抗体の決定と構築はＬａｄｎｅｒらによる米国特許第４９４６７７８号明細書に記載されている。
「検出可能標識」という用語は、例えば、本質的に放射線の放出（放射活性）により、又は相互作用により測定可能なパラメーターを示し得るあらゆる構造要素であり得る。検出可能標識は蛍光色素、例えば、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及びシアニン並びにそれらの誘導体である。好ましいフルオロフォアは６８０ｎｍと９５０ｎｍの間の近赤外（ＮＩＲ）範囲で発光する。この波長はバックグラウンド蛍光が非常に低く、且つ、組織透過性が優れており、したがってインビボでの蛍光検出に理想的に適している。特定の実施形態において、Ｓｎａｐタグと融合している腫瘍特異的抗体又は他のリガンドがＮＩＲ色素のＯ（６）−ベンジルグアニン（ＢＧ）誘導体で標識される。その標識抗体又はリガンドは腫瘍増殖及び／又は治療をインビボで視覚化するために使用され得る画像化ツールとして機能する。
一具体例において、ＥＧＦＲを標的とする単鎖抗体断片ＳＮＡＰタグ融合タンパク質に、７８２ｎｍで発光するＮＩＲ色素のＢＧ誘導体を結合した。それにより生じたインビボ画像化プローブを使用して膵臓癌異種移植モデルにおけるＥＧＦＲの発現を検出した。他の具体例において、幾つかのフルオロフォア結合複合体ＡＢをフローサイトメトリー用途及び共焦点顕微鏡法用途に使用した。さらに、検出可能標識はガンマ線放出放射性同位元素、例えば、ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、イットリウム９０、又はＤＯＴＡ若しくはＤＴＡＰのような錯化剤と通常組み合わせられる他のあらゆる診断学的に適切な同位元素であり得る。
さらに、検出可能標識はＣｄＳｅ又はＩｎＧａＰのような重金属から構成される量子ドットであり得る。量子ドットは高い量子収量と光安定性を有するため、好ましい光学イメージング剤である。コンポーネントＣによって表される蛍光標識の別の可能性として、数個（８〜１２個）の金又は銀の原子から構成される新規金属ナノクラスター、又は二酸化ケイ素からできたナノ粒子内に捕捉された合成フルオロフォアであり得る。
さらに、検出可能標識はＭＲＩベースのイメージングの超常磁性酸化鉄粒子である。
ＧＦＰ又はｄｓＲＥＤのような蛍光タンパク質又はそれらの誘導体は複合体ＡＢに結合した検出可能標識として機能し得る。蛍光タンパク質は現在では広範囲の可視光スペクトル並びに近赤外を範囲とする。
さらに、検出可能標識は様々な免疫アッセイにおいて一般的に適用されるアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びガラクトシダーゼのような酵素であり得る。
「無極性アミノ酸」、「極性アミノ酸」、「中性アミノ酸」、「正のアミノ酸」並びに「負のアミノ酸」という用語は必須アミノ酸と他のアミノ酸の両方におけるよく知られた特性を指す。タンパク質構成アミノ酸については表１にこれらの特性をまとめている。
ポリペプチドは個々のアミノ酸を生体高分子に重合するために用いられるペプチド結合を示す。ペプチド結合はエクソペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼによる酵素分解の対象となる。自然条件でポリペプチドの安定性を上昇させるため、Ｎ末端又はＣ末端をブロックすること、及び／又は、例えば、特にレトロ／インベルソ方向としてＤ−アミノ酸によって形成されるペプチド結合を導入することにより、ポリペプチド骨格を修飾することが可能である。
細胞と培養
ヒト急性骨髄性白血病Ｍ２由来細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１をドイツ生物材料リソースセンター（Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ、ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）から購入し、選択抗原として使用した。２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した８０％（ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、エッゲンシュタイン、ドイツ）の中で細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で培養し、３〜４日毎に１：２の比率で分割した。
ヒト急性骨髄性白血病Ｍ２由来細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１をドイツ生物材料リソースセンター（Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ、ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）から購入し、選択抗原として使用した。２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した８０％（ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、エッゲンシュタイン、ドイツ）の中で細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で培養し、３〜４日毎に１：２の比率で分割した。
フィコール試薬（ＧＥヘルスケア社、ミュンヘン、ドイツ）を使用してヘパリン添加全血より新しく単離されたヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の他、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ヴェーゼル、ドイツ）から得たヒト胚腎臓細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ及び急性骨髄性白血病Ｍ７由来細胞株ＫＧ−１を陰性対照として使用した。１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｍｌ当たり１０，０００単位のペニシリンと１０，０００μｇのストレプトマイシンからなるストック溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む９０％（ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ培地の中で上と同じ条件を用いて細胞を培養した。加えて、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質のトランスフェクションと発現のためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。そして、細胞を６×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに播種し、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡ及び３μｌのＦｕＧｅｎｅ ＨＤトランスフェクションリージェント（ロッシュ・ダイアグノスティックスＧｍｂＨ社、マンハイム、ドイツ）と共に培養した。機能性タンパク質の発現とＳＮＡＰタグ活性を、過去に記載されたように１４試験した。１００μｇ／ｍｌのゼオシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を標準培地に添加することにより、トランスフェクションに成功した細胞をゼオシン選択圧下で培養した。タンパク質の大量生産のため、２００ｍｌの培地を使用してトリプルフラスコ（Ｎｕｎｃ社、ランゲンゼルボルト、ドイツ）の中でトランスフェクト細胞を培養した。７〜８日毎に培地を更新した。
ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにおける可溶性ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質の分析
可溶性ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡにおいて、粗細胞培養上清並びに精製タンパク質を使用して、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ融合タンパク質の機能性が示された。そのため、９６ウェルマイクロタイタープレートを、１：１００に希釈した１００μｌのＫａｓｕｍｉ−１とＰＢＭＣの膜断片にて、４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％のＭＰＢＳを使用して２時間ブロッキングを行った後に、１００μｌ／ウェルのｓｃＦｖ含有細胞上清を室温で４００ｒｐｍの速度で振盪しながら１時間インキュベートした。０．０５％のＰＢＳＴを使用して未結合タンパク質を洗い流し、１００μｌの新しく調製したＡＢＴＳを使用して、結合したｓｃＦｖをそれらのＳＮＡＰタグを介して検出した。各ウェルに基質を添加し、上に記載されているように暗所でインキュベートした。Ｔｅｃａｎリーダーにおいて３時点（ＡＢＴＳの添加から１５分後、３０分後、及び６０分後）でＯＤ４９０ｎｍを参照として吸光度をＯＤ４０５ｎｍで測定した。
可溶性ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡにおいて、粗細胞培養上清並びに精製タンパク質を使用して、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ融合タンパク質の機能性が示された。そのため、９６ウェルマイクロタイタープレートを、１：１００に希釈した１００μｌのＫａｓｕｍｉ−１とＰＢＭＣの膜断片にて、４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％のＭＰＢＳを使用して２時間ブロッキングを行った後に、１００μｌ／ウェルのｓｃＦｖ含有細胞上清を室温で４００ｒｐｍの速度で振盪しながら１時間インキュベートした。０．０５％のＰＢＳＴを使用して未結合タンパク質を洗い流し、１００μｌの新しく調製したＡＢＴＳを使用して、結合したｓｃＦｖをそれらのＳＮＡＰタグを介して検出した。各ウェルに基質を添加し、上に記載されているように暗所でインキュベートした。Ｔｅｃａｎリーダーにおいて３時点（ＡＢＴＳの添加から１５分後、３０分後、及び６０分後）でＯＤ４９０ｎｍを参照として吸光度をＯＤ４０５ｎｍで測定した。
真核性発現ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質の結合強度の定量的比較のため、１μｇのＩＭＡＣ精製タンパク質を、総計で１００μｌの体積となるように２％のＭＰＢＳ中で予めブロックしたものを、各マイクロタイタープレートウェルにアプライし、ファージＥＬＩＳＡについて説明されている通りにＥＬＩＳＡ法を行った。一次抗体として０．２μｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗ＳＮＡＰタグポリクローナル抗体（Ａ００６８４、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）を使用し、二次抗体として１：５０００に希釈したポリクローナルヤギ抗ウサギＨＲＰ標識抗体（ａｂ６７２１、Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、英国）を使用して、結合したｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を検出した。直接的に標識されたｓｃＦｖクローンの結合活性の定性的試験のため、１μｇの溶出ｓｃＦｖタンパク質を、新たに回収され３回洗浄された５×１０５個のＰＢＭＣ又はＫａｓｕｍｉ−１細胞と共に、ブロッキング緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ）中で１時間、遮光下、氷上でインキュベートした。細胞洗浄器中でＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を３００μｌのブロッキング緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリーでの結合分析に直接的に使用した。
選択されたｓｃＦｖの機能的親和定数（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）の決定
選択された各ｓｃＦｖ抗体の親和定数の決定に、Ｂｅｎｅｄｉｃｔら１６の方法を改変したものが用いられている。それぞれビスタ・グリーンで標識されたｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタンパク質を様々な希釈度でＰＢＳで希釈し、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞と共に、上に記載されるようにインキュベーションした。濃度を０．５ｎＭ〜２０００ｎＭの範囲とし、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグの量の増加に伴い飽和レベルに達するようにした。細胞固有の蛍光やｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質の非特異的結合により生じるバックグラウンド蛍光シグナルを減算した後、各ｓｃＦｖとアプライした濃度についての蛍光強度の幾何平均を算出した。特異性を試験するためにＰＢＭＣに対する機能的親和力を並行して試験した。
選択された各ｓｃＦｖ抗体の親和定数の決定に、Ｂｅｎｅｄｉｃｔら１６の方法を改変したものが用いられている。それぞれビスタ・グリーンで標識されたｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタンパク質を様々な希釈度でＰＢＳで希釈し、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞と共に、上に記載されるようにインキュベーションした。濃度を０．５ｎＭ〜２０００ｎＭの範囲とし、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグの量の増加に伴い飽和レベルに達するようにした。細胞固有の蛍光やｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質の非特異的結合により生じるバックグラウンド蛍光シグナルを減算した後、各ｓｃＦｖとアプライした濃度についての蛍光強度の幾何平均を算出した。特異性を試験するためにＰＢＭＣに対する機能的親和力を並行して試験した。
一次組織試料
日常の病理組織学的検査に由来する保管されたホルマリン固定パラフィン包埋組織を材料として用いた。ホルマリン固定とパラフィン包埋は標準化された条件下で行われた。外科的切除の前に患者からインフォームドコンセントを得た後、地域の倫理委員会の許可を得てその材料を保管した。日常のＨＥ染色切片を評価している２人の経験を積んだ胃腸科の病理学者（シュテファン・キルヒナー、シュテファン・ガッテンレーナー）がパラフィン包埋組織の腫瘍ブロックを選択した。
日常の病理組織学的検査に由来する保管されたホルマリン固定パラフィン包埋組織を材料として用いた。ホルマリン固定とパラフィン包埋は標準化された条件下で行われた。外科的切除の前に患者からインフォームドコンセントを得た後、地域の倫理委員会の許可を得てその材料を保管した。日常のＨＥ染色切片を評価している２人の経験を積んだ胃腸科の病理学者（シュテファン・キルヒナー、シュテファン・ガッテンレーナー）がパラフィン包埋組織の腫瘍ブロックを選択した。
ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質を使用する免疫組織化学染色
脱パラフィン化後のＩＨＣにより、ＦＦＰＥ腸骨稜生検の連続切片に対して、選択したｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質の陽性の結合についての分析を行った。ミクロトーム上でホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックから組織切片を切り出し、粘着性スライドグラス（Ｈａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ社、ヴュルツブルク、ドイツ）上に載せた。２μｍ厚の連続切片を用いて完全自動化ＢＯＮＤ−ＭＡＸ（ライカマイクロシステムズ社、都市、国）で染色を行った。パーオキシド・ブロッキング試薬（ライカ社）で切片を１０分間ブロックし、直ぐにボンド洗浄溶液（ライカ社）で３回洗浄し、３％ＢＳＡで２０分間再びブロックし、そして前回のように洗浄した。１００μｌのｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質を含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清を３０分間インキュベートし、続いて抗体希釈剤中に１：５０００に希釈した１００μｌのマウスモノクローナル抗ＳＮＡＰタグ抗体と３０分間インキュベートすることにより結合を検査した。上記のように非特異的及び未結合抗体を洗い流した。ボンド・ポリマー・リファイン・ディテクションキットを製造業者の説明に従い使用して特異的結合を視覚化した。ＤＡＢ染色を１０分後に停止し、細胞をヘマトキシリンで５分間対比染色した。脱水、封入後、光学顕微鏡法で画像を撮った。病理学者が結合シグナルを視覚的に評価した。
脱パラフィン化後のＩＨＣにより、ＦＦＰＥ腸骨稜生検の連続切片に対して、選択したｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質の陽性の結合についての分析を行った。ミクロトーム上でホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックから組織切片を切り出し、粘着性スライドグラス（Ｈａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ社、ヴュルツブルク、ドイツ）上に載せた。２μｍ厚の連続切片を用いて完全自動化ＢＯＮＤ−ＭＡＸ（ライカマイクロシステムズ社、都市、国）で染色を行った。パーオキシド・ブロッキング試薬（ライカ社）で切片を１０分間ブロックし、直ぐにボンド洗浄溶液（ライカ社）で３回洗浄し、３％ＢＳＡで２０分間再びブロックし、そして前回のように洗浄した。１００μｌのｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質を含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清を３０分間インキュベートし、続いて抗体希釈剤中に１：５０００に希釈した１００μｌのマウスモノクローナル抗ＳＮＡＰタグ抗体と３０分間インキュベートすることにより結合を検査した。上記のように非特異的及び未結合抗体を洗い流した。ボンド・ポリマー・リファイン・ディテクションキットを製造業者の説明に従い使用して特異的結合を視覚化した。ＤＡＢ染色を１０分後に停止し、細胞をヘマトキシリンで５分間対比染色した。脱水、封入後、光学顕微鏡法で画像を撮った。病理学者が結合シグナルを視覚的に評価した。
免疫蛍光
上述のように脱パラフィン化とＢＯＮＤ−ＭＡＸでの染色の準備を行った後の組織切片に対して、免疫蛍光共局在化実験を行った。自動化免疫蛍光前処理を始める前に、切片を３％ＢＳＡで２０分間ブロックし、直ぐにボンド洗浄溶液（ライカ社）で３回洗浄した。ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグを含むトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清から、遠心分離により細胞破片を取り除き、その上清を１：４０に希釈したモノクローナルマウス抗ＣＤ３４抗体と混合した。組織切片上での４℃、一晩のインキュベーションの後にトリス緩衝液で未結合タンパク質を３回洗い流した。Ｄａｋｏ希釈剤中に１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ＳＮＡＰタグ抗体、及びこれに引き続く３％ＢＳＡ添加トリス緩衝液中に１：５００に希釈したヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８とのインキュベーションにより、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質の結合を検出した。同じ希釈度のモノクローナルヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用して抗ＣＤ３４抗体の陽性の結合を検出した。これらのインキュベーションは室温で２時間行い、引き続き上述の洗浄方法を行った。Ｄａｋｏ蛍光封入剤で組織切片を封入し、蛍光色素の検出用に４８８ｎｍと５６８ｎｍのフィルターを使用して顕微鏡で蛍光画像を撮った。
上述のように脱パラフィン化とＢＯＮＤ−ＭＡＸでの染色の準備を行った後の組織切片に対して、免疫蛍光共局在化実験を行った。自動化免疫蛍光前処理を始める前に、切片を３％ＢＳＡで２０分間ブロックし、直ぐにボンド洗浄溶液（ライカ社）で３回洗浄した。ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグを含むトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清から、遠心分離により細胞破片を取り除き、その上清を１：４０に希釈したモノクローナルマウス抗ＣＤ３４抗体と混合した。組織切片上での４℃、一晩のインキュベーションの後にトリス緩衝液で未結合タンパク質を３回洗い流した。Ｄａｋｏ希釈剤中に１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ＳＮＡＰタグ抗体、及びこれに引き続く３％ＢＳＡ添加トリス緩衝液中に１：５００に希釈したヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８とのインキュベーションにより、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質の結合を検出した。同じ希釈度のモノクローナルヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用して抗ＣＤ３４抗体の陽性の結合を検出した。これらのインキュベーションは室温で２時間行い、引き続き上述の洗浄方法を行った。Ｄａｋｏ蛍光封入剤で組織切片を封入し、蛍光色素の検出用に４８８ｎｍと５６８ｎｍのフィルターを使用して顕微鏡で蛍光画像を撮った。
データ分析
クマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのデジタルスキャニングの後に、ＡＩＤＡイメージアナライザー４．２７ソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ社、シュトラウベンハルト、ドイツ）を使用して可溶性ｓｃＦｖタンパク質の定量的分析を行った。ＶｅｒｓａＤｏｃ ＭＰシステム（ＢＩＯ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）とＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅベーシック１−Ｄ分析ソフトウェア第４．２．１版（ＢＩＯ−Ｒａｄ社）でフルオロフォア標識ｓｃＦｖを検出した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン社、ハイデルベルク、ドイツ）とフローサイトメトリー用Ｗｉｎｄｏｗｓマルチプルドキュメント・インターフェース第２．８版（ＷｉｎＭＤＩ、ジョゼフ・トロッター、米国）を使用してフローサイトメトリー分析からのデータを評価した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ社、ラホヤ、米国）を用いて統計分析を行った。データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で記載された。独立した実験の有意性を判定するために両側ｔ検定を用いた。基準ｐ＜０．０５を有意と見なし（＊）、ｐ＜０．０１を非常に有意と見なし（＊＊）、ｐ＜０．００１を高度に有意と見なした（＊＊＊）。
クマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのデジタルスキャニングの後に、ＡＩＤＡイメージアナライザー４．２７ソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ社、シュトラウベンハルト、ドイツ）を使用して可溶性ｓｃＦｖタンパク質の定量的分析を行った。ＶｅｒｓａＤｏｃ ＭＰシステム（ＢＩＯ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）とＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅベーシック１−Ｄ分析ソフトウェア第４．２．１版（ＢＩＯ−Ｒａｄ社）でフルオロフォア標識ｓｃＦｖを検出した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン社、ハイデルベルク、ドイツ）とフローサイトメトリー用Ｗｉｎｄｏｗｓマルチプルドキュメント・インターフェース第２．８版（ＷｉｎＭＤＩ、ジョゼフ・トロッター、米国）を使用してフローサイトメトリー分析からのデータを評価した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ社、ラホヤ、米国）を用いて統計分析を行った。データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で記載された。独立した実験の有意性を判定するために両側ｔ検定を用いた。基準ｐ＜０．０５を有意と見なし（＊）、ｐ＜０．０１を非常に有意と見なし（＊＊）、ｐ＜０．００１を高度に有意と見なした（＊＊＊）。
結果
可溶性ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質の結合親和力
選択したバインダーのｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を作製するためにｓｃＦｖインサートをバイシストロニックｐＭＳ ＳＮＡＰタグ真核生物発現ベクターにクローニングし（図１Ａ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。ゼオシンによる選択と蛍光顕微鏡法における緑色蛍光（ｅＧＦＰ）タンパク質活性の上昇により、有効なトランスフェクションを特定した。ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を上清に分泌させ、ＩＭＡＣにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットで分析した。精製したタンパク質を直接使用するか、又はＢＧ−ＳＮＡＰ基質を用いてフルオロフォアであるビスタ・グリーン又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７と結合させ、標識の視覚化が成功した後に使用した。ｓｃＦｖのモノクローナルＥＬＩＳＡで測定された吸収値に基づいて結合活性強度の最初の分類を行った。各精製ｓｃＦｖタンパク質１μｇを、Ｋａｓｕｍｉ−１の固定化膜断片、及び陰性対照としてのＰＢＭＣの固定化膜断片とインキュベートした。ウサギ抗ＳＮＡＰタグ一次抗体とＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して陽性の結合を検出し、ＡＢＴＳの添加後に４０５ｎｍで視覚化した。陰性対照よりも少なくとも２．５倍高い吸収値を有する選択したクローンを中程度の親和性（ａｆｆｉｎｅ）として分類し、５倍高い吸収値を有するクローンを高親和性として表した。この分類に従うと、選択したバインダーＥＭＩ４０８はＫａｓｕｍｉ−１膜断片に対する高親和性結合活性を示し、クローンＥＭＩ４０９は中程度の結合を示した（図１Ｂ）。さらに、フローサイトメトリー分析により生標的細胞への結合強度を評価したところ、１μｇのビスタ・グリーン標識タンパク質とインキュベートするとクローンＥＭＩ４０９については３６．６４±２４．３９％の、及びクローンＥＭＩ４０８については６５．７５±８．０７％のＫａｓｕｍｉ−１細胞のシフトがＦＬ−１で見出された（図１Ｃ）。ＰＢＭＣ枯渇細胞、又はＨＥＫ２９３Ｔ若しくはＫＧ−１のような他の陰性対照細胞に対する非特異的結合活性は、いかなる時にも観察されなかった。飽和レベルに達するように最大で２０００ｎＭの各バインダーと共にＫａｓｕｍｉ−１細胞をインキュベートし、ＫＤ値を決定した。細胞結合ｓｃＦｖのＭＦＩの増加を測定し、バックグラウンド蛍光に対して正規化し、飽和結合曲線において、アプライしたｓｃＦｖの濃度に対してプロットした。非線形回帰を用いて計算した各試料のＫＤ値はクローンＥＭＩ４０８については１９．９±２．５ｎＭであり、クローンＥＭＩ４０８については１５５．８±５７．３ｎＭであった（表１）。
可溶性ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグタンパク質の結合親和力
選択したバインダーのｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を作製するためにｓｃＦｖインサートをバイシストロニックｐＭＳ ＳＮＡＰタグ真核生物発現ベクターにクローニングし（図１Ａ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。ゼオシンによる選択と蛍光顕微鏡法における緑色蛍光（ｅＧＦＰ）タンパク質活性の上昇により、有効なトランスフェクションを特定した。ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を上清に分泌させ、ＩＭＡＣにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットで分析した。精製したタンパク質を直接使用するか、又はＢＧ−ＳＮＡＰ基質を用いてフルオロフォアであるビスタ・グリーン又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７と結合させ、標識の視覚化が成功した後に使用した。ｓｃＦｖのモノクローナルＥＬＩＳＡで測定された吸収値に基づいて結合活性強度の最初の分類を行った。各精製ｓｃＦｖタンパク質１μｇを、Ｋａｓｕｍｉ−１の固定化膜断片、及び陰性対照としてのＰＢＭＣの固定化膜断片とインキュベートした。ウサギ抗ＳＮＡＰタグ一次抗体とＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して陽性の結合を検出し、ＡＢＴＳの添加後に４０５ｎｍで視覚化した。陰性対照よりも少なくとも２．５倍高い吸収値を有する選択したクローンを中程度の親和性（ａｆｆｉｎｅ）として分類し、５倍高い吸収値を有するクローンを高親和性として表した。この分類に従うと、選択したバインダーＥＭＩ４０８はＫａｓｕｍｉ−１膜断片に対する高親和性結合活性を示し、クローンＥＭＩ４０９は中程度の結合を示した（図１Ｂ）。さらに、フローサイトメトリー分析により生標的細胞への結合強度を評価したところ、１μｇのビスタ・グリーン標識タンパク質とインキュベートするとクローンＥＭＩ４０９については３６．６４±２４．３９％の、及びクローンＥＭＩ４０８については６５．７５±８．０７％のＫａｓｕｍｉ−１細胞のシフトがＦＬ−１で見出された（図１Ｃ）。ＰＢＭＣ枯渇細胞、又はＨＥＫ２９３Ｔ若しくはＫＧ−１のような他の陰性対照細胞に対する非特異的結合活性は、いかなる時にも観察されなかった。飽和レベルに達するように最大で２０００ｎＭの各バインダーと共にＫａｓｕｍｉ−１細胞をインキュベートし、ＫＤ値を決定した。細胞結合ｓｃＦｖのＭＦＩの増加を測定し、バックグラウンド蛍光に対して正規化し、飽和結合曲線において、アプライしたｓｃＦｖの濃度に対してプロットした。非線形回帰を用いて計算した各試料のＫＤ値はクローンＥＭＩ４０８については１９．９±２．５ｎＭであり、クローンＥＭＩ４０８については１５５．８±５７．３ｎＭであった（表１）。
表１．選択したバインダーは、ＥＬＩＳＡ吸収値（＋はバックグラウンドよりも５倍未満、＋＋はバックグラウンドよりも５倍超高い）、ＦＡＣＳにより特定されるシフト細胞のパーセンテージ（＋は６０％未満、＋＋は６０％超）に基づいて中程度（＋）又は強（＋＋）と分類される。実験は少なくとも３回行われた。
ＦＦＰＥ一次組織上での結合
少なくとも２人のＡＭＬ Ｍ２陽性の患者の脱パラフィン化ＦＦＰＥ組織切片について、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグを含むトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清の結合分析を評価した。クローンＥＭＩ４０８とＥＭＩ４０９は、２回繰り返されたＩＨＣにおいて陽性の染色を示した。非結合性ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を使用した陰性対照では染色されないままであり、健康な骨髄生検での結合も観察されなかった（図２）。
少なくとも２人のＡＭＬ Ｍ２陽性の患者の脱パラフィン化ＦＦＰＥ組織切片について、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグを含むトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清の結合分析を評価した。クローンＥＭＩ４０８とＥＭＩ４０９は、２回繰り返されたＩＨＣにおいて陽性の染色を示した。非結合性ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を使用した陰性対照では染色されないままであり、健康な骨髄生検での結合も観察されなかった（図２）。
免疫蛍光二重染色
例として、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４モノクローナルマウス抗体を使用する免疫蛍光二重染色のために、ＥＭＩ４０８（ｓｃＦｖ）−ＳＮＡＰ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７を使用した。ＣＤ３４陽性細胞集団へのクローンＥＭＩ４０８の特異的結合が観察された（図３）。
例として、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４モノクローナルマウス抗体を使用する免疫蛍光二重染色のために、ＥＭＩ４０８（ｓｃＦｖ）−ＳＮＡＰ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７を使用した。ＣＤ３４陽性細胞集団へのクローンＥＭＩ４０８の特異的結合が観察された（図３）。
選択したｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質の交差反応性
精製し、フルオロフォアと結合させたｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を、他の細胞種への交差反応性について検査した。種々の（ｖｉａｂｌｅ）フローサイトメトリーの使用により、膵臓癌、前立腺癌、又は線維芽細胞のような関連性のない腫瘍細胞株への望ましくない結合活性を排除することができた。健康なＰＢＭＣに加えて、急性単球性白血病（Ｍ５、細胞株：ＭｏｎｏＭａｃ１）及び急性巨核芽球性白血病（Ｍ７、細胞株：ＫＧ−１）などの他の亜型のＡＭＬ細胞に対しても、結合は観察されなかった。しかしながら、ｓｃＦｖ ＥＭＩ４０８は、大元の選択細胞株であるＫａｓｕｍｉ−１（Ｍ２）と強い関連がある急性骨髄球白血病由来細胞株ＧＦ−Ｄ８（Ｍ１）に対して陽性の結合を示した（図４）。１μｇのビスタ・グリーン標識ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタンパク質ＥＭＩ４０８をＧＦ−Ｄ８細胞とインキュベートした後に、１８．６４±１３．３５％の細胞がＦＬ−１においてシフトした。非特異的コンストラクトとのインキュベーションはシグナルを示さなかった。
精製し、フルオロフォアと結合させたｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を、他の細胞種への交差反応性について検査した。種々の（ｖｉａｂｌｅ）フローサイトメトリーの使用により、膵臓癌、前立腺癌、又は線維芽細胞のような関連性のない腫瘍細胞株への望ましくない結合活性を排除することができた。健康なＰＢＭＣに加えて、急性単球性白血病（Ｍ５、細胞株：ＭｏｎｏＭａｃ１）及び急性巨核芽球性白血病（Ｍ７、細胞株：ＫＧ−１）などの他の亜型のＡＭＬ細胞に対しても、結合は観察されなかった。しかしながら、ｓｃＦｖ ＥＭＩ４０８は、大元の選択細胞株であるＫａｓｕｍｉ−１（Ｍ２）と強い関連がある急性骨髄球白血病由来細胞株ＧＦ−Ｄ８（Ｍ１）に対して陽性の結合を示した（図４）。１μｇのビスタ・グリーン標識ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタンパク質ＥＭＩ４０８をＧＦ−Ｄ８細胞とインキュベートした後に、１８．６４±１３．３５％の細胞がＦＬ−１においてシフトした。非特異的コンストラクトとのインキュベーションはシグナルを示さなかった。
参照文献
(1) Abutalib, S. A., and Tallman, M. S. (2006) Monoclonal antibodies for the treatment of acute myeloid leukemia. Curr Pharm Biotechnol 7, 343-69.
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Claims (15)
- Ｍ２型急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）特異的診断のための抗体又は抗体断片を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは抗体の重鎖ＶＨ及び軽鎖ＶＬの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対応しており、前記相補性決定領域が：
５アミノ酸からなる配列により規定され、前記５アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記５アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ１領域；
１７アミノ酸からなる配列により規定され、前記１７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記１７アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＰＯＮ − ＢＰ＋又はＰＯＮ − ＢＰ＋ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＡＰ− − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＢＰ＋ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ２領域；
７アミノ酸からなる配列により規定され、前記７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記７アミノ酸は式：ＮＰＮ − ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＢＰ＋又はＰＯＮ − ＮＰＮ − ＡＰ− − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記重鎖ＶＨのＣＤＲ３領域；
１１アミノ酸からなる配列により規定され、前記１１アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記１１アミノ酸は式：ＢＰ＋ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ１領域；
７アミノ酸からなる配列により規定され、前記７アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記７アミノ酸は式：ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＢＰ０又はＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ２領域；
９アミノ酸からなる配列により規定され、前記９アミノ酸はｐＨ７．４において側鎖に極性及び電荷を有し、前記アミノ酸配列の前記９アミノ酸は式：ＰＯＮ − ＰＯＮ − ＮＰＮ又はＢＰ＋ − ＢＰ＋又はＮＰＮ − ＰＯＮ又はＢＰ＋ − ＰＯＮ − ＮＰＮ − ＮＰＮ − ＰＯＮのとおり記号によって表されており、前記アミノ酸はペプチド結合によって連結されている、前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ３領域
を含み、
複数の前記式の前記アミノ酸はタンパク質構成アミノ酸であり、各記号は次の意味を有する：
ＰＯＮはｐＨ７．４において側鎖の極性が極性であり側鎖の電荷が中性のアミノ酸を表し；
ＮＰＮはｐＨ７．４において側鎖の極性が無極性であり側鎖の電荷が中性のアミノ酸を表し；
ＢＰ＋はｐＨ７．４において側鎖の極性が塩基性であり側鎖の電荷が正のアミノ酸を表し；
ＢＰ０はｐＨ７．４において側鎖の極性が塩基性であり側鎖の電荷が主に中性のアミノ酸を表し；
ＡＰ−はｐＨ７．４において側鎖の極性が酸性であり側鎖の電荷が負のアミノ酸を表す、
ポリペプチド。 - ＰＯＮがアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸を表し；
ＮＰＮがアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンからなる群より選択されるアミノ酸を表し；
ＢＰ＋がアルギニン又はリシンを表し；、
ＢＰ０がヒスチジンを表し；
ＡＰ−がアスパラギン酸又はグルタミン酸を表す、
請求項１に記載のポリペプチド。 - 前記抗体又は抗体断片がその：
重鎖ＣＤＲ１の中に配列番号１のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含み；
重鎖ＣＤＲ２の中に配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８５％の相同性を有するペプチドを含み；
重鎖ＣＤＲ３の中に配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８５％の相同性を有するペプチドを含む、
請求項１又は請求項２に記載のポリペプチド。 - 前記抗体又は抗体断片がその：
軽鎖ＣＤＲ１の中に配列番号６のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含み；
軽鎖ＣＤＲ２の中に配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するペプチドを含み；
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列のペプチドに対して少なくとも５０％の相同性を有するペプチドを含む、
請求項１から請求項３の少なくとも１項に記載のポリペプチド。 - 前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１の配列であり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２又は配列番号３の配列であり、且つ、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号４又は配列番号５の配列である、請求項１から請求項４の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
- 前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号６の配列であり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号７又は配列番号８の配列であり、且つ、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号９又は配列番号１０の配列である、請求項１から請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
- 抗体の可変領域の前記重鎖ＶＨの前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と抗体の可変領域の前記軽鎖ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がリンカー構造を介して相互に連結している、請求項１から請求項６の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
- 前記リンカー構造が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である、請求項１から請求項７の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが抗体又は組換え抗体、特に単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１から請求項８の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
- 検出可能標識を含む請求項１から請求項９の少なくとも１項に記載のポリペプチドを含む化合物。
- 前記検出可能標識が、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及びシアニン、並びにそれらの誘導体などの蛍光色素；ガンマ線放出放射性同位元素、特にヨード−１３１、ルテチウム−１７７、イットリウム９０；重金属、特にＣｄＳｅ又はＩｎＧａＰ、から構成される量子ドット；少なくとも３個、特に８〜１２個、の金又は銀の原子から構成される貴金属ナノクラスター、又は二酸化ケイ素からできたナノ粒子内に捕捉された合成フルオロフォア；ＭＲＩベースの分子イメージングの超常磁性酸化鉄粒子；ＧＦＰ又はｄｓＲＥＤのような蛍光タンパク質、又はそれらの誘導体；アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びガラクトシダーゼなどの酵素、からなる群より選択される、請求項１０に記載の化合物。
- 請求項１から請求項９の少なくとも１項に記載のポリペプチドが化学連結基によって検出可能標識と連結している、請求項１０又は請求項１１に記載の化合物。
- 診断薬、特にＭ２型急性骨髄性白血病を診断するための診断薬、として使用される請求項１０から請求項１２の少なくとも１項に記載の化合物。
- Ｍ２型急性骨髄性白血病の診断における請求項１０から請求項１２の少なくとも１項に記載の化合物の使用。
- 請求項１から請求項９の少なくとも１項に記載のポリペプチド又は請求項１０から請求項１２の少なくとも１項に記載の化合物を含む、Ｍ２型急性骨髄性白血病の診断において使用するための診断キット。
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