CN114028579B - 核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs在制备治疗膀胱癌药物中的应用 - Google Patents

核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs在制备治疗膀胱癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了核酸适配体‑药物结合物PTK7‑GEMs在制备治疗膀胱癌药物中的应用。本发明的实验结果发现PTK7‑GEMs通过空间构象与肿瘤细胞膜表面高表达的PTK7蛋白靶向结合，并通过大胞饮入胞方式在胞内磷酸酶作用下释放出吉西他滨，从而在发挥细胞毒性作用，并在三种动物荷瘤模型中显示其显著的抗癌效果。本发明是第一个在膀胱癌组织标本及多种膀胱癌细胞中验证PTK7高表达的研究；同样也是第一个吉西他滨的核酸适配体‑药物结合物（PTK7‑GEMs）通过PTK7蛋白这个靶点高亲和力、特异性将吉西他滨靶向精准运转至肿瘤部位，从而精准发挥抗癌作用的研究。

Description

核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs在制备治疗膀胱癌药物中 的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在世界范围内，膀胱癌的发病率居恶性肿瘤的第十一位，其形成过程复杂，多种基因参与其中，可分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)、肌层浸润性膀胱癌(MIBC)和转移性膀胱癌，其中20～30％的新发病例是MIBC。MIBC的治疗以根治性膀胱切除及盆腔淋巴结清扫为主，术后复发率高达30～45％，5年生存率为45～66％，微转移灶是局部治疗MIBC失败的主要原因之一；约50％新诊断的MIBC患者已发生潜在的局部或远处转移，MIBC仅手术治疗效果有时并不理想，以及部分患者不能通过手术完全切除病灶，临床往往会辅以放、化疗为主的治疗手段。辅助化疗可以使病理分期明确、有转移证据的患者受益于系统化疗，减少局部复发或远处转移复发的可能性。吉西他滨(Gemcitabine，GEM)是一种脱氧胞苷类似物．属嘧啶类，是细胞周期特异性抗肿瘤代谢类药物，主要作用于S期细胞，抑制DNA 合成，并可阻止细胞由Gl期进入S期。
吉西他滨是临床膀胱癌化疗中最常用的一线药物之一，然而，这类基于小分子药物(SMD)的化疗药不能明确区分癌细胞和正常细胞，临床用药常导致严重的副作用和全身毒性。为了解决此类问题，抗体-药物偶联物（ADC）已被批准用于临床治疗，但使用抗体进行药物递送时仍存在挑战，尤其是免疫原性的风险和耐药性的增加事件，此外，合成和化学修饰方面的困难，严格的储存要求也是其主要面对的问题。近年来，靶向癌症治疗尤其是对相应的细胞表面靶点的特异性识别的核酸适配体-药物结合物选择性地将细胞毒性抗癌药物输送到肿瘤组织，由于其易化学修饰，对靶点亲和力高，靶向性强，合成简单，无系统毒副作用，从而受到广泛关注，目前来讲，对于癌症抗肿瘤用药，临床上有效的治疗性适配体-药物结合物的开发远远落后于治疗性抗体-药物，因此，开发膀胱癌靶向性的核酸适配体-吉西他滨结合物对膀胱癌治疗具有重大意义。
蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)是受体酪氨酸激酶假激酶家族中高度保守的成员, PTK7蛋白的特异性核酸适配体序列已知， PTK7在结肠癌、乳腺癌、肺癌和食道癌等多种肿瘤细胞中高表达，并且在肿瘤增殖、侵袭，迁移中扮演重要作用. PTK7特异性DNA适配子SGC8是通过一种新的细胞选择过程(CELL-SELEX)筛选出来的，sgc8能有效地膜表面PTK7高表达细胞特异性结合并内化,且评估SGC8对细胞活力无影响，没有细胞毒性。然而关于PTK7在膀胱癌临床标本及膀胱细胞系中是否高表达，暂未有相关研究，同样关于核酸适配体-药物结合物（APDC）是否在膀胱癌组织中有相关特异性靶点，从而具有特意性且能高效传递药物分子，也暂无相关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是探究核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs对膀胱癌细胞中的细胞毒性及在胞内的智能释放，此外三种动物荷瘤模型验证抗癌效果，旨在对吉西他滨在靶向膀胱癌治疗应用提供一种新的思路。
本发明的技术方案是：
核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
优选方案，所述所述膀胱癌包括非肌层浸润性膀胱癌，肌层浸润性膀胱癌，膀胱原位癌，转移性膀胱癌。
PTK7在膀胱癌组织标本及多种膀胱癌细胞中高表达；PTK7-GEMs通过空间构象与肿瘤细胞膜表面高表达的PTK7蛋白靶向结合，并通过巨胞饮入胞方式在胞内磷酸酶作用下释放出吉西他滨，从而在发挥细胞毒性作用，并在三种动物荷瘤模型中显示其显著的抗癌效果。本研究结果提示PTK7-GEMs能靶向肿瘤细胞，并在胞内智能释放，能更好发挥吉西他滨的抗癌效果。
本文设计并合成了一种基于核酸适配体功能化小分子药物PTK7核酸适配体-吉西他滨(PTK7-GEMs)结合物，其能保持血清稳定性，选择性输送到肿瘤部位，与膀胱癌细胞膜表面PTK7过表达的细胞通过空间构象特异性结合，并通过巨胞饮方式入胞，在胞内磷酸酯酶的作用下智能释放吉西他滨，从而发挥强大的细胞毒性作用。PTK7-GEMs对其靶向的膀胱癌细胞具有优异的识别能力和强大的细胞毒性。在三种不同类型的荷瘤裸鼠体内实验中，PTK7-GEMs均显示出比GEM更强的细胞毒性，更有效、更安全的治疗效果。这些结果可能为利用PTK7-GEMs开发更新颖的膀胱癌靶向治疗药物提供新的思路及策略。
以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
附图说明
图1为PTK7在膀胱癌组织及多种膀胱癌细胞高表达图，其中图1A是qRT-PCR法测定PTK7在不同膀胱癌细胞均相较较于正常膀胱上皮细胞表达水平高的图；图1B是WB法测定PTK7蛋白在不同膀胱癌细胞均相较较于正常膀胱上皮细胞表达水平高的图；图1C是免疫荧光分析显示PTK7在BUC细胞膜上呈强阳性染色图；图1D是GEPIA、STARBASE和GSE数据库显示PTK7在BUC组织中高表达图；图1E是qRT-PCR测定PTK7在20对BUC组织中的转录和翻译水平均显著高于邻近正常尿路上皮组织的图；图1F是Western blot测定PTK7在20对BUC组织中的转录和翻译水平均显著高于邻近正常尿路上皮组织的图；图1G是采用免疫组织化学方法检测148例根治性膀胱切除的BUC临床组织中PTK7的蛋白水平图；图H是免疫组化结果显示PTK7在90/148(60.81%)的BUS和12/85(14.12%)的正常尿路上皮性膀胱上皮组织中呈高表达(P<0.001)。
图2是用PTK7-GEMs及其类似物合成原理图。
图3是用流式细胞术测定PTK7-GEMs与膀胱癌细胞靶向特异性结合图；对于5637细胞，Lib-GEMS-FITC与Cells only相当，未观察到明显荧光强度；PTK7-GEMs-FITC显示出较高的荧光强度，表明Lib-GEMS-FITC 未结合至5637细胞膜表面，然而PTK7-GEMs-FITC能与5637细胞特异性结合，显示较强的靶向性；进一步验证观察结果，设计PTK7-GEMs-FITC与Lib-GEMs-FITC之间的竞争实验， PTK7-GEMs-FITC加入Lib预孵1小时后的5637细胞可仍显示较强的荧光强度，相反，当PTK7-GEMs-FITC加入PTK7预孵1小时后的5637细胞时，没有观察到明显的荧光强度漂移，同样，Lib-GEMs-FITC与PTK7预孵1小时的5637细胞共同孵育时也没有观察到荧光强度。这些结果表明，PTK7-GEMS-FITC可以靶向具有高结合亲和力生物标记物PTK7蛋白的5637细胞。
图4是用高速液相色谱方法验证PTK7-GEMs智能释放图：将PTK7-GEMs置于经典的反应因素中，如低pH5.5缓冲液(肿瘤微环境），10%胎牛血清(细胞培养液)和10×10−3M谷胱甘肽(肿瘤还原微环境)，然后用细胞裂解液通过高效液相色谱分析来研究药物释放机制。在37℃下用5637细胞裂解液(未加任何抑制剂)处理PTK7-GEMs(保留时间：15.7min)时，观察到与时间相关的PTK7-GEMs(保留时间：15.7min)和不同大小适体片段(保留时间分别为：7.5min、10.2min、11.3min，)释放曲线。此外，磷酸酶抑制剂的存在下在2小时内显著阻碍了PTK7-GEMs中GEM的释放。另外值得特别注意的是，在磷酸酶存在下，大约50%的GEM在1小时内被释放，在2小时达到75%，而其他经典的反应因素在2小时内引起的GEM释放较少或为零。
图5是用皮下异种移植瘤模型验证PTK7-GEMs的抗瘤效果；膀胱癌细胞5637异种移植小鼠模型（每组5只小鼠，6组）中可以观察到，PTK7-GEMs具有最佳的抗肿瘤效果（肿瘤体积和肿瘤重量），GEM组和LIB-GEMs也展现了一定的抗肿瘤效果，但效力低于PTK7-GEMs，而PTK7与LIB与PBS相当未展现抗肿瘤效果。
具体实施方式
实验方法：
1、细胞培养
人膀胱癌细胞(BIU87、5637、T24、EJ、RT4、J82、UM-UC-3、TCCSUP)和正常膀胱尿路上皮细胞系Svhuc购自ATCC；5637和Svhuc，分别用RPMI-1640和F12K培养，其余细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养；Dulbecco‘s磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)洗涤细胞。
2、免疫组化
二甲苯中清除石蜡切片，并在乙醇溶液中重新水化。然后，切片在0.01柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中120°C加热3min以修复抗原。用3%过氧化氢溶液浸泡20min阻断内源性过氧化物酶活性，通用封闭血清封闭组织20min。组织切片在室温下用抗PTK7抗体(Abcam；1：300稀释度)孵育2h，然后分别用生物素标记的二抗和链霉亲和素过氧化物酶孵育20min。最后，用3，3-二氨基联苯胺(DAB)进行信号显影。用正常鼠IgG代替一抗，获得阴性对照。以已知的免疫染色阳性玻片作为阳性对照。
3、WB
使用含蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液提取细胞的总蛋白。10％SDS-PAGE电泳分离总蛋白，并将蛋白转移到PVDF膜上。 用0.1％BSA封闭后，将膜与PTK7一抗（＃ab180753，Abcam，Cambridge，UK）在4°C孵育过夜，然后在室温下与二抗（1：10000， LI-COR Biosciences，美国）孵育1小时。 通过增强的LI-COR Odyssey红外成像系统（LI-COR Biosciences，NE，美国）检测蛋白含量。GAPDH为内参。
4、PTK7-GEMs及其类似物合成步骤
碳酸锂(900 Mg)和二甲基吡啶(1350 Mg)首先加入化合物1(吉西他滨269 mg，~1.0 mmol，纯度97%)，再用无水二氯甲烷(100mL)悬浮。部分加入二甲基色胺(~460 mg，1.12mmol)，加入150mL二氯甲烷，稀释后用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。除去溶剂后，残留经闪蒸柱净化，得到吉西他滨化合物2(~4 0 0 mg，收率73%，M+H+=543.3)。将吉西他滨化合物2(264 mg，~0.5 mmol)再悬浮于40mL 二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺(650 mg，5.0 mmol)，在0℃下冷却。加入N-二异丙基氯磷酰胺(596 mg，2.44 mmol)，用薄层层析(TLC)监测反应。当原料消失时，反应溶液用二氯甲烷(~100mL)稀释，然后用饱和碳酸氢钠和饱氯化钠洗涤。所得产品用无水硫酸钠干燥，干液浓缩，残渣经闪蒸柱净化，得到吉西他滨磷酰胺3(~380mg得率80%，分子量为950.03，M+Na+=973.09)白色粉末。确定PTK7-GEMS序列，根据DNA合成仪(Polygen GmbH，Langen，德国)的要求自动进行合成。在自动合成之后，用约40 0μL的28%氢氧化铵在65℃下裂解寡核苷酸胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤 30min。裂解后的DNA与1mL冰冷乙醇和40µL 3M氯化钠混合，在-20℃下沉淀60min，然后在4℃下12000rpm离心20min，得到沉淀物。沉淀物用400µL 0.1M乙酸三乙胺(TEAA)溶解，然后用C18柱进行高效液相色谱纯化。DNA产物经冷冻干燥后，再悬浮在灭菌的超纯水中，然后用脱盐微柱脱盐，储存于灭菌水。
5、靶向性测定
共培养3×105个细胞(5637和Svhuc细胞)，用1000rpm的洗涤缓冲液洗涤3min，然后与200 nM FITC标记的DNA(PTK7-GEMs，Lib-GEMs，Lib)在4°C 200µL的结合缓冲液中孵育1h进行结合分析。在竞争结合实验中，将无标记DNA(PTK7，Lib)与5637细胞预孵育1h，再加入200 nM FITC标记的DNA(PTK7-GEMs，Lib-GEMs)，在4℃下孵育1h，用洗涤缓冲液洗涤3次后，收集样品，再悬浮于200µL结合缓冲液中进行流式细胞仪检测。
6、统计分析
使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析，比较两个实验组时，先进行方差分析，然后进行T检验。 P <0.05被认为具有统计学意义，*表示P <0.05，**表示P <0.01。
实验结果：
1、PTK7在膀胱癌组织及多种膀胱癌细胞高表达
结果表明，PTK7在BUC细胞中高表达，在正常膀胱尿路上皮细胞中低表达(图1A和1B)。免疫荧光分析显示PTK7在BUC细胞膜上呈强阳性染色(图1C)。此外，GEPIA、STARBASE和GSE数据库显示PTK7在BUC组织中高表达(图1D)。此外，qRT-PCR和Western blot显示PTK7在20对BUC组织中的转录和翻译水平均显著高于邻近正常尿路上皮组织(图1E和1F)。此外，采用免疫组织化学方法检测148例根治性膀胱切除的BUC临床组织中PTK7的蛋白水平。免疫组化结果显示，PTK7在90/148(60.81%)的BUS和12/85(14.12%)的正常尿路上皮性膀胱上皮组织中呈高表达(P<0.001，图1G和H)。
、PTK7-GEMs及其类似物合成原理图，如图2.
3、PTK7-GEMs靶向膀胱癌细胞并特异性结合
5637细胞，Lib-GEMs-FITC（PTK7对照序列）荧光强度与Cells only（空白对照）荧光强度相当，无明显荧光结合到细胞膜；相比之下，PTK7-GEMs-FITC显示出较高的荧光强度，表明Lib-GEMs-FITC 未结合至5637细胞膜表面，而PTK7-GEMs-FITC能与5637细胞特异性结合，显示较强的靶向性；为了进一步验证观察结果，设计了PTK7-GEMs-FITC与Lib-GEMs-FITC之间的竞争实验， PTK7-GEMs-FITC加入Lib预孵1小时后的5637细胞可仍显示较强的荧光强度，相反，当PTK7-GEMs-FITC加入PTK7预孵1小时后的5637细胞时，没有观察到明显的荧光强度漂移，同样，Lib-GEMs-FITC与PTK7预孵1小时的5637细胞共同孵育时也没有观察到荧光强度。这些结果表明，PTK7-GEMS-FITC可以靶向具有高结合亲和力生物标记物PTK7蛋白的5637细胞。
、PTK7-GEMs在胞内智能释放
PTK7-GEMs置于经典的反应体系中，如低pH5.5缓冲液(肿瘤微环境），10%胎牛血清(细胞培养液)和10×10−3M谷胱甘肽(肿瘤还原微环境)，然后用细胞裂解液通过高效液相色谱分析来研究药物释放机制。用RIPA裂解(未加任何抑制剂)得到5637 细胞裂解液，在37℃下PTK7-GEMs直接与5637细胞裂解液孵育（0、0.5、1、2、4h），观察到与时间相关的PTK7-GEMs(保留时间：15.7min)和不同大小适体片段(保留时间分别为：7.5min、10.2min、11.3min，)释放曲线。此外，磷酸酶抑制剂的存在下在4小时内显著阻碍了PTK7-GEMs中GEM的释放。另外值得特别注意的是，在磷酸酶存在下，大约50%的GEM在1小时内被释放，在2小时达到约75%，而其他经典的反应因素在2小时内引起的GEM释放较少或为零。
、PTK7-GEMs在荷瘤皮下肿瘤模型中显示显著的抗癌效果
从膀胱癌细胞5637异种移植小鼠模型（每组6只小鼠，6组）中可以观察到，而PTK7组、LIB组与PBS组相当无抗肿瘤效果，GEM组和LIB-GEMs组展现了一定的抗肿瘤效果，PTK7-GEMs具有最佳的抗肿瘤效果（肿瘤体积和肿瘤重量）。
结论：
1、PTK7在膀胱癌组织及多种膀胱癌细胞高表达。
2、通过科学设计合成PTK7-GEMs及其类似物。
3、PTK7-GEMs通过PTK7靶点靶向膀胱肿瘤部位并特异性结合。
4、PTK7-GEMs在胞内智能释放。
5、PTK7-GEMs在荷瘤皮下肿瘤模型中显示显著的抗癌效果。
本发明的实验结果发现PTK7-GEMs通过空间构象与肿瘤细胞膜表面高表达的PTK7蛋白靶向结合，并通过巨胞饮方式入胞在胞内磷酸酶作用下释放出吉西他滨，从而在发挥细胞毒性作用，并动物荷瘤模型中显示其显著的抗癌效果。本发明是第一个在膀胱癌组织标本及多种膀胱癌细胞中验证PTK7高表达的研究；同样也是第一个吉西他滨的核酸适配体-药物结合物（PTK7-GEMs）通过PTK7蛋白这个靶点高亲和力、特异性将吉西他滨靶向精准运转至肿瘤部位，从而精准发挥抗癌作用的研究。

Claims (2)

1.核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs在制备治疗膀胱癌药物中的应用，所述PTK7-GEMs的制备方法为：碳酸锂900 mg和二甲基吡啶1350 mg加入化合物1吉西他滨269 mg，1.0mmol，纯度97%，再用无水二氯甲烷100mL悬浮；加入二甲基色胺460 mg，1.12 mmol，加入150mL二氯甲烷，稀释后用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥；除去溶剂后，残留经闪蒸柱净化，得到吉西他滨化合物2，4 0 0 mg；将吉西他滨化合物2，264 mg，0.5 mmol，再悬浮于40mL 二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺650 mg，5.0 mmol，在0℃下冷却；加入N-二异丙基氯磷酰胺596 mg，2.44 mmol，用薄层层析监测反应；当原料消失时，反应溶液用二氯甲烷100mL稀释，然后用饱和碳酸氢钠和饱氯化钠洗涤；所得产品用无水硫酸钠干燥，干液浓缩，残渣经闪蒸柱净化，得到吉西他滨磷酰胺3白色粉末，380mg，分子量为950.03。
2.根据权利要求1所述应用，其特征是，所述膀胱癌选自非肌层浸润性膀胱癌，肌层浸润性膀胱癌，膀胱原位癌，转移性膀胱癌。
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