CZ309738B6 - Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo - Google Patents

Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo Download PDF

Info

Publication number
CZ309738B6
CZ309738B6 CZ2019-572A CZ2019572A CZ309738B6 CZ 309738 B6 CZ309738 B6 CZ 309738B6 CZ 2019572 A CZ2019572 A CZ 2019572A CZ 309738 B6 CZ309738 B6 CZ 309738B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
group
glycopolymer
substituted
polymer
mol
Prior art date
Application number
CZ2019-572A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2019572A3 (cs
Inventor
Pavla Bojarová
Bojarová Pavla RNDr., Ph.D.
Tomáš Vašíček
Tomáš Mgr. Vašíček
Petr Chytil
Chytil Petr Mgr., Ph.D.
Marcela Filipová
Marcela Mgr. Filipová
Olga Janoušková
Janoušková Olga Mgr., Ph.D.
Tomáš Etrych
DSc. Etrych Tomáš RNDr.
M.R. Tavares
Original Assignee
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i. filed Critical Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2019-572A priority Critical patent/CZ309738B6/cs
Priority to PCT/CZ2020/050067 priority patent/WO2021047699A1/en
Publication of CZ2019572A3 publication Critical patent/CZ2019572A3/cs
Publication of CZ309738B6 publication Critical patent/CZ309738B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A61K31/78—Polymers containing oxygen of acrylic acid or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F22/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a carboxyl radical and containing at least one other carboxyl radical in the molecule; Salts, anhydrides, esters, amides, imides or nitriles thereof
    • C08F22/36—Amides or imides
    • C08F22/38—Amides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Glykopolymer sestávající z HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 % mol. strukturních jednotek vzorce I a popřípadě koncových skupin o vzorci –S-sukcinimid-(CH2)r-Linker-Substituovaný sacharid nebo –C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylen)-Linker-Substituovaný sacharid, a jeho použití pro léčbu pevných nádorů, lymfomu nebo leukemie.

Description

Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
Oblast techniky
Vynález se týká multivalentních vodorozpustných nebo micelárních polymerů, tj. homopolymerů i kopolymerů, se sacharidovými strukturami obsahujícími terminální monosacharid v galaktokonfiguraci, které jsou účinné jako inhibitory galektinů. Tyto glykopolymery lze využít jako léčiva pro terapii a prevenci rakovinných onemocnění spojených s nadprodukcí galektinů, zvláště lidského galektinu-3 (Gal-3).
Dosavadní stav techniky
V poslední době se vývoj léčiv v protinádorové terapii posouvá od klasických nízkomolekulárních léčiv k hledání nových léčiv nebo lékových forem umožňujících cílené působení aktivní látky především v místě, kde je terapeutický účinek třeba. V současnosti vstupují do klinického využití jako léčiva monoklonální protilátky, které jsou poměrně účinné u různých typů malignit, ovšem často je jejich použití spojené s poměrně silnými toxickými účinky pro pacienta. Vedle protilátek se cíleně působící formy léčiva dají využít především u takových látek, jejichž vedlejší účinky mohou vést až k poškození zdravých částí organizmu. Využití polymerních nosičů, především vodorozpustných nebo micelárních polymerů, pro cílenou dopravu léčiv je jednou z významných možností řešení zmíněného problému. Vysoká molární hmotnost polymeru s aktivní složkou zabraňuje rychlému vyloučení z organizmu glomerulární filtrací. Tím se významně prodlužuje doba cirkulace v krvi i celkové setrvání v organizmu vedoucí ke zvýšení biologické využitelnosti systému. Kromě toho vysoká molární hmotnost polymerního systému vede ke zvýšené akumulaci v pevných nádorech díky EPR (enhanced permeability and retention) efektu.
Tohoto efektu lze využít v případě navázání léčiva na makromolekulární nosič pro jeho cílenou akumulaci v nádoru. V minulosti byla vyvinuta celá řada systémů, které jsou založeny na využití EPR efektu pro cílení léčiv, např. polymerní micely, liposomy, nanočástice, nanokapsle nebo vodorozpustné polymerní konjugáty. Polymerní micely jsou na rozdíl od rozpustných polymerních systémů obvykle připravovány samouspořádáním amfifilních diblokových kopolymerů do vysokomolekulárních micelárních útvarů tvořících koloidní roztoky. Mezi vodorozpustnými systémy tvoří jednu z nejvýznamnějších skupin polymerní systémy připravené na bázi polymerů obsahujících jednotky N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA polymery). Jediný a hlavní nedostatek omezující využití HPMA polymerů jako nosičů léčiv v humánní medicíně je jejich neštěpitelný uhlíkový řetězec a s tím spojené omezení molárních hmotností použitelných pro přípravu polymerního nosiče na molární hmotnosti menší než 50 000 až 60 000 g/mol (pod vylučovací mezí organizmu). Bohužel, polymery nad touto mezí nejsou efektivně a dostatečně účinně z těla vylučovány, a tudíž jejich použití jako léčiva by vedlo k nežádoucí akumulaci polymeru v organizmu. Navýšení molární hmotnosti HPMA polymerů, a tedy prodloužení jejich cirkulace v organizmu, je možné vmezeřením biodegradovatelných spojek mezi jednotlivé bloky HPMA kopolymerů. Vhodné jsou zvláště spojky enzymově, hydrolyticky nebo reduktivně štěpitelné. Struktury vzniklé spojením bloků k sobě se nazývají multiblokové, roubované nebo hvězdicovité. Variantou může být též příprava amfifilního HPMA polymeru, který se do nadmolekulární micelární struktury sám složí a po poklesu koncentrace pod kritickou micelární koncentraci se sám rozpadne na krátké kopolymery vyloučitelné z organizmu.
Nedávno bylo popsáno, že HPMA polymer může sloužit jako nosič několika scFv řetězců antiCD20 a díky své multivalenci může způsobovat apoptózu CD20 pozitivních buněk (Kopeček J. Adv. Drug Delivery Rev. 2013, 65, 49-59). Tento koncept byl popsán jako „drug-free therapeutics“ (terapeutika bez léčiv) a v USA nyní probíhají jeho zkoušky. Základem pro účinnost tohoto systému je multivalence polymeru daná již samotnou strukturou použitého polymeru.
- 1 CZ 309738 B6
Galektin-3 (Gal-3) je lektin patřící do rodiny galektinů - proteinů vážících glykany s terminálním β-galaktosidem. V současné době je tomuto galektinu věnována značná pozornost s ohledem na jeho významný vliv na procesy ovlivňující nádorové bujení, jako je vznik metastáz, překonání imunitní odpovědi organizmu, mRNA splicing, genová exprese, apoptóza a vznik zánětu. Gal-3 je exprimován řadou nádorových tkání a buněk, a to jak intracelulárně, tak extracelulárně, kdy je jednak asociován s glykostrukturami na povrchu buněk, jednak je uvolňován do mezibuněčného prostředí. Zvýšená exprese Gal-3 v nádorových tkáních (Thijssen V. L. et al. Biochim. Biophys. Acta 2015, 1855, 235-247) vede k zhoršené prognóze vývoje onemocnění a zvýšenému riziku vzniku metastáz. Dále byla prokázána klíčová role extracelulárního Gal-3 produkovaného do nádorového mikroprostředí při potlačení imunitní odpovědi T buněk proti nádorovým buňkám a snížení funkce NK buněk, což následně vede k rozšíření nádorového bujení a vzniku metastáz. Bylo prokázáno, že inhibice extracelulárního Gal-3 vede k ochraně T buněk imunitního systému proti apoptóze vyvolané Gal-3.
Gal-3 produkovaný nádorovými buňkami může být lokalizován především v jádře, v cytoplazmě a na membráně. Extracelulární Gal-3 je produkován do mikroprostředí nádoru a rovněž krví do celého těla. Zvýšená přítomnost Gal-3 je v přímé korelaci s horší prognózou vývoje nádorového onemocnění, např. v případě nádorů štítné žlázy, některých nádorů tlustého střeva, hlavy a krku nebo nádorů mozku. Jedním z důvodů může být vliv volného Gal-3 na apoptózu protinádorových T lymfocytů. Gal-3 může díky své zvýšené expresi v nádorové tkáni sloužit jako terapeutický marker a současně terapeutický cíl. Také jeho přítomnost v krevním řečišti či mikronádorovém prostředí může být sledována s ohledem na vývoj nádorového onemocnění ; ovlivnění hladiny volného Gal-3 může ovlivnit efektivitu protinádorové imunitní odpovědi (Sano H. et al. J. Immunol. 2000, 165 (4), 2156-2164, Guha P. PNAS 2013, 110 (13), 5052-5057).
V posledních letech byly intenzivně studovány různé modifikace základních sacharidových ligandů galektinů - galaktosy, laktosy (Gale4Glc) nebo N-acetyllaktosaminu (Gale4GlcNAc) - a vliv těchto modifikací na afinitu připravených glykomimetik k jednotlivým galektinům, zvláště pak biomedicínsky nejvíce studovaným galektinu-1 a -3. Vnesení aromatické skupiny na C-3 mateřského galaktosového zbytku bylo demonstrováno jako nejvýhodnější pro zvýšení afinity ke galektinům. Strukturní analogy N-acetyllaktosaminu a thiodigalaktosidů (TDG; Gale1-1eGal) se vyprofilovaly v rozsáhlou skupinu účinných glykomimetických inhibitorů galektinů odolných vůči enzymové degradaci in vivo, což je důležitým faktorem pro budoucí klinickou aplikaci. Byla popsána i multivalentní prezentace těchto glykomimetik na hovězím sérovém albuminu jako nosiči.
Kromě již uvedených sloučenin byla v literatuře popsána řada dalších sacharidů jako ligandů galektinů. Jedná se zvláště o struktury na bázi poly-N-acetyllaktosaminu. Tyto komplexní oligosacharidové struktury a další, jednodušší sacharidy na bázi laktosy, galaktosy či Nacetyllaktosaminu bez zmíněných substitucí byly též v minulosti vystaveny v multivalentní prezentaci na řadě nosičů, jako např. na peptidech, polymerech, oligonukleotidech, fullerenech a kalixarenech, i na dendrimerech a nanočásticích. Multivalentní prezentace často výrazně zvýšila nízkou afinitu monovalentního sacharidu. I když byly v některých případech demonstrovány vysoké afinity ke galektinům metodou ELISA, jednalo se vždy pouze o modelový systém, který nelze použít pro in vivo aplikace. Žádný z dosud připravených multivalentních nosičů nenabízí unikátní kombinaci vlastností glykopolymerů podle předkládaného vynálezu (konkrétně dobrou definovatelnost a reprodukovatelnost přípravy, biokompatibilitu, stabilitu in vivo a výhodnou farmakokinetiku).
HPMA polymery nesoucí protirakovinné léčivo doxorubicin a kovalentně navázané jednoduché mono- a disacharidy (laktosa, galaktosa, galaktosamin) byly v minulosti studovány (David A. Pharmaceut. Res. 2002, 19, 1114-1122; David A. et al. Eur. J. Cancer 2004, 40, 148-157) pro možnost aktivního cílení do buněk vybraných rakovinných linií, z nichž některé exprimovaly Gal3. V popsaných případech nebylo uvažováno o účinku konjugátů na inhibici Gal-3 a korelace získaných výsledků s expresí Gal-3 na buňkách nebyla průkazná. V publikaci autorů tohoto
- 2 CZ 309738 B6 vynálezu (Bojarová P. et al. J. Nanobiotechnol. 2018, 16, 73) byla syntetizována série HPMA konjugátů s jednoduchým disacharidem LacdiNAc a demonstrován jejich inhibiční účinek (IC50 v řádu μM) na Gal-3 ve stanovení ELISA. Předkládaný vynález si klade za cíl poskytnout glykopolymery se zlepšeným inhibičním účinkem na Gal-3, a při tom mající vhodné vlastnosti pro přípravu a aplikaci, které jsou nezbytnými podmínkami pro možnost praktického využití.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je struktura, syntéza a použití nového polymerního léčiva s dobře kontrolovatelným obsahem navázaných substituovaných sacharidů. Obsah navázaných substituovaných sacharidů se reguluje množstvím přidané sacharidové složky k polymernímu nosiči, protože je mu úměrný. Nové léčivo jeví prodlouženou farmakokinetiku a zvýšenou akumulaci v nádoru díky obsahu polymerní složky, a zároveň silnou inhibici galektinů.
Glykopolymery nesoucí substituované sacharidy podle tohoto vynálezu mají nejen vyšší afinitu ke Gal-3 ve vazebných testech typu ELISA, než je tomu u glykopolymerů známých ze stavu techniky, ale především mají prokazatelně silnější účinek v biologických testech, jak je doloženo ve srovnávacím příkladu 26. Oproti nejbližšímu stavu techniky jsou tak jednoznačně účinnější na inhibici Gal-3, která má přímý dopad na protinádorovou imunitní odpověď a migraci nádorových buněk.
Na rozdíl od všech dříve připravených systémů jsou glykopolymery podle vynálezu jediným prostředkem s inhibičním účinkem vůči Gal-3, který lze použít in vivo pro terapii nádorového bujení, a to díky odpovídající farmakokinetice zajištěné polymerní složkou, biokompatibilitě, in vivo stabilitě, a dobré reprodukovatelnosti přípravy. V rámci tohoto vynálezu byl prokázán silný účinek připravených glykopolymerů nejen na potlačení indukce apoptózy u buněk imunitního systému, ale též dosud nedemonstrovaný účinek na potlačení migrace nádorových buněk. Oba tyto účinky mají přímý dopad na léčbu nádorů a potlačení metastatického procesu.
Jedním z důležitých znaků systému podle předkládaného vynálezu jsou polymerní řetězce tvořené inertním, nenabitým, s organizmem neinteragujícím vodorozpustným polymerem na bázi HPMA, který je využit jako multivalentní nosič pro navázání substituovaných sacharidů s cílem dosáhnout zvýšené interakce s lektiny, a též zlepšené farmakokinetiky nesených substituovaných sacharidů. V kombinaci se specifickými substituovanými sacharidy se pak dosahuje zde popsaných účinků.
Struktura glykopolymeru podle vynálezu vychází z polymerních nosičů na bázi HPMA polymerů, na které jsou kovalentně navázány substituované sacharidy, jejichž interakce s galektiny má díky polymernímu nosiči multivalentní charakter a dochází k aviditě při vazbě na zmíněné galektiny. Popsaná silná interakce s galektiny vede k samotnému biologickému účinku, který spočívá v několika bodech, a to v protektivním efektu na buňky imunitního systému proti apoptóze indukované Gal-3, dále v inhibici migrace nádorových buněk a s tím spojené inhibici metastatického rozsevu.
Pod pojmem „léčivo“ se zde rozumí látka přímo mající léčebné účinky, nebo adjuvans, nebo imunomodulant.
Termínem „polymer“ jsou zde zahrnuty kopolymery i homopolymery. Zejména termínem „HPMA polymer“ je zahrnut jako HPMA kopolymer, tak HPMA homopolymer.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy glykopolymer obsahující polymerní nosič na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 % mol.
- strukturních jednotek vzorce I:
- 3 CZ 309738 B6
(I) kde
Y 1 je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)P-, kde p = 1 až5, a qarjsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y1 může být, popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé; Y1 je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující -CH2-CH2- a -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-;
Y 2 je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;
Linker je vybrán ze skupiny zahrnující 1,2,3-triazolylen, (C1-C6 alkyl)-l,2,3-triazolylen; NH-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-; -NH-C(=S)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-; nebo k substituentu Y2 prostřednictvím skupiny -C(=O)- nebo jen kovalentní vazbou vázaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, přičemž tento cyklooktynyl či azacyklooktynyl je dále konjugovaný s triazolylem, (například tvořený 3,4,5,13tetrazatetracyklo[13.4.0.02,6.07,12]nonadeka-l(15),2(6),3,7(12),8,10,16,18-oktaen-13karbaldehydovým motivem);
Subst. sacharid je substituent odvozený od substituovaného sacharidu obecného vzorce III popsaného zde níže reakcí terminální aminové, azidové, alkynylové, aminoethylureidylové nebo aminoethylthioureidylové skupiny, přičemž skupiny vzniklé reakcí uvedených terminálních skupin jsou součástí Linkeru;
a/nebo
- koncových skupin řetězce HPMA polymeru majících vzorec -S-sukcinimid-(CH2)r-LinkerSubst sacharid nebo -C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylen)-Linker-Subst sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Subst. sacharid jsou definovány výše.
Přirozenými aminokyselinami jsou zde míněny přirozeně se vyskytující kyseliny: histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny.
Glykopolymer může kromě poly(HPMA) řetězců obsahovat také větvící jednotky, například amidoaminové jednotky vhodné pro přípravu dendrimerních (hvězdicovitých) polymerních jader poly(amidoaminu) (PAMAM), nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové jednotky vhodné pro tvorbu dendrimerních jader. Například může glykopolymer hvězdicové struktury obsahovat jádro z PAMAM a postranní řetězce z poly(HPMA), obsahující výše uvedené koncové skupiny a/nebo monomerní jednotky vzorce I.
-4CZ 309738 B6
Postup přípravy glykopolymerů podle předkládaného vynálezu obsahuje následující kroky:
a) poskytnutí monomerů polymerního nosiče, a případně větvících jednotek,
b) polymeraci monomerů polymerního nosiče,
c) volitelný krok polymer-analogických reakcí,
d) navázání substituovaného sacharidu.
Krok poskytnutí monomerů zahrnuje poskytnutí TV-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) a poskytnutí methakryloyl(aminoacyl) esterů, a popřípadě větvících jednotek. HPMA je komerčně dostupný a jeho syntéza je publikována (např. Chytil P. et al. Eur. J. Pharm. Sci. 2010, 41 (3-4), 472-482). Komerčně dostupné monomery jsou dále například V-aminoethylmethakrylamid, Naminopropylmethakrylamid, nebo jejich /Boc chráněné analogy.
Syntézu dalších fůnkcionalizovaných monomerů odvozených od HPMA lze popsat následovně. Funkcionalizované monomery, methakroylované sloučeniny, lze popsat obecným vzorcem II
kde
Y 1 je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)P-, kde p = 1 až5, a qarjsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y1 může být, popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;
Y 2 je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;
Y 3 je vybrán ze skupiny zahrnující primární amin (NH2), /Boc substituovaný amin, azid, terminální alkynyl mající 2 až 8 atomů uhlíku, fenyl substituovaný alespoň jedním azidem nebo C2-C4 alkynylem; a cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, jako je například (1 l,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl) nebo (17^,8^,9^)bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9-yl;, přičemž tento substituovaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl je vázán přes karbonylovou skupinu; -karbonyl-thiazolin-2-thionovou skupinu (TT), karbonyl-4-nitrofenoxy skupinu, -karbonyl-2,3,4,5,6-pentafluorfenoxy skupinu, -karbonylsukcinimidylovou skupinu, a COOH skupinu; přičemž karbonyl je -C(=O)- skupina.
Větvící jednotky jsou obvykle komerčně dostupné, v některých případech jsou komerčně dostupná i větvená či hvězdicovitá jádra pro dendrimerní polymery.
Dalším krokem postupu podle vynálezu je krok b), tj. krok syntézy polymerních nosičů polymeraci monomerů, popřípadě s větvícími jednotkami. Polymerní nosič obvykle obsahuje statistický polymer obsahující od 0,5 do 25 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce II a/nebo
- 5 CZ 309738 B6 koncových jednotek hlavního polymerního řetězce popsaných výše, a alespoň 75 % mol. (75 až 99,5 % mol.) jiných jednotek, což zahrnuje monomerní jednotky odvozené od HPMA a popřípadě i větvící jednotky. Polymerizace typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tercbutylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující 2-kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2-kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2kyano-2-propylethyltrithiokarbonát a 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu. Molární hmotnost MQ takto připravených polymerů je v rozmezí od 4000 do 100 000 g/mol, s výhodou 20 000 až 50 000 g/mol.
Volitelně může být zahrnut i krok odstranění koncových skupin obsahujících síru z polymerů, při jejichž přípravě bylo použito přenosové činidlo, ve kterém jsou tyto polymery reagovány s přebytkem azoiniciátoru ze skupiny iniciátorů polymerace popsaných výše. Polymerní nosič je pak zakončen zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru. Reakce typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C, a v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid.
Volitelným krokem c) je zavedení azidové či alkylové skupiny (i) reakcí Y3 skupiny na polymeru, pokud ta je odstupující skupinou (tj. je vybraná z thiazolin-2-thionové skupiny (TT), 4-nitrofenoxy skupiny, 2,3,4,5,6-pentafluorfenoxy skupiny, sukcinimidylové skupiny, a OH skupiny), s aminosloučeninou (např. amino(C 1-C8 alkanem)) zakončenou skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 terminálním alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 3-amino-1-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)yl)propan-1 -onem, či N-[(1R ,8 S,9 s )-bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxykarbonyl]-1,8diamino-3,6-dioxaoctanem; nebo (ii) reakcí Y3 skupiny na polymeru, pokud ta je primární aminoskupinou, s karboxy(C1-C8 alkanem) zakončeným skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 6-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanovou kyselinou, či jejím N-hydroxysukcinimidyl esterem a (1R,8S,9s)-bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9ylmethyl N-sukcinimidyl karbonátem, nebo funkčními deriváty tohoto karboxyalkanu obsahujícími dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou. Tyto polymer-analogické reakce typicky probíhají při pokojové teplotě v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol.
Jedno výhodné provedení polymerního nosiče je takové, že volitelně může dále obsahovat 0,5 až 12 % mol. dalších strukturních jednotek odvozených od obecného vzorce II, kde Y1 a Y2 jsou jak je definováno výše, ale Y3 je vybrán ze skupiny tvořené karbonyl-hydrazono-(C12-C18 alkanonem), karbonyl-hydrazono-5a-cholestanonem, karbonyl-hydrazono-cholest-4-en-3-onem, případně jiným substituentem odvozeným od ketoderivátů cholesterolu; nebo je vybrán ze skupiny tvořené karbonyl-(C9-C15 alkoxy), karbonyl-cholesterylu, nebo jiných sloučenin odvozených od cholesterolu, např. 7-dehydrocholesterolu, či vitamínu D; nebo je vybrán ze skupiny tvořené karboxamido-(C10-C18 alkylem) a karbohydrazido-(C10-C18 alkylem), nebo karboxamido-(C10C18 alkenylem) a karbohydrazido-(C10-C18 alkenylem), obsahujícím aspoň jednu dvojnou vazbu (C=C), s výhodou odvozené od kyseliny olejové, linolové, linoleové.
Polymerní nosič může obecně mít lineární, větvenou, nebo síťovanou strukturu.
V případě lineární struktury se obvykle jedná o polymerní nosič obsahující 0,5 až 25 % mol. monomerních jednotek vzorce II a/nebo koncových jednotek popsaných výše, a alespoň 75 % mol. HPMA monomerních jednotek.
- 6 CZ 309738 B6
V případě větvené nebo síťované struktury je obsaženo alespoň 75 % mol. HPMA monomerních jednotek a větvících jednotek.
V některých provedeních polymerního nosiče větvené struktury je jen část funkčních skupin vhodných pro vazbu substituovaných sacharidů rozmístěna podél polymerního řetězce, nebo dokonce nejsou monomery vzorce II obsaženy vůbec. Funkční skupiny vhodné pro vazbu substituovaných sacharidů, nebo alespoň jejich část, mohou mít formu koncových skupin umístěných na jednom konci polymerního řetězce HPMA polymeru, přičemž druhý konec polymerního řetězce je navázaný k multivalentní molekule, např. dendrimeru, např. PAMAM dendrimernímu jádru nebo k jádru na bázi 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru. Prvním krokem přípravy jev takových provedeních polymerizace HPMA, která typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, terc-buty 1alkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory AIBN, ACVA, V70, za přítomnosti přenosového činidla obsahujícího karboxylovou skupinu nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou; přenosové činidlo je s výhodou vybrané ze skupiny obsahující 4kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu, 1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3-yl)butyl dithiobenzoát, 2-kyano-5-oxo-5-(2-thioxo-1,3-thiazolidin-3yl)pentan-2-yl ethylkarbontrithioát V druhém kroku jsou polymery navázány amidovou vazbou k multivalentní sloučenině nesoucí koncové primární aminoskupiny, s výhodou tvořené poly(amidoaminovým) (PAMAM), nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionovým dendrimerem, přičemž reakce typicky probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Dendrimer může tvořit až 3 % mol. obsahu výsledného polymerního konjugátu. Následně jsou in situ zablokovány zbývající primární aminoskupiny nízkomolekulární aminoreaktivní sloučeninou, s výhodou acetanhydridem. Ve třetím kroku jsou síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru buď redukovány borohydridem sodným a in situ dojde k adici SH skupin na V-derivovaný maleimid, s výhodou propynylmaleimid či azido-PEG3-maleimid, přičemž reakce probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Popřípadě jsou síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru reagovány s přebytkem azoiniciátoru nesoucím karboxylovou skupinu, nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou, a to při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid. Molární hmotnost Mn takto připravených polymerů je v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, s výhodou 100 000 až 400 000 g/mol.
Finálním krokem d) přípravy je vazba substituovaného sacharidu vybraného ze skupiny sestávající ze substituovaných sacharidů obecného vzorce III:
HO^-OR5
R1-X-Y-Z
U-V-W-R4
R2 (III), kde kombinace U, V a W je vybrána z následujících možností lila, Illb, lile, Illd, lile:
-7 CZ 309738 B6
ZOH r (Illa),
Illa: kde V a W je jen vazba, a kde U je 1 -ί/ζζο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R4, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R1 a na atomu C-6 skupinou -OR6;
(Illb)
Illb: kde V a W je jen vazba a kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4;
(lile) lile: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4;
Illd: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4;
(Me) lile: kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3v a na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3w a na atomu C-1 skupinou R4;
a kde
-8CZ 309738 B6
R1 je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou C1-C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C2-C5 alkynylem, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 azidoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou azidoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(C1C5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou aminoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 aminoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, sulfoskupinu, kumaryl, benzoyl a C2-C5 alkynyl;
X je [1,2,3]-triazol nebo vazba,
Y je CH2 nebo vazba,
Z je O nebo [1,2,3]-triazol.
R2, R3u, R3v, R3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1- O-α-L-fukosyl,
R4 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, aminoskupinu, C2-C5 alkynyloxyskupinu, azid, C1-C5 azidoalkoxyskupinu, aminoethylthioureidyl, aminofenyloxyskupinu a azidofenyloxyskupinu,
R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O -β-sialyl, C1-C5 azidoalkyl, C2-C5 alkynyl a C1-C5 aminoalkyl;
přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu koncovou aminoskupinu, azidoskupinu nebo C2-C5 alkynyl, a to s výhodou jako součást substituentu vybraného z R1, R5 nebo R6, pokud U je 1- thio-β-D-galaktopyranosyl, a s výhodou jako součást substituentu R4 ve všech ostatních kombinacích;
a přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III není laktosa (Galβ4Glc), LacNAc (Galβ4GlcNAc) ani LacdiNAc (GalNAcβ4GlcNAc).
Sacharid v substituentu R1 je s výhodou monosacharid, výhodněji 1- O-α-D-galaktopyranosyl nebo 2-O-α-sialyl.
Pokud V a W je vazba a U je 1- thio-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R4, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R1 a na atomu C-6 skupinou -OR6 (varianta IIIa), s výhodou R2 je hydroxyskupina a R4 je také hydroxyskupina.
Pokud V a W je vazba a U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-1 skupinou R4 (varianta IlIb), s výhodou R2 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu a acetamidoskupinu a R3u je acetamidoskupina.
Pokud V a W je vazba a U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-1 skupinou R4 (varianta IIIc), s výhodou R2 je hydroxyskupina a R3u je acetamidoskupina.
Pokud V a W je vazba a U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-1 skupinou R4 (varianta IIId), s výhodou R2 je hydroxyskupina a R3u je acetamidoskupina.
- 9 CZ 309738 B6
Pokud U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-1 substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3v a na atomu C-1 substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3w a na atomu C-1 skupinou R4 (varianta IIIe), s výhodou R2, R3v a R3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu a acetamidoskupinu a R3u je acetamidoskupina.
Substituované sacharidy se k polymernímu nosiči navazují buď amidovou vazbou, nebo azidalkynovou cykloadicí, tzv. „click“ reakcí (za tvorby Linkeru ze skupiny Y3 a ze substituentu na substituovaném sacharidu obsahujícího terminální aminové, azidové, alkynylové, nebo aminoethylthioureidylové skupiny, typicky substituentu R1 nebo R4 nebo R5 nebo R6). Aminolytická reakce typicky probíhá v aprotickém rozpouštědle, s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid. Cykloadiční reakce je s výhodou katalyzovaná, s výhodou měďnými ionty, nebo může být nekatalyzovaná. Reakce typicky probíhá ve vodě, případně ve směsných rozpouštědlech tvořených vodou, vodnými pufry, alkoholy, aprotickým rozpouštědlem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid, případně jejich směsi. V případě cykloadiční reakce katalyzované mědí obsahuje reakční směs měďné či měďnaté kationty s výhodou díky přítomnosti CuSO4 nebo CuBr, a redukční činidlo, s výhodou kyselinu askorbovou nebo askorbát sodný. Ve všech případech je výhodné využít čištění pomocí gelové filtrace na koloně (např. s náplní Sephadex G-25) ve vodě a případně další čištění od kationtů mědi, s výhodou pomocí komplexace s 8-chinolinolem, a následného čištění na koloně (např. Sephadex LH-20) s methanolem jako mobilní fází.
Důležitým přínosem vynálezu je vhodná prezentace substituovaného sacharidu na polymerním nosiči, přičemž jeho obsah v glykopolymeru tvoří 0,5 až 25 % mol., s výhodou 3 až 18 % mol. Multivalentní uspořádání substituovaných sacharidů na polymerech umožňuje multivalentní interakci s Gal-3, a tím významně navyšuje vazebnou aktivitu ke Gal-3 a obecně ke galektinům.
Předmětem vynálezu je dále imunomodulační účinek polymerních konjugátů se substituovanými sacharidy díky vazbě ke Gal-3 výše popsanou multivalentní interakcí. Aplikací polymerních nosičů se sacharidy dochází k vyvázání extracelulárního Gal-3 v nádorové tkáni, a tím k inhibici Gal-3 indukované apoptózy T lymfocytů v nádoru, což umožní navýšení imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám přímo v nádoru. Vazba polymerních nosičů s navázanými substituovanými sacharidy na Gal-3 přímo produkovaný nádorovými buňkami dále vede ke snížení migrace nádorových buněk. Vzhledem k tomu, že Gal-3 v některých typech nádorových buněk zvyšuje pravděpodobnost vzniku metastáz prostřednictvím inhibice vazby buněk k podkladu a buněk vzájemně mezi sebou, vede aplikace polymerních konjugátů se substituovanými sacharidy prostřednictvím vazby na Gal-3 ke snížení možnosti migrace buněk do metastatických ložisek a snížení jejich motility.
Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, která se vyznačuje tím, že obsahuje glykopolymer podle vynálezu obsahující aktivní substituovaný sacharid a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku vybranou ze skupiny zahrnující plniva, antiadheziva, pojiva, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty.
Předmětem vynálezu je glykopolymer podle vynálezu a/nebo jeho farmaceutická kompozice pro použití jako léčivo k léčbě pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukemie, zejména kolorektálního karcinomu, karcinomu prostaty, karcinomu prsu, melanomu, lymfomu, leukemie.
Předmětem vynálezu je rovněž glykopolymer podle vynálezu a/nebo jeho farmaceutická kompozice pro použití jako adjuvancium při protinádorové terapii.
- 10 CZ 309738 B6
Objasnění výkresů
Obr. 1: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P11b (obsah substituovaného sacharidu 20 byl 4,9 % mol.).
Obr. 2: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P11d (obsah substituovaného sacharidu 20 byl 9,7 % mol.).
Obr. 3: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P13a (obsah substituovaného sacharidu 9 byl 5,1 % mol.).
Obr. 4: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P13b (obsah substituovaného sacharidu 9 byl 8,9 % mol.).
Obr. 5: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu HPMA s jednoduchým disacharidem LacdiNAc (obsah LacdiNAc byl 12,3 % mol.).
Obr. 6: Inhibice migrace a proliferace myších (4T1, B16-F10) a lidských (DLD-1) nádorových buněk pomocí konjugátů P11a a P11c.
Seznam zkratek
ACVA, 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina); AIBN, 2'-azobis(2-methylpropionitril); Gal-3, galektin-3; HPMA, N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid; MA-AP-TT, 3-(3methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion; MA-propynyl, 2-methyl- N-(prop-2-yn-1 -yl)prop2-enamid; 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion; MA skupina, N-methakryloyl skupina; tBoc skupina, terc-butoxykarbonylová skupina; TT skupina, thiazolin-2-thionová skupina; TBAB, tetra-n-butylamoniumbromid; THPTA, tris hydroxypropyltriazolylmethylaminový ligand; V70, 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4dimethylpentannitril); LacdiNAc (GalNAcβ4GlcNAc); LacNAc (Galβ4GlcNAc); laktosa (Galβ4Glc), 4T1 (buněčná linie myšího nádoru prsu); B16-F10 (buněčná linie myšího kožního melanomu); CT26 (buněčná linie myšího kolorektálního karcinomu); DLD-1 (buněčná linie lidského kolorektálního adenokarcinomu); HEK293 (linie lidských embryonálních buněk z ledvin); HT-29 (buněčná linie lidského kolorektálního adenokarcinomu); Jurkat (imortalizovaná buněčná linie T lymfocytů); LNCaP (buněčná linie lidského adenokarcinomu prostaty); OVCAR3 (buněčná linie lidského adenokarcinomu vaječníků); PC3 (buněčná linie lidského adenokarcinomu prostaty); Raji (lidská buněčná linie Burkittova lymfomu); SU-DHL-5 (buněčná linie lidského B-lymfomu); SU-DHL-6 (buněčná linie lidského B-lymfomu);
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů
N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA)
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu (Chytil P. et al. Eur. J. Pharm. Sci 2010, 41 (3-4), 473-482). Produkt byl chromatograficky čistý. 1H-NMR (300 MHz, (CD3ŘSO, 296 K): δ 1,00-1,02 (d, 3H, CHOH-CH3), 1,85 (s, 3H, CH3), 3,00-3,12 (m, 2H, CH2), 3,64-3,73 (m, 1H, CH), 4,68-4,70 (d, 1H, OH), 5,30 a 5,66 (d, 2H, CH=), 7,59 (br, 1H, NH).
N-Methakryloylpropynylamin (MA-propynylamin) byl připraven podle dříve popsaného postupu. (Lynn G.M. et al., Biomacromolecules, 2019, 20 (2), 854-870) Produkt byl chromatograficky čistý.
- 11 CZ 309738 B6 ’H-NMR(300 MHz, (CD3)2SO, 296 K): δ 1,85 (s, 3H, CH3), 3,05 (s, 1H, =CH), 3,88 (d, 2H, -CH2-), 5,37 a 5,68 (d, 2H, =CH2), 8,37 (s, 1H, NH).
3-(3-Methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (MA-AP-TT)
MA-AP-TT byl připraven podle dříve popsaného postupu (Subr V. et al. Biomacromolecules 2006, 7 (1), 122-130). Produkt byl chromatograficky čistý. 'H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 295 K): δ 1,20-1,27 (m, 2H, CH2-y), 1,40-1,54 (m, 4H, CH2-p, CH2-8), 1,82 (s, 3H, CH3), 2,28 (t, 2H, CH2a), 3,04-3,34 (m, 2H, CH2-s), 3,57 (s, 3H, OCH3), 5,28 a 5,60 (d, 2H, CH2=), 7,88 (br, 1H, NH).
Příklad 2: Syntéza statistického kcpolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-TT) radikálovou polymerací (Pl)
833 mg HPMA (5,82 mmol), 167 mg MA-AP-TT (0,646 mmol) a AIBN (160 mg; 0,974 mmol) byly rozpuštěny v 6,2 ml dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostatované na 60 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 ml) a přesrážen z methanolu (6 ml) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 ml). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 850 mg, 85 %; molární hmotnosti = 23 900 g/mol, Mn = 12 100 g/mol, D = 1,98.
Příklad 3: Syntéza statistického kcpolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-TT) řízenou RAFT radikálovou polymerací (P2)
800 mg HPMA (5,59 mmol) bylo rozpuštěno v 5,52 ml fórc-butylalkoholu a smícháno s roztokem 160 mg MA-AP-TT (0,621 mmol), 4,97 mg AIBN (17,7 pmol) a 7,84 mg 2-kyanopropan-2-yl dithioáta (35,5 pmol) v 1,38 ml dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 16 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 ml) a přesrážen z methanolu (6 ml) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 ml). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 730 mg, 76 %; molární hmotnosti = 22 900 g/mol, Mn = 20 600 g/mol, £>= 1,11.
- 12 CZ 309738 B6
Příklad 4: Odstraněni koncových skupin na polymeru pocházejících z přenosového činidla
700 mg polymeru P2 nesoucího koncové dithiobenzoátové skupiny a 70 mg iniciátoru AIBN bylo rozpuštěno v 5 ml dimethylsulfoxidu, probubláno argonem a zataveno ve skleněné ampuli. Po 2 h ve vodní lázni termostatované na 80 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 ml) a přesrážen z methanolu (6 ml) do směsi aceton diethylether (3:1; 120 ml). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek polymeru byl 621 mg.
Příklad 5: Syntéza statistického kcpolymeru poly(HPMA-co-MA-propynyt) řízenou RAFT radikálovou polymerací (P3)
264 mg HPMA (1,84 mmol) a 12 mg V-methakryloylpropynylaminu (MA-propynyl) (97,0 pmol) bylo rozpuštěno v 1,3 ml destilované vody a smícháno s roztokem 1,3 mg ACVA (4,7 pmol) a 2,6 mg 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanové kyseliny (9,5 pmol) v 0,65 ml dioxanu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 7 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 ml) a zcentrifugován. Čištění probíhalo gelovou filtrací s použitím kolony s náplní Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl získán srážením do diethyletheru, filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 127 mg, 46 %; molární hmotnosti = 22 900 g/mol, Mn = 20 600 g/mol, D= 1,11.
Příklad 6: Syntéza statistického kcpolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-propynyt) korjugací propynylaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-Tl) (P4)
600 mg polymerního prekurzoru (obsahujícího 0,54 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 6 ml dimethylformamidu a za míchání při pokojové teplotě bylo k roztoku přidáno 40 pl propynylaminu (0,65 mmol) a 108 pl V-ethyldiisopropylaminu (0,65 mmol). Reakce probíhala 16 h při pokojové teplotě. Polymer byl čištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 ml), filtrací a sušením. Výtěžek: 560 mg; molární hmotnosti: = 21 800 g/mol, Mn = 20 200 g/mol, B = 1,08.
- 13 CZ 309738 B6
Příklad 7: Syntéza hvězdicového kcpolymeru obsahující PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-propynylem (P5)
500 mg HPMA (3,49 mmol) bylo rozpuštěno v 3,4 ml terc-butylalkoholu a smícháno s roztokem 2,8 mg 2-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxo-thiazolidin-3-yl)-butylazo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)-pentannitrilu (5,4 pmol) a 4,4 mg 1-kyano-1-methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3-yl)butylesteru dithiobenzoové kyseliny (10,7 pmol) v 0,85 ml dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostate váné na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 ml) a přesrážen z methanolu (6 ml) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 ml). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek: 345 mg, 69 %; molární hmotnosti: = 29 800 g/mol, Mn = 27 100 g/mol, D = 1,10.
340 mg polymerního prekurzoru (obsahujícího 11,2 pmol koncových TT skupin) bylo rozpuštěno v 2,2 ml dimethylsulfoxidu a přidáno k 20 % hmotn. methanolovému roztoku 1,5 mg PAMAM dendrimeru (1,4 pmol dendrimeru G2 s diaminobutanovým jádrem). Po 1,5 h míchání při pokojové teplotě byla reakce zastavena přidáním 50 pl acetanhydridu. Polymer byl vyčištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 ml), následně filtrací a sušením. Výtěžek konjugační reakce byl 85 % hvězdicového kopolymeru.
100 mg hvězdicového polymerního prekurzoru bylo rozpuštěno v 1 ml methanolu. Do míchaného roztoku polymeru bylo přisypáno 10 mg práškového borohydridu sodného. Po 1 h míchání při pokojové teplotě bylo in situ přidáno 10 mg propynylmaleimidu rozpuštěného v 0,2 ml methanolu. Po 1 h reakce byl polymer čištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (25 ml), následovně filtrací a sušením. Molární hmotnosti: Mw = 210 000 g/mol, D = 1,19. Obdobným způsobem byly připraveny vzorky využívající jako jádro 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer.
Příklad 8: Syntéza hvězdicového kcpolymeru obsahující PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(PlPMA)-TT (P6)
- 14 CZ 309738 B6
500 mg HPMA (3,49 mmol) bylo rozpuštěno v 3,4 ml /erc-butyl alkoholu a smícháno s roztokem 2,8 mg 2-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxo-thiazolidin-3-yl)-butylazo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)-pentannitril (5,4 pmol) a 4,4 mg 1-kyano-1-methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3-yl)butylestem dithiobenzoové kyseliny (10,7 pmol) v 0,85 ml dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostate váné na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 ml) a přesrážen z methanolu (6 ml) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 ml). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek: 345 mg, 69 %; Molární hmotnosti: Mw = 29 800 g/mol, Mn = 27 100 g/mol, D = 1,10.
340 mg polymerního prekurzoru (obsahujícího 11,2 pmol koncových TT skupin) bylo rozpuštěno v 2,2 ml dimethylsulfoxidu a přidáno k 20 % hmotn. methanolového roztoku 1,5 mg PAMAM dendrimeru (1,4 pmol dendrimer G2 s diaminobutanovým jádrem). Po 1,5 h míchání při pokojové teplotě byla reakce zastavena přidáním 50 pl acetanhydridu. Polymer byl čištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 ml), následován filtrací a sušením. Výtěžek konjugační reakce byl 85 % hvězdicového kopolymeru.
100 mg hvězdicového polymerního prekurzoru a 10 mg 2-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)-butylazo]-2-methyl-5-oxo-5-(2-thioxothiazolidin-3-yl)-pentannitrilu bylo rozpuštěno v 0,7 ml dimethylsulfoxidu, probubláno argonem a zataveno ve skleněné ampuli. Po 3 h ve vodní lázni termostate váné na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (25 ml) a přesrážen z methanolu (1 ml) do směsi aceton diethylether (3:1; 25 ml). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Molární hmotnosti:
= 205 000 g/mol, D = 1,20. Obdobným způsobem byly připraveny vzorky využívající jako jádro 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer.
Příklad 9: Syntéza statistického kcpolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-azadibenzocyklookíyn) konjugaci azadibenzocyklookíynaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-Tl) (P7)
- 15 CZ 309738 B6
200 mg polymerního prekurzoru (obsahujícího 0,11 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 2 ml dimethylformamidu a za míchání při pokojové teplotě bylo k roztoku přidáno 32 mg azadibenzocyklooktynaminu (0,12 mmol) rozpuštěného v 0,1 ml dimethylformamidu a 22 μΐ Nethyldiisopropylaminu (0,13 mmol). Reakce probíhala 16 h při pokojové teplotě. Polymer byl čištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (50 ml), následován filtrací a sušením. Výtěžek: 184 mg; Molární hmotnosti: = 28 000 g/mol, Mn = 25 200 g/mol, D = 1.11.
Příklad 10: Syntéza statistického kcpolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-propylazia) konjugaci 3azido-l-propylaminu spoly(HPMA-co-MA-AP-Tl) (P8)
300 mg polymerního prekurzoru P2 bylo rozpuštěno v 3,5 ml methanolu a za míchání při pokojové teplotě přidáno 40 μΐ 3-azido-l-propylaminu (0,40 mmol). Po 30 min bylo do reakční směsi přikapáno pomalu 92 μΐ V-ethyldiisopropylaminu (0,53 mmol). Po 20 h reakce při pokojové teplotě bylo přidáno 40 μΐ 1-aminopropan-2-olu (0,29 mmol) a mícháno dalších 30 min. Polymer byl čištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (50 ml), následován filtrací a sušením. Výtěžek: 234 mg; Molární hmotnosti: = 23 700 g/mol, Mn = 21 100 g/mol, D = 1.1; obsah azidových skupin 16,7 % mol.
Příklad 11: Syntéza 3'-O-[4-(azidomethyl)benzyl]-P-D-galaktopyranosyl-(l—>l)-3-O-(4-{[4(brommethyl)-1 //-1,2,3-triazol-1 -yl]methyl}benzyl)-1 -thίο-β-D-galaktopyranosidu (3)
- 16CZ 309738 B6
Výchozí látka P-D-galaktopyranosyl)-(l—>l)-l-thio-P-D-galaktopyranosid (1) reagovala v přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu2SnO) s nadbytkem bromidu za vzniku selektivně C-3, C-3’ 5 disubstituované sloučeniny 2. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu te/ra-n-butylamoniumbromidu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 až 84 °C). Následně byla pomocí cykloadiční click reakce terminální azidové funkční skupiny a alkynové skupiny propynylbromidu (0,5 eq.) za katalýzy Cu(I) v přítomnosti trishydroxypropyltriazolylmethylaminového ligandu (THPTA) připravena sloučenina 3.
Příklad 12: Syntéza 2-azidoethyl-3-O-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-P-D-galaktopyranosyl-(l—>4)2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosidu (7)
5
TBAB
Bu2SnO □IPEA benzylbromid suchý dioxan 24h, 84’C
- 17CZ 309738 B6
Disacharid 6 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru 2-azidoethyl-2-acetamido-2deoxy-β-D-glukopyranosidu (5) a donoru 72-niΐrofenyl-2-aceΐamido-2-deoxy-β-Dgalaktopyranosidu (4) za katalýzy mutantní Tyr470His β-A-acetylhexosaminidasou z Talaromyces flavus (Tyr470His 7/Hcx) (Bojarová P. et al. J Nanobiotechnol. 2018, 16, 73). Benzyl byl selektivně vnesen na C'-3 reakcí 6 s benzylbromidem v přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu2SnO) za vzniku substituovaného sacharidu 7.
Příklad 13: Syntéza 3-O-propynyl- β -D-galaktopyranosyl-(l—>l)-3-O-[(4-bromfenyl)-l//-(l,2,3triazol-4-yl)meΐhyl]-β-D-galakΐopyranosidu (9)
TBAB
Bu2SnO
DIPEA propargylbromid suchý dioxan 24h. 82-94’C
CuSO,
L-askorbát sodný
THPTA p- azidoph eny I bromid t-bu tyla lkohol/H20 (1/1)
24’C. 2-4h
Výchozí látka β-D-galaktopyranosyl)-(l—>l)-l-//?/o-β-D-galaktopyranosid (1) reagovala v přítomnosti cínového komplexu (Bu2SnO) s nadbytkem propynylbromidu za vzniku selektivně C3, C-3’ disubstituované sloučeniny 8. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 až 94 °C). Druhý reakční krok založený na Cu(I)-katalýzováné azid-alkynové cykloadici 4-bromfenylazidu za katalýzy THPTA byl proveden ve směsi fórc-butylalkoholu a vody za vzniku sloučeniny 9.
Příklad 14: Syntéza 2-aminoethylthioureidyl-3-(9-[(4-bromfenyl)-l//-(l,2,3-triazol-4-yl)methyl]β-D-galaktopyranosyl-(l—>3)-2-aceΐamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosidu (15)
- 18 CZ 309738 B6
p-azaophenyltromid CuSO,. L-36kcrtialsMty· THPTA
Výchozí disacharid 12 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru (terc5 butoxykarbonylam i no)ethylth ioureidyl-2-acetam ido-2-deoxy-P-D-gl ukopyranosidu (11) (Bojarová P. et al. Molecules 2019, 24, 599) a donoru junitrofenyl-P-D-galaktopyranosidu (10) za katalýzy rekombinantni p3-galaktosidasou z Bacillus circulans. Disacharid 12 reagoval v přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu2SnO) s nadbytkem propynylbromidu za vzniku selektivně C-3' substituované sloučeniny 13. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu ίο (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 až 94 °C). Následný reakční krok založený na
Cu(I)-katalyzované cykloadici mezi terminálním alkynem 13 a /2-azidofenylbromidem v přítomnosti THPTA byl proveden ve směsi terc-butylalkoholu a vody za vzniku sloučeniny 14. Následné odchránění aminoskupiny za vzniku sloučeniny 15 proběhlo v IM HC1 při 4 °C po dobu 48 h.
Příklad 15: Syntéza p-D-GalNAc-(l->4)-P-D-GlcNAc-(l->3)-P-D-Gal-(l->4)-P-D-GlcNAc-l-O(2-aminoethylthioureidyl) (LacdiNAc-LacNAc-linker-NH2; 20)
- 19CZ 309738 B6
1M HCI, 4a h
Výchozí disacharid 16 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru (tercbuΐoxykarbonylamino)eΐhyhhioureidyl-2-aceΐamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosidu (11) (Bojarová P. et al. Molecules 2019, 24, 599) a donoru/2-nitiofenyl-β-D-galakΐopyranosidu (10) za katalýzy rekombinantní β4-galaktosidasou z Bacillus circulans. Disacharid 16 byl použit jako akceptor pro glykosylaci β-D-GlcNAc jednotkou za katalýzy rekombinantní β-Αacetylhexosaminidasou Bbhl z Bfidobacterium b.fidum, selektivní pro tvorbu β(1—>3) vazby. Vzniklý trisacharid 18 byl dále použit jako akceptor pro glykosylaci β-D-GalNAc za katalýzy 10 selektivní mutantní β-A-acetylhexosaminidasou z Talaromyces flavus za vzniku tetrasacharidu 19.
Následné odchránění aminoskupiny u tetrasacharidu 19 za vzniku sloučeniny 20 proběhlo v 1M HC1 při 4 °C po dobu 48 h. Alternativně je možné tuto sloučeninu připravit pomocí rekombinantních glykosyltransferas dle postupů popsaných v literatuře (Laaf D. et al. Bioconjug. Chem. 2017, 28, 2832-2840).
Příklad 16: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 15 s poly(HPMA-co-MA-AP-Tl) (P9)
-20CZ 309738 B6
mg polymeru P2 (obsahujícího 14,6 pmol TT skupin) a 9,2 mg sloučeniny 15 (13,1 pmol) bylo rozpuštěno v 0,8 ml dimethylacetamidu a probubláno argonem. Po přídavku 2,3 μΐ Nethyldiisopropylaminu (13,1 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno 1,1 pl 1-aminopropan-2-olu (14,6 pmol) a ponecháno reagovat 1 h. Polymerní konjugát byl čištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymerní frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymerní konjugát byl izolován lyofilizováním. Výtěžek: 25,4 mg; 83,4 %; Molární hmotnosti: = 25400 g/mol, Mn = 23 600 g/mol, D = 1,08; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 5,0 % mol.
Příklad 17: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 3 spoly(HPMA-co-MA-AP-prcpynyl)em (P10)
Ke 2 mg CuSO4-5H2O (16 pmol) rozpuštěným v 25 pl vody bylo přidáno k roztoku 25 mg j>o/y(HPMA-co-MA-AP-propynylu), P4, (17,4 pmol propynylových skupin), 1,6 mg askorbátu sodného (16,2 pmol) a 12,9 mg sloučeniny 3 (16,2 pmol) rozpuštěných v 225 pl vody. Reakční směs byla probublána argonem před a po přídavku síranu měďnatého a míchána 1 h při pokojové
-21 CZ 309738 B6 teplotě. Poté byl roztok naředěn 1 ml 5% roztoku disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny, polymerní konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25 ve vodě a lyofilizován. Konjugát byl rozpuštěn ve 2 ml methanolu a přidán nadbytek 8-chinolinolu. Po 20 min byl vzorek čištěn od zbytkové mědi gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Po odpaření rozpouštědla byl polymer rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Výtěžek: 29,4 mg; 84,0 %; Molární hmotnosti: = 27 500 g/mol, Mn = 25 200 g/mol, D = 1,09; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 9,8 % mol.
Příklad 18: Syntéza koi jugátu substituovaného sacharidu 20 spoly(HPMA-co-MA-AP-Tl) (Pil)
Polymerní konjugát Pil byl připraven s různým obsahem cukerné složky. 20 mg polymeru P2 (obsahujícího 16,4 pmol TT skupin) a 2,7 mg substituovaného sacharidu 20 (3,0 pmol) v případě přípravy Pila, 5,3 mg substituovaného sacharidu 20 (5,9 pmol) v případě přípravy Pllb, 9,1 mg substituovaného sacharidu 20 (10,2 pmol) v případě přípravy Plic, nebo 10,3 mg substituovaného sacharidu 20 (11,2 pmol) v případě přípravy Plld bylo rozpuštěno v 1,2 ml směsi dimethylacetamidu se suchým methanolem (3:1) a probubláno argonem. Po přídavku 0,8 pl Nethyldiisopropylaminu (4,8 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno 1,5 pl 1 -aminopropan-2-olu (20 pmol) a ponecháno reagovat 0,5 h. Polymerní konjugát byl čištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymerní frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymerní konjugát byl izolován lyofilizací. Charakteristiky jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1. Charakteristika připravených glykopolymerů nesoucích substituovaný sacharid 20
Název konjugátu Výtěžek reakce (%) Obsah cukerné složky (% mol.)* (g/mol) t (g/mol) t
Pila 88 2,6 22500 21700 1,04
Pllb 90 4,9 24500 22400 1,09
Plic 91 7,2 28300 27300 1,03
Plld 90 9,7 28200 26300 1,07
*Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí 'H-NMR.
fMolární hmotnosti a disperzita byly stanoveny pomocí GPC, jak je uvedeno v příkladu 21.
Příklad 19: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 7 s poly(HPMA-co-MA-APazadibenzocyklookíynem) (P12)
-22 CZ 309738 B6
mg /?o/v(HPMA-co-MA-AP-azadibcnzocyklooktynu), P7, (8,9 pmol azadibenzocyklooktynových skupin) bylo rozpuštěno v 300 μΐ methanolu, smícháno s roztokem
6,3 mg substituovaného sacharidu 7 (11,0 pmol) v 200 μΐ methanolu a probubláno argonem. Po h míchání při pokojové teplotě byl polymerní konjugát čištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymerní frakce byla zakoncentrována na vakuu na 1 ml a polymer byl izolován precipitací do nadbytku ethylacetátu (40 ml) a filtrací následovanou sušením do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 24,7 mg; 80,1 %; Molární hmotnosti: = 30 800 g/mol, Mn =
28 000 g/mol, D = 1,10; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 5,1 % mol.
Příklad 20: Syntéza korjugátu substituovaného sacharidu propylazidem) (PÍ 3) s poly(HPMA-co-MA-AP-
-23 CZ 309738 B6
Polymerní konjugát P13 byl připraven s různým obsahem cukerné složky. 15 mg polymerního prekurzoru P8 bylo rozpuštěno v 150 μl dimethylformamidu a smícháno s 3,54 mg (5,6 μmol), nebo 6,3 mg (9,9 μmol) substituovaného sacharidu 9 v 300 dimethylformamidu pro přípravu P13a, či P13b, resp. Poté bylo přidáno 0,88 mg (6,2 μmol), nebo 2,42 mg (12,9 μmol) CuBr v případě P13a, či P13b, resp., a mícháno při pokojové teplotě Po 20 h byl přidán nadbytek 8-chinolinolu, roztok byl míchán dalších 30 min a naředěn 2 ml methanolu. Polymerní konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Frakce obsahující polymer byla odpařena, produkt rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. P13a: Výtěžek: 15,3 mg; molární hmotnosti: Mw = 28 600 g/mol, Mn = 25 900 g/mol, D = 1,1; obsah cukerné složky v konjugátu byl 4,5 % mol. P13b: Výtěžek: 17,4 mg; molární hmotnosti: Mw = 30 600 g/mol, Mn = 28 100 g/mol, D = 1,1; obsah cukerné složky v konjugátu byl 8,9 % mol.
Příklad 21: Příklad charakterizace polymerních prekurzorů a konjugátů
Připravené kopolymery, polymerní prekurzory i jejich konjugáty se substituovanými sacharidy byly charakterizovány stanovením váhového i početního průměru molárních hmotností (Mw, Mn) a příslušného indexu disperzity (B) pomocí gelové permeační chromatografie (GPC) na systému vybaveném UV detektorem (Shimadzu, Japan), RI detektorem (Optilab REX, Wyatt Technology Corp., USA) a víceúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN Heleos-II, Wyatt Technology Corp., USA). Pro charakterizaci byla v případě SEC použita kolona TSK 3000 Super SW a jako mobilní fáze směs MeOH (80 %) a 0,3 M octanového pufru o pH 6,5 (20 %). Koncentrace vzorků byla ve všech případech 3 mg/ml.
Obsah TT skupin byl stanoven spektrofotometricky na UV-VIS spektrofotometru Specord 205 (Analytik Jena, Německo) v methanolu (εο = 10 800 l.mol'.cm1) podle literatury (Šubr V. et al. Biomacromolecules 2006, 7 (1), 122-130).
Obsah trojných vazeb a konjugovaných substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) na spektrometru Bruker Avance III 600 MHz ve vodě.
Příklad 22: ELISA
Afinita Gal-3 k substituovaným sacharidům a jejich konjugátům s polymery byla stanovena za použití kompetitivního ELISA stanovení (Bojarová P. et al. J Nanobiotechnol. 2018, 16, 73; Bumba L. et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 372). Toto stanovení dává předběžnou informaci o síle vazby Gal-3 na glykokopolymery, ale je třeba jej brát pouze jako orientační pomůcku a vzít v úvahu zvláště biologický účinek glykopolymerů (viz příklady 25-27). V jamkách mikrotitračních destičkových modulů F16 Maxisorp NUNC-Immuno Modules (Thermo Scientific, Roskilde, Dánsko) byl imobilizován přes noc asialofetuin (Sigma Aldrich, Steinheim, Německo; 0,1 μΜ v PBS pufru, 50 μl, 5 pmol na jamku). Jamky byly následně vyblokovány BSA (2 % w/v) rozpuštěném v PBS (1 h, teplotě místnosti). Posléze byla do jamek přidána směs testované sloučeniny v různých koncentracích a Gal-3 (celkový objem 50 μl; 4.5 μΜ finální koncentrace Gal3) a inkubovány po dobu 2 hodin. Detekce navázaného Gal-3 byla provedena pomocí monoklonální anti-His6-IgG1 myší protilátky konjugované s křenovou peroxidasou (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo) rozpuštěné v PBS pufru (1:1000, 50 μl, 1 h, teplotě místnosti). Substrátový roztok TMB One (Kem-En-Tec, Taastrup, Dánsko) byl použit k zahájení kolorimetrické reakce konjugované peroxidasy. Tato reakce byla zastavena přídavkem 3 M HCl (50 μl). Vazebný signál navázaného Gal-3 byl stanoven spektrofotometricky při 450 nm (Spectra Max Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Získané výsledky byly analyzovány za použití softwaru Prism 7.0 (GraphPad, USA) a byly vyhodnoceny jako IC50.
- 24 CZ 309738 B6
Tabulka 2. Inhibiční potenciál vybraných sloučenin a konjugátů (IC50) stanovený metodou ELISA
Název konjugátu Obsah cukerné složky [% mol.]* IC50 na glykan [ μΜ] IC50 glykopolymeru [μΜ]
Laktosa - 132 -
Substituovaný sacharid 20 - 7,21 -
Glykopolymer P11a 2,6 0,22 0,066
Glykopolymer P11b 4,9 0,14 0,023
Glykopolymer P11c 7,2 4,8 0,51
Glykopolymer P11d 9,7 4,4 0,40
Substituovaný sacharid 9 - 16 -
Glykopolymer P13a 4,5 28 4,2
Glykopolymer P13b 8,9 6,9 0,62
*Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí 1H-NMR.
1 Převzato z literatury (Bocker S. et al. Biomolecules 2015, 5, 1671-1696)
Příklad 23: Kvantifikace produkce Gal-3 u vybraných nádorových linií.
Buněčná linie Detekce Gal-3 s využitím průtokové cytometrie Exprese Gal-3 detekovaná pomocí metody Western blot
Lokalizace na membráně Lokalizace na membráně Intracelulární
4T1 Netestováno + ++
B16-F10 Netestováno + ++
CT26 Netestováno - ++
DLD-1 ++ + ++
HEK293 ++ + ++
HT-29 + Netestováno Netestováno
Jurkat Netestováno - -
LNCaP - - -
OVCAR-3 ++ + ++
PC3 + + ++
Raji - Netestováno Netestováno
SU-DHL-5 - - -
SU-DHL-6 + Netestováno Netestováno
Vysvětlivky: Míra exprese Gal-3 - „-“ = nedetekovatelná, „+“ = výrazná, „++“ = silně výrazná.
Příklad 24: Inhibice vazby externího galektinu-3 na povrch buněk s expresí galektinu-3 pomocí glykopolymerů
- 25 CZ 309738 B6
Schopnost glykopolymerů inhibovat vazbu externího Gal-3 na povrch buněk byla prokázána pomocí inhibičního vazebného testu průtokovou cytometrií. V testu byl použit proteinový konstrukt Gal-3-AVI nesoucí na své N-koncové části aminokyselinovou sekvenci Avi-tag, která umožňuje cílené navázání molekuly biotinu a jeho následnou detekci pomocí fluorescenčně značeného konjugátu streptavidin-fykoerytrin (L. Bumba et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 372). Jak bylo zjištěno imunochemickým testem pomocí metody ELISA, vazebné vlastnosti nativního Gal3 a Gal-3-AVI konstruktu jsou identické. Vazba glykopolymerů na Gal-3 inhibovala vazbu Gal-3 na povrch HEK293 buněk (imortalizovaná buněčná linie lidských zárodečných ledvinových buněk), u nichž byla prokázána silná exprese Gal-3 (viz příklad 23) a zároveň velká kapacita vyvazovat volný Gal-3 z roztoku.
Alikvoty Gal-3-AVI konstruktu (finální koncentrace 10 pg/ml) byly smíchány se zvyšující se koncentrací glykopolymeru P11b (3 pM - 100 pM) nebo laktosy (3 nM - 100 mM) jako pozitivní kontroly a inkubovány po dobu 30 minut na ledu v PBS pufru s přídavkem 1% hovězího sérového albuminu (BSA). Tato směs byla přidána k suspenzi HEK293 buněk (106 /ml) a pomalu promíchávána na ledu po dobu 30 min. Následně byly buňky promyty PBS pufrem a označeny pomocí streptavidin-fykoerytrinového konjugátu (Biolegend, USA). Síla vazby Gal-3-AVI konstruktu na povrch HEK293 buněk byla analyzována pomocí průtokové cytometrie a kvantifikována jako relativní intenzita fluorescence při 575 nm.
Tabulka 3. Inhibiční potenciál glykopolymeru P11b (IC50) stanovený v inhibičním vazebném testu s buněčnou linií HEK293 pomocí průtokové cytometrie
Název konjugátu Obsah cukerné složky [% mol.]* IC50 glykopolymeru [μΜ]
Laktosa - 225
Glykopolymer P11b 4,9 0,057
*Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí 1H-NMR.
Příklad 25: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy lidských T buněk pomocí glykopolymerů
Schopnost glykopolymerů účinně inhibovat apoptózu indukovanou Gal-3 byla prokázána prostřednictvím annexin V/ propidiumjodid apoptotického testu průtokovou cytometrií. Experimenty byly provedeny na imortalizované buněčné linii lidských T lymfocytů Jurkat. Bylo prokázáno, že lidský Gal-3 produkovaný nádorovými buňkami do okolního prostředí indukuje u této linie apoptózu.
V pokusech in vitro byly Jurkat buňky preinkubovány s různými koncentracemi glykopolymerů P11 a P13 (0,1; 1; 5; 10 a 50 μΜ) po dobu 5 minut a poté k nim byl přidán 10 μΜ Gal-3. Glykopolymery vyvazovaly volný Gal-3 z roztoku (okolí buněk), a ten tak nemohl indukovat apoptózu Jurkat buněk. Účinnost inhibice Gal-3 glykopolymery byla stanovena jako míra apoptózy buněk. Pro kontrolní experiment byl využit čistý HPMA polymer bez substituovaných sacharidů.
Glykopolymery inhibovaly apoptózu indukovanou Gal-3. Maximálního inhibičního efektu bylo dosaženo v koncentraci 5 μΜ nebo 1 μΜ v případě testovaného konjugátu P11b nebo P11d (viz Obr. 1 a 2). Čistý HPMA polymer bez substituovaných sacharidů vykazoval také mírný protektivní účinek, a to v 50 μΜ koncentraci.
Glykopolymer P13 také prokázal vysoký inhibiční efekt (viz obr. 3 a 4).
Příklad 26 (srovnávací): Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy lidských T buněk (Jurkat) pomocí glykopolymeru nesoucího jednoduchý disacharid LacdiNAc
- 26 CZ 309738 B6
Tabulka 4. Charakteristika srovnávacího glykopolymeru nesoucího jednoduchý disacharid LacdiNAc
Název konjugátu Obsah cukerné složky (% mol.)* Mw (g/mol)t Mn (g/mol)t D t IC50 na glykan [μΜ] IC50 na glykopolymer [μΜ]
LacdiNAcHPMA 12,3 30 100 28 000 1,07 38,5 2,3
*Obsah sacharidu byl stanoven pomocí 1H-NMR.
tMolární hmotnosti a disperzita byly stanoveny pomocí GPC, jak je uvedeno v příkladu 21.
Obr. 5 znázorňuje inhibici galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu HPMA polymeru s jednoduchým disacharidem LacdiNAc (obsah LacdiNAc byl 12,3 % mol., viz tabulka 4). S analogickým konjugátem s obsahem 8,4 % mol. LacdiNAc byly dosaženy stejné výsledky. Jedná se o totožný disacharid jako v publikaci (Bojarová P. et al. J. Nanobiotechnol. 2018, 16, 73). Je evidentní, že v buněčných testech vykázal tento konjugát výrazně nižší schopnost inhibovat apoptózu Jurkat buněk než konjugáty se substituovanými disacharidy, které jsou předmětem vynálezu.
Příklad 27: Inhibice migrace lidských i myších nádorových buněk
Migrace vybraných nádorových buněk, které exprimují Gal-3, byla studována s využitím tzv. scratch testu. Tento test je založen na nasazení zkoumané buněčné kultury na kultivační misku, při jejím 70 až 80 % nárůstu jsou buňky hrotem 1 ml plastové špičky seškrábnuty z povrchu v délce cca 1 cm a šířce cca 0,5 až 1 mm. Následně je vyměněno médium, v kterém jsou buňky kultivovány, a nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím testované látky. Migrace buněk je poté sledována rychlostí a mírou zarůstání vzniklé mezery.
Inhibiční účinek polymerů P11a obsahující 2,6 % mol. a P11c obsahujících 7,2 % mol. tetrasacharidu byl sledován po přidání k médiu myších buněk nádoru prsu (4T1), myší melanoblastomové buněčné linie (B16F10) a lidských buněk kolorektálního karcinomu (DLD1). Polymerní konjugáty byly přidány v koncentraci 10 μM nebo 20 μM. Po 24 a 48 h byla měřena oblast, která zůstává buňkami neporostlá, a byl sledován rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou bez přidaného polymerního konjugátu. Obr. 6 ukazuje rozdíly v šířce zarostlé zóny u kontrolního vzorku, ke kterému nebyl přidán žádný polymerní konjugát (kontrola), dále vzorku, ke kterému byl přidán samotný HPMA polymer (pHPMA), a vzorkům s konjugáty. V případě buněk 4T1 a B16F10 oba konjugáty způsobily inhibici migrace oproti kontrole i u vzorku inkubovanému s polymerním nosičem. U buněk DLD1 pouze konjugát s vyšším molárním zastoupením cukerné složky způsobil inhibici migrace odlišnou od kontroly a polymerního nosiče.

Claims (5)

1. Glykopolymer sestávající z HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 % mol.
- strukturních jednotek vzorce I:
Linker
Šubstituo\aný sachand (I) kde
Y 1 je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku;
Y 2 je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;
Linker je vybrán ze skupiny zahrnující 1,2,3-triazolylen, (Cl alkyl)-l,2,3-triazolylen; -NHC(=S)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-;
p řičemž Substituovaný sacharid je substituovaný sacharid obecného vzorce lile;
a popřípadě
- koncových skupin o vzorci -S-sukcinimid-(CH2)r-Linker-Substituovaný sacharid nebo C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylen)-Linker-Substituovaný sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Substituovaný sacharid jsou definovány výše;
přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce lile je fA py·· (lile) kde
R1 je vodík;
X je vazba,
Y je vazba,
-28CZ 309738 B6
Z je O,
R2, R3u, R3v, R3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu,
R4 je vazba k Línkem,
R5 je vodík;
5 přičemž glykopolymer volitelně dále obsahuje větvící jednotky, přičemž větvícími jednotkami jsou amidoaminové jednotky nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové jednotky.
2. Glykopolymer podle nároku 1, který má vzorec:
HN
3. Glykopolymer podle nároku 1 nebo 2 pro použití pro léčbu pevných nádorů, lymfomu nebo 10 leukemie.
4. Glykopolymer podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako adjuvans nebo imunomodulant
5. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje glykopolymer podle nároku 1 nebo 2 a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku vybranou ze skupiny zahrnující plniva, antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty,
CZ2019-572A 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo CZ309738B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-572A CZ309738B6 (cs) 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
PCT/CZ2020/050067 WO2021047699A1 (en) 2019-09-09 2020-09-09 Glycopolymer, method of preparation thereof, use thereof as medicament

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-572A CZ309738B6 (cs) 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2019572A3 CZ2019572A3 (cs) 2021-03-17
CZ309738B6 true CZ309738B6 (cs) 2023-09-06

Family

ID=74865563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-572A CZ309738B6 (cs) 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ309738B6 (cs)

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. Ulbrich et al: "Targeted Drug Delivery with Polymers and Magnetic Nanoparticles: Covalent and Noncovalent Approaches, Release Control, and Clinical Studies" Chem. Rev. 2016 May 11;116(9):5338-431. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00589 *
M. Hovorková: "Multivalentní sacharidové ligandy galektinů" UK, Přírodovědecká fakulta, Praha 2018 *
P. Bojarová et al: "Biocompatible glyconanomaterials based on HPMA-copolymer for specific targeting of galectin-3" J Nanobiotechnology. 2018 Sep 20;16(1):73. doi: 10.1186/s12951-018-0399-1. *
P. Bojarová et al: "Glycan - decorated HPMA copolymers as high-affinity lectin ligands" Polym. Chem. 8, 2647-2658 (2017) *
P. Bojarová, V. Křen: "Sugared biomaterial binding lectins: achievements and perspectives" Biomater. Sci. 4, 1142-1160 (2016) *
R. Pola et al: "Click chemistry as a powerful and chemoselective tool for the attachment of targeting ligands to polymer drug carriers" Polym. Chem. 5, 1340-1350 (2014) *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2019572A3 (cs) 2021-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7041818B2 (en) DDS compound and method for measurement thereof
JP5687899B2 (ja) 生理活性物質の高分子結合体
US6709679B2 (en) Antineoplastic conjugates of transferin, albumin and polyethylene glycol
JP5457672B2 (ja) 間接的な化学的複合体形成によって得られるヒアルロン酸又はその誘導体の抗腫瘍性バイオ複合体、及び医薬分野におけるそれらの使用
JP5866301B2 (ja) 増殖及びタンパク質合成の細胞内ターゲッティングのためのポリアニオン性多価高分子
US20090104143A1 (en) Hyaluronic acid containing bioconjugates: targeted delivery of anti-cancer drugs to cancer cells
JP2005535604A (ja) 治療剤を含むポリマーナノ物品
Arslan et al. A modular and orthogonally reactive platform for fabrication of polymer–drug conjugates for targeted delivery
CA3082835A1 (fr) Prodrogues polymeres et leur administration sous-cutanee et/ou intramusculaire
Sahoo et al. Multifunctional alternating “Bitter-Sweet” macromolecular architecture
JP5019524B2 (ja) 新規ポリ（メタ）アクリレート共重合体ならびに小胞体及びゴルジ体への送達方法
Sedlar et al. Glycopolymer Inhibitors of Galectin-3 Suppress the Markers of Tissue Remodeling in Pulmonary Hypertension
CZ309738B6 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ309634B6 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ2020132A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ2020137A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
WO2021047699A1 (en) Glycopolymer, method of preparation thereof, use thereof as medicament
CZ309067B6 (cs) Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
Zhukova et al. Preparation of a Doxorubicin Conjugate with (Co) Polymers of Methacrylic acid for Targeted Tumor Therapy
Etrych et al. Micellar and Antibody‐Targeted Polymer Therapeutics
WO2021121446A1 (en) Copolymer with hydrolytic release of cancerostatic agent cytarabine, method of its preparation and use thereof
EP4427762A1 (en) Trans-cyclooctene with improved t-linker
WO2024214771A1 (ja) デキストランとｔｌｒ７アゴニストのコンジュゲート体
KR20110057796A (ko) 헤파린과 접합되어 3원 생체분자를 이루는 항암 및 항종양 약물 전달 시스템