CN115475252A - 一种基于非天然核酸适体的protac的制备方法及其在三阴性乳腺癌治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于非天然核酸筛选和乳腺癌靶向治疗领域，尤其涉及一种基于非天然核酸适体的PROTAC（PROteolysis‑TArgeting Chimera）的制备方法及其在三阴性乳腺癌治疗中的应用。本发明首先利用体外筛选技术鉴定出能够结合c‑Myc/Max二聚体的苏糖核酸(TNA)适体，连接天然结合c‑Myc的E box DNA序列，形成二价亲和分子，进一步连接泛素连接酶E3的配体，构建TNA适体‑E box‑E3配体复合物（TEP），该复合物特异性诱导c‑Myc降解。当与palbociclib联用时，TEP高效抑制了三阴性乳腺癌小鼠中肿瘤的生长。与现有的小分子抑制剂比较，本发明中的基于非天然核酸的PROTAC分子亲和性更高，在使用剂量更小的情况下，仍具有高效的抗肿瘤效果。TNA的引入增强了复合物的亲和力、生物稳定性和靶向性，更适用于体内应用，为TNBC的靶向治疗提供了新的策略。

Description

一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法及其在三阴性 乳腺癌治疗中的应用
技术领域
本发明属于非天然核酸筛选和乳腺癌靶向治疗领域，尤其涉及一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法及其在三阴性乳腺癌治疗中的应用。
背景技术
乳腺癌是发病率第一，死亡率第二的恶性肿瘤。其中，三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)的侵袭性强、复发率高、临床预后差。因缺少可利用的有效靶点，治疗药物的选择十分有限。许多在其他乳腺癌亚型中具有较好疗效的靶向药物分子，在TNBC的治疗中响应率较低。
近年来，越来越多的研究表明，c-Myc是TNBC潜在的治疗靶点。c-Myc是一类癌基因，在超过50％的人类癌症中高表达。c-Myc与其相关因子X(Max)共同作用结合DNA增强子原件结合DNA增强子原件(E box，5’-CAC[G/A]TG-3’)，调节下游参与细胞的增殖、分化、凋亡以及血管生成的靶基因的转录。在TNBC中，c-Myc的高表达与TNBC预后差相关，因此，靶向抑制c-Myc可能为TNBC提供一种潜在的治疗策略。
目前报道的靶向c-Myc抑制剂主要为小分子抑制剂，其作用机制是阻断c-Myc与Max的相互作用，从而阻断转录功能。然而，c-Myc是一类天然的无序蛋白，缺乏小分子可以利用的识别位点，寻找直接作用于c-Myc的小分子抑制剂是国际上药物研发的难点，目前已经报道的c-Myc的小分子抑制剂活性普遍较低，特异性差，毒性高，进入临床应用较为困难。核酸适体是一类具有靶向功能的生物大分子，可以利用的结合位点更多，经过化学修饰的非天然核酸具备区别于天然核酸的化学结构，可以增强核酸分子的生物稳定性，是新型的可以用于疾病的诊断和治疗的分子工具。
核酸适体与靶标结合通常是一一对应的关系，为了实现适体在体内与靶标形成多次转换对应的关系，可以借鉴蛋白降解靶向嵌合体(PROteolysis TArgeting Chimera,PROTAC)，在适体的序列末端通过化学手段连接一个泛素连接酶的配体，在细胞内招募泛素连接酶，对临近的蛋白进行泛素化标记，从而诱导蛋白质降解。在这个过程中，由于核酸适体-泛素连接酶配体复合物不会被降解，所以一个核酸适体-泛素连接酶配体复合物可以诱导多个蛋白的降解。
综上所述，利用体外筛选技术分离可以靶向c-Myc/Max二聚体的TNA适体，并在筛选文库中引入E box DNA序列，竞争性抑制c-Myc/Max复合物与靶基因的结合，同时利用内源蛋白酶体降解途径，诱导c-Myc/Max二聚体降解，实现抑制活性与诱导降解的双功能，在体内体外抑制TNBC增殖，为TNBC的治疗提供新的策略。
发明内容
本发明的目的是为了解决背景技术中提及的c-Myc小分子抑制剂的特异性差，毒性高的问题，提供一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法及其在三阴性乳腺癌治疗中的应用。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于非天然核酸适体的PROTAC配体复合物，其包括结合c-Myc/Max二聚体的非天然核酸适体和天然结合c-Myc/Max的E box DNA序列，同时在非天然核酸适体–E box的末端连接一个E3泛素连接酶配体。
上述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC配体复合物，其所述的非天然核酸包括苏糖核酸TNA或氟代阿拉伯糖核酸FANA或锁核酸LNA。
上述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC配体复合物，其所述E3泛素连接酶配体包括泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、阿伐度胺或吲地磺胺。
一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其包括以下步骤：体外筛选非天然核酸适体；将非天然核酸适体进行高通量测序，挑选拷贝数高的序列进行亲和性测试；连接E box DNA；将E3泛素连接酶配体连接到非天然核酸适体-E box的末端，即制得降解c-Myc的非天然核酸PROTAC。
上述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其体外筛选非天然核酸适体包括以下步骤：
1)以生物素标记的DNA随机文库为模板，体外“转录”合成非天然核酸文库，通过链霉亲和素树脂分离，乙醇沉淀法收集非天然核酸文库；
2)体外构建c-Myc/Max二聚体，与非天然核酸文库孵育，非天然核酸文库与c-Myc/Max的摩尔比为第一轮1:1，第二轮2:1，第三轮10:1，通过毛细管电泳进行分离，毛细管进样体积为11nL，回收与c-Myc/Max结合的组分；
3)以回收到的组分为模板，使用非天然核酸聚合酶将非天然核酸“逆转录”为DNA序列，用于下一轮筛选。
上述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其亲和性测试包括以下步骤：
1)利用带有E box增强子序列的引物，以DNA序列为模板，在非天然核酸聚合酶催化下，“转录”合成带有E box序列的非天然核酸序列；
2)通过链霉亲和素柱分离非天然核酸-E box链；
3)将带有E box序列的DNA作为互补链，与非天然核酸-E box链进行退火，形成杂交双链；
4)将上述的杂交双链与c-Myc/Max二聚体孵育30min，利用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析混合物，在80V恒压及冰浴条件下，电泳1h，分析亲和性强弱。
上述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其将E3泛素连接酶配体连接到非天然核酸适体的E box的末端的具体方法为：利用酰胺化反应将E3泛素连接酶配体连接到非天然核酸适体的E box的末端，形成TEP分子；
一种基于非天然核酸适体的PROTAC的应用，其所述非天然核酸PROTAC应用于抑制三阴性乳腺癌增殖。
上述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的应用，其利用阳离子脂质体纳米粒子包裹CDK4/6抑制剂或TEP，进行药物联用。
有效效果：
本发明的基于非天然核酸适体的c-Myc抑制剂利用非天然核酸作为分子工具，结合PRORAC技术，实现对c-Myc的特异性降解，与现有的小分子抑制剂比较，本发明中的非天然核酸抑制剂的亲和性更高，使用剂量更小，生物毒性更低。
附图说明
图1是TNA适体E box与E3泛素连接酶配体结合的原理概括说明图。
图2是筛选后的TNA适体E box结合c-Myc/Max的示意图；其中，A.TNA与DNA结构单元。B.筛选过程示意图。凝胶电泳迁移方法测试TNA aptamer-E box对c-Myc/Max的亲和力的胶图和亲和力计算图，T1E(C，D)，T2E(E，F)，T3E(G，H)和E box(I，J)。
图3是E box和筛选后富集程度最高的三条序列的二级结构预测示意图。
图4是TNA适体E box结合内源性c-Myc的示意图。其中，A和B.Pull down实验证明三条TNA aptamer-E box可以结合三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468和Hs578T中的c-Myc/Max的示意图；C.共聚焦荧光显微镜对转染了TNA aptamer-E box的Hs578T细胞进行成像的成像图。
图5是TEP分子在细胞内降解c-Myc的示意图。其中，A.pomalidominde-COOH连接TE的示意图。B.TEP在细胞内降解c-Myc，而E box-pomalidominde(EP)和对照序列DNA-pomalidominde(DP)不能降解c-Myc；C.TEP降解c-Myc的浓度梯度。D.TEP降解c-Myc的时间梯度图。E.TEP处理Hs578T细胞后，免疫荧光表征细胞内的c-Myc的表达水平的示意图。F.小分子MYCi975降解c-Myc的浓度梯度图。G.100nM的TE，100nM的TEP和100nM TEP与150nM的蛋白酶体抑制剂MG132共同处理4T1细胞后的c-Myc水平。
图6是TEP与帕博西布的协同作用图。A，B和C.100nM的TEP和不同浓度的帕博西布的协同作用图，其中，当帕博西布为5mM时协同效应最为明显。
图7是E-box单链序列连接泊马度胺前后的质谱结果图。
图8是TEP分子与相同序列的DNA的序列在10％人血清中的稳定性实验的示意图；
图9是脂质体纳米粒子包裹TEP或帕博西部的粒径分布测量图，琼脂糖凝胶电泳验证脂质体与TEP结合图。
图10是TEP与帕博西布联合治疗。A，对荷瘤小鼠进行间隔给药示意图。B，脂质体搭载核酸后，通过小鼠尾静脉注射，在体内可以靶向4T1肿瘤部位。C，不同给药组小鼠肿瘤的大小对比照片。D，不同给药组小鼠肿瘤的生长曲线。E，不同给药组小鼠肿瘤的重量。F，各组肿瘤的苏木精&伊红(H&E)染色图，Ki67和c-Myc的免疫组化的代表性图片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。
实施例1
如图1、图2所示，本发明提供了一种基于非天然核酸适体的PROTAC配体复合物，包括结合c-Myc/Max二聚体的非天然核酸适体和天然结合c-Myc/Max的E box DNA序列，同时在非天然核酸适体–E box的末端连接一个E3泛素连接酶配体。非天然核酸包括苏糖核酸TNA或氟代阿拉伯糖核酸FANA或锁核酸LNA等非天然核酸。E3泛素连接酶配体包括泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、阿伐度胺或吲地磺胺。核酸适体是一类具有靶向功能的生物大分子，可以利用的结合位点更多，经过化学修饰的非天然核酸适体具备区别于天然核酸的化学结构，可以增强核酸分子的生物稳定性。同时，在E box的末端连接泛素连接酶的配体泊马度胺pomalidomide，利用内源蛋白酶体降解途径，诱导c-Myc/Max二聚体循环降解，实现抑制活性与诱导降解的双功能，对TNBC的治疗效果更佳。
一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、体外筛选非天然核酸适体，包括以下步骤：
1)制备非天然核酸文库，参照表1、图2所示，以生物素标记的DNA随机文库为模板，外源添加FAM标记的DNA引物P1，在Kod-RI DNA聚合酶的催化下体外“转录”合成非天然核酸TNA文库，利用链霉素亲和柱分离法分离出TNA文库单链。体外构建c-Myc/Max二聚体，在模拟的生理条件下(136mM NaCl,2.6mM KCl,4mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,2mM MgCl2,pH 7.4)与TNA文库孵育。TNA文库与c-Myc/Max的摩尔比为：第一轮1:1，第二轮2:1，第三轮10:1；
2)体外构建c-Myc/Max二聚体，与TNA文库孵育，TNA文库与c-Myc/Max的摩尔比为第一轮1:1，第二轮2:1，第三轮10:1，通过毛细管电泳进行分离，毛细管内径50μm，总长度60cm，毛细管进样体积为11nL，回收与c-Myc/Max结合的组分；
3)以回收到的组分为模板，使用Bst DNA聚合酶将TNA序列“逆转录”为相应的DNA序列；进行PCR扩增,分离单链后，回收DNA模板，再进行“转录”反应制备TNA文库，产生可用于下一轮筛选的TNA文库；
循环进行“转录-链分离-孵育-靶标结合组分分离-逆转录-扩增-链分离”的步骤。
上述的实验步骤循环进行3轮。
步骤二、筛选后的非天然核酸适体进行高通量测序，挑选拷贝数高的序列进行亲和性测试，连接E box DNA，包括以下步骤：
1)利用Cy5.5标记的引物P3，引物部分带有E box增强子序列，以生物素标记的DNA序列为模板，在Kod-RI催化下，“转录”合成非天然核酸序列；将富集后的DNA文库进行高通量测序，选择其中拷贝数较高的序列进行活性测试，并进行序列统计分析。拷贝数最高的三条序列的二级结构如图2B所示；
2)通过链霉亲和素柱分离Cy5.5-E box-TNA；
3)使用一段22nt的带有E box序列的DNA作为互补链，将Cy5.5标记的E box-TNA与含有E box序列的22nt的DNA退火，形成TNA-E box(TE)分子杂交双链；
4)将c-Myc和Max按摩尔比1:1孵育30min，将100nM的Cy5.5-TE与不同浓度的c-Myc/Max在37℃下培养1h，孵育缓冲液为20mM Tris,50mM NaCl,2mM MgCl2,0.1％Tween-20，pH 7.5，总体积10μL。孵育后加入5μL 50％的甘油，通过8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，在80V恒压、冰浴条件下，电泳1h，电泳后使用Odyssey CLx成像，使用自带软件Image J software分析定量。参照表2、图3所示，对结合了c-Myc/Max二聚体的Cy5.5-Ebox-TNA进行定量，分析亲和性强弱。
步骤三、将E3泛素连接酶配体连接到TNA-E box的末端，即制得降解c-Myc的非天然核酸PROTAC，包括以下步骤：
1)利用酰胺化反应将E3泛素连接酶配体泊马度胺连接到TNA-E Box的末端，形成TEP分子；
2)将TEP分子转染到TNBC细胞内部。
参照图4-图8，本实施例测试结果如下：
(1)TE分析结合内源性c-Myc测试。
使用1％的BSA处理链霉亲和素磁珠，室温下震荡1h。100pmole Biotin-TE分子与100μL磁珠孵育1h，孵育缓冲液：20mM Tris,1M NaCl,1mM EDTA,pH 7.5。高速离心收集磁珠，清洗一次，缓冲液：20mM Tris,10mM NaCl,0.1％Tween-20,pH 7.5。使用非变性的细胞裂解液裂解细胞Hs578T和MDA-MB-468细胞。200μg的全细胞裂解液与磁珠在4℃下孵育过夜，使用一条随机序列作为对照，孵育后高速离心收集磁珠，使用清洗缓冲液重悬磁珠，摇晃5分钟，重复3次，加入30μL 1×蛋白上样缓冲液，99℃下煮10min，最后用于Western Blot分析。
(2)荧光共定位分析
在35-mm玻璃皿中种植1×106个Hs578T细胞，培养过夜。FAM标记的TE分子通过Lipofectamine3000转染到1×106个Hs578T细胞内。步骤如下：50pmole FAM-TE溶解在25μLOpti-MEM中，5μL的Lipofectamine3000溶解在25μL Opti-MEM中，混合后室温下孵育15min，加入到1mL Opti-MEM中，与Hs578T细胞孵育6h后，PBS洗一次，用4％的多聚甲醛固定细胞，室温下避光固定30min。使用Hoechst 33258染色30min，PBS洗两次，使用Olympus激光共聚焦荧光显微镜对细胞成像。
(3)TEP在细胞内降解c-Myc
1)DNA-pomalidomide的制备。利用酰胺化反应将E3泛素连接酶配体连接到TNA-EBox的末端，形成TEP分子；
1mg COOH标记的pomalidomide在激活缓冲液(15mM EDC，15mM NHS，100mM MES，500mM NaCl,pH 6.0)中震荡30min，温度为25℃。加入60μL 100nmole的NH2-DNA和40μL 1MNaHCO3 pH 8.5，25℃下反应2h。反应后产物用乙醇沉淀收集，HPLC纯化。
2)经过退火杂交形成TEP；
3)将TEP分子转染到TNBC细胞内部。
(4)免疫荧光
在35-mm玻璃皿中种植1×106个Hs578T细胞，培养过夜。TEP复合物通过Lipofectamine3000转染到Hs578T细胞内，步骤同上。转染后换成含10％FBS，1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，继续培养24h。PBS洗一次，用4％的多聚甲醛固定细胞，室温下避光固定30min。0.1％Triton-X 100对细胞处理10min，用含1％BSA的PBST室温下封闭1h。使用c-Myc一抗(1:100,ab32072)4℃下过夜孵育，细胞用PBST清洗两次，使用Alex555标记的二抗(1:200,ab150078)室温下避光孵育1h。PBST清洗两次，Hoechst 33258室温下染色30min，PBST清洗两次。使用Olympus激光共聚焦荧光显微镜对细胞成像。
(5)CCK8细胞活力测试
在6孔板中种植1×106个Hs578T细胞，培养过夜。转染TEP浓度为100nM，转染步骤如(4)所示，转染后继续培养12h，以5×103的密度转接到96孔板中，培养12h。使用不同浓度的帕博西布(1,5and 10μM)处理细胞24h。使用CCK8试剂盒追踪监测细胞活力，1h后，测量450nm的吸收值，计算每个孔的细胞活力。
本发明应用于抑制三阴性乳腺癌增殖，利用阳离子脂质体纳米粒子包裹CDK4/6抑制剂或TEP，进行药物联用。参照图9所示，脂质体纳米粒子包裹TEP和帕博西布粒径分布测量图。包裹TEP和帕博西布的阳离子脂质体纳米粒子的制备步骤如下：
(6)采用薄膜水合法制备阳离子脂质体
使用电子分析天平准确称取10mg 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(chloride salt)(DOTAP)、10mg 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(DOPE)、25mg Soybean soft phospholipid(S100)、12.5mg cholesterol、2.5mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000-cRGD(DSPE-PEG2000-cRGD)和1.5mg帕博西布，溶解在10ml氯仿-甲醇(5:1，v/v)溶液中，并置于25mL茄形瓶中，通过旋转蒸发器在40℃水浴中减压蒸发30min至所有有机溶剂蒸发，且在瓶壁上沉积了一层磷脂薄膜，随后在真空干燥箱中放置过夜，以确保完全除去残留的溶剂。将脂膜溶解在5mL超纯水中，60℃下水化1小时。用超声探头在400W的脉冲(脉冲1s，脉冲1s)下超声10分钟，超声后使用0.22μm滤膜过滤，得到脂质体纳米溶液，储存在4℃冰箱以备使用。
(7)体内靶向以及抑制肿瘤生长实验
向体重为15g左右的雌性Balb/c小鼠背部皮下注射2×107个4T1肿瘤细胞，待体积达到200mm3左右时，尾静脉注射搭载了Cy5-TEP的脂质体，Cy5-TEP约为2nmole。2小时后对其体表进行成像。
向体重为15g左右的雌性Balb/c小鼠背部皮下注射2×107个4T1肿瘤细胞，待一周后，体积达到100mm3左右时开始间隔给药，采用肿瘤原位注射的方式，TEP(6mg/kg),帕博西布(10mg/kg)，联合组TEP(6mg/kg)+帕博西布(10mg/kg)，一共给药四次，每两天测量肿瘤大小，采用V＝1/2ab2的公式计算肿瘤体积。移植肿瘤后第17天将肿瘤剥出，拍照，称量。
本发明首先利用体外筛选技术鉴定出能够结合c-Myc/Max二聚体的苏糖核酸(TNA)适体，连接天然结合c-Myc的E box序列，形成二价亲和分子，进一步借鉴靶向PROTAC，连接泛素连接酶E3的配体，构建TNA适体-E box-E3配体复合物，特异性诱导c-Myc降解。该技术方案可以应用于治疗三阴性乳腺癌药品，利用脂质体纳米粒子同时包裹CDK4/6抑制剂和基于非天然核酸适体的c-Myc抑制剂，进行药物联用。与现有的小分子抑制剂比较，本发明中的非天然核酸抑制剂的亲和性更高，使用剂量更小。苏糖核酸的引入能够增强复合物的生物稳定性，更适用于体内应用，为TNBC的靶向治疗提供新的策略。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于非天然核酸适体的PROTAC复合物分子，其特征在于：包括结合c-Myc/Max二聚体的非天然核酸适体、天然结合c-Myc/Max的E box DNA 序列、以及一个招募E3泛素连接酶的小分子配体。
2.根据权利要求1所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC复合物，其特征在于：所述的非天然核酸为苏糖核酸TNA。
3.根据权利要求1所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC复合物，其特征在于：所述E3泛素连接酶配体为泊马度胺Pomalidominde。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：体外筛选非天然核酸适体；对富集文库进行高通量测序，挑选拷贝数高的序列进行亲和性测试；连接非天然核酸适体、E box DNA和E3泛素连接酶配体，即制得靶向降解c-Myc的、基于非天然核酸的PROTAC。
5.根据权利要求4所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其特征在于，体外筛选非天然核酸适体包括以下步骤：
1)以生物素标记的DNA随机文库为模板，体外“转录”合成非天然核酸文库，通过链霉亲和素树脂分离，乙醇沉淀法收集非天然核酸文库；
2)体外构建c-Myc/Max二聚体，与非天然核酸文库孵育，非天然核酸文库与c-Myc/Max的摩尔比为第一轮1:1，第二轮2:1，第三轮10:1，通过毛细管电泳进行分离，毛细管进样体积为11 nL，回收与c-Myc/Max结合的非天然核酸组分；
3)以回收到的组分为模板，使用非天然核酸聚合酶将非天然核酸“逆转录”为DNA序列，用于下一轮筛选。
6.根据权利要求4所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其特征在于，亲和性测试包括以下步骤：
1)利用带有E box增强子序列的引物，以DNA序列为模板，在非天然核酸聚合酶催化下，“转录”合成带有E box序列的非天然核酸序列；
2)通过链霉亲和素柱分离非天然核酸-E box链；
3)将带有E box序列的DNA作为互补链，与非天然核酸-E box链进行退火，形成杂交双链；
4)将上述的杂交双链与c-Myc/Max二聚体孵育30 min，利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析混合物，在80 V恒压及冰浴条件下，电泳1 h，分析亲和性强弱。
7.根据权利要求4所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法，其特征在于：将E3泛素连接酶配体连接到非天然核酸适体的E box的末端的具体方法为：利用酰胺化反应将E3泛素连接酶配体连接到非天然核酸适体的E Box的末端，形成非天然核酸-E box-E3泛素连接酶配体分子。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的应用，其特征在于：所述非天然核酸PROTAC应用于抑制三阴性乳腺癌增殖。
9.根据权利要求8所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的应用，其特征在于：利用阳离子脂质体纳米粒子包裹CDK4/6抑制剂或TEP，进行药物联用。
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