JP2019055966A - 最小毒性プロドラッグ - Google Patents
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Abstract
Description
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPはオリゴペプチド部分であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、ここでそれらのOP部分の1つは直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してDに結合している。或いは、複数のOP部分はそれぞれが独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してDに結合する。複数のOP部分の一部が独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してDに結合し、且つ複数のOP部分の一部がそれら自体それぞれ独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、それらのOP部分の1つが直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してDに結合している中間立体配座が含まれる)
又はその薬学的に許容可能な塩を有する。
(i)薬物を入手するステップ;
(ii)薬物を、キャッピングされたオリゴペプチド部分に結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ;又は、それに代えて、
(ii’)薬物をオリゴペプチド部分に結合させて、次にそのオリゴペプチド部分にキャッピング基を結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ;及び
(iii)ステップ(ii)又は(ii’)で得られたプロドラッグを精製するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;詳細には、OPは、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;さらにより詳細には、OPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し、及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有し;及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物DをGP−、AP−又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりジペプチド−薬物中間体プロドラッグとしてGP−D、AP−D又はKP−Dを得るステップ;
(iii)薬物D及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)薬物D及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、カルボキシ末端プロリンを含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり、前記プロリンは、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Dに結合し;詳細には、OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;より詳細には、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;さらにより詳細には、OPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有し;及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)薬物D及びプロドラッグ[Cx−OP]y−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)薬物D及びプロドラッグ[Cx−OP]y−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、カルボキシ末端プロリンを含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり、前記プロリンは、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Dに結合し;詳細には、OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;より詳細には、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;さらにより詳細には、OPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり;
前記方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dをインビトロ培養細胞と37℃で5時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;より詳細には、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;さらにより詳細には、OPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有し;及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物DをGP−、AP−又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりGP−D、AP−D又はKP−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたプロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、カルボキシ末端プロリンを含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり、前記プロリンは、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Dに結合し;詳細には、OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;より詳細には、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;さらにより詳細には、OPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法を含み;
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dを単離CD10及び/又はTOPペプチダーゼと、及び単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間〜24時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPはオリゴペプチド部分であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、ここでそれらのOP部分の1つは直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してDに結合している。換言すれば、複数のOP部分は共に結合することにより、OP部分の1つを介して直線状又は分枝状構造でDに結合した直線状又は分枝状構造を形成し得る。或いは、複数のOP部分はそれぞれ独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してDに結合する。複数のOP部分の一部がそれぞれ独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してDに結合し、且つ複数のOP部分の一部がそれら自体独立に上記に記載したとおり互いに結合することにより、それらのOP部分の1つが直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してDに結合した直線状又は分枝状構造を形成する中間立体配座が含まれる)
又はその薬学的に許容可能な塩を有する。
(i)薬物を入手するステップ;
(ii)薬物を、ホスホノアセチルでキャッピングされたオリゴペプチド部分に結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ;又は、それに代えて、
(ii’)薬物をオリゴペプチド部分に結合させて、次にそのオリゴペプチド部分にホスホノアセチルキャッピング基を結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ;及び
(iii)ステップ(ii)又は(ii’)で得られたプロドラッグを精製するステップ。
CD10は、疎水性アミノ酸のアミノ側で小さいペプチドを切断する中性エンドペプチターゼ/亜鉛依存性細胞表面メタロペプチダーゼである。B細胞並びに肺、結腸及び腎臓の上皮細胞などの正常細胞に存在することに加えて、CD10は多くの腫瘍型(Ravel et al.2008,Clin Cancer Res 14,1258−1265)、例えば、膵癌(Notohara et al.2000,Am J Surg Pathol 24,1361−1371)、肝細胞癌(Karabork et al.2010,Pathol Res Pract 206,572−577)、メラノーマ(Velazquez et al.2007,J Transl Med 5,2)、前立腺癌(Song et al.2004,Prostate 58,394−405)、肺小細胞癌(Shipp et al.1991,Proc Natl Acad Sci USA 88,10662−10666)、腎癌、子宮内膜肉腫及び横紋筋肉腫(Chu et al.2000,Am J Clin Pathol 113,374−382)に存在する。CD10は、ほぼ半数の軟部組織肉腫で発現する(組織球腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(malignant peripheral nerve sheat tumors);Deniz et al.2012, Pathol Res Pract 208,281−285)。さらに興味深いことには、FAPの間質分布と同様に、CD10は、結腸直腸癌(Hirano et al.2012,Pathol Int 62,600−611)、乳癌(Desmedt et al.2012,Clin Cancer Res 18,1004−1014;Marketsov et al.20,84−89)、膵内分泌腫瘍(Deschamps et al.2006,Hum Path 37,802−808)、胃癌(Huang et al.2005,Jpn J Clin Oncol 35,245−250)及び基底細胞癌(Yada et al.2004,Am J Dermatopathol 26,463−473)の間質細胞に見られる。
DPIVは広域の活性を有するジペプチジルプロリルペプチダーゼであり、多数の生理的基質を包含する。DPIVは多数の臓器の上皮細胞で発現する。DPIVは、胸腺、脾臓及びリンパ節並びにリンパ球で発現する。DPIVは実験条件下でコラーゲン及びフィブロネクチンに結合する(Loster et al.1995,Biochem Biophys Res Commun 217,341)。DPIVは、腫瘍性T細胞悪性腫瘍(Dang et al.2002,Histol Histopathol 17,1213−1226)並びに種々の腺癌、例えば、肝細胞癌(Stecca et al.1997,J Hepatol 27,997−945)、甲状腺癌(Tanaka et al.1995,Int J Cancer 64,326−331)、髄膜腫(Yu et al.2010,FEBS Journal 277,1126−1144;Stremenoova et al.2010,Int J Oncology 36,351−358)、食道腺癌(Goscinski et al.2008,APMIS 116,823−831)、肺腺癌(Asada et al.1993,Histopathology 23,265−270)及び骨・軟部組織腫瘍(Dohi et al.2009,Histopathology 4,432−440)において上方制御される。DPIVはヒト結腸直腸癌及びヒト中皮腫の癌幹細胞で発現する(Pang et al.2010,Cell Stem Cell 6,603−615;Yamazaki et al.2012,Biochem Biophys Res Commun 419,529−536)。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は、直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサー基などのスペーサー基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法が含まれ;及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物DをGP−、AP−又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりジペプチド−薬物中間体プロドラッグとしてGP−D、AP−D又はKP−Dを得るステップ;
(iii)薬物D及び前記ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)薬物D及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;詳細にはOPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサー基などのスペーサー基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法を提供し;及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物DをGP−、AP−又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりジペプチド−薬物中間体プロドラッグとしてGP−D、AP−D又はKP−Dを得るステップ;
(iii)薬物D及び前記ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)薬物D及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;詳細にはOPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり;
前記方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)薬物D及びプロドラッグ[Cx−OP]y−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)薬物D及びプロドラッグ[Cx−OP]y−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;詳細にはOPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり;
前記方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dをインビトロ培養細胞と37℃で5時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;詳細にはOPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり;
前記方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物DをGP−、AP−又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりGP−D、AP−D又はKP−Dジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ;
(iii)ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−Dを単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間接触させるステップ;
(iv)ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、配列ALGP(配列番号1)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドであり;詳細にはOPはテトラペプチドALGP(配列番号1)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法が含まれ;
前記方法は、以下のステップを含む:
(i)薬物Dを入手するステップ;
(ii)薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dを単離CD10及び/又はTOPペプチダーゼと、及び単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間〜24時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ。
1.Fmoc−ペプチド−OHの合成
1.1.Fmoc−ALAL−OHの合成
Fmoc−Leu−Wang樹脂(5g、1当量)をジメチルホルムアミド(20mL)中で30分間膨潤させた。フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基を、ジメチルホルムアミド(16mL)中ピペリジン(4mL)で3分間処理することにより除去し、次に樹脂をろ過し、続いて同じ処理を3分間及び7分間行った。樹脂をジメチルホルムアミド(20mL)で3回洗浄した。Fmoc−Ala−OH(2当量)及び2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(2当量)をジメチルホルムアミド(20mL)中に可溶化し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(4当量)を添加した。混合物を6分間予備的に活性化させ、樹脂に添加した。次に樹脂を60分間振盪し、ジメチルホルムアミド(20mL)で3回洗浄した。Fmoc基を、ジメチルホルムアミド(16mL)中ピペリジン(4mL)で3分間処理することにより除去し、次に樹脂をろ過した。同じ処理を2回、3分間及び7分間繰り返した。樹脂をジメチルホルムアミド(20mL)で3回洗浄した。同じプロトコルをFmoc−ロイシン−OH(2当量)及びFmoc−アラニン−OH(2当量)で繰り返した。
MS(ES+):609.3[MH]+;純度:90%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−Leu−Wang樹脂の代わりにFmoc−Gly−Wang樹脂で出発し、Fmoc−Leu及びFmoc−Alaを加えて、パラグラフ1.1.に記載のとおり調製した。
MS(ES+):482.2[MH]+;純度:92%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−Leu−Wang樹脂の代わりにFmoc−Phe−Wang樹脂で出発し、Fmoc−Pro;Fmoc−Leu及びFmoc−Alaを加えて、パラグラフ1.1.に記載のとおり調製した。
MS(ES+):669[MH]+;純度:98%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−Phe−Wang樹脂で出発し、Fmoc−Ala;Fmoc−Leu及びFmoc−Alaを加えて、パラグラフ1.3.に記載のとおり調製した。
MS(ES+):643[MH]+;純度:90%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−Leu−Wang樹脂の代わりにFmoc−Gly−Wang樹脂で出発し、Fmoc−Ile及びFmoc−Alaを加えて、パラグラフ1.1.に記載のとおり調製した。
MS(ES+):482.5[MH]+;純度:60%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−Leu−Wang樹脂の代わりにFmoc−Gly−Wang樹脂で出発し、Fmoc−Leu及びFmoc−Lys(IvDde)を加えて、パラグラフ1.1.に記載のとおり調製した。
MS(ES+):744[MH]+
Fmoc−Leu−Wang樹脂の代わりにFmoc−Gly−Wang樹脂で出発し、Fmoc−Pro及びFmoc−Glyを加えて、パラグラフ1.1.に記載のとおり調製した。
MS(ES+):452[MH]+
2.1.NH2−ALAL−ドキソルビシンの合成
ドキソルビシン(1当量)をジメチルホルムアミド(10mL)中に可溶化した。ジメチルホルムアミド(2mL)中のFmoc−ALAL−OH(1.2当量)の溶液をドキソルビシンに添加し、N,N−ジイソプロピルエチルアミンでpHをpH8に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド(2mL)中2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.2当量)を添加した。溶液のpHを確認し、pH8〜8.5に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、HPLCにより確認した。反応が完了している場合、Fmoc基をピペリジン(10%最終体積)によって室温で5分間処理することにより除去し、乳酸緩衝液10% pH3を0℃で添加した。混合物をYMCにロードした。生成物をMeOHで回収し、溶媒を蒸発させた。ALAL−ドキソルビシンをセミ分取HPLC(カラムLuna、C18)により精製した。
MS(ES+):912[MH]+;純度:95%(HPLCにより214nmで測定)。
ドキソルビシン(1当量)をジメチルホルムアミド(10mL)中に可溶化した。ジメチルホルムアミド(2mL)中Fmoc−プロリン−OH(1.2当量)の溶液をドキソルビシンに添加し、pHをN,N−ジイソプロピルエチルアミンでpH8〜8.5に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド(2mL)中2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.2当量)を添加した。溶液のpHを確認し、pH8〜8.5に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、HPLCにより確認した。反応が完了している場合、Fmoc基をピペリジン(10%最終体積)によって室温で5分間処理することにより除去し、乳酸緩衝液10% pH3を0℃で添加した。混合物をYMCにロードした。生成物をMeOHで回収し、溶媒を蒸発させた。Pro−ドキソルビシンをセミ分取HPLC(カラムLuna、C18)により精製した。Fmoc−グリシン−OH(1.2当量)で同じプロトコルに従った。
P−Dox:MS(ES+):641[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
GP−Dox:MS(ES+):698[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
Pro−ドキソルビシン(1当量)をジメチルホルムアミド(10mL)中に可溶化した。ジメチルホルムアミド(2mL)中Fmoc−ALG−OH(1.2当量)の溶液をドキソルビシンに添加し、N,N−ジイソプロピルエチルアミンでpHをpH8に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド(2mL)中2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.2当量)を添加した。溶液のpHを確認し、pH8〜8.5に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、HPLCにより確認した。反応が完了している場合、Fmoc基をピペリジン(10%最終体積)によって室温で5分間処理することにより除去し、乳酸緩衝液10% pH3を0℃で添加した。混合物をYMCにロードした。生成物をMeOHで回収し、溶媒を蒸発させた。ALGP−ドキソルビシンをセミ分取HPLC(カラムLuna、C18)により精製した。
MS(ES+):882[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−ALAL−OHの代わりにFmoc−ALPF−OHを使用して2.1に記載のとおり調製した。
MS(ES+):971[MH]+;純度:97%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−ALAL−OHの代わりにFmoc−ALAF−OHを使用して2.1に記載のとおり調製した。
MS(ES+):947[MH]+純度:96%(HPLCにより214nmで測定)。
Fmoc−ALAL−OHの代わりにFmoc−AIGP−OHを使用して2.1に記載のとおり調製した。
Fmoc−ALAL−OHの代わりにFmoc−GPGP−OHを使用して2.1に記載のとおり調製した。
3.1.PhAc−ALGP−ドキソルビシンの合成
MS(ES+):1004.4[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
MS(ES+):1034[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
MS(ES+):1094[MH]+;純度:92%(HPLCにより214nmで測定)。
MS(ES+):1068[MH]+;純度:97%(HPLCにより214nmで測定)。
PhAc−D(Dmab)LGP−ドキソルビシンを、NH2−ALAL−Doxの代わりにNH2−D(Dmab)LGP−Doxで3.2に記載のとおり調製した。4−{N−[1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)−3−メチルブチル]−アミノ}ベンジルとしても知られる保護基Dmabをヒドラジン水和物2%によって室温で5分間除去した。乳酸緩衝液10% pH3を0℃で添加し、混合物をYMCにロードした。生成物をMeOHで回収し、溶媒を蒸発させた。PhAc−DLGP−ドキソルビシンをセミ分取HPLC(カラムLuna、C18)により精製した。
MS(ES+):1048.3[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
PhAc−T(Dmab)SGP−ドキソルビシンを、NH2−ALAL−Doxの代わりにNH2−T(Dmab)SGP−Doxで3.2に記載のとおり調製した。保護基Dmabをヒドラジン水和物2%によって室温で5分間除去した。乳酸緩衝液10% pH3を0℃で添加し、混合物をYMCにロードした。生成物をMeOHで回収し、溶媒を蒸発させた。PhAc−TSGP−ドキソルビシンをセミ分取HPLC(カラムLuna、C18)により精製した。
MS(ES):1008.3[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
NH2−ALAL−Doxの代わりにNH2−AIGP−Doxで3.2に記載のとおり調製した。
MS(ES+):1004.3[MH]+;純度:99%(HPLCにより214nmで測定)。
PhAc−K(IvDde)LGP−ドキソルビシンを、NH2−ALAL−Doxの代わりにNH2−K(IvDde)LGP−Doxで3.2に記載のとおり調製した。保護基IvDdeをヒドラジン水和物2%によって室温で5分間除去した。乳酸緩衝液10% pH3を0℃で添加し、混合物をYMCにロードした。生成物をMeOHで回収し、溶媒を蒸発させた。PhAc−KLGP−ドキソルビシンをセミ分取HPLC(カラムLuna、C18)により精製した。
MS(ES+):1061[MH]+;純度:91.5%(HPLCにより214nmで測定)。
NH2−ALAL−Doxの代わりにNH2−GPGP−Doxで3.2に記載のとおり調製した。
MS(ES+):974.9[MH]+;純度:98%(HPLCにより214nmで測定)。
方法
健常ドナー由来のクエン酸塩加ヒト血液及び血漿(pH7、Innovative Research)を使用して、ホスホノアセチルでキャッピングされた薬物コンジュゲート(PhAc−ALAL−Dox、PhAc−ALPF−Dox、PhAc−ALAF−Dox、PhAc−ALGP−Dox、PhAc−DLGP−Dox及びPhAc−KLGP−Dox)の安定性を既知のスクシニル−βALAL−Doxプロドラッグコンジュゲートと比較して評価した。
Suc−βALAL−Doxと同様、試験した全てのキャッピングコンジュゲートがヒト血漿及びヒト血液中で安定であることが示された。血液又は血漿の存在下、37℃で5時間インキュベートした後、試験試料中に検出されたドキソルビシンコンジュゲートの代謝誘導体は10%以下であった(例外:PhAc−ALAL−Doxは血中で15%の代謝産物をもたらす;データは表1及び表2に要約)。
1.方法
1.1.腫瘍細胞により分泌されるペプチダーゼの存在下における再活性化アッセイ
LS−174T腫瘍細胞のサブコンフルエント培養物をリン酸緩衝生理食塩水溶液で2回洗浄したとともに、0.02%ウシ血清アルブミンを含有する新鮮な培養培地(フェノールレッド不含DMEM−F12)を添加する(100μl/cm2)。24時間インキュベートした後、馴化培地を回収し、300gで10分間遠心し、1M トリス−HCl、pH7.4(1体積の緩衝液+19体積の培地)で緩衝し、超遠心法により20倍濃縮する(カットオフ閾値10kDa)。
CD10(組換えヒトネプリライシン、R&D systems、参照記号1182−ZN)を、0.2mg/mL BSAを補足した0.1M MES pH6.5中に20nMで希釈した。TOP(組換えヒトthimetオリゴペプチダーゼ、R&D systems、参照記号3439−ZN)を、50mMトリス−HCl pH7.4/0.5M NaCl/0.1M DTTの溶液中に10nMに希釈した。CD26及びFAPを、トリス−HCl pH7.5緩衝液中に1μg/mLで希釈した。50μMの各化合物を酵素溶液に添加することにより(1体積の酵素溶液+1体積の100μM薬物溶液)、反応を開始させた。試料を、精製酵素の存在下、水浴中37℃で0、1、又は3時間インキュベートした。各時点で50μLの試料を回収し、ヒト血漿について上記に記載したとおり処理した。並行して、Suc−βALAL−doxの活性化を参照として試験した。
N−キャッピングされたペプチド−ドキソルビシンコンジュゲートのインビトロ再活性化アッセイの結果を表3に提供する。
方法
PhAc−ALAL−Dox及びPhAc−ALGP−Doxを生理食塩水に溶解した。化合物をOF−1マウスの外側尾静脈に静脈内ボーラス注射によって投与した(10μl/g)。体重をモニタすることによりインビボ毒性を評価した。
図1の結果は、160μmol/kgのPhAc−ALAL−Doxの高い毒性を示す。80μmol/kgのPhAc−ALAL−Doxで処置した群では、有意な体重減少は観察されない。240及び320μmol/kgの用量でのPhAc−ALGP−Dox注射は十分な忍容性がある。PhAc−ALGP−Dox 240μmol/kg処置群では中程度の体重減少(28日目に最大15%)が記録され、PhAc−ALAL−Doxと比較してその毒性が低いことが分かる。320μmol/kgのPhAc−ALGP−Doxの注射は有意な体重減少を引き起こし、1匹のマウスは12日目に死亡が認められた。これらのデータは、単回静脈内ボーラス注射後のPhAc−ALGP−Doxの最大耐量(MTD)が240〜320μmol/kgであることを示している。Doxの毒性は30〜40μmol/kgの間を変動し、1回の静脈内注射後におけるPhAc−ALGP−Doxの毒性が少なくとも6分の1であることを示している。
方法
ドキソルビシン及びPhAc−ALGP−Doxの抗腫瘍活性を、ヒトLS−174T結腸癌又はMX−1乳癌の異所性異種移植片を有する無胸腺マウス(nude/nude NMRI)のモデルで試験した。
図2に示されるとおり、皮下移植したLS174T腫瘍(結腸癌)を有するヌードマウスにおいてPhAc−ALGP−Doxを140μモル/kg及び160μモル/kgで2回(毎週1回)静脈内注射した。その体重、及び腫瘍サイズを28日間追跡し、Dox(15μmol/kg)及びNaClで処置した動物群と比較した。全ての処置群で有意な且つ同程度の抗腫瘍活性が観察された(表4)。
方法
OF−1マウスを使用して薬物動態学的組織分布試験を実施した。ドキソルビシン及びPhAc−ALGP−Doxを8.62mMの用量で生理食塩水に溶解し、マウスに外側尾静脈における静脈内経路によって投与した(10μL/g)。薬物投与後の種々の時点(5分、30分、1時間、4時間、7時間、16時間及び24時間)で各群3匹のマウスを頸椎脱臼により犠牲にし、血液及び心臓組織を採取した。心臓を切開し、リン酸緩衝生理食塩水で慎重にリンスし(心腔内の血液を除去する)、ペーパー上で乾燥させて液体窒素で凍結した。それらは分析まで保存した。血液試料を遠心(10分、2000g、4℃)して血漿画分を分離し、それを分析用に保存した。心臓をUltraturraxホモジナイザーで1.5mLの水中にホモジナイズした。microBCAタンパク質アッセイ(Pierce)を使用してタンパク質濃度を計測した。抽出後(50μL試料に150μLのアセトニトリルを添加した)、HPLCにより薬物の組織内定量化を行った。試料をボルテックスし、室温13000rpmで10分間遠心した。上清を回収した。200mMのギ酸緩衝液pH4.5(1体積 試料上清+3体積 緩衝液)を添加することにより試料を緩衝した後、HPLC分析を行った(蛍光検出 ex=235nm em=560nm)。
ドキソルビシン及びPhAc−ALGP−doxを野生型雌性OF−1マウスに86.2μmol/kgの等モル用量で静脈内ボーラス注射した。血漿及び心臓組織における薬物及び代謝産物濃度の進展をHPLC分析により決定した。Dox又はPhAc−ALGP−Doxの注射後、最初の5分間で薬物血漿濃度の約90%が消失した(図4A及び図4B)。1%未満のPhAc−ALGP−Doxが急速に加水分解されLGP−Dox、GP−Dox及びDoxになった。1時間後、これらの代謝産物はもはや検出されなかった。ドキソルビシンを注射した後のドキソルビシンの血漿曲線下面積(AUC)値は、PhAc−ALGP−Doxの注射後より63倍高い(表6)。
マウス胚性幹細胞由来心筋細胞(Cor.At(登録商標)、Axiogenesis(ドイツ))を使用して初期リード最適化における心臓安全性スクリーニング用の関連性のある且つ予測的なインビトロモデルでインビトロ心毒性試験を実施した。Cor.At(登録商標)心筋細胞は、化合物の潜在的心臓細胞毒性をインビトロで分類するための標準化された均質且つ再現可能な細胞系を提供する。試験化合物とインキュベートした後、ニュートラルレッド取り込み試験を用いて、非特異的な参照細胞型、例えばマウス線維芽細胞(MEF)と比較したときの心臓細胞の生存率及び完全性に直接影響を及ぼす効果を決定した。
漸増濃度のPhAc−ALGP−Dox又はドキソルビシンの存在下でCorAt心筋細胞をインキュベートした。48時間後、ニュートラルレッド取り込み試験を用いて細胞生存率を決定した。対照細胞としてマウス胚線維芽細胞(MEF)を使用して、心臓特異的毒性を一般的な細胞毒性と区別した。PhAc−ALGP−Doxの用量反応曲線(図5)は、実に、試験した最も高い濃度(20μg/ml)に限りCor.At心筋細胞に対して中程度の毒性効果を示した。この濃度では、MEFに対する効果はそれほど明白でない(37%生存率に対して81%生存率)。MEFについては、この化合物ではIC50に達しない。試験したそれより低いいずれの濃度でも、PhAc−ALGP−Doxは毒性効果を示さなかった。ドキソルビシンの用量反応曲線は試験した2つの最も高い濃度(20μg/ml及び2μg/ml)でCor.At心筋細胞に対しても、並びにMEFに対しても、実に重度の毒性効果を示した。0.2μg/mlでこの化合物はCor.At心筋細胞に対し実に中程度の毒性効果を示したが、MEFに対しては最低限の効果しか示さなかった(Cor.At心筋細胞の67%生存率に対してMEFの89%生存率)。Cor.At心筋細胞に対する効果は、MEFに対する効果より僅かに高いに過ぎないが、この化合物は、一般的な細胞毒性効果に隠されていることがあり得る心臓毒性効果を及ぼすと考えられる。
方法
PhAc−ALGP−Doxの腫瘍活性化を、ヒトLoVo結腸癌の異所性異種移植片を有する無胸腺マウス(nude/nude NMRI)を使用して評価した。LoVo腫瘍を、6週齢雌性NMRIヌードマウス(Harlan)の右側腹部に細胞(107細胞)を皮下移植することによって確立した。異種移植片の皮下移植後4週間に薬物又は対照を投与した。注射当日、動物を4匹の動物の群に無作為に割り当てた。PhAc−ALGP−Doxコンジュゲートを漸増用量(1.5、3.5、5、10、20、30、46、及び62mM)で生理食塩水中に溶解した。コンジュゲートを10μl/gで外側尾静脈にボーラス静脈内注射(i.v.)によって送達した。注射後24時間でマウスを頸椎脱臼により犠牲にし、腫瘍を回収し、リン酸緩衝生理食塩水でリンスしてホモジナイズした。アセトニトリルで腫瘍ホモジネートからの薬物の抽出を実施し、腫瘍中に存在するドキソルビシンをHPLC分析によって定量化した。
図6の結果から、PhAc−ALGP−Doxの注射用量に伴いDox腫瘍内濃度が増加し、200μmol/kgでプラトー値に達することが分かる。この実施例の結果は、腫瘍部位における限られたプロドラッグ活性化速度及び利用可能性が、PhAc−ALGP−Doxとの接触期間の間に利用可能な最大の酵素活性に依存し得ることを示している。
方法
PhAc−ALGP−Doxを生理食塩水中に溶解し、OF−1マウスの外側尾静脈に単回又は複数回腹腔内(ip)注射によって投与した(10μl/g)。PhAc−ALGP−Doxは、以下の種々の注射スケジュールに従い280及び560μmol/kgの同様の累積用量で投与した:単回ip注射;56及び112μmol/kgで1日1回5日連続ip注射又は28及び56μmol/kgの用量で1日2回5日連続。体重をモニタすることによりインビボ毒性を評価した。
いずれの注射スケジュールでも、280μmol/kgの累積用量のPhAc−ALGP−Doxを受けた動物群では体重減少は記録されなかった(図7)。280μmol/kgの単回ip注射後のPhAc−ALGP−Doxの毒性研究を別途行っており、結果を図7に示す。単回ip注射により投与した560μmol/kgの用量は極めて毒性が高かった。動物は1週間で体重が25%減少し、犠牲にした。結果は明らかに、用量を複数回の注射に分割することが毒性を低下させることを示している。112μmol/kgのPhAc−ALGP−Doxの1日1回5日連続ip注射もまた、11日目に最大22.5%の大きい体重減少を引き起こしたが、その後回復期が続いた。56μmol/kgのPhAc−ALGP−Doxの10回のip注射(1日2回5日連続)で処置した群では、体重減少は観察されなかった。同レジームに従い注入されるドキソルビシンの最大耐量が3μmol/kgであることを考えると、PhAc−ALGP−ドキソルビシンは、これらの条件下では毒性が約15分の1である。
方法
OF−1マウスを使用して薬物動態学的組織分布試験を実施した。ドキソルビシン及びPhAc−ALGP−Doxを9.2mMの用量で生理食塩水に溶解し、腹腔内経路によってマウスに投与した(10μL/g、各群6匹のマウス)。薬物投与後の種々の時点(5分、30分、1時間、4時間、及び24時間)で、EDTAコートを施したマイクロチューブ(Starsted)を使用して3匹のマウスの外側尾静脈から血液試料を採取した。24時間後、各群3匹のマウスを頸椎脱臼により犠牲にし、心臓を採取した。それらの心臓を切開し、リン酸緩衝生理食塩水中で慎重にリンスし(心腔内の血液を除去する)、ペーパー上で乾燥させて液体窒素で凍結した。それらは分析まで保存した。心臓をUltraturraxホモジナイザーで1.5mLの水中にホモジナイズした。microBCAタンパク質アッセイ(Pierce)を使用してタンパク質濃度を計測した。抽出後(50μL試料に150μLのアセトニトリルを添加した)、HPLCにより薬物の組織内定量化を行った。試料をボルテックスし、室温13000rpmで10分間遠心した。上清を回収した。200mMのギ酸緩衝液pH4.5(1容積試料上清+3容積緩衝液)を添加することにより試料を緩衝した後、HPLC分析を行った(蛍光検出 ex=235nm em=560nm)。
OF−1マウスへの腹腔内(ip)注射後、PhAc−ALGP−Doxの血中薬物動態を評価した。92μmol/kgのPhAc−ALGP−Doxのip注射後最初の5分間で、注射した用量の低い割合(約1%)が血液コンパートメントに達した。プロドラッグの血中濃度は1時間安定しており、続いて低下した。4時間後、コンジュゲートはもはや検出されなかった(図8A)。AUC値は、PhAc−ALGP−Dox及びDoxについてそれぞれ44.2μM.h及び3.6μM.hであった。図8Bの結果は、等モル用量でのドキソルビシンの血中薬物動態を示す。注射後最初の5分間で、注射した用量の低い割合(約2.5%)が血液コンパートメントに達した。血中Dox濃度は1時間以内に極めて低い濃度に急速に低下し、それが注射後最大24時間にわたり安定したまま保たれた。ドキソルビシンのAUC値は70.3μM.hであった。
方法
ヒトLoVo結腸癌又はMX−1乳癌の異所性異種移植片を有する無胸腺マウス(nude/nude NMRI)を使用して、遊離ドキソルビシンと比較したPhAc−ALGP−Doxの有効性を評価した。6週齢雌性NMRIヌードマウス(Harlan)の右側腹部に細胞(107細胞)を皮下移植することにより、腫瘍を確立した。腫瘍が150〜200mm3のサイズ(ノギスを使用して計測し、以下の式により計算した:[長さ×幅2]/2)に達したときに処置を投与した。動物を4〜6匹の動物の群に無作為に割り当てた。ドキソルビシン及びPhAc−ALGP−Doxを生理食塩水に溶解した。化合物を10μl/gでボーラス腹腔内注射(ip)によって送達した。実験の経過中、臨床徴候、体重及び腫瘍体積を週2回管理した。結果は時間の関数としての平均腫瘍体積の進展として提供する。最適T/C(処置マウスと対照マウスとの平均腫瘍体積比)の値及びTGD(1000mm3に達する際の腫瘍増殖遅延)を処置有効性の尺度として使用した。最適T/C%は、達成された最大腫瘍成長阻害(TGI)を示す(TGI=100−(T/C’100))。22日目にGraph Pad Prism 5.0ソフトウェアのマンホイットニーt検定を使用して統計的分析を実施した。
Lovo異種移植片を有するマウスが生理食塩水、又は0.5、1及び2μmol/kgのドキソルビシン、又は25、35及び50μmol/kgのPhac−ALGP−Doxの1日2回(5〜6時間間隔で)5日連続(2Q1D5;合計10回の注射)の腹腔内注射を受けた。その体重及び腫瘍サイズを追跡して比較した(図9)。NaCl及びドキソルビシン処置群では、腫瘍壊死が起こった時点で腫瘍の計測を中止した。この実験において有意な体重減少は記録されなかった。PhAc−ALGP−Doxは用量依存性の抗腫瘍効果及び腫瘍増殖遅延の増加を生じた(表8)。2μmol/kgのドキソルビシンで処置した群で中程度の腫瘍成長阻害が観察された一方、0.5及び1μmol/kgの用量では抗腫瘍活性は見られなかった。22日目、50μmol/kg PhAc−ALGP−Doxによる抗腫瘍効果は2μmol/kg Doxと比較したとき統計的に高く、それぞれ65%及び45%のTGI値であった。各処置によって生じた絶対成長遅延を、処置マウスの腫瘍が190から1,000mm3に成長するまでの時間(日)から媒体処置マウスで腫瘍が同じサイズに達するまでの時間(日)を引いた差として計算した。50μmol/kg PhAc−ALGP−Dox処置プロトコルは17日の成長遅延をもたらした一方、最大用量の2μmol/kgドキソルビシン単独は6日の成長遅延を生じさせたに過ぎなかった。
方法
十分な記載がなされているB16−F10肺転移性メラノーマモデルにおいてPhAc−ALGP−Doxの有効性を試験した。この目的上、5×107個のB16−F10マウスメラノーマ細胞をC57BL6マウスの外側静脈に注射した。処置は細胞注射の3日後に開始した。動物は1日2回(5〜6時間間隔)5日連続で生理食塩水又は2及び3.5μmol/kgのドキソルビシン又は50μmol/kgのPhAc−ALGP−Doxの腹腔内注射を受けた(合計10回の注射/マウス)。細胞注射後14日目に各群5匹のマウスを犠牲にした。肺を採取し、メラニン定量化のため処理した(Molecular Pharmacology,74:1576−1586,2008)。残りのマウスを観察することにより、生存を決定した。
PhAc−ALGP−Doxは、NaCl及びドキソルビシン処置群と比較して有意に肺転移の形成を阻害し、マウスの生存を増加させる(図12)。14日目、肺ホモジネート中のメラニンの量は対照群で501mg/mL、2及び3.5μmol/kgドキソルビシン処置群で183及び53mg/mL、及び50μmol/kg PhAc−ALGP−Dox処置群で16mg/mLであった。生存期間中央値は、NaCl、2及び3.5μmol/kgドキソルビシン又は50μmol/kg PhAc−ALGP−Doxを受けた群でそれぞれ20、24、28及び36日であった。
方法
HCT116細胞をSCIDマウスに皮下注射した。異種移植片が確立された後、それらを切除し、ガンマ線を照射した他の雌性SCIDマウスの盲腸(ceacum)に顕微手術技法を用いて同所性移植した。癌細胞注射後12日目にマウスを16匹の4群に無作為化した。それらの群が、5日連続で1日2回、それぞれ生理食塩水、2μmol/kgのドキソルビシン並びに35及び50μmol/kgのPhAc−ALGP−Doxの腹腔内注射を受けた。結腸癌細胞を盲腸に注射後34日目に動物を犠牲にし、転移数を肉眼でカウントし、原発腫瘍を秤量した。
結果を図15及び図16に示す。2μmol/kgのドキソルビシンはSCIDマウスには毒性が高過ぎることが分かり、10日以内に全ての動物が死亡した。PhAc−ALGP−Doxもまた他の試験動物腫瘍異種移植モデルと比較してこれらのマウスに対する毒性がより高く、35μmol/kgの用量で12匹のマウスが34日生存し、50μmol/kg処置群では9匹のマウスが生き残った。
PhAc−ALGP−Dox(35μmol/kg ip)及びドキソルビシン(3.5μmol/kg ip)の白血球減少効果を2つの独立した実験で比較した。CD1マウスが薬物の1日2回の腹腔内注射を5日連続で受けた(合計10回の注射/マウス;2×各群5匹の動物)。マウスの体重の進展を記録した。処置開始後4、11及び15日目、EDTAコートを施したMicrovettesチューブ(Starsted)に尾静脈から血液を採取した。白血球(WBC)を、SCILvet abc血液分析器を使用してカウントした。WBCの増加又は減少は、各マウスの0日目のWBC(100%)に対する割合として表した。図13は、2つの試験を合わせた結果を示す。
方法
マウスにおけるPhAc−ALGP−Doxの慢性心毒性を、Bertazzoli et al.1979(Cancer Treat Rep 63,1877−1883)によって以前記載されたとおり形態学的に評価した。CD1雌性白マウスを、10μL/gの尾静脈におけるボーラス静脈内注射によって処置した(各群6マウス)。化合物は週2回、10回注射した。最初の4回の注射と最後の6回の注射との間に動物を2週間処置しないでおき、骨髄抑制を回復させた。PhAc−ALGP−Doxの処置用量レベルは、13.8;27.6;55.2;及び82.8μmol/kgであった。ドキソルビシン6.9μmol/kgを参照として使用した。最後の注射後3週間でネンブタール(50mg/kg)を腹腔内注射することにより動物を深麻酔し、失血させた。心臓を慎重に採取し、NaCl 9‰でリンスし、10%ホルムアルデヒド溶液中に固定した。試料を病理組織分析(CITox Lab、France)用に処理した。心臓をトリミングし、パラフィンワックスに包埋し、厚さ4ミクロンの切片に切り、ヘマトキシリン−エオシンで染色した後、顕微鏡的評価を行った。実験の経過中、各注射前又は週1回、体重を管理した。
PhAc−ALGP−Doxで処置した群において体重減少は観察されなかった(図14)。処置終了時、ドキソルビシン処置動物は脱力の徴候を示し、移所運動活性が低下した。ドキソルビシン処置群では、中程度の体重低下(最大で犠牲時における8%)が記録された。
1.PhAc−ALGP−メイタンシン
メイタンシンは強力な微小管標的化合物であり、サブナノモル濃度で有糸分裂停止を誘導して腫瘍細胞を死滅させる。しかしながら、その副作用及び腫瘍特異性の欠如が、臨床使用の奏効を妨げている。メイタンシンは微小管集合を阻害し、微小管分解を誘導し、及び有糸分裂を中断させる。メイタンシンは多くの腫瘍細胞株に対して細胞毒性を呈し、ビンカアルカロイドより約100倍高い細胞毒性及びドキソルビシンより約1000倍高い毒性を示す。
ゲルダナマイシン及びその誘導体は、ベンゾキノンアンサマイシンのファミリーであり、当初はその弱い抗生物質活性に基づき単離され、後に強力な抗腫瘍活性を示すことが分かった抗生物質である。ゲルダナマイシンは、その正常な細胞対応物と比較して、v−src、bcr−abl及びp53などの腫瘍細胞で突然変異するタンパク質の優先的な分解を誘導する。この効果はHsp90によって媒介される。その強力な抗腫瘍性の潜在能力にも関わらず、ゲルダナマイシンは抗腫瘍剤としていくつかの重大な欠点を有し、それがゲルダナマイシン類似体、詳細には17位に置換を含む類似体の開発につながっている。
タキサンは、イチイ属(Taxus)植物により産生されるジテルペンである。タキサンには、パクリタキセル(タキソール(Taxol))及びドセタキセル(タキソテール(Taxotere);以下の図を参照)が含まれる。
カンプトテシン(CPT;以下に示す構造)は、DNA酵素トポイソメラーゼI(TopoI)を阻害する細胞毒性キノリンアルカロイドである。CPTは予備臨床試験で顕著な抗癌活性を示したが、低い溶解性及び(高い)有害薬物反応を被る。これらの欠点のために、合成及び医薬品化学者は多数のカンプトテシン合成及び様々な誘導体を開発している。2つのCPT類似体、即ちトポテカン及びイリノテカンが承認されており、現在の癌化学療法において用いられている。
ビンブラスチン(以下に構造を示す)は、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌、及び精巣癌を含めたある種の癌の処置に使用される抗微小管薬である。ビンブラスチンはまた、ランゲルハンス細胞組織球症の処置にも使用される。ビンブラスチンは伝統的には、マダガスカルのニチニチソウ(Madagascar periwinkle)であるツルニチニチソウ(Vinca rosea)としても知られるニチニチソウ(Catharanthus roseus)から得られた。ビンブラスチンは植物においてアルカロイドのカタランチン及びビンドリンの連結により生成される。
アムルビシン(以下に構造を示す)は第三世代の合成アントラサイクリン類似体であり、小細胞肺癌の処置において実質的な臨床的有効性が実証されている。アムルビシンは強力なトポイソメラーゼII阻害薬であり、単剤として、並びに肺及び乳房を含めた様々な固形腫瘍に対する抗癌療法との併用で研究されている。アムルビシンはFDAによりオーファンドラッグ類として認可されている。
誘導体の合成は、以上に概略的に記載した、且つ各細胞毒性化合物に関して言及した参考文献にさらに詳説される方法に基づき得る。
9.1.GP−細胞毒性化合物コンジュゲートの生物学的インビトロ試験
出発化合物(非コンジュゲート、「親」薬物)及びそのコンジュゲート型誘導体(「GP−薬物」)の細胞毒性活性をインビトロ細胞株で試験する。これらの細胞株は、細胞毒性化合物の各々に関して以上に言及した参考文献中に言及されているものの少なくとも一部である。薬物濃度及びインキュベーション時間の関数として試験を行う必要がある。GP−薬物は、短いインキュベーション時間後には親薬物と比べて活性がはるかに低いはずである。インキュベーション時間の増加に伴い、インキュベーション培地の一部である血清中に存在するエキソプロテアーゼによってGP−薬物の加水分解が増加するため、この差の大きさは小さくなり得る。そのような場合、血清中のエキソプロテアーゼの存在は、可能であればGP−薬物を無血清インキュベーション培地中でインキュベートすることにより確認され得る。
満足なGP−プロドラッグが得られたら、対応するPhAc−ALGP−細胞毒性化合物コンジュゲートの生物学的インビトロ特性を分析する。この分析には、元の非コンジュゲート親薬物とそのコンジュゲート型プロドラッグ対応物とのインビトロ細胞の細胞毒性効果を評価することが含まれる。薬物及びプロドラッグの用量反応曲線を比較する。プロドラッグは非コンジュゲート薬物と同等の細胞毒性(cytotoxicitcy)を及ぼすと予想される。
上記に記載したとおりプロテアーゼとのプレインキュベーション前及びその後のプロドラッグの細胞内取込み(率)を試験する。これを達成するには、薬物及びプロドラッグを適切に標識することが必要となり得る(以下参照)。
10.1.最大耐量(MTD)の決定
インビボ試験は、初めに、漸増用量のプロドラッグを注射したマウスの体重減少を計測することにより、プロドラッグコンジュゲートのMTDを決定する。これを遊離細胞毒性薬物のMTDと比較する。MTDは、動物の元の体重の20%を超える体重減少を引き起こさない用量として決定し得る。
非コンジュゲート型/遊離細胞毒性化合物で得られた既発表のデータに基づき1つ又は2つの異なるヒト異種移植片腫瘍モデルを選択する。プロドラッグ及び遊離薬物を上記に記載したとおり決定したMTDでIP注射する。体重及び腫瘍体積を2日おきに計測し、MTDの遊離出発薬物で得られた結果と比較する。
恐らくアムルビシンなどの蛍光薬物を除いては、薬物及びプロドラッグの薬物動態学的組織分布試験は、化学分析的決定方法において十分な感受性を生じさせるため、薬物及びプロドラッグを適切に標識することが必要となり得る。ある種の標識は放射標識であり、化合物は、例えば、トリチウム交換によるか又はC−14標識前駆体との新合成(neosynthesis)により放射性標識され得る。標識は、その標識、又はある標識が、プロドラッグの代謝産物中に維持されるようなものでなければならない。血漿薬物動態、並びにコンジュゲート薬物及びその代謝産物の腫瘍内蓄積を、臓器及び組織分布と併せて調査する。
図16〜図19に提供する実験の結果から、PhAc−ALGP−doxのいくつかの興味深い特性が導き出され得る。
この実験では、ドキソルビシンをALGPペプチドに結合させる効果を、ドキソルビシン抵抗性脂肪肉腫におけるその活性を試験することにより評価した。本結果は、ドキソルビシンをALGPに結合させると、耐容される実験的用量が高くなることを実証している。このように、ドキソルビシン抵抗性肉腫異種移植片の実験的化学療法であっても、PhAc−ALGP−doxには前記ドキソルビシン抵抗性脂肪肉腫の異種移植片成長を制限する能力がある。この試験では、マウス群(双方の群ともn=4)は(各マウスが2つの腫瘍を有する)、それぞれ、生理食塩水で処置し(対照群)、ドキソルビシンで処置し(ドキソルビシン処置群)及びPhAc−ALGP−doxで処置した(PhAc−ALGP−dox処置群)。処置0日目〜21日目、対照(n=7)及びドキソルビシン処置腫瘍(n=8)の両方において、それぞれ258%(p=0.018)及び246%(p=0.012)に至る腫瘍体積の着実な増加があった。他方でPhAc−ALGP−doxで処置した腫瘍では、105%での腫瘍体積の安定化が明らかとなった(図16)。PhAc−ALGP−dox処置マウス(n=6)における腫瘍体積成長の遅延は、21日目に対照群(p=0.003)又はドキソルビシン処置群(p=0.002)と比較したとき統計的に有意であった。
実験全体にわたり、マウスの体重及び全般的な健康をモニタした。体重の進展を示す詳細なグラフを図17に提供する(対照群:n=4;PhAc−ALGP−dox処置群:n=3;ドキソルビシン処置群:n=4)。重大な副作用は観察されなかったとともに、概して動物の体重は許容値(処置中に開始時体重の20%減少)未満に降下することはなかった。PhAc−ALGP−dox群の1匹のマウスは倫理的理由で13日目に犠牲にした(体重79.8%、動物は11日目から痩せ、剖検中に、恐らくはミニポンプを外科的に植え込んだ結果としての感染に起因する限定的な腹腔内の腹水が認められた)。
対照又はドキソルビシン処置動物と比較して、PhAc−ALGP−doxで処置したマウスにおいて総白血球及び総好中球に重大な変化は観察されなかった(それぞれ図18及び図19;対照群:n=4;PhAc−ALGP−dox処置群:n=3;ドキソルビシン処置群:n=4)。好中球減少症は、遊離ドキソルビシン処置の最も重大な毒性副作用の1つである。従って、遊離ドキソルビシンと比べて40倍高い用量のPhAc−ALGP−ドキソルビシンを投与した21日後の好中球(netrophil)数が変化しないままであることは、臨床的観点からは極めて有望な新規の実験結果である。
対照又はドキソルビシン処置動物と比較して、PhAc−ALGP−doxで処置したマウスにおいて総白血球及び総好中球に重大な変化は観察されなかった(それぞれ図18及び図19;対照群:n=4;PhAc−ALGP−dox処置群:n=3;ドキソルビシン処置群:n=4)。好中球減少症は、遊離ドキソルビシン処置の最も重大な毒性副作用の1つである。従って、遊離ドキソルビシンと比べて40倍高い用量のPhAc−ALGP−ドキソルビシンを投与した21日後の好中球(netrophil)数が変化しないままであることは、臨床的観点からは極めて有望な新規の実験結果である。
さらに、本願発明は次の態様を含む。
項1. 一般構造:
[C x −OP] y −D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPはオリゴペプチド部分であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有するプロドラッグ又はその薬学的に許容可能な塩。
項2. 前記オリゴペプチド部分OPが、配列ALGP(配列番号1)、ALAL(配列番号2)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドである、項1に記載のプロドラッグ又はその塩。
項3. 前記キャッピング基Cがホスホノアセチル基である、項1に記載のプロドラッグ又はその塩。
項4. 前記キャッピング基Cがホスホノアセチル基であり、前記オリゴペプチド部分OPが、配列ALGP(配列番号1)、ALAL(配列番号2)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドである、項1に記載のプロドラッグ又はその塩。
項5. 前記薬物Dがドキソルビシンである、項1〜4のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項6. 前記薬物Dがペグ化されている、項1〜5のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項7. 前記リンカー又はスペーシング基が存在する場合、自己脱離リンカー又はスペーシング基である、項1〜6のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項8. 前記プロドラッグが化合物Iである、項1〜7のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項9. 項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩を含む組成物。
項10. 薬学的に許容可能な溶媒、希釈剤又は担体の少なくとも1つをさらに含む、項9に記載の組成物。
項11. 癌の処置に用いるための、項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は項9若しくは10に記載の組成物。
項12. 前記癌の処置が併用化学療法処置又は集学的化学療法処置である、項11に記載のプロドラッグ若しくはその塩、又は組成物。
項13. 前記癌の処置が、薬剤耐性克服剤(reverting agent)を含む治療と併用される、項11又は12に記載のプロドラッグ若しくはその塩、又は組成物。
項14. 対象における腫瘍又は癌の治療方法であって、前記腫瘍又は癌の近傍に薬物の治療有効量を提供するのに十分な量の項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は項9若しくは10に記載の組成物を、癌を有する対象に投与することを含み、前記投与が前記腫瘍又は癌の処置をもたらす、方法。
項15. 前記プロドラッグ若しくはその塩、又は前記組成物の治療有効量が白血球減少症又は心毒性を引き起こさない、項14に記載の方法。
項16. 併用化学療法処置又は集学的化学療法処置の一部である、項14又は15に記載の方法。
項17. 前記対象に薬剤耐性克服剤(reverting agent)を投与することを含む処置と併用される、項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
項18. 項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグの製造方法であって、
(i)前記薬物を入手するステップ;
(ii)前記薬物を、キャッピングされたオリゴペプチド部分に結合させるステップであって、それにより前記プロドラッグを生じさせるステップ;又は、それに代えて、
(ii’)前記薬物をオリゴペプチド部分に結合させて、次に前記オリゴペプチド部分にキャッピング基を結合させるステップであって、それにより前記プロドラッグを生じさせるステップ;及び
(iii)ステップ(ii)又は(ii’)で得られた前記プロドラッグを精製するステップ
を含む方法。
項19. 一般構造
[C x −OP] y −D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物DをGP−、AP−又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりGP−D、AP−D又はKP−Dジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ;
(iii)薬物D及び前記ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)前記薬物D及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[C x −OP] y −Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項20. 一般構造
[C x −OP] y −D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物Dを[C x −OP] y とコンジュゲートするステップであって、それにより[C x −OP] y −Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)薬物D及びプロドラッグ[C x −OP] y −Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)薬物D及びプロドラッグ[C x −OP] y −Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するプロドラッグ[C x −OP] y −Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[C x −OP] y −Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項21. 一般構造
[C x −OP] y −D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物Dを[C x −OP] y とコンジュゲートするステップであって、それにより[C x −OP] y −Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[C x −OP] y −Dをインビトロ培養細胞と37℃で5時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[C x −OP] y −Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[C x −OP] y −Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[C x −OP] y −Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項22. 一般構造
[C x −OP] y −D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物DをGP−、AP−、又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりGP−D、AP−D又はKP−Dジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ;
(iii)ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間接触させるステップ;
(iv)ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[C x −OP] y −Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項23. 一般構造
[C x −OP] y −D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物Dを[C x −OP] y とコンジュゲートするステップであって、それにより[C x −OP] y −Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[C x −OP] y −Dを単離CD10及び/又はTOPペプチダーゼと、及び単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間〜24時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[C x −OP] y −Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[C x −OP] y −Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[C x −OP] y −Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項24. 前記キャッピング基Cがホスホノアセチル基である、項19〜23のいずれか一項に記載の方法。
項25. 前記薬物Dが、メイタンシン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン(campthothecin)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、メトトレキサート(methothrexate)、アミノプテリン、アムルビシン、又はそのいずれかの誘導体からなる群から選択される、項19〜23のいずれか一項に記載の方法。
項26. 前記リンカー又はスペーシング基が、存在する場合、自己脱離リンカー又はスペーシング基である、項19〜25のいずれか一項に記載の方法。
項27. 項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は項9若しくは10に記載の組成物を含む容器を含むキット。
項28. 同じ容器又は1つ以上の別個の容器に、1つ以上のさらなる抗癌薬をさらに含む、項27に記載のキット。
項29. 前記さらなる抗癌薬が抗体又はその断片である、項28に記載のキット。
項30. 同じ容器又は1つ以上の別個の容器に、1つ以上の薬剤耐性克服剤をさらに含む、項27又は28に記載のキット。
Claims (30)
- 一般構造:
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPはオリゴペプチド部分であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有するプロドラッグ又はその薬学的に許容可能な塩。 - 前記オリゴペプチド部分OPが、配列ALGP(配列番号1)、ALAL(配列番号2)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドである、請求項1に記載のプロドラッグ又はその塩。
- 前記キャッピング基Cがホスホノアセチル基である、請求項1に記載のプロドラッグ又はその塩。
- 前記キャッピング基Cがホスホノアセチル基であり、前記オリゴペプチド部分OPが、配列ALGP(配列番号1)、ALAL(配列番号2)、ALAP(配列番号3)、TSGP(配列番号4)、TSAP(配列番号5)、KLGP(配列番号6)、KLAP(配列番号7)、ALKP(配列番号8)、TSKP(配列番号9)、又はKLKP(配列番号10)を有するテトラペプチドである、請求項1に記載のプロドラッグ又はその塩。
- 前記薬物Dがドキソルビシンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
- 前記薬物Dがペグ化されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
- 前記リンカー又はスペーシング基が存在する場合、自己脱離リンカー又はスペーシング基である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
- 前記プロドラッグが化合物Iである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩を含む組成物。
- 薬学的に許容可能な溶媒、希釈剤又は担体の少なくとも1つをさらに含む、請求項9に記載の組成物。
- 癌の処置に用いるための、請求項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は請求項9若しくは10に記載の組成物。
- 前記癌の処置が併用化学療法処置又は集学的化学療法処置である、請求項11に記載のプロドラッグ若しくはその塩、又は組成物。
- 前記癌の処置が、薬剤耐性克服剤(reverting agent)を含む治療と併用される、請求項11又は12に記載のプロドラッグ若しくはその塩、又は組成物。
- 対象における腫瘍又は癌の治療方法であって、前記腫瘍又は癌の近傍に薬物の治療有効量を提供するのに十分な量の請求項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は請求項9若しくは10に記載の組成物を、癌を有する対象に投与することを含み、前記投与が前記腫瘍又は癌の処置をもたらす、方法。
- 前記プロドラッグ若しくはその塩、又は前記組成物の治療有効量が白血球減少症又は心毒性を引き起こさない、請求項14に記載の方法。
- 併用化学療法処置又は集学的化学療法処置の一部である、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記対象に薬剤耐性克服剤(reverting agent)を投与することを含む処置と併用される、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグの製造方法であって、
(i)前記薬物を入手するステップ;
(ii)前記薬物を、キャッピングされたオリゴペプチド部分に結合させるステップであって、それにより前記プロドラッグを生じさせるステップ;又は、それに代えて、
(ii’)前記薬物をオリゴペプチド部分に結合させて、次に前記オリゴペプチド部分にキャッピング基を結合させるステップであって、それにより前記プロドラッグを生じさせるステップ;及び
(iii)ステップ(ii)又は(ii’)で得られた前記プロドラッグを精製するステップ
を含む方法。 - 一般構造
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物DをGP−、AP−又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりGP−D、AP−D又はKP−Dジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ;
(iii)薬物D及び前記ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)前記薬物D及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。 - 一般構造
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)薬物D及びプロドラッグ[Cx−OP]y−Dの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ;
(iv)薬物D及びプロドラッグ[Cx−OP]y−Dの細胞毒性を決定するステップ;
(v)(iv)から、薬物Dと同等の細胞毒性活性を有するプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。 - 一般構造
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dをインビトロ培養細胞と37℃で5時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。 - 一般構造
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物DをGP−、AP−、又はKP−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりGP−D、AP−D又はKP−Dジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ;
(iii)ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間接触させるステップ;
(iv)ジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグGP−D、AP−D又はKP−Dに対応する[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。 - 一般構造
[Cx−OP]y−D
(式中、Cはキャッピング基であり;
OPは、グリシン−プロリン(GP)、アラニン−プロリン(AP)、及びリジン−プロリン(KP)からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが4連続アミノ酸(テトラペプチド)及び最大長さが8アミノ酸のペプチド(即ち4、5、6、7又は8連続アミノ酸の長さを有するペプチド)であり;
Dは薬物であり;
xは、y=1のとき少なくとも1である整数であり;
yは、少なくとも1である整数であり、yが1より大きい場合、少なくとも1つのOPがキャッピング基を有し;及び
CとOPとの間の結合及びOPとDとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、yが1より大きい場合、複数のOP部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び/又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してDに結合する)
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって
(i)前記薬物Dを入手するステップ;
(ii)前記薬物Dを[Cx−OP]yとコンジュゲートするステップであって、それにより[Cx−OP]y−Dプロドラッグを得るステップ;
(iii)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dを単離CD10及び/又はTOPペプチダーゼと、及び単離FAP及び/又はDPIVペプチダーゼと37℃で3時間〜24時間接触させるステップ;
(iv)プロドラッグ[Cx−OP]y−Dから遊離薬物Dへの変換を決定するステップ;
(v)(iv)から、少なくとも50%がDに変換されるプロドラッグ[Cx−OP]y−Dを同定するステップ;及び
(vi)ステップ(v)で同定された[Cx−OP]y−Dを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。 - 前記キャッピング基Cがホスホノアセチル基である、請求項19〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬物Dが、メイタンシン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン(campthothecin)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、メトトレキサート(methothrexate)、アミノプテリン、アムルビシン、又はそのいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項19〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカー又はスペーシング基が、存在する場合、自己脱離リンカー又はスペーシング基である、請求項19〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は請求項9若しくは10に記載の組成物を含む容器を含むキット。
- 同じ容器又は1つ以上の別個の容器に、1つ以上のさらなる抗癌薬をさらに含む、請求項27に記載のキット。
- 前記さらなる抗癌薬が抗体又はその断片である、請求項28に記載のキット。
- 同じ容器又は1つ以上の別個の容器に、1つ以上の薬剤耐性克服剤をさらに含む、請求項27又は28に記載のキット。
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20220927 |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20221108 |
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C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20230124 |
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C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20230221 |
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C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20230221 |