CZ2020137A3

CZ2020137A3 - Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo

Info

Publication number: CZ2020137A3
Application number: CZ2020137A
Authority: CZ
Inventors: Pavla Bojarová; Bojarová Pavla RNDr., Ph.D.; Tomáš Vašíček; Tomáš Mgr. Vašíček; Petr Chytil; Chytil Petr Mgr., Ph.D.; Marcela Filipová; Marcela Mgr. Filipová; Olga Janoušková; Janoušková Olga Mgr., Ph.D.; Tomáš Etrych; Ph.D. DSc. Etrych Tomáš RNDr.; M.R. Tavares
Original assignee: Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.; Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2021-09-22

Abstract

Řešení se týká multivalentních glykopolymerů na bázi HPMA polymerů (kopolymerů i homopolymerů) se sacharidovými strukturami obsahujícími terminální monosacharid v galakto-konfiguraci, které jsou účinné jako inhibitory galektinů. Tyto glykopolymery lze využít jako léčiva pro terapii a prevenci rakovinných onemocnění spojených s nadprodukcí galektinů, zvláště lidského galektinu-3 (Gal-3).

Description

Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo

Oblast techniky

Vynález se týká multivalentních vodorozpustných nebo micelámích polymerů, tj. homopolymerů i kopolymerů, se sacharidovými strukturami obsahujícími terminální monosacharid v galaktokonfiguraci, které jsou účinné jako inhibitory galektinů. Tyto glykopolymery lze využít jako léčiva pro terapii a prevenci rakovinných onemocnění spojených s nadprodukcí galektinů, zvláště lidského galektinu-3 (Gal-3).

Dosavadní stav techniky

V poslední době se vývoj léčiv v protinádorové terapii posouvá od klasických nízkomolekulámích léčiv k hledání nových léčiv nebo lékových forem umožňujících cílené působení aktivní látky především v místě, kde je terapeutický účinek třeba. V současnosti vstupují do klinického využití jako léčiva monoklonální protilátky, které jsou poměrně účinné u různých typů malignit, ovšem často je jejich použití spojené s poměrně silnými toxickými účinky pro pacienta. Vedle protilátek se cíleně působící formy léčiva dají využít především u takových látek, jejichž vedlejší účinky mohou vést až k poškození zdravých částí organizmu. Využití polymemích nosičů, především vodorozpustných nebo micelámích polymerů, pro cílenou dopravu léčiv je jednou z významných možností řešení zmíněného problému. Vysoká molámí hmotnost polymeru s aktivní složkou zabraňuje rychlému vyloučení z organizmu glomemlámí filtrací. Tím se významně prodlužuje doba cirkulace v krvi i celkové setrvání v organizmu vedoucí ke zvýšení biologické využitelnosti systému. Kromě toho vysoká molámí hmotnost polymemího systému vede ke zvýšené akumulaci v pevných nádorech díky EPR (enhanced permeability and retention) efektu.

Tohoto efektu lze využít v případě navázání léčiva na makromolekulámí nosič pro jeho cílenou akumulaci v nádoru. V minulosti byla vyvinuta celá řada systémů, které jsou založeny na využití EPR efektu pro cílení léčiv, např. polymemí micely, liposomy, nanočástice, nanokapsle nebo vodorozpustné polymemí konjugáty. Polymemí micely jsou na rozdíl od rozpustných polymemích systémů obvykle připravovány samouspořádáním amfifilních diblokových kopolymerů do vysokomolekulámích micelámích útvarů tvořících koloidní roztoky. Mezi vodorozpustnými systémy tvoří jednu z nej významnějších skupin polymemí systémy připravené na bázi polymerů obsahujících jednotky A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA polymery). Jediný a hlavní nedostatek omezující využití HPMA polymerů jako nosičů léčiv v humánní medicíně je jejich neštěpitelný uhlíkový řetězec a stím spojené omezení molámích hmotností použitelných pro přípravu polymemího nosiče na molámí hmotnosti menší než 50 000 až 60 000 g/mol (pod vylučovací mezí organizmu). Bohužel, polymery nad touto mezí nejsou efektivně a dostatečně účinně z těla vylučovány, a tudíž jejich použití jako léčiva by vedlo k nežádoucí akumulaci polymeru v organizmu. Navýšení molámí hmotnosti HPMA polymerů, a tedy prodloužení jejich cirkulace v organizmu, je možné vmezeřením biodegradovatelných spojek mezi jednotlivé bloky HPMA kopolymerů. Vhodné jsou zvláště spojky enzymově, hydrolyticky nebo reduktivně štěpitelné. Struktury vzniklé spojením bloků k sobě se nazývají multiblokové, roubované nebo hvězdicovité. Variantou může být též příprava amfifilního HPMA polymeru, který se do nadmolekulámí micelámí struktury sám složí a po poklesu koncentrace pod kritickou micelámí koncentraci se sám rozpadne na krátké kopolymery vyloučitelné z organizmu.

Nedávno bylo popsáno, že HPMA polymer může sloužit jako nosič několika scFv řetězců antiCD20 a díky své multivalenci může způsobovat apoptózu CD20 pozitivních buněk (Kopeček J. Adv. Drug Delivery Rev. 2013, 65,49-59). Tento koncept byl popsánjako „drug-free therapeutics“ (terapeutika bez léčiv) a v USA nyní probíhají jeho zkoušky. Základem pro účinnost tohoto systému je multi valence polymeru daná již samotnou stmkturou použitého polymeru.

-1 CZ 2020 - 137 A3

Galektin-3 (Gal-3) je lektin patřící do rodiny galektinů - proteinů vážících glykany s terminálním β-galaktosidem. V současné době je tomuto galektinů věnována značná pozornost s ohledem na jeho významný vliv na procesy ovlivňující nádorové bujení, jako je vznik metastáz, překonání imunitní odpovědi organizmu, mRNA splicing, genová exprese, apoptóza a vznik zánětu. Gal-3 je exprimován řadou nádorových tkání a buněk, a to jak intracelulámě, tak extracelulámě, kdy je jednak asociován s glykostrukturami na povrchu buněk, jednak je uvolňován do mezibuněčného prostředí. Zvýšená exprese Gal-3 v nádorových tkáních (Thijssen V. L. et al. Biochim. Biophys. Acta 2015, 1855, 235-247) vede k zhoršené prognóze vývoje onemocnění a zvýšenému riziku vzniku metastáz. Dále byla prokázána klíčová role extracelulámího Gal-3 produkovaného do nádorového mikroprostředí při potlačení imunitní odpovědi T buněk proti nádorovým buňkám a snížení funkce NK buněk, což následně vede k rozšíření nádorového bujení a vzniku metastáz. Bylo prokázáno, že inhibice extracelulámího Gal-3 vede k ochraně T buněk imunitního systému proti apoptóze vyvolané Gal-3.

Gal-3 produkovaný nádorovými buňkami může být lokalizován především v jádře, v cytoplazmě a na membráně. Extracelulámí Gal-3 je produkován do mikroprostředí nádom a rovněž krví do celého těla. Zvýšená přítomnost Gal-3 je v přímé korelaci s horší prognózou vývoje nádorového onemocnění např. v případě nádorů štítné žlázy, některých nádorů tlustého střeva, hlavy a krku nebo nádorů mozku. Jedním z důvodů může být vliv volného Gal-3 na apoptózu protinádorových T lymfocytů. Gal-3 může díky své zvýšené expresi v nádorové tkáni sloužit jako terapeutický marker a současně terapeutický cíl. Také jeho přítomnost v krevním řečišti či mikronádorovém prostředí může být sledována s ohledem na vývoj nádorového onemocnění; ovlivnění hladiny volného Gal-3 může ovlivnit efektivitu protinádorové imunitní odpovědi (Sano H. et al. J. Immunol. 2000, 165 (4), 2156-2164, GuhaP. PNAS 2013, 110 (13), 5052-5057).

V posledních letech byly intenzivně studovány různé modifikace základních sacharidových ligandů galektinů - galaktosy, laktosy (Gaip4Glc) nebo A-acetyllaktosaminu (Gaip4GlcNAc) - a vliv těchto modifikací na afinitu připravených glykomimetik k jednotlivým galektinům, zvláště pak biomedicínsky nejvíce studovaným galektinů-1 a -3. Vnesení aromatické skupiny na C-3 mateřského galaktosového zbytku bylo demonstrováno jako nejvýhodnější pro zvýšení afinity ke galektinům. Strukturní analogy A-acetyllaktosaminu a thiodigalaktosidů (TDG; Gaipi-ipGal) se vyprofilovaly v rozsáhlou skupinu účinných glykomimetických inhibitorů galektinů odolných vůči enzymové degradaci in vivo, což je důležitým faktorem pro budoucí klinickou aplikaci. Byla popsána i multivalentní prezentace těchto glykomimetik na hovězím sérovém albuminu jako nosiči.

Kromě již uvedených sloučenin byla v literatuře popsána řada dalších sacharidů jako ligandů galektinů. Jedná se zvláště o struktury na bázi poly-A-acetyllaktosaminu. Tyto komplexní oligosacharidové struktury a další, jednodušší sacharidy na bázi laktosy, galaktosy či Nacetyllaktosaminu bez zmíněných substitucí byly též v minulosti vystaveny v multivalentní prezentaci na řadě nosičů, jako např. na peptidech, polymerech, oligonukleotidech, fúllerenech a kalixarenech, i na dendrimerech a nanočásticích. Multivalentní prezentace často výrazně zvýšila nízkou afinitu monovalentního sacharidu. I když byly v některých případech demonstrovány vysoké afinity ke galektinům metodou ELISA, jednalo se vždy pouze o modelový systém, který nelze použít pro in vivo aplikace. Žádný z dosud připravených multivalentních nosičů nenabízí unikátní kombinaci vlastností glykopolymerů podle předkládaného vynálezu (konkrétně dobrou defmovatelnost a reprodukovatelnost přípravy, biokompatibilitu, stabilitu in vivo a výhodnou farmakokinetiku).

HPMA polymery nesoucí protirakovinné léčivo doxorubicin a kovalentně navázané jednoduché mono- a disacharidy (laktosa, galaktosa, galaktosamin) byly v minulosti studovány (David A. Pharmaceut. Res. 2002, 19, 1114-1122; David A. et al. Eur. J. Cancer 2004, 40, 148-157) pro možnost aktivního cílení do buněk vybraných rakovinných linií, z nichž některé exprimovaly Gal3. V popsaných případech nebylo uvažováno o účinku konjugátů na inhibici Gal-3 a korelace získaných výsledků s expresí Gal-3 na buňkách nebyla průkazná. V publikaci autorů tohoto

- 2 CZ 2020 - 137 A3 vynálezu (Bojarová P. et al. J. Nanobiotechnol. 2018, 16, 73) byla syntetizována série HPMA konjugátů s jednoduchým disacharidem LacdiNAc a demonstrován jejich inhibiční účinek (IC50 v řádu CM) na Gal-3 ve stanovení ELISA. Předkládaný vynález si klade za cíl poskytnout glykopolymery se zlepšeným inhibičním účinkem na Gal-3, a při tom mající vhodné vlastnosti pro přípravu a aplikaci, které jsou nezbytnými podmínkami pro možnost praktického využití.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je struktura, syntéza a použití nového polymemího léčiva s dobře kontrolovatelným obsahem navázaných substituovaných sacharidů. Obsah navázaných substituovaných sacharidů se reguluje množstvím přidané sacharidové složky k polymemímu nosiči, protože je mu úměrný. Nové léčivo jeví prodlouženou farmakokinetiku a zvýšenou akumulaci v nádoru díky obsahu polymemí složky, a zároveň silnou inhibici galektinů.

Glykopolymery nesoucí substituované sacharidy podle tohoto vynálezu mají nejen vyšší afinitu ke Gal-3 ve vazebných testech typu ELISA než je tomu u glykopolymerů známých ze stavu techniky, ale především mají prokazatelně silnější účinek v biologických testech, jak je doloženo ve srovnávacím příkladu 26. Oproti nejbližšímu stavu techniky jsou tak jednoznačně účinnější na inhibici Gal-3, která má přímý dopad na protinádorovou imunitní odpověď a migraci nádorových buněk.

Na rozdíl od všech dříve připravených systémů jsou glykopolymery podle vynálezu jediným prostředkem s inhibičním účinkem vůči Gal-3, který lze použít in vivo pro terapii nádorového bujení, a to díky odpovídající farmakokinetice zajištěné polymemí složkou, biokompatibilitě, in vivo stabilitě, a dobré reprodukovatelnosti přípravy. V rámci tohoto vynálezu byl prokázán silný účinek připravených glykopolymerů nejen na potlačení indukce apoptózy u buněk imunitního systému, ale též dosud nedemonstrovaný účinek na potlačení migrace nádorových buněk. Oba tyto účinky mají přímý dopad na léčbu nádorů a potlačení metastatického procesu.

Jedním z důležitých znaků systému podle předkládaného vynálezu jsou polymemí řetězce tvořené inertním, nenabitým, s organizmem neinteragujícím vodorozpustným polymerem na bázi HPMA, který je využit jako multivalentní nosič pro navázání substituovaných sacharidů s cílem dosáhnout zvýšené interakce s lektiny, a též zlepšené farmakokinetiky nesených substituovaných sacharidů. V kombinaci se specifickými substituovanými sacharidy se pak dosahuje zde popsaných účinků.

Struktura glykopolymerů podle vynálezu vychází z polymemích nosičů na bázi HPMA polymerů, na které jsou kovalentně navázány substituované sacharidy, jejichž interakce s galektiny má díky polymemímu nosiči multivalentní charakter a dochází k aviditě při vazbě na zmíněné galektiny. Popsaná silná interakce s galektiny vede k samotnému biologickému účinku, který spočívá v několika bodech, a to v protektivním efektu na buňky imunitního systému proti apoptóze indukované Gal-3, dále v inhibici migrace nádorových buněk a stím spojené inhibici metastatického rozsevu.

Pod pojmem „léčivo“ se zde rozumí látka přímo mající léčebné účinky, nebo adjuvans, nebo imunomodulant.

Termínem „polymer“ jsou zde zahrnuty kopolymery i homopolymery. Zejména termínem „HPMA polymer“ je zahrnut jako HPMA kopolymer, tak HPMA homopolymer.

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy glykopolymer obsahující polymemí nosič na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 mol. %

- strukturních jednotek vzorce I:

-3CZ 2020 - 137 A3

HN

Linker I Substituovaný sacharid (I), kde

Y¹ je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y¹ může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé; Y¹ je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující -CH2-CH₂- a -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-;

Y² je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;

Linker je vybrán ze skupiny zahrnující 1,2,3-triazolylen, (C1-C6 alkyl)-l,2,3-triazolylen; NH-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-; -NH-C(=S)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-; nebo k substituentu Y² prostřednictvím skupiny -C(=O)- nebo jen kovalentní vazbou vázaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, přičemž tento cyklooktynyl či azacyklooktynyl je dále konjugovaný s triazolylem, (například tvořený 3,4,5,13tetrazatetracyklo[13.4.0.02,6.07,12]nonadeka-l(15),2(6),3,7(12),8,10,16,18-oktaen-13karbaldehydovým motivem);

Substituovaný sacharid je substituent odvozený od substituovaného sacharidu obecného vzorce III popsaného zde níže (v rámci popisu kroku d) postupu přípravy) reakcí terminální aminové, azidové, alkynylové, aminoethylureidylové nebo aminoethylthioureidylové skupiny, přičemž skupiny vzniklé reakcí uvedených terminálních skupin jsou součástí Linkeru; a přičemž Substituovaný sacharid není laktosa (Gaip4Glc), LacNAc (Gaip4GlcNAc) ani LacdiNAc (GalNAcP4GlcNAc) a/nebo

- koncových skupin řetězce HPMA polymeru majících vzorec -S-sukcinimid-(CH₂)_r-LinkerSubstituovaný sacharid nebo -C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylen)-Linker-Substituovaný sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Substituovaný sacharid jsou definovány výše.

Přirozenými aminokyselinami jsou zde míněny přirozeně se vyskytující kyseliny: histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny.

Substituovaný sacharid odvozený od substituovaného sacharidu obecného vzorce III popsaného zde níže (v rámci popisu kroku d) postupu přípravy) reakcí terminální aminové, azidové, alkynylové, aminoethylureidylové nebo aminoethylthioureidylové skupiny, přičemž skupiny

-4CZ 2020 - 137 A3 vzniklé reakcí uvedených terminálních skupin jsou součástí Linkeru, je s výhodou substituovaný sacharid obecného vzorce III:

kde kombinace U, V a W a R4 je vybrána z následujících možností lila, Illb, lile, Illd, lile:

ZOH t

Ř¹ (lila) lila: kde V a W je jen vazba, a kde U je 1 -ί/πο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R⁴, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R¹ a na atomu C-6 skupinou -OR⁶;

Illb: kde V a W je jen vazba a kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

lile: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

(Illd);

Illd: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

-5CZ 2020 - 137 A3

(Ilie)

Ilie: kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3v a na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3w a na atomu C-l skupinou R⁴;

a kde

R¹ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou C1-C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(Cl-C5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou aminoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 aminoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2-C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, sulfoskupinu, kumaryl, benzoyl, C2-C5 alkynyl, C1-C5 alkyl s vazbou k Línkem, vazbu k Línkem, fenyl s vazbou k Línkem, a fenyl-(Cl-C5)alkyl s vazbou k Línkem;

X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,

Y je CH₂ nebo vazba,

Z je O nebo [l,2,3]-triazol.

R², R^3u, R^3v, R^3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl,

R⁴ je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl, -NH-vazbu k Línkem, C1-C5 alkoxy s vazbou k Línkem, vazbu k Línkem, -Ovazbu k Línkem, fenyloxyskupinu s vazbou k Línkem na fenylu,

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-C-sialyl, C1-C5 alkyl s vazbou k Línkem, vazbu k Línkem;

přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu vazbu k Línkem, a to s výhodou jako součást substituentu vybraného z R¹, R⁵ nebo R⁶, pokud U je Ι-ίΛ/ο-β-ϋgalaktopyranosyl, a s výhodou jako součást substituentu R⁴ve všech ostatních kombinacích.

Glykopolymer může kromě poly(HPMA) řetězců obsahovat také větvicí jednotky, například amidoaminové jednotky vhodné pro přípravu dendrimemích (hvězdicovitých) polymerních jader poly(amidoaminu) (PAMAM), nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové jednotky vhodné pro tvorbu dendrimemích jader. Například může glykopolymer hvězdicové struktury obsahovat jádro z PAMAM a postranní řetězce z poly(HPMA), obsahující výše uvedené koncové skupiny a/nebo monomemí jednotky vzorce I.

V jednom provedení je glykopolymerem glykopolymer na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 mol.%

-6CZ 2020 - 137 A3

- strukturních jednotek vzorce I:

Ý²

I

Linker

Substituovaný sacharid (I) kde

Y¹ je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH₂)_q(C(O)-NH-(CH₂)_r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y¹ může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;

Linker je vybrán ze skupiny zahrnující 1,2,3-triazolylen, (C1-C6 alkyl)-l,2,3-triazolylen; NH-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-; -NH-C(=S)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-; nebo k substituentu Y² prostřednictvím skupiny -C(=O)- nebo jen kovalentní vazbou vázaný 3,4,5,13-tetrazatetracyklo[13.4.0.02,6.07,12]nonadeka-l(15),2(6),3,7(12),8,10,16,18-oktaen13-karbaldehyd;

Substituovaný sacharid je substituovaný sacharid obecného vzorce III;

a/nebo

- koncových skupin o vzorci -S-sukcinimid-(CH₂)_r-Linker-Substituovaný sacharid nebo C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylen)-Linker-Substituovaný sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Substituovaný sacharid jsou definovány výše;

přičemž Substituovaný sacharid obecného vzorce III je

kde kombinace U, V a W a R4 odpovídá vzorci lila

-7 CZ 2020 - 137 A3

ZOH t

R¹ (Illa) kde ve vzorci Illa U je l-riwo-P-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R⁴, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R¹ a na atomu C-6 skupinou -OR⁶; V a W jsou vazba;

a kde

R¹ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou C1-C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(Cl-C5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2-C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, kumaryl, benzoyl, C1-C5 alkyl s vazbou k Linkeru, vazbu k Linkeru, fenyl s vazbou k Linkeru, a fenyl-(ClC5)alkyl s vazbou k Linkeru;

X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,

Y je CLE nebo vazba,

Z je O nebo [l,2,3]-triazol.

R² je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl,

R⁴ je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl,

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-a-sialyl;

přičemž Substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu vazbu k Linkeru jako součást substituentu R¹.

V dalším provedení je glykopolymerem glykopolymer na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 mol.%

- strukturních jednotek vzorce I:

-8CZ 2020 - 137 A3

Linker

Substituovaný sacharid (I) kde

Substituovaný sacharid je substituovaný sacharid obecného vzorce III;

a/nebo

- koncových skupin o vzorci -S-sukcinimid-(CH₂)_r-Linker-Substituovaný sacharid nebo C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylenj-Linker-Substituovaný sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Substituovaný sacharid jsou definovány výše;

přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III je

U-V-W-R⁴ (III), kde kombinace U, V a W a R4 odpovídá vzorci Illb nebo lile nebo Illd

-9CZ 2020 - 137 A3

(Illb) kde ve vzorci Illb U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴; V a W je vazba;

(lile) kde ve vzorci lile U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴; V a W je vazba;

(Illd) kde ve vzorci Illd U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴; V a W je vazba;

a kde

R¹ je vybrán ze skupiny obsahující fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(Cl-C5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2-C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, kumaryl, a benzoyl;

X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,

Y je CH₂ nebo vazba,

Z je O nebo [l,2,3]-triazol.

R², R^3u jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1 -O-a-L-fukosyl,

R⁴ je vybrán ze skupiny obsahující -NH-vazbu k Linkeru, C1-C5 alkoxy s vazbou k Linkeru, vazbu k Linkeru, -O-vazbu k Linkeru, fenyloxyskupinu s vazbou k Linkeru na fenylu;

R⁵ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-a-sialyl.

-10CZ 2020 - 137 A3

V ještě dalším provedení je glykopolymerem glykopolymer na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 mol.%

- strukturních jednotek vzorce I:

HN

Ý²

I

Linker

Substituovaný sacharid (I) kde

Substituovaný sacharid je substituovaný sacharid obecného vzorce III;

a/nebo

přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III je

□„_V„yy-~R⁴

R^z (III), kde kombinace U, V a W a R4 odpovídá vzorci lile

-11 CZ 2020 - 137 A3

kde ve vzorci lile je U 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3va na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3w a na atomu C-l skupinou R⁴;

a kde

R¹ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(Cl-C5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2-C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, sulfoskupinu, kumaryl, benzoyl;

X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,

Y je CH₂ nebo vazba,

Z je O nebo [l,2,3]-triazol.

R⁴ je vybrán ze skupiny obsahující C1-C5 alkoxy s vazbou k Linkeru, vazbu k Linkeru, -O-vazbu k Linkeru, fenyloxyskupinu s vazbou k Linkeru na fenylu,

R⁵ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-a-sialyl.

Postup přípravy glykopolymerů podle předkládaného vynálezu obsahuje následující kroky:

a) poskytnutí monomerů polymemího nosiče, a případně větvicích jednotek,

b) polymeraci monomerů polymemího nosiče,

c) volitelný krok polymer-analogických reakcí, d) navázání substituovaného sacharidu.

Krok poskytnutí monomerů zahrnuje poskytnutí W-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) a poskytnutí methakryloyl(aminoacyl) esterů, a popřípadě větvicích jednotek. HPMA je komerčně dostupný ajeho syntéza je publikována (např. Chytil P. et al. Eur. J. Pharm. Sci. 2010, 41 (3-4), 472-482). Komerčně dostupné monomery jsou dále například A-aminoethylmethakrylamid, Naminopropylmethakrylamid, nebo jejich /Boc chráněné analogy.

Syntézu dalších fůnkcionalizovaných monomerů odvozených od HPMA lze popsat následovně. Funkcionalizované monomery, methakroylované sloučeniny, lze popsat obecným vzorcem II

-12 CZ 2020 - 137 A3

(Π), kde

Y³ je vybrán ze skupiny zahrnující primární amin (NH₂), /Boc substituovaný amin, azid, terminální alkynyl mající 2 až 8 atomů uhlíku, fenyl substituovaný alespoň jedním azidem nebo C2-C4 alkynylem; a cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, jako je například (ll,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl) nebo (l/?.8.S'.9,s)bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9-yl;, přičemž tento substituovaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl je vázán přes karbonylovou skupinu; -karbonyl-thiazolin-2-thionovou skupinu (TT), karbonyl-4-nitrofenoxy skupinu, -karbonyl-2,3,4,5,6-pentafluorfenoxy skupinu, -karbonylsukcinimidylovou skupinu, a COOH skupinu; přičemž karbonyl je -C(=O)- skupina.

Větvicí jednotky jsou obvykle komerčně dostupné, v některých případech jsou komerčně dostupná i větvená či hvězdicovitá jádra pro dendrimemí polymery.

Dalším krokem postupu podle vynálezu je krok b), tj. krok syntézy polymemích nosičů polymerací monomerů, popřípadě s větvícími jednotkami. Polymemí nosič obvykle obsahuje statistický polymer obsahující od 0,5 do 25 mol% monomemích jednotek obecného vzorce II a/nebo koncových jednotek hlavního polymemího řetězce popsaných výše, a alespoň 75 mol% (75 až 99,5 mol%) jiných jednotek, což zahrnuje monomemí jednotky odvozené od HPMA a popřípadě i větvicí jednotky. Polymerizace typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tercbutylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující 2-kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2-kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2kyano-2-propylethyltrithiokarbonát a 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu. Molámí hmotnost M_a takto připravených polymerů je v rozmezí od 4000 do 100 000 g/mol, s výhodou 20 000 až 50 000 g/mol.

Volitelně může být zahrnut i krok odstranění koncových skupin obsahujících síru z polymerů, při jejichž přípravě bylo použito přenosové činidlo, ve kterém jsou tyto polymery reagovány s přebytkem azoiniciátom ze skupiny iniciátorů polymerace popsaných výše. Polymemí nosič je pak zakončen zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru. Reakce typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C, a v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid.

-13 CZ 2020 - 137 A3

Volitelným krokem c) je zavedení azidové či alkylové skupiny (i) reakcí Y³ skupiny na polymeru, pokud taje odstupující skupinou (tj. je vybraná z thiazolin-2-thionové skupiny (TT), 4-nitrofenoxy skupiny, 2,3,4,5,6-pentafluorfenoxy skupiny, sukcinimidylové skupiny, a OH skupiny), s aminosloučeninou (např. amino(Cl-C8 alkanem)) zakončenou skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 terminálním alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 3-amino-l-(l l,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)yl)propan-l-onem, či Λ'-| (I /?.8.S'.9,s)-bicyklo|6.1.0 |non-4-yn-9-ylmcthyloxykarbonyl |-1.8diamino-3,6-dioxaoctanem; nebo (ii) reakcí Y³ skupiny na polymeru, pokud ta je primární aminoskupinou, s karboxy(Cl-C8 alkanem) zakončeným skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 6-(l l,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanovou kyselinou, či jejím A-hydroxysukcinimidyl esterem a (17?.8,S'.9.s)-bicyklo| 6.1.0 |non-4-yn-9ylmethyl V-sukcinimidyl karbonátem, nebo funkčními deriváty tohoto karboxyalkanu obsahujícími dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou. Tyto polymer-analogické reakce typicky probíhají při laboratorní teplotě v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol.

Jedno výhodné provedení polymemího nosiče je takové, že volitelně může dále obsahovat 0,5 až 12 mol% dalších strukturních jednotek odvozených od obecného vzorce II, kde Y¹ a Y² jsou jak je definováno výše, ale Y³ je vybrán ze skupiny tvořené karbonyl-hydrazono-(C12-C18 alkanonem), karbonyl-hydrazono-5a-cholestanonem, karbonyl-hydrazono-cholest-4-en-3-onem, případně jiným substituentem odvozeným od ketoderivátů cholesterolu; nebo je vybrán ze skupiny tvořené karbonyl-(C9-C15 alkoxy), karbonyl-cholesterylu, nebo jiných sloučenin odvozených od cholesterolu, např. 7-dehydrocholesterolu, či vitamínu D; nebo je vybrán ze skupiny tvořené karboxamido-(C10-C18 alkylem) a karbohydrazido-(C10-C 18 alkylem), nebo karboxamido-(C10C18 alkenylem) akarbohydrazido-(C10-C18 alkenylem), obsahujícím aspoň jednu dvojnou vazbu (C=C), s výhodou odvozené od kyseliny olejové, linolové, linoleové.

Polymemí nosič může obecně mít lineární, větvenou, nebo síťovanou strukturu.

V případě lineární struktury se obvykle jedná o polymemí nosič obsahující 0,5 až 25 mol% monomemích jednotek vzorce II a/nebo koncových jednotek popsaných výše, a alespoň 75 mol% HPMA monomemích jednotek.

V případě větvené nebo síťované struktury je obsaženo alespoň 75 mol% HPMA monomemích jednotek a větvicích jednotek.

V některých provedeních polymemího nosiče větvené struktury je jen část funkčních skupin vhodných pro vazbu substituovaných sacharidů rozmístěna podél polymemího řetězce, nebo dokonce nejsou monomery vzorce II obsaženy vůbec. Funkční skupiny vhodné pro vazbu substituovaných sacharidů, nebo alespoň jejich část, mohou mít formu koncových skupin umístěných na jednom konci polymemího řetězce HPMA polymeru, přičemž druhý konec polymemího řetězce je navázaný k multivalentní molekule, např. dendrimeru, např. PAMAM dendrimemímu jádm nebo k jádru na bázi 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru. Prvním krokem přípravy je v takových provedeních polymerizace HPMA, která typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100°C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, terc-butylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory AIBN, ACVA, V70, za přítomnosti přenosového činidla obsahujícího karboxylovou skupinu nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou; přenosové činidlo je s výhodou vybrané ze skupiny obsahující 4kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu, 1 -kyano-1 -methyl -4-oxo-4-(2-14CZ 2020 - 137 A3 thioxothiazolidin-3 -yl)butyl dithiobenzoát, 2-kyano-5 -oxo-5 -(2-thioxo-1,3 -thiazolidin-3 yl)pentan-2-yl ethylkarbontrithioát. V druhém kroku jsou polymery navázány amidovou vazbou k multivalentní sloučenině nesoucí koncové primární aminoskupiny, s výhodou tvořené poly(amidoaminovým) (PAMAM), nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionovým dendrimerem, přičemž reakce typicky probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Dendrimer může tvořit až 3 mol% obsahu výsledného polymemího konjugátu. Následně jsou in situ zablokovány zbývající primární aminoskupiny nízkomolekulámí aminoreaktivní sloučeninou, s výhodou acetanhydridem. Ve třetím kroku jsou síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru buď redukovány borohydridem sodným a in situ dojde k adici SH skupin na A-derivovaný maleimid, s výhodou propynylmaleimid či azido-PEG3-maleimid, přičemž reakce probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující vodu, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Popřípadě jsou síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru reagovány s přebytkem azoiniciátoru nesoucím karboxylovou skupinu, nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou, a to při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid. Molámí hmotnost M, takto připravených polymerů je v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, s výhodou 100 000 až 400 000 g/mol.

Finálním krokem d) přípravy je vazba substituovaného sacharidu vybraného ze skupiny sestávající ze substituovaných sacharidů obecného vzorce III:

HO^OR⁵

U-V-W-R⁴ (III), kde kombinace U, V a W a R4 je vybrána z následujících možností lila, Illb, IIIc, Illd, lile:

Z OH f

R’ (lila) lila: kde V a W je jen vazba, a kde U je 1 -ί/ύο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R⁴, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R¹ a na atomu C-6 skupinou -OR⁶;

_rOH r^3u (Illb)

-15 CZ 2020 - 137 A3

IIIc: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

(Me) lile: kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3v a na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3w a na atomu C-l skupinou R⁴;

a kde

R¹ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou Cl -C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C2-C5 alkynylem, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 azidoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou azidoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(ClC5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou aminoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 aminoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, sulfoskupinu, kumaryl, benzoyl a C2-C5 alkynyl;

X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,

Y je CH2 nebo vazba,

Z je O nebo [l,2,3]-triazol.

-16 CZ 2020 - 137 A3

R⁴ je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, aminoskupinu, C2-C5 alkynyloxyskupinu, azid, C1-C5 azidoalkoxyskupinu, aminoethylthioureidyl, aminofenyloxyskupinu a azidofenyloxyskupinu,

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-C-sialyl, C1-C5 azidoalkyl, C2-C5 alkynyl a C1-C5 aminoalkyl;

přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu koncovou aminoskupinu, azidoskupinu nebo C2-C5 alkynyl, a to s výhodou jako součást substituentu vybraného z R¹, R⁵ nebo R⁶, pokud U je Ι-ί/ηο-β-D-galaktopyranosyl, a s výhodou jako součást substituentu R⁴ve všech ostatních kombinacích.

Sacharid v substituentu R¹ je s výhodou monosacharid, výhodněji 1 -O-a-D-galaktopyranosyl nebo 2-O-a-sialyl.

Pokud V a W je vazba a U je l-í/wo^-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R⁴, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R¹ a na atomu C-6 skupinou -OR⁶ (varianta lila), s výhodou R² je hydroxy skupina a R⁴ je také hydroxyskupina.

Pokud V a W je vazba a U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴ (varianta Illb), s výhodou R² je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu a acetamidoskupinu a R^3u je acetamidoskupina.

Pokud V a W je vazba a U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴ (varianta IIIc), svýhodou R² je hydroxyskupina aR^3u je acetamidoskupina.

Pokud V a W je vazba a U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴ (varianta Illd), s výhodou R² je hydroxyskupina aR^3u je acetamidoskupina.

Pokud U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3v a na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3w a na atomu C-l skupinou R⁴ (varianta lile), s výhodou R², R^3v a R^3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu a acetamidoskupinu a R^3u je acetamidoskupina.

Substituované sacharidy se k polymemímu nosiči navazují buď amidovou vazbou, nebo azidalkynovou cykloadicí, tzv. „click“ reakcí (za tvorby Línkem ze skupiny Y³ a ze substituentu na substituovaném sacharidu obsahujícího terminální aminové, azidové, alkynylové, nebo aminoethylthioureidylové skupiny, typicky substituentu R¹ nebo R⁴ nebo R⁵ nebo R⁶). Aminolytická reakce typicky probíhá v aprotickém rozpouštědle, s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid. Cykloadiční reakce je s výhodou katalyzovaná, s výhodou měďnými ionty, nebo může být nekatalyzovaná. Reakce typicky probíhá ve vodě, případně ve směsných rozpouštědlech tvořených vodou, vodnými pufry, alkoholy, aprotickým rozpouštědlem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid, případně jejich směsi. V případě cykloadiční reakce katalyzované mědí obsahuje reakční směs měďné či měďnaté kationty s výhodou díky přítomnosti CuSO4 nebo CuBr, a redukční činidlo, s výhodou kyselinu askorbovou nebo askorbát sodný. Ve všech případech je výhodné využít čištění pomocí gelové filtrace na koloně (např. s náplní Sephadex G-25) ve vodě a případně další čištění od kationtů mědi, s výhodou pomocí komplexace s 8-chinolinolem, a následného čištění na koloně (např. Sephadex LH-20) s methanolem jako mobilní fází.

-17 CZ 2020 - 137 A3

Důležitým přínosem vynálezu je vhodná prezentace substituovaného sacharidu na polymemím nosiči, přičemž jeho obsah v glykopolymeru tvoří 0,5 až 25 mol%, s výhodou 3 až 18 mol%. Multivalentní uspořádání substituovaných sacharidů na polymerech umožňuje multivalentní interakci s Gal-3, a tím významně navyšuje vazebnou aktivitu ke Gal-3 a obecně ke galektinům.

Předmětem vynálezu je dále imunomodulační účinek polymemích konjugátů se substituovanými sacharidy díky vazbě ke Gal-3 výše popsanou multivalentní interakcí. Aplikací polymemích nosičů se sacharidy dochází k vyvázání extracelulámího Gal-3 v nádorové tkáni, a tím k inhibici Gal-3 indukované apoptózy T lymfocytů v nádom, což umožní navýšení imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám přímo v nádom. Vazba polymemích nosičů s navázanými substituovanými sacharidy na Gal-3 přímo produkovaný nádorovými buňkami dále vede ke snížení migrace nádorových buněk. Vzhledem ktomu, že Gal-3 v některých typech nádorových buněk zvyšuje pravděpodobnost vzniku metastáz prostřednictvím inhibice vazby buněk k podkladu a buněk vzájemně mezi sebou, vede aplikace polymemích konjugátů se substituovanými sacharidy prostřednictvím vazby na Gal-3 ke snížení možnosti migrace buněk do metastatických ložisek a snížení jejich motility.

Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, která se vyznačuje tím, že obsahuje glykopolymer podle vynálezu obsahující aktivní substituovaný sacharid a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku vybranou ze skupiny zahrnující plniva, antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty.

Předmětem vynálezu je glykopolymer podle vynálezu a/nebo jeho farmaceutická kompozice pro použití jako léčivo k léčbě pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukemie, zejména kolorektálního karcinomu, karcinomu prostaty, karcinomu prsu, melanomu, lymfomu, leukemie.

Předmětem vynálezu je rovněž glykopolymer podle vynálezu a/nebo jeho farmaceutická kompozice pro použití jako adjuvancium při protinádorové terapii.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu Plíb (obsah substituovaného sacharidu 20 byl 4,9 mol%).

Obr. 2: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu Plíd (obsah substituovaného sacharidu 20 byl 9,7 mol%).

Obr. 3: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P13a (obsah substituovaného sacharidu 9 byl 5,1 mol%).

Obr. 4: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P13b (obsah substituovaného sacharidu 9 byl 8,9 mol%).

Obr. 5: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P14 (obsah substituovaného sacharidu 23 byl 9,5 mol%).

Obr. 6: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu P15 (obsah substituovaného sacharidu 26 byl 7,3 mol%).

Obr. 7: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu HPMA s jednoduchým disacharidem LacdiNAc (obsah LacdiNAc byl 12,3 mol%).

-18 CZ 2020 - 137 A3

Obr. 8: Inhibice migrace a proliferace myších (4T1, B16-F10) a lidských (DLD-1) nádorových buněk pomocí konjugátů Pila a Plic.

Seznam zkratek

ACVA, 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina); AIBN, 2'-azobis(2-methylpropionitril); Gal-3, galektin-3; HPMA, A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid; MA-AP-TT, 3-(3methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion; MA-propynyl, 2-methyl-A-(prop-2-yn-1 -yl)prop2-enamid; 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion; MA skupina, A-methakryloyl skupina; /Boc skupina, terc-butoxykarbonylová skupina; TT skupina, thiazolin-2-thionová skupina; TBAB, tetra-n-butylamoniumbromid; THPTA, trishydroxypropyltriazolylmethylaminový ligand; V70, 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4dimethylpentannitril); LacdiNAc (GalNAcP4GlcNAc); LacNAc (Gaip4GlcNAc); laktosa (Gaip4Glc), 4T1 (buněčná linie myšího nádoru prsu); B16-F10 (buněčná linie myšího kožního melanomu); CT26 (buněčná linie myšího kolorektálního karcinomu); DLD-1 (buněčná linie lidského kolorektálního adenokarcinomu); HEK293 (linie lidských embryonálních buněk z ledvin); HT-29 (buněčná linie lidského kolorektálního adenokarcinomu); Jurkat (imortalizovaná buněčná linie T lymfocytů); LNCaP (buněčná linie lidského adenokarcinomu prostaty); OVCAR3 (buněčná linie lidského adenokarcinomu vaječníků); PC3 (buněčná linie lidského adenokarcinomu prostaty); Ráji (lidská buněčná linie Burkittova lymfomu); SU-DHL-5 (buněčná linie lidského B-lymfomu); SU-DHL-6 (buněčná linie lidského B-lymfomu);

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Syntéza monomerů

A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA)

HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu (Chytil P. et al. Eur. J. Pharm. Sci 2010, 41 (3-4), 473-482). Produkt byl chromatograficky čistý. Ή-NMR (300 MHz, (CD3)₂SO, 296 K): δ 1,00-1,02 (d, 3H, CHOH-CH3), 1,85 (s, 3H, CH₃), 3,00-3,12 (m, 2H, CH₂), 3,64-3,73 (m, 1H, CH), 4,68-4,70 (d, 1H, OH), 5,30 a 5,66 (d, 2H, CH₂=), 7,59 (br, 1H, NH).

A-Methakryloylpropynylamin (MA-propynylamin) byl připraven podle dříve popsaného postupu. (Lynn G.M. et al., Biomacromolecules, 2019, 20 (2), 854-870) Produkt byl chromatograficky čistý. Ή-NMR (300 MHz, (CD₃)₂SO, 296 K): δ 1,85 (s, 3H, CH₃), 3,05 (s, 1H, =CH), 3,88 (d, 2H, -CH₂-), 5,37 a 5,68 (d, 2H, =CH₂), 8,37 (s, 1H, NH).

3-(3-Methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (MA-AP-TT)

MA-AP-TT byl připraven podle dříve popsaného postupu (Subr V. et al. Biomacromolecules 2006, 7 (1), 122-130). Produkt byl chromatograficky čistý. Ή-NMR (300 MHz, (CD3)₂SO, 295 K): δ 1,20-1,27 (m, 2H, CH₂-y), 1,40-1,54 (m, 4H, CH₂-p, CH₂-6), 1,82 (s, 3H, CH₃), 2,28 (t, 2H, CH₂a), 3,04-3,34 (m, 2H, CH₂-s), 3,57 (s, 3H, OCH₃), 5,28 a 5,60 (d, 2H, CH₂=), 7,88 (br, 1H, NH).

Cholest-5en-3p-yl 6-methacrylamido hexanoate (MA-AH-chol) byl připraven podle dříve popsaného postupu (Chytil P. et al. J. Controlled Release 2008, 127/2, 121-130). Produkt byl chromatograficky čistý. Bod tání 98 - 100 °C, Elementální analýza: Vypočteno: C 78,25 %, H 10,83 %, N 2,47 %; Nalezeno C 78,73 %, H 10,85 %, N 2,34 %, Ή-NMR (CDCI3): δ 5,81 br, 1H (NH); δ 5,65 a 5,29 d, 2H (CH₂=C(CH₃)CO); δ 4,58 m, 1H (CO-O-CH-(CH₂)₂); δ 3,30 m, 1H (CH₂-NH); vybrané intensity z cholesterolové části molekuly: δ 5.35 t, 1H (C=CH-CH₂); δ 0,66 s, 3H (C(18)H₃).

-19 CZ 2020 - 137 A3

Příklad 2: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-TT) radikálovou polymerací (Pl)

833 mg HPMA (5,82 mmol), 167 mg MA-AP-TT (0,646 mmol) a AIBN (160 mg; 0,974 mmol) byly rozpuštěny v 6,2 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostatované na 60 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 850 mg, 85 %; molámí hmotnosti M_w = 23 900 g/mol, M_a = 12 100 g/mol, D = 1,98.

Příklad 3: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-TT) řízenou RAFT radikálovou polymerací (P2)

800 mg HPMA (5,59 mmol) bylo rozpuštěno v 5,52 mL terc-butyl alkoholu a smícháno s roztokem 160 mg MA-AP-TT (0,621 mmol), 4.97 mg AIBN (17,7 pmol) a 7,84 mg 2-kyanopropan-2-yl dithioátu (35,5 pmol) v 1,38 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 16 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 730 mg, 76 %; molámí hmotnosti = 22 900 g/mol, = 20 600 g/mol, D = 1,11.

Příklad 4: Odstranění koncových skupin na polymeru pocházejících z přenosového činidla

700 mg polymeru P2 nesoucího koncové dithiobenzoátové skupiny a 70 mg iniciátoru AIBN bylo rozpuštěno v 5 mL dimethylsulfoxidu, probubláno argonem a zataveno ve skleněné ampuli. Po 2 h ve vodní lázni termostatované na 80 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek polymeru byl 621 mg.

-20CZ 2020 - 137 A3

Příklad 5: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-propynyl) řízenou RAFT radikálovou polymerací (P3)

264 mg HPMA (1,84 mmol) a 12 mg A-methakryloylpropynylaminu (MA-propynyl) (97,0 pmol) bylo rozpuštěno v 1,3 mL destilované vody a smícháno s roztokem 1,3 mg ACVA (4,7 pmol) a 2,6 mg 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanové kyseliny (9,5 pmol) v 0,65 mL dioxanu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 7 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a zcentrifugován. Čištění probíhalo gelovou filtrací s použitím kolony s náplní Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl získán srážením do diethyletheru, filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 127 mg, 46 %; molámí hmotnosti A/_w = 22 900 g/mol, M_n = 20 600 g/mol, D = 1,11.

Příklad 6: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-propynyl) konjugací propynylaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P4)

600 mg polymemího prekurzoru (obsahujícího 0,54 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 6 mL dimethylformamidu a za míchání při laboratorní teplotě bylo k roztoku přidáno 40 pL propynylaminu (0,65 mmol) a 108 pL A-ethyldiisopropylaminu (0,65 mmol). Reakce probíhala 16 h při laboratorní teplotě. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL), filtrací a sušením. Výtěžek: 560 mg; molámí hmotnosti: = 21 800 g/mol, M_n = 20 200 g/mol, D = 1,08.

Příklad 7: Syntéza hvězdicového kopolymeru obsahující PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-propynylem (P5)

- 21 CZ 2020 - 137 A3

500 mg ΗΡΜΑ (3,49 mmol) bylo rozpuštěno v 3,4 mL terc-butylaikoholil a smícháno s roztokem 2,8 mg 2-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxo-thiazolidin-3-yl)-butylazo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)-pentannitrilu (5,4 pmol) a 4,4 mg 1-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3-yl)butylesteru dithiobenzoové kyseliny (10,7 pmol) v 0,85 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek: 345 mg, 69 %; molámí hmotnosti: M_w = 29 800 g/mol, M_n = 27 100 g/mol, D = 1,10.

340 mg polymemího prekurzom (obsahujícího 11,2 pmol koncových TT skupin) bylo rozpuštěno v 2,2 mL dimethylsulfoxidu a přidáno k 20 hmotn% methanolovému roztoku 1,5 mg PAMAM dendrimeru (1,4 pmol dendrimeru G2 s diaminobutanovým jádrem). Po 1,5 h míchání při laboratorní teplotě byla reakce zastavena přidáním 50 pL acetanhydridu. Polymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL), následně filtrací a sušením. Výtěžek konjugační reakce byl 85 % hvězdicového kopolymem.

100 mg hvězdicového polymemího prekurzom bylo rozpuštěno v 1 mL methanolu. Do míchaného roztoku polymem bylo přisypáno 10 mg práškového borohydridu sodného. Po 1 h míchání při laboratorní teplotě bylo in situ přidáno 10 mg propynylmaleimidu rozpuštěného v 0,2 mL methanolu. Po 1 h reakce byl polymer čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (25 mL), následovně filtrací a sušením. Molámí hmotnosti: M_w = 210 000 g/mol, D = 1,19. Obdobným způsobem byly připraveny vzorky využívající jako jádro 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer.

Příklad 8: Syntéza hvězdicového kopolymeru obsahující PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-TT (P6)

- 22 CZ 2020 - 137 A3

500 mg ΗΡΜΑ (3,49 mmol) bylo rozpuštěno v 3,4 mL terc-butylaikoholil a smícháno s roztokem 2,8 mg 2-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxo-thiazolidin-3-yl)-butylazo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)-pentannitril (5,4 pmol) a 4,4 mg 1-kyano-l -methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3-yl)butylesteru dithiobenzoové kyseliny (10,7 pmol) v 0,85 mL dimethylsulfoxidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 6 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek: 345 mg, 69 %; Molámí hmotnosti: M_w = 29 800 g/mol, M_n = 27 100 g/mol, D = 1,10.

340 mg polymemího prekurzoru (obsahujícího 11,2 pmol koncových TT skupin) bylo rozpuštěno v 2,2 mL dimethylsulfoxidu a přidáno k 20 hmotn% methanolového roztoku 1,5 mg PAMAM dendrimeru (1,4 pmol dendrimer G2 s diaminobutanovým jádrem). Po 1,5 h míchání při laboratorní teplotě byla reakce zastavena přidáním 50 pL acetanhydridu. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (120 mL), následován filtrací a sušením. Výtěžek konjugační reakce byl 85 % hvězdicového kopolymeru.

100 mg hvězdicového polymemího prekurzoru a 10 mg 2-[ 1-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3 -yl)-butylazo] -2-methyl-5 -oxo-5 -(2-thioxothiazolidin-3 -yl)-pentannitrilu bylo rozpuštěno v 0,7 mL dimethylsulfoxidu, probubláno argonem a zataveno ve skleněné ampuli. Po 3 h ve vodní lázni termostatované na 70 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (25 mL) a přesrážen z methanolu (1 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 25 mL). Polymer byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Molámí hmotnosti: M_w = 205 000 g/mol, D = 1,20. Obdobným způsobem byly připraveny vzorky využívající jako jádro 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer.

Příklad 9: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-azadihenzocyklooktyn) konjugací azadihenzocyklooktynaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P7)

- 23 CZ 2020 - 137 A3

200 mg polymemího prekurzoru (obsahujícího 0,11 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 2 mL dimethylformamidu a za míchání při laboratorní teplotě bylo k roztoku přidáno 32 mg azadibenzocyklooktynaminu (0,12 mmol) rozpuštěného v 0,1 mL dimethylformamidu a 22 pL Nethyldiisopropylaminu (0,13 mmol). Reakce probíhala 16 h při laboratorní teplotě. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (50 mL), následován filtrací a sušením. Výtěžek: 184 mg; Molámí hmotnosti: M_w = 28 000 g/mol, M_a = 25 200 g/mol, D = 1.11.

Příklad 10: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-propylazid) konjugací 3azido-1 -propylaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P8)

300 mg polymemího prekurzoru P2 bylo rozpuštěno v 3,5 mL methanolu a za míchání při lab.t. přidáno 40 pL 3-azido-1-propylaminu (0,40 mmol). Po 30 min bylo do reakční směsi přikapáno pomalu 92 pL/V-ethyldiisopropylaminu (0,53 mmol). Po 20 h reakce při lab.t. bylo přidáno 40 pL l-aminopropan-2-olu (0,29 mmol) a mícháno dalších 30 min. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (50 mL), následován filtrací a sušením. Výtěžek: 234 mg; Molámí hmotnosti:= 23 700 g/mol,= 21 100g/mol, D = 1.1; obsah azidových skupin 16,7 mol%.

Příklad 11: Syntéza 3'-O-[4-(azidomethyl)benzyl]-P-D-galaktopyranosyl-(l^l)-3-O-(4-{[4(brommethyl)-\H-1,2,3-triazol-1 -yl]methyl}benzyl)-1 -thio-P-D-galaktopyranosidu (3)

-24CZ 2020 - 137 A3

Výchozí látka P-D-galaktopyranosyl)-(l^l)-l-thio-P-D-galaktopyranosid (1) reagovala v 5 přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu2SnO) s nadbytkem bromidu za vzniku selektivně C-3, C-3’ disubstituované sloučeniny 2. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu tetra-n-butylamoniumbromidu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 - 84 °C). Následně byla pomocí cykloadiční click reakce terminální azidové funkční skupiny a alkynové skupiny propynylbromidu (0.5 eq.) za katalýzy Cu(I) v přítomnosti tris10 hydroxypropyltriazolylmethylaminového ligandů (THPTA) připravena sloučenina 3.

Příklad 12: Syntéza 2-azidoethyl-3-O-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-P-D-galaktopyranosyl(1 ^4)-2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosidu (7)

- 25 CZ 2020 - 137 A3

i TBAB

I BujSnO

I DIPEA

I benzytbramid

I suchý dioxan

I 24h, 84X i

Disacharid 6 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru 2-azidoethyl-2-acetamido-2deoxy-β-D-glukopyranosidu (5) a donoru p-nitrofenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D5 galaktopyranosidu (4) za katalýzy mutantni Tyr470His β-řV-acetylhexosamimdasou z Talaromyces flavus (Tyr470His 7/Hcx) (Bojarová P. et al. J Nanobiotechnol. 2018, 16, 73). Benzyl byl selektivně vnesen na C'-3 reakcí 6 s benzylbromidem v přítomnosti dibutylcinoxidu (Bu₂SnO) za vzniku substituovaného sacharidu 7.

io Příklad 13: Syntéza 3-O-propynyl-β-D-galaktopyranosyl-(l^l)-3-O-[(4-bromfenyl)-lH-(l,2,3triazol-4-yl)methyl]-β-D-galaktopyranosidu (9)

- 26 CZ 2020 - 137 A3

TBAB Bu₂SnO DIPEA propargylbromid suchý dioxan 24h, 82 - 94°C

CuSO₄

L-askorbát sodný ΤΗΡΤΑ p-azidophenylbromid í-butylalkohol/H₂O (1/1) 24°C, 2-4h

Br

Výchozí látka P-D-galaktopyranosyl)-(l^l)-l-í/no-P-D-galaktopyranosid (1) reagovala v přítomnosti cínového komplexu (Bu₂SnO) s nadbytkem propynylbromidu za vzniku selektivně C5 3, C-3’ disubstituované sloučeniny 8. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 - 94 °C). Druhý reakční krok založený na Cu(I)-katalýzováné azid-alkynové cykloadici 4-bromfenylazidu za katalýzy THPTA byl proveden ve směsi terc-butylalkoholu a vody za vzniku sloučeniny 9.

ίο Příklad 14: Syntéza 2-aminoethylthioureidyl-3-O-[(4-bromfenyl)-lH-(l,2,3-triazol-4-yl)methyl]β-D-galaktopyranosyl -( 1 ^3)-2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosidu (15)

- 27 CZ 2020 - 137 A3

TBAB

Bu₂SnO DIPEA propargylbrom id suchý dioxan 24h, 82 - 94°C

p-azidophenylbromid

CuSO₄, L-askorbát sodný ΤΗΡΤΑ w ř-butylalkohol/H₂O (1/1)

Výchozí disacharid 12 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru (tercbutoxykarbonylamino)ethylthioureidyl-2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosidu (11) (Bojarová P. et al. Molecules 2019, 24, 599) a donorup-nitrofenyl-P-D-galaktopyranosidu (10) za katalýzy rekombinantní p3-galaktosidasou z Bacillus circulans. Disacharid 12 reagoval v přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu2SnO) s nadbytkem propynylbromidu za vzniku selektivně C-3' substituované sloučeniny 13. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu (TBAB) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (82 - 94 °C). Následný reakční krok založený na ίο Cu(I)-katalyzované cykloadici mezi terminálním alkynem 13 a p-azidofenylbromidem v přítomnosti THPTA byl proveden ve směsi íerc-butylalkoholu a vody za vzniku sloučeniny 14.

- 28 CZ 2020 - 137 A3

Následné odchránění aminoskupiny za vzniku sloučeniny 15 proběhlo v IM HC1 při 4 °C po dobu 48 h.

Příklad 15: Syntéza β-D-GalNAc-( 1->4)-P-D-G1cNAc-( 1^3)-p-D-Gal-( 1^4)-p-D-GlcNAc-l-O(2-aminoethylthioureidyl) (LacdiNAc-LacNAc-linker-NH2; 20)

1$

Výchozí disacharid 16 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru (tercbutoxykarbonylamino)ethylthioureidyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosidu (11) (Bojarová P. et al. Molecules 2019, 24, 599) a donorup-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosidu (10) za katalýzy rekombinantní β4-galaktosidasou z Bacillus circulans. Disacharid 16 byl použit jako akceptor pro glykosylaci β-D-GlcNAc jednotkou za katalýzy rekombinantní β-Αacetylhexosaminidasou Bbhl z Bifidobacterium bifidum, selektivní pro tvorbu β(1—>3) vazby. Vzniklý trisacharid 18 byl dále použit jako akceptor pro glykosylaci β-D-GalNAc za katalýzy selektivní mutantní β-A-acetylhexosaminidasou z Talaromyces flavus za vzniku tetrasacharidu 19. Následné odchránění aminoskupiny u tetrasacharidu 19 za vzniku sloučeniny 20 proběhlo v 1M HC1 při 4 °C po dobu 48 h. Alternativně je možné tuto sloučeninu připravit pomocí rekombinantních glykosyltransferas dle postupů popsaných v literatuře (Laaf D. et al. Bioconjug. Chem. 2017, 28,2832-2840).

- 29 CZ 2020 - 137 A3

Příklad 16: Syntéza 3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-galaktopyranosyl-( 1 ^4)-2-acetamido-2-deoxy^D-glukopyranosylazidu (23)

²² TBAB

BUžSnO DIPEA bsnzyfcrofhid suchý dioxan 24h_t 84°C

I

Disacharid 22 byl připraven chemoenzymovou syntézou z akceptoru 2-acetamido-2-deoxy^-Dglukopyranosylazidu (21) a donoru p-nitrofenyl-2-deoxy-β-D-galaktopyranosidu (10) za katalýzy β4-galaktosidasou z Bacillus circulans (Tavares M. R. et al. Biomacromolecules 2020, 21, 2, 641652). Benzyl byl selektivně vnesen na C'-3 reakcí 22 s benzylbromidem v přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu₂SnO) za vzniku substituovaného sacharidu 23.

Příklad 17: Syntéza glukopyranosylazidu (26)

-O-(kumarylmethyl)-P-D-galaktopyranosyl-( 1 -^4)-β-ϋ-

Ac₂O, py

2, HBr/AcOH, CH₂CI₂

3. NaN₃

4. MeONa/ dry MěOH^

suchý diaxan 36^eC.16 h

Laktosa (24) byla peracetylována ve směsi acetanhydridu a bezvodého pyridinu. Vzniklý peracetát byl hromován HBr/AcOH při 0 °C v bezvodém dichlormethanu. Azidová skupina na C-l byla vnesena glykosylací fázovým transferem s NaN₃ za katalýzy tetrabutylamoniumhydrogensulfátem. Sloupcová chromatografie na silikagelu a následná deprotekce dle Zempléna dala vznik β-Dlaktosylazidu 25.

Azid 25 reagoval v přítomnosti dibutylcínoxidu (Bu₂SnO) s nadbytkem 3-(brommethyl)kumarinu za vzniku selektivně C-3' substituovaného disacharidu 26. Reakce probíhala v přítomnosti katalyzátoru fázového transferu (TBAB) a AýV-diisopropylethylaminu (DIPEA) v suchém dioxanu za zvýšené teploty (86 °C).

-30CZ 2020 - 137 A3

Příklad 18: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 15 spoly(HPMA-co-MA-AP-TT) (P9)

mg polymeru P2 (obsahujícího 14,6 pmol TT skupin) a 9,2 mg sloučeniny 15 (13,1 pmol) bylo rozpuštěno v 0,8 mL dimethylacetamidu a probubláno argonem. Po přídavku 2,3 pL Nethyldiisopropylaminu (13,1 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,1 pl l-aminopropan-2-olu (14,6 pmol) a ponecháno reagovat 1 h. Polymerní konjugát byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymerní frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymerní konjugát byl izolován lyofilizo váním. Výtěžek: 25,4 mg; 83,4 %; Molámí hmotnosti: M_w = 25400 g/mol, M_a = 23600 g/mol, D = 1,08; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 5,0 mol%.

Příklad 19: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu propynyl)em (P10) s poly(HPMA-co-MA-AP-

Ke 2 mg CUSO4 5H2O (16 pmol) rozpuštěným v 25 pL vody bylo přidáno k roztoku 25 mg poZy(HPMA-co-MA-AP-propynylu), P4, (17,4 pmol propynylových skupin), 1,6 mg askorbátu sodného (16,2 pmol) a 12,9 mg sloučeniny 3 (16,2 pmol) rozpuštěných v 225 pL vody. Reakční směs byla probublána argonem před a po přídavku síranu měďnatého a míchána 1 h při laboratorní teplotě. Poté byl roztok naředěn 1 mL 5% roztoku disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny,

-31CZ 2020 - 137 A3 polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25 ve vodě a lyofilizován. Konjugát byl rozpuštěn ve 2 mL methanolu a přidán nadbytek 8-chinolinolu. Po 20 min byl vzorek čištěn od zbytkové mědi gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Po odpaření rozpouštědla byl polymer rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Výtěžek: 29,4 mg; 84,0%; Molámí hmotnosti: M_w = 2Ί 500 g/mol, M_a = 25 200 g/mol, D = 1,09; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 9,8 mol%.

Příklad 20: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 20 s poly(HPMA-co-MA-AP-TT) (Pil)

Polymemí konjugát Pil byl připraven s různým obsahem cukerné složky. 20 mg polymeru P2 (obsahujícího 16,4 pmol TT skupin) a 2,7 mg substituovaného sacharidu 20 (3,0 pmol) v případě přípravy Pila, 5,3 mg substituovaného sacharidu 20 (5,9 pmol) v případě přípravy Pllb, 9,1 mg substituovaného sacharidu 20 (10,2 pmol) v případě přípravy Plic, nebo 10,3 mg substituovaného sacharidu 20 (11,2 pmol) v případě přípravy Plld bylo rozpuštěno v 1,2 mL směsi dimethylacetamidu se suchým methanolem (3:1) a probubláno argonem. Po přídavku 0,8 pL Nethyldiisopropylaminu (4,8 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,5 pl l-aminopropan-2-olu (20 pmol) a ponecháno reagovat 0,5 h. Polymemí konjugát byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymemí konjugát byl izolován lyofilizací. Charakteristiky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1. Charakteristika připravených glykopolymerů nesoucích substituovaný sacharid 20

Název konjugátu	Výtěžek reakce (%)	Obsah cukerné složky (mol%)*	M_w(g/mol) t	AL (g/mol) t
Pila	88	2,6	22500	21700	1,04
Pllb	90	4,9	24500	22400	1,09
Plic	91	7,2	28300	27300	1,03
Plld	90	9,7	28200	26300	1,07

* Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí Ή-NMR.

tMolámí hmotnosti a disperzita byly stanoveny pomocí GPC, jak je uvedeno v Příkladu 21.

Příklad 21: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 7 s poly(HPMA-co-MA-APazadibenzocyklooktynem) (P12)

-32CZ 2020 - 137 A3

mg poZy(HPMA-co-MA-AP-azadibenzocyklooktynu), P7, (8,9 pmol azadibenzocyklooktynových skupin) bylo rozpuštěno v 300 pL methanolu, smícháno s roztokem 5 6,3 mg substituovaného sacharidu 7 (11,0 pmol) v 200 pL methanolu a probubláno argonem. Po h míchání při laboratorní teplotě byl polymemí konjugát čištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zakoncentrována na vakuu na 1 mL a polymer byl izolován precipitací do nadbytku ethylacetátu (40 mL) a filtrací následovanou sušením do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 24,7 mg; 80,1%; Molámí hmotnosti: M_w = 30 800 g/mol,M_n = ίο 28 000 g/mol, D = 1,10; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 5,1 mol%.

Příklad 22: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 9 propylazidem) (P13) s poly(HPMA-co-MA-AP-

Polymemí konjugát P13 byl připraven s různým obsahem cukerné složky. 15 mg polymemího prekurzom P8 bylo rozpuštěno v 150 pL dimethylformamidu a smícháno s 3,54 mg (5.6 pmol), nebo 6,3 mg (9,9 pmol) substituovaného sacharidu 9 v 300 dimethylformamidu pro přípravu P13a,

-33CZ 2020 - 137 A3 či P13b, resp. Poté bylo přidáno 0,88 mg (6,2 pmol), nebo 2,42 mg (12,9 pmol) CuBr v případě P13a, či P13b, resp., a mícháno při lab.t. Po 20 h byl přidán nadbytek 8-chinolinolu, roztok byl míchán dalších 30 min a naředěn 2 mL methanolu. Polymerní konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Frakce obsahující polymer byla odpařena, produkt rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. P13a: Výtěžek: 15,3 mg; molámí hmotnosti: M_w = 28 600 g/mol, Μ_Ά = 25 900 g/mol, D = 1,L obsah cukerné složky v konjugátu byl 4,5 mol%. P13b: Výtěžek: 17,4 mg; molámí hmotnosti: = 30 600 g/mol, M„ = 28 100 g/mol, D = 1,L obsah cukerné složky v konjugátu byl 8,9 mol%.

Příklad 23: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 23 s poly(HPMA-co-MA-APpropylazidem) (PÍ4)

mg polymemího prekurzom P8 bylo rozpuštěno v 300 pL bezvodého methanolu a za míchání smícháno s 4,3 mg (8,7 pmol) substituovaného sacharidu 23 a 1,5 mg (9,5 pmol) CuBr rozpuštěných v směsi dimethylformamidu a methanolu (4:1). Po 20 h míchání při lab.t. byl přidán nadbytek 8-chinolinolu, roztok byl míchán dalších 30 min a naředěn 2 mL methanolu. Polymerní konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Frakce obsahující polymer byla odpařena, produkt rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. P14: Výtěžek: 15 mg; molámí hmotnosti: = 34 600 g/mol, M_n = 25 900 g/mol, £> = 1,3; obsah cukerné složky v konjugátu byl

9,5 mol%.

Příklad 24: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 26 s poly(HPMA-co-MA-APpropylazidem) (PÍ 5)

-34CZ 2020 - 137 A3 mg polymemího prekurzoru P8 bylo rozpuštěno v 150 pL bezvodého methanolu a za míchání smícháno s 5,8 mg (11,3 pmol) substituovaného sacharidu 26 a 2,0 mg (12,4 pmol) CuBr rozpuštěných v 100 pL dimethylformamidu. Po 20 h míchání při lab.t. byl přidán nadbytek 8chinolinolu, roztok byl míchán dalších 30 min a naředěn 2 mL methanolu. Polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Frakce obsahující polymer byla odpařena, produkt rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. P15: Výtěžek: 26 mg; molámí hmotnosti: M^ = 38 400 g/mol, M„ = 29 600 g/mol, D = 1,3; obsah cukerné složky v konjugátu byl 7,3 mol%.

Příklad 25: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 3 s hvězdicovým kopolymerem obsahujícím PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-propynylem (P16)

N=N

K 1 mg CUSO4 5H2O (8 pmol) rozpuštěným v 25 pL vody bylo přidáno k roztoku 25 mg hvězdicového kopolymeru obsahující PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořenápo/y(HPMA)propynylem, P5, (1,3 pmol propynylových skupin), 1 mg askorbátu sodného (10,1 pmol) a 2 mg sloučeniny 3 (2,5 pmol) rozpuštěných v 225 pL vody. Reakční směs byla probublána argonem před a po přídavku síranu měďnatého a míchána 1 h při laboratorní teplotě. Poté byl roztok naředěn 1 mL 5% roztoku disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny, polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25 ve vodě a lyofilizován. Konjugát byl rozpuštěn ve 2 mL methanolu a přidán nadbytek 8-chinolinolu. Po 20 min byl vzorek čištěn od zbytkové mědi gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Po odpaření rozpouštědla byl polymer rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Výtěžek: 23,1 mg; 85 %; Molámí hmotnosti: M_w = 220 000 g/mol, D = 1,12; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 0,7 mol%.

Příklad 26: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 23 s hvězdicovým kopolymerem obsahujícím PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-propynylem (PÍ 7)

-35CZ 2020 - 137 A3

Ke 1 mg CUSO4 5H2O (8 μmol) rozpuštěným v 25 pL vody bylo přidáno k roztoku 25 mg hvězdicového kopolymeru obsahující PAMAM dendrimemí jádro a ramena tvořenápoZy(HPMA)propynylem, P5, (1,3 pmol propynylových skupin), 1 mg askorbátu sodného (10,1 pmol) a 1 mg sloučeniny 23 (2 pmol) rozpuštěných v 225 pL vody. Reakční směs byla probublána argonem před a po přídavku síranu měďnatého a míchána 1 h při laboratorní teplotě. Poté byl roztok naředěn 1 mL 5% roztoku disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny, polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25 ve vodě a lyofilizován. Konjugát byl rozpuštěn ve 2 mL methanolu a přidán nadbytek 8-chinolinolu. Po 20 min byl vzorek čištěn od zbytkové mědi gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Po odpaření rozpouštědla byl polymer rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Výtěžek: 22,4 mg; 83 %; Molámí hmotnosti: M_w = 225 000 g/mol, D = 1,13; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 0,7 mol%.

Příklad 27: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 20 s hvězdicovým kopolymerem obsahujícím PAMAM dendrimerní jádro a ramena tvořená poly(HPMA)-TT (P18) o

s ^H)oh fy

A o-X^^^ o-Z-j _Λ o-2

NH ΝΗ-^·>'χ«ω,έ-0Η

HN.

HO

HN.

HO )OH

O-Z-?

xZ..ý'«„„i>OH HN.

HO o-2

Λ -NH

HN

HO

NH NH-jLy.

HN

O

HO )OH

O-Z?¹

HO

HN.

HO

O-2

HN.

O HO θ )oh fO-J^Z-OH

HN.

HO )OH

O-Z-J

HN.

mg polymeru P6 (obsahujícího 1,4 pmol TT skupin) a 1,6 mg substituovaného sacharidu 20 (1,7 pmol) bylo rozpuštěno v 1,2 mL směsi dimethylacetamidu se suchým methanolem (3:1) a probubláno argonem. Po přídavku 0,6 pL/V-ethyldiisopropylaminu (3,4 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1 pl 1 -aminopropan-2-olu (13 pmol) a ponecháno reagovat 0,5 h. Polymemí konjugát byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymemí konjugát byl izolován lyofilizací. Výtěžek: 21,8 mg; 82 %; Molámí hmotnosti: M_w = 215 000 g/mol, D = 1,15; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 0,7 mol%.

Příklad 28: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-TT-co-MA-AH-chol) řízenou RAFT radikálovou polymerací (P19)

-36CZ 2020 - 137 A3

979 mg ΗΡΜΑ (6,84 mmol) a 91,4 mg MA-AH-chol (0,16 mmol) bylo rozpuštěno v 9 mL terc5 butyl alkoholu a smícháno s roztokem 180,8 mg MA-AP-TT (0,70 mmol), 6,2 mg V-70 (20 pmol) a 8,8 mg 2-kyanopropan-2-yl dithioátu (40 pmol) v 1 mL dimethylacetamidu. Polymerační směs byla probublána argonem a zatavena ve skleněné ampuli. Po 16 h ve vodní lázni termostatované na 40 °C byla ampule ochlazena a otevřena. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (150 mL) a přesrážen z methanolu (6 mL) do směsi aceton - diethylether (3:1; 120 mL). Polymer ίο byl získán filtrací a sušením pod vakuem. Výtěžek 937 mg, 75 %; molámí hmotnosti = 23 000 g/mol. M, = 20 800 g/mol, D = 1,10.

Příklad 29: Syntéza statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AP-propynyl-co-MA-AH-chol) konjugací propynylaminu s poly(HPMA-co-MA-AP-TT-co-MA-AH-chol) (P20)

300 mg polymerního prekurzoru P19 (obsahujícího 0,27 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 3 mL dimethylformamidu a za míchání při laboratorní teplotě bylo k roztoku přidáno 20 pL 20 propynylaminu (0,32 mmol) a 54 pL /V-ethyldiisopropylaminu (0,32 mmol). Reakce probíhala 16 h při laboratorní teplotě. Polymer byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymer byl izolován srážením do nadbytku acetonu (60 mL), filtrací a sušením. Výtěžek: 270 mg; molámí hmotnosti: M_w = 22 300 g/mol, = 19 500 g/mol, D = 1,14.

-37CZ 2020 - 137 A3

Příklad 30: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 3 s poly(HPMA-co-MA-AP-propynylco-MA-AH-chol)em (P21)

Ke 2 mg CuSO4 5H2O (16 pmol) rozpuštěným v 25 pL vody bylo přidáno k roztoku 25 mg po/y(HPMA-co-MA-AP-propynyl-co-MA-AH-chol)u, P20, (18 pmol propynylových skupin), 1,6 mg askorbátu sodného (16,2 pmol) a 12,9 mg sloučeniny 3 (16,2 pmol) rozpuštěných v 225 pL vody. Reakční směs byla probublána argonem před a po přídavku síranu měďnatého a míchána 1 h při laboratorní teplotě. Poté byl roztok naředěn 1 mL 5% roztoku disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny, polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25 ve vodě a lyofilizován. Konjugát byl rozpuštěn ve 2 mL methanolu a přidán nadbytek 8-chinolinolu. Po 20 min byl vzorek čištěn od zbytkové mědi gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Po odpaření rozpouštědla byl polymer rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Výtěžek: 28,2 mg; 81 %; Molámí hmotnosti: M_w = 28 100 g/mol,M_n = 25 000 g/mol, D = 1,12; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 9,3 mol%.

Příklad 31: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 23 s poly(HPMA-co-MA-AP-propynylco-MA-AH-chol)em (P22)

-38CZ 2020 - 137 A3

Ke 2 mg CUSO4 5H2O (16 pmol) rozpuštěným v 25 pL vody bylo přidáno k roztoku 25 mg po/y(HPMA-co-MA-AP-propynyl-co-MA-AH-chol)u, P20, (18 pmol propynylových skupin), 1,6 mg askorbátu sodného (16,2 pmol) a 8,1 mg sloučeniny 23 (16,2 pmol) rozpuštěných v 225 pL vody. Reakční směs byla probublána argonem před a po přídavku síranu měďnatého a míchána 1 h při laboratorní teplotě. Poté byl roztok naředěn 1 mL 5% roztoku disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny, polymemí konjugát byl přečištěn gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25 ve vodě a lyofilizován. Konjugát byl rozpuštěn ve 2 mL methanolu a přidán nadbytek 8-chinolinolu. Po 20 min byl vzorek čištěn od zbytkové mědi gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Po odpaření rozpouštědla byl polymer rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Výtěžek: 28,0 mg; 81 %; Molámí hmotnosti: M_w = 27 300 g/mol, M_n = 24 800 g/mol, f) = 1,10; Obsah cukerné složky v konjugátu byl 9,0 mol%.

Příklad 32: Syntéza konjugátu substituovaného sacharidu 20 s poly(HPMA-co-MA-AP-TT-coMA-AH-chol) (P23)

mg polymem P19 (obsahujícího 15,6 pmol TT skupin) a 5,3 mg substituovaného sacharidu 20 (5,9 pmol) bylo rozpuštěno v 1,2 mL směsi dimethylacetamidu se suchým methanolem (3:1) a probubláno argonem. Po přídavku 0,8 pL A-ethyldiisopropylaminu (4,8 pmol) byla reakční směs míchána 20 h při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,5 pl 1-aminopropan-2-olu (20 pmol) a ponecháno reagovat 0,5 h. Polymemí konjugát byl čištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou filtrací na koloně Sephadex LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zbavena methanolu pomocí vakuové destilace a polymemí konjugát byl izolován lyofilizací. Výtěžek 22,5 mg, 89 %; molámí hmotnosti M_w = 24 900 g/mol, M_a = 22 600 g/mol, D = 1,10. Obsah cukerné složky v konjugátu byl 4,8 mol%.

-39CZ 2020 - 137 A3

Příklad 33: Příklad charakterizace polymerních prekurzorů a konjugátů

Připravené kopolymery, polymemí prekurzory i jejich konjugáty se substituovanými sacharidy byly charakterizovány stanovením váhového i početního průměru molámích hmotností (A/_w, M_n) a příslušného indexu disperzity (£>) pomocí gelové permeační chromatografie (GPC) na systému vybaveném UV detektorem (Shimadzu, Japan), Rl detektorem (Optilab REX, Wyatt Technology Corp., USA) a víceúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN Heleos-II, Wyatt Technology Corp., USA). Pro charakterizaci byla v případě SEC použita kolona TSK 3000 Super SW ajako mobilní fáze směs MeOH (80 %) a 0,3 M octanového pufru o pH 6,5 (20 %). Koncentrace vzorků byla ve všech případech 3 mg/ml.

Obsah TT skupin byl stanoven spektrofotometricky na UV-VIS spektrofotometru Specord 205 (Analytik Jena, Německo) v methanolu (ssos = 10 800 L.mol fcm¹) podle literatury (Subr V. et al. Biomacromolecules 2006, 7 (1), 122-130).

Obsah trojných vazeb a konjugovaných substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) na spektrometru Bruker Avance III 600 MHz ve vodě.

Příklad 34: ELISA

Afinita Gal-3 k substituovaným sacharidům a jejich konjugátům s polymery byla stanovena za použití kompetitivního ELISA stanovení (Bojarová P. et al. J Nanobiotechnol. 2018, 16, 73; Bumba L. et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 372). Toto stanovení dává předběžnou informaci o síle vazby Gal-3 na glykokopolymery, ale je třeba jej brát pouze jako orientační pomůcku a vzít v úvahu zvláště biologický účinek glykopolymerů (viz Příklady 25-27). V jamkách mikrotitračních destičkových modulů F16 Maxisorp NUNC-Immuno Modules (Thermo Scientific, Roskilde, Dánsko) byl imobilizován přes noc asialofetuin (Sigma Aldrich, Steinheim, Německo; 0,1 μΜ v PBS pufru, 50 pL, 5 pmol na jamku). Jamky byly následně vyblokovány BSA (2 % w/v) rozpuštěném v PBS (1 h, lab.t.). Posléze byla do jamek přidána směs testované sloučeniny v různých koncentracích a Gal-3 (celkový objem 50 pL; 4.5 pM finální koncentrace Gal-3) a inkubovány po dobu 2 hodin. Detekce navázaného Gal-3 byla provedena pomocí monoklonální anti-Hise-IgGl myší protilátky konjugované s křenovou peroxidasou (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo) rozpuštěné v PBS pufru (1:1000, 50 pL, 1 h, lab.t.). Substrátový roztok TMB One (Kem-En-Tec, Taastrup, Dánsko) byl použit k zahájení kolorimetrické reakce konjugované peroxidasy. Tato reakce byla zastavena přídavkem 3 M HC1 (50 pL). Vazebný signál navázaného Gal-3 byl stanoven spektrofotometricky při 450 nm (Spectra Max Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Získané výsledky byly analyzovány za použití softwaru Prism 7.0 (GraphPad, USA) a byly vyhodnoceny jako IC50.

Tabulka 2. Inhibiční potenciál vybraných sloučenin a konjugátů (IC50) stanovený metodou ELISA

Název konjugátu	Obsah cukerné složky [mol%] *	IC50 na glykan FúM]	ICso glykopolymerů FúM]
Laktosa	-	132	-
Substituovaný sacharid 20	-	7,2	-
Glykopolymer Pila	2,6	0,22	0,066
Glykopolymer Pllb	4,9	0,14	0,023
Glykopolymer Plic	7,2	4,8	0,51
Glykopolymer PÍ Id	9,7	4,4	0,40
Substituovaný sacharid 9	-	16	-
Glykopolymer P13a	4,5	28	4,2
Glykopolymer P13b	8,9	6,9	0,62

-40CZ 2020 - 137 A3

Glykopolymer P14	9,5	61	4,9
Substituovaný disacharid 26	-	8,5	-
Glykopolymer P15	7,3	8,2	0,56

* Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí Ή-NMR.

¹ Převzato z literatury (Bócker S. et al. Biomolecules 2015, 5, 1671-1696)

Příklad 35: Kvantifikace produkce Gal-3 u vybraných nádorových linií.

Buněčná linie	Detekce Gal-3 s využitím průtokové cytometrie	Exprese Gal-3 detekovaná pomocí metody Western blot
	Lokalizace na membráně	Lokalizace na membráně	Intracelulární
4T1	Netestováno	+	++
B16-F10	Netestováno	+	++
CT26	Netestováno	-	++
DLD-1	++	+	++
HEK293	++	+	++
HT-29	+	Netestováno	Netestováno
Jurkat	Netestováno	-	-
LNCaP	-	-	-
OVCAR-3	++	+	++
PC3	+	+	++
Ráji	-	Netestováno	Netestováno
SU-DHL-5	-	-	-
SU-DHL-6	+	Netestováno	Netestováno

Vysvětlivky: Míra exprese Gal-3 - = nedetekovatelná, „+“ = výrazná, „++“ = silně výrazná.

Příklad 36: Inhibice vazby externího galektinů-3 na povrch buněk s expresí galektinů-3 pomocí glykopolymerů

Schopnost glykopolymerů inhibovat vazbu externího Gal-3 na povrch buněk byla prokázána pomocí inhibičního vazebného testu průtokovou cytometrií. V testu byl použit proteinový konstrukt Gal-3-AVI nesoucí na své N-koncové části aminokyselinovou sekvenci Avi-tag, která umožňuje cílené navázání molekuly biotinu a jeho následnou detekci pomocí fluorescenčně značeného konjugátu streptavidin-fykoerytrin (L. Bumba et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 372). Jak bylo zjištěno imunochemickým testem pomocí metody ELISA, vazebné vlastnosti nativního Gal3 a Gal-3-AVI konstruktu jsou identické. Vazba glykopolymerů na Gal-3 inhibovala vazbu Gal-3 na povrch HEK293 buněk (imortalizovaná buněčná linie lidských zárodečných ledvinových

-41 CZ 2020 - 137 A3 buněk), u nichž byla prokázána silná exprese Gal-3 (viz Příklad 23) a zároveň velká kapacita vyvažovat volný Gal-3 z roztoku.

Alikvoty Gal-3-AVI konstruktu (finální koncentrace 10 Ig/mL) byly smíchány se zvyšující se koncentrací glykopolymeru Pllb (3 pM - 100 EM) nebo laktosy (3 nM - 100 mM) jako pozitivní kontroly a inkubovány po dobu 30 minut na ledu v PBS pufru s přídavkem 1% hovězího sérového albuminu (BSA). Tato směs byla přidána k suspenzi HEK293 buněk (10⁶ /mL) a pomalu promíchávána na ledu po dobu 30 min. Následně byly buňky promyty PBS pufrem a označeny pomocí streptavidin-fýkoerytrinového konjugátu (Biolegend, USA). Síla vazby Gal-3-AVI konstruktu na povrch HEK293 buněk byla analyzována pomocí průtokové cytometric a kvantifikována jako relativní intenzita fluorescence při 575 nm.

Tabulka 3. Inhibiční potenciál glykopolymeru Pllb (IC50) stanovený v inhibičním vazebném testu s buněčnou linií HEK293 pomocí průtokové cytometric

Název konjugátu	Obsah cukerné složky [mol%]*	IC50 glykopolymeru [pM]
Laktosa	-	225
Glykopolymer Pllb	4,9	0,057

* Obsah substituovaných sacharidů byl stanoven pomocí Ή-NMR.

Příklad 37: Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy lidských T buněk pomocí glykopolymeru Schopnost glykopolymerů účinně inhibovat apoptózu indukovanou Gal-3 byla prokázána prostřednictvím annexin NI propidiumjodid apoptotického testu průtokovou cytometrií. Experimenty byly provedeny na imortalizované buněčné linii lidských T lymfocytů Jurkat. Bylo prokázáno, že lidský Gal-3 produkovaný nádorovými buňkami do okolního prostředí indukuje u této linie apoptózu.

V pokusech in vitro byly Jurkat buňky preinkubovány s různými koncentracemi glykopolymerů PH a P13 (0,1; 1; 5; 10 a 50 μΜ) po dobu 5 minut a poté k nim byl přidán 10 pM Gal-3. Glykopolymery vyvažovaly volný Gal-3 z roztoku (okolí buněk), a ten tak nemohl indukovat apoptózu Jurkat buněk. Účinnost inhibice Gal-3 glykopolymery byla stanovena jako míra apoptózy buněk. Pro kontrolní experiment byl využit čistý HPMA polymer bez substituovaných sacharidů.

Glykopolymery inhibovaly apoptózu indukovanou Gal-3. Maximálního inhibičního efektu bylo dosaženo v koncentraci 5 pM nebo 1 pM v případě testovaného konjugátu Pllb nebo Plld (viz Obr. 1 a 2). Čistý HPMA polymer bez substituovaných sacharidů vykazoval také mírný protektivní účinek, a to v 50 pM koncentraci.

Glykopolymer P13 také prokázal vysoký inhibiční efekt (viz Obr. 3 a 4). I glykopolymery P14 (viz Obr. 5) a P15 (viz Obr. 6) prokázaly inhibiční efekt.

Příklad 38 (srovnávací): Inhibice galektinem-3 indukované apoptózy lidských T buněk (Jurkat) pomocí glykopolymeru nesoucího jednoduchý disacharid LacdiNAc

Tabulka 4. Charakteristika srovnávacího glykopolymeru nesoucího jednoduchý disacharid LacdiNAc

-42 CZ 2020 - 137 A3

Název konjugátu	Obsah cukerné složky (mol%)*	(g/mol)t	AL (g/mol)t		IC₅₀na glykan FúM]	IC₅₀ na glykopolymer FúM]
LacdiNAcHPMA	12,3	30100	28000	1,07	38,5	2,3

* Obsah sacharidu byl stanoven pomocí Ή-NMR.

t Molámí hmotnosti a disperzita byly stanoveny pomocí GPC, jak je uvedeno v Příkladu 21.

Obr. 7 znázorňuje inhibici galektinem-3 indukované apoptózy Jurkat buněk pomocí konjugátu HPMA polymeru s jednoduchým disacharidem LacdiNAc (obsah LacdiNAc byl 12,3 mol%, viz Tabulka 4). S analogickým konjugátem s obsahem 8,4 mol% LacdiNAc byly dosaženy stejné výsledky. Jedná se o totožný disacharid jako v publikaci (Bojarová P. et al. J. Nanobiotechnol. 2018, 16, 73). Je evidentní, že v buněčných testech vykázal tento konjugát výrazně nižší schopnost inhibovat apoptózu Jurkat buněk než konjugáty se substituovanými disacharidy, které jsou předmětem vynálezu.

Příklad 39: Inhibice migrace lidských i myších nádorových buněk

Migrace vybraných nádorových buněk, které exprimují Gal-3, byla studována s využitím tzv. scratch testu. Tento test je založen na nasazení zkoumané buněčné kultury na kultivační misku, při jejím 70-80 % nárůstu jsou buňky hrotem 1 mL plastové špičky seškrábnuty z povrchu v délce cca 1 cm a šířce cca 0,5-1 mm. Následně je vyměněno médium, v kterém jsou buňky kultivovány, a nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím testované látky. Migrace buněk je poté sledována rychlostí a mírou zarůstání vzniklé mezery.

Inhibiční účinek polymerů Pila obsahující 2,6 mol% a Plic obsahujících 7,2 mol% tetrasacharidu byl sledován po přidání k médiu myších buněk nádoru prsu (4T1), myší melanoblastomové buněčné linie (B16F10) a lidských buněk kolorektálního karcinomu (DLD1). Polymerní konjugáty byly přidány v koncentraci 10 μΜ nebo 20 pM. Po 24 a 48 h byla měřena oblast, která zůstává buňkami neporostlá, a byl sledován rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou bez přidaného polymemího konjugátu. Obr. 8 ukazuje rozdíly v šířce zarostlé zóny u kontrolního vzorku, ke kterému nebyl přidán žádný polymerní konjugát (kontrola), dále vzorku, ke kterému byl přidán samotný HPMA polymer (pHPMA), a vzorkům s konjugáty. V případě buněk 4T1 a B16F10 oba konjugáty způsobily inhibici migrace oproti kontrole i u vzorku inkubovanému s polymemím nosičem. U buněk DLD1 pouze konjugát s vyšším molámím zastoupením cukerné složky způsobil inhibici migrace odlišnou od kontroly a polymemího nosiče.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Glykopolymer na bázi HPMA polymerů s obsahem od 0,5 do 25 mol.%

- strukturních jednotek vzorce I:

Linker

I

Substituovaný sacharid (I), kde

Y¹ je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH₂)_q(C(O)-NH-(CH₂)_r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y¹ může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;

Y² je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;

Linker je vybrán ze skupiny zahrnující 1,2,3-triazolylen, (C1-C6 alkyl)-l,2,3-triazolylen; NH-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-; -NH-C(=S)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-; nebo k substituentu Y² prostřednictvím skupiny -C(=O)- nebo jen kovalentní vazbou vázaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, přičemž tento cyklooktynyl či azacyklooktynyl je dále konjugovaný s triazolylem;

Substituovaný sacharid je substituent odvozený od substituovaného sacharidu obecného vzorce III reakcí terminální aminové, azidové, alkynylové nebo aminoethylthioureidylové skupiny, přičemž skupiny vzniklé reakcí uvedených terminálních skupin jsou součástí Linkeru;

a/nebo

- koncových skupin o vzorci -S-sukcimmid-(CH₂)_r-Linker-Substituovaný sacharid nebo C(CN)(CH3)-(C1-C4 alkylenj-Linker-Substituovaný sacharid; kde r je vybráno ze skupiny zahrnující 1, 2 a 3, a Linker a Substituovaný sacharid jsou definovány výše;

přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III je

-44CZ 2020 - 137 A3

U—V-W-R⁴ (III), kde kombinace U, V a W je vybrána z následujících možností lila, Illb, lile, Illd, lile:

Z OH

R¹ (lila) lila: kde V a W je jen vazba, a kde U je 1 -ί/πο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R⁴, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R¹ a na atomu C-6 skupinou -OR⁶;

(IHb)

Illb: kde V a W je jen vazba a kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

lile: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

Illd: kde V a W je jen vazba a kde U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

(Hle)

-45 CZ 2020 - 137 A3

Ilie: kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3v a na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3w a na atomu C-l skupinou R⁴;

a kde

R¹ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou Cl -C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C2-C5 alkynylem, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 azidoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou azidoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(ClC5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou aminoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 aminoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, sulfoskupinu, kumaryl, benzoyl a C2-C5 alkynyl;

X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,

Y je CH₂ nebo vazba,

Z je O nebo [l,2,3]-triazol.

R², R^3u, R^3v, R^3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-L-fukosyl,

R⁴ je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, aminoskupinu, C2-C5 alkynyloxyskupinu, azid, C1-C5 azidoalkoxyskupinu, aminoethylthioureidyl, aminofenyloxyskupinu a azidofenyloxyskupinu,

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-a-sialyl, C1-C5 azidoalkyl, C2-C5 alkynyl a C1-C5 aminoalkyl;

přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu koncovou aminoskupinu, azidoskupinu nebo C2-C5 alkynyl, a to s výhodou jako součást substituentu vybraného z R¹, R⁵ nebo R⁶, pokud U je 1 -ίΛ/ο-β-D-galaktopyranosyl, a s výhodou jako součást substituentu R⁴ ve všech ostatních kombinacích;

a přičemž Substituovaný sacharid není laktosa (Ga^4Glc), LacNAc (Ga^4GlcNAc) ani LacdiNAc (GalNAcE4GlcNAc).
2. Glykopolymer podle nároku 1, kde nosič na bázi HPMA polymeru obsahuje polymemí řetězce tvořené HPMA polymerem a větvicí jednotky, přičemž větvícími jednotkami jsou s výhodou amidoaminové jednotky nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové jednotky.
3. Glykopolymer podle nároku 1 nebo 2, kde nosič na bázi HPMA polymerů dále obsahuje 0,5 až 12 mol.% strukturních jednotek s obecným vzorcem odpovídajícím obecnému vzorci I, kde Y¹a Y² jsou jak je definováno v nároku 1, ale struktura -Linker-Subst.sacharid je nahrazena substituentem vybraným ze skupiny tvořené karbonyl-hydrazono-(C12-C18 alkanonem), karbonyl-hydrazono-5a-cholestanonem, karbonyl-hydrazono-cholest-4-en-3-onem; karbonyl(C9-C15 alkoxy), karbonyl-cholesterylem, karbonyl-7-dehydrocholesterylem, karbonylvitamínem D; karboxamido-(C10-C 18 alkylem), karbohydrazido-(C10-C18 alkylem),

-46 CZ 2020 - 137 A3 karboxamido-(C10-C18 alkenylem) a karbohydrazido-(C10-C18 alkenylem), obsahujícím aspoň jednu dvojnou vazbu (C=C).
4. Způsob přípravy glykopolymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:

a) poskytnutí monomerů polymemího nosiče, a případně větvicích jednotek,

b) polymeraci monomerů polymemího nosiče,

c) volitelný krok polymer-analogických reakcí, d) navázání substituovaného sacharidu.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že krok a) poskytnutí monomerů zahrnuje poskytnutí fůnkcionalizovaných monomerů obecného vzorce II

kde

Y¹ je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH₂)_q(C(O)-NH-(CH₂)_r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Y¹ může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;

Y² je vybrán ze skupiny zahrnující vazbu, karbamoyl, karbamoyl-(Cl-C8-alkylen), a fenylen; přičemž karbamoylem se rozumí skupina -C(=O)-NH- i skupina -NH-C(=O)-;

Y³ je vybrán ze skupiny zahrnující primární amin (NH₂), tBoc substituovaný amin, azid, terminální alkynyl mající 2 až 8 atomů uhlíku, fenyl substituovaný alespoň jedním azidem nebo C2-C4 alkynylem; a cyklooktynyl či azacyklooktynyl substituovaný alespoň jedním halogenem, cyklopropanem nebo konjugovaný s alespoň jedním benzenovým kruhem, jako je například (ll,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl) nebo (l/?.8.S'.9,s)bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9-yl;, přičemž tento substituovaný cyklooktynyl či azacyklooktynyl je vázán přes karbonylovou skupinu; -karbonyl-thiazolin-2-thionovou skupinu (TT), karbonyl-4-nitrofenoxy skupinu, -karbonyl-2,3,4,5,6-pentafluorfenoxy skupinu, -karbonylsukcinimidylovou skupinu, a COOH skupinu; přičemž karbonyl je -C(=O)- skupina, a dále poskytnutí A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), a případně methakryloyl(aminoacyl) esterů a/nebo větvicích jednotek.
6. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačený tím, že krok b) syntézy polymemích nosičů polymeraci monomerů se provede při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, íerc-butylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující 2-kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2-kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2-kyano-2-

-47 CZ 2020 - 137 A3 propylethyltrithiokarbonát a 4-kyano-4-[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu.
7. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačený tím, že krok b) syntézy polymemích nosičů polymerací monomem a větvicích jednotek se provede tak, že prvním krokem přípravy je polymerizace HPMA při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující vodu, vodné pufry, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, íerc-butylalkohol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory AIBN, ACVA, V70, za přítomnosti přenosového činidla obsahujícího karboxylovou skupinu nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou; kde přenosové činidlo je s výhodou vybrané ze skupiny obsahující 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 4kyano-4-[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu, 1 -kyano-1 -methyl-4-oxo4-(2-thioxothiazolidin-3 -yljbutyl dithiobenzoát, 2-kyano-5 -oxo-5 -(2-thioxo-1,3 -thiazolidin-3 yl)pentan-2-yl ethylkarbontrithioát, a v druhém kroku se provede reakce polymerů získaných v prvním kroku s multivalentní sloučeninou nesoucí koncové primární aminoskupiny, s výhodou tvořenou poly(amidoaminovým) nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionovým dendrimerem, za tvorby amidové vazby mezi HPMA a multivalentní sloučeninou, přičemž reakce se provádí v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol, následně se in situ zablokují zbývající primární aminoskupiny nízkomolekulámí aminoreaktivní sloučeninou, s výhodou acetanhydridem, ve třetím kroku se síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru buď redukují borohydridem sodným a in situ dojde k adici SH skupin na A-derivovaný maleimid, s výhodou propynylmaleimid či azido-PEG3-maleimid, přičemž reakce probíhá v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující vodu, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol; nebo se síru obsahující skupiny na druhém konci polymeru podrobí reakci s přebytkem azoiniciátoru nesoucím karboxylovou skupinu, nebo její funkční derivát obsahující dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou, a to při teplotě v rozmezí od 50 do 100 °C, s výhodou 60 až 80 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že se dále provede krok odstranění koncových skupin obsahujících síru z polymerů, při jejichž přípravě bylo použito přenosové činidlo, ve kterém jsou tyto polymery reagovány s přebytkem azoiniciátoru ze skupiny zahrnující 2,2'-azobis(2methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), za vzniku polymemího nosiče zakončeného zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 8, vyznačený tím, že se dále provede krok c) zavedení azidové či alkylové skupiny postupem vybraným z:

(i) reakce Y³ skupiny na polymeru, pokud ta je odstupující skupinou, s aminosloučeninou zakončenou skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň jedním azidem, C2-C5 terminálním alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 3-amino-l-(l 1,12didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)propan-l-onem, či Λ'-|( l/?.8.S'.9,s)-bicyklo|6.1,0|non-4-yn9-ylmethyloxykarbonyl] -1,8-diamino-3,6-dioxaoctanem;

(ii) reakce Y³ skupiny na polymeru, pokud ta je primární aminoskupinou, s karboxy(Cl-C8 alkanem) zakončeným skupinou vybranou z azidu, ethynylu, fenylu substituovaného alespoň

-48 CZ 2020 - 137 A3 jedním azidem, C2-C5 alkynylem, nebo substituovaným cyklooktynem, s výhodou 6-(11,12didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanovou kyselinou, či jejím Nhydroxysukcinimidyl esterem a (lR,8S,95)-bicyklo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl A-sukcinimidyl karbonátem, nebo funkčními deriváty tohoto karboxyalkanu obsahujícími dobře odstupující skupinu tvořenou s výhodou TT, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxy, nebo sukcinimidylovou skupinou.
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 9, vyznačený tím, že v kroku d) se na polymemí nosič naváže substituovaný sacharid vybraný ze skupiny sestávající ze substituovaných sacharidů obecného vzorce III: kde kombinace U, V a W je vybrána z následujících možností lila, Illb, lile, Illd, lile:

Z OH

Λ

Ř¹ (lila) lila: kde V a W je vazba, a kde U je Ι-ίΛζο-β-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R⁴, na atomu C-3 uskupením -Z-Y-X-R¹ a na atomu C-6 skupinou -OR⁶;

R^3u (Illb)

Illb: kde V a W je vazba a kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

lile: kde V a W je vazba a kde U je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

-49 CZ 2020 - 137 A3

Illd: kde V a W je vazba a kde U je 3-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l skupinou R⁴;

lile: kde U je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3u a na atomu C-l substituentem V, kde V je 3-O-D-galaktopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3v a na atomu C-l substituentem W, kde W je 4-O-D-glukopyranosyl substituovaný na atomu C-2 skupinou R^3w a na atomu C-l skupinou R⁴;

a kde

R¹ je vybrán ze skupiny obsahující vodík, fenyl, fenyl substituovaný alespoň jedním halogenem, fenyl substituovaný alespoň jednou nitroskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou karboxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou C1-C5 alkoxyskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C2-C5 alkynylem, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 azidoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou azidoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním halogen(ClC5)alkyltriazolylem, fenyl substituovaný alespoň jednou sulfoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou kyanoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jednou aminoskupinou, fenyl substituovaný alespoň jedním C1-C5 aminoalkylem, fenyl substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou, naftyl, naftyl substituovaný alespoň jedním halogenem, bifenyl, sacharid, C2C6 heteroaryl obsahující alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S, N, sulfoskupinu, kumaryl, benzoyl a C2-C5 alkynyl;

X je [l,2,3]-triazol nebo vazba,

Y je CH₂ nebo vazba,

Z je O nebo [l,2,3]-triazol.

R², R^3u, R^3v, R^3w jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, acetamidoskupinu, C1-C5 acylamidoskupinu, 1-O-a-fukosyl,

R⁴ je vybrán ze skupiny obsahující hydroxyskupinu, aminoskupinu, C2-C5 alkynyloxyskupinu, azid, C1-C5 azidoalkoxyskupinu, aminoethylthioureidyl, aminofenyloxyskupinu a azidofenyloxyskupinu,

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, sulfoskupinu, 2-O-a-sialyl, C1-C5 azidoalkyl, C2-C5 alkynyl a C1-C5 aminoalkyl;

přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III obsahuje vždy právě jednu koncovou aminoskupinu, azidoskupinu nebo C2-C5 alkynyl, a to s výhodou jako součást substituentu

-50CZ 2020 - 137 A3 vybraného z R¹, R⁵ nebo R⁶, pokud U je Ι-ί/πο-β-D-galaktopyranosyl, a s výhodou jako součást substituentu R⁴ ve všech ostatních kombinacích a přičemž substituovaný sacharid obecného vzorce III není laktosa (Ga^4Glc), LacNAc (Ga^4GlcNAc) ani LacdiNAc (GalNAc34GlcNAc).
11. Glykopolymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako léčivo, adjuvans, nebo imunomodulant.
12. Glykopolymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pro léčbu pevných nádorů, lymfomu nebo leukemie; nebo pro použití pro inhibici migrace nádorových buněk a potlačení metastatického rozsevu nádorových onemocnění; nebo pro použití pro inhibici indukce apoptózy u buněk imunitního systému v nádoru.
13. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje glykopolymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku vybranou ze skupiny zahrnující plniva, antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzerv an ty. sladidla, sorbenty.