BE1022878A1 - Vaccins anti-meningococciques - Google Patents
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Abstract
Cette invention concerne des vaccins antiméningococciques qui peuvent être améliorés par incorporation de multiples allèles ou variants de fHbp, afin de couvrir plus largement la diversité connue de cette protéine, et/ou par réduction de la quantité du composant OMV dans chaque dose.
rHI m i_i_
Description
VACCINS ANTI—MENINGOCOCCIQUES DOMAINE TECHNIQUE
Cette invention relève du domaine de la vaccination antiméningococcique .
CONTEXTE
Neisseria meningitidis est une bactérie capsulée à Gram-négatif qui colonise les voies respiratoires supérieures d'environ 10 % de la population humaine. Des vaccins conjugués sont disponibles contre les sérogroupes A, C, W135 et Y, mais le seul vaccin disponible pour se protéger contre le sérogroupe B en général est le BEXSERO™ qui a été approuvé en 2013. Ce produit contient quatre composants immunogènes principaux : la protéine liant le facteur H, "fHbp" ; la protéine liant l'héparine, NHBA ; l'adhésine A de Neisseria, NadA ; et les vésicules de membrane externe (OMV).
RESUME DE L'INVENTION
Selon un aspect, la présente invention est une composition immunogène comprenant un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, en combinaison avec un ou plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) des vésicules de membrane externe de méningocoques.
Selon un autre aspect, la présente invention est une composition immunogène comprenant des vésicules de membrane externe de méningocoques en combinaison avec un ou plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3 ; les vésicules de membrane externe (OMV) étant présentes à une concentration entre 5 et 30 pg/ml. En particulier, le polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3 est un polypeptide de fusion stabilisé et/ou ne liant pas fHbp. Plus particulièrement, le fHbp vl porte une mutation à la position R41, par exemple une mutation R41S. Plus particulièrement encore, les polypeptides fHbp v2 et v3 portent une ou plusieurs mutations stabilisantes et/ou ne liant pas le facteur H (fH) aux positions suivantes, numérotées selon les séquences pleine longueur (SEQ ID NO : 1 & 3) et également selon les séquences AG (SEQ ID NO : 8 & 7) :
Selon un autre aspect, la présente invention est une composition immunogène comprenant un polypeptide de fusion ayant une séquence d'acides aminés de formule NH2—A-[-X-L]3-B— COOH, où chaque X est un variant différent de la séquence fHbp, L est une séquence d'acides aminés lieur (« linker ») facultative, A est une séquence d'acides aminés N-terminale facultative, et B est une séquence d'acides aminés C-terminale facultative.
Selon un autre aspect, la présente invention est une méthode destinée à protéger un mammifère, tel qu'un sujet humain, contre une infection à méningocoques, comprenant l'administration d'une composition immunogène selon 1'invention.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 montre une courbe RCD, la proportion étant indiquée sur l'axe des y (de 0,0 à 1,0) et le titre SBA sur l'axe des x (de 0 à 256, par incréments de 16) . La courbe du haut est celle du groupe C ; le groupe le plus rapide à atteindre 0,0 est S.
La Figure 2 est la représentation d'une mutation stabilisante et d'une mutation ne liant pas le facteur H (fH) introduites dans les polypeptides fHbp vl, v2 et v3 pour produire les protéines de fusion 731 S et 731 SNB.
Les Figures 3 (a)-(g) montrent que les compositions comprenant la fusion 741-231 (SEQ ID NO : 10) et H OMV suscitent des GMT plus élevés que BEXSERO™ contre sept souches testées (3a=v2, 3b=v2, 3c=v3, 3d=v3, 3e=v2, 3f=v2, 3g=v3).
DESCRIPTION DETAILLEE
Pour améliorer le BEXSERO™, il serait avantageux d'améliorer encore sa couverture contre diverses souches méningococciques (en cas de décalages potentiels et de mutations au fur et à mesure que l'utilisation du vaccin se généralise) et également de réduire les rares occurrences de fièvre qui sont parfois observées quand le vaccin est coadministré avec des vaccins infantiles classiques [1] . A ces fins, les inventeurs ont modifié le BEXSERO™ de deux façons : (i) pour inclure de multiples allèles ou variants de fHbp, et couvrir plus largement la diversité connue de cette protéine ; et (ii) pour réduire la quantité du composant OMV dans chaque dose. Comme démontré dans la présente, ces deux modifications conduisent bel et bien à une amélioration du vaccin.
Par conséquent, dans un premier mode de réalisation, l'invention est une composition immunogène comprenant un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, en combinaison avec un ou plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) des vésicules de membrane externe de méningocoques.
De plus, selon un second mode de réalisation, la présente invention est une composition immunogène comprenant des vésicules de membrane externe de méningocoques en combinaison avec un ou plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3 ; les vésicules de membrane externe (OMV) étant présentes à une concentration entre 5 et 30 pg/ml.
De manière similaire, en combinant ces deux modes de réalisation, l'invention est une composition immunogène comprenant (i) un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, (ii) un polypeptide NHBA, (iii) un polypeptide NadA et (iv) de 5 à 30 pg/ml de vésicules de membrane externe de méningocoques.
Protéine liant le facteur H (fHbp)
Une composition selon l'invention peut comprendre un polypeptide fHbp. Le BEXSERO™ comprend un polypeptide fHbp, ledit fHbp ayant également été connu sous les noms de "741" (SEQ ID NO : 2536 dans réf. 2 ; SEQ ID 1 dans la présente), "NMB1870", "GNA1870" [3,5], "P2086", "LP2086" ou "ORF2086" [6,8]. La structure 3D de cette protéine est connue [9,10], et comporte deux tonneaux ß joints par un court lieur (« linker »). De nombreuses publications ont rapporté l'efficacité protectrice de cette protéine dans les vaccins anti-méningococciques, voir p. ex. références 11,15. Cette protéine est exprimée sous une forme lipidée dans de multiples souches couvrant tous les sérogroupes. Les séquences fHbp ont été regroupées en trois variants [3] (désignés vl, v2 et v3 dans la présente), et il s'est avéré de manière générale qu'un sérum dirigé contre un variant donné est bactéricide envers les souches qui expriment ce variant, mais n'est pas actif envers les souches qui expriment l'un des deux autres variants, à savoir qu'il y a une protection croisée intra-variant, mais pas de protection croisée inter-variants (hormis quelques cas de réactivité croisée v2 et v3).
Pour accroître la réactivité croisée inter-variants, la séquence fHbp a été remaniée pour contenir certaines spécificités pour les trois variants [16] . Au lieu de suivre cette approche, cependant, l'invention utilise un polypeptide de fusion qui comprend les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3 . fHbp vl
Le fHbp pleine longueur provenant de la souche MC58 dans vl a la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO : 1) : MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAERGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG IRHIGLAAKQ '
La lipoprotéine mature est dépourvue des 19 premiers acides aminés de SEQ ID NO : 1 (soulignés ; donne SEQ ID NO : 4, commençant par Cys-20). Le BEXSERO™ contient une forme "AG" du fHbp vl dans laquelle la séquence pleine longueur est tronquée jusqu'au résidu 26 (à savoir, qui élimine la portion poly-glycine et commence à la place par Val-27), donnant SEQ ID NO : 7.
Un fHbp méningococcique vl utilisé dans le cadre de l'invention comprendra une séquence d'acides aminés (i) présentant une identité de séquence d'au moins i % avec SEQ ID NO : 7, et/ou (ii) comprenant un fragment de SEQ ID NO : 7.
La valeur de i peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 7) et plus préférablement de 95.
De manière générale, le fragment mentionné en (ii) comportera au moins 7 acides aminés, p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 acides aminés contigus ou plus provenant de SEQ ID NO : 7. Le fragment contiendra typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 7. L'identification et la cartographie des épitopes de fHbp sont établies [12 ; 17,21]. Le partage d'au moins 30 acides aminés contigus avec SEQ ID NO : 7 sera typique, et généralement une séquence d'acides aminés de fHbp vl contiendra plusieurs, (p. ex. 2, 3, 4, 5 ou plus) fragments provenant de SEQ ID NO : 7.
Dans l'ensemble, une séquence d'acides aminés de fHbp vl peut présenter une identité de séquence d'au moins i % avec SEQ ID NO : 7 et contenir plusieurs fragments provenant de celle-ci. Généralement, une séquence de fHbp vl contient au moins une séquence d'acides aminés qui n'est pas présente dans SEQ ID NO : 2 et/ou au moins une séquence d'acides aminés qui n'est pas présente dans SEQ ID NO : 3.
Un polypeptide utilisé dans le cadre de l'invention et contenant une séquence vl peut, après administration à un mammifère hôte convenable (tel qu'une souris ou un sujet humain), susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4. Ces anticorps comprendront certains anticorps qui ne reconnaissent pas un polypeptide v2 ou v3 (p. ex. qui ne reconnaîtront pas un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 5 et un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 6), bien qu'ils puissent également comprendre certains anticorps ayant des réactions croisées avec des polypeptides v2 et/ou v3. Dans l'idéal, les anticorps sont bactéricides envers une souche méningococcique qui exprime un fHbp vl, p. ex. envers la souche MC58 (voir ci-dessous). fHbp v2
Le fHbp pleine longueur provenant de la souche 2996 dans v2 a la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO : 2) :
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEK INNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGK IEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKV HEIGIAGKQ
La lipoprotéine mature est dépourvue des 19 premiers acides aminés de SEQ ID NO : 2 (soulignés ; donne SEQ ID NO : 5) et la forme AG de SEQ ID NO : 2 est dépouvue des 26 premiers acides aminés (SEQ ID NO : 8).
Un fHbp méningococcique v2 utilisé dans le cadre de l'invention comprendra une séquence d'acides aminés (i) présentant une identité de séquence d'au moins j % avec SEQ ID .NO : 8, et/ou (ii) comprenant un fragment de SEQ ID NO : 8.
La valeur de j peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 8) et plus préférablement de 95.
De manière générale, le fragment mentionné en (ii) comportera au moins 7 acides aminés, p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 acides aminés contigus ou plus provenant de SEQ ID NO : 8. Le fragment contiendra typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 8. L'identification et la cartographie des épitopes de fHbp sont établies (voir ci-dessus) . Le partage d'au moins 30 acides aminés contigus avec SEQ ID NO : 8 sera typique, et généralement une séquence d'acides aminés de fHbp v2 contiendra plusieurs (p. ex. 2, 3, 4, 5 ou plus) fragments provenant de SEQ ID NO : 8.
Dans l'ensemble, une séquence d'acides aminés de fHbp v2 peut présenter une identité de séquence d'au moins j % avec SEQ ID NO : 8 et contenir plusieurs fragments provenant de celle-ci. Généralement, une séquence de fHbp v2 contient au moins une séquence d'acides aminés qui n'est pas présente dans SEQ ID NO : 1 et/ou au moins une séquence d'acides aminés qui n'est pas présente dans SEQ ID NO : 3.
Un polypeptide utilisé dans le cadre de l'invention et contenant une séquence v2 peut, après administration à un mammifère hôte convenable (tel qu'une souris ou un sujet humain), susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 5. Ces anticorps comprendront certains anticorps qui ne reconnaissent pas un polypeptide vl ou v3 (p. ex. qui ne reconnaîtront pas un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4 et un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 6), bien qu'ils puissent également comprendre certains anticorps ayant des réactions croisées avec des polypeptides vl et/ou v3. Dans l'idéal, les anticorps sont bactéricides envers une souche méningococcique qui exprime un fHbp v2, p. ex. envers la souche M2091 (voir ci-dessous). fHbp v3
Le fHbp pleine longueur provenant de la souche M1239 dans v3 a la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO : 3) :
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSI PQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSAT VKIGEKVHEIGIAGKQ
La lipoprotéine mature est dépourvue des 19 premiers acides aminés de SEQ ID NO : 3 (soulignés ; donne SEQ ID NO : 6) et la forme AG de SEQ ID NO : 3 est dépouvue des 31 premiers acides aminés (SEQ ID NO : 9).
Un fHbp méningococcique v3 utilisé dans le cadre de l'invention comprendra une séquence d'acides aminés (i) présentant une identité de séquence d'au moins k % avec SEQ ID NO : 9, et/ou (ii) comprenant un fragment de SEQ ID NO : 9.
La valeur de k peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 9) et plus préférablement de 95.
De manière générale, le fragment mentionné en (ii) comportera au moins 7 acides aminés, p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, . 60, 65, 70, 75, 80 acides aminés contigus ou plus provenant de SEQ ID NO : 9. Le fragment contiendra typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 9. L'identification et la cartographie des épitopes de fHbp sont établies (voir ci-dessus) . Le partage d'au moins 30 acides aminés contigus avec SEQ ID NO : 9 sera typique, et généralement une séquence d'acides aminés de fHbp vl contiendra plusieurs (p. ex. 2, 3, 4, 5 ou plus) fragments provenant de SEQ ID NO : 9.
Dans l'ensemble, une séquence d'acides aminés de fHbp v3 peut présenter une identité de séquence d'au moins k % avec SEQ ID NO : 9 et contenir plusieurs fragments provenant de celle-ci. Généralement, une séquence de fHbp v3 contient au moins une séquence d'acides aminés qui n'est pas présente dans SEQ ID NO : 1 et/ou au moins une séquence d'acides aminés qui n'est pas présente dans SEQ ID NO : 2.
Un polypeptide utilisé dans le cadre de l'invention et contenant une séquence v3 peut, après administration à un mammifère hôte convenable (tel qu'une souris ou l'homme), susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 6. Ces anticorps comprendront certains anticorps qui ne reconnaissent pas un polypeptide vl ou v2 (p. ex. qui ne reconnaîtront pas un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4 et un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 5) , bien qu'ils puissent également comprendre certains anticorps ayant des réactions croisées avec des polypeptides vl et/ou v2. Dans l'idéal, les anticorps sont bactéricides envers une souche méningococcique qui exprime un fHbp v3, p. ex. envers la souche M01-240355 (voir ci-dessous).
Polypeptide de fusion L'invention utilise un polypeptide de fusion qui comprend les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3. Par conséquent, le polypeptide de fusion peut inclure au moins un épitope provenant de chacune des SEQ ID NO : 7, 8, et 9 et, après administration à un mammifère hôte, peut susciter la production d'anticorps capables de reconnaître les trois polypeptides, à savoir (i) un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4, (ii) un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 5, et (iü) un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 6. Dans l'idéal, ces anticorps sont bactéricides envers une souche méningococcique qui exprime un fHbp vl, une souche méningococcique qui exprime un fHbp v2, et également une souche méningococcique qui exprime un fHbp v3 (p. ex. envers chacune des souches MC58, M2091, et M01- 240355) .
En référence aux définitions données ci-dessus, si applicable, pour le polypeptide de fusion, il est préférable que i=j=k.
En général, un polypeptide de fusion fHbp selon l'invention a une séquence d'acides aminés de formule :
NH2-A-[-X-L-]3-B-COOH dans laquelle chaque X est un variant différent de la séquence fHbp, L est une séquence d'acides aminés lieur (« linker ») facultative, A est une séquence d'acides aminés N-terminale facultative, et B est une séquence d'acides aminés C-terminale facultative.
Les trois fragments X sont une séquence vl, v2, et v3 telle que décrite ci-dessus. Elles peuvent être présentes dans un ordre quelconque dans le sens N- à C-terminal, à savoir vl-v2-v3, vl-v3-v2, v2-vl-v3, v2-v3-vl, v3-vl-v2, ou v3-v2-vl. L'ordre préféré entre tous est v2-v3-vl. A chaque occurrence de [-X-L-], une séquence d'acides aminés lieur (« linker ») -L- peut être présente ou absente.
La ou les séquences d'acides aminés lieurs (« linker ») -L- seront généralement courtes (p. ex. 20 acides aminés ou moins, à savoir 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre d'exemples, il y a les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage, les lieurs (« linker ») poly-glycine (à savoir Glyn où n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 42)), et les étiquettes histidine (à savoir Hisn où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 43)) . D'autres séquences d'acides aminés lieurs (« linker ») convenables s'imposeront à l'homme du métier. Un lieur (« linker ») utile est GSGGGG (SEQ ID NO : 22), le dipeptide Gly-Ser étant formé à partir d'un site de restriction BamHI, facilitant ainsi le clonage et la manipulation. Un autre lieur (« linker ») utile est SEQ ID NO : 23, qui peut éventuellement être précédé par un dipeptide Gly-Ser (SEQ ID NO : 24, provenant de BamEI) ou par un dipeptide Gly-Lys (SEQ ID NO : 25, provenant de HindlII). -A- est une séquence d'acides aminés N-terminale facultative. Elle sera généralement courte (p. ex. 40 acides aminés ou moins, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre
d'exemples, il y a les séquences de tête (« leader ») qui dirigent le transport des protéines. Si Xi est dépourvu de sa propre méthionine N-terminale, -A- peut fournir ledit résidu méthionine dans le polypeptide traduit (p. ex. -A- est un résidu Met seul) . Le résidu Met peut être à l'extrémité N-terminale d'une séquence lieur (« linker ») telle que SEQ ID NO : 23 (à savoir SEQ ID NO : 26), ou à l'extrémité N-terminale d'une séquence courte (p. ex. SEQ ID NO : 27). -B- est une séquence d'acides aminés C-terminale facultative. Elle sera généralement courte (p. ex. 40 acides aminés ou moins, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre d'exemples, il y a les séquences qui dirigent le transport des protéines, les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (p. ex. comprenant les étiquettes histidine, à savoir Hisn où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 43) ) , ou les séquences qui améliorent la stabilité du polypeptide. D'autres séquences d'acides aminés C-terminales convenables s'imposeront à l'homme du métier. Un fragment -B- convenable est SEQ ID NO : 28, dans lequel Leu-Glu en aval de l'étiquette histidine provient d'un site de restriction Xhol.
Un polypeptide de fusion convenable, utilisable avec l'invention comprend SEQ ID NO : 10. D'après la formule ci-dessus, dans SEQ ID NO : 10, -A- est SEQ ID NO : 26, Xi est une séquence fHbp v2 (SEQ ID NO : 8), -Li- est SEQ ID NO : 24, X2 est une séquence fHbp v3 (SEQ ID NO : 9) , -L2- est SEQ ID NO : 22, X3 est une séquence fHbp vl (SEQ ID NO : 7), et L3 et B sont absents. Les trois séquences fHbp dans SEQ ID NO : 10 sont soulignées ci-dessous :
MGPDSDRLQQRRVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGD SLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQR SFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELA AAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGPD S DRLQQRRVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNS LNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKINNPDKTDSLINQRS FLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAA AELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGG VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKV SRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHT SFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRH AVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
Un polypeptide de fusion préféré, utilisable avec l'invention comprend SEQ ID NO : 29. D'après la formule ci-dessus, dans SEQ ID NO : 29, -A- est SEQ ID NO : 26, Xi est une séquence fHbp v2 (SEQ ID NO : 8), -Lj.- est SEQ ID NO : 22, X2 est une séquence fHbp v3 (SEQ ID NO : 9) , -L2- est SEQ ID NO : 22, X3 est une séquence fHbp vl (SEQ ID NO : 7), et L3 et B sont absents. Les trois séquences fHbp dans SEQ ID NO : 29 sont soulignées ci-dessous :
MGPDSDRLQQRRVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKT
YGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP
DKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHG
KIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATV
KIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLT
LSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSA
WALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLH
YSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFG
DRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLT
LDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEF
QVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAF
GSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAE
KGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
Par conséquent, dans l'idéal l'invention utilise un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 29, mais l'invention peut également utiliser un polypeptide comprenant SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 29, mais modifiée à hauteur de 10 changements d'acides aminés _ individuels (à savoir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles) , à condition que le polypeptide puisse susciter la production d'anticorps, capables de reconnaître les trois polypeptides méningococciques de type sauvage de SEQ ID NO : 4-6, comme décrit ci-dessus. En outre, SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 2 9 peut être modifiée au niveau du fragment -A-(p. ex. pour utiliser une alternative à SEQ ID NO : 26) , de façon qu'un polypeptide utilisé avec l'invention puisse comprendre SEQ ID NO : 30, éventuellement modifiée à hauteur de 10 changements d'acides aminés individuels (comme décrit ci-dessus).
Par exemple, SEQ ID NO : 30 peut être modifiée pour introduire des mutations ponctuelles qui altèrent la capacité de chaque fHbp à interagir avec fH. Par exemple, SEQ ID NO : 30 peut être mutée aux résidus E240, E496, et R543, pour obtenir ainsi SEQ ID NO : 31 (portant les mutations E240X, E496X et R543X, où X est un acide aminé quelconque autre que l'acide aminé indiqué, à savoir, E240X désigne tout acide
aminé autre que E sur le résidu 240) . Un mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 31 est SEQ ID NO : 32 (portant les mutations E240A, E496A, R543S). L'invention peut utiliser SEQ ID NO : 31 (p. ex. SEQ ID NO : 32), éventuellement modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (comme décrit ci-dessus), à condition que les résidus E240, E496, et R543 ne soient pas présents.
De plus, SEQ ID NO : 30 peut être modifiée pour introduire des mutations ponctuelles qui accroissent la stabilité d'un f Hbp. Par exemple, SEQ ID NO : 30 peut être mutée au niveau des résidus S32, L123, S285, et L379, pour obtenir ainsi SEQ ID NO : 33 (portant les mutations S32X,
L123X, S285X et L379X) . Un mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 33 est SEQ ID NO : 34 (portant les mutations S32V, L123R, S285V, L379R). L'invention peut utiliser SEQ ID NO : 33 (p. ex. SEQ ID NO : 34), éventuellement modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (comme décrit ci-dessus), à condition que les résidus S32, L123, S285, et L379 ne soient pas présents. Un de ces polypeptides est SEQ ID NO : 35, dans lequel la séquence vl a été modifiée pour inclure une mutation comme rapporté dans réf. 22, p. ex. la mutation "R41S" (SEQ ID NO : 36) . SEQ ID NO : 35 porte les mutations S32X, L123X, S285X, L379X et R543X, et SEQ ID No:36 les mutations S32V, L123R, S285V, L379R et R543S. La nomenclature "R41S" est numérotée par rapport au polypeptide vl mature (SEQ ID NO : 4), par conséquent, p. ex., elle est présente dans le polypeptide de fusion SEQ ID NO : 35 sous forme de R543X et dans SEQ ID NO : 36 sous forme de R543S.
Ces diverses approches peuvent être combinées, de façon que l'invention puisse utiliser un polypeptide comprenant SEQ ID NO : 37 (p. ex. un polypeptide ayant, la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 38) . SEQ ID NO : 37 et SEQ ID NO : 38 portent les mutations S32V, L123R, E240A, S285V, L379R, E496A et R543S. SEQ ID NO:38 comprend en outre SEQ ID NO : 26 à son extrémité N-terminale.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention peut utiliser SEQ ID NO : 39 (portant les mutations L123X et L379X) p. ex. SEQ ID NO : 40 (portant les mutations L123R et L379R). De manière similaire, l'invention peut utiliser SEQ ID NO : 39 (p. ex. SEQ ID NO : 40), éventuellement modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (comme décrit ci-dessus), à condition que les résidus L123 et L379 ne soient pas présents (voir p. ex. SEQ ID NO : 34, qui diffère de SEQ ID NO : 40 par incorporation de deux substitutions S/V comme indiqué ci-dessus). Un de ces polypeptides est SEQ ID NO : 41, dans lequel la séquence vl a été modifiée pour inclure la mutation "R41S", et comprend par conséquent L123R, L379R et R543S. Dans d'autres modes de réalisation, quand ces protéines de fusion sont présentes dans des compositions selon l'invention, des OMV peuvent être présentes à des concentrations entre 2,5 et 12,5 pg/ml.
Les résidus acides aminés notés à des fins de mutation ci-dessus sont définis par rapport à des séquences de départ spécifiques. Les résidus acides aminés dans toute autre séquence fHbp peuvent être facilement identifiés par alignement de séquences, étant p. ex. l'acide aminé qui, quand il est aligné à l'aide d'un algorithme d'alignement par paire (p. ex. l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch, décrit ci-dessous), s'aligne avec l'acide aminé mentionné dans la présente. Souvent l'acide aminé sera identique, mais l'alignement l'identifiera facilement si ce n'est pas le cas. fHbp est naturellement une lipoprotéine chez N. meningitidis. Elle s'est également avérée être lipidée quand elle est exprimée chez E. coli avec sa séquence de tête (« leader ») native ou des séquences de tête (« leader ») hétérologues. Les polypeptides selon l'invention peuvent avoir un résidu cystéine N-terminal, qui peut être lipidé p. ex. comprendre un groupe palmitoyle, formant généralement une tripalmitoyl-S-glycéryl-cystéine. Dans les modes de réalisation normaux, toutefois, le polypeptide de fusion selon l'invention n'est pas lipidé (typiquement parce que le fragment -A- N-terminal ne dirige pas la lipidation) chez l'hôte d'expression.
Antigène neisserien liant 1'héparine (NHBA)
Une composition selon l'invention peut comprendre un polypeptide immunogène NHBA. L'antigène NHBA a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [23] sous forme de gène NMB2132 (Numéro d'accès GenBank GI :7227388 ; SEQ ID NO : 11 dans la présente). Des séquences de l'antigène NHBA provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis. Par exemple, on peut voir des formes alléliques de NHBA sur les Figures 5 et 15 de la référence 24, et dans l'exemple 13 et sur la figure 21 de la référence 2 (SEQ ID 3179 à 3184 dans la présente). Divers fragments immunogènes de l'antigène NHBA ont également été rapportés, y compris le fragment "AG" de SEQ ID NO : 12. Les antigènes NHBA préférés pour une utilisation dont fait l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 60 % ou plus (p. ex. 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 12 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 12, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les. fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 12.
Les antigènes NHBA selon l'invention les plus utiles peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un mammifère hôte convenable (tel qu'une souris ou un sujet humain), peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13. Les antigènes NHBA avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps anti-méningococciques bactéricides après administration à un sujet mammifère.
Un polypeptide NHBA particulièrement préféré pour une utilisation dont fait l'invention comprend SEQ ID NO : 12, éventuellement modifiée à hauteur de 3 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, ou 3 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles), à condition que le polypeptide puisse susciter la production d'anticorps capables de se lier à SEQ ID NO : 13, comme décrit ci-dessus.
Comme observé dans le BEXSERO™, le polypeptide NHBA peut être utilement présent sous la forme d'un polypeptide de fusion e.g. lié par fusion à un polypeptide NMB1030. Dans ces polypeptides de fusion, NMB1030 est de préférence en aval de NHBA. NMB1030 provenant de la souche MC58 a le numéro d'accès GenBank GI :7226269 (SEQ ID NO : 14 dans la présente) . Une séquence NMB1030 pour une utilisation dont fait l'invention peut comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 60 % ou plus (p. ex. 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 14 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 14, où "n" vaut 30 ou plus. Un fragment NMB1030 utile est SEQ ID NO : 15.
Un de ces polypeptides de fusion NHBA-NMB1030 a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 16. Par conséquent, l'invention peut utiliser SEQ ID NO : 16, éventuellement modifiée à hauteur de 3 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, ou 3 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles), à condition que le polypeptide puisse susciter la production d'anticorps capables de se lier à SEQ ID NO : 13, comme décrit ci-dessus.
Adhésine A de Neisseria (NadA)
Une composition selon l'invention peut comprendre un polypeptide immunogène NadA. L'antigène NadA a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [23] sous forme de gène NMB1994 (Numéro d'accès GenBank GI :7227256 ; SEQ ID NO : 17 dans la présente). Les séquences de l'antigène NadA provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis, et l'activité de la protéine à titre d'adhésine de Neisseria est bien documentée. Divers fragments immunogènes de NadA ont également été rapportés. Les antigènes NadA préférés utilisables dans le cadre de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 60 % ou plus (p. ex. 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 17 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 17, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 17.
Les antigènes NadA selon l'invention les plus utiles peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un mammifère hôte, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 18. Les antigènes NadA avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps anti-méningococciques bactéricides après administration à un mammifère hôte.
Un polypeptide NadA particulièrement préféré pour une utilisation dans le cadre de l'invention comprend SEQ ID NO : 19, éventuellement modifiée à hauteur de 3 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, ou 3 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles), à condition que le polypeptide puisse susciter la production d'anticorps capables de se lier à SEQ ID NO : 18, comme décrit ci-dessus. Vésicules de membrane externe de méningocoques (OMV)
Les compositions selon l'invention comprennent des OMV de méningocoques, à savoir toute vésicule protéoliposomique obtenue par rupture ou boursoufflure d'une membrane externe de méningocoques pour former des vésicules à partir de celle-ci qui conservent les composants protéiques de la membrane externe (p. ex. PorA, PorB, RmpM, Opa, Ope, Omp85, FetA/FrpB,
NspA, etc.), ayant un diamètre dans la plage de 50 à 200 nm. Par conséquent, le terme peut inclure les OMV (parfois appelées "blebs") ainsi que les vésicules dites "microvésicules" (MV [25]) ou "OMV natives" ("NOMV" [26]). Voir également les références 27 à 33. Les vésicules de membrane externe typiques sont préparées artificiellement à partir de bactéries, et peuvent être préparées par un traitement détergent (p. ex. au désoxycholate), ou par des moyens non détergent (voir p. ex. référence 37) . Les techniques pour former des OMV comprennent le traitement des bactéries avec un détergent de type sel d'acide biliaire (p. ex. sels d'acide lithocholique, d'acide chenodésoxycholique, d'acide ursodésoxycholique, d'acide désoxycholique, d'acide cholique, d'acide ursocholique, etc., le désoxycholate de sodium [34 & 35] étant préféré pour traiter Neisseria) à un pH suffisamment élevé pour ne pas précipiter le détergent [36] . D'autres techniques peuvent être utilisées essentiellement en l'absence de détergent [37,38.] telles que des techniques de sonication, homogénéisation, microfluidisation, cavitation, choc osmotique, broyage, presse de French, mélange, etc. Les méthodes n'utilisant pas ou peu de détergent permettent de conserver des antigènes utiles tels que NspA et fHbp [37]. Par conséquent, les OMV utilisées avec l'invention peuvent être préparées à l'aide d'un tampon d'extraction d'OMV contenant environ 0,5 % de désoxycholate ou moins, p. ex. environ 0,2 %, environ 0,1 %, <0,05 % voire pas du tout.
Les vésicules connues sous les noms de MV et NOMV sont des vésicules de membrane naturelles qui se forment spontanément pendant la croissance bactérienne et sont libérées dans le milieu de culture. Les MV peuvent être obtenues par culture de Neisseria dans un milieu de culture de type bouillon, séparation des cellules entières des MV dans le milieu de culture de type bouillon (p. ex. par filtration ou centrifugation à basse vitesse pour ne former que des culots de cellules et pas de vésicules plus petites), puis collecte des MV à partir du milieu appauvri en cellules (p. ex. par filtration, précipitation différentielle ou agrégation des MV, par centrifugation à grande vitesse pour former des culots de MV) . De manière générale, les souches utilisables dans la production de MV peuvent être choisies en fonction de la quantité de MV produites en culture, les réfs 45 & 46 décrivant p. ex. Neisseria comme une bactérie à production élevée de MV.
Les vésicules peuvent être préparées à partir de bactéries qui ont été génétiquement manipulées [39,42] p. ex. pour accroître l'immunogénicité (p. ex. immunogènes hyperexprimés) , réduire la toxicité, inhiber la synthèse du polysaccharide capsulaire, sous-réguler l'expression de PorA, etc. Elles peuvent être préparées à partir de souches hyperproductrices de vésicules [43,46]. Des vésisules provenant de bactéries ayant des sous-types de protéines de membrane externe de classe I différentes peuvent être utilisées, p. ex. six sous-types différents [47,48] obtenus à partir de deux populations de vésicules génétiquement modifiées différentes comportant chacune trois sous-types, ou neuf sous-types différents obtenus à partir de trois populations de vésicules génétiquement modifiées différentes comportant chacune trois sous-types, etc. Les sous-types utiles comprennent : PI.7,16 ; PI.5-1,2-2 ; PI.19,15-1 ; PI. 52,10 ; PI.12-1,13 ; PI.7-2,4 ; Pl.22,14 ; PI.7-1,1 ; PI.18-1,3,6. En général, toutefois, il est préférable pour la présente invention de préparer les OMV à partir d'une souche de méningocoque de type sauvage.
Les vésicules utilisables dans le cadre de l'invention peuvent par conséquent être préparées à partir de toute souche méningococcique de type sauvage. Les vésicules proviendront généralement d'une souche de sérogroupe B, mais il est possible de les préparer à partir de sérogroupes autres que B (la référence 36 décrit p. ex. un procédé pour le sérogroupe · A), tels que A, C, W135 ou Y. La souche peut être de tout sérotype (p. ex. 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), de tout séro-sous-type (p. ex. Pl.4), et de tout immunotype (p. ex.
Ll ; L2 ; L3 ; L3,7 ; L3,7,9 ; L10 ; etc.) . Les méningocoques peuvent provenir de toute lignée convenable, y compris de lignées hyperinvasives et hypervirulentes, p. ex. de l'une quelconque des sept lignées hyp.ervirulentes suivantes : sous-groupe I ; sous-groupe III ; sous-groupe IV-1 ; complexe ET-5 ; complexe ET-37 ; cluster A4 ; lignée 3. De manière préférée entre toutes, les OMV sont préparées à partir de la souche NZ98/254, ou autre souche de séro-sous-type PI. 4 PorA. De manière avantageuse, l'invention utilise les mêmes OMV que celles utilisées dans le BEXSERO™ et MENZB™, préparées à partir de la souche NZ98/254.
De manière générale, les vésicules contiendront un LOS méningococcique (également connu sous le nom de LPS), mais l'effet pyrogène du LOS dans les OMV est bien plus faible, à quantité égale, à celui du LOS purifié, et l'adsorption des OMV sur 1'hydroxyde d'aluminium réduit en outre leur pyrogénicité. Les niveaux de LOS sont exprimés en Unités Internationales (IU) d'endotoxine et peuvent être déterminés par le dosage LAL (lysat d'amœbocytes de limule). De préférence, le LOS est présent à moins de 2000 IU par pg de protéine OMV.
Quand un LOS est présent dans une vésicule, il est possible de traiter la vésicule de façon à lier ses composants LOS et protéines (conjugaison "intra-bleb" [49]) .
Un procédé utile de purification d'OMV est décrit dans la référence 50 et implique l'ultrafiltration sur OMV brutes, plutôt qu'une centrifugation à grande vitesse. Le procédé peut impliquer une étape d'ultracentrifugation après l'ultrafiltration. Les OMV peuvent également être purifiées par le procédé de filtration par exclusion de taille à deux étapes décrit dans réf. 51.
De manière utile, les OMV peuvent être mises en suspension dans une solution de saccharose une fois qu'elles ont été préparées.
Combinaisons
Une composition selon l'invention peut comprendre chacun des composants suivants : (a) un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, (b) un polypeptide NHBA, (c) un polypeptide NadA et (d) des OMV.
Dans ces combinaisons : (a) dans l'idéal le polypeptide de fusion fHbp comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10, mais éventuellement modifiée à hauteur de 10 changements d'acides aminés individuels, comme décrit ci-dessus ; (b) dans l'idéal, le polypeptide NHBA comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12, mais éventuellement modifiée à hauteur de 3 changements d'acides aminés individuels, comme décrit ci-dessus ; et (c) dans l'idéal, le polypeptide NadA comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 19, mais éventuellement modifiée à hauteur de 3 changements d'acides aminés individuels, comme décrit ci-dessus .
De préférence : (a) le polypeptide de fusion fHbp a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10 ; (b) le polypeptide NHBA a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12 et (c) le polypeptide NadA a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 19.
Mieux encore : (a) le polypeptide de fusion fHbp a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10 ; (b) le polypeptide NHBA a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 16 et (c) le polypeptide NadA a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 19.
Les polypeptides dans les compositions selon l'invention peuvent être présents à toute concentration capable de susciter une réponse immunologique efficace chez l'hôte. La dose peut être déterminée par des essais de routine, en s'inspirant en particulier des enseignements fournis par le BEXSERO™, qui contient les polypeptides fHbp, NHBA et NadA, chacun à raison de 100 yg/ml. Par conséquent, les polypeptides fHbp, NHBA et/ou NadA peuvent chacun être présents dans une composition selon l'invention à une concentration entre 20 et 400 pg/ml, p. ex. entre 50 et 150 pg/ml, entre 80 et 120 gg/ml, ou d'environ 100 pg/ml. Les concentrations d'antigènes sont faciles à quantifier par des dosages protéiques standards.
De manière similaire, les OMV dans les compositions selon l'invention peuvent être présentes à toute concentration capable de susciter une réponse immunologique efficace chez l'hôte. La dose peut être déterminée par des essais de routine, en s'inspirant en particulier des enseignements fournis par le BEXSERO™, qui contient des OMV à raison de 50 pg/ml. Par conséquent, selon le premier mode de réalisation de l'invention, les OMV peuvent être présentes dans une composition à une concentration entre 20 et 100 pg/ml, p. ex. entre 30 et 75 pg/ml, entre 40 et 60 pg/ml, ou dans l'idéal, d'environ 50 pg/ml. Dans le second mode de réalisation de l'invention, toutefois, les OMV sont présentes à une plus basse concentration, à savoir entre 5 et 30 pg/ml, p. ex. entre 10 et 15 yg/ml, ou dans l'idéal d'environ 12,5 pg/ml.
Dans certains modes de réalisation, les OMV sont présentes à des concentrations plus basses, entre 2,5 et 12,5 pg/ml, par exemple de 2,5 pg/ml, 3,0 pg/ml, 3,5 pg/ml, 4,0 pg/ml, 4.5 pg/ml, 5,0 pg/ml, 5,5 pg/ml, 6,0 yg/ml, 6,5 pg/ml, 7,0 pg/ml, 7,5 pg/ml, 8,0 pg/ml, 8,5 pg/ml, 9,0 pg/ml, 9.5 pg/ml et 10 pg/ml.
Les quantités et les concentrations d'OMV dans les compositions selon l'invention se définissent de la même manière que dans le BEXSERO™, à savoir en fonction de la protéine totale. Celle-ci peut être évaluée à l'aide de divers dosages, p. ex. réf. 29 décrit l'utilisation du dosage de
Folin-Lowry. La protéine totale peut être dosée selon la
European Pharmacopoeia, Ph. Eur. Assay 2.5.33, à l'aide de l'une quelconque des sept méthodes proposées par la pharmacopée. La méthode 2 propose le test de Lowry, qui est préféré. Par conséquent, une composition selon le second mode de réalisation de l'invention contient des OMV représentant une protéine totale de 5 à 30 pg/ml.
Polypeptides
Les polypeptides selon l'invention peuvent être préparés par divers moyens, p. ex. par synthèse chimique (au moins en partie), digestion de polypeptides plus longs à l'aide de protéases, traduction à partir d'ARN, purification à partir d'une culture cellulaire (p. ex. à partir d'une expression recombinée ou d'une culture de N. meningitidis) , etc. L'expression hétérologue chez un hôte E. coli est une voie d'expression préférée. .
Dans l'idéal, les polypeptides selon l'invention ont une longueur d'au moins 100 acides aminés, p. ex. 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, ou plus. Par exemple, un polypeptide de fusion fHbp aura généralement une longueur d'au moins 500aa, un polypeptide NHBA aura généralement une longueur d'au moins 400aa, et un polypeptide NadA aura généralement une longueur d'au moins 250aa.
Les polypeptides sont de préférence préparés sous une forme sensiblement pure ou sensiblement isolée (à savoir sensiblement exempte de tout autre polypeptide neisserien ou polypeptide issu de la cellule hôte) . En général, les polypeptides sont fournis dans un environnement non naturel, p. ex. ils sont séparés de leur environnement naturel. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide est présent dans une composition qui est enrichie pour le polypeptide comparativement au matériau de départ. Par conséquent, un polypeptide purifié est fourni, "purifié" signifiant que le polypeptide est présent dans une composition qui est sensiblement exempte d'autres polypeptides exprimés, "sensiblement exempte" signifiant que plus de 50 % (p. ex. ^75 %, ^80 %, ^90 %, ^95 %, ou ^99 %) du polypeptide total dans la composition est un polypeptide selon l'invention.
Les polypeptides peuvent prendre diverses formes (p. ex. natives, fusions, non glycosylées, lipidées, ponts disulfure, etc.).
Des séquences telles que SEQ ID NO : 19 ne contiennent pas de méthionine N-terminale. Si un polypeptide selon l'invention est obtenu par traduction chez un hôte biologique, alors un codon de départ est requis, qui fournira une méthionine N-terminale chez la plupart des hôtes. Par conséquent, un polypeptide selon l'invention comprendra, au moins à un stade naissant, un résidu méthionine en amont de ladite séquence SEQ ID No.
Dans certains modes de réalisation, un polypeptide dans une composition selon l'invention peut comprendre une séquence N-terminale en amont (comme approprié) de la séquence du polypeptide fHbp, NHBA ou NadA. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide comporte une méthionine unique à l'extrémité N-terminale immédiatement suivie de la séquence d'acides aminés de l'immunogène pertinent ; dans d'autres, une séquence amont plus longue peut être utilisée. Cette séquence amont peut être courte (p. ex. 40 acides aminés ou moins, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre d'exemples, il y a les séquences de tête (« leader ») qui dirigent le transport des protéines, ou les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (p. ex. une étiquette histidine, à savoir His/i où n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 44)) .
Un polypeptide selon 1'invention peut également comprendre des acides aminés en aval de l'acide aminé final de la séquence d'acides aminés du fHbp, NHBA ou NadA (comme approprié). Ces extensions C-terminales peuvent être courtes (p. ex. 40 acides aminés ou moins, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre d'exemples, il y a les séquences qui dirigent le transport des protéines, les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (p. ex. une étiquette histidine, à savoir His^ où n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 44)) ou les séquences qui améliorent la stabilité du polypeptide. D'autres séquences d'acides aminés C-terminales convenables s'imposeront à l'homme du métier.
Le terme "polypeptide" désigne des polymères de type acides aminés de longueur quelconque. Le polymère peut être linéaire ou ramifié, il peut comprendre des acides aminés modifiés, et il peut être interrompu par des acides non aminés. Le terme englobe également un polymère de type acides aminés qui a été modifié naturellement ou suite à une intervention : par exemple, formation de liaisons disulfure, glycosylation, lipidation, acétylation, phosphorylation, ou toute autre manipulation ou modification, telle que la conjugaison avec un composant de marquage. Sont également inclus dans la définition les polypeptides contenant par exemple un ou plusieurs analogues d'un acide aminé (y compris, par exemple, les acides aminés non naturels, etc.), ainsi que d'autres modifications connues dans l'état de la technique. Les polypeptides peuvent se présenter sous forme de chaînes simples ou de chaînes associées.
Les polypeptides selon l'invention sont de préférence exprimés par des moyens recombinants chez un hôte hétérologue (par exemple, chez E. coli), puis purifiés, et combinés et formulés avec des OMV pour donner une composition selon 1'invention.
Dans certains modes de réalisation, un polypeptide comprend une séquence d'acides aminés telle que décrite ci-dessus, à ceci près que jusqu'à 10 acides aminés (à savoir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) à l'extrémité N-terminale et/ou jusqu'à 10 acides aminés (à savoir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) à l'extrémité C-terminale sont délétés. Réponses bactéricides
Comme mentionné ci-dessus, les polypeptides et les compositions préférés selon l'invention peuvent susciter des réponses en anticorps qui sont bactéricides envers les méningocoques. Les réponses en anticorps bactéricides sont commodément mesurées après immunisation de souris et sont un indicateur standard de l'efficacité du vaccin (voir p. ex. note de bas de page 14 de réf. 52 ; également réf. 53) . Par conséquent, les anticorps seront bactéricides envers une souche d'essai dans un dosage de l'activité bactéricide sérique convenable (SBA).
Un polypeptide de fusion fHbp peut de préférence susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers une souche méningococcique qui exprime un fHbp vl, une souche méningococcique qui exprime un fHbp v2, et également une souche méningococcique qui exprime un fHbp v3. Une souche vl convenable pour un test SBA est MC58, qui est largement disponible (p. ex. ATCG BAA-335) et était la souche séquencée dans référence 23. Une souche v2 convenable pour un test SBA est M2091 (ATCC 13091) . Une souche v3 convenable pour un test SBA est M01-240355, qui est une souche de référence MLSt de Neisseria (id 19265 dans réf. 54) qui a été entièrement séquencée (voir EMBL ID CP002422 [55]) .
Par conséquent, les polypeptides de fusion fHbp préférés peuvent susciter la production d'anticorps chez une souris qui sont bactéricides envers chacune des souches MC58, M2091, et M01-240355 dans un dosage de l'activité bactéricide sérique. Par exemple, une composition selon l'invention peut fournir un titre bactéricide sérique >1:4 par le dosage de Goldschneider avec comme source de complément du sérum humain [56,58], et/ou fournir un titre bactéricide sérique >1:128 avec comme source de complément du sérum de bébé lapin.
Immunisation
Les polypeptides décrits ci-dessus peuvent être utilisés à titre de principe (s) actif (s) dans des compositions immunogènes, et par conséquent l'invention concerne une composition immunogène (p. ex. un vaccin) comprenant les polypeptides décrits ci-dessus. L'invention concerne également une méthode destinée à susciter une réponse en anticorps chez un mammifère, tel qu'une souris ou un sujet humain, comprenant l'administration d'une composition immunogène selon l'invention audit mammifère. De préférence, la réponse en anticorps est une réponse en anticorps protecteurs et/ou bactéricides. L'invention concerne également des compositions selon l'invention pouvant être utilisées dans ces méthodes. L'invention concerne également une méthode destinée à protéger un mammifère, tel qu'une souris ou un sujet humain, contre une infection à Neisseria (p. ex. méningococcique) comprenant l'administration audit mammifère d'une composition immunogène selon l'invention. L'invention concerne des compositions utilisables à titre de médicaments (p. ex. sous forme de compositions immunogènes ou de vaccins) . Dans un mode de réalisation, elle concerne également l'utilisation d'un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, et un ou plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) des vésicules de membrane externe de méningocoques, dans la fabrication d'un médicament destiné à prévenir l'infection à Neisseria (p. ex. méningococcique) chez un mammifère. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation de vésicules de membrane externe de méningocoques et d'un ou de plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, dans la fabrication d'un médicament destiné à prévenir l'infection à Neisseria (p. ex. méningococcique) chez un mammifère, dans lequel la concentration de vésicules de membrane externe dans le médicament est entre 5 et 30 pg/ml.
Le mammifère est de préférence un sujet humain. Le sujet humain peut être un adulte ou, de préférence, un enfant. Quand le vaccin est à usage prophylactique, le sujet humain est de préférence un enfant (p. ex. un tout petit ou un nourrisson) ; quand le vaccin est à usage thérapeutique, le sujet humain est de préférence un adulte. Un vaccin destiné à des enfants peut également être administré à des adultes, p. ex. pour évaluer son innocuité, son dosage, son immunogénicité, etc.
Les utilisations et les méthodes sont particulièrement utiles pour prévenir/traiter des maladies comprenant, entre autres, la méningite (en particulier la méningite bactérienne, telle que la méningite à méningocoques) et la bactériémie. Par exemple, elles se prêtent à une immunisation active des individus contre une maladie à méningocoques invasive provoquée par N. meningitidis (par exemple de sérogroupe B). L'efficacité du traitement thérapeutique peut être testée en surveillant l'infection à Neisseria après administration de la composition selon l'invention. L'efficacité du traitement propylactique peut être testée en surveillant les réponses immunitaires dirigées contre fHbp, NHBA, NadA et PorA (comme approprié) après administration de la composition. L'immunogénicité des compositions selon l'invention peut être déterminée par administration desdites compositions à des sujets d'essai (p. ex. enfants de 12 à 16 mois, ou modèles animaux), puis détermination des paramètres standards comprenant les anticorps sériques bactéricides (SBA) et les titres ELISA (GMT). De manière générale, ces réponses immunitaires seront déterminées environ 4 semaines après l'administration de la composition, et comparées aux valeurs déterminées avant administration de la composition. Un accroissement d'au moins 4 à 8 fois des SBA est préféré. Quand plus d'une dose de la composition est administrée, plus d'une détermination post-administration peut être pratiquée.
Les compositions préférées selon l'invention peuvent conférer un titre d'anticorps à un patient qui est supérieur au critère de séroprotection de chaque composant antigénique chez un pourcentage acceptable de sujets humains. Les antigènes associés à un titre d'anticorps au-dessus duquel un hôte est considéré comme séroconverti contre l'antigène sont bien connus, et ces titres sont publiés par des organisations telles que 1'OMS. De préférence, plus de 80 % d'un échantillon statistiquement significatif de sujets est séroconverti, plus préférablement plus de 90 %, mieux encore plus de 93 % et de manière préférée entre toutes de 96 à 100 %. L'invention peut être utilisée pour conférer une immunité systémique et/ou muqueuse.
De manière générale, les compositions selon l'invention seront administrées directement au patient. L'administration directe peut être effectuée par injection parentérale (p. ex. sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par voie rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre administration par voie muqueuse. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras est préférée. L'injection peut se faire par l'intermédiaire d'une aiguille (p. ex. une aiguille hypodermique) , mais une injection sans aiguille peut être pratiquée en variante. Une dose intramusculaire typique est d'environ 0,5 ml (p. ex. comme observé dans le BEXSERO™).
La posologie peut être un schéma unidose ou multidose. Les multidoses peuvent être utilisées dans un schéma de primovaccination et/ou un schéma de doses de rappel. Un schéma de primovaccination peut être suivi d'un schéma de doses de rappel. L'intervalle de temps convenable entre les doses de primovaccination (p. ex. entre 4 et 16 semaines) , et entre la primovaccination et le (s) rappel (s) peut être déterminé à chaque fois. Par exemple, le BEXSERO™ est administré en deux ou trois doses à des intervalles d'au moins 1 mois ou d'au moins 2 mois, en fonction du sujet (p. ex. nourrissons ou autres).
La composition immunogène selon l'invention contiendra généralement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, qui peut être toute substance qui n'induit pas elle-même la production d'anticorps nocifs pour le patient recevant la composition, et qui peut être administrée sans toxicité indue. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent comprendre les liquides tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol et l'éthanol. Des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou émulsifiants, des substances de tamponnage de pH, et autres, peuvent également être présentes dans ces véhicules. Une discussion approfondie concernant les véhicules convenables figure dans réf. 59. Par exemple, le BEXSERO™ contient du chlorure de sodium, de l'histidine, du saccharose, de 1'hydroxyde d'aluminium, et de l'eau pour préparations inj ectables.
Les infections à Neisseria affectent diverses parties du corps, de sorte que les compositions selon l'invention peuvent ✓ être préparées sous diverses formes. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous forme de préparations injectables, de type soit solution liquide, soit suspension. Des formes solides pour une mise en solution ou une mise en suspension dans des véhicules liquides avant injection peuvent également être préparées. Les compositions se prêtant à une injection par voie parentérale (p. ex. dans le muscle) sont préférées entre toutes.
La composition est de préférence stérile. Elle est de préférence apyrogène. Elle est de préférence tamponnée, p. ex. à un pH entre pH 6 et pH 8, généralement autour de pH 7. Quand une composition comprend un sel d'hydroxyde d'aluminium, il est préférable d'utiliser un tampon histidine [60]. Les compositions selon l'invention peuvent être isotoniques vis-à-vis des sujets humains.
Les compositions immunogènes comprennent une quantité immunologiquement efficace de l'immunogène, ainsi que de tout autre composant spécifié, comme nécessaire. Par "quantité immunologiquement efficace", on entend que l'administration de cette quantité à un individu, soit sous forme d'une unidose, soit dans le cadre d'une série, est efficace à des fins de traitement ou de prévention. Cette quantité varie en fonction de la santé et de la condition physique de l'individu à traiter, de son âge, du groupe taxonomique auquel appartient l'individu à traiter (p. ex. primate non humain, primate, etc.), de la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, du degré de protection recherché, de la formulation du vaccin, de l'avis du médecin traitant sur le cas médical, et autres facteurs pertinents. Cette quantité devrait s'inscrire dans une plage relativement large qui peut être déterminée par des essais réguliers. Le traitement posologique peut être un schéma à une seule dose ou à multidose (comprenant p. ex. des doses de rappel) . La composition peut être administrée conjointement à d'autres agents immunorégulateurs .
Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans les compositions selon l'invention comprennent, entre autres, les sels métalliques insolubles, les émulsions huile dans l'eau (p. ex. MF59 ou AS03, contenant toutes les deux du squalène) , les saponines, les dérivés non toxiques du LPS (tels que le lipide A monophosphorylé ou le MPL 3-0-désacylé), les oligonucléotides immunostimulateurs, les toxines bactériennes détoxifiées ADP-ribosylantes, les microparticules, les liposomes, les imidazoquinolones, ou leurs mélanges. D'autres substances capables d'agir comme des agents immunostimulateurs sont décrites dans le chapitre 7 de réf. 61. L'utilisation d'un adjuvant de type hydroxyde d'aluminium et/ou phosphate d'aluminium est particulièrement préférée, et les polypeptides sont généralement adsorbés sur ces sels. Ces sels comprennent les oxyhydroxydes et les hydroxyphosphates (voir p. ex. les chapitres 8 & 9 de réf. 61). Les sels peuvent prendre toute forme convenable (p. ex. gel, forme cristalline, amorphe, etc.) . Al+++ devrait être présent à <1 mg/dose. L'adjuvant préféré entre tous est 1'hydroxyde d'aluminium, tel qu'il est utilisé dans le BEXSERO™. Les polypeptides et les OMV dans une composition selon l'invention peuvent être adsorbés sur cet adjuvant, comme dans le BEXSERO™. L'hydroxyde d'aluminium peut être incorporé à raison d'environ 1 mg/ml d'Al+++ (à savoir 0,5 mg par dose de 0,5 ml) .
Autres composants antigéniques
Une composition selon l'invention peut comprendre d'autres immunogènes polypeptidiques de méningocoques en plus de fHbp, NHBA, NadA et/ou des OMV. Par exemple, elle peut comprendre un ou plusieurs des suivants : NspA, App, NhhA, HmbR, etc.
Une composition selon l'invention peut également comprendre un antigène "936". L'antigène 936 a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [23] sous forme de gène NMB2091 (SEQ ID NO : 20 dans la présente). Les antigènes 936 préférés pour une utilisation dont fait l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %., 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 21 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 21, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 21. Les antigènes 936 les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un hôte mammifère, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 20. L'antigène 936 est un bon partenaire de fusion pour fHbp (voir p. ex. références 62 & 63).
En plus des antigènes polypeptidiques méningococciques, la composition peut comprendre des antigènes pour immuniser contre d'autres maladies ou infections. Par exemple, la composition peut comprendre un ou plusieurs des autres antigènes suivants : - un antigène saccharidique de N. meningitidis sérogroupe A, C, W135 et/ou Y, tel que le saccharide décrit dans réf. 64 de sérogroupe C (voir également réf. 65) ou dans réf. 66. - un antigène saccharidique de Streptococcus pneumoniae [p. ex. 67, 68, 69]. - un antigène du virus de l'hépatite A, tel qu'un virus inactivé [p. ex. 70, 71] . - un antigène du virus de l'hépatite B, tel que des antigènes de surface et/ou de cœur [p. ex. 71, 72]. - un antigène diphtérique, tel que l'anatoxine diphtérique [p. ex. chapitre 3 de réf. 73] p. ex. le mutant CRM197 [p. ex. 74] . - un antigène tétanique, tel que l'anatoxine tétanique (p. ex. chapitre 4 de réf. 73). - un antigène de Bordetella pertussis, tel que l'holotoxine pertussique (PT) et 1'hémagglutinique filamenteuse (FHA) de B. pertussis, éventuellement également en combinaison avec la pertactine et/ou les agglutinogènes 2 et 3 (p. ex. réf. 75 & 76). - un antigène saccharidique d'Haemophilus influenzae B [p. ex. 65] . - un ou des antigènes polio [p. ex. 77, 78] tels que l'IPV. - des antigènes des virus de la rougeole, des oreillons et/ou de la rubéole (p. ex. chapitres 9, 10 & 11 de réf. 73). - un ou des antigènes du virus influenza (p. ex. chapitre 19 de réf. 73), tels que 1 ' hémagglutinine et/ou les protéines de surface de type neuraminidase. - un antigène de Moraxella catarrhalis [p. ex. 79]. - un antigène protéique de Streptococcus agalactiae (streptocoque de groupe B) [p. ex. 80, 81]. - un antigène saccharidique de Streptococcus agalactiae (streptocoque de groupe B). - un antigène de Streptococcus pyogenes (streptocoque de groupe A) [p. ex. 81, 82, 83] . - un antigène de Staphylococcus aureus [p. ex. 84].
La composition peut comprendre un ou plusieurs de ces autres antigènes.
Les antigènes protéiques toxiques peuvent être détoxifiés si nécessaire (p. ex. détoxification de la toxine pertussique par des moyens chimiques et/ou génétiques [76]).
Quand un antigène diphtérique est incorporé dans la composition, il est préférable d'inclure également des antigènes tétaniques et pertussiques. De manière similaire, quand un antigène tétanique est incorporé, il est préférable d'inclure également des antigènes diphtériques et pertussiques. De manière similaire, quand un antigène pertussique est incorporé, il est préférable d'inclure également des antigènes diphtériques et tétaniques. Les combinaisons DTP sont par conséquent préférées.
Les antigènes saccharidiques sont de préférence sous la forme de conjugués. Les protéines porteuses pour les conjugués sont décrites plus en détails ci-dessous.
Les antigènes dans la composition seront typiquement présents à une concentration d'au moins 1 pg/ml chacun. En général, la concentration de tout antigène donné sera suffisante pour susciter une réponse immunitaire contre cet antigène.
Les compositions immunogènes selon l'invention peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques (p. ex. pour traiter une infection existante) ou prophylactiques (p. ex. pour prévenir une infection future).
Comme alternative à l'utilisation d'antigènes protéiques dans les compositions immunogènes selon l'invention, un acide nucléique (qui pourrait être l'ARN, tel qu'un ARN à autoréplication, ou l'ADN, tel qu'un plasmide) codant pour l'antigène peut être utilisé.
Dans certains modes de réalisation, une composition selon l'invention comprend des antigènes de saccharides capsulaires conjugués provenant de 1, 2, 3 ou 4 des sérogroupes A, C, W135 et Y de méningocoques. Dans d'autres modes de réalisation, une composition selon l'invention comprend au moins un antigène de saccharide capsulaire pneumococcique conjugué.
Méningocoques de sérogroupes Y, W135, C et A
Les actuels vaccins contre le méningocoque de sérogroupe C (MENJUGATE™ [64,85], MENINGITEC™ et NEISVAC-C™) comprennent des saccharides conjugués. MENJUGATE™ et MENINGITEC™ contiennent des antigènes oligosaccharidiques conjugués à une protéine porteuse CRM197, tandis que NEISVAC-C™ utilise le polysaccharide complet (dés-O-acétylé) conjugué à une protéine porteuse de type anatoxine tétanique. Le vaccin MENACTRA™ contient des antigènes de saccharides capsulaires conjugués provenant de chacun des sérogroupes Y, W135, C et A.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir des antigènes saccharidiques capsulaires provenant d'un ou de plusieurs des sérogroupes Y, -W135, C et A du méningocoque, dans lesquelles les antigènes sont conjugués à une ou plusieurs protéines porteuses et/ou sont des oligosaccharides. Par exemple, la composition peut contenir un antigène saccharidique capsulaire provenant du : sérogroupe C ; sérogroupes A et C ; sérogroupes A, C et W135 ; sérogroupes A, C et Y ; sérogroupes C, W135 et Y ; ou provenant des quatre sérogroupes A, C, W135 et Y.
Une quantité typique de chaque antigène saccharidique méningococcique par dose est entre 1 et 20 pg, p. ex. environ 1 pg, environ 2,5 pg, environ 4 pg, environ 5 pg, ou environ 10 pg (exprimés en termes de saccharide) .
Quand un mélange comprend des saccharides capsulaires provenant des deux sérogroupes A et C, le rapport (p/p) saccharide MenA:saccharide MenC peut être supérieur à 1 (p. ex. 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou plus). Quand un mélange comprend des saccharides capsulaires provenant du sérogroupe Y et d'un ou des deux sérogroupes C et W135, le rapport (p/p) saccharide MenY:saccharide MenWl35 peut être supérieur à 1 (p. ex. 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou plus) et/ou le rapport (p/p) saccharide MenY:saccharide MenC peut être inférieur à 1 (p. ex. 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, ou moins). Les rapport (p/p) préférés pour les saccharides provenant des sérogroupes A:C:W135:Y sont : 1:1:1:1 ; 1:1:1:2 ; 2:1:1:1 ; 4:2:1:1 ; 8:4:2:1 ; 4:2:1:2 ; 8:4:1:2 ; 4:2:2:1 ; 2:2:1:1 ; 4:4:2:1 ; 2:2:1:2 ; 4:4:1:2 ; et 2:2:2:1. Les rapport (p/p) préférés pour les saccharides provenant des sérogroupes C:W135:Y sont : 1:1:1 ; 1:1:2 ; 1:1:1 ; 2:1:1 ; 4:2:1 ; 2:1:2 ; 4:1:2 ; 2:2:1 ; et 2:1:1. L'utilisation d'un poids eessentiellement égal de chaque saccharide est préférée.
Les saccharides capsulaires peuvent être utilisés sous la forme d'oligosaccharides. Ceux-ci sont commodément formés par fragmentation du polysaccharide capsulaire purifié (p. ex. par hydrolyse), normalement suivie par la purification des fragments ayant la taille recherchée.
La fragmentation des polysaccharides est de préférence réalisée pour obtenir un degré moyen final de polymérisation (DP) dans l'oligosaccharide inférieur à 30 (p. ex. entre 10 et 20, de préférence d'environ 10 pour le sérogroupe A ; entre 15 et 25 pour les sérogroupes W135 et Y, de préférence d'environ 15-20 ; entre 12 et 22 pour le sérogroupe C ; etc.) . Le DP peut être commodément mesuré par une chromatographie d'échange d'ions ou par des dosages colorimétriques [86].
Si une hydrolyse est effectuée, l'hydrolysat sera généralement dimensionné afin d'éliminer les oligosaccharides de courte longueur [65]. Ceci peut être effectué de diverses façons, comme par une ultrafiltration suivie d'une chromatographie d'échange d'ions. Les oligosaccharides ayant un degré de polymérisation inférieur ou égal à environ 6 sont de préférence éliminés du sérogroupe A, et ceux ayant un degré de polymérisation inférieur à environ 4 sont de préférence éliminés des sérogroupes W135 et Y.
Les antigènes saccharidiques MenC préférés, utilisés dans MENJUGATE™, sont décrits dans la référence 85.
Conjugaison covalente
De manière générale, les saccharides capsulaires dans les compositions selon l'invention seront conjugués à des protéines porteuses. En général, la conjugaison améliore l'immunogénicité des saccharides dans la mesure où elle les convertit d'antigènes T-indépendants en antigènes T- dépendants, permettant ainsi l'amorçage d'une mémoire immunologique. La conjugaison est particulièrement utile pour les vaccins pédiatriques et est une technique très connue.
Les protéines porteuses typiques sont des toxines bactériennes, telles que les toxines diphtériques ou tétaniques, ou les anatoxines ou mutants de celles-ci. Le mutant toxine diphtérique CRM197 [87] est utile, and est la protéine porteuse du PREVNAR™. D'autres protéines porteuses convenables comprennent le complexe protéique de membrane externe de N. meningitidis [88], les peptides synthétiques [89,90], les protéines de choc thermique [91,92], les protéines pertussiques [93,94], les cytokines [95], les lymphokines [95], les hormones [95], les facteurs de croissance [95], les protéines artificielles comprenant de multiples épitopes T CD4+ humains provenant de divers antigènes dérivés de pathogènes [96] tels que N19 [97], la protéine D de H. influenzae [98,100], la pneumolysine [101] ou ses dérivés non toxiques [102], la protéine de surface pneumococcique PspA [103], les protéines absorbant le fer [104], la toxine A ou B de C. difficile [105], 1'exoprotéine recombinée A de P. aeruginosa (rEPA) [106], etc.
Toute réaction de conjugaison convenable peut être utilisée, avec tout lieur (« linker ») convenable, là où c'est nécessaire.
Le saccharide sera typiquement activé ou fonctionnalisé avant conjugaison. L'activation peut impliquer, par exemple, des réactifs de cyanylation tels que CDAP (p. ex. tétrafluoroborate de l-cyano-4-diméthylamino-pyridinium [107, 108, etc.]). D'autres techniques convenables utilisent des carbodiimides, des hydrazides, des esters actifs, du norborane, de l'acide p-nitrobenzoïque, du N-hydroxy-succinimide, S-NHS, EDC, TSTU, etc.
Les liaisons par l'intermédiaire d'un groupe lieur (« linker ») peuvent être formées à l'aide de toute procédure connue, par exemple, les procédures décrites dans les références 109 et 110. Un type de liaison implique l'amination . réductrice du polysaccharide, le couplage du groupe amino obtenu à une extrémité du groupe lieur (« linker ») acide adipique, puis le couplage d'une protéine à l'autre extrémité du groupe lieur (« linker ») acide adipique [111,112]. D'autres lieurs (« linker ») comprennent le B-propionamido [113], la nitrophényl-éthylamine [114], les halogénures halogénoacyle [115], les liaisons glycosidiques [116], l'acide 6-aminocaproïque [117], l'ADH [118], les fragments C4 à C12 [119], etc. Comme alternative à l'utilisation d'un lieur (« linker »), la liaison directe peut être utilisée. Les liaisons directes à la protéine peuvent comprendre l'oxydation du polysaccharide, suivie de l'amination réductrice avec la protéine, comme décrit, par exemple, dans les références 120 et 121.
Un procédé impliquant l'introduction de groupes amino dans le saccharide (p. ex. par remplacement des groupes =0 terminaux par -NH2) , suivie de la formation de dérivés avec un diester adipique (p. ex. N-hydroxysuccinimidodiester d'acide adipique) et réaction avec la protéine porteuse est préféré.
Une autre réaction préférée utilise l'activation de CDAP à l'aide d'une protéine porteuse D, p. ex. pour MenA ou MenC. Généralités
Le terme "comprenant" englobe "contenant" ainsi que "constitué par", p. ex. une composition "comprenant" X peut être exclusivement constituée par X ou peut contenir quelquechose d'autre, p. ex. X + Y. Les références à "comprenant" (ou "comprend", etc.) peuvent éventuellement être remplacées par des références à "constitué par" (ou "constitué de", etc.).
Le terme "environ" en relation avec une valeur numérique x est facultatif et désigne, par exemple, x + 10 %.
Le terme "sensiblement" n'exclut pas "complètement", p. ex. une composition qui est "sensiblement exempte" de Y peut être complètement exempte de Y. Là où c'est nécessaire, le terme "sensiblement" peut être omis de la définition de 1’invention. "L’identité de séquence" est de préférence déterminée par l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch [122], en utilisant les paramètres par défaut (p. ex. avec une pénalité d'ouverture de gap = 10.0, et une pénalité d'extension de gap = 0.5, en utilisant la matrice de notation EBLOSUM62). Cet algorithme est facile à mettre en œuvre avec l'outil needle du logiciel EMBOSS [123]. Quand l'application fait référence à une identité de séquence avec une SEQ ID particulière, l'identité doit être calculée sur toute la longueur de cette SEQ ID.
Après le sérogroupe, la classification des méningocoques inclut le sérotype, le séro-sous-type, puis 1'immunotype, et la nomenclature standard liste le sérogroupe, le sérotype, le séro-sous-type, et 1'immunotype, chacun séparé par un deux-points, p. ex. B : 4 : PI. 15 : L3,7,9 . Au sein du sérogroupe B, certaines lignées provoquent la maladie souvent (hyperinvasives), certaines lignées provoquent des formes plus sévères de la maladie que d'autres (hypervirulentes), et d'autres provoquent rarement la maladie. Sept lignées hypervirulentes sont reconnues, à savoir les sous-groupes I, III et IV-1, le complexe ET-5, le complexe ET-37, le cluster A4 et la lignée 3. Elles ont été définies par électrophorèse multilocus des enzymes (MLEE), mais le typage multilocus des séquences (MLST) a également été utilisé pour classifier les méningocoques. Les quatre principaux clusters hypervirulents sont les complexes ST32, ST44, ST8 et ST11.
EXEMPLES
Exemple 1 : le vaccin BEXSERO™ (à titre de référence)
Le BEXSERO™ est sans danger et efficace et a été autorisé pour un usage humain en Europe et ailleurs. Il contient les éléments immunogènes suivants par dose de 0,5 ml :
Ces immunogènes sont adsorbés sur un adjuvant de type hydroxyde d'aluminium (0,5 mg A1+++ par dose). La composition contient également du NaCl, un tampon histidine, et du saccharose.
Exemple 2 : Polypeptides de fusion stabilisés et stabilisés non liants
Les inventeurs ont étudié deux types différents de mutations dans v2 et v3 : d'abord, ils ont identifié des résidus dans SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3 qui peuvent être modifiés pour accroître la stabilité du polypeptide. Deuxièmement, ils ont identifié des résidus qui réduisent la liaison au facteur H humain (fH) . Les mutants polypeptidiques fHbp portant ces deux types de mutations ont des propriétés améliorées. Plus spécifiquement, les mutants fHbp qui ne lient pas le facteur H mais qui conservent l'immunogénicité sont avantageux car les réponses en anticorps obtenues sont dirigées contre des épitopes sur ou à proximité du site de fixation du fH. Après vaccination avec des antigènes fHbp de type sauvage, ces épitopes peuvent être occultés par la liaison du facteur H. Les acides aminés présentant le plus d'intérêt, numérotés selon les séquences pleine longueur (SEQ ID NO : 1 & 3) et également selon les séquences AG (SEQ ID NO : 8 & 7) sont les suivants :
** Quand un seul de ces résidus est muté, la préférence va à la leucine
Les mutations concernant la stabilité et la liaison fHbp ont été combinées pour donner les formes mutantes v2 et v3 et fusionnées à une séquence vl mutante portant la mutation R41S. Les mutants ont été fusionnés dans l'ordre v2-v3-vl et joints les uns aux autres par des lieurs (« linker ») , pour donner S NB 731 (SEQ ID NO : 38) . Comparativement aux trois séquences de type sauvage, ce polypeptide de fusion inclut un total de 7 mutations ponctuelles (Figure 2). Séparément, les mutations concernant la stabilité dans v2 et v3 ont été fusionnées avec la séquence du mutant vl "R41S" dans l'ordre v2-v3-vl et joints les uns aux autres par des lieurs (« linker ») , pour donner 731 S (SEQ ID NO : 40) . Par conséquent, comparativement aux trois séquences de type sauvage, ce polypeptide de fusion inclut un total de 5 mutations ponctuelles (Figure 2).
La capacité des formes ne liant pas fH du fHbp à susciter des titres SBA a été testée chez des souris transgéniques (Tg) :
Ces données indiquent que les formes non liantes de fHbp peuvent être plus immunogènes.
Exemple 3 : Substitution de la fusion NMB2091-fHbp
Le BEXSERO™ a été modifié par remplacement du polypeptide de fusion NMB2091-fHbp par un polypeptide "triple fusion" constitué par les variants fHbp, dans l'ordre v2-v3-vl de l'extrémité N- à C-terminale. Ce polypeptide de fusion a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10. De plus, le composant OMV a été omis. Les deux vaccins ont été comparés chez des souris immunisées les jours 0, 21 et 35, les sérums étant évalués les jours 34 et 49 contre un panel de 15 souches de sérogroupe B dans divers complexes clonaux, MLST, et classifications ET. Les antigènes ont été administrés à 20 pg/dose, avec l'adjuvant à 3 mg/ml.
Les proportions de souches présentant des titres SBA supérieurs à divers seuils étaient les suivantes :
L'utilisation du polypeptide de fusion v2-v3-vl peut par conséquent fournir une couverture contre une proportion plus élevée du panel (60 % contre 53 %) , à un titre SBA anti-MenB élevé (>4096) .
Exemple 4 : Réduction de 4 fois de la dose OMV
Le BEXSERO™ a été modifié par remplacement du polypeptide de fusion NMB2091-fHbp par le polypeptide fHbp "triple fusion" v2-v3-vl (SEQ ID NO : 10) mais également soit par (i) réduction de 4 fois de la dose OMV, à 12,5 pg/ml, soit par (ii) élimination du composant OMV. Trois compositions ont par conséquent été préparées :
Pour évaluer 1'immunogénicié de ces trois vaccins, des sujets humains ont reçu trois doses à des intervalles de 1 mois (mois 0, 1, 2). Les sérums ont été'prélevés aux mois 0, 1, 2 et 3, puis 6 mois après la troisième dose (mois 8), pour une évaluation contre un panel de souches pertinentes. Les titres (GMT) obtenus étaient les suivants :
Des sérums de patients regroupés en pool ont été utilisés pour évaluer la couverture d'un panel de souches MenB qui expriment un fHbp vl. Un nombre similaire de souches a été couvert de manière adéquate dans chaque groupe, mais les titres (GMT) les plus élevés étaient dans le groupe C :
Des sérums de patients individuels ont été testés contre un panel de 6 souches MenB qui expriment un fHbp v2 ou v3 (dont une souche testée deux fois) . Là encore, les titres (GMT) les plus élevés étaient dans le groupe C :
De plus, la proportion de sujets immunisés ayant un titre SBA supérieur à 1:8 était généralement plus élevée dans le groupe C comparativement aux groupes M et S, p. ex. 80 % ou plus pour la souche M1239 après 3 doses contre 50 % ou moins dans les deux autres groupes.
Les courbes RCD (distribution cumulative inverse) des titres SBA ont également montré un meilleur profil, p. ex. la Figure 1 montre une courbe pour des sérums à 3 mois contre la souche UK293, où le groupe C est nettement au-dessus des autres.
Des sérums de patients regroupés en pool ont été utilisés pour évaluer la couverture d'un panel de 26 souches MenB qui expriment un fHbp v2 ou v3. Là encore, les titres (GMT) les plus élevés étaient dans le groupe C :
Ces données montrent par conséquent que le vaccin "C", dans lequel l'immunogène fHbp a été remplacé et la dose d'OMV a été réduite de 4 fois, n'est pas inférieur au BEXSERO™. En fait, les sérums des sujets individuels et regroupés en pool montrent tous deux de meilleurs taux de réponses sériques, des GMT plus élevés, et une couverture accrue contre les souches pour le vaccin "C", comparé au BEXSERO™.
Exemple 5 : Avidité des anticorps L'avidité des anticorps chez les patients des groupes "C" et "S" a été comparée à l'aide d'un système opérant sous Gyrolab qui comprend une étape de lavage à l'aide d'un agent chaotrope pour détacher les anticorps de basse affinité de l'antigène, et obtenir "l'indice d'avidité" sous forme de pourcentage d'anticorps anti-vl.fHbp d'affinité élevée parmi les anticorps totaux spécifiques de vl.fHbp. Vingt sérums séparés ont été évalués 1 mois après la première dose et 1 mois après la troisième dose. De plus, les titres SBA ont été évalués contre la souche H44/76, et les corrélations entre indice d'avidité et titre SBA (log2) ont été déterminées.
Les résultats (corrélation R et p de Pearson) étaient les suivants :
Il existait donc une corrélation significative entre le titre SBA et l'indice d'avidité dans le groupe "C" à ces deux points temporels, mais pas dans le groupe "S". Chez les sujets ayant reçu le vaccin avec 12,5 pg/ml d'OMV, l'indice d'avidité se corréle aux titres SBA, ce qui suggère que la présence d'OMV a un effet positif sur la qualité des anticorps induits. Dans l'ensemble, chez les sujets ayant reçu des OMV, la tendance est que les titres bactéricides sont plus élevés et qu'ils se corrélent à l'avidité des anticorps induits par la formulation vaccinale.
Un sous-panel de souches var2/3 a été sélectionné pour l'étude des sérums de sujets individuels selon les critères suivants : (i) Souches non couvertes par Bexsero dans les essais cliniques précédents, (ii) Souches appartenant à des complexes clonaux pertinents, (iii) Souches exprimant des sous-variants fHbp épidémiologiquement pertinents, (iv) Niveau d'expression de fHbp moyen, (v) Souches spécifiquement détruites par 741-231 (principe hSBA compétitif) . Les résultats sont illustrés sur les Figures 3 (a) à 3(g) et démontrent que 741-231+ +3 OMV+ alun suscite des titres GMT plus élevés contre les 7 souches testées. Par conséquent, la théorie hSBA indique que les formulations contenant la fusion 741-231 ne sont pas inférieures au Bexsero. En effet, l'analyse à la fois des sérums de sujets individuels et des sérums regroupés en pool sur les souches var2/3 montre de meilleurs taux de réponses sériques, des titres GMT plus élevés, et une couverture accrue contre ces souches pour la formulation contenant 741-231 + H OMV + alun.
Exemple 6 : Réduction des doses OMV et utilisation de 731 "S" et 731 "SNB"
Le BEXSERO™ a été modifié par remplacement du polypeptide de fusion NMB2091-fHbp par des polypeptides fHbp v2-v3-vl "triple fusion" stabilisés ou stabilisés et non liants (SEQ ID NO : 40 et 38, respectivement) mais également par réduction de la dose OMV à 10 ou 2,5 pg/ml :
Pour préparer des antisérums murins, 20 pg de NadA, NHBA-NMB1030 et soit NMB2091-fHbp, soit fHbp 231S ou fHbp 231SNB avec 10 ou 2,5 pg d'OMV dérivées de la souche NZ98/254 ont été utilisés pour immuniser des souris femelles CD1 de six semaines (Charles River) . Huit souris par groupe ont été utilisées. Les antigènes ont été administrés par voie intrapéritonéale avec de 1'hydroxyde d'aluminium (3 mg/ml) les jours 0, 21 et 35. Les sérums ont été recueillis 2 semaines après le prélèvement final et thermo-inactivés pendant 30 min à 56 °C avant analyse.
Dosage bactéricide sérique sur des sérums d’animaux avec source de complément humain L'activité bactéricide sérique contre des souches Nm a été évaluée comme décrit précédemment. Du sérum ou plasma humain provenant d'un adulte sain (sans activité bactéricide intrinsèque lors de tests à une concentration finale de 25 ou 50 %) a été utilisé comme source de complément. Les titres bactérides sériques ont été définis comme la dilution sérique provoquant une réduction de 50 % des unités formant colonies (CFU) par ml après une incubation de 60 min des bactéries avec le mélange réactionnel, par rapport aux CFU témoins par ml au temps 0.
La dilution la plus basse testée pour chaque sérum était de 1:16 (limite de détection) . Les titres au-dessous de la limite de détection ont été définis à la moitié de cette limite à des fins d'analyse et le seuil positif a été fixé à un accroissement de 4 fois cette valeur (à savoir, 32) . Les sérums regroupés en pool dérivés des souris immunisées avec la formulation Bexsero étaient sous le seuil positif pour 14 souches sur les 34 testées, tandis que les sérums regroupés en pool dérivés de la formulation de 2nde génération étaient sous la limite de détection pour 1 seule souche dans le cas de la formulation vaccinale contenant fHbp 231SNB et pour 1 seule souche dans le cas de la formulation contenant fHbp 231S.
Les données hSBA rapportées dans le tableau ci-dessous ont montré un accroissement de la couverture suscité par les formulations vaccinales contenant fHbp 231S ou fHbp 231SNB comparativement au Bexsero dans le panel des 34 souches testées :
On comprendra que l'invention n'est décrite ci-dessus que par le biais d'exemples et que des modifications peuvent être apportées tout en restant dans la portée et l'esprit de 1'invention.
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Claims (15)
- REVENDICATIONS1. Composition immunogène comprenant un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, en combinaison avec un ou plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) des vésicules de membrane externe de méningocoques.
- 2. Composition immunogène comprenant des vésicules de membrane externe de méningocoques en combinaison avec un ou plusieurs des composants suivants : (i) un polypeptide NHBA, (ii) un polypeptide NadA et/ou (iii) un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3 ; les vésicules de membrane externe (OMV) étant présentes à une concentration entre 5 et 30 pg/ml.
- 3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, comprenant (i) un polypeptide de fusion comprenant les trois fHbp méningococciques vl, v2 et v3, (ii) un polypeptide NHBA, (iii) un polypeptide NadA et (iv) des vésicules de membrane externe de méningocoques.
- 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle : • le polypeptide de fusion inclut au moins un épitope provenant de chacune des SEQ ID NO : 7, 8, et 9 et, après administration à une souris, peut susciter la production d'anticorps capables de reconnaître les trois polypeptides, à savoir (a) un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 4, (b) un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 5, et (c) un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 6 ; • le polypeptide NHBA peut susciter la production d'anticorps qui, après administration à une souris, peut se lier à un polypeptide constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13 ; et/ou • le polypeptide NadA peut susciter la production d'anticorps qui, après administration à une souris, peut se lier à un polypeptide constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 18.
- 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le polypeptide de fusion fHbp a une a une séquence d'acides aminés de formule NH2—A-[-X-L-]3-B— COOH, dans laquelle chaque X est un variant différent de la séquence fHbp, L est une séquence d'acides aminés lieur (« linker ») facultative, A est une séquence d'acides aminés N-terminale facultative, et B est une séquence d'acides aminés C-terminale facultative.
- 6. Composition selon la revendication 5, dans laquelle les séquences des variants fHbp sont dans l'ordre v2-v3-vl dans le sens N-terminal à C-terminal.
- 7. Composition selon la revendication 6, dans laquelle le polypeptide de fusion comprend une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par SEQ ID NO : 10, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, et 38.
- 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle : (a) le polypeptide de fusion fHbp a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 36, ou SEQ ID NO : 38 ; (b) le polypeptide NHBA comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12 ; et (c) le polypeptide NadA a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 19.
- 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les OMV proviennent d'une souche de sérogroupe B.
- 10. Composition selon la revendication 9, dans laquelle les OMV sont préparées à partir de la souche NZ98/254.
- 11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les OMV sont présentes à une concentration entre 10 et 15 pg/ml.
- 12. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les polypeptides fHbp, NHBA et NadA sont présents à une concentration entre 50 et 150 pg/ml.
- 13. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un adjuvant de type hydroxyde d'aluminium..
- 14. Méthode de protection d'un mammifère contre une infection à méningocoques, oomprenant l'administration d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes audit mammifère.
- 15. Méthode selon la revendication 14 dans laquelle ledit mammifère est un sujet humain.
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