JP5675619B2 - 葉酸拮抗薬の葉酸受容体結合性コンジュゲート - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９（ｅ）条に基づき、２００８年９月１７日に提出した米国仮出願第６１／０９７，６５５号の利益を主張するものであり、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

葉酸（ＦＡ）、すなわちビタミンＢ９は、１−炭素経路の代謝の適切な維持と、ヌクレオチド生合成のために、すべての生細胞に必要な必須栄養素である。このリガンドは、葉酸受容体（ＦＲ）と呼ばれる細胞表面糖タンパク（細胞外環境からリガンドを捕捉するグリコシルホスファチジルイノシトール結合タンパクである）に対して、非常に高い親和性（ＫＤ約１００ｐＭ）を示す。葉酸受容体（ＦＲ）は、葉酸（ＦＡ）を結合する腫瘍関連膜タンパクであり、葉酸に結合している分子を細胞内に、エンドサイトーシス機構を介して輸送することができる。結合するとすぐに、ＦＲ−リガンド複合体を取り囲んでいる形質膜は陥入して、エンドソームと呼ばれる内部小胞を形成することになる。エンドソーム膜に共局在化しているプロトンポンプの作用を通じて、この小胞腔のｐＨは若干低下し、この酸性化が、ＦＲタンパクのコンフォメーション変化を仲介し、結合しているリガンドを解放して、サイトゾルへの侵入を可能にすると推定される。また、ＦＲは、認識されている腫瘍抗原であり、このため、考え得る治療的価値を得る目的で、ＦＲの存在と機能を活かす方法が検討されてきている。

正常な成体組織におけるＦＲ−αの分布は、肺組織、脈絡叢組織、及びいくつかの腺組織など、いくつかの極性化上皮細胞の頂上部細胞膜表面に限られている。また、その発現は、胎盤栄養膜細胞内、及び近位尿細管上皮細胞の腔表面上で高く、後者での発現は、尿素から葉酸を再吸収するために重要と思われる。しかし、いくつかの癌型では、ＦＲ−αが高度発現する。非ムチン性卵巣癌（卵巣癌の大部分）は、初めて「過剰発現」と関連付けられた腫瘍型である。いくつかの研究で、これらの腫瘍の約８０〜９０％がＦＲ−αを過剰発現することが確認された。他の婦人科癌（例えば漿液性子宮腫瘍の約５０％）もこの受容体を過剰発現する。類内膜癌の組織学的サブタイプは、ＦＲ−αを発現する頻度が上記よりも低いが、最も一般的な子宮癌形態である。したがって、本発明では、相当数の子宮癌患者が、何らかの形態のＦＲ標的療法による恩恵を受けることができると考える。さまざまな頻度でＦＲ−αを過剰発現すると報告されている他の腫瘍としては、小児脳上衣腫、乳房腫瘍、結腸腫瘍、腎腫瘍、肺腫瘍、及び中皮種が挙げられる。

ＦＡが、ＦＲ陽性細胞内への送達を仲介するために、分子の事実上すべてにコンジュゲートできることは一般的に認められているが、すべてのコンジュゲートが同じ親和性でＦＲに結合するわけではないことは予想できる。本発明では例えば、ＦＡ分子の非常に近くで結合する大型の薬物は、おそらくは立体相互作用が原因で、ＦＡがＦＲの結合ポケットに入る能力を変える場合があると考える。更に、ＦＡとの分子内会合によって、結合性が不十分なコンジュゲートであって、ＦＲの中に適切に配向できないコンジュケートが生じるので、上記の薬物の性質も重要である場合がある。いずれのケースでも、ＦＡは、分子を標的部位に送達した後には利用されない。したがって、本発明では、病状を治療する第２の機能を有する潜在性がある異なる分子を標的送達することが有用であると認識した。

本発明では、葉酸拮抗薬も、ＦＲを標的にすることができると共に、解離可能なリンカーと連動して、ＦＲを発現する細胞に分子を標的送達することもできることが見出されている。しかし、このような葉酸拮抗薬の相対的親和性（４℃で測定した場合）は多岐にわたることが報告されており、このことが、葉酸拮抗薬を標的リガンドとして利用することの妨げとなっている。また、本明細書では、予想外なことに、葉酸拮抗薬の葉酸受容体における相対的親和性は、葉酸と比べて、温度に依存することが見出された。更に、相対的親和性が温度の上昇と共に向上する葉酸拮抗薬もあれば、相対的親和性が温度の上昇と共に低下する葉酸拮抗薬もあることも見出された。更に、温度が上昇しても相対的親和性が比較的変化しない葉酸拮抗薬もある。

本明細書には、葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬と、少なくとも１つの解離可能なリンカーと、１種以上の薬物とを含むコンジュゲートであって、４℃を超える温度、例えば、２０℃を超える温度、２５℃を超える温度、３０℃を超える温度、及び／又は生理学的に適切な温度（哺乳類の生理学的温度）において、前記葉酸拮抗薬の葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）が高いコンジュゲートを含む化合物、組成物、及び方法について記載されている。本明細書には、葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬と、少なくとも１つの解離可能なリンカーと、１種以上の薬物とを含むコンジュゲートであって、４℃を超える温度、例えば、２０℃を超える温度、２５℃を超える温度、３０℃を超える温度、及び／又は生理学的に適切な温度（哺乳類の生理学的温度）において、葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）が高いコンジュゲートを含む化合物、組成物、及び方法についても記載されている。一般に、本明細書に記載されているコンジュゲートは共有結合コンジュゲートであるが、本明細書に記載されているコンジュゲートの一部を形成する薬物に、他の結合形態が含まれていてもよいことは理解されたい（金属キレートのような錯体などが挙げられるが、これらに限らない）。

１つの実施形態では、本明細書に記載されている温度のうちの１つ以上の温度において、葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）が少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．２５、又は少なくとも約０．５である葉酸拮抗薬を含むコンジュゲートを含む化合物、組成物、及び方法について説明されている。別の実施形態では、本明細書に記載されている温度のうちの１つ以上の温度において、葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）が少なくとも約０．０５、少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．２５、又は少なくとも約０．５であるコンジュゲートを含む化合物、組成物、及び方法について説明されている。

別の実施形態では、葉酸受容体結合性リガンドのＦＲに対する親和性を評価する方法が説明されている。１つの態様では、結合親和性は相対的であり、葉酸との比較によるものである。本明細書に記載されているアッセイを用いて、葉酸受容体結合性リガント及び／又はコンジュゲートを葉酸と競合させることによって、葉酸受容体に結合するための相対的選択性及び／又は特異性を評価してよいものと理解されたい。このような相対的親和性を用いて、ＦＲに結合できる分子を選択してよいと共に、ＦＲ受容体結合性部分を含むコンジュゲートを選択してよいことは明らかである。

別の実施形態では、下記の式の薬物送達コンジュゲートを含む化合物、組成物、及び方法が記載されている。
ＡＬ（Ｄ）_m
式中、Ａは葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬であり、Ｌは、少なくとも１つの解離可能なリンカーを含む一価又は多価リンカーであり、各Ｄは薬物であり、ｍは１〜約３の整数である。ｍが１よりも大きい場合、各薬物Ｄは独立して、各ケースで選択を行うものと理解されたい。換言すれば、Ｄは、各ケースにおいて同じ薬物であっても異なる薬物であってもよい。

別の実施形態では、本明細書に記載されている組成物と方法は、患者における１種以上の病原性細胞集団を治療するのに有用である。本発明の組成物は、本明細書に記載されている１種以上のコンジュゲートを治療有効量、任意で１種以上の担体、賦形剤、及び／若しくは希釈剤、又はこれらの組み合わせと共に含む。本発明の方法は、本明細書に記載されている１種以上のコンジュゲート、及び／又は本明細書に記載されている１種以上の組成物を有効量投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明の組成物と方法は、癌及びその他の疾患を治療するのに有用である。

別の実施形態では、医薬の製造の際に、本発明の化合物と組成物を使用することについて説明されており、前記医薬は、患者における１種以上の病原性細胞集団を治療するためのコンジュゲート及び／又は組成物であって、本明細書に記載されている１種以上のコンジュゲート、及び／又は本明細書に記載されている１種以上の組成物を治療有効量含む。患者における１種以上の病原性細胞集団を治療するための方法であって、本明細書に記載されているいずれの方法においても、前記医薬を用いてよいものと理解されたい。

図１のパネルＡは、ＫＢ細胞ベースの相対的親和性アッセイである。パネルＢは、無細胞の相対的親和性アッセイ（プレートに結合させた単離葉酸受容体）である。いずれのアッセイも、血清の存在しない状態で行った。また、プレートは、氷床の上に置いた。ＦＡは●であり、ＥＣ１４５は■である。 図２のパネルＡは氷上のＰｔｅ酸である。パネルＢは３７℃におけるＰｔｅである。パネルＣは氷上のＬＶである。パネルＤは３７℃におけるＬＶである。各アッセイは、接着ＫＢ細胞をＦＲ源として用いて、試験培地中に血清のない状態で行った。ＦＡ＝Ｐｔｅ−γＧｌｕは●であり、ＬＶは○であり、Ｐｔｅは■である。 図３のパネルＡは氷上のＥＣ７２である。パネルＢは３７℃におけるＥＣ７２である。パネルＣは氷上のＥＣ１７である。パネルＤは３７℃におけるＥＣ１７である。各アッセイは、接着ＫＢ細胞をＦＲ源として用いて、試験培地中に血清のない状態で行った。ＦＡすなわちＰｔｅ−γＧｌｕは●であり、ＥＣ７２は○であり、ＥＣ１７は■である。 図４のパネルＡは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の量を徐々に増やした場合におけるＦＡのＫＢ細胞に対する結合性を示している。パネルＢはＦＡのＲＡを、パネルＣはＥＣ１４５のＲＡを示している（血清の割合：０％（●）、１０％（■）、２５％（▲）、５０％（□）、７５％（▽）、１００％（○））。パネルＤは、０％又は１０％の血清がＥＣ１４０のＲＡに及ぼす作用を示している。 図５は、化合物の皮下ＫＢ腫瘍に対する活性を示している（２μモル／ｋｇ、週に３回／２週間、縦の点線は投与最終日を示している）。（ａ）はコントロールであり、（ｂ）はＥＣ０２８２（ＣＢ３７１７）であり（０／５が完全奏効）、（ｃ）はＥＣ１４５であり（２／５が完全奏効）であり、（ｄ）はＥＣ０２８４である（５／５が完全奏効）。 図６は、各試験グループにおける処置動物の体重の変化率を示している（２μモル／ｋｇ、週に３回／２週間、縦の点線は投与最終日を示している）。（ａ）はコントロールであり、（ｂ）はＥＣ０２８２（ＣＢ３７１７）であり（０／５が完全奏効）、（ｃ）はＥＣ１４５であり（２／５が完全奏効）であり、（ｄ）はＥＣ０２８４である（５／５が完全奏効）。 図７は、相対的親和性アッセイ（１０％血清／ＦＤＲＰＭＩ）を示している。ＦＡは（●）は１．０００であり、ＥＣ２８４（■）は０．１４８であり、ＥＣ２８３（○）は０．００２である。 図８は、相対的親和性アッセイ（１０％血清／ＦＤＲＰＭＩ）を示している。（ａ）ＦＡ（●）は１．０００であり、（ｂ）ＥＣ２８２（●）は０．１４８である。 図９は、ＥＣ２８２のＫＢ細胞に対する活性（７２時間連続アッセイ）を示している。パネルＡではＩＣ_５０は５ｎＭであり、パネルＢではＩＣ_５０は１９ｎＭである。 図１０は、ＥＣ０２８４のＫＢ細胞に対する活性（２時間の処置／７２時間アッセイ）を示している。（ａ）はＥＣ０２８４＋過剰な葉酸であり、（ｂ）はＥＣ０２８４である。

１つの実施形態では、下記の式の薬物送達コンジュゲートについて説明されている。
ＡＬ（Ｄ）_m
式中、Ａは葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬であり、Ｌは、少なくとも１つの解離可能なリンカーを含む一価又は多価リンカーであり、各Ｄは薬物であり、ｍは１〜約３の整数である。ｍが１よりも大きい場合、各Ｄは、各ケースにおいて同じ薬物であっても異なる薬物であってもよいことを理解されたい。別の実施形態では、一価又は多価リンカーＬは、少なくとも２つの解離可能なリンカーを含む。上記のそれぞれの１つの変形形態では、一価又は多価リンカーは、ジスルフィドではない少なくとも１つの解離可能なリンカーを含む。

別の実施形態では、本明細書に記載されているコンジュゲートは、本明細書に記載されている温度のうちの１つ以上の温度において、葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）が少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．２５、又は少なくとも約０．５である葉酸拮抗薬を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されているコンジュゲートの葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）は、本明細書に記載されている温度のうちの１つ以上の温度において、少なくとも約０．０５、少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．２５、又は少なくとも約０．５である。別の実施形態では、葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬と、少なくとも１つの解離可能なリンカーと、１種以上の薬物とを含むコンジュゲートであって、４℃を超える温度、例えば、２０℃を超える温度、２５℃を超える温度、３０℃を超える温度、及び／又は生理学的に適切な温度（哺乳類の生理学的温度など）において、前記葉酸拮抗薬の葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）が高いコンジュゲートを含む化合物、組成物、及び方法について説明されている。また、本明細書には、葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬と、少なくとも１つの解離可能なリンカーと、１種以上の薬物とを含むコンジュゲートであって、４℃を超える温度、例えば、２０℃を超える温度、２５℃を超える温度、３０℃を超える温度、及び／又は生理学的に適切な温度（哺乳類の生理学的温度など）において、葉酸受容体に対する相対的親和性（葉酸と比較した場合）が高いコンジュゲートを含む化合物、組成物、及び方法について説明されている。一般に、本明細書に記載されているコンジュゲートは共有結合コンジュゲートであるが、本明細書に記載されているコンジュゲートの薬物形成部分に、他の結合形態が含まれていてもよいものと理解されたい（金属キレートなどのような錯体が挙げられるが、これらに限らない）。

本明細書に記載されている葉酸拮抗薬及び／又はコンジュゲートの相対的親和性の測定は、いずれかの従来の方法によって、又はこの代わりに、本明細書に記載されている方法であって、４℃を超える温度、例えば、２０℃を超える温度、２５℃を超える温度、３０℃を超える温度、及び／又は生理学的に適切な温度（哺乳類の生理学的温度など）における相対的親和性を測定するように適合させた方法によって、行ってよいものと理解されたい。

本明細書で使用する場合、「葉酸拮抗薬」という用語は一般に、葉酸代謝の阻害薬、アンタゴニスト、又はその他のモジュレーター（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲＴＦ）、ホリルポリグルタミン酸シンテターゼ（ＦＰＧＳ）、及びチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の阻害薬及び／若しくはアンタゴニスト、又は葉酸受容体アンタゴニストなど）であるいずれかの化合物を指す。葉酸拮抗薬が、上記のいずれの葉酸結合部位、又は、葉酸若しくは別の化合物が上記のいずれの葉酸結合部位に結合する作用に影響を及ぼす別の部位に結合できることは明らかである。本明細書で使用する場合、「葉酸受容体結合性」という用語は一般に、葉酸受容体に選択的又は特異的に結合する化合物を指す。

別の実施形態では、葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬は、ＬＶ、すなわちＬ−ロイコボリン（Ｌ−５−ホルミルテトラヒドロ葉酸）、５−ＣＨ３−ＴＨＦ（５−メチルテトラヒドロ葉酸）、ＦＡ（葉酸）、ＰｔｅＧｌｕ（プテロイルグルタミン酸塩（ＦＡ））、ＭＴＸ（メトトレキサート）、２−ｄＭＴＸ（２−デスアミノ−ＭＴＸ）、２−ＣＨ３−ＭＴＸ（２−デスアミノ−２−メチル−ＭＴＸ）、ＡＭＴ（アミノプテリン）、２−ｄＡＭＴ（２−デスアミノ−ＡＭＴ）、２−ＣＨ３−ＡＭＴ（２−デスアミノ−２−メチル−ＡＭＴ）、１０−ＥｄＡＭ（１０−エチル−１０−デアザアミノプテリン）、ＰＴ５２３（Ｎα−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）−Ｎδ−（ヘミフタロイル）−Ｌ−オルニチン）、ＤＤＡＴＨＦ（５，１０−ジデアザ−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸）、５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕｅ（５−デアザ−５，６，７，８−テトラヒドロイソ葉酸）、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ（Ｎ９−メチル−５−デアザ−５，６，７，８−テトラヒドロイソ葉酸）、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ（Ｎα−（５−デアザプテロイル）−Ｌ−ホモシステイン酸）、５−ｄＰｔｅＡＰＢＡ（Ｎα−（５−デアザプテロイル）−ＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸、５−ｄＰｔｅＯｒｎ（Ｎα−（５−デアザプテロイル）−Ｌ−オルニチン）、５−ｄＨ４ＰｔｅＨＣｙｓＡ（Ｎα−（５−デアザ−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイル）−Ｌ−ホモシステイン酸）、５−ｄＨ４ＰｔｅＡＰＢＡ（Ｎα−（５−デアザ−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイル）−ＤＬ−２−アミノ−４−ホスホブタン酸）、５−ｄＨ４ＰｔｅＯｒｎ（Ｎα−（５−デアザ−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイル）−Ｌ−オルニチン）、ＣＢ３７１７（Ｎ１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸）、ＩＣＩ−１９８，５８３（２−デスアミノ−２−メチル−Ｎ１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸）、４−Ｈ−ＩＣＩ−１９８，５８３（４−デオキシ−ＩＣＩ−１９８，５８３）、４−ＯＣＨ３−ＩＣＩ−１９８，５８３（４−メトキシ−ＩＣＩ−１９８，５８３）、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｖａｌ−ＩＣＩ−１９８，５８３、バリン−ＩＣＩ−１９８，５８３、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｓｕｂ−ＩＣＩ−１９８，５８３（２−アミノ−スベリン酸塩−ＩＣＩ−１９８，５８３）、７−ＣＨ３−ＩＣＩ−１９８，５８３（７−メチル−ＩＣＩ−１９８，５８３）、ＺＤ１６９４（Ｎ−［５（Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イル−メチル）アミノ）２−チエニル）］−Ｌ−グルタミン酸）、２−ＮＨ２−ＺＤ１６９４（２−アミノ−ＺＤ１６９４）、ＢＷ１８４３Ｕ８９（（Ｓ）−２［５−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−１−オキソ−２−イソインドリニル］−グルタル酸）、ＬＹ２３１５１４（Ｎ−（４−（２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−ピロロ［２，３−Ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル）ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸）、ＩＡＨＱ（５，８−ジデアザイソ葉酸）、２−ｄＩＡＨＱ（２−デスアミノ−ＩＡＨＱ）、２−ＣＨ３−ｄＩＡＨＱ（２−デスアミノ−２−メチル−ＩＡＨＱ）、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ（５−デアザイソ葉酸）、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ（Ｎ９−メチル−５−デアザイソ葉酸）、Ｎ９−ＣＨＯ−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ（Ｎ９−ホルミル−５−デアザイソ葉酸）、ＡＧ３３７（３，４−ジヒドロ−２−アミノ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）キナゾリン、及びＡＧ３７７（２，４−ジアミノ−６−［Ｎ−（４−（フェニルスルホニル）ベンジル）エチル］アミノ］キナゾリンから選択する。

別の実施形態では、葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬は、アミノプテリン、メトトレキサート、ラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸ、ＺＤ１６９４ともいう）、プレビトレキセド（ｐｌｅｖｉｔｒｅｘｅｄ）（ＢＧＣ９３３１、ＺＤ９３３１ともいう）、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ、ＬＹ２３１５１４ともいう）、ロメテレキソール（５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸）、ジペプチドリガンド（ＣＢ３７１７、ＣＢ３００９４５）を有する関連のシクロペンタ［ｇ］キナゾリン（ＢＧＣ９４５ともいう）、及び６−Ｒ，Ｓ−ＢＧＣ９４５のＣＢ３００６３８といったその立体異性体（ＢＧＣ６３８ともいう）、並びに、ＢＷ１８４３Ｕ８９から選択する。実例的な葉酸拮抗薬の調製については、Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４、及びＴｈｅｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００３に記載されている。上記の発行物、及び本明細書で引用されている追加的な各発行物は、参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、葉酸受容体結合性葉酸拮抗薬は、アミノプテリン、メトトレキサート、ＣＢ３７１７、プレビトレキセド（ｐｌｅｖｉｔｒｅｘｅｄ）、ラルチトレキセド、ＢＧＣ９４５、ペメトレキセドなどから選択する。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、ＣＢ３７１７、プレビトレキセド（ｐｌｅｖｉｔｒｅｘｅｄ）、ラルチトレキセド、及び５−Ｍｅ−ＴＨＦから選択する。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、ＢＧＣ９４５、ＢＧＣ６３８、及びＢＧＣ９３３１から選択する。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、約２０℃以上の温度において、葉酸受容体に対する相対的親和性が約０．１以上である化合物である。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、２−ＣＨ３−ｄＩＡＨＱ、５−ｄＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＯｒｎ、Ｎ９−ＣＨＯ−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、２−ｄＩＡＨＱ、７−ＣＨ３−ＩＣＩ−１９８５８３、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｖａｌ−ＩＣＩ−１９８５８３、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｓｕｂ−ＩＣＩ−１９８５８３、４−ＭｅＯ−ＩＣＩ−１９８５８３、ＩＣＩ−１９８５８３、５−ｄＨ４ＰｔｅＨＣｙｓＡ、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ、５−ＣＨ３−ＴＨＦ、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＬＹ２３１５１４、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ４ＰｔｅＯｒｎ、５−ｄＨ４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、及びＤＤＡＴＨＦから選択する。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、２０℃以上の温度において、葉酸受容体に対する相対的親和性が約０．２以上である化合物である。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、Ｎ９−ＣＨＯ−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、２−ｄＩＡＨＱ、７−ＣＨ３−ＩＣＩ−１９８５８３、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｖａｌ−ＩＣＩ−１９８５８３、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｓｕｂ−ＩＣＩ−１９８５８３、４−ＭｅＯ−ＩＣＩ−１９８５８３、ＩＣＩ−１９８５８３、５−ｄＨ４ＰｔｅＨｃｙｓＡ、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ、５−ＣＨ３−ＴＨＦ、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＬＹ２３１５１４、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ４ＰｔｅＯｒｎ、５−ｄＨ４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、及びＤＤＡＴＨＦから選択する。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、約２０℃以上の温度において、葉酸受容体に対する相対的親和性が約０．５以上である化合物である。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＬＹ２３１５１４、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ４ＰｔｅＯｒｎ、５−ｄＨ４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨｃｙｓＡ、及びＤＤＡＴＨＦから選択する。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、５−ｄＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＯｒｎ、及び２−ＣＨ３−ＩＡＨＱから選択する。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ、ＩＣＩ−１９８５８３、４−ＭｅＯ−ＩＣＩ−１９８５８３、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｖａｌ−ＩＣＩ−１９８５８３、Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｓｕｂ−ＩＣＩ−１９８５８３、７−ＣＨ３−ＩＣＩ−１９８５８３、Ｎ９−ＣＨＯ−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、及び２ｄ−ＩＡＨＱから選択する。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、Ｎ９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ペメトレキセド、ＣＢ３７１７、ラルチトレキセド、２−デスメチル−２−ＮＨ２−ラルチトレキセド、ＢＷ１８３４Ｕ８９、ＩＡＨＱ、５−ｄＨ４ＰｔｅＨｃｙｓＡ、ｄＨ４ＰｔｅＡＰＢＡ、ｄＨ４ＰｔｅＯｒｎ、及びＤＤＡＴＨＦから選択する。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、葉酸のデアザ又はジデアザ類似体（その還元誘導体も含む）である。別の実施形態では、葉酸拮抗薬はＣＢ３７１７である。別の実施形態では、葉酸拮抗薬は５−Ｍｅ−ＴＨＦである。

あるいは、別の実施形態では、葉酸拮抗薬はロイコボリンではない。あるいは、別の実施形態では、葉酸拮抗薬はプテロイン酸ではない。あるいは、別の実施形態では、葉酸拮抗薬はペメトレキセドではない。あるいは、別の実施形態では、葉酸拮抗薬はメトトレキサートではない。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は下記の式の化合物である。
［化１］

式中、ＸはＰＯ（ＯＨ）_２（５−ｄＰｔｅＡＰＢＡ）、ＣＨ_２ＮＨ_２（５−ｄＰｔｅＯｒｎ）、又はＳＯ_２ＯＨ（５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ）である。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は下記の式の化合物である。
［化２］

式中、ＸはＮであり、ＹはＮＨ_２であり、ＲはＨ（５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ）であるか、ＸはＮであり、ＹはＮＨ_２であり、ＲはＣＨ_３（Ｎ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ）であるか、ＸはＮであり、ＹはＮＨ_２であり、ＲはＣＨＯ（Ｎ^９−ＣＨＯ−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ）であるか、ＸはＣＨであり、ＹはＮＨ_２であり、ＲはＨ（ＩＡＨＱ）であるか、ＸはＣＨであり、ＹはＨであり、ＲはＨ（２−ｄＩＡＨＱ）であるか、又は、ＸはＣＨであり、ＹはＣＨ_３であり、ＲはＨ（２−ＣＨ_３−ｄＩＡＨＱ）である。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は下記の式の化合物である。
［化３］

式中、ＸはＯＨであり、ＲはＨであり、ＹはＧｌｕ（ＩＣＩ−１９８５８３）であるか、ＸはＯＣＨ_３であり、ＲはＨであり、ＹはＧｌｕ（４−ＭｅＯ−ＩＣＩ−１９８５８３）であるか、ＸはＯＨであり、ＲはＨであり、Ｙはバリン（Ｇｌｕ−ｔｏ−Ｖａｌ−ＩＣＩ−１９８５８３）であるか、ＸはＯＨであり、ＲはＨであり、Ｙはスベリン酸塩（Ｇｌｕ−Ｓｕｂ−ＩＣＩ−１９８５８３）であるか、又は、ＸはＯＨであり、ＲはＣＨ_３であり、ＹはＧｌｕ（７−ＣＨ_３−ＩＣＩ−１９８５８３）である。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は下記の式の化合物である。
［化４］

式中、ＸはＰＯ（ＯＨ）_２（５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ）、ＣＨ_２ＮＨ_２（５−ｄＨ_４ＰｔｅＯｒｎ）、又はＳＯ_２ＯＨ（５−ｄＨ_４ＰｔｅＨＣｙｓＡ）である。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は下記の式の化合物である。
［化５］

式中、ＡはＮＨ（５−ｄ（ｉ）Ｈ_４ＰｔｅＧｌｕ）、ＮＣＨ_３（Ｎ^９−ＣＨ３−５−ｄ（ｉ）Ｈ_４ＰｔｅＧｌｕ）、又はＣＨ_２（ＤＤＡＴＨＦ）である。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、下記の式のＢＷ１８３４Ｕ８９である。
［化６］

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は、下記の式のＢＧＣ９４５（Ｒ＝ＣＨ_２ＯＨ）又はＢＧＣ６３８（Ｒ＝ＣＨ_３）である。
［化７］

１つの変形形態では、これらの葉酸拮抗薬の絶対立体化学はＬ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｇｌｕである。

別の実施形態では、葉酸拮抗薬は下記の式の化合物である。
［化８］

追加的な葉酸拮抗薬は、Ｇａｎｇｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １０．１０２１／ｊｍ８００２４４ｖ（２００８）に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

別の実施形態では、グルタミン酸ラジカルを含む上記の各化合物において、対応する類似体も本明細書に記載されており、この場合、本明細書に記載されているように、１つ以上のアミノ酸がグルタミン酸塩と置き換わっている。このようにアミノ酸（Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓなど）がグルタミン酸塩と置き換わることは、自然に発生する場合もあれば、自然ではない場合もある（不自然な絶対配置、βアミノ酸、不自然な側鎖などが挙げられるが、これらに限らない）ものと理解されたい。別の実施形態では、グルタミン酸塩と置き換わっている少なくとも１つのアミノ酸が変化している。別の実施形態では、Ｇｌｕが、ジペプチド（Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ）部分によって置換されている。

上記の薬物は、製薬学的に活性な化合物を含め、細胞機能を調節するか又は他の形で修正することのできるいずれかの分子であることができる。好適な分子としては、ペプチド、オリゴペプチド、レトロインバーソオリゴペプチド、タンパク、少なくとも１つの非ペプチド結合がペプチド結合と置き換わっているタンパク類似体、アポタンパク、糖タンパク、酵素、補酵素、酵素阻害薬、アミノ酸及びその誘導体、受容体及び他の膜タンパク、抗原及びその抗体、ヘプテン及びその抗体、ホルモン、脂質、リン脂質、リポソーム、毒素、抗生物質、鎮静薬、気管支拡張薬、β遮断薬、抗菌薬、抗高血圧薬、心臓血管作用薬（抗不整脈薬、強心配糖体、抗狭心症薬、及び血管拡張薬を含む）、中枢神経系作用薬（興奮薬、向精神薬、抗躁薬、及び抑制薬を含む）、抗ウイルス薬、抗ヒスタミン薬、制癌薬（化学療法薬を含む）、精神安定薬、抗うつ薬、Ｈ−２アンタゴニスト、鎮痙薬、制吐薬、プロスタグランジン及びプロスタグランジン類似体、筋弛緩薬、興奮薬、うっ血除去薬、鎮吐薬、利尿薬、鎮痙薬、ぜん息治療薬、抗パーキンソン薬、去痰薬、咳抑制薬、並びに、粘液溶解薬を挙げることができるが、これらに限らない。

更に、上記の薬物は、当該技術分野において既知の薬物であって、細胞毒性があるか、腫瘍透過性を高めるか、腫瘍細胞の増殖を阻害するか、アポトーシスを促進するか、標的細胞の抗アポトーシス活性を低下させるか、感染因子に起因する疾患を治療する目的で用いられるか、又は、いずれかのタイプの病原性細胞に起因する病状を治療するのに有用であるいずれかの薬物であることができる。本発明に従って用いるのに適した薬物としては、アルキル化剤、抗男性ホルモン、抗エストロゲン、アンドロゲン、アクラマイシン及びアクラマイシン誘導体、エストロゲン、代謝拮抗薬（シトシンアラビノシド、プリン類似体、ピリミジン類似体、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、及びその他の白金化合物など）、タモキシフェン、タキソール、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標）、シクロホスファミド、ダウノマイシン、リゾキシン、Ｔ２毒素、植物アルカノイド、プレドニゾン、ヒドロキシ尿素、テニポシド、マイトマイシン、ディスコデルモリド、微小管阻害薬、エポチロン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、シクロプロピルベンズ［ｅ］インドロン、セコ−シクロプロピルベンズ［ｅ］インドロン、Ｏ−Ａｃ−セコ−シクロプロピルベンズ［ｅ］インドロン、ブレオマイシン及び他のいずれかの抗生物質、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、ビンクリスチン、ビンブラスチン、その類似体及び誘導体（デアセチルビンブラスチンモノヒドラジドなど）、並びに、その他のビンカアルカロイド（国際公開特許第ＷＯ２００７／０２２４９３号（その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものを含む）、コルヒチン、コルヒチン誘導体、アロコルヒチン、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ハリコンドリンＢ、ドラスタチン（ドラスタチン１０など）、アマニチン（α−アマニチンなど）、カンプトテシン、イリノテカン、及びその他のカンプトテシン誘導体、メイタンシン、ゲルダナマイシン及びゲルダナマイシン誘導体、エストラムスチン、ノコダゾール、ＭＡＰ４、コルセミド、ペプチド及びペプチド模倣シグナル伝達阻害薬、並びに、他のいずれかの薬物又は毒素が挙げられる。本発明に従って用いることができる他の薬物としては、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、クロラムフェニコール、アミノ配糖体系抗生物質、ゲンタマイシ、アンホテリシンＢ、アシクロビア、トリフルリジン、ガンシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リバビリン、及びその他のいずれかの他の抗菌化合物が挙げられる。

別の実施形態では、上記の薬物は、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンなどが挙げられるが、これらに限らない）、並びに、その類似体及び誘導体である。別の実施形態では、上記の薬物は、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、並びに、その類似体及び誘導体である。別の実施形態では、上記の薬物は、エポチロン、並びに、その類似体及び誘導体である。別の実施形態では、上記の薬物は、マイトマイシン、並びに、その類似体及び誘導体である。上記の各実施形態の１つの選択においては、葉酸拮抗薬はＥＣ２８２である。

別の実施形態では、本発明の化合物を調製するプロセスについて説明されている。実例としては、ＥＣ０２８４は下記のように調製する。
［化９］

ＥＣ０２８４について例示されているが、本明細書に記載されている他の化合物を調製する目的で、出発材料を適切に選択することによって、上記の実例的な合成法は普通に修正及び適合させてもよいものと理解されたい。

上記の一価又は多価リンカーは、上記の葉酸拮抗薬を上記の１種以上の薬物に連結するための結合点を２つ以上有するいずれかの原子鎖であり、この原子鎖は、直鎖であっても、分岐鎖であっても、環状であってもよく、あるいは、１つ以上の環状領域を含んでもよい。実例としては、このリンカーは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、及びＳｉを含む。上記の一価又は多価リンカーは、少なくとも１つの解離可能なリンカーも含む。

「解離可能なリンカー」という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、生理学的条件下で分断できる結合（例えば、ｐＨ不安定性、酸不安定性、酸化不安定性、及び／又は酵素不安定性の結合）を少なくとも１つ含むリンカーを指す。当然のことながら、結合の分断をもたらす上記のような生理学的条件としては、例えば生理学的ｐＨにおいて生じるか、又は、サイトゾルのｐＨよりも低いｐＨを有するエンドソームのような細胞小器官への区画化の結果として生じる標準的な化学加水分解反応が挙げられる。１つの変形形態では、生理学的条件は、エンドソーム内で見られる条件である。

開裂可能な１つ又は複数の結合が、開裂可能なリンカーの内部、及び／又は開裂可能なリンカーの一方若しくは両方の末端部に存在してもよい。換言すれば、解離可能なリンカーは、切断しやすい結合を含んでも、スペーサーリンカーのような別のリンカー、又は、その代わりに、切断しやすい結合を介して薬物若しくは葉酸拮抗薬に連結されていてもよい。当然のことながら、開裂可能な結合の不安定性は、当該結合の分断を補助又は促進すること（近接性補助ともいう）のできる官能基又は断片をリンカーＬ内に含めることによって調節してもよい。加えて、解離可能なリンカーの結合の分断後に、受容体結合性リガンド剤コンジュゲートの追加的な断片化を補助又は促進することのできる追加的な官能基又は断片を多価リンカーＬ内に含めてもよいことは明らかである。開裂可能な結合の不安定性は、例えば開裂可能な結合又はその結合の近くの置換基の変更（開裂可能なジスルフィド結合に隣接させてα分岐を含める、加水分解できるケイ素−酸素結合を有する部分のケイ素の置換基の疎水性を向上させる、加水分解できるケタール又はアセタールの一部を形成するアルコキシ基をホモロゲートするなど）によって、調節することができる。このようなリンカーは２つ以上の解離可能なリンカーを含むことも理解されたい。例えば、本明細書には、２つ以上の解離可能なリンカーを含む自己犠牲型（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）リンカーについて説明されている。

したがって、開裂可能な結合は、解離可能なリンカー内の２つの隣接する原子に連結でき、並びに／又は、他のリンカー、若しくは、本明細書に記載されているようなＡ及びＤを解離可能な各リンカーのいずれかの末端若しくは両方の末端に連結できるものと理解されたい。開裂可能な結合が、解離可能なリンカー内の２つの隣接する原子を連結するケースでは、結合の分断後、解離可能なリンカーは、２つ以上の断片に分断される。あるいは、開裂可能な結合が、解離可能なリンカーと別の部分（追加的なヘテロ原子、追加的なスペーサーリンカー、別の解離可能なリンカー、葉酸拮抗薬Ａ、又は薬物Ｄなど）との間にあるケースでは、結合の分断後、解離可能なリンカーは、上記の別の部分から分離される。

別の実施形態では、リンカーＬは、解離可能なジスルフィドリンカーを含む。別の実施形態では、リンカーＬは、解離可能なジスルフィドリンカーではない解離可能なリンカーを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、リンカーＬは、解離可能なリンカーを少なくとも２つ含む。別の実施形態では、リンカーＬは、解離可能なリンカーを少なくとも２つ含み、その少なくとも１つのリンカーが解離可能なジスルフィドリンカーではない。別の実施形態では、リンカーＬは、解離可能なリンカーを少なくとも２つ含み、その少なくとも１つのリンカーが、葉酸拮抗薬から各薬物Ｄを分離させる。

別の実施形態では、二価リンカー内の結合の開裂後、解離した官能基が、追加的な結合の分断又は開裂を化学的に補助する（近接性補助開裂又は分断ともいう）ような形で、剥離可能なリンカーとスペーサーリンカーが配列されていてもよい。このような解離可能なリンカーは、解離可能なリンカーを少なくとも２つ含むものと理解されたい。このような二価リンカー又はその一部の実例的な実施形態としては、下記の式を有する化合物が挙げられる。
［化１０］

式中、Ｘは、窒素、酸素、若しくは硫黄のようなヘテロ原子、又はカルボニル基であり、ｎは、０〜４から選択した整数（実例では２）であり、Ｒは、水素、又は置換基（誘導的に、又はメトキシを含むアルコキシなどのようなアリール環の共鳴によって、正電荷を安定化できる置換基を含む）であり、（^＊）という符号は、追加的なスペーサー、ヘテロ原子、又は多価リンカーを形成する解離可能なリンカーの結合点か、薬物又はその類似体若しくは誘導体、あるいは、葉酸拮抗薬又はその類似体若しくは誘導体の結合点を示している。１つの実施形態では、ｎは２であり、Ｒはメトキシである。アリール環、ベンジル炭素、アルカン酸、又はメチレン架橋に、他の置換基（ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロなどが挙げられるがこれらに限らない）が存在してもよいことは明らかである。補助開裂部は、ベンジリニウム中間体、ベンジン中間体、ラクトン環化、オキソニウム中間体、β脱離などを伴う機構を含んでよい。更に、解離可能なリンカーの開裂後の断片化に加えて、解離可能なリンカーの初期開裂も近接性補助機構によって促進できることも明らかである。

本明細書に記載されている二価リンカーを開裂させるための実例的な機構としては、下記の１，４及び１，６断片化機構が挙げられる。
［化１１］

式中、Ｘは、外来性又は内在性求核試薬、グルタチオン、又は生体内還元性剤などであり、Ｚ又はＺ’のいずれかは、葉酸拮抗薬若しくは薬物、又は、多価リンカーの他の部分と連動している葉酸拮抗薬若しくは薬物部分である。上記の断片化機構は協調機構として示されているが、多価リンカーを最終的に断片化して、示されている最終生成物にするように、個別の工程をいずれの数行ってもよいものと理解されたい。例えば、酸触媒によってカルバメート部分を脱離させることによって、結合の開裂を生じさせてもよいことは明らかである（この開裂は、上記の例に示されているβ硫黄又はジスルフィドのアリール基のいずれかによってもたらされる安定化によって近接性補助してよい）。この実施形態のこれらの変形形態では、解離可能なリンカーはカルバメート部分である。あるいは、断片化は、ジスルフィド基への求核攻撃によって開始させて開裂を引き起こして、チオレートを形成させることができる。このチオレートは、炭酸又はカルバミン酸部分と分子間で置き換わって、対応するチアシクロプロパンを形成させることができる。ベンジル含有多価リンカーのケースでは、実例のようにジスルフィド結合を分断した後、共鳴安定化した中間体を形成させることによって、得られたフェニルチオレートを更に断片化して、炭酸又はカルバミン酸部分を解離させることができる。これらのケースのいずれでも、本明細書に記載されている実例的な多価リンカーの解離可能な性質は、存在する化学的、代謝的、生理学的、又は生物学的条件に適切であり得るいずれの機構によっても実現させることができる。

解離可能なリンカーの結合を開裂させるための他の実例的な機構としては、下記のようなオキソニウムの補助による開裂が挙げられる。
［化１２］

式中、Ｚは、葉酸拮抗薬若しくは薬物であるか、又は、それぞれ、多価リンカーの他の部分と連動している葉酸拮抗薬若しくは薬物部分（１つ以上のスペーサーリンカー及び／又は他の解離可能なリンカーを含む薬物又は葉酸拮抗薬部分など）である。理論によって束縛されることなく、この実施形態では、エンドソーム内にあるような酸触媒は、ウレタン基のプロトン化を介して開裂を開始させることができる。加えて、酸触媒によるカルバメートの脱離は、ＣＯ_２とＺに結合している窒素含有部分との解離をもたらし、水又は他のいずれかのルイス塩基により捕捉できるベンジルカチオンの形成をもたらす。

別の実例的なリンカーとしては、下記の式の化合物が挙げられる。
［化１３］

式中、Ｘは、ＮＨ、ＣＨ_２、又はＯであり、Ｒは、水素、又は置換基（誘導的に、又はメトキシを含むアリール環（アルコキシなど）の共鳴によって、正電荷を安定化できる置換基を含む）であり、（^＊）という符号は、追加的なスペーサー、ヘテロ原子、又は多価リンカーを形成する解離可能なリンカーの結合点か、薬物又は葉酸拮抗薬の結合点を示している。

本明細書に記載されているこのような多価リンカーを開裂させるための例示的な機構としては、下記の１，４及び１，６断片化機構が挙げられ、その後には、ヒドラジド基による環化を介して、アシル化Ｚ’の近接性補助開裂が行われる。
［化１４］

式中、Ｘは、外来性又は内在性求核試薬、グルタチオン、又は生体内還元性剤などであり、Ｚ又はＺ’のいずれかは、葉酸拮抗薬若しくは薬物、又は、多価リンカーの他の部分と連動している葉酸拮抗薬若しくは薬物部分である。上記の断片化機構は協調機構として示されているが、多価リンカーを最終的に断片化して、示されている最終生成物にするように、個別の工程をいずれの数行ってもよいものと理解されたい。例えば、酸触媒によってカルバメート部分を脱離させることによって、結合の開裂を生じさせてもよいことは明らかである（この開裂は、上記の例で示されているβ硫黄又はジスルフィドのアリール基のいずれかによってもたらされる安定化によって近接性補助してよい）。この実施形態のこれらの変形形態では、解離可能なリンカーはカルバメート部分である。あるいは、断片化は、ジスルフィド基への求核攻撃によって開始させて開裂を引き起こして、チオレートを形成させることができる。このチオレートは、炭酸又はカルバミン酸部分と分子間で置き換わって、対応するチアシクロプロパンを形成させることができる。ベンジル含有多価リンカーのケースでは、実例のようにジスルフィド結合を分断した後、共鳴安定化した中間体を形成させることによって、得られたフェニルチオレートを更に断片化して、炭酸又はカルバミン酸部分を解離させることができる。これらのケースのいずれでも、本明細書に記載されている実例的な多価リンカーの解離可能な性質は、存在する化学的、代謝的、生理学的、又は生物学的条件に適切であり得るいずれの機構によっても実現させることができる。理論によって束縛されることなく、この実施形態では、エンドソーム内にあるような酸触媒も、ウレタン基のプロトン化を介して開裂を開始させることができる。加えて、本明細書に同様に記載されているように、酸触媒によるカルバメートの脱離は、ＣＯ_２とＺに結合している窒素含有部分との解離をもたらし、水又は他のいずれかのルイス塩基により捕捉できるベンジルカチオンの形成をもたらすことができる。

別の実施形態では、本明細書に記載されている多価リンカーは、下記の式の化合物である。
［化１５］

式中、ｎは、１〜約４から選択した整数であり、Ｒ^ａとＲ^ｂはそれぞれ独立して、水素及びアルキル（分岐鎖であってもよいＣ_１〜Ｃ_４アルキルのような低級アルキルを含む）からなる群から選択されるか、又は、Ｒ^ａとＲ^ｂは、結合している炭素原子と一体となって炭素環を形成し、Ｒは、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアシル基、又は適切に選択した窒素保護基であり、（^＊）は、薬物、葉酸拮抗薬、他の多価リンカー、又はコンジュゲートの他の部分の結合点を示している。

別の実施形態では、本明細書に記載されている多価リンカーとしては、下記の式の化合物が挙げられる。
［化１６］

式中、ｍは、１〜約４から選択した整数であり、Ｒは、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアシル基、又は適切に選択した窒素保護基であり、（^＊）は、薬物、葉酸拮抗薬、他の多価リンカー、又はコンジュゲートの他の部分の結合点を示している。

別の実施形態では、本明細書に記載されている多価リンカーとしては、下記の式の化合物が挙げられる。
［化１７］

式中、ｍは、１〜約４から選択した整数であり、Ｒは、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアシル基、又は適切に選択した窒素保護基であり、（^＊）は、薬物、葉酸拮抗薬、他の多価リンカー、又はコンジュゲートの他の部分の結合点を示している。

別の実例的な機構には、二価リンカー内の結合の開裂後、解離した官能基が、追加的な結合の分断又は開裂を化学的に補助する（近接性補助開裂又は分断ともいう）ような形で、剥離可能なリンカーとスペーサーリンカーが配列されていることが伴っている。このような多価リンカー又はその部分の実例的な実施形態としては、下記の式を有する化合物が挙げられる。
［化１８］

式中、Ｘは、窒素、酸素、若しくは硫黄のようなヘテロ原子であり、ｎは、０、１、２、及び３から選択した整数であり、Ｒは、水素、又は置換基（誘導的に、又はアルコキシのようなアリール環などの共鳴によって、正電荷を安定化できる置換基を含む）であり、Ｚ又はＺ’のいずれかは、葉酸拮抗薬若しくは薬物、又は、多価リンカーの他の部分と連動している葉酸拮抗薬若しくは薬物部分である。アリール環、ベンジル炭素、カルバメート窒素、アルカン酸、又はメチレン架橋に、他の置換基（ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロなどが挙げられるが、これらに限らない）が存在してもよいことは明らかである。補助開裂部は、ベンジリニウム中間体、ベンジン中間体、ラクトン環化、オキソニウム中間体、β脱離などを伴う機構を含んでよいことは明らかである。更に、解離可能なリンカーの開裂後の断片化に加えて、解離可能なリンカーの初期開裂も近接性補助機構によって促進できることも明らかである。

この実施態様において、ヒドロキシアルカン酸（環化されていてもよい）は、例えばオキソニウムイオンによってメチレン架橋の開裂を促進すると共に、結合の開裂、又は解離可能なリンカーの結合の開裂の後に続く断片化を促進する。あるいは、酸触媒により、かつオキソニウムイオンの補助によるメチレン架橋の開裂は、この実例的な多価リンカー又はその断片の断片化カスケードを開始させことができる。あるいは、カルバメートの酸触媒による加水分解は、ヒドロキシアルカン酸（環化していてもよい）のβ脱離を促進することができると共に、例えばオキソニウムイオンによってメチレン架橋の開裂を促進することができる。本明細書に記載されている代謝的条件、生理学的条件、又は細胞条件下で結合を分断又は開裂させる他の化学的機構が、上記のような断片化のカスケードを開始できることは明らかである。本明細書に記載されている代謝的条件、生理学的条件、又は細胞条件下で結合を分断又は開裂させる他の化学的機構が、上記のような断片化のカスケードを開始してもよいことは明らかである。

別の実施形態では、多価リンカー内の結合の開裂後、解離した官能基が、追加的な結合の分断又は開裂を化学的に補助する（近接性補助開裂又は分断ともいう）ような形で、剥離可能なリンカーとスペーサーリンカーが配列されていてもよい。このような多価リンカー又はその部分の実例的な実施形態としては、下記の式を有する化合物が挙げられる。
［化１９］

式中、Ｘは、窒素、酸素、若しくは硫黄のようなヘテロ原子であり、ｎは、０、１、２、及び３から選択した整数であり、Ｒは、水素、又は置換基（誘導的に、又はアルコキシのようなアリール環などの共鳴によって正電荷を安定化できる置換基を含む）であり、（^＊）という符号は、追加的なスペーサー、ヘテロ原子、又は多価リンカーを形成する解離可能なリンカーの結合点、あるいは、薬物又は葉酸拮抗薬の結合点を示している。アリール環、ベンジル炭素、アルカン酸、又はメチレン架橋に、他の置換基（ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロなどが挙げられるがこれらに限らない）が存在してもよいことは明らかである。補助開裂部は、ベンジリニウム中間体、ベンジン中間体、ラクトン環化、オキソニウム中間体、β脱離などを伴う機構を含んでよい。更に、解離可能なリンカーの開裂後の断片化に加えて、解離可能なリンカーの初期開裂も近接性補助機構によって促進できることも明らかである。

本明細書に記載されているリンカーの別の実例的な実施態様としては、β脱離を伴う化学的機構によって、本明細書に記載されている条件下で開裂する解離可能なリンカーが挙げられる。１つの態様では、このような解離可能なリンカーは、β−チオ、β−ヒドロキシ、及びβ−アミノ置換カルボン酸、並びに、その誘導体（エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、及び尿素など）を含む。別の態様では、このような解離可能なリンカーは、２−及び４−チオアリールエステル、カルバメート、及びカーボネートを含む。

別の実例的な実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。１つの変形形態では、リンカーは、単一のアミノ酸を含む。別の変形形態では、リンカーは、２〜約５０個、２〜約３０個、又は２〜約２０個のアミノ酸を有するペプチドを含む。別の変形形態では、リンカーは、約４〜約８個のアミノ酸を有するペプチドを含む。このようなアミノ酸は実例としては、天然のアミノ酸又はその立体異性体からから選択する。アミノ酸は、他のいずれのアミノ酸（下記の式を有するいずれかのアミノ酸など）であってもよい。
−Ｎ（Ｒ）−（ＣＲ’Ｒ”）_ｑ−Ｃ（Ｏ）−
式中、Ｒは水素、アルキル、アシル、又は好適な窒素保護基であり、Ｒ’とＲ”は水素又は置換基であり、Ｒ’とＲ”は、それぞれ存在する際に、それぞれ独立して選択され、ｑは、１、２、３、４、又は５のような整数である。実例としては、Ｒ’及び／又はＲ”は独立して、水素、又は天然のアミノ酸に存在する側鎖（メチル、ベンジル、ヒドロキシメチル、チオメチル、カルボキシル、カルボキシルメチル、グアニジノプロピルなど）、並びに、その誘導体及び保護誘導体に相当するが、これらに限らない。別の実施形態では、Ｒ’及び／又はＲ”は独立して、水素、又は、天然のアミノ酸に存在する側鎖の類似体（β−アミノアラニンのような、セリン及びトレオニンの対応するアミノ類似体など）に相当するが、これらに限らない。上記の式は、あらゆる立体異性変形形態を含む。例えば、アミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルニチン、トレオニンなどから選択してよい。１つの変形形態では、解離可能なリンカーは、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルチニン、及びトレオニンから選択した少なくとも２つのアミノ酸を含む。別の変形形態では、解離可能なリンカーは、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルチニン、及びトレオニンから選択した２〜約５個のアミノ酸を含む。別の変形形態では、解離可能なリンカーは、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びオルニチン、並びにこれらの組み合わせから選択したアミノ酸からなるトリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド又はヘキサペプチドを含む。

アミノ酸という用語は、本明細書で用いる場合、一般にアミノアルキルカルボキシレートを指し、そのアルキルラジカルは、アルキル、ヒドロキシアルキル、スルフヒドリルアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキルなどで置換されていてもよく、天然のアミノ酸（セリン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）に対応する基を含む。このようなアミノ酸は、単一の立体異性のものであっても、立体異性体の特定の混合物（ラセミ混合物を含む）であってもよいものと理解されたい。加えて、アミノ酸は、βアミノ酸（βアラニンなど）、γアミノ酸、及びもっと長いアミノ酸（下記の式のアミノ酸など）も指す。
−Ｎ（Ｒ）−（ＣＲ’Ｒ”）_ｑ−Ｃ（Ｏ）−
式中、Ｒは水素、アルキル、アシル、又は好適な窒素保護基であり、Ｒ’とＲ”は水素又は置換基であり、Ｒ’とＲ”は、それぞれ存在する際に、それぞれ独立して選択され、ｑは、１、２、３、４、又は５のような整数である。実例としては、Ｒ’及び／又はＲ”は独立して、水素、又は天然のアミノ酸に存在する側鎖（メチル、ベンジル、ヒドロキシメチル、チオメチル、カルボキシル、カルボキシルメチル、グアニジノプロピルなど）、並びに、その誘導体及び保護誘導体に相当するが、これらに限らない。上記の式は、あらゆる立体異性変形形態を含む。例えば、アミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルニチン、トレオニンなどから選択してよい。本明細書に記載されているビタミン受容体結合性薬物送達コンジュゲートの中間体の別の実例的な態様では、その薬物、又はその類似体若しくは誘導体は、アルキルチオール求核試薬を含む。

リンカーの追加的な例（追加的な多価リンカー、親水性リンカーなど）は、米国特許出願公開第２００５／０００２９４２号、米国特許出願公開第２００８／０２４８０５２号、米国特許出願公開第２００８／０５６８２４号、及び国際公開第ＷＯ２００９／００２９９３号に記載されており、これらの開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

別の実施形態では、上記の標的送達コンジュゲートのうちのいずれか１種と、１種以上の担体、賦形剤、及び希釈剤、又はこれらの組み合わせとを含む医薬組成物について説明されている。

別の実施形態では、患者における病原性細胞集団を治療するための方法であって、上記の標的送達コンジュゲートのうちのいずれか１種を有効量投与する工程を含む方法について説明されている。

別の実施形態では、疾患を軽減する必要のある患者を治療する方法であって、その患者に、上記の標的送達コンジュゲートのうちのいずれか１種を治療有効量投与する工程を含む方法について説明されている。１つの実施形態では、その疾患は癌である。

本明細書に記載されている葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートは、ヒト臨床医学用途と獣医学用途の両方で用いることができる。したがって、病原性細胞集団を有すると共に、上記の薬物送達コンジュゲートで治療を行う宿主動物は、ヒトであることもできるし、獣医学用途の場合には、実験動物、畜産動物、ペット、若しくは野生動物であることもできる。本明細書に記載されている方法は、ヒト、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、サル、チンパンジーなどの実験動物、イヌ、ネコ、及びウサギのようなペット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギのような畜産動物、並びに、クマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、及びクジラのような飼育されている野生動物など（ただしこれらに限らない）の宿主動物に適用することができる。

本発明の方法は、これらの宿主動物において様々な病状を引き起こす病原性細胞集団に適用可能である。病原性細胞という用語は、例えば、癌細胞、感染因子（細菌及びウイルスなど）、細菌感染細胞又はウイルス感染細胞、並びに、葉酸受容体を独自に発現するか、優先的に発現するか、又は過剰発現する他のいずれかのタイプの病原性細胞を指す。また、病原性細胞には、本明細書に記載されている葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートによって治療すると軽減される病状を引き起こすいずれの細胞も含めることができる。

別の実施形態では、病原性細胞集団は、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含め、腫瘍形成性の癌細胞集団であることも、非腫瘍形成性であることもできる。癌細胞集団は、自然に発生することも、宿主動物の生殖細胞系に存在する突然変異、若しくは体細胞突然変異のようなプロセスによって発生することも、又は、化学物質、ウイルス、又は放射線によって誘発されることもある。本発明の方法を用いて、癌腫、肉腫、リンパ腫、ホジキン病、黒色腫、中皮腫、バーキットリンパ腫、鼻咽腔癌、白血病、及び骨髄腫のような癌を治療することができる。癌細胞集団としては、口腔癌、甲状腺癌、内分泌癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、咽頭癌、膵癌、結腸癌、膀胱癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、乳癌、精巣癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、肝癌、及び肺癌を挙げることができるが、これらに限らない。

病原性細胞集団が癌細胞集団である実施形態では、コンジュゲートの投与効果は、腫瘍質量の縮小若しくは排除、又は、腫瘍細胞の増殖の阻害によって測定される治療反応である。腫瘍の場合、上記の排除は、原発腫瘍の細胞の排除、又は、転移したか、若しくは、原発腫瘍から解離する過程である細胞の排除であることができる。腫瘍の外科切除、放射線療法、化学療法、又は生物学的療法を含むいずれかの治療アプローチによって腫瘍を除去した後に、腫瘍の再発を予防する目的で、上記の薬物送達コンジュゲートによって予防的治療を行うことも説明されている。この予防的治療は、上記の薬物送達コンジュゲートによる初期治療（毎日複数回投与するレジメンでの治療など）であることも、及び／又は、初期治療（単一若しくは複数）から数日若しくは数カ月後に行う追加治療若しくは一連の治療であることもできる。したがって、本明細書に記載されている方法を用いて治療したいずれかの病原性細胞集団の排除には、病原性細胞数の減少、病原性細胞の増殖の阻害、病原性細胞の再発を予防する予防的治療、又は、疾患の症状を軽減させる、病原性細胞の治療が含まれる。

癌細胞を排除しているケースでは、本発明の方法は、腫瘍の外科切除、放射線療法、化学療法、又は他の免疫療法（モノクローナル抗体療法、免疫調節薬による治療、免疫エフェクター細胞の養子移入、並びに、造血成長因子、サイトカイン、及びワクチン接種による治療が挙げられるが、これらに限らない）のような生物学的療法と併せて用いることができる。

１つの実施形態では、リガンドに特異的に結合すると共に、病原性細胞上で優先的に発現する受容体、輸送体、又はその他の表面提示タンパクに、本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートの葉酸拮抗薬部分が結合すると、そのコンジュゲートは、標的病原性細胞内にインターナリゼーションすることができる。このようなインターナリゼーションは、例えば、受容体を介したエンドサイトーシスを通じて生じることできる。１つ以上の解離可能なリンカーを含む葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートによって、結合リガンド部分と薬物は、細胞内で解離できるようになり、薬物は、その細胞内標的に作用を及ぼすことができる。

一般に、二価リンカー（Ｌ）と、葉酸拮抗薬、又はその類似体若しくは誘導体とのコンジュゲート、二価リンカー（Ｌ）と、薬物又はその類似体若しくは誘導体とのコンジュゲート（いずれかの介在ヘテロ原子を含む）を形成させるためのあらゆる方法を用いることができる。また、スペーサーリンカーと、解離可能なリンカーと、リンカー（Ｌ）を形成するいずれかの追加的なヘテロ原子とのコンジュゲートを形成するための方法であって、当該技術分野で認められているあらゆる方法も用いることもできる。共有結合は、例えば、上記のリンカー、薬物、及び／又は葉酸拮抗薬のいずれかに存在する酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、又はヒドラゾ基の間のアミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、又はイミノ結合の形成を通じて生じることができる。

別の実例的な態様では、本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートを投与するためのいずれかの有効なレジメンを用いることができる。例えば、葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートは、単回用量として投与することも、１日に複数回投与するレジメンとして分割して投与することもできる。別の実施形態では、時差レジメン、例えば、１日に１回の治療の代替策として、週１〜３日の治療を用いることができ、このような間欠的すなわち時差的なレジメンは、毎日行う治療と同等であり、本明細書に記載されている方法の範囲内であるとみなす。１つの実施形態では、本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートを複数回注射することによって宿主を治療して、病原性細胞集団を排除する。別の実施形態では、本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートを例えば１２〜７２時間の間隔、又は４８〜７２時間の間隔で複数回（好ましくは約２回〜最大約５０回）、宿主に注射する。別の実施形態では、初期注射（１回又は複数回）の後、数日又は数カ月の間隔で、本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートを患者に追加的に注射することができ、この追加的な注射によって、病原性細胞によって生じる病状の再発が予防される。

別の実施形態では、１回量以上の用量で投与したときに、宿主動物の病原性細胞集団を排除するのに有効である量の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートを含む医薬組成物について説明されている。本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートは、宿主動物に非経口投与、例えば、皮内投与、皮下投与、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与、又は髄腔内投与するのが好ましい。あるいは、本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートは、経口投与のような他の医学的に有用なプロセスによって宿主動物に投与することができると共に、いずれかの有効用量、及び好適な治療投与形態（持続放出投与形態を含む）を用いることができる。

非経口投与形態の例としては、等張食塩水、５％グルコース、又はその他の周知の製薬学的に許容可能な液体担体（液体アルコール、グリコール、エステル、及びアミドなど）中の有効剤の水溶液が挙げられる。非経口投与形態は、上記の用量の薬物送達コンジュゲートを含む再構成可能な凍結乾燥体の形態であることができる。本実施形態の１つの態様では、当該技術分野において既知のいずれかの数の持続放出投与形態（例えば、米国特許第４，７１３，２４９号、同第５，２６６，３３３号、及び同第５，４１７，９８２号（これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている生分解性炭水化物マトリックスなど）を投与することができ、あるいは、低速ポンプ（例えば浸透圧ポンプ）を用いることもできる。

本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートの１日の単位用量は、宿主の状態、治療対象の病状、コンジュゲートの分子量、コンジュゲートの投与経路及び組織分布、並びに、放射線療法のような他の治療法を併用する可能性に応じて大きく変化することがある。患者に投与する有効量は、体表面積、患者の体重、及び患者の状態に対する医師の評価がベースとなる。実例的な実施形態では、有効な用量は、例えば、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、及び約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇの範囲であることができる。

１つの実例的な態様では、上に詳述されている方法と組み合わせて又はそのアジュバントとして、治療因子を含む少なくとも１種の追加的な組成物を宿主に投与して、結合リガンド・薬物送達コンジュゲートを介して病原性細胞集団を排除する能力を強化することができ、あるいは、２種以上の追加的な治療因子を投与することもできる。この治療因子は、化学療法剤、又は投与される結合リガンド薬物送達コンジュゲートの効能を補うことができる別の治療因子から選択することができる。

１つの実例的な態様では、これらの因子の組み合わせであって、治療効果のある組み合わせを用いることができる。１つの実施形態では、本発明の葉酸拮抗薬・薬物送達コンジュゲートと共に、これらの治療因子を、例えば１日に複数回するレジメンで１日の用量当たり約０．１ＭＩＵ／ｍ^２〜１日の用量当たり約１５ＭＩＵ／ｍ^２の範囲の量であるか、又は、１日に複数回するレジメンで１日の用量当たり約０．１ＭＩＵ／ｍ^２〜１日の用量当たり約７．５ＭＩＵ／ｍ^２の範囲の量である治療有効量用いて、病原性細胞を有する宿主動物の病原性細胞を排除、減少、又は無毒化することができる（ＭＩＵ＝ミリ国際単位、ｍ^２＝平均的なヒトの大まかな体表面積）。

別の実施形態では、化学療法剤（例えば、それ自体に細胞毒性があるものか、又は腫瘍透過性を高めるように機能できるもの）も、本明細書に記載されている方法において、結合リガンド薬物送達コンジュゲートと組み合わせて用いるのに適している。このような化学療法剤としては、アドレノコルチコイド及びコルチコステロイド、アルキル化剤、抗男性ホルモン、抗エストロゲン、アンドロゲン、アクラマイシン及びアクラマイシン誘導体、エストロゲン、代謝拮抗物質（シトシンアラビノサイド、プリン類似体、ピリミジン類似体、及びメトトレキサートなど）、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン及び他の白金化合物、タモキシフェン、タクソール、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標）、シクロホスファミド、ダウノマイシン、リゾキシン、Ｔ２毒素、植物アルカノイド、プレドニゾン、ヒドロキシ尿素、テニポシド、マイトマイシン、ディスコデルモリド、微小管阻害薬、エポチロン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、シクロプロピルベンゾ［ｅ］インドロン、セコシクロプロピルベンゾ［ｅ］インドロン、Ｏ−Ａｃ−セコ−シクロプロピルベンゾ［ｅ］インドロン、ブレオマイシン及び他のいずれかの抗生物質、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、ビンクリスチン、ビンブラスチン、その類似体及び誘導体（デアセチルビンブラスチンモノヒドラジドなど）、コルヒチン、コルヒチン誘導体、アロコルヒチン、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ハリコンドリンＢ、ドラスタチン（ドラスタチン１０など）、アマニチン（αアマニチンなど）、カンプトテシン、イリノテカン及び他のカンプトテシン誘導体、ゲルダナマイシン及びゲルダナマイシン誘導体、エストラムスチン、ノコダゾール、ＭＡＰ４、コルセミド、炎症剤及び炎症誘発剤、ペプチド及びペプチド模倣シグナル伝達阻害薬、並びに、当該技術分野で認められている他の任意の薬剤又は毒素が挙げられる。用いることができる他の薬物としては、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、クロラムフェニコール、アミノ配糖体系抗生物質、ゲンタマイシ、アンホテリシンＢ、アシクロビア、トリフルリジン、ガンシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リバビリン、メイタンシン、及びその類似体及び誘導体、ゲムシタビン、並びに、当該技術分野で認められている他のいずれかの抗菌化合物が挙げられる。

上記の治療因子は、結合リガンド薬物送達コンジュゲートの前、後、又はそれと同時に宿主動物に投与することができると共に、上記の治療因子は、結合リガンド薬物送達コンジュゲートを含有する同じ組成物の一部として、又は、結合リガンド薬物送達コンジュゲートとは異なる組成物の一部として投与することができる。上記の治療因子を治療有量含有する上記のような治療用組成物のいずれを用いることもできる。

本明細書に記載されている葉酸拮抗薬コンジュゲートは、当該技術分野で認められている合成法によって調製することができる。この合成法は、任意の追加的なヘテロ原子、若しくはスペーサーリンカーに既に存在しているヘテロ原子、解離可能なリンカー、薬物、及び／又は葉酸拮抗薬の選択に応じて選択する。一般に、関連する結合形成反応については、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，”ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＴｈｅｏｄｒａ Ｅ．Ｇｒｅｅｎ＆Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｏｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されており、これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。別の態様では、葉酸拮抗薬はリンカーを介して薬物に結合している。１つの実施形態では、このリンカーはオリゴペプチドを含む。

別の実施形態では、下記の実例的な葉酸拮抗薬−リンカー中間体を調製する。
［化２０］

上記のプロセスは実例的なものであり、本明細書に記載されている追加的な中間体を調製する目的で適合及び修正してよいものと理解されたい。

下記の実例的な実施例について説明する。

材料：２００６年３月１４日に提出されたＸｕ ｅｔ ａｌ．，の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９１５３号に従って、プテロイル酸（Ｐｔｅ）とＮ^１０−トリフルオロアセチルプテロイル酸を調製した。ペプチド合成試薬はノババイオケム（カリフォルニア州ラホヤ）及びバッケム（カリフォルニア州サンカルロス）から購入した。葉酸を含まないＲＰＭＩ培地（ＦＦＲＰＭＩ）とＰＢＳはニューヨーク州グランドアイランドのギブコから入手した。牛乳の可溶性葉酸結合タンパク（ｓＦＢＰ）はスクリップスから購入した（アイテム番号Ｆ０５２４）。^３Ｈ−チミジンはカリフォルニア州ブレアのモラベクバイオケミカルズ（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。他のあらゆる一般的な試薬はシグマ（ミズーリ州セントルイス）又はその他の大手供給元から購入した。

比較用化合物のＥＣ２０、ＥＣ１１９、ＥＣ１７、ＥＣ７２、ＥＣ１４０、及びＥＣ１４５は、エンドサイト社（インディアナ州ウエストラファイエット）から入手した。これらの合成、精製、及び分析的特徴については、他の文献（Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２；１３（６）：１２００−１０、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００２；５１（３）：１５３−６２、Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２００５；１６（４）：８０３−１１、Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２００６；１７（５）：１２２６−３２、Ｖｌａｈｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２００６；１６（１９）：５０９３−６）に詳細に説明されている。比較例のデス−グルタミルＣＢ３７１７と葉酸拮抗薬ＣＢ３７１７も、既知の手順（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８１；１７（１）：１１−９、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９８６；２９（６）：１１１４−８）に従って調製してよい。

比較例：ＥＣ２１６の合成：乾いた１０ｍＬの丸底フラスコ内で、Ｐｔｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ（７．６ｍｇ、１８．３μモル）と３−（４−デスアセチルビンブラスチニル）ヒドラジンカルボン酸２−ピリジルジチオエチルエステル（１５ｍｇ、１５．３μＭ）を０．８ｍＬのＤＭＳＯにアルゴン雰囲気下で溶解させた。ＤＩＰＥＡ（５４μＬ、０．３１ｍＭ、２０当量）を上記の溶液に加え、得られた澄明な溶液をアルゴン下で３時間攪拌した。分析的ＨＰＬＣ（１０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ＝７．０）、及びアセトニトリル）によって、この反応の進行をモニタリングした。その反応混合物をろ過し、分取用のＨＰＬＣカラム（ウォーターズのＸＴｅｒｒａ Ｃ１８、７μｍ、１９×３００ｍｍ）に注入した。１ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）（Ａ）とアセトニトリル（Ｂ）によって溶出して（方法：３０分で１５ｍＬ／分にて１％のＢ〜８０％のＢ）、生成物を含有する純粋な画分を得た。純粋な画分を合わせて、アセトニトリルを減圧下で周囲温度にて除去した。４８時間凍結乾燥した後、得られたＥＣ２１６コンジュゲートを単離した（１０ｍｇ、５１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６＋Ｄ_２Ｏ）δ８．６３（ｓ，１Ｈ）、７．５８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）７．２４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．１０−６．８０（ｍ，２Ｈ）、６．６５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）、６．４１（ｓ，１Ｈ）、６．１９（ｓ，１Ｈ）、５．６８（ｍ，１Ｈ）、５．５６（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．４６（ｓ，２Ｈ）、４．３５−３．９０（ｍ，４Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）、３．４５−２．２０（ｍ，２３Ｈ）、２．０５−１．８５（ｍ，２Ｈ）、１．５６（ｍ，２Ｈ）、１．４０−０．９５（ｍ，８Ｈ）、０．７８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）、０．７１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝１２８６．３４

α-ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチル−Ｌ−グルタミン酸ジエステルＥＣ０６１４の合成：
［化２１］

Ｆｍｏｃα−（ｔ−ブチル）−Ｌ−グルタミン酸（１．２７５ｇ、３ｍモル）、２−（２−ピリジルジチオ）エタノール（６８４ｍｇ、３．０ｍモル）、ＤＭＡＰ（８０６ｍｇ、６．６ｍモル）、ＨＯＢｔ（４５０ｍｇ、３．０ｍモル）を１５０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させた。この溶液にＤＣＣ（６８０ｍｇ、３．３ｍモル）を加え、その溶液を室温にてアルゴン下で一晩攪拌した。その反応混合物をろ過し、溶媒を蒸発させた。トルエンを加えて所望の生成物を溶解させてから、更にＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、この有機溶液をＮａＯＡｃ（０．１Ｍ）／１０％ＮａＣｌ（ｐＨ＝６）によって洗浄し、続いてＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて、澄明な油を得た。５０％のＥｔＯＡｃ／５０％の石油エーテルを溶出液として用いたシリカカラムに粗生成物を入れ、１．５ｇの生成物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）８．４７−８．４４（ｍ，１Ｈ）、７．４６（ｄ，Ｊ＝７．４ＨＺ，２Ｈ）、７．６８−７．５８（ｍ，４Ｈ）、７．３９−７．２６（ｍ，４Ｈ）、７．１０−７．０５（ｍ，１Ｈ）、５．４２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．４０−４．２６（ｍ，４Ｈ）、４．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．０３（ｓ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５０−２．３０（ｍ，２Ｈ）、２．２８−２．１８（ｍ，１Ｈ）、２．０２−１．８５（ｍ，１Ｈ）、１．４８（ｓ，９Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）１７２．７、１７１．２、１５９．８、１５６．２、１４９．９、１４４．１、１４３．９、１４１．５、１３７．２６、１２７．９、１２７．３、１２５．３、１２１．１、１２０．２、１２０．１、８２．８、６７．３、６２．６、５３．９、４７．４、３７．４、３０．３、２８．２、２８．１

ＥＣ２８２（ＣＢ３７１７）の合成：
［化２２］

Ｎ^１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸α−ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチル−ジエステル（ＥＣ０６１５）の合成：
［化２３］

６１４ｍｇのＦｍｏｃ保護グルタミン酸（ＥＣ０６１４）を１２．０ｍＬのＤＭＦに溶解させた。この溶液に、５，８−ジデアザプテロイン酸（３５０ｍｇ）、ＰｙＢＯＰ（５１０ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１５０ｍｇ）、ＤＭＡＰ（１３５ｍｇ）を加えた。続いて、この反応混合物を５分間攪拌し、０．３ｍＬのＥｔ_３Ｎを加え、その反応混合物を一晩攪拌した。この反応混合物をＮａＯＡｃ（０．１Ｍ）／１０％ＮａＣｌ（ｐＨ＝６）に加え、遠心分離して、粗生成物６０１ｍｇを得た。この粗生成物をＨＰＬＣ（１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）、及びアセトニトリル）によって精製して、３６０ｍｇの生成物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．９２（ｂｒ，１Ｈ，ラクタムＮＨ）、８．４２（ｄｄ，Ｊ＝４．８，１．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．２３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．８２−７．７０（ｍ，５Ｈ）、７．４７（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．２０（ｍ，１Ｈ）、７．１３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．８３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、６．２８（ｂｒ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，２Ｈ）、４．３２−４．１９（ｍ，５Ｈ）、３．１９（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．０７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．１０−１．８３（ｍ，２Ｈ）、１．３７（ｓ，９Ｈ）

デアセチルビンブラスチンヒドラジド誘導体ＥＣ０６１６の合成：
［化２４］

３９．５ｍｇのＤＡＶＬＢＨピリジルジスルフィド誘導体を０．５ｍＬのＴＨＦ／０．５ｍＬのＨ_２Ｏに溶解させ、４．２ｍｇのメルカプトプロピオン酸を０．５ｍＬのＴＨＦ／０．５ｍＬのＨ_２Ｏに溶解させ、アルゴンで脱気しながら、この溶液をｐＨ７に調節した。メルカプトプロピオン酸溶液をビンブラスチン溶液に加え、２０分間攪拌した。その反応混合物をＨＰＬＣ（１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ、ｐＨ５．２）で精製した。凍結乾燥後、２４ｍｇの生成物を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）９７７．３８、^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）９．３９（ｓ，ｂｒ，１Ｈ）、９．２９（ｓ，ｂｒ，１Ｈ）、９．１２（ｓ，ｂｒ，１Ｈ）、８．６１（ｓ，ｂｒ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．２４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．９９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．９０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．４０（ｓ，１Ｈ）、６．１８（ｓ，１Ｈ）、５．６７（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，４．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．５６（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．２１（ｔ，ｂｒ，２Ｈ）、４．１４−３．９０（ｍ，３Ｈ）、３．７８（ｓ，１Ｈ）、３．７０（ｓ，３Ｈ）、３．５０（ｓ，３Ｈ）、３．３８（ｓ，２Ｈ）、３．２６−３．００（ｍ，６Ｈ）、３．００−２．８７（ｍ，５Ｈ）、２．８６（ｓ，１Ｈ）、２．７６（ｓ，３Ｈ）、２．７１−２．５７（ｍ，２Ｈ）、２．５２−２．４７（ｍ，３Ｈ）、２．４０−２．３８（ｍ，２Ｈ）、２．０５−１．８８（ｍ，２Ｈ）、１．７０−１．５０（ｍ，２Ｈ）、１．３８−１．２０（ｍ，５Ｈ）、０．８８−０．５３（ｍ，７Ｈ）

ＥＣ０２８５の合成：
［化２５］

１１７ｍｇのＥＣ０６１５と、８７ｍｇのチオペプチドを６．０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、アルゴンで脱気し、０．２ｍＬのＤＩＰＥＡを加え、２時間後、ＨＰＬＣ（１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ５．２）／アセトニトリル）で精製して、１２６ｍｇの生成物を得た。この生成物９０ｍｇを５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ（９７．５：２．５）に溶解させ、１時間攪拌した。続いて、この反応混合物を冷やしたＥｔ_２Ｏに加え、１０分間攪拌した。この沈殿物を遠心分離し、Ｅｔ_２Ｏで３回洗浄した。この反応物を８２ｍｇの白色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）１０７３．３０、^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）７．５７（ｓ，１Ｈ）、７．４８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．２２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．６０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．５２−４．４３（ｍ，３Ｈ）、４．３６−４．３０（ｍ，２Ｈ）、４．２２（ｑ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８８−３．７３（ｍ，２Ｈ）、３．２８（ｄｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．１１（ｔ，ｄｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．７０−２．４８（ｍ，８Ｈ）、２．４５−２．３１（ｍ，６Ｈ）、２．２８−２．２０（ｍ，２Ｈ）、２．１７−２．０３（ｍ，２Ｈ）、１．９６−１．８２（ｍ，２Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）１８１．６、１７８．５、１７８．２、１７７．９、１７７．８、１７５．７、１７４．２、１７３．５、１６８．９、１５４．１、１５０．２、１４１．７、１３３．９、１２２．９、１２８．９、１２４．６、１２１．２、１１８．７、１１５．８、１１２．９、８０．１、７３．５、６３．１、５４．９、５４．２、５２．４、５１．７、４１．１、３８．８、３８．７、３８．４、３５．９、３４．８、３３．２、３０．９、３０．８、２７．１、２３．３

ＥＣ０２８４の合成：
［化２６］

０．１ｍＬのＴＨＦ中の２２．０ｍｇのＥＣ０６１６に、０．１ｍＬのＴＨＦ中の２．６ｍｇのＮＨＳ、０．１ｍＬのＴＨＦ中の２．７ｍｇのＤＩＰＥＡ、０．１ｍＬのＤＭＦ中の１１．７ｍｇのＰｙＢＯＰを加えた。この反応混合物を室温で４０分間攪拌し、その反応物をＨＰＬＣでモニタリングした。別の当量のＮＨＳ、ＤＩＰＥＡ、ＰｙＢＯＰをこの反応物に加え、４０分間攪拌した。１６．０ｍｇのＥＣ０２８５を０．５ｍＬのＨ_２Ｏに溶解させてから、ＮａＨＣＯ_３水溶液によってｐＨ７．５に調節し、続いて、上記の反応溶液と混合した。３０分後、１ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）によるＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥後に１１．２ｍｇのＥＣ０２８４を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）^＋２０３３．４、^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＋Ｄ_２Ｏ）７．５７（ｓ，１Ｈ）、７．６２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．４６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．３４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．２３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．１４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．９０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．８２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．４０（ｓ，１Ｈ）、６．１８（ｓ，１Ｈ）、５．６７（ｄｄ，１Ｈ）、５．５６（ｄｄ，１Ｈ）、４．６２（ｓ，ｂｒ，２Ｈ）、４．５１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．３６−４．２６（ｍ，４Ｈ）、４．１８（ｍ，２Ｈ）、４．１４−３．９６（ｍ，５Ｈ）、３．７６（ｓ，１Ｈ）、３．６９（ｓ，２Ｈ）、３．２６−２．６５（ｍ，３２Ｈ）、２．３６−１．８３（ｍ，１８Ｈ）、１．７１（ｍ，６Ｈ）、１．６４−１．３８（ｍ，５Ｈ）、１．３２−１．１３（ｍ，１３Ｈ）、０．８８−０．５６（ｍ，１１Ｈ）

α−ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルメトトレキサートＥＣ０６１９の合成：
［化２７］

グルタミン酸のピリジルジチオ誘導体ＥＣ０６１４（５０ｍｇ、１当量）をドライＤＭＦ中でよく攪拌させた溶液に、４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］安息香酸（３０ｍｇ、１当量）、ＰｙＢｏｐ（４８ｍｇ、１当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１２ｍｇ、１．１当量）、及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１１ｍｇ、１．１当量）を加えた。５分間攪拌後、トリエチルアミン（３５μＬ、３当量）を加えた。この反応混合物を室温で１８時間攪拌させた（ＴＬＣ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２０％ＭｅＯＨ）。この溶媒を減圧下で除去した。分取ＨＰＬＣ（１０ｍＭの酢酸アンモニウム、（ｐＨ＝７）、及びアセトニトリル)によって、α−ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルメトトレキサート（３８ｍｇ）を精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６８０．３１、^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．５５（ｓ，１Ｈ）、８．４１（ｄｄ，１Ｈ）、８．１９（ｄ，１Ｈ）、７．７７（ｍ，１Ｈ）、７．７０（ｄ，２Ｈ）、７．１９（ｍ，１Ｈ）、６．８０（ｄ，２Ｈ）、４．７６（ｓ，２Ｈ）、４．２８（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｔ，２Ｈ）、３．１９（ｓ，３Ｈ）、３．０６（ｔ，２Ｈ）、２．３６（ｔ，２Ｈ）、１．９７（ｍ，２Ｈ）、１．３７（ｓ，９Ｈ）

γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルメトトレキサートＥＣ０６２０の合成：
［化２８］

α−ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルメトトレキサートＥＣ０６１９（２０ｍｇ）を０．５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ溶液（９７．５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＰＳ）に溶解させた。この反応混合物を１時間攪拌してから（分析的ＨＰＬＣ、１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７）、及びアセトニトリル）、ジエチルエーテル中で沈殿させた。得られた沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し（３回）、遠心分離によって単離し、真空下で乾燥させて、粗生成物（１８ｍｇ）を得た。この黄色の粉末（γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルメトトレキサート）を更なる精製なしに次の工程で利用した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６２４．３２、^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１２．５８（ｂｒ，１Ｈ）、８．６９（ｓ，１Ｈ）、８．４１（ｍ，１Ｈ）、８．２３（ｄ，１Ｈ）、７．７６（ｍ，１Ｈ）、７．７０（ｄ，２Ｈ）、７．１９（ｍ，１Ｈ）、６．８０（ｄ，２Ｈ）、４．８５（ｓ，２Ｈ）、４．３５（ｍ，１Ｈ）、４．１９（ｔ，２Ｈ）、３．２３（ｓ，３Ｈ）、３．０５（ｔ，２Ｈ）、２．３５（ｔ，２Ｈ）、２．０８（ｍ，１Ｈ）、１．９１（ｍ，１Ｈ）

ＥＣ０４０１の合成：
［化２９］

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｏ^ｔＢｕ（３０ｍｇ、１当量）をドライＥｔＯＡｃに溶解させた。この溶液を−１５℃まで冷却した。アルゴン下で攪拌しながら、この溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２６μＬ、２．１当量）とクロロギ酸イソブチル（１４μＬ、１．５当量）を加えた。−１５℃で４５分間攪拌後、ヒドラジンカルボン酸２−（ピリジン−２−イル−ジスルファニル）エチルエステル（２４ｍｇ、１．４当量）を加えた。この反応混合物を−１５℃で３０分間攪拌してから、５分以内に室温まで加温した。更に３０分間、室温で攪拌を続けた（ＴＬＣ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ＭｅＯＨ）。溶媒を蒸発させて乾燥した。得られたグルタミン酸のピリジルジチオ誘導体ＥＣ０４０１（４０ｍｇ）をシリカゲルカラム（石油エーテル中の６６％ＥｔＯＡｃ）で精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６５３．１、^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３＆ＣＤ_３ＯＤ）δ８．４８（ｄ，１Ｈ）、７．７３（ｍ，４Ｈ）、７．５８（ｄ，２Ｈ）、７．３７（ｔ，２Ｈ）、７．２８（ｔ，２Ｈ）、７．１４（ｍ，１Ｈ）、５．７６（ｍ，１Ｈ）、４．３５（ｔ，２Ｈ）、４．３２（ｔ，２Ｈ）、４．１８（ｔ，１Ｈ）、３．０１（ｔ，２Ｈ）、２．２４（ｍ，４Ｈ）、１．９０（ｍ，１Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）

メトトレキサート−Ｏ^ｔＢｕ−ヒドラジドピリジルジスルフィド−エタノールカルバゼートＥＣ０４０２の合成：
［化３０］

グルタミン酸のピリジルジチオ誘導体ＥＣ０４０１（４５ｍｇ、１当量）をドライＤＭＦ中でよく攪拌した溶液に、４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］安息香酸（２５ｍｇ、１当量）を加えてから、ＰｙＢｏｐ（３９ｍｇ、１．１当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０ｍｇ、１．１当量）、及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（９ｍｇ、１．１当量）を加えた。５分攪拌後、トリエチルアミン（２９μＬ、３当量）を加えた。この反応混合物を室温で１８時間攪拌させた。溶媒を減圧下で除去した。メトトレキサートのｔ−ブチル保護ピリジルジチオ誘導体ＥＣ０４０２（２５ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７）、及びアセトニトリル）によって精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝７３８．１、^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＆Ｄ_２Ｏ）δ８．５７（ｓ，１Ｈ）、８．４６（ｄ，１Ｈ）、７．８０（ｍ，２Ｈ）、７．７３（ｄ，２Ｈ）、７．２４（ｔ，１Ｈ）、６．８１（ｄ，２Ｈ）、４．７９（ｓ，２Ｈ）、４．２２（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｔ，２Ｈ）、３．２１（ｓ，３Ｈ）、３．０９（ｔ，２Ｈ）、２．２１（ｔ，２Ｈ）、２．０１（ｍ，１Ｈ）、１．９１（ｍ，１Ｈ）、１．３９（ｓ，９Ｈ）

メトトレキサートヒドラジドピリジルジスルフィド−エタノールカルバゼートＥＣ０４０３の合成：
［化３１］

メトトレキサートのｔ−ブチル保護ピリジルジチオ誘導体ＥＣ０４０２（２５ｍｇ）を０．５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ溶液（９７．５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＰＳ）に溶解させた。この反応混合物を０．５時間攪拌してから、ジエチルエーテル中で沈殿させた（分析的ＨＰＬＣ、１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７）、及びアセトニトリル）。得られた沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し（３回）、遠心分離によって単離し、真空下で乾燥させて、粗生成物（１８ｍｇ）を得た。この黄色の粉末（メトトレキサートヒドラジドピリジルジスルフィド−エタノールカルバゼートＥＣ０４０３）を更なる精製なしに次の工程で利用した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６８２．３、^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＆Ｄ_２Ｏ）δ８．７０（ｓ，１Ｈ）、８．４４（ｄ，１Ｈ）、７．８２（ｍ，２Ｈ）、７．７４（ｄ，２Ｈ）、７．２４（ｔ，１Ｈ）、６．８１（ｄ，２Ｈ）、４．８７（ｓ，２Ｈ）、４．３２（ｄｄ，１Ｈ）、４．２０（ｔ，２Ｈ）、３．２４（ｓ，３Ｈ）、３．０８（ｔ，２Ｈ）、２．２１（ｔ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，１Ｈ）、１．９４（ｍ，１Ｈ）

α−ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルアミノプテリンＥＣ０４５９の合成：
［化３２］

グルタミン酸のピリジルジチオ誘導体（９５ｍｇ、１当量）を１ｍＬのドライＤＭＦ中でよく攪拌した溶液に、デス−ｇｌｕ−アミノプテリン（５０ｍｇ、１当量）、ＰｙＢｏｐ（９４ｍｇ、１．１当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２４ｍｇ、１．１当量）、及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２２ｍｇ、１．１当量）を加えた。５分間攪拌後、トリエチルアミン（６７μＬ、３当量）を加えた。この反応混合物を室温で一晩攪拌させた（ＴＬＣ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２０％ＭｅＯＨ）。溶媒を減圧下で除去した。このα−ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルメトトレキサート（４５ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（１０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ＝７）及びアセトニトリル）によって精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６６６．２、^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．６９（ｓ，１Ｈ）、８．４２（ｍ，１Ｈ）、８．１９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７（ｍ，１Ｈ）、７．７０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．２０（ｍ，１Ｈ）、６．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．４９（ｓ，２Ｈ）、４．２８（ｍ，１Ｈ）、４．２２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．０７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．３８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）、２．０７−１．８２（ｍ，２Ｈ）、１．３７（ｓ，９Ｈ）

γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルアミノプテリンＥＣ０４６０の合成：
［化３３］

α−ｔ−ブチル−γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルアミノプテリンＥＣ０４５９（３６ｍｇ）を０．５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ溶液（９７．５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＰＳ）に溶解させた。この反応混合物を１時間攪拌してから（分析的ＨＰＬＣ、１０ｍＨのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７）、及びアセトニトリル）、ジエチルエーテル中で沈殿させた。得られた沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し（３回）、遠心分離によって単離し、真空下で乾燥させて、粗生成物（３０ｍｇ）を得た。この黄色の粉末（γ−２−（ピリジル）ジスルフィド−エチルアミノプテリン）を更なる精製なしに次の工程で利用した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６１０．１、^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６＋Ｄ_２Ｏ）：δ８．８１（ｓ，１Ｈ）、８．４２（ｍ，１Ｈ）、７．７８（ｍ，１Ｈ）、７．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２０（ｍ，１Ｈ）、６．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、４．６０（ｓ，２Ｈ）、４．３６（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．０６（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．３７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．１５−２．０１（ｍ，１Ｈ）、２．００−１．８６（ｍ，１Ｈ）

アミノプテリン−Ｏ−ｔ−ブチル−ヒドラジドピリジルジスルフィド−エタノールカルバゼートＥＣ０４６８の合成：
［化３４］

グルタミン酸のピリジルチオ誘導体ＥＣ０４０１（１０４ｍｇ、１当量）を１ｍＬのドライＤＭＦ中でよく攪拌した溶液に、デス−ｇｌｕ−アミノプテリン（５０ｍｇ、１当量）を加えてから、ＰｙＢｏｐ（９４ｍｇ、１．１当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２４ｍｇ、１．１当量）、及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２２ｍｇ、１．１当量）を加えた。５分攪拌後、トリエチルアミン（６７μＬ、３当量）を加えた。この反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。メトトレキサートのｔ−ブチル−保護ピリジルジチオ誘導体ＥＣ０４６８（６８ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７）、及びアセトニトリル)によって精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝７２４．２、^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＆Ｄ_２Ｏ）δ８．６９（ｓ，１Ｈ）、８．４５（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８６−７．７４（ｍ，２Ｈ）、７．７０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．２４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．４９（ｓ，２Ｈ）、４．２７−４．１８（ｍ，１Ｈ）、３．０８（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．０３−２．９７（ｍ，２Ｈ）、２．２２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．０８−１．８６（ｍ，４Ｈ）、１．３９（ｓ，９Ｈ）

アミノプテリンヒドラジドピリジルジスルフィド−エタノールカルバゼートＥＣ０４６９の合成：
［化３５］

アミノプテリンのｔ−ブチル−保護ピリジルジチオ誘導体ＥＣ０４６８（３３ｍｇ）を０．５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ溶液（９７．５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＰＳ）に溶解させた。この反応混合物を３０分間攪拌してから、ジエチルエーテル中で沈殿させた（分析的ＨＰＬＣ、１０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７）、及びアセトニトリル）。得られた沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し（３回）、遠心分離によって単離し、真空下で乾燥させて、粗生成物（３０ｍｇ）を得た。この黄色の粉末（メトトレキサートヒドラジドピリジルスルフィド−エタノールカルバゼートＥＣ０４６９）を更なる精製なしに次の工程で利用した。ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６６８．２、^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＆Ｄ_２Ｏ）δ８．８２（ｓ，１Ｈ）、８．４４（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．８０（ｍ，２Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．２４（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ）、６．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．６０（ｓ，２Ｈ）、４．３２（ｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．２０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．０７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．２２（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．１５−１．９４（ｍ，２Ｈ）

上記のプロセスは、下記のような本明細書に記載されている追加的なコンジュゲートを調製する目的で、出発材料を適切に選択して適合させてよいものと理解されたい。
［化３６］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１９６４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化３７］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化３８］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化３９］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４０］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４１］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４２］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４３］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４４］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４５］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４６］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４７］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４８］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化４９］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５０］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５１］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５２］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５３］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５４］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５５］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５６］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５７］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５８］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。
［化５９］

式中、ＡはＮ^９−ＣＨ_３−５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、５−ｄ（ｉ）ＰｔｅＧｌｕ、ＩＡＨＱ、ＢＷ１８４３Ｕ８９、２−ＮＨ_２−ＺＤ１６９４、ＺＤ１６９４、ＣＢ３７１７、５−ｄＨ_４ＰｔｅＡＰＢＡ、５−ｄＰｔｅＨＣｙｓＡ、又はＤＤＡＴＨＦである。

酸官能基で終わらない葉酸拮抗薬部分（例えば５−ｄＨ_４ＰｔｅＯｒｎ）から調製したコンジュゲートの場合、コンジュゲートは、介在リンカー基を加えることによって調製してよいものと理解されたい。この介在リンカー基は、葉酸拮抗薬部分と二価リンカー部分に対する共有結合を形成できる官能基を含むように選択する。

方法の実施例
細胞の培養：葉酸を含まないＲＰＭＩ培地（ＦＦＲＰＭＩ）であって、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＨＩＦＣＳ）を含有する培地を用いて、３７℃で、ＣＯ_２５％／空気９５％の加湿雰囲気にて、抗生物質無添加で、細胞を単層として連続的に培養した。ＨＩＦＣＳには内因性葉酸の正常成分を含め、これによって、生理的な適切性の高いこの培地内で細胞が増殖を維持できるようにした（Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ １９９１；８８：５５７２−６）。いずれの細胞実験も、別段の定めのない限り、１０％ＨＩＦＣＳを含有するＦＦＲＰＭＩ（ＦＦＲＰＭＩ／ＨＩＦＣＳ）を増殖培地として用いて行った。

プレートベースの相対的親和性アッセイ：１００マイクロリットルのＦＢＰ溶液（ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬ）をマイクロタイタープレートＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（登録商標）の各ウェルに加えた。プレートを４℃で一晩インキュベートしてから、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する冷やしたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。プレートを室温に平衡化し、１時間、氷上で、０．２％のゼラチンを含有する新たに調製したＰＢＳ−Ｔ１００μＬ／ウェルによってブロックし、続いて、ＰＢＳ−Ｔによって更に３回洗浄した。非標識ＦＡ又はＥＣ１４５が存在しない状態で、及び、濃度を向上させながら非標識ＦＡ又はＥＣ１４５を存在させた状態で、１００ｎＭの^３Ｈ−ＦＡを含有するＰＢＳ溶液（１００μＬ／ウェル）を３連の指定のウェルに加えた。プレートを３７℃にて１時間、静かに振盪させながらインキュベートしてから、ＰＢＳ−Ｔによって３回すすいだ。１００μＬの酸−生理食塩液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって、最大２０で、室温にてウェルから剥がし、３ｍＬのカクテルを含む個々のシンチレーションバイアルに、この酸性サンプルを移した。１００ｎＭの^３Ｈ−ＦＡ溶液（競合物質なし）のみに暴露させたウェルをネガティブコントロールとし、１００ｎＭの^３Ｈ−ＦＡと１ｍＭの非標識ＦＡに暴露させたウェルをポジティブコントロールとし、すべてのサンプルのＤＰＭ値から、後者のサンプルで測定されたＤＰＭ（標識の非特異的結合を表す）を減じた。相対的親和性は、ＫＢ細胞のＦＲに結合している^３Ｈ−ＦＡの５０％を置換するのに必要な化合物の逆モル比として定義し、ＦＡのＦＲに対する相対的親和性を１とした。

細胞ベースの相対的親和性アッセイ：Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １９９５；４８：４５９−７１によって初めて説明された方法を修正したものに基づき、各試験物質の相対的親和性を割り出した。簡潔には、ＦＲ陽性のＫＢ細胞を２４ウェルのＦａｌｃｏｎプレートに播いて、ＦＦＲＰＭＩ／ＨＩＦＣＳにて一晩、接着単層（＞７５％コンフルエント）を形成させた。１０％のＨＩＦＣＳを添加したと共に、非標識ＦＡ又はＥＣ１４５が存在しない状態で、及び、濃度を向上させながら非標識ＦＡ又はＥＣ１４５を存在させた状態で、１００ｎＭの^３Ｈ−ＦＡを含有するＦＦＲＰＭＩによって、使用済みのインキュベーション培地を置き換えた。（下記の図で定められているように）細胞を１時間、氷上で、又は３７℃のインキュベーター内でインキュベートしてから、０．５ｍＬのＰＢＳで３回すすいだ。５００マイクロリットルの１％ドデシル硫酸ナトリウムＰＢＳ溶液を各ウェルに加え、５分後、細胞溶解物を回収し、５ｍＬのシンチレーションカクテルを含有する個々のバイアルに移してから、放射活性を計数した。ＦＦＲＰＭＩ中の^３Ｈ−ＦＡ（競合物質なし）のみに暴露させた細胞をネガティブコントロールとし、^３Ｈ−ＦＡと１ｍＭの非標識葉酸に暴露させた細胞をポジティブコントロールとし、すべてのサンプルのＤＰＭ値から、後者のサンプルで測定されたＤＰＭ（標識の非特異的結合を表す）を減じた。相対的親和性は、上記のように定義した。

相対的親和性アッセイのフォーマット：本明細書に記載されているインビボＲＡアッセイでは、リガンドが、ＦＲに結合する際に、ＦＡと競合する能力を測定する。今日まで、ＦＲ源として、培養細胞が最も広く用いられてきた。しかし、本明細書では、このアッセイに無細胞の固定化ＦＲプレート系を用いることの評価について説明する。この後者の方法では、市販の牛乳の可溶性ＦＢＰを化学的に接着させたマイクロタイタープレートを用いた。上記の細胞ベースの方法と同様に、^３Ｈ−ＦＡは、接着させたＦＲに結合する際に、濃度を向上させた試験物質と直接競合することができる。しかし、細胞ベースの方法とは異なり、結合させた放射性標識は利便的なことに、弱酸性の食塩液ですすぐことによって、プレートから「剥がす」ことができる。いずれのアッセイでも、相対的親和性（ＲＡ）値が１．０であることは、試験物質のリガンドのＦＲに対する親和性がＦＡと等しいことを示す。同様に、１よりも小さい値は、親和性がＦＡよりも小さいことを表し、１よりも大きい値は、親和性がＦＡよりも大きいことを表す。

細胞ベースの方法とプレートベースの方法の両方の機能性は、ＥＣ１４５、微小管脱安定化剤の葉酸コンジュゲート、デアセチルビンブラスチンモノヒドラジド（ＤＡＶＬＢＨ、表１を参照）を用いて直接比較した。低温インキュベーション条件下で評価したところ、実験上、ヒトＦＲ（ＫＢ細胞）場合には、ＦＡのＲＡに対して、ＥＣ１４５のＲＡは０．１９であり、プレートに接着させた牛乳のＦＢＰの場合には、ＥＣ１４５のＲＡは０．１２であることが分かった（図１を参照）。当然ながら、上記の２つのアッセイの結果は似通っていた（因数２未満）。しかし、（ｉ）ＫＢ細胞アッセイは、膜結合性のヒト型のＦＲによる試験を伴い、（ｉｉ）プレートベースのアッセイでは、ウシの可溶性葉酸結合タンパクを使用し、（ｉｉｉ）プレートアッセイは、実行する際のコストが細胞アッセイよりも高く、（ｉｖ）細胞ベースのアッセイは、必要な工程数がプレートアッセイよりも少ないことを考慮して、以降の実験では、細胞ベースのアッセイを用いることを採用した。

温度依存性作用：いくつかの関連するプテロエートの相対的親和性に対するインキュベーション温度の作用を測定した。図２Ａに示されているように、氷上でインキュベートした細胞を用いて試験したところ、実験上では、プテロイン酸（Ｐｔｅ）のＲＡは０．４２であり、すなわち、ＦＡよりも親和性が２．４倍小さいことが明らかになった。他の公開されている報告（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７９；２５４（２２）：１１３１２−８、Ｋａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ １９８６；８３：５９８３−７）では、ＰｔｅのＦＲに対する親和性は極度に低いことが示されているので、この値は驚くほど高かったことになる。これらのデータとこれまでのデータの食い違いの原因を調べた。興味深いことに、このアッセイを３７℃で繰り返したところ、ＰｔｅのＲＡは０．０１まで大きく低下した。すなわち、親和性がＦＡよりも１００倍小さかった。ロイコボリン（ＬＶ、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸又は葉酸とも呼ばれる。図２Ｃ及びＤを参照）でも同様のパターンが示された。追加的な試験によって、これらの発見を確認した（データは図示せず）。興味深いことに、同様の条件下で多くのＦＡ−薬物コンジュゲートを試験したところ、このような温度依存作用は、常に観察されたわけではなかった。実際、図３に示されているように、ＥＣ７２（ＦＡのマイトマイシンＣコンジュゲート）とＥＣ１７（ＦＡのフルオレセインコンジュゲート）の双方のＲＡは、温度とともに向上した。以降の試験は３７℃で行った。

血清依存性作用：上記のすべての実験は、血清の存在しない状態で行った。しかし、血清の存在下で、細胞によって、葉酸、ＦＡ−薬物コンジュゲート、及び更には葉酸拮抗薬の活性を評価するのが常法である。血清がＲＡアッセイに及ぼし得る影響を評価する目的で、培地中の血清の割合が様々である条件下で、^３Ｈ−ＦＡの細胞に対する結合レベルを測定した。図４Ａに示されているように、ウシ胎仔血清が１００％で存在する場合でも、^３Ｈ−ＦＡのＫＢ細胞に対する結合性は、ウシ胎仔血清による影響を受けないことが分かった。同様に、血清の割合を０％から１００％まで高めたところ、非標識ＦＡが、ＫＢ細胞に結合する際に^３Ｈ−ＦＡと競合する能力に対する作用は軽微なものに過ぎず（図４Ｂを参照）、ＦＡに関するＲＡ計算値は、あらゆる試験条件間で１３％しか変わらなかった。興味深いことに、血清が≧１０％の濃度で存在する場合、デアセチルビンブラスチンモノヒドラジドＦＡコンジュゲートＥＣ１４５に関するＲＡ値は、０．４８（±０．０２）でほぼ一定のままであることが分かったが、血清が存在しない状態で評価したところ、ＥＣ１４５では、２．４倍ＲＡが低下したことが、再現性のある形で観察された（図４Ｃを参照）。この後者の発見を確認する目的で、同様の条件下で、関連するビンカアルカロイドコンジュゲートＥＣ１４０（表１の構造を参照）のＲＡを試験した。図４Ｄに示されているように、１０％の血清を加えたところ、ＥＣ１４０のＲＡは、０．１２（血清なし）から０．５０に４倍向上した。注目すべきことに、ＥＣ１４５とＥＣ１４０の双方とも、２時間よりも長いインキュベーション期間の間、９５％の血清中で安定を維持するので（ＨＰＬＣ−ＵＶによる。データは図示せず）、これらのコンジュゲートからの遊離葉酸の分解及び解離は、これらの観察結果に関与していない。血清がＦＡ−薬物のＲＡを向上させるメカニズムは今のところ不明であるが、理論によって束縛されることなく、バルク薬の血清タンパクとの動的相互作用によって、ＦＡ部分のＦＲの結合ポケットへの提示を助けることができる。以降のすべてのＲＡ分析用の標準的な条件では、１０％ウシ胎仔血清を含む試験培地を使用した。

葉酸類似体の相対的親和性：定義したアッセイ条件（ＦＲ源としての接着ＫＢ細胞と１０％血清添加培地を使用することを含む）を採用して、一連の葉酸類似体が、結合の際に^３Ｈ−ＦＡと競合する能力について評価した。表１に示されているように、ＦＡのＧｌｕ残基を除去してＰｔｅを生成させたところ、ＲＡが９１倍低下した（図２Ｂを参照）。このような結果は、他の文献の報告と整合している。Ｐｔｅからｐ−アミノベンゾイル部分を更に除去すると、評価したいずれの濃度においても、プテリン−６−カルボン酸が、^３Ｈ−ＦＡのＫＢ細胞に対する結合を遮断できなくなるので、競合結合能が完全に無くなることが分かった。最も一般的な天然の血清由来葉酸である５−メチルテトラヒドロ葉酸（Ａｎｔｏｎｙ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ １９８５；２６０（２８）：１４９１１−７）のＦＲに対する親和性は１４倍小さく、その同等体５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（ロイコボリン）のＦＲに対する親和性は１２５倍小さいことが分かった。同様に、よく使われる葉酸拮抗薬のメトトレキサート（ＭＴＸ）の親和性は５０倍小さかった。ＣＢ３７１７のＲＡ値は、ＦＡのＲＡ値と同じであることが分かった。対照的に、デス−グルタミル類似体のＲＡ値は、＞３００倍低かった（表１を参照）。総合的にこれらのデータによって、プテロエートのｐ−アミノベンゾイル（又はアリール）基と近接した位置にあるグルタミル部分、又は少なくとも親水性部分が、ＦＲに対する高い結合親和性に寄与していることが示されている。最後に、リボフラビン結合性タンパクとＦＲが約２７％の相同性を有することが報告されている。本明細書に記載されているアッセイによって測定した場合、リボフラビンのＫＢ由来ＦＲに対するＲＡは非常に低い。表１に示されているように、３００倍モルのこのビタミンでさえも、ＫＢ細胞に対する^３Ｈ−ＦＡの結合性と競合できなかった。

薬物の相対的結合親和性に対する影響：放射線画像診断、化学療法、免疫療法、及び炎症での用途に有用である薬物のＦＡコンジュゲートの作製について（３つの臨床候補を含め、これらのコンジュゲートのいくつかのＲＡ値など）、上で報告してきた。しかし、これらの報告のアッセイ条件は標準化されていなかった。本明細書では、表２に、上で報告したコンジュケートの一部と、すべて標準的な条件（すなわち、ＦＲ源としての接着ＫＢ細胞と３７℃の１０％血清添加培地の使用）下で試験した多くの新たなコンジュケートのＲＡ値を記載する。これらのコンジュゲート内の薬物は、金属キレートペプチドから強力な化学療法薬まで多種多様である。しかし、大半において、どのＲＡ値も因数約２以内に収まる。理論によって束縛されることなく、このことによって、コンジュゲートのＦＡ部分と薬物部分との間に配置されている柔軟な分子スペーサーによって一般的に、ＦＡ部分のＦＲに対する効率的な結合が可能になることが示されていると考えられる。スペーサーが短いほど、デアセチルビンブラスチンモノヒドラジドコンジュゲートＥＣ２１６のＲＡ値が（表２のＥＣ１４５と比べて）低下することが分かっている。しかし、最近作られたステロイドコンジュゲートの結合親和性が２０倍小さいことが分かっているので（ＥＣ０３８４、表２）、スペーサーが、コンジュゲートのＲＡに作用することができる唯一の決定要因ではないことは明らかである。

移植したＫＢ腫瘍に対する作用：マウスにヒトＫＢ腫瘍細胞異種移植片を皮下注射した。２週間のスケジュールで週に３回、短期投与した後、マウスの腫瘍は無くなったようであった（図５）。１１０日間の実験全体を通じて、腫瘍は再増殖しなかった。コンジュゲートの活性には、いずれの体重減少も伴わなず（図６）、同時に注射した過剰の葉酸（ＦＲを標的とする特異性の指標）と競合可能であった。

低めの温度で結合親和性アッセイを行うことは、親和性の低いリガンドの競合性を増加させる傾向があるのは明らかである。したがって、相対的な結合親和性を評価するためには、高めの温度を用いると、得られる条件の識別性が高めることができるので、その方が良い場合のあることが分かる。

また、試験培地中に血清が存在することは、ＦＡ−薬物コンジュゲートのＲＡにとっては重要であるが、ＦＡ自体にとっては重要でないことが証明されたことは明らかである。例えば、いずれのビンカコンジュゲート（ＥＣ１４５、ＥＣ１４０）のＲＡ値も、血清の存在下で、劇的に向上することが示された（それぞれ２．４倍、４．１倍）。いずれの薬剤も後から、９５％の血清中でさえも、２時間を超える間、安定したままであることが分かったので、これらの結果は、コンジュゲートからのＦＡの分解又は解離によって説明することはできなかった。とはいえ、３７℃の１０％血清添加培地中に、濃度を向上させながら競合物質を存在させた状態で、１００ｎＭの^３Ｈ−ＦＡに暴露させたＦＲ陽性の接着ＫＢ細胞の使用を含む標準化プロトコールを用いて、多種多様な葉酸類似体とＦＡ−薬物コンジュゲートをスクリーニングし、比較目的で、それらのＲＡ値を割り出した（表１及び２を参照）。

更に、葉酸類似体の中で、Ｐｔｅ基の近くに荷電部分を有することの重要性が観察されたのは興味深いことであったことは明らかである。例えば、Ｇｌｕ残基がそれぞれＰｔｅ及びＮ^１０−プロパルギル５，８−ジデアザプテロイン酸に結合していると、ＲＡ値が９０〜＞３００倍向上した。注目すべきことに、Ｇｌｕ残基はこの位置で結合していることが最も多いが、結合親和性を大きく損なうことなく、Ｇｌｕを他のアミノ酸に置換できることが知れられている（Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １９９９；７（３）：１５７−６９、ＭｃＡｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１；３０：５６７４−８１、Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１；３２：３２８）。調査した一連のＦＡ−薬物コンジュゲートでは、それぞれ異なる薬物の間に大きな構造的違いが存在するにもかかわらず、ＲＡ値が約２の因数以内のままであったことが分かった。しかし、２つの例外が明らかになった。第１の例外では、ＥＣ１４５のペプチドベースのスペーサーをγＧｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＣｙｓからγＧｌｕ−Ｃｙｓ残基のみ（ＥＣ２１６における残基）にまで短くすると、ＲＡが１０倍低下することが示された。スペーサー領域内の荷電基の多くを削除すると、コンジュゲートの水溶性特性が損なわれる場合があることは明らかであるが、ＥＣ２１６は、アッセイ期間全体を通じて、（３０μＭにおいてでさえも）溶解したままであることが観察された。したがって、理論によって束縛されることなく、ＥＣ２１６で観察されるＲＡ値が低めなのは、薬物（ＤＡＶＬＢＨ）がＰｔｅ単位に近接することに起因する立体的干渉によるものであると考えられる。

明らかになったもう一方の例外は、脂肪親和性ステロイドが葉酸に連結していたときに、ＲＡ値が２０倍低くなることであった（ＥＣ０３８４、表２を参照）。ＥＣ０３８４は、＞９６％の値を有する血清タンパクを結合させることが分かった。葉酸コンジュゲートの大半は、８０％未満の値を有する血清タンパクを結合させる（非公表の９３３１観察）。理論によって束縛されることなく、この要因によって、部分的に、低いＲＡが観察されることを説明できると考えられる。

Claims (20)

1. 式ＡＬＤｍ（式中、Ａは葉酸拮抗薬であり、Ｌは、少なくとも１つの解離可能なリンカーを含むリンカーであり、ｍは１〜約３であり、各Ｄは、独立して選択した薬物である）のコンジュゲートであって、前記葉酸拮抗薬の式が：
   

   

   であることを特徴とするコンジュゲート。
2. ｍが１又は２であることを特徴とする、請求項１に記載のコンジュゲート。
3. ｍが１であることを特徴とする、請求項１に記載のコンジュゲート。
4. 前記リンカーが更に、ジスルフィドではない解離可能なリンカーを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１に記載のコンジュゲート。
5. 前記リンカーが更に、少なくとも２つの解離可能なリンカーを含むことを特徴とする、請求項１に記載のコンジュゲート。
6. 前記少なくとも１つの解離可能なリンカーがジスルフィドではないことを特徴とする、請求項５に記載のコンジュゲート。
7. 少なくとも１つのＤがビンカアルカロイド、チューブリシン、マイトマイシン、及びエポチロンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のコンジュゲート。
8. 請求項１に記載のコンジュゲートと、１以上の担体、賦形剤、及び希釈剤、又はこれらの組み合わせとを含むことを特徴とする医薬組成物。
9. 患者における病原性細胞の集団の治療用の薬剤の製造のための、有効量の請求項１に記載のコンジュゲート、又は１以上の担体、賦形剤、及び希釈剤、又はこれらの組み合わせを含む請求項１に記載のコンジュゲートの組成物の使用であって、前記病原性細胞が葉酸受容体を独自に発現するか、優先的に発現するか、あるいは過剰発現することを特徴とする使用。
10. 前記病原性細胞が癌細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
11. 式ＡＬＤｍ（Ａは葉酸拮抗薬であり、Ｌは、少なくとも１つの解離可能なリンカーを含むリンカーであり、ｍは１〜約３であり、各Ｄは、独立して選択した薬物である）のコンジュゲートであって、前記葉酸拮抗薬の式が：
    

    

    であり、
    ここで、前記葉酸拮抗薬が、約２０℃又はそれ以上の温度において、葉酸に比較して葉酸受容体に対して約０．５又はそれ以上の相対的親和力がある化合物である、
    ことを特徴とするコンジュゲート。
12. ｍが１又は２であることを特徴とする、請求項１１に記載のコンジュゲート。
13. ｍが１であることを特徴とする、請求項１１に記載のコンジュゲート。
14. 前記リンカーが更に、ジスルフィドではない解離可能なリンカーを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１１に記載のコンジュゲート。
15. 前記リンカーが更に、少なくとも２つの解離可能なリンカーを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のコンジュゲート。
16. 前記少なくとも１つの解離可能なリンカーがジスルフィドではないことを特徴とする、請求項１５に記載のコンジュゲート。
17. 少なくとも１つのＤがビンカアルカロイド、チューブリシン、マイトマイシン、及びエポチロンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のコンジュゲート。
18. 請求項１１に記載のコンジュゲートと、１以上の担体、賦形剤、及び希釈剤、又はこれらの組み合わせとを含むことを特徴とする医薬組成物。
19. 患者における病原性細胞の集団の治療用の薬剤の製造のための、有効量の請求項１に記載のコンジュゲート、又は１以上の担体、賦形剤、及び希釈剤、又はこれらの組み合わせを含む請求項１に記載のコンジュゲートの組成物の使用であって、前記病原性細胞が葉酸受容体を独自に発現するか、優先的に発現するか、あるいは過剰発現することを特徴とする使用。
20. 前記病原性細胞が癌細胞であることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。

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