JP2015513370A - 脳損傷または神経変性のバイオマーカーとしてのシトルリン化脳および神経タンパク質 - Google Patents
脳損傷または神経変性のバイオマーカーとしてのシトルリン化脳および神経タンパク質 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、その全文を参照文献として本願に援用する、2012年3月13日に出願された米国特許仮出願第61/610,034号の利益を主張する。
本発明は、第1R01HL091759−02号、第5U54HL090515−02号、および第NHLBI−HV−10−05(2)号助成金の下で米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本願は配列表を含む。それは「P11929-02_Sequence_Listing.txt.」という標題のASCIIテキストファイルとしてEFS−Webを通じて電子的に提出されている。配列表はサイズが75,410バイトであり、2013年3月12日に作成された。その全体を本願に参照文献として援用する。
本願で用いる用語「抗体」は、特定の抗原と反応する任意の免疫グロブリン分子に関して用いられる。当該用語は、任意の発生源(例:ヒト、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなど)から入手した任意の免疫グロブリン(例:IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなど)を包含することが意図されている。抗体の具体的な種類/例はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外の様式でヒトに適した抗体を包む。「抗体」は、本願に記載する任意の抗体の任意のフラグメントまたは誘導体も含む。
(A.質量分析法による検出)
1つの実施形態においては、本発明のバイオマーカーは、気相イオンを検出する質量分析器を用いる方法である質量分析法によって検出しうる。質量分析法の例は、飛行時間型、磁気セクター、四極子フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、オービトラップ、前述の混成または複合等である。
他の実施形態においては、本発明のバイオマーカーはイムノアッセイによって検出および/または測定することができる。イムノアッセイは、バイオマーカーを捕捉するために抗体などの生体特異的捕捉試薬を必要とする。多くの抗体が市販されている。抗体は、たとえば動物をバイオマーカーによって免疫することなどの、技術上周知の方法によっても生成することができる。バイオマーカーは、その結合特性に基づいてサンプルより分離することができる。代替的に、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列が既知である場合は、ポリペプチドを合成し、さらに技術上周知の方法によって抗体を生成するために用いることができる。
いくつかの実施形態においては、本発明のバイオマーカーはメソスケールディスカバリー(メリーランド州ゲッサーズバーグ)によって開発されたエレクトロケミカルミネセント(電気化学発光)測定法によって検出しうる。電気化学発光検出は、電気化学的に刺激されたときに発光する標識を用いる。刺激メカニズム(電気)はシグナル(光)からデカプリングするため、バックグラウンドシグナルは最小である。標識は安定で、非放射性でありかつ簡便な結合化学特性の選択肢を提供する。約620nmの光を発し、カラークエンチングの問題を解消する。米国特許第7,497,997号;第7,491,540号;第7,288,410号;第7,036,946号;第7,052,861号;第6,977,722号;第6,919,173号;第6,673,533号;第6,413,783号;第6,362,011号;第6,319,670号;第6,207,369号;第6,140,045号;第6,090,545号;および第5,866,434号を参照されたい。米国特許出願公開第2009/0170121号;第2009/006339号;第2009/0065357号;第2006/0172340号;第2006/0019319号;第2005/0142033号;第2005/0052646号;第2004/0022677号;第2003/0124572号;第2003/0113713号;第2003/0003460号;第2002/0137234号;第2002/0086335号;および第2001/0021534号を参照されたい。
本発明のバイオマーカーは、他の適当な方法で検出することができる。この目的のために用いることのできる検出パラダイムは、光学的方法、電気化学的方法(ボルタメトリー法および電流滴定法)、原子間力顕微鏡、およびたとえば多極共鳴分光法などの高周波法を含む。光学的方法の例示は、共焦点および非共焦点顕微鏡に加えて、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率(例:表面プラスモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、回折格子結合器導波管法または干渉法)である。
(A.)
本発明は、脳損傷または神経変性を診断するためのバイオマーカーの使用に関する。簡潔さを期するために、用語「脳損傷」は、本願を通して用いられることが理解されるが、本願に記載の方法およびバイオマーカーは神経変性を診断する状況においても適用されることが理解される。より具体的には、本発明のバイオマーカーは、個人、対象または患者において、たとえば脳損傷を診断するためなどに脳損傷または状態を判定、認定、および/または評価するための診断検査において使用することができる。具体的な実施形態においては、脳損傷状態は患者の脳損傷状態を判定すること、またはたとえば個人、対象または患者の脳損傷を診断するためなどに脳損傷状態を判定することを含むことができる。より具体的には、脳損傷(例:無症候性脳損傷)を診断する際に検出しようとするバイオマーカーはMBP、GFAP、チューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、アストロタクチン1(ASTN1)、脳血管新生阻害物質3(BAI3);カルノシンジペプチダーゼ1(CNDP1);ERMIN;グリア細胞線維性酸性タンパク質(GFAP);代謝型グルタミン酸受容体3型(GRM3);ケルヒ様タンパク質32(KLH32);メラノーマ抗原ファミリーE,2(MAGE2);ニューレグリン3(NRG3);ニューログラニン(NRGN);オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質(OMG);溶質輸送体ファミリー39(亜鉛輸送体)、メンバー12(SLC39A12);レティキュロン1(RTN1);メタロチオネイン(MT3)、およびペプチジルアルギニンデイミナーゼ2型(PAD−2)をさらに含むが、これに限定されない。表1〜11および13〜17も本発明の方法において有用なバイオマーカー(すなわちペプチド)を列挙する。関係技術上既知である他のバイオマーカーを本願に記載のバイオマーカーと組み合わせて用いうる。本発明は、非修飾および修飾(例:シトルリン化または他の翻訳後修飾)タンパク質/ポリペプチド/ペプチドの両者、さらには前述のいずれかに対する自己抗体の検出、測定、定量、判定などをさらに意図し、患者の脳損傷状態を判定する。
本発明のバイオマーカーは、患者の脳損傷状態を評価、判定、および/または認定(本願では互換的に使用される)するための診断検査において用いることができる。語句「脳損傷状態」は脳損傷がないことを含めた状態の任意の判別可能な発現を含む。たとえば、脳損傷状態は、患者における脳損傷の有無、脳損傷を発症するリスク、脳損傷の病期または重症度、脳損傷の進行(例:経時的な脳損傷の進行)および脳損傷の治療の有効性またはこれに対する反応(例:治療後の脳損傷の臨床的経過観察および監視など)を制限なく含む。この状態に基づき、追加的な診断検査または治療手技または治療法を含めたさらなる手順を指示しうる。
具体的な実施形態においては、本発明は患者が脳損傷を発症するリスクを判定するための方法を提供する。バイオマーカーの百分率、比率、量またはパターンは、たとえば高、中、または低などの多様なリスク状態の特徴である。脳損傷を発症するリスクは、関連バイオマーカーを測定し、その後それらを分類アルゴリズムに投入するか、または参照値、すなわち特定のリスクレベルと関連する事前に定義するバイオマーカーのレベルまたはパターンと比較することによって判定する。
他の実施形態においては、本発明は患者の脳損傷の重症度を判定するための方法を提供する。脳損傷の各等級または病期は、特徴的なバイオマーカーのレベルまたはバイオマーカー群の相対的レベル/比率(パターンまたは比率)を有する可能性がある。脳損傷の重症度は、関連バイオマーカーを測定し、その後それらを分類アルゴリズムに投入するか、または参照値、すなわち特定の病期と関連する事前に定義するバイオマーカーのレベルまたはパターンと比較することによって判定する。
1つの実施形態においては、本発明は患者の脳損傷の経過を判定するための方法を提供する。脳損傷の経過は、脳損傷の進行(悪化)および脳損傷の後退(改善)を含む、脳損傷状態の経時的変化を意味する。時間と共に、バイオマーカーの量または相対的な量(例:パターンまたは比率)は変化する。たとえば、バイオマーカー「X」が脳損傷に伴って増加することがある一方で、バイオマーカー「Y」が脳損傷に伴って減少することもある。したがって、脳損傷または非脳損傷に向かうこれらのバイオマーカーの経時的な増加または減少の傾向は、状態の経過を示す。このため、本方法は、患者の1つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを、たとえば1回目および2回目などの少なくとも2つの測定時に測定し、かつ変化があればこれを比較することを包含する。脳損傷の経過はこれらの比較に基づいて判定する。
脳損傷状態を認定する方法の一定の実施形態においては、方法は状態に基づく患者の治療を管理することをさらに含む。そのような管理は、脳損傷状態を判定することに続く医師または臨床家の措置を含む。たとえば、医師が脳損傷の診断を下す場合、その後に一定のモニタリング法を実施するであろう。本発明の方法を用いた脳損傷の経過の評価は、その後一定の脳損傷治療法を必要とすることもある。代替的に、非脳損傷の診断の後で、患者が罹患していることもありうる具体的な疾患を判定するためにさらなる検査を行うこともありうる。また、診断検査の結果が脳損傷に関する結論に至らない場合はさらなる検査を要請することもある。
他の実施形態においては、本発明は医薬品の治療効果を判定するための方法を提供する。これらの方法は、医薬品の臨床試験を実施する際、および医薬品を使用している患者の進行をモニタリングする際に有用である。治療法または臨床試験は、医薬品を特定の投与法で投与することを包含する。投与法は、医薬品の1回投与または医薬品の経時的複数回投与を包含しうる。医師または臨床研究者は、患者または被験者に対する医薬品の効果を投与の過程に渡ってモニタリングする。薬剤が病状に対して薬理学的影響を有する場合、本発明の1つまたはそれ以上のバイオマーカーの量または相対量(例:パターン、プロフィールまたは比率)は、非脳損傷プロフィールに向かって変化しうる。したがって、投与クール中、患者における1つまたはそれ以上のバイオマーカーの経過を追跡することができる。これにより、本方法は薬物療法を受ける患者の1つまたはそれ以上のバイオマーカーを測定すること、およびバイオマーカーレベル/比率を患者の脳損傷状態と(例:種々の脳損傷状態に対応する事前に定義するバイオマーカーのレベル/比率との比較により)相関させることを包含する。本方法の1つの実施形態は、たとえば1回目および2回目など、薬物療法クール中の少なくとも2つの測定時について1つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル/比率を判定し、かつバイオマーカーのレベル/比率に変化があればこれと比較することを包含する。たとえば、1つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル/比率は薬剤の投与の前後、または薬剤投与中の異なる2つの測定時に測定することができる。治療法の効果はこれらの比較に基づいて判定する。治療が有効である場合は1つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル/比率は正常となる傾向を示す一方、治療が無効である場合は1つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル/比率は脳損傷を表す傾向を示すであろう。
一部の実施形態においては、「既知のサンプル」などのサンプルを用いて生成したデータはその後分類モデルを「トレーニング」するために用いることができる。「既知のサンプル」とは事前に分類されたサンプルである。分類モデルを形成するために用いるデータは「トレーニングデータセット」と呼ぶことができる。分類モデルを形成するために用いるトレーニングデータセットは生データを含むこともあれば、または事前に処理したデータを含むこともある。分類モデルは、一旦トレーニングすれば未知のサンプルを用いて生成したデータにおけるパターンを認識することができる。分類モデルはその後未知のサンプルを階級に分類するために用いることができる。これは、たとえば特定の生体サンプルが一定の生物学的状態と関連するか否か予測する際など(例:疾患対非疾患)に有用となることがある。
他の態様においては、本発明は脳損傷状態を認定するためのキットであって、当該キットが本願に記載するバイオマーカーを検出するために用いられるキットを提供する。具体的な実施形態においてキットは、MBP、GFAP、PAD−2、チューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GFAP、GRM3、KLH32、MAGE2、NRG3、NRGN、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、およびPAD2、さらには表1〜11、および13〜17に列記されたペプチドを含むがこれに限定されない本発明のバイオマーカーに対する抗体を含むELISAキットとして提供される。具体的な実施形態においては、抗体はNRGNまたはそのペプチドの修飾または非修飾型と特異的に結合する。
本発明はシトルリン化ポリペプチドを提供する。本願で用いる用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本願において任意の長さのアミノ酸の重合体を意味するために互換的に用いられる。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語は、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの発現後修飾も包含する。定義に含まれるものは、たとえば、1つまたはそれ以上のアミノ酸類似体(たとえば非天然アミノ酸などを含む)を含有するポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、さらには天然に生成および非天然的に生成する技術上既知の他の修飾体を含む。
本発明は、シトルリン化ペプチドを用いるための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本願に記載のシトルリン化ペプチドは、対応する自己抗体の存在について測定するために用いることができる。具体的な実施形態においては、対象におけるシトルリン化NRGNに対する自己抗体の存在を検出するための方法は、対象から採取された生体サンプルをシトルリン化NRGNポリペプチドと接触させること、およびポリペプチドのポリペプチドに特異的な自己抗体との結合を検出することを含み、結合の検出が対象におけるシトルリン化NRGN自己抗体の存在を示すことを特徴とする。本発明は、チューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GRM3、KLH32、MAGE2、NRG3、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせに対する自己抗体の検出を意図する。より具体的には、本発明は修飾および/または非修飾タンパク質/ペプチドに対する自己抗体の検出/定量/測定を意図する。
(試薬と化学物質)
ウシミエリン塩基性タンパク質(MBP)およびペプチジルアルギニンデイミナーゼ2型(PAD2)はシグマ−アルドリッチ(ミズーリ州セントルイス)より入手した。ウシニューログラニン(NRGN)およびウシグリア細胞線維性酸性タンパク質(GFAP)は、ウシMPBサンプル内で質量分析法(MS)により同定した。組換えヒトNRGNは、細菌(Rosetta2 DE3、pEX−N−His−NRGNプラスミド)に発現させNi−NTAアガロースビーズで精製した。N末端のHis−タグ、C末端のT79およびR80を含む追加的なアミノ酸残基を、組換えタンパク質NRGNに導入した(図8)。ヒトの脳に由来する天然ヒトグリア細胞線維性酸性タンパク質(GFAP)は、カルビオケム(EMDケミカル社、ニュージャージー州ギブズタウン)より購入した。ヒトMBPは、ヒトGFAPサンプル内で質量分析法により同定した。配列決定グレード修飾トリプシンおよびエンドプロテイナーゼGlu−Cは、プロメガ(ウィスコンシン州マジソン)より購入した。エンドプロテイナーゼLys−Cは、ロシェ・ダイアグノスティクス(インディアナ州インディアナポリス)より入手した。RapiGest界面活性剤は、ウォーターズ(マサチューセッツ州ミルフォード)より購入した。その他の薬品はシグマ−アルドリッチ(ミズーリ州セントルイス)に由来した。
ウシMBP、ヒトGFAP、およびヒト組換えタンパク質NRGNを未処理とするかまたはPAD2で処理してペプチジルアルギニンをペプチジルシトルリンに変換した。ピアス ビシンコニン酸(BCA)タンパク質測定キット(ピアス、イリノイ州ロックフォード)を用いてタンパク質濃度を測定した。各タンパク質(2μg)を、20mM CaCl2、200mM トリスHCl pH7.5、10mMジチオスレイトールより構成される総体積40μLの緩衝液の中のPAD2 0.15μg(比活性0.254単位/μg;1単位は55℃、pH7.2でN−ベンゾイル−L−アルギニンエチルエステル(BAEE)よりN−α−ベンゾイルシトルリンエチルエステルを1時間あたり1μモル生成)により55℃で2時間処理した。未処理サンプルは同じ緩衝液に溶解した。PAD2処理サンプルおよび未処理サンプルは、0.1%RapiGest界面活性剤で変性させ、5mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンにより50℃で30分間還元し、さらに10mMヨードアセトアミドにより室温で30分間(暗所で)アルキル化した。配列決定グレード修飾トリプシン、Lys−C、またはGlu−Cをタンパク質サンプルに1:20の比率(酵素対基質)で添加した。サンプルを37℃で16時間インキュベートした。サンプルは、Oasis逆相HLBカートリッジ(30mg/30μm、ウォーターズ、マサチューセッツ州ミルフォード)で固相抽出により脱塩した。
ヒト脊髄組織は、ジョンズホプキンス大学医学部病院の2名の患者より承認を得て入手した。組織サンプル(約60mg)は分解緩衝液(8M尿素、Amberlite IRN 150L、2Mチオ尿素、4%Chaps、1%DTT)0.5mL中でホモジナイズし、サンプル粉砕キット(GEヘルスケア、ニュージャージー州ピスカタウェイ)により製品プロトコルにしたがってタンパク質を抽出した。ホモジネートは12,000rpmで10分間遠心分離し、さらに上清を−80℃の冷凍庫で保存した。上清(100μL)は、2−Dクリーンアップキット(GEヘルスケア、ニュージャージー州ピスカタウェイ)により指示にしたがって清澄化した。沈殿および遠心分離の後、ペレットを6M尿素に溶解した。2つの標本中のタンパク質濃度を、ピアスBCAタンパク質測定キット(ピアス、イリノイ州ロックフォード)を用いて測定した。タンパク質抽出物を還元し、アルキル化し、上述の方法でトリプシン、Lys−C、またはGlu−Cにより消化した。
消化したタンパク質サンプル(100ng)を、ナノフローHPLCによりLTQ−オービトラップ質量分析器(サーモフィッシャーサイエンティフィック、カリフォルニア州サンホセ)上で分析した。アジレント1200シリーズナノフローLCシステム(アジレント、カリフォルニア州サンタクララ)を、溶媒A(0.1%ギ酸)および溶媒B(90%アセトニトリル0.1%ギ酸溶液)によるクロマトグラフィ分離に用いた。サンプルは、Michrom Bioresources社(カリフォルニア州オーバン)のMagic C18AQ充填剤(粒子径5μm、孔径200Å)を所内で10cm充填した内径75μmの逆相キャピラリーカラムPicoFritSelf/Pカラム(New Objectifve、マサチューセッツ州ウォバーン)に装填した。流速2μL/分の溶媒B2%で8分間の分離を開始した。流速300nL/分で、溶媒B10%から45%まで36分間のリニアグラジエントの後、溶媒B45%から95%まで10分間のリニアグラジエントを行った。
(例1:ウシMBPタンパク質のLC−MS/MS分析)
ウシMBPは2つのシトルリン化部位を有することが過去に報告されている。ウシMBPは容易に購入できるので、複雑な混合物からシトルリン化ペプチドを同定するためのLC−MS/MS法を確立するためのモデルタンパク質としてウシMBPを選択した。Lys−Cおよびトリプシンを、ウシMBPサンプルからペプチドフラグメントを生成するためのエンドプロテイナーゼとして共に用いた。
b:ペプチドの質量対電荷比率
c:選択した前駆体イオンの荷電状態
d:T97でリン酸化されたペプチドまたはされていないペプチドのいずれも検出された。
e:NA、シトルリン化残基が同定されなかったので該当せず。
f:ヒトではペプチド配列が保持されている。
g:シトルリン化アルギニン残基はヒトでは保持されているが、ペプチド配列は異なる。
ウシMBPサンプル中で新規タンパク質ニューログラニン(NRGN)がシトルリン化されると確認された。GFAPのシトルリン化ペプチドも確認された。GFAPのシトルリン化残基が同定されたのはこれが初めてである。NRGNおよびGFAPのシトルリン化ペプチドおよび当該ペプチドの非修飾体は、いずれもウシMBPサンプル中で同定された(表2)。シトルリン化ペプチドの配列は、MS/MSスペクトルを理論フラグメントイオン、シトリン化ペプチドの特異なフラグメント化パターン(図5および6)、および前駆体イオンの高分解度質量体電荷比と比較して確認した。
b:ペプチドの質量対電荷比率
c:zは選択された前駆体イオンの荷電状態
d:NA、シトルリン化残基が同定されなかったので該当せず。
e:シトルリン化アルギニン残基はヒトにおいて保持されるが、ペプチド配列は異なる。
f:ヒトにおいてペプチド配列が保持されている。
ヒト自己免疫疾患である多発性硬化症(MS)では、GFAPおよびMBPタンパク質がシトルリン化されることが過去に報告されている。先行研究では、シトルリン化GFAPおよびMBPは化学修飾されたシトルリンに対する抗体を用いて検出された。しかし、GFAPのシトルリン化残基は同定されなかった。
b:ペプチドの質量対電荷比率
c:zは選択された前駆体イオンの荷電状態である。
d:NA、シトルリン化残基が同定されなかったので該当せず。
NRGN、GFAPおよびMBPにおいて考えられるすべてのシトルリン化部位の位置を確認するため、これら3つのタンパク質をPAD2酵素で処理した。Lys−CおよびGlu−Cを用いて質量分析法のための適切なペプチドを生成した。組換えヒトNRGNは、サブクローニングの結果NおよびC末端に追加的アミノ酸を導入された(図8)。
b:二重荷電イオンの質量対電荷比率;前駆体イオンの荷電状態は通常+2である。
c:T79およびR80はサブクローニング中に組換えタンパク質NRGNに導入される。
d:T97でリン酸化されたペプチドまたはされていないペプチドのいずれも検出された。
e:このペプチドではR106のモノ-およびジメチル化が認められた。
トリプシンおよびlys−C消化物としたヒト脊髄脳組織サンプルのいずれにおいてもMBP、GFAP、およびNRGNが同定された。タンパク質配列有効範囲はそれぞれ64%、54%および31%であった。MPBについては、ヒト組織サンプルにおいて11の内因性シトルリン化部位が確認された(図11)。シトルリン化部位は、本発明において同定された5つの新規アルギニン残基(R43、R49、R65、R162、およびR169)を含む。この結果は、ヒトサンプル中に神経タンパク質のシトルリン化型が存在することを立証する。ペプチドおよびタンパク質の修飾型は、現在の我々の方法を用いて複雑な混合物中で検出することができる。
これらの発見に基づき、本発明者らは内因性ヒトタンパク質NRGN、GFAP、MBP、およびPAD2を定量するためのMRM測定法を開発している(表5〜9、11〜12、および14〜17)。MRM測定法は、表1〜4に記載されたシトルリン化および非修飾ペプチドに基づく、考えられる典型的な生物分析法の一部に過ぎない。これらはすべての可能なMRM測定法の完全な一覧ではない。代替的なMRM測定法は、異なる荷電状態のペプチドイオン、他の修飾を伴うペプチド(たとえば酸化、メチル化、およびリン酸化)、シトルリン化残基および/または修飾の組み合わせを伴うペプチド、および他のエンドプロテイナーゼまたは化学試薬を用いて生成されるペプチドに基づいて開発することができる。さらなるシトルリン化部位は、ヒトGFAPタンパク質について存在しうる。これらのヒトGFAPタンパク質の追加的修飾ペプチドについて同様のMRM測定法を開発することができる。MRM測定法は、シトルリン化ペプチドまたは化学的に修飾されたタンパク質について開発することも可能である。
GFAPのシトルリン化の可能性を評価するため、活性化カルシウムの存在下で精製ヒトタンパク質をPAD2酵素により処理した。質量分析法分析に先立ち、トリプシン、Lys−CおよびGlu−Cを用いて未処理のおよび処理サンプルの適切なペプチドを生成した。未処理サンプルには、ヒトGFAPタンパク質について同定された5つの自然シトルリン化部位である残基R30、R36、R270、R406およびR416があった(表9;シトルリン化ペプチドのMS/MSスペクトル(データは示さず))。各MS/MSスペクトルを理論的フラグメントイオンと比較することでこれをマニュアル検証した。ペプチド配列は、高分解度オービトラップMS分析によっても確認された(表12)。シトルリン化ペプチドのMS/MSスペクトルにおけるイソシアン酸(HNCO)の中性損失は、衝突誘発解離後の典型的なフラグメント化経路である。この特異なフラグメントイオンはシトルリン化ペプチドの同定および検証のためにモニタリングされ、また大半のサンプルで観察された。
トリプシンで消化されたか(表9)またはLys−C消化されたか(表13)にかかわらず、未処理サンプル中では合計5つのウシMBPのアルギニン残基がシトルリン化されると確認された。シトルリン化ペプチドNIVTPR*TPPPSQGK(残基91〜104)(配列番号9)、PGFGYGGR*ASDYK(残基122〜134)(配列番号11)、および当該ペプチドの非修飾体NIVTPR(残基91−96)、PGFGYGGR(残基122〜129)(配列番号17)が確認されたことは、シトルリン化によってシトルリン残基のC末端におけるトリプシンによるタンパク分解消化が阻害されうることを示した。しかし、MBPのシトルリン化ペプチドの1つはC末端にシトルリンを含む(表9および付表13)。ペプチドNIVTPRTPPPSQGK(配列番号8)は残基Q102において脱アミノ化を受けることもある。この脱アミノ化はニワトリMPBタンパク質において過去に報告された。このNまたはQ脱アミノ化されたペプチドを残基R96でシトルリン化されるペプチドと識別するための診断フラグメントイオンとして、1つの中性損失ピークを用いることができる。しかし、NまたはQ脱アミノ化されたペプチドのMS/MSスペクトルはイオン強度が低いために捕捉されないこともある。この場合、高分解度HCDスペクトルが、アルギニン残基がシトルリン化されたペプチドを同定する際に有用である。
ウシニューログラニンは、市販のウシMBPサンプル内で、MBPとともに共精製される不純物として同定された。このウシNRGNタンパク質は、R68非修飾型としてもシトルリン型としても確認された(表14)。R68を含むシトルリン化ペプチドの配列は、CID上のMS/MSスペクトル(データは示さず)および前駆体イオンの正確なm/z値によって確認された。ウシにおいて高度に保持されているヒトNRGNにおけるすべてのシトルリン化可能な部位の位置を確認するために、組換えヒトNRGNをPAD2酵素で処理しかつ未処理および処理サンプルをトリプシン、Lys−CまたはGlu−Cのいずれかで処理した。予想通り、PAD2処理後のヒトNRGNにおいてはヒトNRGNの残基R68もシトルリン化された。組換えタンパク質NRGNについては、処理後に5つの追加的シトルリン化部位が認められた(表9および表15)。これには、内因性タンパク質には認められないがNRGNのクローニング時に導入されている追加的R80アミノ酸が含まれた。これらの結果は、ヒトNRGNの5つのアルギニン残基はすべてインビトロでシトルリン化できることを証明した。ヒトNRGNのシトルリン化ペプチドのMS/MSスペクトルのデータは示さず。
3つの脳タンパク質GFAP、MBPおよびNRGNの内因性シトルリン化部位を、非アルツハイマー対照(n=3)およびアルツハイマー病患者(n=3)から入手した脳組織サンプル中で同定および定量した(臨床的記述については表2)。GFAP、MBP、およびNRGNは、すべてのヒト脳組織サンプル中でそれぞれ最大アミノ酸配列有効範囲64%、54%および44%で同定された。ペプチド配列およびシトルリン化残基は表11に列記する。インビボでは、GFAPは残基R30、R36、R270、R406、およびR416に5つのシトルリン化部位を含んだ一方で、MBPは6つの新規アルギニン残基(R32、R44、R50、R92、R189、およびR196)を含む14の残基がシトルリン化された。シトルリン化アルギニン残基のマッピングより、非AZおよびAZサンプルのいずれでもMBP R92およびR124、GFAP R406および416のインビボシトルリン化が保持されることが証明され、またMBP R32およびGFAP R270はAZサンプルのみで検出された。NRGNの残基R68がシトルリン化されることが認められた(ヒトNRGNの残基R68を含むシトルリン化および非修飾ペプチドの典型的なクロマトグラフィピークは図13を参照)。質量許容差を10ppmとすると、前駆体イオンのm/z値に基づいてシトルリン化ペプチドを非修飾ペプチドのC13ピークから識別することができる。
単一患者の正常脳領域および臨床的脳卒中による梗塞域の半影領域に由来する脳組織サンプルにおいて、数多くの追加的脳タンパク質の内因性シトルリン化が同定された。これらのシトルリン化体のうちいくつかは脳卒中組織においてのみ同定され(チューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、TPPP3、およびNRGN2、アイソフォーム2)、これらのタンパク質の梗塞特異的な修飾が示唆された。
c:T79およびR80はサブクローニング中に組換えタンパク質NRGNに導入される。
c:(-)はこのタンパク質のC末端を示す。
b:前駆体イオンの荷電状態は特に規定しない場合+2である。
d:T97でリン酸化されたペプチドまたはされていないペプチドのいずれも検出された。
d:残基R106においてモノおよびジメチル化されたペプチドが認められた。
e:(-)はこのタンパク質のC末端を示す。
b:ペプチドの質量対電荷比率
c: NA、非修飾ペプチドであるので該当しない。
Claims (60)
- 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者からサンプルを入手すること;
b.1つまたはそれ以上の脳損傷バイオマーカータンパク質の1つまたはそれ以上のアルギニン残基におけるシトルリン化アルギニン残基の非シトルリン化アルギニン残基に対する比率を判定すること;および
c.前記比率を脳損傷を有する患者または脳損傷のない患者と相関させ、これにより前記診断を提供することという段階を含む前記方法。 - 請求項1に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液、末梢血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、糞便および滑液からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液、血漿血清、脳脊髄液(CSF)または尿であることを特徴とする前記方法。
- 請求項3に記載の前記方法であって、前記サンプルがCSFであることを特徴とする前記方法。
- 請求項3に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液であることを特徴とする前記方法。
- 請求項3に記載の前記方法であって、前記サンプルが血清であることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記の判定する段階が多重反応モニタリング質量分析法(MRM−MS)を用いて遂行されることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記の判定する段階がイムノアッセイを用いて遂行されることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記の1つまたはそれ以上の脳損傷バイオマーカータンパク質がニューログラニン(NRGN)、ミエリン塩基性タンパク質、(MBP)、グリア細胞線維性酸性タンパク質(GFAP)、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせであることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がNRGN、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がMBP、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がGFAP、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がPAD、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2;NDRG2アイソフォーム2、アストロタクチン1(ASTN1)、脳血管新生阻害物質3(BAI3)、カルノシンジペプチダーゼ1(CNDP1)、ERMIN、グリア細胞線維性酸性タンパク質(GFAP)、代謝型グルタミン酸受容体3型(GRM3)、ケルヒ様タンパク質32(KLH32)、メラノーマ抗原ファミリーE,2(MAGE2)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ニューレグリン3(NRG3)、ニューログラニン(NRGN)、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質(OMG)、溶質輸送体ファミリー39(亜鉛輸送体)、レティキュロン(RTN1)、およびペプチジルアルギニンデイミナーゼ(1〜4および6型)(PAD)、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つまたはそれ以上のタンパク質であることを特徴とする前記方法。
- 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者より採取したサンプル中の1つまたはそれ以上のシトルリン化ペプチドの対応する非修飾ペプチドに対する比率を質量分析法を用いて判定すること;および
b.前記比率を脳損傷を有する患者または脳損傷のない患者と相関させ、これにより前記診断を提供することという段階を含む前記方法。 - 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者より採取したサンプル中の1つまたはそれ以上のシトルリン化ペプチドの対応する非修飾ペプチドに対する比率を質量分析法を用いて判定すること;および
b.事前に定義する比率の1つとの相関が前記診断をもたらすことを特徴とする、前記比率を脳損傷を有する患者と相関する同じペプチドの前記事前に定義する比率および脳損傷のない患者と相関する同じペプチドの前記事前に定義する比率と比較することという段階を含む前記方法。 - 請求項15または16に記載の前記方法であって、前記の1つまたはそれ以上のペプチドがチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GFAP、GRM3、KLH32、MAGE2、MBP、NRG3、NRGN、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
- 請求項15または16に記載の前記方法であって、前記の1つまたはそれ以上のペプチドがNRGN、MBP、GFAP、PADまたはその組み合わせであることを特徴とする前記方法。
- 請求項15または16に記載の前記方法であって、前記の1つまたはそれ以上のペプチドがNRGN、MBP、GFAP、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせであることを特徴とする前記方法。
- 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者より採取したサンプル中の1つまたはそれ以上の翻訳後修飾ペプチドの対応する非修飾ペプチドに対する比率をMRM−MSを用いて判定すること;および
b.前記比率を脳損傷を有する患者または脳損傷のない患者と相関させ、これにより前記診断を提供することという段階を含む前記方法。 - 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者より採取したサンプル中の1つまたはそれ以上の翻訳後修飾ペプチドの対応する非修飾ペプチドに対する比率をMRM−MSを用いて判定すること;および
b.事前に定義する比率の1つとの相関が前記診断をもたらすことを特徴とする、前記1つまたはそれ以上の比率を脳損傷を有する患者と相関する同じ翻訳後修飾/非修飾ペプチドの前記事前に定義する比率および脳損傷のない患者と相関する同じ翻訳後修飾/非修飾ペプチドの前記事前に定義する比率と比較することという段階を含む前記方法。 - 請求項20または21に記載の前記方法であって、前記翻訳後修飾がシトルリン化、酸化、メチル化、リン酸化、システイン化s−ニトロソ化、s−グルタチオレーションまたはその組み合わせであることを特徴とする前記方法。
- 請求項20または21に記載の前記方法であって、前記の1つまたはそれ以上のペプチドがチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、チューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GFAP、GRM3、KLH32、MAGE2、MBP、NRG3、NRGN、OMG、SLC39A12、RTN1、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
- 請求項20または21に記載の前記方法であって、前記の1つまたはそれ以上のペプチドがNRGN、MBP、GFAP、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせであることを特徴とする前記方法。
- 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者より採取したサンプル中の1つまたはそれ以上のシトルリン化ペプチドの対応する非修飾ペプチドに対する比率を質量分析法を用いて判定すること;
b.前記患者より採取した同じサンプル中の1つまたはそれ以上の翻訳後修飾ペプチドの対応する非修飾ペプチドに対する比率をMRM−MSを用いて判定すること;
c.前記1つまたはそれ以上のシトルリン化:非修飾ペプチド比率を1つまたはそれ以上の翻訳後修飾:非修飾ペプチド比率と比較すること;および
d.前記の比較された比率を脳損傷を有する患者または脳損傷のない患者と相関させ、これにより前記診断を提供することという段階を含む前記方法。 - 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.NRGN、PAD、MBP GFAP、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせのうち1つまたはそれ以上のアルギニン部位のうち1つまたはそれ以上のシトルリン化の度合いを判定すること;および
b.前記シトルリン化の度合いを脳損傷を有する患者または脳損傷のない患者と相関させ、これにより前記診断を提供することという段階を含む前記方法。 - 請求項1〜8、15〜16、20〜22、および25のうちいずれか1つに記載の前記方法であって、前記ペプチドが表5〜9、11〜12、および14〜17に示す1つまたはそれ以上のペプチドであることを特徴とする前記方法。
- 請求項1〜8、15〜16、20〜22、および25のうちいずれか1つに記載の前記方法であって、前記ペプチドがNRGN、MBP、GFAP、およびPAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせの約8から約45アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項1〜8、15〜16、20〜22、および25のうちいずれか1つに記載の前記方法であって、前記ペプチドがチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GFAP、GRM3、KLH32、MAGE2、MBP、NRG3、NRGN、OMG、SLC39A12、RTN1、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせの約8から約45アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記方法。
- 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者から採取したサンプル中の1つまたはそれ以上のシトルリン化脳損傷バイオマーカータンパク質のレベルを測定すること;および
b.事前に定義するレベルの1つとの相関が前記診断をもたらすことを特徴とする、前記1つまたはそれ以上のバイオマーカーの前記レベルを脳損傷を有する患者と相関する同じバイオマーカーの前記事前に定義するレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーの前記事前に定義するレベルと比較することという段階を含む前記方法。 - 請求項30に記載の前記方法であって、前記1つまたはそれ以上の脳損傷バイオマーカータンパク質がチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GFAP、GRM3、KLH32、MAGE2、MBP、NRG3、NRGN、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせであることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記1つまたはそれ以上の脳損傷バイオマーカータンパク質がNRGN、MBP、GFAP、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせであることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がNRGN、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がMBP、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がGFAP、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記脳損傷バイオマーカータンパク質がPAD、そのアイソフォーム、またはその翻訳後修飾型であることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液、末梢血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、糞便および滑液からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液、血漿血清、脳脊髄液(CSF)または尿であることを特徴とする前記方法。
- 請求項38に記載の前記方法であって、前記サンプルがCSFであることを特徴とする前記方法。
- 請求項38に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液であることを特徴とする前記方法。
- 請求項38に記載の前記方法であって、前記サンプルが血清であることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記の判定する段階が質量分析法を用いて遂行されることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記の判定する段階が質量分析法.多重反応モニタリング質量分析法(MRM−MS)を用いて遂行されることを特徴とする前記方法。
- 請求項30に記載の前記方法であって、前記の判定する段階がイムノアッセイを用いて遂行されることを特徴とする前記方法。
- 患者の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記患者からサンプルを採取すること;
b.シトルリン化脳損傷バイオマーカータンパク質のパネルがNRGN、MBP、GFAP、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせを含むことを特徴とする、前記患者から採取した前記サンプル中の前記バイオマーカーのパネルのレベルを質量分析法を用いて測定すること;
c.事前に定義するレベルの1つとの相関が前記診断をもたらすことを特徴とする、前記のバイオマーカーのパネルの前記レベルを脳損傷を有する患者と相関する同じバイオマーカーのパネルの前記事前に定義するレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーのパネルの前記事前に定義するレベルと比較することという段階を含む前記方法。 - 請求項45に記載の前記方法であって、前記バイオマーカーのパネルがチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GRM3、KLH32、MAGE2、NRG3、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つまたはそれ以上のシトルリン化脳損傷バイオマーカータンパク質をさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 患者の脳損傷状態を判定するための方法であって:
a.前記患者からサンプルを採取すること;
b.シトルリン化脳損傷バイオマーカータンパク質のパネルがNRGN、MBP、GFAP、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせを含むことを特徴とする、前記患者から採取した前記サンプル中の前記バイオマーカーのパネルのレベルをSRM−MSを用いて測定すること;および
c.事前に定義するレベルのうちの1つとの相関が前記患者の前記脳損傷状態を判定することを特徴とする、前記バイオマーカーのパネルの前記レベルを脳損傷を有すること、脳損傷がないこと、脳損傷が進行すること、および脳損傷が後退することからなる群から選択される1つまたはそれ以上の脳損傷状態と相関する同じバイオマーカーのパネルの前記の事前に定義するレベルと比較することという段階を含む前記方法。 - 請求項47に記載の前記方法であって、前記バイオマーカーのパネルがチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GRM3、KLH32、MAGE2、NRG3、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つまたはそれ以上のシトルリン化脳損傷バイオマーカータンパク質をさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 患者の脳損傷を診断するための診断キットであって:
a.前記患者から生体サンプルを採取するための基材;および
b.NRGN、MBP、GFAP、PAD、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つまたはそれ以上のヒトシトルリン化脳損傷バイオマーカータンパク質のレベルを測定するための手段を含む前記キット。 - 請求項49に記載のキットであって、前記1つまたはそれ以上のヒトシトルリン化脳損傷バイオマーカータンパク質がチューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、NDRG2アイソフォーム2、ASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GRM3、KLH32、MAGE2、NRG3、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、そのアイソフォーム、その翻訳後修飾型、または前述のいずれかの組み合わせをさらに含むことを特徴とする前記キット。
- 対象の脳損傷を診断するための方法であって:
a.前記対象からサンプルを採取すること;
b.前記対象から採取した前記サンプル中のシトルリン化脳損傷バイオマーカーペプチドに対する自己抗体の存在を検出すること;および
c.シトルリン化脳損傷バイオマーカーペプチドに対する自己抗体の量を脳損傷を有する患者または脳損傷のない患者と相関させ、これにより前記診断を提供することという段階を含む前記方法。 - 請求項51に記載の前記方法であって、前記の検出する段階が:
a.対象から採取した生体サンプルをシトルリン化脳損傷バイオマーカーペプチドと接触させること;および
b.結合の検出が前記対象における前記のシトルリン化脳損傷バイオマーカーペプチド自己抗体の存在を示すことを特徴とする、前記ペプチドの前記ペプチドに対して特異的な自己抗体との結合を検出することを含むことを特徴とする前記方法。 - 請求項52に記載の前記方法であって、前記結合が固相酵素免疫測定法(ELISA)、免疫沈降測定法または免疫ブロット法によって検出されることを特徴とする前記方法。
- 請求項51に記載の前記方法であって、前記シトルリン化脳損傷バイオマーカーペプチドがNRGN、MBP、GFAP、PAD−2、チューブリンβ−4B鎖、チューブリンα−1B鎖、CNPアーゼ、PPIA、セプチン−7、伸長因子1−α2、TPPP、TPPP3、エルミンアイソフォーム2、およびNDRG2アイソフォーム2のうち1つまたはそれ以上であることを特徴とする前記方法。
- 請求項51に記載の前記方法であって、前記シトルリン化脳損傷バイオマーカーペプチドがASTN1、BAI3、CNDP1、ERMIN、GFAP、GRM3、KLH32、MAGE2、MBP、NRG3、NRGN、OMG、SLC39A12、RTN1、MT3、PADのうち1つまたはそれ以上であることを特徴とする前記方法。
- 対象における脳損傷治療法の有効性を評価するための方法であって:
a.脳損傷治療法に先立ち対象におけるcit−NRGN、cit−MBP、およびcit−GFAPに対する自己抗体の初期レベルを確立すること;
b.前記脳損傷治療法の開始後の少なくとも1つの時点においてcit−NRGN、cit−MBP、およびcit−GFAPペプチドを用いてcit−NRGN、cit−MBP、およびcit−GFAPに対する自己抗体のレベルをモニタリングすること;および
c.前記自己抗体のレベルの減少が前記脳損傷治療法の前記有効性を示すことを特徴とする、前記のcit−NRGN、cit−MBP、およびcit−GFAPに対する自己抗体の実測レベルを前記のcit−NRGN、cit−MBP、およびcit−GFAPに対する自己抗体の初期レベルと比較することという段階を含む前記方法。 - 請求項56に記載の前記方法であって、前記のcit−NRGN、cit−MBP、およびGFAPに対する自己抗体のレベルがELISA、免疫沈降測定法、または免疫ブロット法によって測定されることを特徴とする前記方法。
- 対象の脳損傷状態を認定するための方法であって:
a.前記対象に由来する生体サンプル中のcit−NRGN、cit−MBP、およびGFAPに対する自己抗体のレベルを測定すること;および
b.前記測定値を脳損傷状態と相関させることという段階を含む前記方法。 - 請求項58に記載の前記方法であって、前記のcit−NRGN、cit−MBP、およびGFAPに対する自己抗体のレベルがELISA、免疫沈降測定法、または免疫ブロット法によって測定されることを特徴とする前記方法。
- 請求項58に記載の前記方法であって、脳損傷状態が脳損傷のリスク、脳損傷の発症、脳損傷の有無、脳損傷の病期、脳損傷のサブタイプ、前記対象の予後、および脳損傷の治療の有効性からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
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