JP6523965B2 - 最小毒性プロドラッグ - Google Patents

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Description

本発明は、癌の処置を目的とするオリゴペプチドプロドラッグの分野に関する。これらのプロドラッグが選択性であるためには、血中におけるプロドラッグの安定性を確保するための（オリゴ）ペプチド部分及び／又は保護キャッピング基の存在が必要である。さらに本発明は、詳細には、例示的オリゴペプチド部分ＡＬＧＰ及びそれを含むプロドラッグに関する。詳細には、本発明はまた、キャッピング基ホスホノアセチル及びこのキャッピング基を含むプロドラッグにも関する。
癌の治療は、依然として今日の医学の重要課題の一つである。この問題を克服することができるのは、併用療法手法のみであろう。これには、手術、古典的化学毒性化学療法、分子標的薬物及び免疫療法が含まれ得る。
化学毒性薬物の使用における主要な問題点は、癌細胞に対するその選択性が低く、用量制限的且つ致死的な毒性の副作用が引き起こされることである。最も一般的な急性毒性は骨髄毒性であり、これは重篤な白血球減少症及び血小板減少症を引き起こす。一般的に使用される薬物のいくつかは、より特殊な毒性も有する。アントラサイクリン系薬物のドキソルビシン（Ｄｏｘ）は、重度の骨髄毒性に加えて重度の心毒性を生じさせるかかる化学毒性薬物である。こうした毒性により、累積用量が５００ｍｇ／ｍ２を超えるその使用は制限される。
薬物の腫瘍特異性を高めるために用いられる手法は、（ｉ）腫瘍認識分子（例えば受容体リガンド；例えば、非特許文献１を参照）とのコンジュゲーション、又は（ｉｉ）腫瘍細胞が優先的に分泌又は産生するプロテアーゼによって腫瘍細胞のすぐ近くで優先的に切断されるペプチドとのコンジュゲーションである。
腫瘍特異的オリゴペプチドプロドラッグ、例えばドキソルビシンのプロドラッグが開発されている。先行研究とは対照的に、これらのペプチドプロドラッグは細胞膜に対して不透過性であるように設計され、血中で安定に保たれる一方で、固形腫瘍の細胞外間隙に放出されたペプチダーゼにより切断されて活性薬物となる。これらの活性化ペプチダーゼは必ずしも腫瘍特異的なわけではないが、これらのペプチドが固形腫瘍の細胞外間隙に過剰分泌され、且つ癌細胞浸潤及び転移において重要な役割を果たす限りにおいて、薬物選択性を高めることができる。この手法の独創性は、単一の周知の酵素を標的とするのでなく、培養下に維持されるヒト腫瘍細胞によって排出されることが認められた全ての酵素活性を標的としたことである。Ｎ−スクシニル−β−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−ドキソルビシン（Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘ）は、かかる候補プロドラッグとして選択された（非特許文献２）。コンジュゲートされていないドキソルビシンと比較して、このプロドラッグは毒性がマウスにおいて約５分の１、及びイヌにおいて３分の１である。Ｄｏｘと比べてＳｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘによる慢性的な処置は、ラットにおいて最大８倍高い用量で心臓毒性が有意に低いことが分かった。Ｄｏｘと比べたＳｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘの活性の向上が、いくつかの腫瘍異種移植モデルにおいて観察された（非特許文献３；非特許文献４）。後に、腫瘍細胞馴化培地及び腫瘍細胞で、Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘの活性化因子として２つの酵素、ＣＤ１０（ネプリライシン又はＣＡＬＬＡ抗原）及びｔｈｉｍｅｔオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）が同定されており（非特許文献５；非特許文献６）、しかし他の同定されていないプロテアーゼもまた、この活性化プロセスに関与し得る。
バイオ製薬会社ＤＩＡＴＯＳ ＳＡによって、Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘの第Ｉ相臨床試験が開始された。Ｄｏｘと比較して３倍高い用量で骨髄毒性が起こった。極めて高い累積用量であっても（２７５０ｍｇ／ｍ２）、薬物に関連する重篤な心臓有害事象は報告されなかった。評価可能患者の５９％について臨床的有益性が観察された（非特許文献７、未発表）。
Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘの主な限界は、白血球減少が依然として重大な毒性であること、及び実験的により高い抗腫瘍活性を観察し得るのが、なおも重大な骨髄毒性という代償を払うときに限られることである。かかる骨髄毒性は、Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘのペプチド部分が正常組織に存在する酵素による加水分解に対して感受性を有するために起こるものと思われる。
特許文献１は、ＣＤ１０により切断可能な３〜６アミノ酸オリゴペプチドを含んで設計された化学療法プロドラッグを特に開示している。特許文献２は、ＴＯＰにより切断可能な３アミノ酸オリゴペプチドを含むプロドラッグ、及びＣＤ１０により切断可能でないアミノ酸オリゴペプチド（Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）を含む少なくとも１つのプロドラッグを開示している。特許文献３及び特許文献４は、定位置に遺伝的に非コードのアミノ酸を含む４〜２０アミノ酸オリゴペプチドであって、ＴＯＰにより切断可能なオリゴペプチドを含むプロドラッグを開示している。特許文献４では、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕオリゴペプチドを含む少なくとも１つのプロドラッグが、ＣＤ１０のタンパク質分解作用に抵抗性を示すことが報告された。特許文献５は、固定されたイソロイシンを含む３〜４アミノ酸オリゴペプチドであって、好ましくはＴＯＰに対して抵抗性のオリゴペプチドを含むプロドラッグを開示している；ＣＤ１０に対する感受性又は抵抗性に関する情報は提供されていない。それ自体末端基に結合している（少なくとも２アミノ酸の）オリゴペプチドに薬物が結合したものからなるプロドラッグのより一般的な概念が、特許文献６に開示され、これは後に特許文献７で拡張された。
非薬物部分が少なくとも水溶性ポリマーと、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の作用により選択的に切断可能なペプチド（４〜５個の天然又は非天然アミノ酸を含む）とを含む他のポリマー薬物コンジュゲートが、特許文献８に開示されている。特許文献９は、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）により活性化可能な抗腫瘍性プロドラッグに着目している；このプロドラッグは、環状アミノ酸を定位置に含む４〜９アミノ酸のオリゴペプチドを含む。特許文献１０は、プロドラッグに存在する１０アミノ酸未満のオリゴペプチドにおいて前立腺特異的抗原によるタンパク質分解切断が可能なプロドラッグを開示している。
特許文献１１は、ＦＡＰαにより切断可能な（ｓｃｉｓｓａｂｌｅ）プロドラッグＡｌａ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン及びＬｙｓ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリンを明らかにしている。特許文献１２は、ＦＡＰαにより切断可能な（ｓｃｉｓｓａｂｌｅ）プロドラッグに着目するもので、ＣＤ２６（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対するタンパク質分解感受性（ＣＤ２６は非悪性細胞にも比較的豊富に存在するため、これは望ましくないと考えられる）に関するさらなる実験的研究をいくつか含んでいる。
ＦＡＰαにより活性化可能な他のプロドラッグには、プロメリチン毒素（非特許文献８）、ドキソルビシン（非特許文献９）、タプシガルギン（非特許文献１０）、及び環状アミノ酸を定位置に含む４〜９アミノ酸のオリゴペプチドを含むプロドラッグ（特許文献９）が含まれる。
特許文献１３は、ＭＭＰにより切断可能であるもののネプリライシン（ＣＤ１０）には抵抗性の、３〜８アミノ酸オリゴペプチドを含むドキソルビシンプロドラッグを開示している（同公報の実施例１００１を参照）。メタロプロテイナーゼ感受性及びプラスミン感受性ドキソルビシンプロドラッグ、並びにドキソルビシンとのＣＮＧＲＣ−ペプチドコンジュゲートが開発されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。
特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７及び特許文献１８は、ペプチドを含むプロドラッグを開示し、このペプチドは前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）により切断可能である。
上記のプロドラッグの全てに共通することは、通常オリゴペプチドのＮ末端側に共有結合する保護部分又はキャッピング部分の存在であり、これはプロドラッグの安定性を高め、及び／又はプロドラッグが標的細胞などの細胞内にインターナライズされないように促進する。かかる保護部分又はキャッピング部分には、非天然アミノ酸、β−アラニル基又はβ−スクシニル基が含まれる（例えば特許文献６、特許文献１９）。さらなる安定化保護部分又はキャッピング部分には、ジグリコール酸、マレイン酸、ピログルタミン酸、グルタル酸（例えば、特許文献３）、カルボン酸、アジピン酸、フタル酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸（ｎａｐｈｔｙｌｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、アコニット酸、カルボキシケイ皮酸、トリアゾールジカルボン酸、ブタンジスルホン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその類似体（例えば、特許文献４）、酢酸、１−又は２−ナフチルカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、ポリエチレングリコール酸、ニペコ酸、及びイソニペコ酸（例えば、特許文献２、特許文献１）、コハク酸化ポリエチレングリコール（例えば、特許文献７）が含まれる。１，２，３，４シクロブタンテトラカルボン酸である新しい種類の保護部分又はキャッピング部分が、特許文献２０に紹介された。特許文献８の保護部分又はキャッピング部分は、ポリグルタミン酸、カルボキシル化デキストラン、カルボキシル化ポリエチレングリコール、又はヒドロキシプロリル−メタクリルアミド若しくはＮ−（２−ヒドロキシプロリル）メタクリロイルアミドをベースとするポリマーであり得る。
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Ｓａｆａｖｙ ｅｔ ａｌ．１９９９−Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４２，４９１９−４９２４ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４４：３７５０−３ Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２：２３２７−３１ Ｒａｖｅｌ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４：１２５８−６５ Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：５５２６−３１ Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４２：３０４９−５６ Ｄｅｌｏｒｄ ｅｔ ａｌ． ＬｅＢｅａｕ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ８，１３７８−１３８６ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ １９，４８７−４９６ Ｂｒｅｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０４，１３２０−１３３４ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２０，８５３−８５６ Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２６，６３８−６４４ Ｄｅｖｙ ｅｔ ａｌ．２００４，ＦＡＳＥＢ Ｊ １８，５６５−５６７ Ｖａｎｈｅｎｓｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６３，８９７−９０８
本発明のプロドラッグは、一般構造：
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰはオリゴペプチド部分であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、ここでそれらのＯＰ部分の１つは直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してＤに結合している。或いは、複数のＯＰ部分はそれぞれが独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してＤに結合する。複数のＯＰ部分の一部が独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してＤに結合し、且つ複数のＯＰ部分の一部がそれら自体それぞれ独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、それらのＯＰ部分の１つが直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してＤに結合している中間立体配座が含まれる）
又はその薬学的に許容可能な塩を有する。
詳細には、上記の構造のオリゴペプチド部分は、ＡＬＧＰ（１文字記号；配列番号１）とも称される配列Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（３文字記号）；又はＡＬＡＬ（１文字記号；配列番号２）とも称されるＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（３文字記号）を有するテトラペプチド部分であり、及び／又は上記の構造のキャッピング基Ｃはホスホノアセチル基であり、及び／又は上記の構造の薬物はドキソルビシン（以下ではＤＯＸ又はＤｏｘとも称される）である。或いは、テトラペプチドの構造は、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）である。従って、一実施形態において上記の一般構造におけるテトラペプチドの構造は、ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、及びＫＬＫＰ（配列番号１０）からなる群から選択される。詳細には、上記の一般構造におけるテトラペプチドは、ＡＬＧＰ（配列番号１）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）から選択される；さらにより詳細には、上記の一般構造におけるテトラペプチドはＡＬＧＰ（１文字記号；配列番号１）である。存在するとき、上記のプロドラッグ又はその塩における前記リンカー又はスペーシング基は自己脱離リンカー又はスペーシング基であってもよい。
上記の１つ又は複数のプロドラッグの薬学的に許容可能な塩もまた本発明の一部である。
本発明はさらに、上記のプロドラッグ又はその塩のうちの１つ、又はそのいずれかの組み合わせと、溶媒、希釈剤又は担体のうちの少なくとも１つとを含む組成物に関する。
本発明は、癌の処置で用いられる上記のプロドラッグ若しくはその塩、又はそれを含む上記の組成物を包含する。癌を処置する方法もまた本発明の一部であり、前記方法は、癌を有する対象に前記プロドラッグ若しくはその塩又は前記組成物を投与することを含み、前記投与は前記癌の処置をもたらす。詳細には、前記プロドラッグ若しくはその塩、又は前記組成物の有効量は、重篤な白血球減少症又は心毒性を引き起こさない。
上記のプロドラッグを作製する方法が、本発明のさらなる一部であり、前記方法は以下のステップを含む：
（ｉ）薬物を入手するステップ；
（ｉｉ）薬物を、キャッピングされたオリゴペプチド部分に結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ；又は、それに代えて、
（ｉｉ’）薬物をオリゴペプチド部分に結合させて、次にそのオリゴペプチド部分にキャッピング基を結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）又は（ｉｉ’）で得られたプロドラッグを精製するステップ。
本発明は、候補プロドラッグを作製及びスクリーニングする方法をさらに含み、かかる候補プロドラッグは一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；詳細には、ＯＰは、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；さらにより詳細には、ＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し、及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有し；及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物ＤをＧＰ−、ＡＰ−又はＫＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりジペプチド−薬物中間体プロドラッグとしてＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを得るステップ；
（ｉｉｉ）薬物Ｄ及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
（ｉｖ）薬物Ｄ及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに対応する［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
或いは、前記スクリーニング方法には、候補プロドラッグをスクリーニングする方法があり、調べる候補が一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、カルボキシ末端プロリンを含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり、前記プロリンは、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Ｄに結合し；詳細には、ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；より詳細には、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；さらにより詳細には、ＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有し；及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）薬物Ｄ及びプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
（ｉｖ）薬物Ｄ及びプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
別の代替例では、前記スクリーニングは、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、カルボキシ末端プロリンを含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり、前記プロリンは、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Ｄに結合し；詳細には、ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；より詳細には、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；さらにより詳細には、ＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり；
前記方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄをインビトロ培養細胞と３７℃で５時間接触させるステップ；
（ｉｖ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
さらに別の代替例において、前記スクリーニング方法には、候補プロドラッグをスクリーニングする方法があり、調べる候補が一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；より詳細には、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；さらにより詳細には、ＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有し；及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物ＤをＧＰ−、ＡＰ−又はＫＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間接触させるステップ；
（ｉｖ）プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるプロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたプロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに対応する［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
さらに想定される前記スクリーニングは、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、カルボキシ末端プロリンを含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり、前記プロリンは、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Ｄに結合し；詳細には、ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；より詳細には、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；さらにより詳細には、ＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法を含み；
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを単離ＣＤ１０及び／又はＴＯＰペプチダーゼと、及び単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間〜２４時間接触させるステップ；
（ｉｖ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
上記の代替的スクリーニング方法のいずれにおいても、前記キャッピング基Ｃはホスホノアセチル基であってよい。
上記の代替的スクリーニング方法のいずれにおいても、前記薬物Ｄは、メイタンシン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｈｏｔｈｅｃｉｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、アミノプテリン、アムルビシン、又はそのいずれかの誘導体からなる群から選択され得る。
上記の方法において、及び存在するとき、前記リンカー又はスペーシング基は自己脱離リンカー又はスペーシング基であってもよい。
本発明はさらに、上述のプロドラッグ若しくはその塩を含むか、又はかかるプロドラッグ若しくはその塩を含む組成物を含む容器を含むキットに関する。
ＰｈＡｃ−ペプチド−ＤｏｘコンジュゲートがＯＦ−１正常マウス（ｎ＝４）の体重に及ぼす効果。薬物又は対照を０日目に静脈内経路によって投与した。マウスは一定体積（１０μＬ／ｇ）の生理食塩水（−黒丸−）或いは種々の投与溶液：ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ ８０μｍｏｌ／Ｋｇ（−黒三角形−）及び１６０μｍｏｌ／ｋｇ（−×−）；ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ ２４０μｍｏｌ／ｋｇ（−＊−）及び３２０μｍｏｌ／ｋｇ（−白丸−）の投与を受ける。結果は平均体重の進展を表す。 ＬＳ１７４Ｔ結腸癌ヒト異種移植片を有するＮＭＲＩヌードマウスにおける遊離ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性試験。薬物又は対照を０日目及び７日目に静脈内経路によって投与した。マウスは一定体積（１０μＬ／ｇ）の生理食塩水（−黒丸−；−白丸−）或いは種々の投与溶液：ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ １４０μｍｏｌＫｇ（−黒三角形−）及び１６０μｍｏｌ／ｋｇ（−×−）；Ｄｏｘ １５μｍｏｌ／ｋｇ（−黒ひし形−）の投与を受ける。結果は平均体重及び腫瘍体積の進展±ＳＥＭ（ｎ＝４）を表す。 ＭＸ−１乳癌ヒト異種移植片を有するＮＭＲＩヌードマウスにおける遊離ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性試験。薬物又は対照を０、３、６及び９日目に静脈内経路によって投与した。マウスは一定体積（１０μＬ／ｇ）の生理食塩水（−黒丸−）或いは種々の投与溶液：ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ １００μｍｏｌＫｇ（−＊−）；及びＤｏｘ ８μｍｏｌ／ｋｇ（−黒四角形−）の投与を受ける。結果は平均体重及び腫瘍体積の進展±ＳＥＭ（ｎ＝４）を表す。 ＯＦ−１雌性野生型マウスに８６．２μｍｏｌ／ｋｇの用量で静脈内ボーラス注射した後のドキソルビシン又はＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ及びその代謝産物の血漿中濃度（Ａ、Ｂ）及び心臓組織内濃度（Ｃ、Ｄ）の経時的進展。結果は平均濃度±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。 Ｃｏｒ．Ａｔ（登録商標）細胞（マウス胚性幹細胞由来心筋細胞）に対するＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンのインビトロ細胞毒性。非特異的対照として、不活性化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）に対しても試験を行った。薬物の存在下で細胞を４８時間培養し、ニュートラルレッド取り込み試験を実施して細胞生存を決定した。結果は細胞毒性曲線を表す。Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア５．０を使用して、細胞毒性曲線からＩＣ５０値を計算した。 ＬｏＶｏ結腸癌異種移植片を有するＮＭＲＩヌードマウス（各群３匹のマウス）に静脈内注射によって漸増濃度（１５、３５、５０、１００、２００、３００、４６０、６２０μｍｏｌ／ｋｇ）のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを投与した。２４時間後、マウスを犠牲にし、腫瘍を採取した。ＨＰＬＣ分析による抽出後、腫瘍内ドキソルビシン濃度を決定した。結果は平均腫瘍内ドキソルビシン濃度（ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質）±ＳＤを表す。 ＯＦ−１マウスにおける単回及び複数回腹腔内（ｉｐ）注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの毒性研究。動物を、以下の種々の処置スケジュールによってＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘで処置した：５６μｍｏｌ／ｋｇ ５回（Ｑ１Ｄ５ −＊−）；２８μｍｏｌ／ｋｇ １０回（２Ｑ１Ｄ５ −黒四角形−）；５６０μｍｏｌ／ｋｇ １回（−白四角形−）；１１２μｍｏｌ／ｋｇ ５回（Ｑ１Ｄ５ −黒三角形−）；５６μｍｏｌ／ｋｇ １０回（２Ｑ１Ｄ５ −×−）。 ＯＦ−１雌性野生型マウスに９２μｍｏｌ／ｋｇの等モル用量で腹腔内注射した後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ及びその代謝産物（Ａ）又はドキソルビシン（Ｂ）の血中濃度の経時的進展。結果は平均濃度±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。 ＬｏＶｏ結腸癌ヒト異種移植片を有するＮＭＲＩヌードマウスにおける遊離ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性試験。薬物又は対照を１日２回５日連続で腹腔内経路によって投与した（矢印）。マウスは一定体積（１０μＬ／ｇ）の生理食塩水（−黒丸−）或いは種々の投与溶液：ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ ２５μｍｏｌ／ｋｇ（＊）、３５μｍｏｌ／ｋｇ（白丸）及び５０μｍｏｌ／ｋｇ（＋）；Ｄｏｘ ０．５μｍｏｌ／ｋｇ（黒四角形）、１μｍｏｌ／ｋｇ（黒三角形）及び２μｍｏｌ／ｋｇ（×）の投与を受ける。結果は平均体重及び腫瘍体積の進展±ＳＥＭ（ｎ＝４）を表す。＊＊ Ｄｏｘ ２μｍｏｌ／ｋｇとｐ＜０．０５で統計的に差がある（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアのマンホイットニーｔ検定）。 ＭＸ−１乳癌ヒト異種移植片を有するＮＭＲＩヌードマウスにおける遊離ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性試験。薬物又は対照を１日２回５日連続で腹腔内経路によって投与した（矢印）。処置は、２つのサイクル間に７２時間を置いて繰り返した。マウスは一定体積（１０μＬ／ｇ）の生理食塩水（黒丸）或いは種々の投与溶液：ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ ５０μｍｏｌ／ｋｇ（白丸）、Ｄｏｘ １μｍｏｌ／ｋｇ（黒四角形）、及び１．５μｍｏｌ／ｋｇ（黒三角形）の投与を受ける。結果は平均体重及び腫瘍体積の進展±ＳＥＭ（ｎ＝６）を表す。†＝死亡マウス。 Ｂ１６−Ｆ１０肺転移性メラノーマモデルにおけるドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性評価。左側のグラフは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の注射後１４日目における肺転移のメラニンの定量化を表す。右側のグラフは生存曲線を示す。 ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの白血球減少効果の評価。ＣＤ１マウスがＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ ３５μｍｏｌ／ｋｇ（白丸）又はドキソルビシン ３．５μｍｏｌ／ｋｇ（黒四角形）の１日２回の腹腔内注射を５日連続で受けた。マウスの体重の進展を記録した（Ａ）。処置開始後４、１１及び１５日目に、血液を尾静脈からヘパリン処理済Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓチューブ（Ｓｔａｒｓｔｅｄ）に採取した。末梢白血球（ＷＢＣ）を、ＳＣＩＬｖｅｔ ａｂｃ血液分析器を使用してカウントした（Ｂ）。各マウスについて、ＷＢＣの増加又は減少を０日目のＷＢＣ（１００％）に対する割合として表す。曲線は、平均割合の進展を示す。 ＣＤ−１マウスにおけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの慢性心毒性の評価。動物は、生理食塩水（黒丸）；ドキソルビシン ６．９μｍｏｌ／ｋｇ（黒四角形）又はＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ １３．８（黒三角形）、２７．６（×）、５５．２（＊）及び８２．８μｍｏｌ／ｋｇ（白丸）の静脈内注射（矢印）を１０回受けた。結果は平均相対体重（％）の進展を表す。†＝死亡マウス。 同所性ＨＣＴ１１６ヒト結腸腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘの抗腫瘍効果の評価。ＳＣＩＤマウスにヒトＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞を（盲腸内に）同所性に注入した。１つの群は生理食塩水で処置し、一方、群２及び群３は、３５及び５０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンの腹腔内注射を１０回受けた（２Ｑ１Ｄ５）。細胞接種後３４日目に原発腫瘍重量を記録した。 同所性ＨＣＴ１１６ヒト結腸腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘの（肝臓における）抗転移効果の評価。ＳＣＩＤマウスにヒトＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞を（盲腸内に）同所性に注入した。１つの群は生理食塩水で処置し、一方、群２及び群３は、３５及び５０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンの腹腔内注射を１０回受けた（２Ｑ１Ｄ５）。細胞接種後３４日目に肝転移を記録した。 ＵＺＬＸ−ＳＴＳ３異種移植モデルに対するＰｈＡｃ−ＡＬＧＰの効果。ＵＺＬＸ−ＳＴＳ３は、脱分化型脂肪肉腫（ＤＤＬＰＳ）と診断された患者に由来する組織異種移植片である。継代中、前のマウス腫瘍は、手術中に患者から採取した当初の生検と同じ形態及び分子特徴（即ちＭＤＭ２遺伝子増幅、ＭＤＭ２免疫陽性）を明らかにした。潅流による投与でない以前の異種移植片では、この肉腫腫瘍モデルは、最大耐量で投与した遊離ドキソルビシンに対して完全に抵抗性であった。 合計２４匹のマウスにＵＺＬＸ−ＳＴＳ３（継代１０代の組織異種移植片）を両側性に移植した。動物を３つの異なる群に無作為に割り当てた：対照群（生理食塩水；−黒丸−）；ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシン群（累積用量１．２０ｍｍｏｌ／ｋｇ；−黒四角形−）及びドキソルビシン群（累積用量０．０３ｍｍｏｌ／ｋｇ；−黒三角形−）。薬物は、７日間、Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプを介した連続放出により０．５μｌ／ｈの送達速度で７日間にわたり腹腔内投与した。実験は２１日間継続した（処置７日間＋観察１４日間）。腫瘍体積及びマウス体重をベースラインで評価し、続いて週３回、各実験の終了時まで評価した。２１日後、マウスを犠牲にした。腫瘍体積は三次元ノギス測定により毎週３回記録する。データは各群の相対腫瘍体積平均値±標準偏差として提供する。 ウィルコクソンのマッチドペア検定により０日目の腫瘍体積と実験最終日の体積との比較を行った。マン−ホィットニーＵ検定を用いて種々の群間の比較を実施した（相対腫瘍体積、組織学的評価）。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意な差があると見なした。全ての計算にＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ、バージョン１２．０）を使用した。 図１６に示す実験の動物の相対体重の進展。データは各群のマウスの相対体重平均値±標準偏差として提供する。破線はｎｕ／ｎｕ ＮＭＲＩマウス系統の基準値を示す。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシン（−黒四角形−）；Ｄｏｘ（−黒三角形−）；及び生理食塩水（−黒丸−）。 図１６に示す実験の動物の総白血球数（１０３／μＬ）の進展。データは各群のマウスの白血球数平均値±標準偏差として提供する。破線はｎｕ／ｎｕ ＮＭＲＩマウス系統の基準値を示す。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシン（−黒四角形−）；Ｄｏｘ（−黒三角形−）；及び生理食塩水（−黒丸−）。総白血球数は、マウスの血液パラメータに最適化したＣＥＬＬ−ＤＹＮ ３５００多パラメータ自動血液分析器（Ａｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＩＬ，米国）を使用して決定した。 図１６に示す実験の動物の総好中球数（１０３／μＬ）の進展。データは各群のマウスの好中球数平均値±標準偏差として提供する。破線はｎｕ／ｎｕ ＮＭＲＩマウス系統の基準値を示す。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシン（−黒四角形−）；Ｄｏｘ（−黒三角形−）；及び生理食塩水（−黒丸−）。好中球数は、マウスの血液パラメータに最適化したＣＥＬＬ−ＤＹＮ ３５００多パラメータ自動血液分析器（Ａｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＩＬ，米国）を使用して決定した。
概して、本発明は、治療特性の向上を呈する治療剤の新規プロドラッグ化合物、特に抗腫瘍治療剤を含むプロドラッグを記載する。治療特性の向上には、毒性の低下及び有効性の増加が含まれる。詳細には、本プロドラッグは高い作用特異性、毒性の低下、血清中及び血中での安定性の向上を呈し、且つこれらの治療剤は、標的細胞に関連する１つ又は複数の酵素、例えば標的細胞から放出される細胞外ペプチダーゼ、又は標的細胞の細胞外表面に関連するものによってプロドラッグが最終的に活性化されるまで（この活性化には複数のステップが関わり得る）標的細胞に入り込まない。標的細胞には、癌細胞並びに腫瘍間質細胞が含まれる。本発明のプロドラッグ化合物は、治療剤がオリゴペプチドに直接的又は間接的に結合し、次にはオリゴペプチドが安定化キャッピング基に結合した、プロドラッグ形態の治療剤である。
概して、本発明のプロドラッグは以下の一般構造：
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰはオリゴペプチド部分であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、ここでそれらのＯＰ部分の１つは直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してＤに結合している。換言すれば、複数のＯＰ部分は共に結合することにより、ＯＰ部分の１つを介して直線状又は分枝状構造でＤに結合した直線状又は分枝状構造を形成し得る。或いは、複数のＯＰ部分はそれぞれ独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してＤに結合する。複数のＯＰ部分の一部がそれぞれ独立に、直接か、リンカーを介するか、又はスペーシング基を介してＤに結合し、且つ複数のＯＰ部分の一部がそれら自体独立に上記に記載したとおり互いに結合することにより、それらのＯＰ部分の１つが直接か、リンカーを介するか又はスペーシング基を介してＤに結合した直線状又は分枝状構造を形成する中間立体配座が含まれる）
又はその薬学的に許容可能な塩を有する。
明確にするため、及び網羅的ではなしに、ｙ＝２のとき、以下のプロドラッグは一般構造：Ｃ−ＯＰ−Ｄ−ＯＰ−Ｃ；Ｃ−ＯＰ−ＯＰ−Ｄ及びＣ−ＯＰ−Ｄ−ＯＰに含まれる。従って、複数のオリゴペプチド部分ＯＰを含むプロドラッグ化合物／分子の場合、１つ以上のオリゴペプチド部分ＯＰ上に（上記に記載したとおり直接的又は間接的な結合を介して）キャッピング基Ｃが存在し得る。
一実施形態において、オリゴペプチド部分は、カルボキシ末端プロリンを含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり、前記プロリンは、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Ｄに結合する。限定されるものではないが、本発明者らの理解では、このオリゴペプチド部分は二段階プロセスで薬物Ｄから切断／除去され、第１段階で前記プロドラッグがジペプチド−薬物中間体に変換され、第２段階でジペプチド−薬物中間体が遊離薬物Ｄに変換される。詳細な実施形態において、ジペプチド−薬物中間体に残るジペプチドは配列グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、又はリジン−プロリン（ＫＰ）を有する。従って、本発明の目的は、上述の一般式を有するプロドラッグ（ｐｒｏｄｕｇ）であって、ＯＰが、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）を表し、前記ジペプチドを含むプロリンのプロリンが直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して薬物Ｄに結合するプロドラッグを提供することである。
詳細には、上記の構造のオリゴペプチド部分は、ＡＬＧＰ（１文字記号；配列番号１）とも称される配列Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（３文字記号）；又はＡＬＡＬ（１文字記号；配列番号２）とも称されるＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（３文字記号）を有するテトラペプチド部分であり、及び／又は上記の構造のキャッピング基Ｃはホスホノアセチル基であり、及び／又は上記の構造の薬物はドキソルビシン（以下ではＤＯＸ又はＤｏｘとも称される）である。或いは、テトラペプチドの構造は、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）である。従って、一実施形態において上記の一般構造におけるテトラペプチドの構造は、ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、及びＫＬＫＰ（配列番号１０）からなる群から選択される。詳細には、上記の一般構造におけるテトラペプチドは、ＡＬＧＰ（配列番号１）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）から選択される；さらにより詳細には、上記の一般構造におけるテトラペプチドはＡＬＧＰ（１文字記号；配列番号１）である。本発明の好ましい実施形態において、上記の一般構造における薬物（Ｄ）はドキソルビシン又はその薬学的に許容可能な塩である。
詳細には、プロドラッグは、化合物Ｉの構造（実施例３．１を参照）を有し得るか、又はその薬学的に許容可能な塩であり得る。キャッピング基ホスホノアセチルは、オリゴペプチドの末端端部における非天然アミノ酸の使用が回避されるという利点をもたらす。薬物Ｄがドキソルビシンであるとき、キャッピング基Ｃとしてのホスホノアセチルには、ドキソルビシンのオリゴペプチド誘導体の凝集を回避するために重要な負電荷を提供するというさらなる利点がある。概して、本発明のプロドラッグの安定性は、プロドラッグをヒト血液中で２時間より長くインキュベートしたときに得られる切断誘導体が１０％未満であるものと定義することができる。
キャッピング基Ｃ、オリゴペプチド部分ＯＰ及び薬物の上記の定義にも関わらず、それらは本発明を限定するものではなく、本発明によって他の組み合わせが想定される。これらの組み合わせには、任意のＯＰ及び／又はＤと、キャッピング基Ｃがホスホノアセチル基であるものが含まれる。さらなる組み合わせには、任意のＣ（当該技術分野において公知の任意のキャッピング基）及び／又は任意のＤと、オリゴペプチド部分ＯＰが配列Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（３文字記号）又はＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（３文字記号）又はＡＬＧＰ（１文字記号；配列番号１）又はＡＬＡＬ（１文字記号；配列番号２）を有するテトラペプチド部分であるものが含まれる。或いは、テトラペプチドの構造は、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）である。さらなる代替例では、テトラペプチドの構造は、ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）である。詳細には、上記の一般構造におけるテトラペプチドは、ＡＬＧＰ（配列番号１）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）から選択される；さらにより詳細には、上記の一般構造におけるテトラペプチドはＡＬＧＰ（１文字記号；配列番号１）である。
薬物の構造／化学式に応じて、本発明のオリゴペプチド部分の１つ又は複数（そのうち、その少なくとも１つがキャッピングされている）が薬物に結合していてもよい。オリゴペプチド部分はそれら自体が、薬物に結合した直線状又は分枝状構造を形成することができ、又は、それに代えて、複数のオリゴペプチド部分がそれぞれ独立に薬物に結合する。
キャッピング基又は保護部分若しくはキャッピング部分はプロドラッグのオリゴペプチド部分に結合し、プロドラッグの（例えば、動物、哺乳類、ヒト又はプロドラッグを投与する対象の血中での）溶解性及び／又は安定性を高め、及び／又はプロドラッグが標的細胞などの細胞内にインターナライズされないように促進する。
キャッピング基とオリゴペプチドとの間及び／又はオリゴペプチドと治療剤又は薬物との間の結合は、直接か、例えばオリゴペプチドのＮ末端アミノ基を介するか、又はオリゴペプチドのＣ末端カルボキシル基を介するか、又はオリゴペプチドのアミノ酸のうちの１つの側鎖を介し得る。
或いは、前記結合は、例えばオリゴペプチドＯＰと薬物Ｄとの間にリンカー又はスペーサー基を導入することにより、間接的であってもよい。ドキソルビシンなどの、遊離アミノ（ＮＨ２）基を有する細胞毒性化合物の場合、ＤとＯＰとの間のリンカーそれ自体は、ＤとＯＰとの間のアミド結合の酵素的切断が細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃ）薬物上の遊離ＮＨ２基を確実に利用可能にするため不要である。
しかしながら、抗癌性細胞毒性薬物Ｄのほとんどは遊離ＮＨ２基を持たず、そのためアミド結合によりＯＰに結合することができない。それらの分子にＮＨ２基を導入すると、その細胞毒性活性が低下し又は抑制され得る。かかる薬物については、自己犠牲（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ）（又は自己脱離（ｓｅｌｆ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）、自己犠牲（ｓｅｌｆ−ｓａｃｒｉｆｉｃｉｎｇ）、自己溶解、又は自己脱離（ｓｅｌｆ−ｌｅａｖｉｎｇ））スペーシング基又はスペーサーを、薬物ＤとオリゴペプチドＯＰとの間のリンカーとして使用することができる。ＯＰは、プロドラッグを活性化させる能力を有する細胞外酵素に感受性を有するアミド結合によって自己犠牲スペーサーに結合される。ＯＰとスペーサーとの間のアミド結合の切断後、自己犠牲スペーサーがそれ自体を薬物から切断すると、薬物が誘導体化されないまま残り、即ちその元の活性型のまま残る。自己犠牲性スペーサーは、一方で薬物の−ＯＨ基、−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ基、又は−ＳＨ基のいずれかを、他方でペプチドのカルボキシ末端基につなげるパラアミノベンゾイルオキシカルボニル部分を含む。この種のリンカーは、電子的カスケードスペーサーである。かかる結合はペプチダーゼによって切断可能であることが示されている。ＯＰ−スペーサーアミド結合の切断後、自己脱離スペーサーの芳香族アミンが電子供与性になり、遊離薬物及びＣＯ２の排出及び放出が起こる（Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．１９８１，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２４，４７９−４８０；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２６，６３８−６４４；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４２，５２７７−５２８３，Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４５，４３３６−４３４３）。いくつかの特許及び特許出願が他の自己犠牲性／自己脱離スペーサーを記載しており、例えば、抗体などの標的リガンドから薬物を放出する複素環式のものなどが記載されている（例えば、米国特許第６，２１４，３４５号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１３０１８９号明細書；米国特許出願公開第２００３／００９６７４３号明細書；米国特許第６，７５９，５０９号明細書；米国特許出願公開第２００４／００５２７９３号明細書；米国特許第６，２１８，５１９号明細書；米国特許第６，８３５，８０７号明細書；米国特許第６，２６８，４８８号明細書；米国特許出願公開第２００４／００１８１９４号明細書；国際公開第９８／１３０５９号パンフレット；米国特許出願公開第２００４／００５２７９３号明細書；米国特許第６，６７７，４３５号明細書；米国特許第５，６２１，００２号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１２１９４０号明細書；国際公開第２００４／０３２８２８号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／００４１７９１号明細書）。
その他の、必ずしも自己脱離型ではないリンカー又はスペーサー基の例としては、アミノカプロン酸、ヒドラジド基、エステル基、エーテル基及びスルフヒドリル基が挙げられる。キャッピング基とオリゴペプチドとの間及び／又はオリゴペプチドと治療剤との間の上記に記載したとおりのリンカー又はスペーサー基は、以下のような理由で有利であり得る：（ｉ）立体を考慮する上でのスペーサーとして、治療剤に結合したアミノ酸の酵素的放出又は他の酵素的活性化ステップを促進するため；（ｉｉ）プロドラッグの異なる部分間に適切な結合ケミストリーを提供するため（従って本発明の任意の可能な薬物及び／又はキャッピング部分とオリゴペプチドとのカップリングに柔軟性がもたらされる）；（ｉｉｉ）プロドラッグコンジュゲートを作製する合成プロセスを（例えば、治療剤又はオリゴペプチドをリンカー基と予め誘導体化してからコンジュゲートして収率又は特異性を増強することにより）改善するため；（ｉｖ）プロドラッグの物理的特性を改善するため；又は（ｖ）薬物の細胞内放出に対するさらなる機構を提供するため。いかなる種類の（直接的又は間接的）結合も、結合は（１）オリゴペプチド部分の機能を妨げない又は著しく妨げないものでなければならず、即ち、ＴＯＰによるタンパク質分解切断能力も、ＣＤ１によるタンパク質分解切断能力に対する抵抗性も、いずれも著しく妨げてはならず、及び（２）化合物の血中安定性を保たなければならない。プロドラッグ中のキャッピングされたオリゴペプチド部分の機能の決定は、例えば以下の実施例の節に記載するとおり、容易に、且つ単純な方法で試験することができる。かかる試験が当業者にとって過度の負担となることはない。
語句「薬学的に許容可能な塩」は、本明細書で使用されるとき、意図される医学的用途に安全且つ有効な、所望の生物学的活性を有する本発明の化合物の塩を意味する。薬学的に許容可能な塩には、本発明の化合物中に存在する酸性基又は塩基性基の塩が含まれる。好適な塩基性塩としては、限定はされないが、アルミニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、及びジエタノールアミン塩が挙げられる。薬学的に許容可能な塩に関するレビューは、例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．１９７７（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６，１−１９）又はＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ，Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｅｄｓ．），Ａｕｇｕｓｔ ２００２）（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
本発明のオリゴペプチドとコンジュゲートされる薬物又は治療剤は、癌（例えば細胞毒性活性又は抗血管新生活性を及ぼすことにより）、炎症性疾患、又は他の何らかの医学的状態の処置に有用であり得る。本発明のオリゴペプチドとコンジュゲートされる薬物又は治療剤は、標的細胞に侵入する能力を有する任意の薬物又は治療剤であってよい。従って、治療剤は、抗生物質、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド類、エンジイン類、ポドフィロトキシン類又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン薬物ファミリー、タキサン類、アントラサイクリン類、ドラスタチン類、トポイソメラーゼ阻害薬、白金配位複合体化学療法剤、及びメイタンシノイド類を含む多くの化合物クラスから選択され得る。より詳細には、前記薬物又は治療剤は、以下の化合物、又はその誘導体若しくは類似体のうちの１つであってもよい：ドキソルビシン、ダウノルビシン、アムルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアマイシン、エトポシド、リン酸エトポシド、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキサート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキサート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン（ｅｐｉｔｈｉｏｌｏｎｅ）、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４リン酸、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンプトテシン、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、ハリコンドリンＢ、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロスポリンＡ、及びメイタンシン。誘導体とは、指名された化合物が別の化学的部分（その化合物に直接的又は間接的に結合されるオリゴペプチド部分とは異なる）と反応して生じる化合物を意図し、指名された化合物の薬学的に許容可能な塩、酸、塩基又はエステルが含まれる。他の治療剤又は薬物としては、以下が挙げられる：ビンデシン、ビノレルビン、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール、バッカチンＩＩＩ、７−キシロシルタキソール、イソタキセル、イホスファミド、クロロアミノフェン、プロカルバジン、クロラムブシル、チオホスホルアミド、ブスルファン、ダカルバジン（ＤＴｌＣ）、ゲルダナマイシン、ニトロソウレア、エストラムスチン、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、フォテムスチン、ストレプトニグリン、オキサリプラチン、メトトレキサート、アミノプテリン、ラルチトレキセド、ゲムシタビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、イリノテカン、トポテカン、９−ジメチルアミノメチル−ヒドロキシ−カンプトテシンヒドロクロリド、テニポシド、アムサクリン；ミトキサントロン；Ｌ−カナバニン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、イダルビシン、ルビダゾン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、エピアドリアマイシン（４’エピアドリアマイシン又はエピルビシン）、ミトキサントロン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤを含むアクチノマイシン、ストレプトゾトシン、カリケアマイシン；Ｌ−アスパラギナーゼ；ホルモン類；アロマターゼの純粋阻害薬；アンドロゲン類、プロテアソーム阻害薬；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬（ＦＴＩ）；エポチロン類；ディスコデルモリド；フォストリエシン；ＳＴＩ ５７１（メシル酸イマチニブ）などのチロシンキナーゼ阻害薬；受容体型チロシンキナーゼ阻害薬、例えば、エルロチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、カネルチニブ、ＰＫＩ １６６、ゲフィチニブ、スニチニブ、ラパチニブ、ＥＫＢ−５６９；Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害薬、例えば、ダサチニブ、ニロチニブ、イマチニブ；オーロラキナーゼ阻害薬、例えば、ＶＸ−６８０、ＣＹＣ１１６、ＰＨＡ−７３９３５８、ＳＵ−６６６８、ＪＮＪ−７７０６６２１、ＭＬＮ８０５４、ＡＺＤ−１１５２、ＰＨＡ−６８０６３２；ＣＤＫ阻害薬、例えば、フラボピリドール（ｆｌａｖｏｐｉｒｏｄｏｌ）、セリシクリブ、Ｅ７０７０、ＢＭＳ−３８７０３２；ＭＥＫ阻害薬、例えば、ＰＤ１８４３５２、Ｕ−０１２６；ｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ＣＣＩ−７７９又はＡＰ２３５７３；キネシン紡錘体阻害薬、例えば、イスピネシブ又はＭＫ−０７３１；ＲＡＦ／ＭＥＫ阻害薬、例えば、ソラフェニブ、ＣＨＩＲ−２６５、ＰＬＸ−４０３２、ＣＩ−１０４０、ＰＤ０３２５９０１又はＡＲＲＹ−１４２８８６；ブリオスタチン；Ｌ−７７９４５０；ＬＹ３３３５３１；エンドスタチン類；ＨＳＰ ９０結合剤ゲルダナマイシン、大環状ポリエーテル類、例えば、ハリコンドリンＢ、エリブリン。上記のリストに含まれる多くの化合物に関して、より実験的な指針を本明細書の実施例１６に提供する。本発明に包含されるドキソルビシン以外の薬物の中では、遊離ＮＨ２基を有するアントラサイクリン類似体であるアムルビシンが挙げられ（Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８９，１２２９−１２３８）、これはドキソルビシンに用いられるのと同じ方法で、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰなどのキャッピングされたオリゴペプチドに結合させることができる。哺乳動物に投与した後の本発明に係るプロドラッグの循環半減期を増加させるため、オリゴペプチド部分のアミノ−に対する１つ又は複数のポリエチレングリコール基の付加を実施してもよい。１つ又は複数のポリエチレングリコール基の付加はキャッピング剤の役割も果たし得る。
本発明のプロドラッグ又はその塩は、さらに、そのプロドラッグ又はその塩に加えて、好適な溶媒（プロドラッグを所望の程度に可溶化する能力を有する）、希釈剤（濃縮されたプロドラッグを所望の程度に希釈する能力を有する）又は担体（プロドラッグを吸収し、接着し又は組み込む能力と、続いて対象の体の細胞外コンパートメントに任意の速度でプロドラッグを放出する能力とを有する任意の化合物）のいずれか一つを含む組成物中に存在し得る。前記組成物は、或いは、複数の（即ち２つ以上の）プロドラッグ若しくはその塩、又はそれらの任意の組み合わせ（例えばプロドラッグ１＋その塩、プロドラッグ１＋プロドラッグ２、プロドラッグ１＋その塩＋プロドラッグ２等）を含み得る。詳細には、前記溶媒、希釈剤又は担体は薬学的に許容可能であり、即ち、本発明の組成物で処置する対象への投与が許容可能である。薬学的に許容可能な組成物の製剤化の助けとなるのは、例えば任意の薬局方ブックである。組成物は、それが頭蓋内、脊髄内、経腸及び非経口投与を含む任意の投与方法に好適となるように製剤化され得る。プロドラッグの投与レジメンは、例えば、キャッピング基が存在するか否かに応じて、製剤に応じて、処置する対象の全般的な健康状態に応じて、及び例えば処置を行う医師の判断に応じて異なり得る。
本発明のプロドラッグ若しくはその塩、又はそれを含む組成物は、放出される薬物による処置が可能な疾患の処置に特に好適である。特に関心となるのは、癌又は腫瘍、例えば固形腫瘍である。「癌」には、例えば、乳癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、例えば小細胞癌、非小細胞癌、気管支癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、及び膵癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌、膀胱癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、白血病、神経芽細胞腫、及び膠芽腫が含まれる。本発明のプロドラッグで処置する対象は、かかる処置を必要とする任意の哺乳動物であってよく、しかし詳細にはヒトである。この処置により、疾患の退行（例えば腫瘍体積又は腫瘍量及び転移が減少する点で）、予想される疾患の進行と比較した疾患の進行の低下、又は疾患の安定化（即ち疾患の退行も進行もない）がもたらされ得る。これらは全て、処置の良好な成果である。詳細には、前記プロドラッグ若しくはその塩、又は前記組成物の有効量は、重篤な白血球減少症又は心臓毒性／心毒性を引き起こさない。重篤なヒト白血球減少症の可能な定義は、ＷＨＯ基準の定義によるグレード３の白血球減少症（白血球数１０００〜１９００／ｍＬ）又はグレード４の白血球減少症（白血球数１０００未満／ｍＬ）である。
本発明に係る抗癌プロドラッグ（又はその塩）を併用療法に組み込むこともまた想定される。これは、集学的化学療法において、即ち抗癌プロドラッグ（又はその塩）を他の癌治療、例えば放射線療法（直接照射によるか、それとも同位体標識抗体又は抗体断片の投与を介するかに関わらず）又は手術と共に用いるものであってもよい。これはまた、併用化学療法において、即ち複数の異なる薬物であって、好ましくはその作用機序及びその副作用が異なる薬物で患者を処置するものであってもよい。通常、かかる併用化学療法では、薬物は同時に投与される。併用化学療法の利点は、任意の１つの薬剤に対して抵抗性を生じる可能性が最小限に抑えられることである。さらなる利点は、個々の薬物を各々より低い用量で使用することができ、従って全体的な毒性が低下し得ることであり得る。
本発明に係るプロドラッグ若しくはその塩、又はかかるプロドラッグ若しくは塩を含む組成物は、従って、疾患（例えば癌）の処置に、単剤療法として、又は併用化学療法処置又は集学的化学療法処置の一部として使用することができる。
より一般的には、併用化学療法との関連で、本発明に係る抗癌プロドラッグ（又はその塩）は、１つ以上のアルキル化抗悪性腫瘍剤及び／又は１つ以上の抗代謝産物及び／又は１つ以上の抗微小管剤及び／又は１つ以上のトポイソメラーゼ阻害薬及び／又は１つ以上の細胞毒性抗生物質及び／又は１つ以上の生物学的抗癌剤（抗体など）と併用することができ、ここで該当する場合、これらのうちの１つ以上が本発明に係るプロドラッグ（又はその塩）であってもまたよい。
薬物ドキソルビシン（商標名アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）又はルベックス（Ｒｕｂｅｘ）でもまた知られる）は、複数種の癌、例えば一部の白血病及びホジキンリンパ腫、並びに膀胱癌、乳癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、多発性骨髄腫などの癌の処置によく使用される。ドキソルビシンはさらに、種々の併用療法で使用される。ドキソルビシンを含む療法には、ＡＣ又はＣＡ（アドリアマイシン、シクロホスファミド）、ＴＡＣ（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ＡＣ）、ＡＢＶＤ（アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン）、ＢＥＡＣＯＰＰ（ブレオマイシン、エトポシド、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、シクロホスファミド、オンコビン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）（ビンクリスチン）、プロカルバジン、プレドニゾン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾロン）、ＦＡＣ又はＣＡＦ（５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、シクロホスファミド）、ＭＶＡＣ（メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン）、ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン）及びＣＡＶＥ（ＣＡＶ、エトポシド）、ＣＶＡＤ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、アドリアマイシン、デキサメタゾン）、ＤＴ−ＰＡＣＥ（デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン又はプラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、アドリアマイシン、シクロホスファミド、エトポシド）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、ブレオマイシン、アドリアマイシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン）、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、ロイコボリン、アドリアマイシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン）、Ｐｒｏ−ＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、アドリアマイシン、シクロホスファミド、エトポシド、メクロレタミン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、ロイコボリン）、スタンフォードＶ（ドキソルビシン、メクロレタミン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、プレドニゾン）、ＤＤ−４Ａ（ビンクリスチン、アクチノマイシン、ドキソルビシン）、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン）、レジメンＩ（ビンクリスチン、ドキソルビシン、エトポシド、シクロホスファミド）及びＶＡＰＥＣ−Ｂ（ビンクリスチン、ドキソルビシン、プレドニゾン、エトポシド、シクロホスファミド、ブレオマイシン）が含まれる。ドキソルビシンを含む併用化学療法に加え、ＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド、白金剤（シスプラチン（プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ））））、ＣＡＰＯＸ又はＸＥＬＯＸ（カペシタビン、オキサリプラチン）、ＣＢＶ（シクロホスファミド、カルムスチン、エトポシド）、ＦＯＬＦＩＲＩ（フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン）、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン）、ＦＯＬＦＯＸ（フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン）、ＥＣ（エピルビシン、シクロホスファミド）、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド（ＶＰ−１６））及びＩＦＬ（イリノテカン、ロイコボリン、フルオロウラシル）などの他の併用化学療法が多数ある。マウスのＡｋｔ陽性リンパ腫の処置におけるドキソルビシンとシロリムス（ラパマイシン）の併用が、Ｗｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２００４（Ｎａｔｕｒｅ ４２８，３３２−３３７）により開示されている。これらの併用療法のいずれにおいても、これらの薬物の任意のものを、本発明に係るプロドラッグ（又はその塩）に置換し得る。
さらに、本発明に係る抗癌プロドラッグ（又はその塩）（単独か、それとも既に併用化学療法又は集学的療法の一部であるかに関わらず）と、細胞増殖阻害薬以外の化合物とを含む併用療法もまた想定することができる。そのような他の化合物としては、癌の処置用に承認された又は癌の処置用に開発されている任意の化合物が挙げられる。詳細には、そのような他の化合物としては、モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ（慢性リンパ性白血病）、ベバシズマブ（結腸直腸癌）、セツキシマブ（結腸直腸癌、頭頸部癌）、デノスマブ（固形腫瘍の骨転移）、ゲムツズマブ（急性骨髄性白血病）、イピリムマブ（メラノーマ）、オファツムマブ（慢性リンパ性白血病）、パニツムマブ（結腸直腸癌）、リツキシマブ（非ホジキンリンパ腫）、トシツモマブ（非ホジキンリンパ腫）及びトラスツズマブ（乳癌）が挙げられる。他の抗体としては、例えば、アバゴボマブ（卵巣癌）、アデカツムマブ（前立腺及び乳癌）、アフツズマブ（リンパ腫）、アマツキシマブ、アポリズマブ（血液癌）、ブリナツモマブ、シクスツムマブ（固形腫瘍）、ダセツズマブ（血液癌）、エロツズマブ（多発性骨髄腫）、ファーレツズマブ（卵巣癌）、インテツムマブ（固形腫瘍）、マツズマブ（結腸直腸癌、肺癌及び胃癌）、オナルツズマブ、パルサツズマブ、プリツムマブ（脳癌）、トレメリムマブ、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベルツズマブ（非ホジキンリンパ腫）、ボツムマブ（結腸直腸腫瘍）、ザツキシマブ（ｚａｔｕｘｉｍａｂ）及び国際公開第２００６／０９９６９８号パンフレットに記載されるような抗胎盤成長因子抗体が挙げられる。かかる併用療法の例としては、例えば、ＣＨＯＰ−Ｒ（ＣＨＯＰ（上記参照）＋リツキシマブ）、ＩＣＥ−Ｒ（ＩＣＥ（上記参照）＋リツキシマブ）、Ｒ−ＦＣＭ（リツキシマブ、フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン）及びＴＣＨ（パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ））、カルボプラチン、トラスツズマブ）が挙げられる。
アルキル化抗悪性腫瘍剤の例としては、ナイトロジェンマスタード類（例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド及びブスルファン）、ニトロソウレア類（例えば、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチン及びストレプトゾトシン）、テトラジン類（例えば、ダカルバジン、ミトゾロミド及びテモゾロミド）、アジリジン類（例えば、チオテパ、マイトマイシン及びジアジコン（ＡＺＱ））、シスプラチン類及び誘導体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン）、及び非古典的アルキル化剤（例えば、プロカルバジン及びヘキサメチルメラミン）が挙げられる。
抗代謝産物のサブタイプとしては、抗葉酸薬（例えばメトトレキサート及びペメトレキセド）、フルオロピリミジン類（例えばフルオロウラシル、カペシタビン及びテガフール／ウラシル）、デオキシヌクレオシド類似体（例えばシタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ（Ｖｉｄａｚａ）、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン及びペントスタチン）及びチオプリン（例えばチオグアニン及びメルカプトプリン）が挙げられる。
抗微小管剤としては、ビンカアルカロイドサブタイプ（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン及びビンフルニン）及びタキサンサブタイプ（例えばパクリタキセル及びドセタキセル）が挙げられる。他の抗微小管剤としては、ポドフィロトキシンが挙げられる。
トポイソメラーゼ阻害薬としては、トポイソメラーゼＩ阻害薬（例えばイリノテカン、トポテカン及びカンプトテシン）及びトポイソメラーゼＩＩ阻害薬（例えばエトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、及びアクラルビシン）が挙げられる。
細胞毒性抗生物質としては、アントラサイクリン類（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン及びミトキサントロン）並びにアクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン及びマイトマイシンを含む他の薬物が挙げられる。
本発明に係る任意の抗癌プロドラッグ（又はその塩）は（単独か、それとも既に併用化学療法又は集学的療法の一部であるかに関わらず）、さらに抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）（薬物を活性化させる酵素に結合している癌関連モノクローナル抗体の適用を含むもの）に含めることができる。続く非毒性薬剤の全身投与により毒性薬物へのその変換が生じ、悪性細胞を標的とし得る細胞毒性効果がもたらされる（Ｂａｇｓｈａｗｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １，１７−２９）。
さらに、本発明に係る任意の抗癌プロドラッグ（又はその塩）は（単独か、それとも既に併用化学療法又は集学的療法の一部であるかに関わらず）、化学療法中に起こり得る（多剤）薬剤耐性を克服する能力を有する１つ以上の薬剤（（Ｍ）ＤＲ克服薬又は（Ｍ）ＤＲ克服剤）と併用することができる。かかる薬剤としては、例えばロペラミドが挙げられる（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ ３０，１１９−１２５）。別のかかる併用には、酸化鉄ナノ粒子などのナノ粒子（Ｋｉｅｖｉｔ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １５２，７６−８３）又はリポソームにプロドラッグを負荷することが含まれる。リポソームに負荷される薬物の例としては、ドキソルビシン（ドキソルビシンＨＣＬリポソーム、商標名Ｄｏｘｉｌ、Ｃａｅｌｙｘ又はＭｙｏｃｅｔでもまた知られる）、ダウノルビシン（商標名ＤａｕｎｏＸｏｍｅで知られる）及びパクリタキセル（Ｇａｒｃｉｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ５，１７１０−１７２２）が挙げられる。
本発明に係るプロドラッグ若しくはその塩、又はかかるプロドラッグ若しくは塩を含む組成物は、従って、疾患（例えば癌）の処置に、単剤療法として、又は併用化学療法処置又は集学的化学療法処置の一部として使用することができる。かかる処置の任意のものを、薬剤耐性克服剤（ｒｅｖｅｒｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含む処置とさらに併用することができる。
本発明はさらに、本発明のプロドラッグを作製する方法に関し、前記方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物を入手するステップ；
（ｉｉ）薬物を、ホスホノアセチルでキャッピングされたオリゴペプチド部分に結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ；又は、それに代えて、
（ｉｉ’）薬物をオリゴペプチド部分に結合させて、次にそのオリゴペプチド部分にホスホノアセチルキャッピング基を結合させるステップであって、それによりプロドラッグを生じさせるステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）又は（ｉｉ’）で得られたプロドラッグを精製するステップ。
上記に記載したとおり、前記オリゴペプチド部分を薬物及び／又はキャッピング基と結合させるステップは直接であっても、又はリンカー若しくはスペーシング基、例えば自己犠牲又は自己脱離スペーサーを介して間接的であってもよい。プロドラッグの精製戦略は、明らかに薬物及び／又はキャッピング基の性質に依存することになる。当業者は、本発明に係る任意の可能なプロドラッグに好適な精製戦略を、利用可能な多数の精製技法から選択して設計することができるであろう。
いかなる理論又は説明によっても拘束もされないが、本明細書に記載するとおりの実施例から明らかになる図式は、ＯＰ部分としてＡＬＧＰ−ペプチド（配列番号１）を含み且つ薬物Ｄとしてドキソルビシンを含む本発明の例示的プロドラッグについて、プロドラッグの活性化が多段階で起こっているというものである。かかるプロドラッグは血中及び血漿中で安定であるが、ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の存在下でインキュベートすると変換されてドキソルビシン（Ｄｏｘ）の混合物であるＧＰ−Ｄｏｘ及びＬＧＰ−Ｄｏｘになる。第１の段階におけるこのプロセスは、インビトロでＣＤ１０（共通のロイシンアミノペプチダーゼによってＧＰ−Ｄｏｘに変換され得るＬＧＰ−Ｄｏｘを生じる）及びＴＯＰ（ＧＰ−Ｄｏｘを生じる）などのプロテアーゼにより模倣され得る。ＡＬＧＰ−ドキソルビシンの活性化の第１段階は、非病的な細胞外コンパートメント及び組織におけるその低い存在量と比較した腫瘍の近傍でのＣＤ１０及びＴＯＰの優先的な活性により駆動される。第２の段階、ＧＰ−ＤｏｘからＤｏｘへの変換は、ジペプチジルプロリルペプチダーゼにより駆動され得る。癌の領域ではこのクラスのうち２つのメンバー：ＣＤ２６としても知られるＤＰＩＶと、ＦＡＰ、即ち線維芽細胞活性化タンパク質とが関心となる。これらのプロテアーゼは全て、以下に記載するとおり、腫瘍細胞又は腫瘍間質細胞に関連することが知られている。本発明のプロドラッグのかかる多段階活性化は、一段階で活性化可能な同様のプロドラッグと比較して特異性を増加させ、且つ望ましくない副作用（白血球減少症及び心毒性など）を低下させる。一段階で活性化可能なプロドラッグの例はスクシニル−βＡＬＡＬ−ドキソルビシンであり、これは例えば、ＣＤ１０によって、独りでに細胞に侵入することのできるＬ−Ｄｏｘに容易に変換される（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３，５５２６−５５３１）。多段階活性化手法は、ドキソルビシンと比べて毒性が約２０〜４０分の１であり（投与方法（ＩＶか又はＩＰか）によって変わる）、及びスクシニル−β−ＡＬＡＬ−ドキソルビシンと比べて毒性が６〜１４分の１であるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンプロドラッグを生じる。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンは長期累積心毒性がなく、白血球減少症及びリンパ球減少症を引き起こさない。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンは、ヒト腫瘍異種移植片（肉腫を含む）及び同所性結腸癌に対する活性がドキソルビシンより高い。従って本発明のプロドラッグは、インビトロ又はインビボで、少なくとも二段階、即ち、少なくとも２つの異なるプロテアーゼによる少なくとも２つの本質的なタンパク質分解切断が関わるプロセスで活性化可能であることをさらに特徴とする。「本質的なタンパク質分解切断」は、本明細書では、腫瘍又はその間質などの腫瘍関連細胞に関連する切断であって、即ち腫瘍又は腫瘍関連細胞の直ちに近傍で特異的に起こる切断であることを意味する。
エンドペプチターゼＣＤ１０及びＴＯＰ
ＣＤ１０は、疎水性アミノ酸のアミノ側で小さいペプチドを切断する中性エンドペプチターゼ／亜鉛依存性細胞表面メタロペプチダーゼである。Ｂ細胞並びに肺、結腸及び腎臓の上皮細胞などの正常細胞に存在することに加えて、ＣＤ１０は多くの腫瘍型（Ｒａｖｅｌ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４，１２５８−１２６５）、例えば、膵癌（Ｎｏｔｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．２０００，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ ２４，１３６１−１３７１）、肝細胞癌（Ｋａｒａｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｐａｔｈｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ ２０６，５７２−５７７）、メラノーマ（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，２）、前立腺癌（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ５８，３９４−４０５）、肺小細胞癌（Ｓｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１０６６２−１０６６６）、腎癌、子宮内膜肉腫及び横紋筋肉腫（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．２０００，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １１３，３７４−３８２）に存在する。ＣＤ１０は、ほぼ半数の軟部組織肉腫で発現する（組織球腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｓｈｅａｔ ｔｕｍｏｒｓ）；Ｄｅｎｉｚ ｅｔ ａｌ．２０１２， Ｐａｔｈｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ ２０８，２８１−２８５）。さらに興味深いことには、ＦＡＰの間質分布と同様に、ＣＤ１０は、結腸直腸癌（Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ ６２，６００−６１１）、乳癌（Ｄｅｓｍｅｄｔ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８，１００４−１０１４；Ｍａｒｋｅｔｓｏｖ ｅｔ ａｌ．２０，８４−８９）、膵内分泌腫瘍（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｈｕｍ Ｐａｔｈ ３７，８０２−８０８）、胃癌（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｊｐｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５，２４５−２５０）及び基底細胞癌（Ｙａｄａ ｅｔ ａｌ．２００４，Ａｍ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ ２６，４６３−４７３）の間質細胞に見られる。
ＴＯＰ（Ｔｈｉｍｅｔオリゴペプチダーゼ）は、多くの組織及び細胞型にわたり分布するチオール依存性の主要な細胞質メタロエンドプロテアーゼである。ＴＯＰは、可溶性酵素の分泌を介するのと細胞膜への付着によるのとの両方によって細胞外位置を獲得することができる。ＴＯＰは多くの組織及び細胞型にわたり分布する。ＴＯＰは、神経内分泌シグナル伝達及び神経ペプチドの細胞外代謝に関与する（Ｃｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ ２３，６４７−６６４）。ＴＯＰはプロテアソームの代謝に関与する（Ｓａｒｉｃ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ４５，４６７２３−４６７３２）。ＴＯＰは前立腺及び前立腺癌における神経ペプチドプロセシングに関与し（Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ ５，４７１−４７８）、腫瘍細胞馴化培地中に見られる。ＴＯＰは損傷した細胞又は壊死細胞から放出され得る。その活性は酸素添加培地で低下し、極めて多くの場合に固形腫瘍に特有である無酸素環境で増強される。ＴＯＰは内皮細胞の表面で発現し、血管作動性ペプチド代謝において役割を担う（Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００３，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８４，Ｈ１９７８−１９８４；Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｆｕｎｃｔ ２３，１９５−２０４）。Ｔｏｐは免疫染色により１４７例中１１３例の乳癌で腫瘍性細胞及び間質細胞の両方に検出される。Ｔｏｐは９８例中８８例の前立腺癌生検において癌細胞及び間質細胞の両方で発現する（Ｒａｖｅｌ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４，１２５８−１２６５）。ＴＯＰはスクシニル−β−ＡＬＡＬ−ドキソルビシン及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンの細胞外活性化に関与する（Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １７，３０４９−３０５６）。
ジペプチジルプロリルペプチダーゼＤＰＩＶ（ＣＤ２６）及びＦＡＰ
ＤＰＩＶは広域の活性を有するジペプチジルプロリルペプチダーゼであり、多数の生理的基質を包含する。ＤＰＩＶは多数の臓器の上皮細胞で発現する。ＤＰＩＶは、胸腺、脾臓及びリンパ節並びにリンパ球で発現する。ＤＰＩＶは実験条件下でコラーゲン及びフィブロネクチンに結合する（Ｌｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１７，３４１）。ＤＰＩＶは、腫瘍性Ｔ細胞悪性腫瘍（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ １７，１２１３−１２２６）並びに種々の腺癌、例えば、肝細胞癌（Ｓｔｅｃｃａ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２７，９９７−９４５）、甲状腺癌（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６４，３２６−３３１）、髄膜腫（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１０，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７７，１１２６−１１４４；Ｓｔｒｅｍｅｎｏｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３６，３５１−３５８）、食道腺癌（Ｇｏｓｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８，ＡＰＭＩＳ １１６，８２３−８３１）、肺腺癌（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３，２６５−２７０）及び骨・軟部組織腫瘍（Ｄｏｈｉ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４，４３２−４４０）において上方制御される。ＤＰＩＶはヒト結腸直腸癌及びヒト中皮腫の癌幹細胞で発現する（Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６，６０３−６１５；Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４１９，５２９−５３６）。
ＦＡＰは、グリシン−プロリン、アラニン−プロリン及びリジン−プロリンジペプチドに限定された極めて狭い特異性を有するジペプチジルエキソペプチダーゼであり、またＩ型コラゲナーゼでもある。しかしながら、ＦＡＰはエンドペプチターゼとしてもまた働き得る（Ｓｉｅｗ ｌａｉ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ １８，１２４５−１２５０）。ＦＡＰは、上皮細胞、間葉細胞；神経細胞及びリンパ系細胞、例えばリンパ球などの正常成人組織には存在しない。ＦＡＰは非悪性腫瘍には存在しない。さらに重要なことには、ＦＡＰは腫瘍性細胞それ自体ではなく、上皮性腫瘍及びユーイング肉腫を除く肉腫性腫瘍に存在する反応性の線維芽細胞、間質細胞及び血管新生細胞で上方制御される（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１０，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７７，１１２６−１１４４；Ｂｒｅｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １１，２５７−２６９）。ＦＡＰは、結腸癌（Ｌｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３，１７３６−１７４１）、メラノーマ（Ｆａｚａｋａｓ ｅｔ ａｌ．２０１１，ＰＬｏＳ ｏｎｅ ６，ｅ２０７５８；Ａｒｔｙｍ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２３，１５９３−１６０１）、膵癌（Ｈｙｕｎｇ−Ｏｋ ｅｔ ａｌ．２０１１，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １１，２４５；Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２８，８４０−８４６）、胃癌（Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２９，６６；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６７，４１１−４１９）、非小肺癌（Ｂｒｅｍｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ １，２０９−２１７）、神経膠腫（Ｍｅｎｌｅｉｎ ２０１１，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３９２，１９９−２０７）、皮膚癌（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊ Ｃｕｔ Ｐａｔｈｏｌ ２，１４５−１５５）、子宮頸癌（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．２００３，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４，１９５−０１９８）、甲状腺癌（Ｎｏｃｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７，７７８−７８０）、直腸癌（Ｓａａｉｇｕｓａ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ３，６５５−６６３）、食道癌（Ｇｏｓｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ Ｐａｔｈｏｌ ３，８９−９６）、乳癌（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｔｓｔａｓｉｓ ６，５６７−５７９）、及び骨・軟部組織腫瘍（Ｄｏｈｉ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４，４３２−４４０）において重要な役割を果たす。腫瘍細胞の反応性間質細胞は、腫瘍性細胞の成長並びにその浸潤及び血管新生能力に必須である（Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１９，３６１３−３６２５；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，４７６７−４７７２；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４，２７１２−２７１６）。
実施例に基づき（例えば実施例１６を参照）、本発明に係る候補プロドラッグをスクリーニングする方法がいくつか想定され得る。かかる方法には、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は、直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサー基などのスペーサー基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法が含まれ；及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物ＤをＧＰ−、ＡＰ−又はＫＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりジペプチド−薬物中間体プロドラッグとしてＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを得るステップ；
（ｉｉｉ）薬物Ｄ及び前記ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
（ｉｖ）薬物Ｄ及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに対応する［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
上記の方法において、用語「〜に対応する」は、選択された候補プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄが、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有すると同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに存在するものと同じ薬物Ｄを含んでいるというように理解されるべきである。場合により、薬物Ｄは、それがジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−ＤにおいてＧＰ−、ＡＰ−又はＫＰ−ジペプチドに結合するのと同じ形でオリゴペプチド部分ＯＰに結合している。換言すれば、ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの奏効が候補プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの奏効の指標又は予測因子となり、ここでＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）を表す。かかる推定は、ドキソルビシンを薬物Ｄとしたときに得られるとおりの本明細書に記載される広範な結果に鑑みて妥当である。ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄが薬物Ｄの細胞毒性活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）と同等の細胞毒性活性を有するとき、それは、培養細胞による遊離薬物Ｄとなるかかるプロドラッグの活性化が奏効していることの良好な指標である。この種類のスクリーニングで使用される培養細胞は、例えば培養腫瘍細胞系であってもよい。
詳細な実施形態において、上述の一般構造中のペプチドＯＰは、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドである。従って、前記実施形態において本発明は、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；詳細にはＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサー基などのスペーサー基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法を提供し；及び
前記スクリーニング方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物ＤをＧＰ−、ＡＰ−又はＫＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりジペプチド−薬物中間体プロドラッグとしてＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを得るステップ；
（ｉｉｉ）薬物Ｄ及び前記ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
（ｉｖ）薬物Ｄ及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに対応する［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
或いは、前記方法は、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；詳細にはＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり；
前記方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）薬物Ｄ及びプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
（ｉｖ）薬物Ｄ及びプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
上述のスクリーニング方法において、用語「同等の細胞毒性活性」は、プロドラッグが、インビトロ培養細胞（培養腫瘍細胞など）との接触後、同じ条件下で同じインビトロ培養細胞と接触させた遊離薬物によって及ぼされる細胞毒性活性の少なくとも５０％又は少なくとも５０〜９９％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも５５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％）を及ぼすというように理解されるべきである。
別の代替例では、前記方法は、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；詳細にはＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり；
前記方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄをインビトロ培養細胞と３７℃で５時間接触させるステップ；
（ｉｖ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
さらに別の代替例において、前記方法は、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；詳細にはＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法であり；
前記方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物ＤをＧＰ−、ＡＰ−又はＫＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄを単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間接触させるステップ；
（ｉｖ）ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに対応する［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
上記の方法において、用語「〜に対応する」は、選択された候補プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄが、限定条件下で少なくとも５０％がＤに変換されることが同定されたプロドラッグＧＰ−Ｄに存在するものと同じ薬物Ｄを含んでいるというように理解されるべきである。場合により、薬物Ｄは、それがプロドラッグＧＰ−ＤにおいてＧＰ−ジペプチドに結合するのと同じ形でオリゴペプチド部分ＯＰに結合している。換言すれば、ステップ（ｖ）で同定されたプロドラッグＧＰ−Ｄの奏効が候補プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの奏効の指標又は予測因子となり、ここでＯＰはＡＬＧＰ−ペプチドである。かかる推定は、ドキソルビシンを薬物Ｄとしたときに得られるとおりの本明細書に記載される広範な結果に鑑みて妥当である。
さらに想定される方法には、一般構造
［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；詳細にはＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か、又はリンカー又は自己犠牲若しくは自己脱離スペーサーなどのスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補プロドラッグをスクリーニングする方法が含まれ；
前記方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを単離ＣＤ１０及び／又はＴＯＰペプチダーゼと、及び単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間〜２４時間接触させるステップ；
（ｉｖ）プロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ。
プロドラッグＧＰ−Ｄ又はプロドラッグ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄから薬物Ｄへの変換に言及する上記のスクリーニング方法のいずれにおいても、候補プロドラッグの選択に使用される変換率は、概して少なくとも５０〜１００％の範囲内にある（例えば少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも５５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％）。
上記の代替的スクリーニング方法のいずれにおいても、前記キャッピング基Ｃはホスホノアセチル基であってよい。詳細な実施形態において、上記のスクリーニング方法のいずれか一つにおけるＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含むプロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；より詳細には、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドであり；さらにより詳細には、ＯＰはテトラペプチドＡＬＧＰ（配列番号１）である。
上記の代替的スクリーニング方法のいずれにおいても、前記薬物Ｄは、ドキソルビシン、メイタンシン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｈｏｔｈｅｃｉｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、アミノプテリン、アムルビシン、又はそのいずれかの誘導体からなる群から選択され得る。
本発明はさらに、本発明に係るプロドラッグ若しくはその塩を含むか又はかかるプロドラッグ若しくはその塩を含む組成物を含む容器を含むキットに関する。かかるキットは、同じ容器（本発明に係るプロドラッグ又はその塩を保持している）又は１つ以上の別個の容器に、１つ以上のさらなる抗癌薬、例えば抗体又はその断片（例えば上記に記載したとおりのもの）をさらに含み得る。それに代えて、又は加えて、かかるキットは、同じ容器（本発明に係るプロドラッグ又はその塩を保持している）又は１つ以上の別個の容器に、１つ以上の薬剤耐性克服剤をさらに含み得る。かかるキットの他の任意選択の構成要素には、本発明に係るプロドラッグ又はその塩を含む治療法の奏効を判定することが可能な１つ以上の診断剤；取扱説明書；無菌の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤が入った１つ以上の容器；ＡＤＥＰＴ療法用の薬剤が入った１つ以上の容器等が含まれる。
以上及び以下に引用する参考文献は全て、全体として参照により援用される。
実施例１．Ｎ−キャッピングペプチドプロドラッグ化合物の合成
１．Ｆｍｏｃ−ペプチド−ＯＨの合成
１．１．Ｆｍｏｃ−ＡＬＡＬ−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（５ｇ、１当量）をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中で３０分間膨潤させた。フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を、ジメチルホルムアミド（１６ｍＬ）中ピペリジン（４ｍＬ）で３分間処理することにより除去し、次に樹脂をろ過し、続いて同じ処理を３分間及び７分間行った。樹脂をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）で３回洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（２当量）及び２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（２当量）をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中に可溶化し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４当量）を添加した。混合物を６分間予備的に活性化させ、樹脂に添加した。次に樹脂を６０分間振盪し、ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）で３回洗浄した。Ｆｍｏｃ基を、ジメチルホルムアミド（１６ｍＬ）中ピペリジン（４ｍＬ）で３分間処理することにより除去し、次に樹脂をろ過した。同じ処理を２回、３分間及び７分間繰り返した。樹脂をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）で３回洗浄した。同じプロトコルをＦｍｏｃ−ロイシン−ＯＨ（２当量）及びＦｍｏｃ−アラニン−ＯＨ（２当量）で繰り返した。
最後のカップリング後、樹脂をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）及びジクロロメタン（２０ｍＬ）で交互に３回洗浄し、乾燥させた。Ｆｍｏｃペプチドを樹脂からトリフルオロ酢酸／トリイソプロピルシラン／水（９５：２．５：２．５ｖ／ｖ／ｖ）（２０ｍＬ）の溶液で２時間切り出した。溶媒を蒸発させた。生成物を水中に沈殿させ、ろ過した。Ｆｍｏｃ−ペプチドを凍結乾燥によって乾燥させた。
ＭＳ（ＥＳ＋）：６０９．３［ＭＨ］＋；純度：９０％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
１．２．Ｆｍｏｃ−ＡＬＧ−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂で出発し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ及びＦｍｏｃ−Ａｌａを加えて、パラグラフ１．１．に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：４８２．２［ＭＨ］＋；純度：９２％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
１．３．Ｆｍｏｃ−ＡＬＰＦ−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂で出発し、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ及びＦｍｏｃ−Ａｌａを加えて、パラグラフ１．１．に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：６６９［ＭＨ］＋；純度：９８％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
１．４．Ｆｍｏｃ−ＡＬＡＦ−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂で出発し、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ及びＦｍｏｃ−Ａｌａを加えて、パラグラフ１．３．に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：６４３［ＭＨ］＋；純度：９０％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
１．５．Ｆｍｏｃ−ＡＩＧ−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂で出発し、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ及びＦｍｏｃ−Ａｌａを加えて、パラグラフ１．１．に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：４８２．５［ＭＨ］＋；純度：６０％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
１．６．Ｆｍｏｃ−ＫＬＧ−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂で出発し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＩｖＤｄｅ）を加えて、パラグラフ１．１．に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：７４４［ＭＨ］＋
１．７．Ｆｍｏｃ−ＧＰＧ−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂で出発し、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙを加えて、パラグラフ１．１．に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：４５２［ＭＨ］＋
２．ペプチド−ドキソルビシンコンジュゲートの合成
２．１．ＮＨ２−ＡＬＡＬ−ドキソルビシンの合成
ドキソルビシン（１当量）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中に可溶化した。ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＡＬＡＬ−ＯＨ（１．２当量）の溶液をドキソルビシンに添加し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンでｐＨをｐＨ８に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．２当量）を添加した。溶液のｐＨを確認し、ｐＨ８〜８．５に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、ＨＰＬＣにより確認した。反応が完了している場合、Ｆｍｏｃ基をピペリジン（１０％最終体積）によって室温で５分間処理することにより除去し、乳酸緩衝液１０％ ｐＨ３を０℃で添加した。混合物をＹＭＣにロードした。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。ＡＬＡＬ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：９１２［ＭＨ］＋；純度：９５％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
２．２．ＮＨ２−Ｐｒｏ−ドキソルビシン及びＮＨ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ドキソルビシンの合成
ドキソルビシン（１当量）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中に可溶化した。ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中Ｆｍｏｃ−プロリン−ＯＨ（１．２当量）の溶液をドキソルビシンに添加し、ｐＨをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンでｐＨ８〜８．５に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．２当量）を添加した。溶液のｐＨを確認し、ｐＨ８〜８．５に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、ＨＰＬＣにより確認した。反応が完了している場合、Ｆｍｏｃ基をピペリジン（１０％最終体積）によって室温で５分間処理することにより除去し、乳酸緩衝液１０％ ｐＨ３を０℃で添加した。混合物をＹＭＣにロードした。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。Ｐｒｏ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。Ｆｍｏｃ−グリシン−ＯＨ（１．２当量）で同じプロトコルに従った。
Ｐ−Ｄｏｘ：ＭＳ（ＥＳ＋）：６４１［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
ＧＰ−Ｄｏｘ：ＭＳ（ＥＳ＋）：６９８［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
２．３．ＮＨ２−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンコンジュゲートの合成
Ｐｒｏ−ドキソルビシン（１当量）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中に可溶化した。ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中Ｆｍｏｃ−ＡＬＧ−ＯＨ（１．２当量）の溶液をドキソルビシンに添加し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンでｐＨをｐＨ８に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．２当量）を添加した。溶液のｐＨを確認し、ｐＨ８〜８．５に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、ＨＰＬＣにより確認した。反応が完了している場合、Ｆｍｏｃ基をピペリジン（１０％最終体積）によって室温で５分間処理することにより除去し、乳酸緩衝液１０％ ｐＨ３を０℃で添加した。混合物をＹＭＣにロードした。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。ＡＬＧＰ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：８８２［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
２．４．ＮＨ２−ＡＬＰＦ−ドキソルビシンの合成
Ｆｍｏｃ−ＡＬＡＬ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ＡＬＰＦ−ＯＨを使用して２．１に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：９７１［ＭＨ］＋；純度：９７％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
２．５．ＮＨ２−ＡＬＡＦ−ドキソルビシンの合成
Ｆｍｏｃ−ＡＬＡＬ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ＡＬＡＦ−ＯＨを使用して２．１に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：９４７［ＭＨ］＋純度：９６％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
２．６．ＮＨ２−ＡＩＧＰ−ドキソルビシンの合成
Ｆｍｏｃ−ＡＬＡＬ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ＡＩＧＰ−ＯＨを使用して２．１に記載のとおり調製した。
２．７．ＮＨ２−ＧＰＧＰ−ドキソルビシンの合成
Ｆｍｏｃ−ＡＬＡＬ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ＧＰＧＰ−ＯＨを使用して２．１に記載のとおり調製した。
３．ＰｈＡｃ−ペプチド−ドキソルビシンの合成
３．１．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンの合成
Figure 0006523965
 ＮＨ２−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ（１当量）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中に可溶化した。ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中ホスホノ酢酸（２．５当量）の溶液をペプチド−ドキソルビシンに添加し、ｐＨをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンでｐＨ８に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（２当量）を添加した。溶液のｐＨを確認し、ｐＨ８〜８．５に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、ＨＰＬＣにより確認した。反応が完了している場合、混合物をジエチルエーテルで沈殿させてろ過した。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：１００４．４［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．２．ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−ドキソルビシンの合成
Figure 0006523965
 ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（１当量）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中に可溶化した。ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中ホスホノ酢酸（２．５当量）の溶液をペプチド−ドキソルビシンに添加し、ｐＨをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンでｐＨ８に調整した。溶液を室温で撹拌し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（２当量）を添加した。溶液のｐＨを確認し、ｐＨ８〜８．５に調整し直した。溶液を室温で撹拌し、ＨＰＬＣにより確認した。反応が完了している場合、混合物をジエチルエーテルで沈殿させてろ過した。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：１０３４［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．３．ＰｈＡｃ−ＡＬＰＦ−ドキソルビシンの合成
Figure 0006523965
 ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの代わりにＮＨ２−ＡＬＰＦ−Ｄｏｘで３．２に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：１０９４［ＭＨ］＋；純度：９２％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．４．ＰｈＡｃ−ＡＬＡＦ−ドキソルビシンの合成
Figure 0006523965
 ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの代わりにＮＨ２−ＡＬＡＦ−Ｄｏｘで３．２に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：１０６８［ＭＨ］＋；純度：９７％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．５．ＰｈＡｃ−ＤＬＧＰ−ドキソルビシンの合成
ＰｈＡｃ−Ｄ（Ｄｍａｂ）ＬＧＰ−ドキソルビシンを、ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの代わりにＮＨ２−Ｄ（Ｄｍａｂ）ＬＧＰ−Ｄｏｘで３．２に記載のとおり調製した。４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］−アミノ｝ベンジルとしても知られる保護基Ｄｍａｂをヒドラジン水和物２％によって室温で５分間除去した。乳酸緩衝液１０％ ｐＨ３を０℃で添加し、混合物をＹＭＣにロードした。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。ＰｈＡｃ−ＤＬＧＰ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：１０４８．３［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．６．ＰｈＡｃ−ＴＳＧＰ−ドキソルビシンの合成
ＰｈＡｃ−Ｔ（Ｄｍａｂ）ＳＧＰ−ドキソルビシンを、ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの代わりにＮＨ２−Ｔ（Ｄｍａｂ）ＳＧＰ−Ｄｏｘで３．２に記載のとおり調製した。保護基Ｄｍａｂをヒドラジン水和物２％によって室温で５分間除去した。乳酸緩衝液１０％ ｐＨ３を０℃で添加し、混合物をＹＭＣにロードした。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。ＰｈＡｃ−ＴＳＧＰ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。
ＭＳ（ＥＳ）：１００８．３［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．７．ＰｈＡｃ−ＡＩＧＰ−ドキソルビシンの合成
ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの代わりにＮＨ２−ＡＩＧＰ−Ｄｏｘで３．２に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：１００４．３［ＭＨ］＋；純度：９９％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．８．ＰｈＡｃ−ＫＬＧＰ−ドキソルビシンの合成
ＰｈＡｃ−Ｋ（ＩｖＤｄｅ）ＬＧＰ−ドキソルビシンを、ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの代わりにＮＨ２−Ｋ（ＩｖＤｄｅ）ＬＧＰ−Ｄｏｘで３．２に記載のとおり調製した。保護基ＩｖＤｄｅをヒドラジン水和物２％によって室温で５分間除去した。乳酸緩衝液１０％ ｐＨ３を０℃で添加し、混合物をＹＭＣにロードした。生成物をＭｅＯＨで回収し、溶媒を蒸発させた。ＰｈＡｃ−ＫＬＧＰ−ドキソルビシンをセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＬｕｎａ、Ｃ１８）により精製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：１０６１［ＭＨ］＋；純度：９１．５％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
３．９．ＰｈＡｃ−ＧＰＧＰ−ドキソルビシンの合成
ＮＨ２−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの代わりにＮＨ２−ＧＰＧＰ−Ｄｏｘで３．２に記載のとおり調製した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：９７４．９［ＭＨ］＋；純度：９８％（ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで測定）。
ＰｈＡｃ−ＴＳＧＰ−ドキソルビシン及びＰｈＡｃ−ＫＬＧＰ−ドキソルビシンの合成に、上記に記載したものと同様の合成手順を使用した
４．スクシニル−βＡＬＡＬ−ドキソルビシン及びスクシニル−βＡＬＰＦ−ドキソルビシンの合成
Figure 0006523965
Figure 0006523965
 Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４：３７５０−３７５３（２００１）が既述しているとおり、スクシニル−βＡＬＡＬ−ドキソルビシン及びスクシニル−βＡＬＰＦ−ドキソルビシンを作成した。
実施例２．血中及び血漿中におけるＮ−キャッピングペプチドプロドラッグの安定性のインビトロ評価
方法
健常ドナー由来のクエン酸塩加ヒト血液及び血漿（ｐＨ７、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ホスホノアセチルでキャッピングされた薬物コンジュゲート（ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＡＬＰＦ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＡＬＡＦ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＤＬＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＫＬＧＰ−Ｄｏｘ）の安定性を既知のスクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘプロドラッグコンジュゲートと比較して評価した。
薬物コンジュゲート（５０μＭ）をヒト血漿と混合し、水浴中３７℃で５時間インキュベートした。０、１、３又は５時間後に５０μＬの試料を回収し、直ちに抽出を実施した：５０μＬ試料に１５０μＬのアセトニトリルを添加した。試料をボルテックスし、室温１３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を回収した。２００ｍＭのギ酸緩衝液ｐＨ４．５（１体積 試料上清＋３体積 緩衝液）を添加することにより試料を緩衝した後、ＨＰＬＣ分析を行った（蛍光検出 ｅｘ＝２３５ｎｍ ｅｍ＝５６０ｎｍ）。
結果
Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘと同様、試験した全てのキャッピングコンジュゲートがヒト血漿及びヒト血液中で安定であることが示された。血液又は血漿の存在下、３７℃で５時間インキュベートした後、試験試料中に検出されたドキソルビシンコンジュゲートの代謝誘導体は１０％以下であった（例外：ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘは血中で１５％の代謝産物をもたらす；データは表１及び表２に要約）。
Figure 0006523965
Figure 0006523965
実施例３．Ｎ−キャッピングペプチドプロドラッグ酵素的活性化のインビトロ評価
１．方法
１．１．腫瘍細胞により分泌されるペプチダーゼの存在下における再活性化アッセイ
ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞のサブコンフルエント培養物をリン酸緩衝生理食塩水溶液で２回洗浄したとともに、０．０２％ウシ血清アルブミンを含有する新鮮な培養培地（フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−Ｆ１２）を添加する（１００μｌ／ｃｍ２）。２４時間インキュベートした後、馴化培地を回収し、３００ｇで１０分間遠心し、１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（１体積の緩衝液＋１９体積の培地）で緩衝し、超遠心法により２０倍濃縮する（カットオフ閾値１０ｋＤａ）。
薬物化合物（５０μＭ）を、調製したてのＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞馴化培地の存在下３７℃で０、１、３又は５時間インキュベートした。各時点で５０μＬの試料を回収し、ヒト血漿について上記に記載したとおり処理した。
１．２．精製酵素（ＴＯＰ、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＦＡＰ）の存在下における再活性化アッセイ
ＣＤ１０（組換えヒトネプリライシン、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、参照記号１１８２−ＺＮ）を、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを補足した０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５中に２０ｎＭで希釈した。ＴＯＰ（組換えヒトｔｈｉｍｅｔオリゴペプチダーゼ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、参照記号３４３９−ＺＮ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ ＤＴＴの溶液中に１０ｎＭに希釈した。ＣＤ２６及びＦＡＰを、トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液中に１μｇ／ｍＬで希釈した。５０μＭの各化合物を酵素溶液に添加することにより（１体積の酵素溶液＋１体積の１００μＭ薬物溶液）、反応を開始させた。試料を、精製酵素の存在下、水浴中３７℃で０、１、又は３時間インキュベートした。各時点で５０μＬの試料を回収し、ヒト血漿について上記に記載したとおり処理した。並行して、Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−ｄｏｘの活性化を参照として試験した。
１．３．結果
Ｎ−キャッピングされたペプチド−ドキソルビシンコンジュゲートのインビトロ再活性化アッセイの結果を表３に提供する。
Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−ＤｏｘはＣＤ１０により切断され、７３％のＬ−Ｄｏｘを放出する。それに対し、ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−ＤｏｘはＣＤ１０によっては効率的に切断されない。この酵素の存在下で３時間インキュベートした後に放出されるＬ−Ｄｏｘは５％未満である。この例では、スクシニル−βＡ−がホスホノアセチルキャッピング基で置換されることによりペプチド−酵素相互作用が阻害される。ＰｈＡｃ−ＡＬＡＦ−ＤｏｘはＣＤ１０により適度に切断され、Ｆ−Ｄｏｘとなる。ＡＬＡＦペプチド部分をＡＬＰＦに変えると、どのようなキャッピング基を使用しても、ＣＤ１０による切断が阻害される。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは酵素により切断されてＬＧＰ−Ｄｏｘになる（３７℃で３時間のインキュベーション後、２５％の代謝産物が放出される）。ＰｈＡｃ−ＡＩＧＰ−ＤｏｘはＣＤ１０により切断されてＩＧＰ−Ｄｏｘになる（３時間のインキュベーション後、１８％の加水分解）。ＰｈＡｃ−ＤＬＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＧＰＧＰ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＫＬＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＴＳＧＰ−Ｄｏｘは、ＣＤ１０によっては全く又は極めて僅かにしか活性化されない。
ＴＯＰはＳｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘを加水分解して、それぞれ６４％及び４４％のＡＬ−Ｄｏｘを放出する。ＡＬＡＦ−Ｄｏｘ及びＡＬＰＦ−Ｄｏｘ誘導体はいずれもＴＯＰによっては切断されない。
ＴＯＰは、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＫＬＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＴＳＧＰ−Ｄｏｘを活性化してＧＰ−Ｄｏｘにする（酵素の存在下で３時間インキュベートした後に検出される代謝産物の７２、３１及び３８％）。
ＰｈＡｃ−ＤＬＧＰ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＧＰＧＰ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＡＩＧＰ−Ｄｏｘは、ＴＯＰによっては切断されない。
キャッピングされたテトラペプチドＤｏｘプロドラッグのＴＯＰ及びＣＤ１０に対する感受性は、その血中安定性と相反するものではない。血中ペプチダーゼのほとんどはエキソプロテアーゼであり、キャッピングされたテトラペプチドＤｏｘプロドラッグが基質としてそれに接触することはできない。しかしながらＴＯＰ及びＣＤ１０は、キャッピング基の存在に影響を受けないエンドプロテアーゼである。
Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、及びＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘは腫瘍細胞が分泌する酵素により活性化されてＬ−Ｄｏｘを放出し、それより少ない程度にＡＬ−Ｄｏｘ及びＤｏｘを放出する。ＰｈＡｃ−ＡＬＡＦ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＡＬＰＦ−Ｄｏｘ、及びＳｕｃ−βＡＬＰＦ−Ｄｏｘは全て、腫瘍細胞が分泌する酵素により活性化されてＦ−Ｄｏｘになる。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは腫瘍細胞馴化培地の存在下で加水分解されてＧＰ−Ｄｏｘ及びＤｏｘ（５時間後に検出された全ての代謝産物のそれぞれ５６％及び２４％）になる一方、ＰｈＡｃ−ＫＬＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＴＳＧＰ−Ｄｏｘ活性化の後には主としてＧＰ−Ｄｏｘが検出される。ＰｈＡｃ−ＤＬＧＰ−Ｄｏｘ、ＰｈＡｃ−ＡＩＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＧＰＧＰ−Ｄｏｘは、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞が分泌するペプチダーゼの存在下では活性化されない。
ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、及びＡＬＰＦ−Ｄｏｘ誘導体について、ＰｈＡｃ保護基とＳｕｃ−βＡ保護基との間に有意差は示されない。
これらの実験では、ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ化合物が、腫瘍細胞が分泌する酵素によってより良好に切断され、さらなるインビボ分析用に選択されている。
ＣＤ２６も、ＦＡＰも、これらの酵素がエキソプロテアーゼ／ジペプチジルプロリン−プロテイナーゼであることと合致して、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ又はＬＧＰ−Ｄｏｘのいずれも加水分解しなかった。しかしながら、ＧＰ−Ｄｏｘは、ＣＤ２６（３７℃で３時間のインキュベーション後に９７％がＤｏｘに変換）及びＦＡＰ（３７℃で３時間のインキュベーション後に６２％がＤｏｘに変換）の両方に良好な基質である。
培養腫瘍細胞はＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ＤｏｘをＧＰ−Ｄｏｘに、ＬＧＰ−ＤｏｘをＤｏｘに、及びＧＰ−ＤｏｘをＤｏｘに変換することができ、これは一方でＣＤ１０及び／又はＴＯＰの存在（ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ＤｏｘからＬＧＰ−Ｄｏｘ又はＧＰ−Ｄｏｘ）、及び他方でＣＤ２６及び／又はＦＡＰの存在（ＧＰ−ＤｏｘからＤｏｘ）を示している。これによりまた、プロドラッグの二段階活性化プロセスが完全に細胞外で起こる、即ちプロドラッグの細胞内（リソソーム）プロセシングが不要であることも確認される。これは、インターナライズされ、さらに細胞内で加水分解されてＤｏｘになるＬ−Ｄｏｘ（Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘから放出される）と対照的である。
Figure 0006523965
続いて、プロリルペプチダーゼの活性に対する基質としてのＧＰ−Ｄｏｘ（ＴＯＰによりＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘから放出される）の感受性をさらに詳細に試験した。２つのかかる酵素ＣＤ２６（異名ＤＰＩＶ）及びＦＡＰは、癌化学療法において潜在的に重要な因子として浮上しつつある。ＣＤ２６（１μｇ／ｍｌ）又はＦＡＰは、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ、ＬＧＰ−Ｄｏｘ（ＴＯＰによりＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘから効率的に放出される）又はＳｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘのいずれも加水分解しなかった。しかしながら、ＧＰ−ＤｏｘはＣＤ２６及びＦＡＰの良好な基質であることが示され、切断されてＤｏｘになった（ＣＤ２６により９７％変換；ＦＡＰにより６２％変換）。このように、癌細胞に対するＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの特異性が増加するという点に注目することは重要である。ＴＯＰは、Ｓｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ又はＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（ＡＬ−Ｄｏｘを放出する）及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ（ＧＰ−Ｄｏｘを放出する）のプロドラッグ活性化プロセスに関与する。ＡＬ−Ｄｏｘは、細胞が分泌するペプチダーゼによるＬ−Ｄｏｘ及びＤｏｘへの変換に対してより一般的な感受性を示すが（及びＬ−Ｄｏｘは細胞内で自動的にＤｏｘに加水分解される）、ＧＰ−Ｄｏｘは、ＣＤ２６及びＦＡＰなどの、腫瘍細胞が主に放出するペプチダーゼに感受性を有するように見える。この感受性の違い及びＧＰ−ＤｏｘからＤｏｘへの活性化に関与する（ＡＬ−ＤｏｘからＤｏｘへの活性化と比べた）酵素の違いが、例えば一方でＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘと、他方でＳｕｃ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ又はＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘとの間の毒性及び活性の違いをもたらす可能性が高い。これに基づき、次の実施例に記載するとおり、ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘのインビボ毒性を評価した。
実施例４．マウスにおける単回又は複数回静脈内注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘコンジュゲートのインビボ毒性の評価
方法
ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを生理食塩水に溶解した。化合物をＯＦ−１マウスの外側尾静脈に静脈内ボーラス注射によって投与した（１０μｌ／ｇ）。体重をモニタすることによりインビボ毒性を評価した。
結果
図１の結果は、１６０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの高い毒性を示す。８０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘで処置した群では、有意な体重減少は観察されない。２４０及び３２０μｍｏｌ／ｋｇの用量でのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ注射は十分な忍容性がある。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ ２４０μｍｏｌ／ｋｇ処置群では中程度の体重減少（２８日目に最大１５％）が記録され、ＰｈＡｃ−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘと比較してその毒性が低いことが分かる。３２０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの注射は有意な体重減少を引き起こし、１匹のマウスは１２日目に死亡が認められた。これらのデータは、単回静脈内ボーラス注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの最大耐量（ＭＴＤ）が２４０〜３２０μｍｏｌ／ｋｇであることを示している。Ｄｏｘの毒性は３０〜４０μｍｏｌ／ｋｇの間を変動し、１回の静脈内注射後におけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの毒性が少なくとも６分の１であることを示している。
実施例５．ヌードマウスのヒト異種移植片腫瘍モデルにおける頻回静脈内ボーラス注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性試験
方法
ドキソルビシン及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの抗腫瘍活性を、ヒトＬＳ−１７４Ｔ結腸癌又はＭＸ−１乳癌の異所性異種移植片を有する無胸腺マウス（ｎｕｄｅ／ｎｕｄｅ ＮＭＲＩ）のモデルで試験した。
ＬＳ １７４Ｔ及びＭＸ−１腫瘍を、６週齢の雌性ＮＭＲＩヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の右側腹部に細胞（それぞれ３×１０６及び１０７細胞を注射した）を皮下移植することによって確立した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３のサイズに達したとき（以下の式を使用して計算した：［長さ×幅２］／２）、処置を開始した。初回注射当日、動物を４匹の動物の群に無作為に割り当てた。ドキソルビシン、及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを生理食塩水に溶解した。化合物を１０μｌ／ｇで外側尾静脈にボーラス静脈内注射（ｉ．ｖ．）によって送達した。実験の経過中、臨床徴候、体重及び腫瘍体積を週２回管理した。結果は時間の関数としての平均腫瘍体積の進展として提供する。最適Ｔ／Ｃ（対照マウスに対する処置マウスの平均腫瘍体積比）の値を処置有効性の尺度として使用した。最適Ｔ／Ｃ％は、達成された最大腫瘍成長阻害を示す（ＴＧＩ＝１００−（Ｔ／Ｃ’１００））。
結果
図２に示されるとおり、皮下移植したＬＳ１７４Ｔ腫瘍（結腸癌）を有するヌードマウスにおいてＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを１４０μモル／ｋｇ及び１６０μモル／ｋｇで２回（毎週１回）静脈内注射した。その体重、及び腫瘍サイズを２８日間追跡し、Ｄｏｘ（１５μｍｏｌ／ｋｇ）及びＮａＣｌで処置した動物群と比較した。全ての処置群で有意な且つ同程度の抗腫瘍活性が観察された（表４）。
これらのデータによりまた、１４０μｍｏｌ／ｋｇ及び１６０μｍｏｌ／ｋｇの用量における体重減少（最大１０％）が、９分の１の用量で投与したＤｏｘにより生じるものと同程度であったことから、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの毒性がより低いことも確認される。
Figure 0006523965
別の実験では、皮下移植したＭＸ−１腫瘍（乳癌）を有するヌードマウスにおいてＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを１００μｍｏｌ／ｋｇの用量で４回（０、３、６及び９日目に）静脈内注射した。その体重及び腫瘍サイズを２９日間追跡し、Ｄｏｘ（８μｍｏｌ／ｋｇ）及びＮａＣｌ処置した動物群と比較した。２つの試験薬物について、有意な体重減少がないこと及び同程度の有意性の抗腫瘍活性（＞６０％の腫瘍成長阻害）が観察された（図３及び表５）。
Figure 0006523965
実施例６．等モル用量のドキソルビシンと比較したマウスにおける単回静脈内ボーラス注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ及びその代謝産物の薬物動態学的組織内定量化
方法
ＯＦ−１マウスを使用して薬物動態学的組織分布試験を実施した。ドキソルビシン及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを８．６２ｍＭの用量で生理食塩水に溶解し、マウスに外側尾静脈における静脈内経路によって投与した（１０μＬ／ｇ）。薬物投与後の種々の時点（５分、３０分、１時間、４時間、７時間、１６時間及び２４時間）で各群３匹のマウスを頸椎脱臼により犠牲にし、血液及び心臓組織を採取した。心臓を切開し、リン酸緩衝生理食塩水で慎重にリンスし（心腔内の血液を除去する）、ペーパー上で乾燥させて液体窒素で凍結した。それらは分析まで保存した。血液試料を遠心（１０分、２０００ｇ、４℃）して血漿画分を分離し、それを分析用に保存した。心臓をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘホモジナイザーで１．５ｍＬの水中にホモジナイズした。ｍｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を計測した。抽出後（５０μＬ試料に１５０μＬのアセトニトリルを添加した）、ＨＰＬＣにより薬物の組織内定量化を行った。試料をボルテックスし、室温１３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を回収した。２００ｍＭのギ酸緩衝液ｐＨ４．５（１体積 試料上清＋３体積 緩衝液）を添加することにより試料を緩衝した後、ＨＰＬＣ分析を行った（蛍光検出 ｅｘ＝２３５ｎｍ ｅｍ＝５６０ｎｍ）。
結果
ドキソルビシン及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘを野生型雌性ＯＦ−１マウスに８６．２μｍｏｌ／ｋｇの等モル用量で静脈内ボーラス注射した。血漿及び心臓組織における薬物及び代謝産物濃度の進展をＨＰＬＣ分析により決定した。Ｄｏｘ又はＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの注射後、最初の５分間で薬物血漿濃度の約９０％が消失した（図４Ａ及び図４Ｂ）。１％未満のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘが急速に加水分解されＬＧＰ−Ｄｏｘ、ＧＰ−Ｄｏｘ及びＤｏｘになった。１時間後、これらの代謝産物はもはや検出されなかった。ドキソルビシンを注射した後のドキソルビシンの血漿曲線下面積（ＡＵＣ）値は、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの注射後より６３倍高い（表６）。
心臓はドキソルビシンの重要な毒性の標的であるため、遊離薬物の心臓組織内濃度を決定した。また、ドキソルビシンを注射した後のドキソルビシンの心臓ＡＵＣ、及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを投与した後のＤｏｘ、ＧＰ−Ｄｏｘ及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの心臓ＡＵＣも決定した（表６）。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ投与後のＤｏｘ心臓ＡＵＣは、等モル用量のＤｏｘ投与後と比べて２５分の１であった。Ｄｏｘ ＡＵＣの臨床的な心臓毒性効果を所与とすれば、これらの結果は、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘがドキソルビシンと比べて心臓毒性が大幅に低いことを強く示唆している。
Figure 0006523965
実施例７．心筋細胞に対するＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘのインビトロ細胞毒性アッセイ
マウス胚性幹細胞由来心筋細胞（Ｃｏｒ．Ａｔ（登録商標）、Ａｘｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ドイツ））を使用して初期リード最適化における心臓安全性スクリーニング用の関連性のある且つ予測的なインビトロモデルでインビトロ心毒性試験を実施した。Ｃｏｒ．Ａｔ（登録商標）心筋細胞は、化合物の潜在的心臓細胞毒性をインビトロで分類するための標準化された均質且つ再現可能な細胞系を提供する。試験化合物とインキュベートした後、ニュートラルレッド取り込み試験を用いて、非特異的な参照細胞型、例えばマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）と比較したときの心臓細胞の生存率及び完全性に直接影響を及ぼす効果を決定した。
結果
漸増濃度のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ又はドキソルビシンの存在下でＣｏｒＡｔ心筋細胞をインキュベートした。４８時間後、ニュートラルレッド取り込み試験を用いて細胞生存率を決定した。対照細胞としてマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用して、心臓特異的毒性を一般的な細胞毒性と区別した。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの用量反応曲線（図５）は、実に、試験した最も高い濃度（２０μｇ／ｍｌ）に限りＣｏｒ．Ａｔ心筋細胞に対して中程度の毒性効果を示した。この濃度では、ＭＥＦに対する効果はそれほど明白でない（３７％生存率に対して８１％生存率）。ＭＥＦについては、この化合物ではＩＣ５０に達しない。試験したそれより低いいずれの濃度でも、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは毒性効果を示さなかった。ドキソルビシンの用量反応曲線は試験した２つの最も高い濃度（２０μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌ）でＣｏｒ．Ａｔ心筋細胞に対しても、並びにＭＥＦに対しても、実に重度の毒性効果を示した。０．２μｇ／ｍｌでこの化合物はＣｏｒ．Ａｔ心筋細胞に対し実に中程度の毒性効果を示したが、ＭＥＦに対しては最低限の効果しか示さなかった（Ｃｏｒ．Ａｔ心筋細胞の６７％生存率に対してＭＥＦの８９％生存率）。Ｃｏｒ．Ａｔ心筋細胞に対する効果は、ＭＥＦに対する効果より僅かに高いに過ぎないが、この化合物は、一般的な細胞毒性効果に隠されていることがあり得る心臓毒性効果を及ぼすと考えられる。
図５に示すとおり、この試験は、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ＤｏｘがＤｏｘと比べてＣｏｒ．Ａｔ（登録商標）心筋細胞に対する細胞毒性が４０〜５０分の１であることを示している。
実施例８．ＬｏＶｏ結腸癌異種移植片を有するヌードマウスにおける単回静脈内ボーラス注射後の腫瘍部位におけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ活性化の評価
方法
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの腫瘍活性化を、ヒトＬｏＶｏ結腸癌の異所性異種移植片を有する無胸腺マウス（ｎｕｄｅ／ｎｕｄｅ ＮＭＲＩ）を使用して評価した。ＬｏＶｏ腫瘍を、６週齢雌性ＮＭＲＩヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の右側腹部に細胞（１０７細胞）を皮下移植することによって確立した。異種移植片の皮下移植後４週間に薬物又は対照を投与した。注射当日、動物を４匹の動物の群に無作為に割り当てた。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘコンジュゲートを漸増用量（１．５、３．５、５、１０、２０、３０、４６、及び６２ｍＭ）で生理食塩水中に溶解した。コンジュゲートを１０μｌ／ｇで外側尾静脈にボーラス静脈内注射（ｉ．ｖ．）によって送達した。注射後２４時間でマウスを頸椎脱臼により犠牲にし、腫瘍を回収し、リン酸緩衝生理食塩水でリンスしてホモジナイズした。アセトニトリルで腫瘍ホモジネートからの薬物の抽出を実施し、腫瘍中に存在するドキソルビシンをＨＰＬＣ分析によって定量化した。
結果
図６の結果から、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの注射用量に伴いＤｏｘ腫瘍内濃度が増加し、２００μｍｏｌ／ｋｇでプラトー値に達することが分かる。この実施例の結果は、腫瘍部位における限られたプロドラッグ活性化速度及び利用可能性が、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘとの接触期間の間に利用可能な最大の酵素活性に依存し得ることを示している。
実施例９．マウスにおける単回及び複数回腹腔内注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘのインビボ毒性の評価
方法
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを生理食塩水中に溶解し、ＯＦ−１マウスの外側尾静脈に単回又は複数回腹腔内（ｉｐ）注射によって投与した（１０μｌ／ｇ）。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは、以下の種々の注射スケジュールに従い２８０及び５６０μｍｏｌ／ｋｇの同様の累積用量で投与した：単回ｉｐ注射；５６及び１１２μｍｏｌ／ｋｇで１日１回５日連続ｉｐ注射又は２８及び５６μｍｏｌ／ｋｇの用量で１日２回５日連続。体重をモニタすることによりインビボ毒性を評価した。
結果
いずれの注射スケジュールでも、２８０μｍｏｌ／ｋｇの累積用量のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを受けた動物群では体重減少は記録されなかった（図７）。２８０μｍｏｌ／ｋｇの単回ｉｐ注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの毒性研究を別途行っており、結果を図７に示す。単回ｉｐ注射により投与した５６０μｍｏｌ／ｋｇの用量は極めて毒性が高かった。動物は１週間で体重が２５％減少し、犠牲にした。結果は明らかに、用量を複数回の注射に分割することが毒性を低下させることを示している。１１２μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの１日１回５日連続ｉｐ注射もまた、１１日目に最大２２．５％の大きい体重減少を引き起こしたが、その後回復期が続いた。５６μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの１０回のｉｐ注射（１日２回５日連続）で処置した群では、体重減少は観察されなかった。同レジームに従い注入されるドキソルビシンの最大耐量が３μｍｏｌ／ｋｇであることを考えると、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンは、これらの条件下では毒性が約１５分の１である。
実施例１０．等モル用量のドキソルビシンと比較したマウスにおける単回腹腔内注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ及びその代謝産物の薬物動態学的組織内定量化
方法
ＯＦ−１マウスを使用して薬物動態学的組織分布試験を実施した。ドキソルビシン及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを９．２ｍＭの用量で生理食塩水に溶解し、腹腔内経路によってマウスに投与した（１０μＬ／ｇ、各群６匹のマウス）。薬物投与後の種々の時点（５分、３０分、１時間、４時間、及び２４時間）で、ＥＤＴＡコートを施したマイクロチューブ（Ｓｔａｒｓｔｅｄ）を使用して３匹のマウスの外側尾静脈から血液試料を採取した。２４時間後、各群３匹のマウスを頸椎脱臼により犠牲にし、心臓を採取した。それらの心臓を切開し、リン酸緩衝生理食塩水中で慎重にリンスし（心腔内の血液を除去する）、ペーパー上で乾燥させて液体窒素で凍結した。それらは分析まで保存した。心臓をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘホモジナイザーで１．５ｍＬの水中にホモジナイズした。ｍｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を計測した。抽出後（５０μＬ試料に１５０μＬのアセトニトリルを添加した）、ＨＰＬＣにより薬物の組織内定量化を行った。試料をボルテックスし、室温１３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を回収した。２００ｍＭのギ酸緩衝液ｐＨ４．５（１容積試料上清＋３容積緩衝液）を添加することにより試料を緩衝した後、ＨＰＬＣ分析を行った（蛍光検出 ｅｘ＝２３５ｎｍ ｅｍ＝５６０ｎｍ）。
結果
ＯＦ−１マウスへの腹腔内（ｉｐ）注射後、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの血中薬物動態を評価した。９２μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘのｉｐ注射後最初の５分間で、注射した用量の低い割合（約１％）が血液コンパートメントに達した。プロドラッグの血中濃度は１時間安定しており、続いて低下した。４時間後、コンジュゲートはもはや検出されなかった（図８Ａ）。ＡＵＣ値は、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ及びＤｏｘについてそれぞれ４４．２μＭ．ｈ及び３．６μＭ．ｈであった。図８Ｂの結果は、等モル用量でのドキソルビシンの血中薬物動態を示す。注射後最初の５分間で、注射した用量の低い割合（約２．５％）が血液コンパートメントに達した。血中Ｄｏｘ濃度は１時間以内に極めて低い濃度に急速に低下し、それが注射後最大２４時間にわたり安定したまま保たれた。ドキソルビシンのＡＵＣ値は７０．３μＭ．ｈであった。
等モル用量のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ又はドキソルビシンのｉｐ注射後２４時間におけるドキソルビシン心臓組織内濃度を計測した。表７の結果は、９２μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの腹腔内注射後に蓄積するドキソルビシンが、等モル用量のドキソルビシンの注射後と比べて１９分の１であることを示している。
Figure 0006523965
実施例１１．ヌードマウスのヒト異種移植片腫瘍モデルにおける頻回腹腔内注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの生体内有効性の評価
方法
ヒトＬｏＶｏ結腸癌又はＭＸ−１乳癌の異所性異種移植片を有する無胸腺マウス（ｎｕｄｅ／ｎｕｄｅ ＮＭＲＩ）を使用して、遊離ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性を評価した。６週齢雌性ＮＭＲＩヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の右側腹部に細胞（１０７細胞）を皮下移植することにより、腫瘍を確立した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３のサイズ（ノギスを使用して計測し、以下の式により計算した：［長さ×幅２］／２）に達したときに処置を投与した。動物を４〜６匹の動物の群に無作為に割り当てた。ドキソルビシン及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを生理食塩水に溶解した。化合物を１０μｌ／ｇでボーラス腹腔内注射（ｉｐ）によって送達した。実験の経過中、臨床徴候、体重及び腫瘍体積を週２回管理した。結果は時間の関数としての平均腫瘍体積の進展として提供する。最適Ｔ／Ｃ（処置マウスと対照マウスとの平均腫瘍体積比）の値及びＴＧＤ（１０００ｍｍ３に達する際の腫瘍増殖遅延）を処置有効性の尺度として使用した。最適Ｔ／Ｃ％は、達成された最大腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示す（ＴＧＩ＝１００−（Ｔ／Ｃ’１００））。２２日目にＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアのマンホイットニーｔ検定を使用して統計的分析を実施した。
結果
Ｌｏｖｏ異種移植片を有するマウスが生理食塩水、又は０．５、１及び２μｍｏｌ／ｋｇのドキソルビシン、又は２５、３５及び５０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈａｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの１日２回（５〜６時間間隔で）５日連続（２Ｑ１Ｄ５；合計１０回の注射）の腹腔内注射を受けた。その体重及び腫瘍サイズを追跡して比較した（図９）。ＮａＣｌ及びドキソルビシン処置群では、腫瘍壊死が起こった時点で腫瘍の計測を中止した。この実験において有意な体重減少は記録されなかった。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは用量依存性の抗腫瘍効果及び腫瘍増殖遅延の増加を生じた（表８）。２μｍｏｌ／ｋｇのドキソルビシンで処置した群で中程度の腫瘍成長阻害が観察された一方、０．５及び１μｍｏｌ／ｋｇの用量では抗腫瘍活性は見られなかった。２２日目、５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘによる抗腫瘍効果は２μｍｏｌ／ｋｇ Ｄｏｘと比較したとき統計的に高く、それぞれ６５％及び４５％のＴＧＩ値であった。各処置によって生じた絶対成長遅延を、処置マウスの腫瘍が１９０から１，０００ｍｍ３に成長するまでの時間（日）から媒体処置マウスで腫瘍が同じサイズに達するまでの時間（日）を引いた差として計算した。５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ処置プロトコルは１７日の成長遅延をもたらした一方、最大用量の２μｍｏｌ／ｋｇドキソルビシン単独は６日の成長遅延を生じさせたに過ぎなかった。
Figure 0006523965
別の同様の試験では（図１０）、薬物又は対照を２週連続で投与した（２Ｑ１Ｄ５×２Ｗ；合計２０回の注射）。この場合、結果は明らかに、ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘのより良好な有効性及びより低い毒性を示す。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ処置群において有意な体重減少は観察されなかった（５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ群で９日目に最大１３％）。しかしながら、ドキソルビシン処置群では用量依存性の毒性が観察された。１．５及び２μｍｏｌ／ｋｇの用量は極めて毒性が高く、重度の体重減少及び動物の死亡を引き起こした。１μｍｏｌ／ｋｇの用量は毒性がやや低かったが、連続的な体重減少が観察された（２９日目に最大１５％）ことからＭＴＤは上回り、２９日目に１匹の死亡マウスが認められた。この用量では、ドキソルビシンは活性が極めて低く、２９日目に４４％のＴＧＩ値であった。５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘで最も高い有効性が達成され、２９日目に７３％のＴＧＩ値で、且つ２２日の有意なＴＧＤであった（表９）。
Figure 0006523965
ＭＸ−１異種移植マウスが、５０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ又は１μｍｏｌ／ｋｇ若しくは１．５μｍｏｌ／ｋｇのドキソルビシンの１日２回のｉｐ注射を含む１週間のサイクルを７２時間間隔で２サイクル受けた（２Ｑ１Ｄ５×２Ｗ；合計２０回の注射）。１．５μｍｏｌ／Ｋｇのドキソルビシンは極めて毒性が高く、重度の体重減少及び動物の死亡を引き起こした。１μｍｏｌ／ｋｇ（ＭＴＤ）のドキソルビシン及び５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘについては、有意な体重減少は観察されなかった。図１１の結果は、５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘが腫瘍成長を有意に阻害し、１μｍｏｌ／ｋｇドキソルビシン（ＭＴＤ）と比較して向上した有効性を有することを示している。試験終了時（３５日目）、腫瘍成長阻害率はＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ又はドキソルビシンついてそれぞれ７６％及び４４％であった（表１０）。この試験では、全ての群で腫瘍壊死が観察された（壊死した腫瘍を有するマウスは試験から除外した）。
これらの実験により、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの毒性がドキソルビシンと比較して２５〜５０分の１であることが確認された。
Figure 0006523965
実施例１２．マウスのＢ１６Ｆ１０メラノーマ肺転移モデルにおける頻回腹腔内注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性評価
方法
十分な記載がなされているＢ１６−Ｆ１０肺転移性メラノーマモデルにおいてＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの有効性を試験した。この目的上、５×１０７個のＢ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ６マウスの外側静脈に注射した。処置は細胞注射の３日後に開始した。動物は１日２回（５〜６時間間隔）５日連続で生理食塩水又は２及び３．５μｍｏｌ／ｋｇのドキソルビシン又は５０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの腹腔内注射を受けた（合計１０回の注射／マウス）。細胞注射後１４日目に各群５匹のマウスを犠牲にした。肺を採取し、メラニン定量化のため処理した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７４：１５７６−１５８６，２００８）。残りのマウスを観察することにより、生存を決定した。
結果
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは、ＮａＣｌ及びドキソルビシン処置群と比較して有意に肺転移の形成を阻害し、マウスの生存を増加させる（図１２）。１４日目、肺ホモジネート中のメラニンの量は対照群で５０１ｍｇ／ｍＬ、２及び３．５μｍｏｌ／ｋｇドキソルビシン処置群で１８３及び５３ｍｇ／ｍＬ、及び５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ処置群で１６ｍｇ／ｍＬであった。生存期間中央値は、ＮａＣｌ、２及び３．５μｍｏｌ／ｋｇドキソルビシン又は５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘを受けた群でそれぞれ２０、２４、２８及び３６日であった。
実施例１３．マウスの同所性ＨＣＴ１１６結腸癌腫瘍モデルにおける頻回腹腔内注射後のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの生体内有効性の評価
方法
ＨＣＴ１１６細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。異種移植片が確立された後、それらを切除し、ガンマ線を照射した他の雌性ＳＣＩＤマウスの盲腸（ｃｅａｃｕｍ）に顕微手術技法を用いて同所性移植した。癌細胞注射後１２日目にマウスを１６匹の４群に無作為化した。それらの群が、５日連続で１日２回、それぞれ生理食塩水、２μｍｏｌ／ｋｇのドキソルビシン並びに３５及び５０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの腹腔内注射を受けた。結腸癌細胞を盲腸に注射後３４日目に動物を犠牲にし、転移数を肉眼でカウントし、原発腫瘍を秤量した。
結果
結果を図１５及び図１６に示す。２μｍｏｌ／ｋｇのドキソルビシンはＳＣＩＤマウスには毒性が高過ぎることが分かり、１０日以内に全ての動物が死亡した。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘもまた他の試験動物腫瘍異種移植モデルと比較してこれらのマウスに対する毒性がより高く、３５μｍｏｌ／ｋｇの用量で１２匹のマウスが３４日生存し、５０μｍｏｌ／ｋｇ処置群では９匹のマウスが生き残った。
対照群では０．８８ｇ（ＳＤ０．４１）の平均原発腫瘍重量が得られた。３０μｍｏｌ／ｋｇのＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの第２の群は、０．６９ｇ（ＳＤ０．２５）の原発腫瘍重量を有した一方で、５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの群は０．４４ｇ（ＳＤ０．１０）の有意な腫瘍重量減少を呈した。
肝転移数は、対照及び３０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘで処置した群についてそれぞれ２０（ＳＤ３３）及び２４（ＳＤ２６）であった。５０μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの効果は非常に顕著で、平均転移数は１．７８（ＳＤ２．９）であった。
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは毒性（ｔｏｘｉｃｉｃｔｙ）を完全に欠いていたわけではないが、このプロドラッグは少なくとも、非毒性レベルでは原発腫瘍（例えば結腸癌）それ自体に対して有効でない場合に、転移（例えば結腸癌の肝転移）の処置／予防用に保持され得る。
実施例１４．ドキソルビシンと比較したＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの白血球減少評価
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ（３５μｍｏｌ／ｋｇ ｉｐ）及びドキソルビシン（３．５μｍｏｌ／ｋｇ ｉｐ）の白血球減少効果を２つの独立した実験で比較した。ＣＤ１マウスが薬物の１日２回の腹腔内注射を５日連続で受けた（合計１０回の注射／マウス；２×各群５匹の動物）。マウスの体重の進展を記録した。処置開始後４、１１及び１５日目、ＥＤＴＡコートを施したＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓチューブ（Ｓｔａｒｓｔｅｄ）に尾静脈から血液を採取した。白血球（ＷＢＣ）を、ＳＣＩＬｖｅｔ ａｂｃ血液分析器を使用してカウントした。ＷＢＣの増加又は減少は、各マウスの０日目のＷＢＣ（１００％）に対する割合として表した。図１３は、２つの試験を合わせた結果を示す。
図１３Ａは、２つの群の体重変動の平均値及びＳＤを提供し、図１３Ｂは、白血球の変動を各マウスの０日目のＷＢＣに対する割合として示す。これらの結果は、明らかに、１０分の１の用量で投与したドキソルビシンと比較して３５μｍｏｌ／ｋｇ ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ ｉｐの毒性が存在しないことを示している。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ処置群では、白血球減少効果及び体重減少は観察されなかった。他方で、ドキソルビシン処置群では、１１日目に１匹のマウス並びに１５日目に３匹のマウスに死亡が認められた。ドキソルビシンは中程度乃至重度の白血球減少（１５日目に平均−４３％ＷＢＣ）及び体重減少（１５日目に平均−１５％）を引き起こした。
実施例１５．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘ慢性心毒性の評価
方法
マウスにおけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの慢性心毒性を、Ｂｅｒｔａｚｚｏｌｉ ｅｔ ａｌ．１９７９（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ ６３，１８７７−１８８３）によって以前記載されたとおり形態学的に評価した。ＣＤ１雌性白マウスを、１０μＬ／ｇの尾静脈におけるボーラス静脈内注射によって処置した（各群６マウス）。化合物は週２回、１０回注射した。最初の４回の注射と最後の６回の注射との間に動物を２週間処置しないでおき、骨髄抑制を回復させた。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの処置用量レベルは、１３．８；２７．６；５５．２；及び８２．８μｍｏｌ／ｋｇであった。ドキソルビシン６．９μｍｏｌ／ｋｇを参照として使用した。最後の注射後３週間でネンブタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することにより動物を深麻酔し、失血させた。心臓を慎重に採取し、ＮａＣｌ ９‰でリンスし、１０％ホルムアルデヒド溶液中に固定した。試料を病理組織分析（ＣＩＴｏｘ Ｌａｂ、Ｆｒａｎｃｅ）用に処理した。心臓をトリミングし、パラフィンワックスに包埋し、厚さ４ミクロンの切片に切り、ヘマトキシリン−エオシンで染色した後、顕微鏡的評価を行った。実験の経過中、各注射前又は週１回、体重を管理した。
結果
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘで処置した群において体重減少は観察されなかった（図１４）。処置終了時、ドキソルビシン処置動物は脱力の徴候を示し、移所運動活性が低下した。ドキソルビシン処置群では、中程度の体重低下（最大で犠牲時における８％）が記録された。
心毒性の顕微鏡的評価の結果を表１１に示す。ドキソルビシン処置群の１匹のマウスは早期（１７日目）に死亡したため顕微鏡検査に出さなかった。６．９μｍｏｌ／ｋｇドキソルビシンを投与した全てのマウスに心臓の顕微鏡的変化があった。心室、中隔及び心房に散在した筋線維の小さい明瞭な細胞質内空胞の存在を特徴とする心筋層の空胞形成が最小限又は僅かにあった。５匹中３匹のマウスで心室及び中隔における筋線維の核が肥大した。加えて、心房筋の特に左側に萎縮及び／又は病変があった。５匹中４匹のマウスに心房筋線維の萎縮及び炎症性浸潤が見られ、５匹中３匹のマウスではフィブリン血栓を伴った。これらのマウスの１匹では、筋線維の変性／壊死もあった。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの投与は、いずれの用量レベルにおいても（即ちドキソルビシンと比較して最大１２倍高い用量）、心臓に何ら病的な顕微鏡的所見を生じなかった。
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総括：ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘの最大耐量は、種々のスケジュール及び投与方法に応じてＤｏｘの６〜１６分の１の毒性であり、３つの実験的腫瘍モデル（ＬＳ１７４Ｔ及びＭＸ−１異種移植片及び肺転移Ｂ１６メラノーマモデル）に対する活性が有意に高い。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−Ｄｏｘは有効用量で白血球減少を引き起こさず、マウスモデルにおいてドキソルビシンのそのＭＴＤレベルの用量の１２倍に相当する用量で累積的心毒性を示さない。
実施例１６．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰとコンジュゲートした他の細胞毒性化合物の合成及び評価
１．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−メイタンシン
メイタンシンは強力な微小管標的化合物であり、サブナノモル濃度で有糸分裂停止を誘導して腫瘍細胞を死滅させる。しかしながら、その副作用及び腫瘍特異性の欠如が、臨床使用の奏効を妨げている。メイタンシンは微小管集合を阻害し、微小管分解を誘導し、及び有糸分裂を中断させる。メイタンシンは多くの腫瘍細胞株に対して細胞毒性を呈し、ビンカアルカロイドより約１００倍高い細胞毒性及びドキソルビシンより約１０００倍高い毒性を示す。
臨床試験では、胃腸及び中枢神経毒性が用量制限毒性であった一方、骨髄抑制はまれであった。単剤として評価したとき、メイタンシンは種々のタイプの癌を有する患者においていかなる有意な反応も示さなかった。
以下の図はメイタンシンを示す：
Figure 0006523965
メイタンシンは、その遊離−ＮＨ又はＯＨ基と反応する自己犠牲スペーサーを介してＰｈＡｃ−ＡＬＧＰとコンジュゲートすることができる。メイタンシンは市販されている（例えば、Ｍｅｄｋｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｘｕｚｋｏｕ Ｋａｉｙｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）。
２．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ゲルダナマイシン
ゲルダナマイシン及びその誘導体は、ベンゾキノンアンサマイシンのファミリーであり、当初はその弱い抗生物質活性に基づき単離され、後に強力な抗腫瘍活性を示すことが分かった抗生物質である。ゲルダナマイシンは、その正常な細胞対応物と比較して、ｖ−ｓｒｃ、ｂｃｒ−ａｂｌ及びｐ５３などの腫瘍細胞で突然変異するタンパク質の優先的な分解を誘導する。この効果はＨｓｐ９０によって媒介される。その強力な抗腫瘍性の潜在能力にも関わらず、ゲルダナマイシンは抗腫瘍剤としていくつかの重大な欠点を有し、それがゲルダナマイシン類似体、詳細には１７位に置換を含む類似体の開発につながっている。
Figure 0006523965
この位置でゲルダナマイシンを誘導体化することにより、インビボ毒性がゲルダナマイシンより低い１７ＡＡＧ（１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン）がもたらされる。１７ＡＡＧに対するＨｓｐ９０の親和性がゲルダナマイシンより低いにも関わらず、１７ＡＡＧとゲルダナマイシンとは同程度の又は同じ濃度で悪性細胞において生物学的効果を提供する。ゲルダナマイシンは高親和性でＨｓｐ９０のＡＴＰ結合ポケットに結合する。Ｈｓｐ９０は、腫瘍細胞の成長及び／又は生存を促進する複数の突然変異し及び過剰発現するシグナル伝達タンパク質の折り畳み、集合及び活性にとって決定的に重要な遍在性の分子シャペロンである。ゲルダナマイシンがＨｓｐ９０と結合することにより、その標的の不安定化及び分解が引き起こされる。Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２００９（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １９，２６５０−２６５３）は、リソソーム酵素により切断可能なリンカーによってゲルダナマイシン（ｇｅｌａｄａｎａｍｙｃｉｎ）を抗体に結合する技法を記載している。このリンカーは（自己犠牲）バリン−アラニン−ｐ−アミノベンジル−アミノ部分を組み込み、一方でゲルダナマイシンのアミノ基との、及び他方で抗体の遊離アミノ基との結合を可能にする。同じ結合技法を用いて、但しリンカーにおいてバリン−アラニンジペプチドをアラニン−ロイシン−グリシン−プロリンテトラペプチドに置換した後に、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ゲルダナマイシンを得ることができる。ゲルダナマイシンは市販されている（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡＧ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−パクリタキセル）。
３．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−パクリタキセル及びＰｈＡｃ−ドセタキセル
タキサンは、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）植物により産生されるジテルペンである。タキサンには、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ））及びドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）；以下の図を参照）が含まれる。
Figure 0006523965
パクリタキセルは、チューブリンを標的とするいくつかの細胞骨格薬物のうちの１つである。パクリタキセル処置細胞は、紡錘体集合、染色体分離、及び細胞分裂の欠損を有する。パクリタキセルは微小管重合体を安定させてそれを解重合から保護し、それにより有糸分裂を阻止する。最近の研究では、有糸分裂を阻止するのに必要な濃度より低い濃度で動態の抑制が起こることが実証されている。より高い治療的濃度では、パクリタキセルは、通常有糸分裂中に活性化されるプロセスである中心体からの微小管解離を抑制するものと見られる。パクリタキセルは、卵巣癌、乳癌及び肺癌並びにカポジ肉腫の処置用に承認されている。共通する副作用としては、悪心嘔吐、食欲不振及び血液毒性、例えば、好中球減少症、貧血症及び血小板減少症が挙げられるが、一部の副作用は、使用される賦形剤の、ポリオキシエチル化ヒマシ油であるクレモフォールＥＬに関連する。
ドセタキセル又はタキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）は、その化学構造の２つの位置でパクリタキセルと異なる。これは炭素１０（パクリタキセルが酢酸エステルを有するところ）にヒドロキシル官能基を有し、フェニルプロピオン酸側鎖に、パクリタキセルにおけるベンジルアミドの代わりにｔｅｒｔ−ブチルカルバメートエステルが存在する。炭素１０官能基の変化に起因して、ドセタキセルはパクリタキセルより水溶性が高い。炭素２のヒドロキシル基は修飾されないままである。
Figure 0006523965
パクリタキセルは単純反応によって抗体に結合された（Ｇｕｉｌｌｅｍａｒｄ ＆ Ｓａｒａｇｏｖｉ ２００１；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１，６９４−６９９）。グルタルアルデヒドを反応させることによりパクリタキセルが誘導体化され、切断可能なエステル結合を含む２’−グルタリル−パクリタキセルが得られた。次に、カルボジイミドでヒドロキシル基を除去することにより２’−グルタリル−パクリタキセルが活性化され、直接そのアミノ基を介してペプチド結合を形成することによって抗体に結合された。この技法はタキソールを抗ハーセプチンモノクローナル抗体と結合させるために最近用いられた（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１２；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１２．２８３）。実験結果は、このコンジュゲートが実験腫瘍で活性であることを示しており、この薬物が生体内で放出されることが示される。
パクリタキセルはまた、パクリタキセルを２’位でスクシニル化し、且つアミド結合を介して抗体にカップリングした後、抗体にコンジュゲートされた（Ｓａｆａｖｙ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ １４，３０２−３１０）。
活性２’−グルタリル又は２’−スクシニルパクリタキセルをＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−テトラペプチドに；或いはスクシニル−パクリタキセルのカルボキシル基に結合している自己犠牲スペーサーにコンジュゲートする同様の方法が用いられる。また、テトラペプチドが及ぼす立体障害は抗体と比べてはるかに小さいことを当然考慮して、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−パクリタキセルコンジュゲートからのタキソールの生体内放出を予想することは理に適っている。パクリタキセル上のスクシニル基のエステル性を考えると、スクシニル結合プロドラッグコンジュゲートの血中での安定性は問題となり得る。従って、２’炭素とテトラペプチドとの間に自己犠牲基を使用することが好ましいこともある。これらのコンジュゲート方法は、変化しない２’炭素を考慮してドセタキセルにも適用することができる。
パクリタキセルは市販されている（例えばＨｕｌａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、ＴｒａｄｅＩｎｄｉａ）。
４．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−カンプトテシン
カンプトテシン（ＣＰＴ；以下に示す構造）は、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩ（ＴｏｐｏＩ）を阻害する細胞毒性キノリンアルカロイドである。ＣＰＴは予備臨床試験で顕著な抗癌活性を示したが、低い溶解性及び（高い）有害薬物反応を被る。これらの欠点のために、合成及び医薬品化学者は多数のカンプトテシン合成及び様々な誘導体を開発している。２つのＣＰＴ類似体、即ちトポテカン及びイリノテカンが承認されており、現在の癌化学療法において用いられている。
研究から、７位、９位、１０位及び１１位における置換がＣＰＴ活性及び物理的特性、例えば効力及び代謝安定性に対して正の効果を有し得ることが分かっている。ホモカンプトテシンのように、ラクトン環を１メチレン単位だけ拡大することもまたその能力を増強する。１２位及び１４位の置換は不活性誘導体をもたらす。
Figure 0006523965
Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２００９（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２０，１２４２−１２５０）は、抗体とカンプトテシン類似体との間のコンジュゲートの設計及び合成を記載した。７−ブチル−１０−アミノカンプトテシン（ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｈｏｔｈｅｃｉｎ）及び７−ブチル−９−アミノ−１０，１１−メチレンジオキシ−カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｅ）はカンプトテシン（ｃａｍｐｔｈｏｔｈｅｃｉｎ）と比べて１０〜１０００倍強力であり、リソソーム酵素の存在下で薬物を放出する自己犠牲スペーサーを含むジペプチドリンカーを介して抗体に結合することができる。カンプトテシン又はその誘導体とＰｈＡｃ−ＡＬＧＰとのコンジュゲートに至らせるため、同様の技法が実現可能である。
カンプトテシンは市販されている（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｅｅｂｏｏ Ｄｈａｋｈｗａ）。
５．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ビンブラスチン及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ビンクリスチン
ビンブラスチン（以下に構造を示す）は、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌、及び精巣癌を含めたある種の癌の処置に使用される抗微小管薬である。ビンブラスチンはまた、ランゲルハンス細胞組織球症の処置にも使用される。ビンブラスチンは伝統的には、マダガスカルのニチニチソウ（Ｍａｄａｇａｓｃａｒ ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ）であるツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）としても知られるニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）から得られた。ビンブラスチンは植物においてアルカロイドのカタランチン及びビンドリンの連結により生成される。
Figure 0006523965
極めて低い濃度では、ビンブラスチンは微小管動態を抑制し、より高い濃度では微小管重合体物質を低減する。共通する副作用は白血球及び赤血球の低血球数であり、及び血小板が一時的に低下することもある。
ビンクリスチンは、Ｎ１がＣＨ３の代わりにＣＨＯである点だけがビンブラスチンと異なる近縁類似体である。構造上はビンブラスチンと極めて類似しているが、ビンクリスチンは他の治療適応症及び極めて重度の副作用を有する。その主な適応症は、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、及び腎芽細胞腫（低年齢小児に最も一般的な腎腫瘍であるウィルムス腫瘍）の処置である。ビンクリスチンの主な副作用は、末梢神経障害、低ナトリウム血症、便秘、及び脱毛である。末梢神経障害は重篤であり得るとともに、ビンクリスチンの使用を回避、低減、又は中止する理由となり得る。
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ビンブラスチン又は−ビンクリスチンコンジュゲートは、その炭素Ｃ４に結合した自己犠牲性スペーサーを介してデスアセチルビンブラスチン又はデスアセチルビンクリスチンを結合することにより得られ得る。
Ｋａｎｄｕｋｕｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８５（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２８，１０７９−１０８８）は、アミノ酸のカルボキシル末端側鎖とのアミド結合が関与するビンブラスチンのアミノ酸誘導体の合成方法を開発した。この結合は、Ｃ４デアセチルビンブラスチンとＮ−マレオイルアミノ酸との間の混合無水物縮合によって達成された；ビンブラスチン−Ｃ４アミノ酸マレオイルはまたラクトサミン化血清アルブミンともコンジュゲートされ、ＨｅｐＧ２癌腫に対して活性であることが示された（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９，９７３−９７９）。論理的にはビンクリスチンに同じ手法を適用することができる。ビンブラスチン又はビンクリスチンとＰｈＡｃ−ＡＬＧＰのコンジュゲーションも同様にこの方法で実現することができる。後者のコンジュゲートは、抗癌活性を保持しながらも、非コンジュゲートビンブラスチン又はビンクリスチンと比べてより良好な安全性プロファイルを有する。ビンブラスチン（例えばＭｅｄｋｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、並びにビンクリスチン（例えばＴｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｄｋｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は市販されている。
６．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−メトトレキサート及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰアミノプテリン
メトトレキサートは葉酸代謝拮抗薬である。メトトレキサートは癌及び自己免疫疾患の処置において使用される。
Figure 0006523965
ジヒドロ葉酸（上）とメトトレキサート（下）との構造の類似性は、メトトレキサートがジヒドロ葉酸の競合阻害薬であることを示唆している。
メトトレキサートは、単独で、或いは他の薬剤と組み合わせて、化学療法のために当初開発され、且つそのために使用され続けている。メトトレキサートは、乳癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、肺癌、骨肉腫、膀胱癌、及び栄養膜新生物を含めた多くの癌の処置に有効である。最も一般的な有害作用としては、潰瘍性口内炎、低白血球数及びひいては感染症素因、悪心、腹痛、疲労、発熱、眩暈、及び急性肺臓炎が挙げられる。
メトトレキサートは２つの異なる経路によって癌及び関節リウマチに影響を及ぼすと考えられている。癌については、メトトレキサートは、テトラヒドロ葉酸合成に関与する酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をアロステリックに阻害する。ＤＨＦＲに対するメトトレキサートの親和性は葉酸の約１０００倍である。ＤＨＦＲは、ジヒドロ葉酸から活性テトラヒドロ葉酸への変換を触媒する。従ってメトトレキサートは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チミジル酸、及びタンパク質の合成を阻害する。関節リウマチの処置については、主要な機序はＤＨＦＲの阻害ではなく、むしろプリン代謝に関与する酵素の阻害によるアデノシンの蓄積、又はＴ細胞活性化の阻害及びＴ細胞による細胞間接着分子発現の抑制であると考えられている。
Ｕｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．１９８９（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４３，６７７−６８４）は、メトトレキサートを遊離カルボキシル基を介して抗体にＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕリンカーで結合する方法を記載した。この方法も同様にメトトレキサートとＰｈＡｃＡＬＧＰペプチドとの結合に適用することができ、酵素的切断後に遊離カルボキシル基を元に戻し得る。メトトレキサートがＤＨＦＲと結合するために遊離α−カルボキシレート基が必要であるため、α−カルボキシレート基の誘導体はインビトロで比較的非活性且つ非毒性である。
メトトレキサートの潜在的プロドラッグもまた作製されており、ここでは２−アミノ基がα−アミノ酸でアシル化された（Ｓｍａｌ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４９，５６７−５７４）。これらのアミノアシル誘導体は、メトトレキサートの２−ＮＨ２プテリジン環で置換される。重要なことに、２−ロイシル−メトトレキサート誘導体は血清の存在下で急速に切断されて活性化され、血清エキソプロテアーゼに対するその感受性を説明している。このことから、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−メトトレキサートコンジュゲートが腫瘍細胞特異的抗癌活性を示すことは妥当と思われる。メトトレキサートとＰｈＡｃ−ＡＬＧＰとの結合は、上述の技法によって実施される。メトトレキサートは市販されている（例えばＣＦ Ｐｈａｒｍａ Ｌｔｄ、Ｙａｓｋｉｋａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。
葉酸の４−アミノ類似体であるアミノプテリン（４−アミノプテロイル酸）は、免疫抑制特性を有する抗悪性腫瘍薬である。アミノプテリンはプテリンの合成誘導体である。アミノプテリンは、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの葉酸結合部位に関して競合することにより酵素阻害薬として働く。その構造はメトトレキサートと極めて類似しており、アミノプテリンもまたそのプテリジン部分に２−ＮＨ２を有する。アミノプテリンはメトトレキサートより前に開発されたが、活性がより高いために生じ得るそのより高い毒性が原因で、１９５０年代初めにメトトレキサートに取って代わられた。近年、急性白血病の処置においてより高い有効性が確認された（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１，８０８９−８０９６）。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−アミノプテリンコンジュゲートはＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−メトトレキサートに関して記載される方法によって合成することができ、腫瘍細胞に対する抗癌活性の特異性の増強も同様に妥当と思われる。アミノプテリンは市販されている（例えばＣａｍｅｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。
７．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−アムルビシン
アムルビシン（以下に構造を示す）は第三世代の合成アントラサイクリン類似体であり、小細胞肺癌の処置において実質的な臨床的有効性が実証されている。アムルビシンは強力なトポイソメラーゼＩＩ阻害薬であり、単剤として、並びに肺及び乳房を含めた様々な固形腫瘍に対する抗癌療法との併用で研究されている。アムルビシンはＦＤＡによりオーファンドラッグ類として認可されている。
Figure 0006523965
アムルビシンは、ドキソルビシンとは異なる構造のアントラサイクリンである。しかしながらアムルビシンは、そのテトラサイクリン環上にＮＨ２基を有する。副作用は、好中球減少症及び血小板減少症など、ドキソルビシンと同様である。起こり得る副作用としての慢性心毒性に関しては不明である。
ドキソルビシンについて概説したとおり、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰとこのアントラサイクリンとのコンジュゲーションが適用される。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰの存在により、アムルビシンの抗癌活性の腫瘍細胞選択性が増す。アムルビシンは市販されている（例えばＭｅｄｋｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
８．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ細胞毒性化合物コンジュゲートのインビトロ試験及びインビボ試験に共通するステップ
誘導体の合成は、以上に概略的に記載した、且つ各細胞毒性化合物に関して言及した参考文献にさらに詳説される方法に基づき得る。
第１のステップでは、ＧＰ−ジペプチドを細胞毒性化合物とコンジュゲートし、ＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲート、細胞毒性化合物、及びそれら二つの間の中間体を検出及び／又は定量化するための分析的方法論を開発する。かかる方法論は、分光測定法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法（ＭＳ）、併用ＨＰＬＣ及びＭＳ、ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間）、又はさらにはＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（超高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）の１つ以上を含み得る。
精製したＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートを生物系においてインビトロで試験し、その細胞毒性を確認する。細胞毒性であることが確認されたＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートについて、完全なＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートの合成を実施し、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−細胞毒性（ｃｙｔｏｙｏｘｉｃ）化合物コンジュゲート、細胞毒性化合物、及びそれら二つの間の中間体を検出及び／又は定量化するための分析的方法論を開発する。
化学合成及び分析的方法の開発は常法通りであると予想されるが、当初想定した合成方法における可能な変更を研究すること、又は例えばペプチド−薬物コンジュゲートの収率及び／又は純度を増加させるなどのため、新規合成方法を開発することが求められ得る。
９．インビトロ試験ステップ
９．１．ＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートの生物学的インビトロ試験
出発化合物（非コンジュゲート、「親」薬物）及びそのコンジュゲート型誘導体（「ＧＰ−薬物」）の細胞毒性活性をインビトロ細胞株で試験する。これらの細胞株は、細胞毒性化合物の各々に関して以上に言及した参考文献中に言及されているものの少なくとも一部である。薬物濃度及びインキュベーション時間の関数として試験を行う必要がある。ＧＰ−薬物は、短いインキュベーション時間後には親薬物と比べて活性がはるかに低いはずである。インキュベーション時間の増加に伴い、インキュベーション培地の一部である血清中に存在するエキソプロテアーゼによってＧＰ−薬物の加水分解が増加するため、この差の大きさは小さくなり得る。そのような場合、血清中のエキソプロテアーゼの存在は、可能であればＧＰ−薬物を無血清インキュベーション培地中でインキュベートすることにより確認され得る。
しかしながら、より重要なことは、精製ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶプロリル−ペプチダーゼとのプレインキュベーション前及びその後のＧＰ−薬物の細胞毒性の分析である。ＧＰ−ドキソルビシンと同様に、ＧＰ−薬物に対するＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶプロリル−ペプチダーゼの作用は、遊離薬物の放出によって細胞毒性を有意に増加させるはずである。この分析の結果が肯定的である場合、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−薬物の合成を実施する。結果が否定的ある場合、それは、プロリン−薬物結合が酵素に接触できないことに起因し得る。この問題に対する解決法は、プロリンと薬物との間に利用可能なＮＨ２末端を含むスペーサーを間に介在させることであってもよく、但し、かかる誘導体がその元の細胞毒性効果を保持するものとする。別の可能な解決法は、薬物−スペーサー及びプロリン結合の加水分解後に元の薬物を戻す自己犠牲スペーサーを間に介在させることであり得る。この種の一つの可能なスペーサーはＰＡＢＣ又はＰＡＢ（パラアミノベンジルオキシカルボニル）であり、コンジュゲートにおいて薬物部分をリガンドに結合させる。このリンカー部分は、ペプチドをアミド結合で切断する細胞外酵素、例えばＦＡＰの基質であるペプチド配列を含む。このペプチドは、薬物及びタンパク質ペプチド配列をつなぎ合わせる自己犠牲部分をさらに含む。ペプチド配列が細胞内酵素によって切断されると、自己犠牲部分はそれ自体を薬物部分から切断し、それにより薬物部分が、誘導体化されていない、活性化した形態となる。
９．２．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−細胞毒性コンジュゲートの生物学的インビトロ試験
満足なＧＰ−プロドラッグが得られたら、対応するＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートの生物学的インビトロ特性を分析する。この分析には、元の非コンジュゲート親薬物とそのコンジュゲート型プロドラッグ対応物とのインビトロ細胞の細胞毒性効果を評価することが含まれる。薬物及びプロドラッグの用量反応曲線を比較する。プロドラッグは非コンジュゲート薬物と同等の細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｃｙ）を及ぼすと予想される。
代替的な実験は、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰプロドラッグを精製ＣＤ１０及びＴＯＰとインキュベートすることからなり、ＧＰ−プロドラッグへの変換を分析する；ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰプロドラッグをＣＤ１０、ＴＯＰ、ＦＡＰ及びＤＰＩＶと同時にインキュベートした後、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰプロドラッグから遊離薬物への変換の程度を分析することができる。それぞれＧＰ−プロドラッグ及び遊離薬物への有意に高い変換レベルが、細胞／腫瘍環境におけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰプロドラッグの細胞毒性効果を示している。
上述の方法論を両方ともに組み合わせることもできる：ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰプロドラッグと精製ＣＤ１０及びＴＯＰとの、又はＰｈＡｃ−ＡＬＧＰプロドラッグとＣＤ１０、ＴＯＰ、ＦＡＰ及びＤＰＩＶとの、又はそれらの両方の反応生成物のインビトロ培養細胞に対する細胞毒性を、遊離薬物の細胞毒性と比較することができる。
９．３．ＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲート及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートのインビトロ薬力学
上記に記載したとおりプロテアーゼとのプレインキュベーション前及びその後のプロドラッグの細胞内取込み（率）を試験する。これを達成するには、薬物及びプロドラッグを適切に標識することが必要となり得る（以下参照）。
１０．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートに対するインビボ試験ステップ
１０．１．最大耐量（ＭＴＤ）の決定
インビボ試験は、初めに、漸増用量のプロドラッグを注射したマウスの体重減少を計測することにより、プロドラッグコンジュゲートのＭＴＤを決定する。これを遊離細胞毒性薬物のＭＴＤと比較する。ＭＴＤは、動物の元の体重の２０％を超える体重減少を引き起こさない用量として決定し得る。
最初に（ｉｎｉｔａｌｌｙ）、プロドラッグ及び遊離薬物を１週間おきに２回、場合により１回以上繰り返してＩＶ投与する。本明細書に記載するドキソルビシンプロドラッグでの経験に基づけば、プロドラッグのインビボ活性化は極めて低い（遅い）。そのような場合、ＭＴＤは、正常マウス及びヒト腫瘍を異種移植したマウスにおいて毎日２回のＩＰ注射を２×５日間行った後に決定する。或いは浸透圧性の又は他のプログラム可能なミニポンプを使用してプロドラッグの低速注入が可能である。
白血球数に対するプロドラッグの効果を遊離薬物と比較し得る。
１０．２．ヒト腫瘍を移植した免疫不全マウスに対する化学療法活性
非コンジュゲート型／遊離細胞毒性化合物で得られた既発表のデータに基づき１つ又は２つの異なるヒト異種移植片腫瘍モデルを選択する。プロドラッグ及び遊離薬物を上記に記載したとおり決定したＭＴＤでＩＰ注射する。体重及び腫瘍体積を２日おきに計測し、ＭＴＤの遊離出発薬物で得られた結果と比較する。
これを、ヒト白血病などの他のヒト腫瘍型に関してＳＣＩＤマウスにおける同所性ヒト異種移植腫瘍に対し繰り返すことができる。原発腫瘍に対するプロドラッグ及び薬物の細胞毒性効果のフォローアップに加えて、転移に対する効果を決定することができる。
１０．３．ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−細胞毒性化合物コンジュゲートの薬物動態、腫瘍分布及び組織分布
恐らくアムルビシンなどの蛍光薬物を除いては、薬物及びプロドラッグの薬物動態学的組織分布試験は、化学分析的決定方法において十分な感受性を生じさせるため、薬物及びプロドラッグを適切に標識することが必要となり得る。ある種の標識は放射標識であり、化合物は、例えば、トリチウム交換によるか又はＣ−１４標識前駆体との新合成（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）により放射性標識され得る。標識は、その標識、又はある標識が、プロドラッグの代謝産物中に維持されるようなものでなければならない。血漿薬物動態、並びにコンジュゲート薬物及びその代謝産物の腫瘍内蓄積を、臓器及び組織分布と併せて調査する。
実施例１７．ＵＺＬＸ−ＳＴＳ３軟部組織肉腫異種移植モデルにおけるＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンの生体内有効性
図１６〜図１９に提供する実験の結果から、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘのいくつかの興味深い特性が導き出され得る。
腫瘍体積
この実験では、ドキソルビシンをＡＬＧＰペプチドに結合させる効果を、ドキソルビシン抵抗性脂肪肉腫におけるその活性を試験することにより評価した。本結果は、ドキソルビシンをＡＬＧＰに結合させると、耐容される実験的用量が高くなることを実証している。このように、ドキソルビシン抵抗性肉腫異種移植片の実験的化学療法であっても、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘには前記ドキソルビシン抵抗性脂肪肉腫の異種移植片成長を制限する能力がある。この試験では、マウス群（双方の群ともｎ＝４）は（各マウスが２つの腫瘍を有する）、それぞれ、生理食塩水で処置し（対照群）、ドキソルビシンで処置し（ドキソルビシン処置群）及びＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘで処置した（ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘ処置群）。処置０日目〜２１日目、対照（ｎ＝７）及びドキソルビシン処置腫瘍（ｎ＝８）の両方において、それぞれ２５８％（ｐ＝０．０１８）及び２４６％（ｐ＝０．０１２）に至る腫瘍体積の着実な増加があった。他方でＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘで処置した腫瘍では、１０５％での腫瘍体積の安定化が明らかとなった（図１６）。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘ処置マウス（ｎ＝６）における腫瘍体積成長の遅延は、２１日目に対照群（ｐ＝０．００３）又はドキソルビシン処置群（ｐ＝０．００２）と比較したとき統計的に有意であった。
ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘの観察された効果は、一部には、ミニポンプによる薬物の７日連続投与によって説明され得る。
第２の、より興味を引く説明は、遊離ドキソルビシン（これははるかに低い用量でしか投与することができない）の投与後と比べた腫瘍間質におけるドキソルビシンの恐らくは極めて高い放出にある。放出されたドキソルビシンが間質細胞に及ぼす細胞増殖抑制効果及び細胞毒性効果が、ひいては癌性細胞の成長に強い影響を及ぼし得る。この間質の効果はまた、２１日間のその体積が減少しない腫瘍体積に関する安定化効果も説明し得る。２１日を超えて観察を延長し、例えば活性薬物放出に効果を有する異なる媒体を使用した、頻回投与と場合により組み合わせることで、相乗的に腫瘍体積の減少が（全ての腫瘍間質細胞の破壊後に）もたらされ得る。
体重
実験全体にわたり、マウスの体重及び全般的な健康をモニタした。体重の進展を示す詳細なグラフを図１７に提供する（対照群：ｎ＝４；ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘ処置群：ｎ＝３；ドキソルビシン処置群：ｎ＝４）。重大な副作用は観察されなかったとともに、概して動物の体重は許容値（処置中に開始時体重の２０％減少）未満に降下することはなかった。ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘ群の１匹のマウスは倫理的理由で１３日目に犠牲にした（体重７９．８％、動物は１１日目から痩せ、剖検中に、恐らくはミニポンプを外科的に植え込んだ結果としての感染に起因する限定的な腹腔内の腹水が認められた）。
総白血球数及び総好中球数
対照又はドキソルビシン処置動物と比較して、ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘで処置したマウスにおいて総白血球及び総好中球に重大な変化は観察されなかった（それぞれ図１８及び図１９；対照群：ｎ＝４；ＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ｄｏｘ処置群：ｎ＝３；ドキソルビシン処置群：ｎ＝４）。好中球減少症は、遊離ドキソルビシン処置の最も重大な毒性副作用の１つである。従って、遊離ドキソルビシンと比べて４０倍高い用量のＰｈＡｃ−ＡＬＧＰ−ドキソルビシンを投与した２１日後の好中球（ｎｅｔｒｏｐｈｉｌ）数が変化しないままであることは、臨床的観点からは極めて有望な新規の実験結果である。
さらに、本願発明は次の態様を含む。
項１. 一般構造：
［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰはオリゴペプチド部分であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）
を有するプロドラッグ又はその薬学的に許容可能な塩。
項２. 前記オリゴペプチド部分ＯＰが、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＬ（配列番号２）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドである、項１に記載のプロドラッグ又はその塩。
項３. 前記キャッピング基Ｃがホスホノアセチル基である、項１に記載のプロドラッグ又はその塩。
項４. 前記キャッピング基Ｃがホスホノアセチル基であり、前記オリゴペプチド部分ＯＰが、配列ＡＬＧＰ（配列番号１）、ＡＬＡＬ（配列番号２）、ＡＬＡＰ（配列番号３）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、ＴＳＡＰ（配列番号５）、ＫＬＧＰ（配列番号６）、ＫＬＡＰ（配列番号７）、ＡＬＫＰ（配列番号８）、ＴＳＫＰ（配列番号９）、又はＫＬＫＰ（配列番号１０）を有するテトラペプチドである、項１に記載のプロドラッグ又はその塩。
項５. 前記薬物Ｄがドキソルビシンである、項１〜４のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項６. 前記薬物Ｄがペグ化されている、項１〜５のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項７. 前記リンカー又はスペーシング基が存在する場合、自己脱離リンカー又はスペーシング基である、項１〜６のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項８. 前記プロドラッグが化合物Ｉである、項１〜７のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩。
項９. 項１〜８のいずれか一項に記載のプロドラッグ又はその塩を含む組成物。
項１０. 薬学的に許容可能な溶媒、希釈剤又は担体の少なくとも１つをさらに含む、項９に記載の組成物。
項１１. 癌の処置に用いるための、項１〜８のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は項９若しくは１０に記載の組成物。
項１２. 前記癌の処置が併用化学療法処置又は集学的化学療法処置である、項１１に記載のプロドラッグ若しくはその塩、又は組成物。
項１３. 前記癌の処置が、薬剤耐性克服剤（ｒｅｖｅｒｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含む治療と併用される、項１１又は１２に記載のプロドラッグ若しくはその塩、又は組成物。
項１４. 対象における腫瘍又は癌の治療方法であって、前記腫瘍又は癌の近傍に薬物の治療有効量を提供するのに十分な量の項１〜８のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は項９若しくは１０に記載の組成物を、癌を有する対象に投与することを含み、前記投与が前記腫瘍又は癌の処置をもたらす、方法。
項１５. 前記プロドラッグ若しくはその塩、又は前記組成物の治療有効量が白血球減少症又は心毒性を引き起こさない、項１４に記載の方法。
項１６. 併用化学療法処置又は集学的化学療法処置の一部である、項１４又は１５に記載の方法。
項１７. 前記対象に薬剤耐性克服剤（ｒｅｖｅｒｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を投与することを含む処置と併用される、項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
項１８. 項１〜８のいずれか一項に記載のプロドラッグの製造方法であって、
（ｉ）前記薬物を入手するステップ；
（ｉｉ）前記薬物を、キャッピングされたオリゴペプチド部分に結合させるステップであって、それにより前記プロドラッグを生じさせるステップ；又は、それに代えて、
（ｉｉ’）前記薬物をオリゴペプチド部分に結合させて、次に前記オリゴペプチド部分にキャッピング基を結合させるステップであって、それにより前記プロドラッグを生じさせるステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）又は（ｉｉ’）で得られた前記プロドラッグを精製するステップ
を含む方法。
項１９. 一般構造
［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
（ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）前記薬物ＤをＧＰ−、ＡＰ−又はＫＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）薬物Ｄ及び前記ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
（ｉｖ）前記薬物Ｄ及びジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに対応する［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項２０. 一般構造
［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
（ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）前記薬物Ｄを［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ とコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）薬物Ｄ及びプロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
（ｉｖ）薬物Ｄ及びプロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するプロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項２１. 一般構造
［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって、
（ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）前記薬物Ｄを［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ とコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）プロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄをインビトロ培養細胞と３７℃で５時間接触させるステップ；
（ｉｖ）プロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるプロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項２２. 一般構造
［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって
（ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）前記薬物ＤをＧＰ−、ＡＰ−、又はＫＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄジペプチド−薬物中間体プロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間接触させるステップ；
（ｉｖ）ジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体プロドラッグＧＰ−Ｄ、ＡＰ−Ｄ又はＫＰ−Ｄに対応する［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項２３. 一般構造
［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄ
（式中、Ｃはキャッピング基であり；
ＯＰは、グリシン−プロリン（ＧＰ）、アラニン−プロリン（ＡＰ）、及びリジン−プロリン（ＫＰ）からなる群から選択されるジペプチドを含む、プロリンをカルボキシ末端に含む最小長さが４連続アミノ酸（テトラペプチド）及び最大長さが８アミノ酸のペプチド（即ち４、５、６、７又は８連続アミノ酸の長さを有するペプチド）であり；
Ｄは薬物であり；
ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）
を有する候補プロドラッグのスクリーニング方法であって
（ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
（ｉｉ）前記薬物Ｄを［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ とコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄプロドラッグを得るステップ；
（ｉｉｉ）プロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを単離ＣＤ１０及び／又はＴＯＰペプチダーゼと、及び単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間〜２４時間接触させるステップ；
（ｉｖ）プロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
（ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるプロドラッグ［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを同定するステップ；及び
（ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃ ｘ −ＯＰ］ ｙ −Ｄを候補プロドラッグとして選択するステップ
を含む方法。
項２４. 前記キャッピング基Ｃがホスホノアセチル基である、項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
項２５. 前記薬物Ｄが、メイタンシン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｈｏｔｈｅｃｉｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、アミノプテリン、アムルビシン、又はそのいずれかの誘導体からなる群から選択される、項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
項２６. 前記リンカー又はスペーシング基が、存在する場合、自己脱離リンカー又はスペーシング基である、項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
項２７. 項１〜８のいずれか一項に記載のプロドラッグ若しくはその塩又は項９若しくは１０に記載の組成物を含む容器を含むキット。
項２８. 同じ容器又は１つ以上の別個の容器に、１つ以上のさらなる抗癌薬をさらに含む、項２７に記載のキット。
項２９. 前記さらなる抗癌薬が抗体又はその断片である、項２８に記載のキット。
項３０. 同じ容器又は１つ以上の別個の容器に、１つ以上の薬剤耐性克服剤をさらに含む、項２７又は２８に記載のキット。

Claims (8)

  1. 一般構造
    ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
    （式中、Ｃはキャッピング基であり；
    ＯＰはＡＬＧＰ（配列番号１）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）を有するテトラペプチドであり；
    Ｄは薬物であり；
    ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
    ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
    ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
    （ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
    （ｉｉ）前記薬物ＤをＧＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりＧＰ−Ｄジペプチド−薬物中間体化合物を得るステップ；
    （ｉｉｉ）薬物Ｄ及び前記ジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
    （ｉｖ）前記薬物Ｄ及びジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
    （ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有するジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄを同定するステップ；及び
    （ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄに対応する［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補化合物として選択するステップ
    を含む方法。
  2. 一般構造
    ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
    （式中、Ｃはキャッピング基であり；
    ＯＰはＡＬＧＰ（配列番号１）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）を有するテトラペプチドであり；
    Ｄは薬物であり；
    ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
    ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
    ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
    （ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
    （ｉｉ）前記薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ化合物を得るステップ；
    （ｉｉｉ）薬物Ｄ及び化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの各々を、独立に、インビトロ培養細胞と接触させるステップ；
    （ｉｖ）薬物Ｄ及び化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄの細胞毒性を決定するステップ；
    （ｖ）（ｉｖ）から、薬物Ｄと同等の細胞毒性活性を有する化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
    （ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補化合物として選択するステップ
    を含む方法。
  3. 一般構造
    ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
    （式中、Ｃはキャッピング基であり；
    ＯＰはＡＬＧＰ（配列番号１）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）を有するテトラペプチドであり；
    Ｄは薬物であり；
    ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
    ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
    ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
    （ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
    （ｉｉ）前記薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ化合物を得るステップ；
    （ｉｉｉ）化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄをインビトロ培養細胞と３７℃で５時間接触させるステップ；
    （ｉｖ）化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
    （ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換される化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
    （ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補化合物として選択するステップ
    含む方法。
  4. 一般構造
    ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
    （式中、Ｃはキャッピング基であり；
    ＯＰはＡＬＧＰ（配列番号１）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）を有するテトラペプチドであり；
    Ｄは薬物であり；
    ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
    ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
    ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補化合物のスクリーニング方法であって
    （ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
    （ｉｉ）前記薬物ＤをＧＰ−ジペプチドとコンジュゲートするステップであって、それによりＧＰ−Ｄジペプチド−薬物中間体化合物を得るステップ；
    （ｉｉｉ）ジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄを単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間接触させるステップ；
    （ｉｖ）ジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
    （ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換されるジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄを同定するステップ；及び
    （ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定されたジペプチド−薬物中間体化合物ＧＰ−Ｄに対応する［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補化合物として選択するステップ
    を含む方法。
  5. 一般構造
    ［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ
    （式中、Ｃはキャッピング基であり；
    ＯＰはＡＬＧＰ（配列番号１）、ＴＳＧＰ（配列番号４）、又はＫＬＧＰ（配列番号６）を有するテトラペプチドであり；
    Ｄは薬物であり；
    ｘは、ｙ＝１のとき少なくとも１である整数であり；
    ｙは、少なくとも１である整数であり、ｙが１より大きい場合、少なくとも１つのＯＰがキャッピング基を有し；及び
    ＣとＯＰとの間の結合及びＯＰとＤとの間の結合は直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介し、及び、ｙが１より大きい場合、複数のＯＰ部分は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介して互いに結合し、及び／又は独立に、直接か又はリンカー若しくはスペーシング基を介してＤに結合する）を有する候補化合物のスクリーニング方法であって
    （ｉ）前記薬物Ｄを入手するステップ；
    （ｉｉ）前記薬物Ｄを［Ｃｘ−ＯＰ］ｙとコンジュゲートするステップであって、それにより［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄ化合物を得るステップ；
    （ｉｉｉ）化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを単離ＣＤ１０及び／又はＴＯＰペプチダーゼと、及び単離ＦＡＰ及び／又はＤＰＩＶペプチダーゼと３７℃で３時間〜２４時間接触させるステップ；
    （ｉｖ）化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄから遊離薬物Ｄへの変換を決定するステップ；
    （ｖ）（ｉｖ）から、少なくとも５０％がＤに変換される化合物［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを同定するステップ；及び
    （ｖｉ）ステップ（ｖ）で同定された［Ｃｘ−ＯＰ］ｙ−Ｄを候補化合物として選択するステップ
    含む方法。
  6. 前記キャッピング基Ｃがホスホノアセチル基又はスクシニル基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記薬物Ｄが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アムルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアマイシン、エトポシド、リン酸エトポシド、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキサート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキサート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン（ｅｐｉｔｈｉｏｌｏｎｅ）、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４リン酸、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンプトテシン、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、ハリコンドリンＢ、シスプラチン、カルボプラチン、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロスポリンＡ、メイタンシン、又はそのいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 存在するとき、前記リンカー又はスペーシング基が自己脱離リンカー又はスペーシング基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
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