JP2009155226A - 抗シトルリン化gfapモノクローナル抗体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シトルリン化されたGFAP(グリア繊維性酸性タンパク質)を対応抗原とし、シトルリン化されていないGFAPとは実質的に反応しない、抗シトルリン化GFAPモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供した。また、該抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定によるシトルリン化GFAPの測定方法、及び該測定方法により測定した被検試料中のシトルリン化GFAPの存在量を指標とする神経変性疾患の検出方法を提供した。
【選択図】図4
Description
(1) ヒトグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)組換えタンパク質の作製
GFAP遺伝子(配列番号1)は、ヒト脳RNA(クローンテック社)からRT-PCR法により単離した。すなわち、上記ヒト脳RNAからoligo-dTプライマーによりcDNAを合成し、該cDNAを鋳型として、pENTR-hGFAP-Fプライマー5'-CACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3' (29 mer)(配列番号5)とpENTR-hGFAP-Rプライマー5'-GAGCAACTATCCTGCTTCTGCTC-3' (23 mer)(配列番号6)をプライマーとして用いてPCRを行ない(94℃−1分、55℃−1分、72℃−2分を30サイクル、Taqポリメラーゼ(インビトロジェン社)及び添付のバッファーを使用)、GFAP cDNAを増幅した。得られたGFAP cDNAをGateway Technology(インビトロジェン社)を用いてpENRT/D-TOPO ベクター(インビトロジェン社)に挿入した。次に、GFAP組換えタンパク質を作製するため、GFAP遺伝子をN末端に6個のヒスチジン(6×His)配列を持つpDEST17ベクター(インビトロジェン社)に組み換え、大腸菌BL21-AIを用いて6×His-GFAPとして組換えタンパク質を作製した。6×His-GFAP組換えタンパク質は不溶性のため、8 M 尿素存在下でNi-NTA アガロースビーズ(Qiagen)を用いて電気泳動による単一のバンド(分子量約50 kDa)が得られるレベルまで精製した(図1)。また、精製したGFAP組換えタンパク質は50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 300 mM NaCl, 0.05% Tween20, 20 mM 2メルカプトエタノール(2-ME), 1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF), 4 M 尿素で透析を行い、尿素濃度を最終4 Mにした。
hPAD2遺伝子(配列番号3)は、ヒト表皮有棘癌細胞HSC-1から抽出した全RNAからRT-PCR法により単離した。すなわち、上記全RNAからoligo-dTプライマーによりcDNAを合成し、該cDNAを鋳型として、pENTR-hPAD2-F 5'-CACCATGCTGCGCGAGCGGACCGTGCGGCTG-3' (31 mer)(配列番号7)とpENTR-hPAD2-R 5'-CCGGAATTCGCGGCCGCTCTGGGCGTGTGAGGGAGGGTCTGGAG-3' (44 mer)(配列番号8)をプライマーとして用いてPCRを行ない(94℃−1分、55℃−2分、72℃−2分を30サイクル、Taqポリメラーゼ(インビトロジェン社)及び添付のバッファーを使用)、hPAD2 cDNAを増幅して得た。得られたhPAD2 cDNAをGateway Technology(インビトロジェン社)を用いてpENRT/D-TOPO ベクター(インビトロジェン社)に挿入した。次に、hPAD2組換えタンパク質を作製するため、hPAD2遺伝子をN末端に6個のヒスチジン(6×His)配列を持つpDEST17ベクター(インビトロジェン社)に組み換え、大腸菌BL21-AIを用いて6×His-hPAD2として組換えタンパク質を作製した。6×His-hPAD2組換えタンパク質は、Ni-NTA アガロースビーズ(Qiagen)を用いて、電気泳動による単一のバンド(分子量約75 kDa)が得られるレベルにまで精製した(図2)。また、hPAD2組換えタンパク質の酵素活性は、benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE)を基質にして測定した。即ち、hPAD2組換えタンパク質と200 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM CaCl2, 10 mM DTT, 20 mM BAEEを25 μlずつ混合し、50℃で1時間反応させた。1時間後、5 M過塩素酸を12.5 μl加えて反応を停止し、氷上に20分間放置した。反応液50μlに比色定量用試薬(0.0416% FeCl3・6H2O:H2SO4:H2PO4(50:25:20)と0.5% ジアセチルモノオキシム, 0.01% チオセミルバジドを2 : 1で混合)950 μlを加え、煮沸水浴で5分間反応後、530 nmで吸光度を測定した。hPAD2活性は、約70 U/mlであった。
シトルリン化GFAP(Cit-GFAP)は(1)で作製したGFAP組換えタンパク質を、(2)で作製したhPAD2組換えタンパク質により、試験管内で酵素的にシトルリン化反応を起こさせて作製した。即ち、4 M尿素の溶けたGFAP (10 mg/ml) 2 mlと200 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM CaCl2, 10 mM DTT, 800 mU hPAD2組換えタンパク質 2 mlを混合し、37℃で反応させた。0分から1440分(24時間)まで経時的に反応液を回収し、GFAPがhPAD2によりどの程度シトルリン化されたかを、電気泳動したタンパク質のクマシー染色、そして化学修飾シトルリン化抗体(非特許文献2)を用いたウエスタン法により確認した。図3に示すように、Cit-GFAPはウエスタン法により反応10分後から確認できた。また、反応時間が長くなるにつれ、GFAP組換えタンパク質の電気泳動による移動度は遅くなり、バンドが2本になった。これは、GFAPがシトルリン化したため、タンパク質の電荷に変化が生じたためと考えられる。このように、GFAPは確かにシトルリン化したことが確認できた。以後、24時間反応後のCit-GFAPを抗体作製の抗原として用いることにした。
抗シトルリン化GFAP(Cit-GFAP)モノクローナル抗体は、上記(3)で作製したCit-GFAPをBALB/Cマウスのフットパットに免疫し、所属リンパ節リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより作製した。即ち、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したCit-GFAP(25〜50μg/マウス)を用いてBALB/Cマウスのフットパットに免疫した。3週間後、Cit-GFAP(25〜50μg/マウス)のみで追加免疫を行い、3日後、マウス後ろ肢リンパ節からリンパ球を取り出し、前もってRPMI-1640培地で培養していたマウスミエローマ細胞(P3U1)と3:1の比率で混合し、PEG(ベーリンガー社製)を用い細胞融合を行った。融合した細胞はHAT培地に浮遊した後、96 well培養プレートに分注し37℃、CO2インキュベータで培養した。
CTGF-1221、CTGF-1224Rの反応特異性は固相抗原ELISA、及びウエスタンブロットにて確認した。固相抗原ELISAはCit-GFAP、GFAP、Cit-HSA、HSA(ヒト血清アルブミン)をELISAプレートに吸着させた後、スキムミルクでブロッキングしたプレートを用いて行った。上記抗原固相プレートの各wellにそれぞれのモノクローナル抗体を反応させた後、上記(4)と同様にPOD標識抗マウスイムノグロブリン抗体、基質ABTSを加え発色を確認することによって行った。ウエスタンブロットは常法に従い、Cit-GFAPとGFAPをそれぞれ電気泳動後、PVDF膜(ミリポア社)に転写し、HRP標識抗マウスイムノグロブリン抗体、ECL化学発光(アマシャムファルマシア社)の順で反応させバンドの存在を確認した。下記表1及び図4に示すように、得られた抗体はいずれもシトルリン化HSAとは反応せず、また、CTGF-1221はCit-GFAPのみに、CTGF-1224RはCit-GFAP、GFAPの両者に反応することが確認できた。
CTGF-1221抗体がCit-GFAP中のどのシトルリン残基を認識しているか明らかにするため、Cit-GFAPをタンパク質分解酵素のひとつであるトリプシンにより部分消化し、CTGF-1221抗体を結合させたアフィニティーカラムにCit-GFAP消化物を結合させた。結合物を60%アセトニトリル、またはグリシン塩酸バッファー(pH 4.0)でCTGF-1221抗体アフィニティーカラムから溶出し、二次元電気泳動及びマススペクトロメトリーによりシトルリンを含むペプチド断片を同定した。その結果、図5に示すように、hPAD2組み換えタンパク質によるシトルリン化を受けたhGFAP中のシトルリン化部位、及びCTGF-1221抗体が認識する領域(図5中の(1)〜(3)、すなわち配列番号1中のaa31〜aa40、aa261〜aa276及びaa412〜aa432)が同定された。CTGF-1221抗体が複数の断片を認識しているのは、Cit-GFAPのシトルリンを含む高次構造を認識しているためであると考えられる。
実施例1で確立したCTGF-1221とCTGF-1224Rを用いてCit-GFAPサンドイッチELISAを確立した。即ち、NUNC社製ELISAプレート(POLYSORB)にCit-GFAPに特異的なCTGF-1221抗体を10μg/mlの濃度にPBS (pH 7.4)で希釈し、100μl/1wellづつ入れ、4 ℃で一晩放置し、吸着させた。次に5%スキムミルク(Difco社製)含有トリス緩衝液 (pH 7.4)を200μl/well入れ、37℃で5時間放置しMaskingを行った。洗浄緩衝液(0.05%Tween20含有PBS pH 7.4)で3回洗浄後、Cit-GFAPを1% BSA-PBSで2n希釈し、100μl/well入れ、37℃で1時間反応させた。特異性を確認するため、GFAPを同様に2n希釈し37℃で1時間反応させた。洗浄緩衝液で3回洗浄、アルカリフォスファターゼ(ALP)標識CTGF-1224R抗体を入れ、37℃で1時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄し、基質PNPPを100μl /well入れ室温で一晩放置した後、405nmの波長を測定した。図6にスタンダード、図7にGFAPとの交差反応を示す。本Cit-GFAP測定系はGFAPへの交差性が低く(0.1%程度)Cit-GFAPを特異的に測定していることが確認された。
実施例1で確立したCit-GFAP測定系(ALP-CTGF-1221 / CTGF-1224R)を用いてAD患者とコントロール脳抽出液中のCit-GFAPを測定した。脳抽出液は0.1M M Tris-HCl (pH7.6), 0.1% NP40, 1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)で脳をホモジナイズして調製した。BSA-PBSで3n希釈したAD患者、及びコントロール脳抽出液(同年齢の脳より抽出)を実施例2のCit-GFAPの代わりに用いてELISAを行った。図8に示すように本測定系は脳抽出液中に存在するNative Cit-GFAPを検出することができた。ADとコントロール脳を比較するとAD患者で数倍量存在することが確認された。
実施例1で作製したCit-GFAPに特異的なCTGF-1221抗体を用いてAD患者とコントロール脳の大脳皮質領域での免疫染色を行った。即ち、AD脳及びコントロール脳をパラフィン包埋して薄切した切片を染色に使用した。切片を脱パラフィン後、一次抗体としてCTGF-1221を用い、次にVECTASTAIN Elite ABC kit (VECTOR社)、そして発色基質にジアミノベンチジン(DAB)を用いて発色させた。図9に示すようにCTGF-1221抗体はAD患者脳で特異的に濃く染色された。コントロール脳ではほとんど染色は認められなかった。従って、CTGF-1221はアルツハイマー病脳に存在するCit-GFAPを特異的に高感度で検出できることが確認できた。
Claims (13)
- シトルリン化されたGFAP(グリア繊維性酸性タンパク質)を対応抗原とし、シトルリン化されていないGFAPとは実質的に反応しない、抗シトルリン化GFAPモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- シトルリン化されたGFAP以外のシトルリン化されたタンパク質とは実質的に反応しない請求項1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- PAD2(2型ペプチジルアルギニンデイミナーゼ)によりシトルリン化されたGFAPと抗原抗体反応する請求項1又は2記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- シトルリン化されたGFAPの断片であって、配列番号1に示されるアミノ酸配列中のaa31〜40、aa261〜276及びaa412〜432の領域から成る各断片の少なくとも1つと特異的に結合する請求項1ないし3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- 前記各断片の全てと特異的に結合する請求項4記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- アルツハイマー病患者の脳中に存在するシトルリン化されたGFAPと抗原抗体反応する請求項1ないし5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- 請求項1ないし6のいずれか1項に記載の抗シトルリン化GFAPモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、被検試料中のシトルリン化GFAPとの抗原抗体反応を利用した免疫測定により、被検試料中のシトルリン化GFAPを測定することを含む、シトルリン化GFAPの測定方法。
- 前記免疫測定は固相化抗体及び標識抗体を用いたサンドイッチ法により行なわれ、固相化抗体及び標識抗体のいずれか一方に前記抗シトルリン化GFAPモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用い、他方にシトルリン化GFAP及び非シトルリン化GFAPの双方と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いる請求項7記載の測定方法。
- 身体から得た被検試料に対して請求項7又は8記載の測定方法を行なうことにより測定される、前記被検試料中のシトルリン化GFAPの存在量を指標とする、神経変性疾患の検出方法。
- 前記被検試料が、脳組織、脳脊髄液、血清又は血漿である請求項9記載の検出方法。
- 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項9又は10記載の検出方法。
- 請求項7又は8記載の測定方法を実施するためのキットであって、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の抗シトルリン化GFAPモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むシトルリン化GFAPの測定キット。
- 請求項9ないし11のいずれか1項に記載の検出方法を実施するためのキットであって、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の抗シトルリン化GFAPモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む神経変性疾患の検出キット。
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