CZ2020132A3 - Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo - Google Patents

Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo Download PDF

Info

Publication number
CZ2020132A3
CZ2020132A3 CZ2020132A CZ2020132A CZ2020132A3 CZ 2020132 A3 CZ2020132 A3 CZ 2020132A3 CZ 2020132 A CZ2020132 A CZ 2020132A CZ 2020132 A CZ2020132 A CZ 2020132A CZ 2020132 A3 CZ2020132 A3 CZ 2020132A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
group
substituted
phenyl substituted
polymer
saccharide
Prior art date
Application number
CZ2020132A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309740B6 (cs
Inventor
Pavla Bojarová
Bojarová Pavla RNDr., Ph.D.
Tomáš Vašíček
Tomáš Mgr. Vašíček
Petr Chytil
Chytil Petr Mgr., Ph.D.
Marcela Filipová
Marcela Mgr. Filipová
Olga Janoušková
Janoušková Olga Mgr., Ph.D.
Tomáš Etrych
Ph.D. DSc. Etrych Tomáš RNDr.
M.R. Tavares
Original Assignee
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i. filed Critical Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2020-132A priority Critical patent/CZ309740B6/cs
Priority to PCT/CZ2020/050067 priority patent/WO2021047699A1/en
Publication of CZ2020132A3 publication Critical patent/CZ2020132A3/cs
Publication of CZ309740B6 publication Critical patent/CZ309740B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/34—Introducing sulfur atoms or sulfur-containing groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Řešení se týká multivalentních glykopolymerů na bázi HPMA polymerů (kopolymerů i homopolymerů) se sacharidovými strukturami obsahujícími terminální monosacharid v galakto-konfiguraci, které jsou účinné jako inhibitory galektinů. Tyto glykopolymery lze využít jako léčiva pro terapii a prevenci rakovinných onemocnění spojených s nadprodukcí galektinů, zvláště lidského galektinu-3 (Gal-3).

Description

PŘIHLÁŠKA VYNÁLEZU
Zveřejněná podle §31 zákona č. 527/1990 Sb.
(21) Číslo dokumentu:
2020-132 (22) Přihlášeno: 09.09.2019 (40) Datum zveřejnění přihlášky vynálezu: 05.05.2021 (Věstník č. 18/2021) (13) Druh dokumentu: A3 (51)Int. Cl.:
(19)
ČESKÁ REPUBLIKA
ÚŘAD PRŮMYSLOVÉHO VLASTNICTVÍ
C08F 20/58 (2006.01)
C08F 20/60 (2006.01)
C07H 99/00 (2006.01)
C08F 8/34 (2006.01)
A61K 31/785 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01)
(71) Přihlašovatel:
Ústav makromolekulám! chemie AV ČR, v. v. i.,
Praha 6, Břevnov, CZ
Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i., Praha 4, Krč, CZ (72) Původce:
RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D., Praha 6, Střešovice, CZ
Mgr. Tomáš Vašíček, 94911 Nitra, SK
Mgr. Petr Chytil, Ph.D., Kladno, Kročehlavy, CZ Mgr. Marcela Filipová, Třebechovice pod Orebem, CZ
Mgr. Olga Janoušková, Ph.D., Brandýs nad LabemStará Boleslav, Brandýs nad Labem, CZ
RNDr. Tomáš Etrych, Ph.D., DSc., Klínec, CZ M.R. Tavares, Praha 10, Vršovice, CZ (74) Zástupce:
HARBER IP s.r.o., Dukelských hrdinů 567/52, 170 00 Praha 7, Holešovice
CZ 2020 -132 A3 (54) Název přihlášky vynálezu:
Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo (57) Anotace:
Řešení se týká multivalentních glykopolymerů na bázi HPMA polymerů (kopolymerů i homopolymerů) se sacharidovými strukturami obsahujícími terminální monosacharid v galaktokonfiguraci, které jsou účinné jako inhibitory galektinů. Tyto glykopolymery lze využít jako léčiva pro terapii a prevenci rakovinných onemocnění spojených s nadprodukcí galektinů, zvláště lidského galekůnu-3 (Gal-3).
CZ 2020 - 132 A3
Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
Oblast techniky
Vynález se týká multivalentních vodorozpustných nebo micelámích polymerů, tj. homopolymerů i kopolymerů, se sacharidovými strukturami obsahujícími terminální monosacharid v galaktokonfiguraci, které jsou účinné jako inhibitory galektinů. Tyto glykopolymery lze využít jako léčiva pro terapii a prevenci rakovinných onemocnění spojených s nadprodukcí galektinů, zvláště lidského galektinu-3 (Gal-3).
Dosavadní stav techniky
V poslední době se vývoj léčiv v protinádorové terapii posouvá od klasických nízkomolekulámích léčiv k hledání nových léčiv nebo lékových forem umožňujících cílené působení aktivní látky především v místě, kde je terapeutický účinek třeba. V současnosti vstupují do klinického využití jako léčiva monoklonální protilátky, které jsou poměrně účinné u různých typů malignit, ovšem často je jejich použití spojené s poměrně silnými toxickými účinky pro pacienta. Vedle protilátek se cíleně působící formy léčiva dají využít především u takových látek, jejichž vedlejší účinky mohou vést až k poškození zdravých částí organizmu. Využití polymemích nosičů, především vodorozpustných nebo micelámích polymerů, pro cílenou dopravu léčiv je jednou z významných možností řešení zmíněného problému. Vysoká molámí hmotnost polymeru s aktivní složkou zabraňuje rychlému vyloučení z organizmu glomerulámí filtrací. Tím se významně prodlužuje doba cirkulace v krvi i celkové setrvání v organizmu vedoucí ke zvýšení biologické využitelnosti systému. Kromě toho vysoká molámí hmotnost polymemího systému vede ke zvýšené akumulaci v pevných nádorech díky EPR (enhanced permeability and retention) efektu.
Tohoto efektu lze využít v případě navázání léčiva na makromolekulámí nosič pro jeho cílenou akumulaci v nádoru. V minulosti byla vyvinuta celá řada systémů, které jsou založeny na využití EPR efektu pro cílení léčiv, např. polymemí micely, liposomy, nanočástice, nanokapsle nebo vodorozpustné polymemí konjugáty. Polymemí micely jsou na rozdíl od rozpustných polymemích systémů obvykle připravovány samouspořádáním amfifilních diblokových kopolymerů do vysokomolekulámích micelámích útvarů tvořících koloidní roztoky. Mezi vodorozpustnými systémy tvoří jednu z nej významnějších skupin polymemí systémy připravené na bázi polymerů obsahujících jednotky JV-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA polymery). Jediný a hlavní nedostatek omezující využití HPMA polymerů jako nosičů léčiv v humánní medicíně je jejich neštěpitelný uhlíkový řetězec a stím spojené omezení molámích hmotností použitelných pro přípravu polymemího nosiče na molámí hmotnosti menší než 50 000 až 60 000 g/mol (pod vylučovací mezí organizmu). Bohužel, polymery nad touto mezí nejsou efektivně a dostatečně účinně z těla vylučovány, a tudíž jejich použití jako léčiva by vedlo k nežádoucí akumulaci polymeru v organizmu. Navýšení molámí hmotnosti HPMA polymerů, a tedy prodloužení jejich cirkulace v organizmu, je možné vmezeřením biodegradovatelných spojek mezi jednotlivé bloky HPMA kopolymerů. Vhodné jsou zvláště spojky enzymově, hydrolyticky nebo reduktivně štěpitelné. Struktury vzniklé spojením bloků k sobě se nazývají multiblokové, roubované nebo hvězdicovité. Variantou může být též příprava amfifilního HPMA polymeru, který se do nadmolekulámí micelámí struktury sám složí a po poklesu koncentrace pod kritickou micelámí koncentraci se sám rozpadne na krátké kopolymery vyloučitelné z organizmu.
Nedávno bylo popsáno, že HPMA polymer může sloužit jako nosič několika scFv řetězců antiCD20 a díky své multivalenci může způsobovat apoptózu CD20 pozitivních buněk (Kopeček J. Adv. Drug Delivery Rev. 2013, 65,49-59). Tento koncept byl popsánjako „drug-free therapeutics“ (terapeutika bez léčiv) a v USA nyní probíhají jeho zkoušky. Základem pro účinnost tohoto systému je multivalence polymem daná již samotnou strukturou použitého polymeru.
-1 CZ 2020 - 132 A3
Galektin-3 (Gal-3) je lektin patřící do rodiny galektinů - proteinů vážících glykany s terminálním β-galaktosidem. V současné době je tomuto galektinů věnována značná pozornost s ohledem na jeho významný vliv na procesy ovlivňující nádorové bujení, jako je vznik metastáz, překonání imunitní odpovědi organizmu, mRNA splicing, genová exprese, apoptóza a vznik zánětu. Gal-3 je exprimován řadou nádorových tkání a buněk, a to jak intracelulámě, tak extracelulámě, kdy je jednak asociován s glykostrukturami na povrchu buněk, jednak je uvolňován do mezibuněčného prostředí. Zvýšená exprese Gal-3 v nádorových tkáních (Thijssen V. L. et al. Biochim. Biophys. Acta 2015, 1855, 235-247) vede k zhoršené prognóze vývoje onemocnění a zvýšenému riziku vzniku metastáz. Dále byla prokázána klíčová role extracelulámího Gal-3 produkovaného do nádorového mikroprostředí při potlačení imunitní odpovědi T buněk proti nádorovým buňkám a snížení funkce NK buněk, což následně vede k rozšíření nádorového bujení a vzniku metastáz. Bylo prokázáno, že inhibice extracelulámího Gal-3 vede k ochraně T buněk imunitního systému proti apoptóze vyvolané Gal-3.
Gal-3 produkovaný nádorovými buňkami může být lokalizován především v jádře, v cytoplazmě a na membráně. Extracelulámí Gal-3 je produkován do mikroprostředí nádoru a rovněž krví do celého těla. Zvýšená přítomnost Gal-3 je v přímé korelaci s horší prognózou vývoje nádorového onemocnění např. v případě nádorů štítné žlázy, některých nádorů tlustého střeva, hlavy a krku nebo nádorů mozku. Jedním z důvodů může být vliv volného Gal-3 na apoptózu protinádorových T lymfocytů. Gal-3 může díky své zvýšené expresi v nádorové tkáni sloužit jako terapeutický marker a současně terapeutický cíl. Také jeho přítomnost v krevním řečišti či mikronádorovém prostředí může být sledována s ohledem na vývoj nádorového onemocnění; ovlivnění hladiny volného Gal-3 může ovlivnit efektivitu protinádorové imunitní odpovědi (Sano H. et al. J. Immunol. 2000, 165 (4), 2156-2164, GuhaP. PNAS 2013, 110 (13), 5052-5057).
V posledních letech byly intenzivně studovány různé modifikace základních sacharidových ligandů galektinů - galaktosy, laktosy (Gaip4Glc) nebo A-acctylIaktosaminu (Gaip4GlcNAc) - a vliv těchto modifikací na afinitu připravených glykomimetik k jednotlivým galektinům, zvláště pak biomedicínsky nejvíce studovaným galektinů-1 a -3. Vnesení aromatické skupiny na C-3 mateřského galaktosového zbytku bylo demonstrováno jako nejvýhodnější pro zvýšení afinity ke galektinům. Strukturní analogy JV-acetyllaktosaminu a thiodigalaktosidů (TDG; Gaipi-ipGal) se vyprofilovaly v rozsáhlou skupinu účinných glykomimetických inhibitorů galektinů odolných vůči enzymové degradaci in vivo, což je důležitým faktorem pro budoucí klinickou aplikaci. Byla popsána i multivalentní prezentace těchto glykomimetik na hovězím sérovém albuminu jako nosiči.
Kromě již uvedených sloučenin byla v literatuře popsána řada dalších sacharidů jako ligandů galektinů. Jedná se zvláště o struktury na bázi poly-V-acetyllaktosaminu. Tyto komplexní oligosacharidové struktury a další, jednodušší sacharidy na bázi laktosy, galaktosy či Nacetyllaktosaminu bez zmíněných substitucí byly též v minulosti vystaveny v multivalentní prezentaci na řadě nosičů, jako např. na peptidech, polymerech, oligonukleotidech, fúllerenech a kalixarenech, i na dendrimerech a nanočásticích. Multivalentní prezentace často výrazně zvýšila nízkou afinitu monovalentního sacharidu. I když byly v některých případech demonstrovány vysoké afinity ke galektinům metodou ELISA, jednalo se vždy pouze o modelový systém, který nelze použít pro in vivo aplikace. Žádný z dosud připravených multivalentních nosičů nenabízí unikátní kombinaci vlastností glykopolymerů podle předkládaného vynálezu (konkrétně dobrou definovatelnost a reprodukovatelnost přípravy, biokompatibilitu, stabilitu in vivo a výhodnou farmakokinetiku).
HPMA polymery nesoucí protirakovinné léčivo doxorubicin a kovalentně navázané jednoduché mono- a disacharidy (laktosa, galaktosa, galaktosamin) byly v minulosti studovány (David A. Pharmaceut. Res. 2002, 19, 1114-1122; David A. et al. Eur. J. Cancer 2004, 40, 148-157) pro možnost aktivního cílení do buněk vybraných rakovinných linií, z nichž některé exprimovaly Gal3. V popsaných případech nebylo uvažováno o účinku konjugátů na inhibici Gal-3 a korelace získaných výsledků s expresí Gal-3 na buňkách nebyla průkazná. V publikaci autorů tohoto
- 2 CZ 2020 - 132 A3 vynálezu (Bojarová P. et al. J. Nanobiotechnol. 2018, 16, 73) byla syntetizována série HPMA konjugátů s jednoduchým disacharidem LacdiNAc a demonstrován jejich inhibiční účinek (IC50 v řádu μΜ) na Gal-3 ve stanovení ELISA. Předkládaný vynález si klade za cíl poskytnout glykopolymery se zlepšeným inhibičním účinkem na Gal-3, a při tom mající vhodné vlastnosti pro přípravu a aplikaci, které jsou nezbytnými podmínkami pro možnost praktického využití.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je struktura, syntéza a použití nového polymemího léčiva s dobře kontrolovatelným obsahem navázaných substituovaných sacharidů. Obsah navázaných substituovaných sacharidů se reguluje množstvím přidané sacharidové složky k polymemímu nosiči, protože je mu úměrný. Nové léčivo jeví prodlouženou farmakokinetiku a zvýšenou akumulaci v nádoru díky obsahu polymemí složky, a zároveň silnou inhibici galektinů.
Glykopolymery nesoucí substituované sacharidy podle tohoto vynálezu mají nejen vyšší afinitu ke Gal-3 ve vazebných testech typu ELISA než je tomu u glykopolymerů známých ze stavu techniky, ale především mají prokazatelně silnější účinek v biologických testech, jak je doloženo ve srovnávacím příkladu 26. Oproti nejbližšímu stavu techniky jsou tak jednoznačně účinnější na inhibici Gal-3, která má přímý dopad na protinádorovou imunitní odpověď a migraci nádorových buněk.
Na rozdíl od všech dříve připravených systémů jsou glykopolymery podle vynálezu jediným prostředkem s inhibičním účinkem vůči Gal-3, který lze použít in vivo pro terapii nádorového bujení, a to díky odpovídající farmakokinetice zajištěné polymemí složkou, biokompatibilitě, in vivo stabilitě, a dobré reprodukovatelnosti přípravy. V rámci tohoto vynálezu byl prokázán silný účinek připravených glykopolymerů nejen na potlačení indukce apoptózy u buněk imunitního systému, ale též dosud nedemonstrovaný účinek na potlačení migrace nádorových buněk. Oba tyto účinky mají přímý dopad na léčbu nádorů a potlačení metastatického procesu.
Jedním z důležitých znaků systému podle předkládaného vynálezu jsou polymemí řetězce tvořené inertním, nenabitým, s organizmem neinteragujícím vodorozpustným polymerem na bázi HPMA, který je využit jako multivalentní nosič pro navázání substituovaných sacharidů s cílem dosáhnout zvýšené interakce s lektiny, a též zlepšené farmakokinetiky nesených substituovaných sacharidů. V kombinaci se specifickými substituovanými sacharidy se pak dosahuje zde popsaných účinků.
Struktura glykopolymerů podle vynálezu vychází z polymemích nosičů na bázi HPMA polymerů, na které jsou kovalentně navázány substituované sacharidy, jejichž interakce s galektiny má díky polymemímu nosiči multivalentní charakter a dochází k aviditě při vazbě na zmíněné galektiny. Popsaná silná interakce s galektiny vede k samotnému biologickému účinku, který spočívá v několika bodech, a to v protektivním efektu na buňky imunitního systému proti apoptóze indukované Gal-3, dále v inhibici migrace nádorových buněk a stím spojené inhibici metastatického rozsevu.
Pod pojmem „léčivo“ se zde rozumí látka přímo mající léčebné účinky, nebo adjuvans, nebo imunomodulant.
Termínem „polymer“ jsou zde zahrnuty kopolymery i homopolymery. Zejména termínem „HPMA polymer“ je zahrnut jako HPMA kopolymer, tak HPMA homopolymer.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy glykopolymer obsahující polymemí nosič na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 mol. %
- strukturních jednotek vzorce I:
-3CZ 2020 - 132 A3
HN
I ‘ji
Linker
Substituovaný sacharid (I) kde
Y1 je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y1 může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé; Y1 je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující -CH2-CH2- a -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-;
Y2 je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;
Linker je vybrán ze skupiny zahrnující 1,2,3-triazolylen, (C1-C6 alkyl)-l,2,3-triazolylen; NH-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-; -NH-C(=S)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-; nebo k substituentu Y2 prostřednictvím skupiny -C(=O)- nebo jen kovalentní vazbou vázaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, přičemž tento cyklooktynyl či azacyklooktynyl je dále konjugovaný s triazolylem, (například tvořený 3,4,5,13tetrazatetracyklo[13.4.0.02,6.07,12]nonadeka-l(15),2(6),3,7(12),8,10,16,18-oktaen-13karbaldehydovým motivem);
Substituovaný sacharid je substituent odvozený od substituovaného sacharidu obecného vzorce III popsaného zde níže reakcí terminální aminové, azidové, alkynylové, aminoethylureidylové nebo aminoethylthioureidylové skupiny, přičemž skupiny vzniklé reakcí uvedených terminálních skupin jsou součástí Linkeru;
a/nebo
- koncových skupin řetězce HPMA polymeru majících vzorec -S-sukcinimid-(CH2)r-Linker-Subst. sacharid nebo -C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylen)-Linker-Subst. sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Subst. sacharid jsou definovány výše.
Přirozenými aminokyselinami jsou zde míněny přirozeně se vyskytující kyseliny: histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny.
Glykopolymer může kromě poly(HPMA) řetězců obsahovat také větvicí jednotky, například amidoaminové jednotky vhodné pro přípravu dendrimemích (hvězdicovitých) polymemích jader
-4CZ 2020 - 132 A3 poly(amidoaminu) (PAMAM), nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové jednotky vhodné pro tvorbu dendrimemích jader. Například může glykopolymer hvězdicové struktury obsahovat jádro z PAMAM a postranní řetězce z poly(HPMA), obsahující výše uvedené koncové skupiny a/nebo monomemí jednotky vzorce I.
Postup přípravy glykopolymerů podle předkládaného vynálezu obsahuje následující kroky:
a) polymeraci monomerů polymemího nosiče a případně větvicích jednotek,
b) volitelný krok polymer-analogických reakcí,
c) navázání substituovaného sacharidu.
Monomery zahrnují A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a methakryloyl(aminoacyl) estery, a popřípadě větvicí jednotky. HPMA je komerčně dostupný a jeho syntéza je publikována (např. Chytil P. etal. Eur. J. Pharm. Sci. 2010, 41 (3-4), 472-482). Komerčně dostupné monomery jsou dále například Λ'-aminocthylmcthakrylamid. A-aminopropylmethakrylamid, nebo jejich /Boc chráněné analogy.
Syntézu dalších funkcionalizovaných monomerů odvozených od HPMA lze popsat následovně. Funkcionalizované monomery, methakroylované sloučeniny, lze popsat obecným vzorcem II
O (Π), kde
Y1 je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y1 může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;
Y2 je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;
Y3 je vybrán ze skupiny zahrnující primární amin (NH2), /Boc substituovaný amin, azid, terminální alkynyl mající 2 až 8 atomů uhlíku, fenyl substituovaný alespoň jedním azidem nebo C2-C4 alkynylem; a cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, jako je například (ll,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl) nebo (IR,^S,9s)bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9-yl;, přičemž tento substituovaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl je vázán přes karbonylovou skupinu; -karbonyl-thiazolin-2-thionovou skupinu (TT), -karbonyl-4-nitrofenoxy skupinu, -karbonyl-2,3,4,5,6-pentafluorfenoxy skupinu, -karbonyl-sukcinimidylovou skupinu, a COOH skupinu; přičemž karbonyl je C(=O)- skupina.
Větvicí jednotky jsou obvykle komerčně dostupné, v některých případech jsou komerčně dostupná i větvená či hvězdicovitá jádra pro dendrimemí polymery.
-5CZ 2020 - 132 A3
Prvním krokem postupu podle vynálezu je krok a), tj. krok syntézy polymemích nosičů polymerací monomerů, popřípadě s větvícími jednotkami. Polymemí nosič obvykle obsahuje statistický polymer obsahující od 0,5 do 25 mol% monomemích jednotek obecného vzorce II a/nebo koncových jednotek hlavního polymemího řetězce popsaných výše, a alespoň 75 mol% (75 až 99,5 mol%) jiných jednotek, což zahrnuje monomemí jednotky odvozené od HPMA a popřípadě i větvicí jednotky. Polymerizace typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tercbutylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující 2-kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2-kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2kyano-2-propylethyltrithiokarbonát a 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu. Molámí hmotnost Mn takto připravených polymerů je v rozmezí od 4000 do 100 000 g/mol, s výhodou 20 000 až 50 000 g/mol.
Volitelně může být zahrnut i krok odstranění koncových skupin obsahujících síru z polymerů, pň jejichž přípravě bylo použito přenosové činidlo, ve kterém jsou tyto polymery reagovány s přebytkem azoiniciátoru ze skupiny iniciátorů polymerace popsaných výše. Polymemí nosič je pak zakončen zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru. Reakce typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C, a v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid.
Volitelným krokem b) je zavedení azidové či alkylové skupiny (i) reakcí Y3 skupiny na polymeru, pokud taje odstupující skupinou (tj. je vybraná z thiazolin-2-thionové skupiny (TT), 4-nitrofenoxy skupiny, 2,3,4,5,6-pentafluorfenoxy skupiny, sukcinimidylové skupiny, a OH skupiny), s aminosloučeninou (např. amino(Cl-C8 alkanem)) zakončenou skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 terminálním alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 3-amino-l-(l l,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)yl)propan-l-onem, či A-| (1 /?. 8.S'.9.s)-bicyklo 16.1,0]non-4-yn-9-ylmethyloxykarbonyl]-l,8diamino-3,6-dioxaoctanem; nebo (ii) reakcí Y3 skupiny na polymeru, pokud ta je primární aminoskupinou, s karboxy(Cl-C8 alkanem) zakončeným skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 6-(l l,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanovou kyselinou, či jejím A-hydroxysukcinimidyl esterem a (lR,8S,95)-bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9ylmethyl /V-sukcinimidyl karbonátem, nebo funkčními deriváty tohoto karboxyalkanu obsahujícími dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou. Tyto polymer-analogické reakce typicky probíhají při laboratorní teplotě v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol.
Jedno výhodné provedení polymemího nosiče je takové, že volitelně může dále obsahovat 0,5 až 12 mol% dalších strukturních jednotek odvozených od obecného vzorce II, kde Y1 a Y2 jsou jak je definováno výše, ale Y3 je vybrán ze skupiny tvořené karbonyl-hydrazono-(C12-C18 alkanonem), karbonyl-hydrazono-5a-cholestanonem, karbonyl-hydrazono-cholest-4-en-3-onem, případně jiným substituentem odvozeným od ketoderivátů cholesterolu; nebo je vybrán ze skupiny tvořené karbonyl-(C9-C15 alkoxy), karbonyl-cholesterylu, nebo jiných sloučenin odvozených od cholesterolu, např. 7-dehydrocholesterolu, či vitamínu D; nebo je vybrán ze skupiny tvořené karboxamido-(C10-C18 alkylem) a karbohydrazido-(C10-C 18 alkylem), nebo karboxamido-(C10C18 alkenylem) akarbohydrazido-(C10-C18 alkenylem), obsahujícím aspoň jednu dvojnou vazbu (C=C), s výhodou odvozené od kyseliny olejové, linolové, linoleové.
Polymemí nosič může obecně mít lineární, větvenou, nebo síťovanou strukturu.
-6CZ 2020 - 132 A3
V případě lineární struktury se obvykle jedná o polymemí nosič obsahující 0,5 až 25 mol% monomemích jednotek vzorce II a/nebo koncových jednotek popsaných výše, a alespoň 75 mol% HPMA monomemích jednotek.
V případě větvené nebo síťované struktury je obsaženo alespoň 75 mol% HPMA monomemích jednotek a větvicích jednotek.
V některých provedeních polymemího nosiče větvené struktury je jen část funkčních skupin vhodných pro vazbu substituovaných sacharidů rozmístěna podél polymemího řetězce, nebo dokonce nejsou monomery vzorce II obsaženy vůbec. Funkční skupiny vhodné pro vazbu substituovaných sacharidů, nebo alespoň jejich část, mohou mít formu koncových skupin umístěných na jednom konci polymemího řetězce HPMA polymeru, přičemž druhý konec polymemího řetězce je navázaný k multivalentní molekule, např. dendrimem, např. PAMAM dendrimemímu jádm nebo k jádru na bázi 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimem. Prvním krokem přípravy je v takových provedeních polymerizace HPMA, která typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100°C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufiry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, terc-butylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory AIBN, ACVA, V70, za přítomnosti přenosového činidla obsahujícího karboxylovou skupinu nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou; přenosové činidlo je s výhodou vybrané ze skupiny obsahující 4kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu, 1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3 -yljbutyl dithiobenzoát, 2-kyano-5 -oxo-5 -(2-thioxo-1,3 -thiazolidin-3 yl)pentan-2-yl ethylkarbontrithioát. V druhém kroku jsou polymery navázány amidovou vazbou k multivalentní sloučenině nesoucí koncové primární aminoskupiny, s výhodou tvořené poly(amidoaminovým) (PAMAM), nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionovým dendrimerem, přičemž reakce typicky probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Dendrimer může tvořit až 3 mol% obsahu výsledného polymemího konjugátu. Následně jsou in sítu zablokovány zbývající primární aminoskupiny nízkomolekulámí aminoreaktivní sloučeninou, s výhodou acetanhydridem. Ve třetím kroku jsou síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru buď redukovány borohydridem sodným a in situ dojde k adici SH skupin na/V-derivovaný maleimid, s výhodou propynylmaleimid či azido-PEG3-maleimid, přičemž reakce probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Popřípadě jsou síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru reagovány s přebytkem azoiniciátoru nesoucím karboxylovou skupinu, nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou, a to při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid. Molámí hmotnost M, takto připravených polymerů je v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, s výhodou 100 000 až 400 000 g/mol.
Finálním krokem c) přípravy je vazba substituovaného sacharidu vybraného ze skupiny sestávající ze substituovaných sacharidů obecného vzorce III:
(ΠΙ),
-7 CZ 2020 - 132 A3 kde kombinace U, V a W je vybrána z následujících možností lila, Illb, lile, Illd, lile:
ZOH
R’ (lila) lila: kde V a W je jen vazba, a kde U je Ι-ί/ηο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R4, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R1 a na atomu C-6 skupinou -OR6;
(Illb)
Illb: kde V a W je jen vazba a kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4;
lile: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4;
Illd: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4;
(lile) lile: kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3v a na
-8CZ 2020 - 132 A3 atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3w a na atomu C-l skupinou R4;
a kde
R1 je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou C1-C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C2-C5 alkynylem, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 azidoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou azidoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(ClC5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou aminoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 aminoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, sulfoskupinu, kumaryl, benzoyl a C2-C5 alkynyl;
X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,
Y je CH2 nebo vazba,
Z je O nebo [l,2,3]-triazol.
R2, R3u, R3v, R3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl,
R4 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, aminoskupinu, C2-C5 alkynyloxyskupinu, azid, C1-C5 azidoalkoxyskupinu, aminoethylthioureidyl, aminofenyloxyskupinu a azidofenyloxyskupinu,
R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-a-sialyl, C1-C5 azidoalkyl, C2-C5 alkynyl a C1-C5 aminoalkyl;
přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu koncovou aminoskupinu, azidoskupinu nebo C2-C5 alkynyl, a to s výhodou jako součást substituentu vybraného z R1, R5 nebo R6, pokud U je Ι-ίύ/ο-β-D-galaktopyranosyl, a s výhodou jako součást substituentu R4ve všech ostatních kombinacích;
a přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III není laktosa (Ga^4Glc), LacNAc (Ga^4GlcNAc) ani LacdiNAc (GalNAcE4GlcNAc).
Sacharid v substituentu R1 je s výhodou monosacharid, výhodněji 1 -O-a-D-galaktopyranosyl nebo 2-O-a-sialyl.
Pokud V a W je vazba a U je Ι-ίύ/ο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R4, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R1 a na atomu C-6 skupinou -OR6 (varianta lila), s výhodou R2 je hydroxy skupina a R4 je také hydroxyskupina.
Pokud V a W je vazba a U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4 (varianta Illb), s výhodou R2 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu a acetamidoskupinu a R3u je acetamidoskupina.
Pokud V a W je vazba a U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4 (varianta IIIc), s výhodou R2 je hydroxyskupina a R3u je acetamidoskupina.
-9CZ 2020 - 132 A3
Pokud V a W je vazba a U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l skupinou R4 (varianta Illd), s výhodou R2 je hydroxyskupina aR3u je acetamidoskupina.
Pokud U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3v a na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R3w a na atomu C-l skupinou R4 (varianta lile), s výhodou R2, R3v a R3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu a acetamidoskupinu a R3u je acetamidoskupina.
Substituované sacharidy se k polymemímu nosiči navazují buď amidovou vazbou, nebo azidalkynovou cykloadicí, tzv. „click“ reakcí (za tvorby Linkeru ze skupiny Y3 a ze substituentu na substituovaném sacharidu obsahujícího terminální aminové, azidové, alkynylové, nebo aminoethylthioureidylové skupiny, typicky substituentu R1 nebo R4 nebo R5 nebo R6). Aminolytická reakce typicky probíhá v aprotickém rozpouštědle, s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid. Cykloadiční reakce je s výhodou katalyzovaná, s výhodou měďnými ionty, nebo může být nekatalyzovaná. Reakce typicky probíhá ve vodě, případně ve směsných rozpouštědlech tvořených vodou, vodnými pufry, alkoholy, aprotickým rozpouštědlem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid, případně jejich směsi. V případě cykloadiční reakce katalyzované mědí obsahuje reakční směs měďné či měďnaté kationty s výhodou díky přítomnosti CuSO4 nebo CuBr, a redukční činidlo, s výhodou kyselinu askorbovou nebo askorbát sodný. Ve všech případech je výhodné využít čištění pomocí gelové filtrace na koloně (např. s náplní Sephadex G-25) ve vodě a případně další čištění od kationtů mědi, s výhodou pomocí komplexace s 8-chinolinolem, a následného čištění na koloně (např. Sephadex LH-20) s methanolem jako mobilní fází.
Důležitým přínosem vynálezu je vhodná prezentace substituovaného sacharidu na polymemím nosiči, přičemž jeho obsah v glykopolymeru tvoří 0,5 až 25 mol%, s výhodou 3 až 18 mol%. Multivalentní uspořádání substituovaných sacharidů na polymerech umožňuje multivalentní interakci s Gal-3, a tím významně navyšuje vazebnou aktivitu ke Gal-3 a obecně ke galektinům.
Předmětem vynálezu je dále imunomodulační účinek polymemích konjugátů se substituovanými sacharidy díky vazbě ke Gal-3 výše popsanou multivalentní interakcí. Aplikací polymemích nosičů se sacharidy dochází k vyvázání extracelulámího Gal-3 v nádorové tkáni, a tím k inhibici Gal-3 indukované apoptózy T lymfocytů v nádoru, což umožní navýšení imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám přímo v nádoru. Vazba polymemích nosičů s navázanými substituovanými sacharidy na Gal-3 přímo produkovaný nádorovými buňkami dále vede ke snížení migrace nádorových buněk. Vzhledem ktomu, že Gal-3 v některých typech nádorových buněk zvyšuje pravděpodobnost vzniku metastáz prostřednictvím inhibice vazby buněk k podkladu a buněk vzájemně mezi sebou, vede aplikace polymemích konjugátů se substituovanými sacharidy prostřednictvím vazby na Gal-3 ke snížení možnosti migrace buněk do metastatických ložisek a snížení jejich motility.
Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, která se vyznačuje tím, že obsahuje glykopolymer podle vynálezu obsahující aktivní substituovaný sacharid a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku vybranou ze skupiny zahrnující plniva, antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty.
Předmětem vynálezu je glykopolymer podle vynálezu a/nebo jeho farmaceutická kompozice pro použití jako léčivo k léčbě pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukemie, zejména kolorektálního karcinomu, karcinomu prostaty, karcinomu prsu, melanomu, lymfomu, leukemie.
-10CZ 2020 - 132 A3
Předmětem vynálezu je rovněž glykopolymer podle vynálezu a/nebo jeho farmaceutická kompozice pro použití jako adjuvancium při protinádorové terapii.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu Pllb (obsah substituovaného sacharidu 20 byl 4,9 mol%).
Obr. 2: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu Plld (obsah substituovaného sacharidu 20 byl 9,7 mol%).
Obr. 3: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P13a (obsah substituovaného sacharidu 9 byl 5,1 mol%).
Obr. 4: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P13b (obsah substituovaného sacharidu 9 byl 8,9 mol%).
Obr. 5: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu HPMA s jednoduchým disacharidem LacdiNAc (obsah LacdiNAc byl 12,3 mol%).
Obr. 6: Inhibice migrace a proliferace myších (4T1, B16-F10) a lidských (DLD-1) nádorových buněk pomocí konjugátů Pila a Plic.
Seznam zkratek
ACVA, 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina); AIBN, 2'-azobis(2-methylpropionitril); Gal-3, galektin-3; HPMA, /V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid; MA-AP-TT, 3-(3methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion; MA-propynyl, 2-methyl-A-(prop-2-yn-1 -yljprop2-enamid; 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion; MA skupina, /V-methakryloyl skupina; /Boc skupina, terc-butoxykarbonylová skupina; TT skupina, thiazolin-2-thionová skupina; TBAB, tetra-n-butylamoniumbromid; THPTA, trishydroxypropyltriazolylmethylaminový ligand; V70, 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4dimethylpentannitril); LacdiNAc (GalNAcP4GlcNAc); LacNAc (Gaip4GlcNAc); laktosa (Gaip4Glc), 4T1 (buněčná linie myšího nádoru prsu); B16-F10 (buněčná linie myšího kožního melanomu); CT26 (buněčná linie myšího kolorektálního karcinomu); DLD-1 (buněčná linie lidského kolorektálního adenokarcinomu); HEK293 (linie lidských embryonálních buněk z ledvin); HT-29 (buněčná linie lidského kolorektálního adenokarcinomu); Jurkat (imortalizovaná buněčná linie T lymfocytů); LNCaP (buněčná linie lidského adenokarcinomu prostaty); OVCAR3 (buněčná linie lidského adenokarcinomu vaječníků); PC3 (buněčná linie lidského adenokarcinomu prostaty); Ráji (lidská buněčná linie Burkittova lymfomu); SU-DHL-5 (buněčná linie lidského B-lymfomu); SU-DHL-6 (buněčná linie lidského B-lymfomu);
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů /V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA)
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu (Chytil P. et al. Eur. J. Pharm. Sci 2010, 41 (3-4), 473-482). Produkt byl chromatograficky čistý. Ή-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 296 K): δ 1,00-1,02 (d, 3H, CHOH-CH3), 1,85 (s, 3H, CH3), 3,00-3,12 (m, 2H, CH2), 3,64-3,73 (m, 1H, CH), 4,68-4,70 (d, 1H, OH), 5,30 a 5,66 (d, 2H, CH2=), 7,59 (br, 1H, NH).
-11 CZ 2020 - 132 A3 /V-Methakryloylpropynylamin (MA-propynylamin) byl připraven podle dříve popsaného postupu. (Lynn G.M. et al., Biomacromolecules, 2019, 20 (2), 854-870) Produkt byl chromatograficky čistý. Ή-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 296 K): δ 1,85 (s, 3H, CH3), 3,05 (s, 1H, =CH), 3,88 (d, 2H, -CH2-), 5,37 a 5,68 (d, 2H, =CH2), 8,37 (s, 1H, NH).
3-(3-Methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (MA-AP-TT)
MA-AP-TT byl připraven podle dříve popsaného postupu (Subr V. et al. Biomacromolecules 2006, 7 (1), 122-130). Produkt byl chromatograficky čistý. Ή-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 295 K): δ 1,20-1,27 (m, 2H, CH2-y), 1,40-1,54 (m, 4H, €Ή2-β. CH2-b), 1,82 (s, 3H, CH3), 2,28 (t, 2H, CH2a), 3,04-3,34 (m, 2H, CH2-s), 3,57 (s, 3H, OCH3), 5,28 a 5,60 (d, 2H, CH2=), 7,88 (br, 1H, NH).
Příklad 2: Syntéza statistického kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AP-TT) radikálovou polymerací (Pl)
833 mg HPMA (5,82 mmol), 167 mg MA-AP-TT (0,646 mmol) a AIBN (160 mg; 0,974 mmol) byly rozpuštěny v 6,2 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostatované na 60 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 850 mg, 85 %; molámí hmotnosti Mw = 23 900 g/mol, Ma = 12 100 g/mol, D = 1,98.
Příklad 3: Syntéza statistického kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AP-TT) řízenou RAFT radikálovou polymerací (P2)
800 mg HPMA (5,59 mmol) bylo rozpuštěno v 5,52 mL terc-butyl alkoholu a smícháno s roztokem 160 mg MA-AP-TT (0,621 mmol), 4.97 mg AIBN (17,7 pmol) a 7,84 mg 2-kyanopropan-2-yl dithioátu (35,5 pmol) v 1,38 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 16 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a
-12 CZ 2020 - 132 A3 sušením pod vakuem. Výtěžek 730 mg, 76 %; molámí hmotnosti Mw = 22 900 g/mol, Mn = 20 600 g/mol, D = 1,11.
Příklad 4: Odstranění koncových skupin na polymeru pocházejících z přenosového činidla
700 mg polymeru P2 nesoucího koncové dithiobenzoátové skupiny a 70 mg iniciátoru AIBN bylo rozpuštěno v 5 mL dimethylsulfoxidu, probubláno argonem a zataveno ve skleněné ampuli. Po 2 h ve vodní lázni termostatované na 80 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek polymeru byl 621 mg.
Příklad 5: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-propynyl) řízenou RAFT radikálovou polymerací (P3)
264 mg HPMA (1,84 mmol) a 12 mg A-methakryloylpropynylaminu (MA-propynyl) (97,0 pmol) bylo rozpuštěno v 1,3 mL destilované vody a smícháno s roztokem 1,3 mg ACVA (4,7 pmol) a 2,6 mg 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanové kyseliny (9,5 pmol) v 0,65 mL dioxanu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 7 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a zcentrifugován. Čištění probíhalo gelovou filtrací s použitím kolony s náplní Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl získán srážením do diethyletheru, filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 127 mg, 46 %; molámí hmotnosti Mv = 22 900 g/mol, = 20 600 g/mol, D = 1,11.
Příklad 6: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-propynyl) konjugací propynylaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P4)
600 mg polymemího prekurzoru (obsahujícího 0,54 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 6 mL dimethylformamidu a za míchání při laboratorní teplotě bylo k roztoku přidáno 40 pL propynylaminu (0,65 mmol) a 108 pL A-ethyldiisopropylaminu (0,65 mmol). Reakce probíhala 16 h při laboratorní teplotě. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL), filtrací a sušením. Výtěžek: 560 mg; molámí hmotnosti: = 21 800 g/mol, Mn = 20 200 g/mol, D = 1,08.
-13 CZ 2020 - 132 A3
Příklad 7: Syntéza hvězdicového kopolymeru obsahující PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-propynylem (P5)
HO—ξ
500 mg HPMA (3,49 mmol) bylo rozpuštěno v 3,4 mL terc-butylaikoholil a smícháno s roztokem 2,8 mg 2-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxo-thiazolidin-3-yl)-butylazo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)-pentannitrilu (5,4 pmol) a 4,4 mg 1-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3-yl)butylesteru dithiobenzoové kyseliny (10,7 pmol) v 0,85 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek: 345 mg, 69 %; molámí hmotnosti: M„ = 29 800 g/mol, Mn = 27 100 g/mol, D = 1,10.
340 mg polymemího prekurzoru (obsahujícího 11,2 pmol koncových TT skupin) bylo rozpuštěno v 2,2 mL dimethylsulfoxidu a přidáno k 20 hmotn% methanolovému roztoku 1,5 mg PAMAM dendrimeru (1,4 pmol dendrimeru G2 s diaminobutanovým jádrem). Po 1,5 h míchání při laboratorní teplotě byla reakce zastavena přidáním 50 pL acetanhydridu. Polymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL), následně filtrací a sušením. Výtěžek konjugační reakce byl 85 % hvězdicového kopolymeru.
100 mg hvězdicového polymemího prekurzoru bylo rozpuštěno v 1 mL methanolu. Do míchaného roztoku polymeru bylo přisypáno 10 mg práškového borohydridu sodného. Po 1 h míchání při laboratorní teplotě bylo in sítu přidáno 10 mg propynylmaleimidu rozpuštěného v 0,2 mL methanolu. Po 1 h reakce byl polymer čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (25 mL), následovně filtrací a sušením. Molámí hmotnosti: Mw = 210 000 g/mol, D = 1,19. Obdobným způsobem byly připraveny vzorky využívající jako jádro 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer.
Příklad 8: Syntéza hvězdicového kopolymeru obsahující PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-TT (P6)
-14CZ 2020 - 132 A3
500 mg HPMA (3,49 mmol) bylo rozpuštěno v 3,4 mL terc-butylaikoholil a smícháno s roztokem 2,8 mg 2-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxo-thiazolidin-3-yl)-butylazo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)-pentannitril (5,4 pmol) a 4,4 mg 1-kyano-l -methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3-yl)butylesteru dithiobenzoové kyseliny (10,7 pmol) v 0,85 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek: 345 mg, 69 %; Molámí hmotnosti: Mw = 29 800 g/mol, ΜΆ = 27 100 g/mol, D = 1,10.
340 mg polymemího prekurzoru (obsahujícího 11,2 pmol koncových TT skupin) bylo rozpuštěno v 2,2 mL dimethylsulfoxidu a přidáno k 20 hmotn% methanolového roztoku 1,5 mg PAMAM dendrimem (1,4 pmol dendrimer G2 s diaminobutanovým jádrem). Po 1,5 h míchání při laboratorní teplotě byla reakce zastavena přidáním 50 pL acetanhydridu. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL), následován filtrací a sušením. Výtěžek konjugační reakce byl 85 % hvězdicového kopolymem.
100 mg hvězdicového polymemího prekurzoru a 10 mg 2-[ 1-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3 -yl)-butylazo] -2-methyl-5 -oxo-5 -(2-thioxothiazolidin-3 -yl)-pentannitrilu bylo rozpuštěno v 0,7 mL dimethylsulfoxidu, probubláno argonem a zataveno ve skleněné ampuli. Po 3 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (25 mL) a přesrážen z methanolu (1 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 25 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Molámí hmotnosti: Mw = 205 000 g/mol, D = 1,20. Obdobným způsobem byly připraveny vzorky využívající jako jádro 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer.
Příklad 9: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-azadihenzocyklooktyn) konjugací azadibenzocyklooktynaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P7)
-15 CZ 2020 - 132 A3
200 mg polymemího prekurzoru (obsahujícího 0,11 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 2 mL dimethylformamidu a za míchání při laboratorní teplotě bylo k roztoku přidáno 32 mg azadibenzocyklooktynaminu (0,12 mmol) rozpuštěného v 0,1 mL dimethylformamidu a 22 pL Nethyldiisopropylaminu (0,13 mmol). Reakce probíhala 16 h při laboratorní teplotě. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (50 mL), následován filtrací a sušením. Výtěžek: 184 mg; Molámí hmotnosti: M„ = 28 000 g/mol, Mn = 25 200 g/mol, D = 1.11.
Příklad 10: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-propylazid) konjugací 3azido-l-propylaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P8)
HN
300 mg polymemího prekurzoru P2 bylo rozpuštěno v 3,5 mL methanolu a za míchání při lab.t. přidáno 40 pL 3-azido-l-propylaminu (0,40 mmol). Po 30 min bylo do reakční směsi přikapáno pomalu 92 pL/V-ethyldiisopropylaminu (0,53 mmol). Po 20 h reakce při lab.t. bylo přidáno 40 pL l-aminopropan-2-olu (0,29 mmol) a mícháno dalších 30 min. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (50 mL), následován filtrací a sušením. Výtěžek: 234 mg; Molámí hmotnosti: A/w = 23 700 g/mol,Mn = 21 100g/mol, D = 1.1; obsah azidových skupin 16,7 mol%.
Příklad 11: Syntéza 3'-O-[4-(azidomethyl)benzyl]-β-D-galaktopyranosyl-(l^·l)-3-O-(4-{[4(brommethyl)-\H-1,2,3-triazol-1 -yl | methyl [ benzyl)-1 -thίο-β-D-galaktopyranosidu (3)
-16 CZ 2020 - 132 A3
Výchozí látka P-D-galaktopyranosyl)-(l^l)-l-thio-P-D-galaktopyranosid (1) reagovala v přítomnosti dibutylcínoxidu (BiuSnO) s nadbytkem bromidu za vzniku selektivně C-3, C-3’ 5 disubstituované sloučeniny 2. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu tetra-n-butylamoniumbromidu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 - 84 °C). Následně byla pomocí cykloadiční click reakce terminální azidové funkční skupiny a alkynové skupiny propynylbromidu (0.5 eq.) za katalýzy Cu(I) v přítomnosti trishydroxypropyltriazolylmethylaminového ligandu (THPTA) připravena sloučenina 3.
Příklad 12: Syntéza 2-azidoethyl-3-O-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-P-D-galaktopyranosyl(1 ->4)-2-acetamido-2-deoxy- β-D-glukopyranosidu (7)
-17 CZ 2020 - 132 A3
TSA8
BujSnO DI PEA benzylbrom id suchý dioxan 24h, 84*0
Disacharid 6 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru 2-azidoethyl-2-acetamido-2deoxy-P-D-glukopyranosidu (5) a donoru y>-nitrofenyl-2-acetamido-2-deoxy-P-D5 galaktopyranosidu (4) za katalýzy mutantni Tyr470His β-řV-acetylhexosaminidasou z Talaromyces flavus (Tyr470His 7/Hcx) (Bojarová P. et al. J Nanobiotechnol. 2018, 16, 73). Benzyl byl selektivně vnesen na C'-3 reakcí 6 s benzylbromidem v přítomnosti dibutylcinoxidu (Bu2SnO) za vzniku substituovaného sacharidu 7.
io Příklad 13: Syntéza 3-O-propynyl^-D-galaktopyranosyl-(l^l)-3-O-[(4-bromfenyl)-lH-(l,2,3triazol-4-yl)methyl]^-D-galaktopyranosidu (9)
-18 CZ 2020 - 132 A3
W
BiijSiiO s uch ý iisisxan 2< 82 - S^C
CsiSOj L-ask®fbáS seíný TH PTA p-azlásphss^bfsmšd
P&utylatohcl!^;<G flřť? 24T, _-4
Výchozí látka P-D-galaktopyranosyl)-(l^l)-l-í/no-p-D-galaktopyranosid (1) reagovala v přítomnosti cínového komplexu (Bu2SnO) s nadbytkem propynylbromidu za vzniku selektivně C5 3, C-3’ disubstituované sloučeniny 8. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 - 94 °C). Druhý reakční krok založený na Cu(I)-katalýzováné azid-alkynové cykloadici 4-bromfenylazidu za katalýzy THPTA byl proveden ve směsi terc-butylalkoholu a vody za vzniku sloučeniny 9.
ίο Příklad 14: Syntéza 2-aminoethylthioureidyl-3-O-[(4-bromfenyl)-IH-( 1,2,3-triazol-4-yl)methyl]P-D-galaktopyranosyl-(l^-3)-2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosidu (15)
-19 CZ 2020 - 132 A3
TSAg
IW&rO sarapsfgyí&ramšá
5L«Sny dio.xari
S2 · «'C
V
: A^důíŠíšňýibř^ i CySOj.. Lx3;tob& ss&iy THPTA
[ MiuíylašksbsSHgC (1 <1Š
u
11« HCl
6.. 3’ C
Výchozí disacharid 12 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru (tercbutoxykarbonylamino)ethylthioureidyl-2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosidu (11) (Bojarová P. et al. Molecules 2019, 24, 599) a donorup-nitrofenyl-P-D-galaktopyranosidu (10) za katalýzy rekombinantní p3-galaktosidasou z Bacillus circulans. Disacharid 12 reagoval v přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu2SnO) s nadbytkem propynylbromidu za vzniku selektivně C-3' substituované sloučeniny 13. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 - 94 °C). Následný reakční krok založený na to Cu(I)-katalyzované cykloadici mezi terminálním alkynem 13 a p-azidofenylbromidem v přítomnosti THPTA byl proveden ve směsi terc-butylalkoholu a vody za vzniku sloučeniny 14.
-20CZ 2020 - 132 A3
Následné odchránění aminoskupiny za vzniku sloučeniny 15 proběhlo v IM HC1 při 4 °C po dobu 48 h.
Příklad 15: Syntéza β-D-GalNAc-i I^4)T-d-GIcNAc-( l^3)T-D-Gal-( I^4)T-d-GIcNAc-I-O(2-aminoethylthioureidyl) (LacdiNAc-LacNAc-linker-NH2; 20)
2SS
Výchozí disacharid 16 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru (tercbutoxykarbonylamino)ethylthioureidyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosidu (11) (Bojarová P. et al. Molecules 2019, 24, 599) a donorup-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosidu (10) za katalýzy rekombinantní β4-galaktosidasou z Bacillus circulans. Disacharid 16 byl použit jako akceptor pro glykosylaci β-D-GlcNAc jednotkou za katalýzy rekombinantní β-Αacetylhexosaminidasou Bbhl z Bifidobacterium bifidum, selektivní pro tvorbu β(1—>3) vazby. Vzniklý trisacharid 18 byl dále použit jako akceptor pro glykosylaci β-D-GalNAc za katalýzy selektivní mutantní β-A-acetylhexosaminidasou z Talaromyces flavus za vzniku tetrasacharidu 19. Následné odchránění aminoskupiny u tetrasacharidu 19 za vzniku sloučeniny 20 proběhlo v 1M HC1 při 4 °C po dobu 48 h. Alternativně je možné tuto sloučeninu připravit pomocí rekombinantních glykosyltransferas dle postupů popsaných v literatuře (Laaf D. et al. Bioconjug. Chem. 2017, 28,2832-2840).
Příklad 16: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 15 spoly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P9)
- 21 CZ 2020 - 132 A3
mg polymeru P2 (obsahujícího 14,6 pmol TT skupin) a 9,2 mg sloučeniny 15 (13,1 pmol) bylo rozpuštěno v 0,8 mL dimethylacetamidu a probubláno argonem. Po přídavku 2,3 pL Nethyldiisopropylaminu (13,1 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,1 pl l-aminopropan-2-olu (14,6 pmol) a ponecháno reagovat 1 h. Polymemí konjugát byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymemí konjugát byl izolován lyofilizo váním. Výtěžek: 25,4 mg; 83,4 %; Molámí hmotnosti: Mw = 25400 g/mol, Ma = 23600 g/mol, D = 1,08; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 5,0 mol%.
Příklad 17: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 3 s poly(HPMA-co-MA-APpropynyl)em (P10)
Ke 2 mg CuSO4 5H2O (16 pmol) rozpuštěným v 25 pL vody bylo přidáno k roztoku 25 mg poZy(HPMA-co-MA-AP-propynylu), P4, (17,4 pmol propynylových skupin), 1,6 mg askorbátu sodného (16,2 pmol) a 12,9 mg sloučeniny 3 (16,2 pmol) rozpuštěných v 225 pL vody. Reakční směs byla probublána argonem před a po přídavku síranu měďnatého a míchána 1 h při laboratorní teplotě. Poté byl roztok naředěn 1 mL 5% roztoku disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny, polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25 ve vodě a lyofilizován. Konjugát byl rozpuštěn ve 2 mL methanolu a přidán nadbytek 8-chinolinolu. Po 20 min byl vzorek
- 22 CZ 2020 - 132 A3 čištěn od zbytkové mědi gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Po odpaření rozpouštědla byl polymer rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Výtěžek: 29,4 mg; 84,0%; Molámí hmotnosti: A/w = 27 500 g/mol, Ma = 25 200 g/mol, D = 1,09; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 9,8 mol%.
Příklad 18: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 20 spoly(HPMA-co-MA-AP-TT) (Pil)
HN
Polymemí konjugát Pil byl připraven s různým obsahem cukerné složky. 20 mg polymeru P2 (obsahujícího 16,4 pmol TT skupin) a 2,7 mg substituovaného sacharidu 20 (3,0 pmol) v případě přípravy Pila, 5,3 mg substituovaného sacharidu 20 (5,9 pmol) v případě přípravy Pllb, 9,1 mg substituovaného sacharidu 20 (10,2 pmol) v případě přípravy Plic, nebo 10,3 mg substituovaného sacharidu 20 (11,2 pmol) v případě přípravy Plld bylo rozpuštěno v 1,2 mL směsi dimethylacetamidu se suchým methanolem (3:1) a probubláno argonem. Po přídavku 0,8 pL Nethyldiisopropylaminu (4,8 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,5 pl l-aminopropan-2-olu (20 pmol) a ponecháno reagovat 0,5 h. Polymemí konjugát byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymemí konjugát byl izolován lyofilizací. Charakteristiky jsou uvedeny v Tabulce 1.
Tabulka 1. Charakteristika připravených glykopolymerů nesoucích substituovaný sacharid 20
Název konjugátu Výtěžek reakce (%) Obsah cukerné složky (mol%)* (g/mol) t (g/mol) t
Pila 88 2,6 22500 21700 1,04
Pllb 90 4,9 24500 22400 1,09
Plic 91 7,2 28300 27300 1,03
Plld 90 9,7 28200 26300 1,07
* Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí Ή-NMR.
tMolámí hmotnosti a disperzita byly stanoveny pomocí GPC, jak je uvedeno v Příkladu 21.
Příklad 19: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 7 s poly(HPMA-co-MA-APazadibenzocyklooktynem) (P12)
- 23 CZ 2020 - 132 A3
mg poZy(HPMA-co-MA-AP-azadibenzocyklooktynu), P7, (8,9 pmol azadibenzocyklooktynových skupin) bylo rozpuštěno v 300 pL methanolu, smícháno s roztokem 5 6,3 mg substituovaného sacharidu 7 (11,0 pmol) v 200 pL methanolu a probubláno argonem. Po h míchání při laboratorní teplotě byl polymemí konjugát čištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zakoncentrována na vakuu na 1 mL a polymer byl izolován precipitací do nadbytku ethylacetátu (40 mL) a filtrací následovanou sušením do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 24,7 mg; 80,1%; Molámí hmotnosti: Mw = 30 800 g/mol, A/ = ίο 28 000 g/mol, D = 1,10; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 5,1 mol%.
Příklad 20: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 9 s poly(HPMA-co-MA-AP-
Polymemí konjugát P13 byl připraven s různým obsahem cukerné složky. 15 mg polymemího prekurzom P8 bylo rozpuštěno v 150 pL dimethylformamidu a smícháno s 3,54 mg (5.6 pmol),
-24CZ 2020 - 132 A3 nebo 6,3 mg (9,9 μιηοΐ) substituovaného sacharidu 9 v 300 dimethylformamidu pro přípravu P13a, či P13b, resp. Poté bylo přidáno 0,88 mg (6,2 pmol), nebo 2,42 mg (12,9 pmol) CuBr v případě P13a, či P13b, resp., a mícháno při lab.t. Po 20 h byl přidán nadbytek 8-chinolinolu, roztok byl míchán dalších 30 min a naředěn 2 mL methanolu. Polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Frakce obsahující polymer byla odpařena, produkt rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. P13a: Výtěžek: 15,3 mg; molámí hmotnosti: A/w = 28 600 g/mol, ΜΆ = 25 900 g/mol, D = 1,L obsah cukerné složky v konjugátu byl 4,5 mol%. P13b: Výtěžek: 17,4 mg; molámí hmotnosti: A/w = 30 600 g/mol, Mn = 28 100 g/mol, D = 1,L obsah cukerné složky v konjugátu byl 8,9 mol%.
Příklad 21: Příklad charakterizace polymerních prekurzorů a konjugátu
Připravené kopolymery, polymemí prekurzory i jejich konjugáty se substituovanými sacharidy byly charakterizovány stanovením váhového i početního průměru molámích hmotností (A/w, Mj) a příslušného indexu disperzity (£>) pomocí gelové permeační chromatografie (GPC) na systému vybaveném UV detektorem (Shimadzu, Japan), RI detektorem (Optilab REX, Wyatt Technology Corp., USA) a víceúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN Heleos-II, Wyatt Technology Corp., USA). Pro charakterizaci byla v případě SEC použita kolona TSK 3000 Super SW a jako mobilní fáze směs MeOH (80 %) a 0,3 M octanového pufru o pH 6,5 (20 %). Koncentrace vzorků byla ve všech případech 3 mg/ml.
Obsah TT skupin byl stanoven spektrofotometricky na UV-VIS spektrofotometm Specord 205 (Analytik Jena, Německo) v methanolu (ssos = 10 800 L.mol fcm1) podle literatury (Subr V. et al. Biomacromolecules 2006, 7 (1), 122-130).
Obsah trojných vazeb a konjugovaných substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) na spektrometm Bmker Avance III 600 MHz ve vodě.
Příklad 22: ELISA
Afinita Gal-3 k substituovaným sacharidům a jejich konjugátům s polymery byla stanovena za použití kompetitivního ELISA stanovení (Bojarová P. et al. J Nanobiotechnol. 2018, 16, 73; Bumba L. et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 372). Toto stanovení dává předběžnou informaci o síle vazby Gal-3 na glykokopolymery, ale je třeba jej brát pouze jako orientační pomůcku a vzít v úvahu zvláště biologický účinek glykopolymerů (viz Příklady 25-27). V jamkách mikrotitračních destičkových modulů F16 Maxisorp NUNC-Immuno Modules (Thermo Scientific, Roskilde, Dánsko) byl imobilizován přes noc asialofetuin (Sigma Aldrich, Steinheim, Německo; 0,1 μΜ v PBS pufru, 50 pL, 5 pmol na jamku). Jamky byly následně vyblokovány BSA (2 % w/v) rozpuštěném v PBS (1 h, lab.t.). Posléze byla do jamek přidána směs testované sloučeniny v různých koncentracích a Gal-3 (celkový objem 50 pL; 4.5 pM finální koncentrace Gal-3) a inkubovány po dobu 2 hodin. Detekce navázaného Gal-3 byla provedena pomocí monoklonální anti-Hise-IgGl myší protilátky konjugované s křenovou peroxidasou (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo) rozpuštěné v PBS pufru (1:1000, 50 pL, 1 h, lab.t.). Substrátový roztok TMB One (Kem-En-Tec, Taastrup, Dánsko) byl použit k zahájení kolorimetrické reakce konjugované peroxidasy. Tato reakce byla zastavena přídavkem 3 M HC1 (50 pL). Vazebný signál navázaného Gal-3 byl stanoven spektrofotometricky při 450 nm (Spectra Max Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Získané výsledky byly analyzovány za použití softwaru Prism 7.0 (GraphPad, USA) a byly vyhodnoceny jako IC50.
- 25 CZ 2020 - 132 A3
Tabulka 2. Inhibiční potenciál vybraných sloučenin a konjugátu (IC50) stanovený metodou ELISA
Název konjugátu Obsah cukerné složky [mol%] * IC50 na glykan [μΜ | IC50 glykopolymeru [μΜ]
Laktosa - 132 -
Substituovaný sacharid 20 - 7,21 -
Glykopolymer Pila 2,6 0,22 0,066
Glykopolymer Pllb 4,9 0,14 0,023
Glykopolymer Plic 7,2 4,8 0,51
Glykopolymer Plld 9,7 4,4 0,40
Substituovaný sacharid 9 - 16 -
Glykopolymer P13a 4,5 28 4,2
Glykopolymer P13b 8,9 6,9 0,62
* Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí Ή-NMR.
1 Převzato z literatury (Bócker S. et al. Biomolecules 2015, 5, 1671-1696)
Příklad 23: Kvantifikace produkce Gal-3 u vybraných nádorových linií.
Buněčná linie Detekce Gal-3 s využitím průtokové cytometrie Exprese Gal-3 detekovaná pomocí metody Western blot
Lokalizace na membráně Lokalizace na membráně Intracelulární
4T1 Netestováno + ++
B16-F10 Netestováno + ++
CT26 Netestováno - ++
DLD-1 ++ + ++
HEK293 ++ + ++
HT-29 + Netestováno Netestováno
Jurkat Netestováno - -
LNCaP - - -
OVCAR-3 ++ + ++
PC3 + + ++
Ráji - Netestováno Netestováno
SU-DHL-5 - - -
SU-DHL-6 + Netestováno Netestováno
- 26 CZ 2020 - 132 A3
Vysvětlivky: Míra exprese Gal-3 - = nedetekovatelná, „+“ = výrazná, „++“ = silně výrazná.
Příklad 24: Inhibice vazby externího galektinu-3 na povrch buněk s expresí galektínu-3 pomocí glykopolymerů
Schopnost glykopolymerů inhibovat vazbu externího Gal-3 na povrch buněk byla prokázána pomocí inhibičního vazebného testu průtokovou cytometrií. V testu byl použit proteinový konstrukt Gal-3-AVI nesoucí na své N-koncové části aminokyselinovou sekvenci Avi-tag, která umožňuje cílené navázání molekuly biotinu a jeho následnou detekci pomocí fluorescenčně značeného konjugátu streptavidin-fýkoerytrin (L. Bumba et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 372). Jak bylo zjištěno imunochemickým testem pomocí metody ELISA, vazebné vlastnosti nativního Gal3 a Gal-3-AVI konstruktu jsou identické. Vazba glykopolymerů na Gal-3 inhibovala vazbu Gal-3 na povrch HEK293 buněk (imortalizovaná buněčná linie lidských zárodečných ledvinových buněk), u nichž byla prokázána silná exprese Gal-3 (viz Příklad 23) a zároveň velká kapacita vyvažovat volný Gal-3 z roztoku.
Alikvoty Gal-3-AVI konstruktu (finální koncentrace 10 Ig/mL) byly smíchány se zvyšující se koncentrací glykopolymerů Plíb (3 pM - 100 UM) nebo laktosy (3 nM - 100 mM) jako pozitivní kontroly a inkubovány po dobu 30 minut na ledu v PBS pufru s přídavkem 1% hovězího sérového albuminu (BSA). Tato směs byla přidána k suspenzi HEK293 buněk (106 /mL) a pomalu promíchávána na ledu po dobu 30 min. Následně byly buňky promyty PBS pufrem a označeny pomocí streptavidin-fýkoerytrinového konjugátu (Biolegend, USA). Síla vazby Gal-3-AVI konstruktu na povrch HEK293 buněk byla analyzována pomocí průtokové cytometric a kvantifikována jako relativní intenzita fluorescence při 575 nm.
Tabulka 3. Inhibiční potenciál glykopolymerů Plíb (IC50) stanovený v inhibičním vazebném testu s buněčnou linií HEK293 pomocí průtokové cytometric
Název konjugátu Obsah cukerné složky [mol%]* IC50 glykopolymerů [μΜ]
Laktosa - 225
Glykopolymer Pllb 4,9 0,057
* Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí Ή-NMR.
Příklad 25: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy lidských T buněk pomocí glykopolymerů
Schopnost glykopolymerů účinně inhibovat apoptózu indukovanou Gal-3 byla prokázána prostřednictvím annexin NI propidiumjodid apoptotického testu průtokovou cytometrií. Experimenty byly provedeny na imortalizované buněčné linii lidských T lymfocytů Jurkat. Bylo prokázáno, že lidský Gal-3 produkovaný nádorovými buňkami do okolního prostředí indukuje u této linie apoptózu.
V pokusech in vitro byly Jurkat buňky preinkubovány s různými koncentracemi glykopolymerů Pil a P13 (0,1; 1; 5; 10 a 50 μΜ) po dobu 5 minut a poté k nim byl přidán 10 μΜ Gal-3. Glykopolymery vyvažovaly volný Gal-3 z roztoku (okolí buněk), a ten tak nemohl indukovat apoptózu Jurkat buněk. Účinnost inhibice Gal-3 glykopolymery byla stanovena jako míra apoptózy buněk. Pro kontrolní experiment byl využit čistý HPMA polymer bez substituovaných sacharidů.
Glykopolymery inhibovaly apoptózu indukovanou Gal-3. Maximálního inhibičního efektu bylo dosaženo v koncentraci 5 μΜ nebo 1 μΜ v případě testovaného konjugátu Pllb nebo Plld (viz Obr. 1 a 2). Čistý HPMA polymer bez substituovaných sacharidů vykazoval také mírný protektivní účinek, a to v 50 μΜ koncentraci.
Glykopolymer P13 také prokázal vysoký inhibiční efekt (viz Obr. 3 a 4).
- 27 CZ 2020 - 132 A3
Příklad 26 (srovnávací): Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy lidských T buněk (Jurkat) pomocí glykopolymeru nesoucího jednoduchý disacharid LacdiNAc
Tabulka 4. Charakteristika srovnávacího glykopolymeru nesoucího jednoduchý disacharid LacdiNAc
Název konjugátu Obsah cukerné složky (mol%)* (g/mol)t Ma (g/mol)t £>ý IC50 na glykan FúM] IC50 na glykopolymer FúM]
LacdiNAcHPMA 12,3 30100 28000 1,07 38,5 2,3
* Obsah sacharidu byl stanoven pomocí Ή-NMR.
ýMolámí hmotnosti a disperzita byly stanoveny pomocí GPC, jak je uvedeno v Příkladu 21.
Obr. 5 znázorňuje inhibici galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu HPMA polymeru s jednoduchým disacharidem LacdiNAc (obsah LacdiNAc byl 12,3 mol%, viz Tabulka 4). S analogickým konjugátem s obsahem 8,4 mol% LacdiNAc byly dosaženy stejné výsledky. Jedná se o totožný disacharid jako v publikaci (Bojarová P. et al. J. Nanobiotechnol. 2018, 16, 73). Je evidentní, že v buněčných testech vykázal tento konjugát výrazně nižší schopnost inhibovat apoptózu Jurkat buněk než konjugáty se substituovanými disacharidy, které jsou předmětem vynálezu.
Příklad 27: Inhibice migrace lidských i myších nádorových buněk
Migrace vybraných nádorových buněk, které exprimují Gal-3, byla studována s využitím tzv. scratch testu. Tento test je založen na nasazení zkoumané buněčné kultury na kultivační misku, při jejím 70-80 % nárůstu jsou buňky hrotem 1 mL plastové špičky seškrábnuty z povrchu v délce cca 1 cm a šířce cca 0,5-1 mm. Následně je vyměněno médium, v kterém jsou buňky kultivovány, a nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím testované látky. Migrace buněk je poté sledována rychlostí a mírou zarůstání vzniklé mezery.
Inhibiční účinek polymerů Pila obsahující 2,6 mol% a Plic obsahujících 7,2 mol% tetrasacharidu byl sledován po přidání k médiu myších buněk nádoru prsu (4T1), myší melanoblastomové buněčné linie (B16F10) a lidských buněk kolorektálního karcinomu (DLD1). Polymemí konjugáty byly přidány v koncentraci 10 μΜ nebo 20 pM. Po 24 a 48 h byla měřena oblast, která zůstává buňkami neporostlá, a byl sledován rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou bez přidaného polymemího konjugátu. Obr. 6 ukazuje rozdíly v šířce zarostlé zóny u kontrolního vzorku, ke kterému nebyl přidán žádný polymemí konjugát (kontrola), dále vzorku, ke kterému byl přidán samotný HPMA polymer (pHPMA), a vzorkům s konjugáty. V případě buněk 4T1 a B16F10 oba konjugáty způsobily inhibici migrace oproti kontrole i u vzorku inkubovanému s polymemím nosičem. U buněk DLD1 pouze konjugát s vyšším molámím zastoupením cukerné složky způsobil inhibici migrace odlišnou od kontroly a polymemího nosiče.
- 28 CZ 2020 - 132 A3
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (11)

1. Glykopolymer na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 mol.%
- strukturních jednotek vzorce I:
HN
X A
Y2
Linker
Substituovaný sacharid (I) kde
Y 1 je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y1 může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;
Y 2 je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;
Linker je vybrán ze skupiny zahrnující 1,2,3-triazolylen, (C1-C6 alkyl)-l,2,3-triazolylen; NH-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-; -NH-C(=S)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-; nebo k substituentu Y2 prostřednictvím skupiny -C(=O)- nebo jen kovalentní vazbou vázaný 3,4,5,13-tetrazatetracyklo[13.4.0.02,6.07,12]nonadeka-l(15),2(6),3,7(12),8,10,16,18-oktaen13-karbaldehyd;
Substituovaný sacharid je substituovaný sacharid obecného vzorce III;
a/nebo
- koncových skupin o vzorci -S-sukcinimid-(CH2)r-Linker-Substituovaný sacharid nebo C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylenj-Linker-Substituovaný sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Substituovaný sacharid jsou definovány výše;
přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III je
- 29 CZ 2020 - 132 A3 (III), kde kombinace U, V a W odpovídá vzorci Illa
(Illa) kde ve vzorci Illa U je Ι-ί/πο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R4, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R1 a na atomu C-6 skupinou -OR6; V a W jsou vazba;
a kde
R1 je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou C1-C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(Cl-C5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2-C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, kumaryl, benzoyl, C1-C5 alkyl s vazbou k Línkem, vazbu k Línkem, fenyl s vazbou k Línkem, a fenyl-(ClC5)alkyl s vazbou k Línkem;
X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,
Y je CH2 nebo vazba,
Z je O nebo [l,2,3]-triazol.
R2 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl,
R4 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu,
R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-β-sialyl;
přičemž Substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu vazbu k Línkem jako součást substituentu R1.
2. Glykopolymer podle nároku 1, který obsahuje polymemí řetězce tvořené HPMA polymerem a větvicí jednotky, přičemž větvícími jednotkami jsou s výhodou amidoaminové jednotky nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové jednotky.
-30CZ 2020 - 132 A3
3. Glykopolymer podle nároku 1 nebo 2, který dále obsahuje 0,5 až 12 mol.% strukturních jednotek s obecným vzorcem odpovídajícím obecnému vzorci I, kde Y1 a Y2 jsou jak je definováno v nároku 1, ale struktura -Linker-Subst.sacharid je nahrazena substituentem vybraným ze skupiny tvořené karbonyl-hydrazono-(C12-C18 alkanonem), karbonyl-hydrazono-5a-cholestanonem, karbonyl-hydrazono-cholest-4-en-3-onem; karbonyl-(C9-C15 alkoxy), karbonyl-cholesterylem, karbonyl-7-dehydrocholesterylem; karboxamido-(C10-C18 alkylem), karbohydrazido-(C10-C18 alkylem), karboxamido-(C10-C18 alkenylem) a karbohydrazido-(C10-C18 alkenylem), obsahujícím aspoň jednu dvojnou vazbu (C=C).
4. Způsob přípravy glykopolymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
a) polymeraci funkcionalizovaných monomerů obecného vzorce II
H,C
O (Π), kde
Y 1 je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y1 může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;
Y 2 je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;
Y 3 je vybrán ze skupiny zahrnující primární amin (NH2), tBoc substituovaný amin, azid, terminální alkynyl mající 2 až 8 atomů uhlíku, fenyl substituovaný alespoň jedním azidem nebo C2-C4 alkynylem; (1 l,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl) nebo (lR,8S,9s)bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9-yl, který je vázán přes karbonylovou skupinu; -karbonyl-thiazolin2-thionovou skupinu (TT), -karbonyl-4-nitrofenoxy skupinu, -karbonyl-2,3,4,5,6pentafluorfenoxy skupinu, -karbonyl-sukcinimidylovou skupinu, a COOH skupinu; přičemž karbonyl je -C(=O)- skupina, a A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), a případně methakryloyl(aminoacyl) esterů a/nebo větvicích jednotek;
při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, terc-butylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril), 4,4'-azobis(4kyanopentanová kyselina), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril), za přítomnosti přenosového činidla;
b) volitelný krok polymer-analogických reakcí,
-31CZ 2020 - 132 A3
c) navázání substituovaného sacharidu, vybraného ze skupiny sestávající ze substituovaných sacharidů obecného vzorce III:
(ΙΠ), kde kombinace U, V a W je obecného vzorce lila:
(lila) a kde
R1 je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou C1-C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C2-C5 alkynylem, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 azidoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou azidoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(ClC5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou aminoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 aminoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, kumaryl, benzoyl, a C2-C5 alkynyl;
X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,
Y je CH2 nebo vazba,
Z je O nebo [l,2,3]-triazol.
R2 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl,
R4 je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu,
R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-P-sialyl;
přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu koncovou aminoskupinu, azidoskupinu nebo C2-C5 alkynyl, a to jako součást substituentu R1.
-32CZ 2020 - 132 A3
5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že krok a) syntézy polymemích nosičů polymerací monomerů se provede za přítomnosti přenosového činidla vybraného ze skupiny obsahující 2kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2-kyano-2propyldodecyltrithiokarbonát, 2-kyano-2-propylethyltrithiokarbonát a 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu.
6. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že krok a) syntézy polymemích nosičů polymerací monomem a větvicích jednotek se provede za přítomnosti přenosového činidla obsahujícího karboxylovou skupinu nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou thiobenzoylthio, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou; kde přenosové činidlo je s výhodou vybrané ze skupiny obsahující 4-kyano-4(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 4-kyano-4- [(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu, 1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3 -yljbutyl dithiobenzoát, 2-kyano-5 -oxo-5 -(2-thioxo-1,3 -thiazolidin-3 yl)pentan-2-yl ethylkarbontrithioát, a v dmhém kroku se provede reakce polymerů získaných v prvním kroku s poly(amidoaminovým) nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionovým dendrimerem, za tvorby amidové vazby mezi HPMA a dendrimerem, přičemž reakce se provádí v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol, následně se in situ zablokují zbývající primární aminoskupiny nízkomolekulámí aminoreaktivní sloučeninou, s výhodou acetanhydridem, ve třetím kroku se sím obsahující skupiny na dmhém konci polymeru buď redukují borohydridem sodným a in situ dojde k adici SH skupin na JV-derivovaný maleimid, s výhodou propynylmaleimid či azido-PEG3-maleimid, přičemž reakce probíhá v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující vodu, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol; nebo se sím obsahující skupiny na dmhém konci polymem podrobí reakci s přebytkem azoiniciátoru nesoucím karboxylovou skupinu, nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou thibenzoylthio, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou, a to při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid.
7. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že se v rámci kroku a) dále provede krok odstranění koncových skupin obsahujících sím z polymem, při jejichž přípravě bylo použito přenosové činidlo, ve kterém jsou tyto polymery reagovány s přebytkem azoiniciátom ze skupiny zahrnující 2,2'-azobis(2-methylpropionitril), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina), 2,2'-azobis(4methoxy-2,4-dimethylpentannitril), za vzniku polymemího nosiče zakončeného zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátom.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 7, vyznačený tím, že se dále provede krok b) zavedení azidové či alkylové skupiny postupem vybraným z:
(i) reakce Y3 skupiny na polymem, pokud ta je odstupující skupinou, s aminosloučeninou zakončenou skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 terminálním alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 3-amino-l-(l 1,12didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)propan-l-onem, či JV-[(lR,8S,95)-bicyklo[6.1,0]non-4-yn9-ylmethyloxykarbonyl] -1,8-diamino-3,6-dioxaoctanem;
(ii) reakce Y3 skupiny na polymem, pokud ta je primární aminoskupinou, s karboxy(Cl-C8 alkanem) zakončeným skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 6-(11,12didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanovou kyselinou, či jejím Nhydroxysukcinimidyl esterem a (l/?.8.S'.9.s)-bicyklo|6,1,0|non-4-yn-9-ylmcthyl JV-sukcinimidyl
-33CZ 2020 - 132 A3 karbonátem, nebo funkčními deriváty tohoto karboxyalkanu obsahujícími dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou.
5
9. Glykopolymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako léčivo, adjuvans, nebo imunomodulant.
10. Glykopolymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pro léčbu pevných nádorů, lymfomu nebo leukemie; nebo pro použití pro inhibici migrace nádorových buněk a potlačení ίο metastatického rozsevu nádorových onemocnění; nebo pro použití pro inhibici indukce apoptózy u buněk imunitního systému v nádoru.
11. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje glykopolymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku vybranou ze skupiny 15 zahrnující plniva, antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty.
CZ2020-132A 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo CZ309740B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020-132A CZ309740B6 (cs) 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
PCT/CZ2020/050067 WO2021047699A1 (en) 2019-09-09 2020-09-09 Glycopolymer, method of preparation thereof, use thereof as medicament

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020-132A CZ309740B6 (cs) 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2020132A3 true CZ2020132A3 (cs) 2021-05-05
CZ309740B6 CZ309740B6 (cs) 2023-09-06

Family

ID=75686126

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2020-132A CZ309740B6 (cs) 2019-09-09 2019-09-09 Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ309740B6 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CZ309740B6 (cs) 2023-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7041818B2 (en) DDS compound and method for measurement thereof
JP5687899B2 (ja) 生理活性物質の高分子結合体
Chen et al. PolyMPC–doxorubicin prodrugs
JP5866301B2 (ja) 増殖及びタンパク質合成の細胞内ターゲッティングのためのポリアニオン性多価高分子
JP2001500133A (ja) トランスフェリン、アルブミン及びポリエチレングリコールの抗腫瘍性の複合体
WO2000066091A1 (en) Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
CN102105157A (zh) 聚合物、抗血管生成剂和靶向部分的缀合物及其在治疗骨相关血管生成状况中的用途
Greco et al. Polysialic acid as a drug carrier: evaluation of a new polysialic acid–epirubicin conjugate and its comparison against established drug carriers
WO2023122599A1 (en) Glycosylated dendrimers for targeted intracellular delivery
CA3082835A1 (fr) Prodrogues polymeres et leur administration sous-cutanee et/ou intramusculaire
JP5019524B2 (ja) 新規ポリ（メタ）アクリレート共重合体ならびに小胞体及びゴルジ体への送達方法
Sedlar et al. Glycopolymer Inhibitors of Galectin-3 Suppress the Markers of Tissue Remodeling in Pulmonary Hypertension
CZ2020132A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ2019572A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ2020133A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ2020137A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
EP0234151A1 (fr) Glycoprotéines modifiées par oxydation et formation de base de Schiff, inhibant les ribosomes, procédé d&#39;obtention et immunotoxines comprenant une telle glycoprotéine
US12433857B2 (en) Conjugate and cancer therapeutic agent
WO2021047699A1 (en) Glycopolymer, method of preparation thereof, use thereof as medicament
CZ309067B6 (cs) Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
Zhukova et al. Preparation of a Doxorubicin Conjugate with (Co) Polymers of Methacrylic acid for Targeted Tumor Therapy
RU2692078C2 (ru) Конъюгат, содержащий фолиевую кислоту и индол-3-карбинол, для медицинского применения
Etrych et al. Micellar and Antibody‐Targeted Polymer Therapeutics
KR20250047787A (ko) 어피바디 미셀 약물 복합체
WO2021121446A1 (en) Copolymer with hydrolytic release of cancerostatic agent cytarabine, method of its preparation and use thereof