JP6786394B2 - 改変髄膜炎菌ｆＨｂｐポリペプチド - Google Patents

Description

本出願は、欧州特許出願第14157399.8号(2014年2月28日出願)および第14177566.8号(2014年7月17日出願)の利益を主張し、その両方の全内容はあらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられるものとする。

技術分野
本発明は、タンパク質工学の分野にあり、特に、有用なワクチン免疫原として知られる、髄膜炎菌H因子結合タンパク質(fHbp)に関する。

髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)は、約10%のヒト集団の上気道に定着するグラム陰性被包性細菌である。コンジュゲートワクチンは、血清群A、C、W135およびYに対して利用可能であるが、2用量レジメンにおいて血清群Bに対して防御するのに利用可能である唯一のワクチンは、2013年に認可されたBEXSERO(商標)製品である。

BEXSERO(商標)における防御免疫原の1つは、タンパク質「741」(参考文献1中の配列番号2536；本明細書では配列番号1)、「NMB1870」、「GNA1870」[2〜4、「P2086」、「LP2086」または「ORF2086」[5〜7]としても知られてきたfHbpである。このタンパク質の3D構造は公知であり[8、9]、タンパク質は短いリンカーにより接続された2つのβ-バレルを有する。多くの刊行物が、髄膜炎菌ワクチンにおけるこのタンパク質の予防効果に関して報告しており、例えば、参考文献10〜14を参照されたい。fHbpリポタンパク質は、全血清群にわたって様々な株において発現される。fHbp配列は3つの変異体[2](本明細書ではv1、v2およびv3と呼ばれる)に分類されており、所与の変異体に対して生じた血清はその変異体を発現する株に対して殺菌的であるが、他の2つの変異体の1つを発現する株に対しては活性ではない、すなわち、変異体内交差防御が存在するが、変異体間交差防御は存在しない(いくつかのv2およびv3交差反応性を除く)ことが一般に見出されている。

ファミリー間交差反応性を増大させるために、fHbp配列は3つ全部の変異体に対する特異性を含有するように操作されてきた[15]。また、親鉄剤[16]およびH因子[17〜25]とのfHbpの相互作用を除去するためにもタンパク質工学が用いられてきた。fHとの相互作用の破壊は、3つ全部の変異体について報告されており、優れたワクチン免疫原を提供すると主張されている[22、26]。しかしながら、v2ポリペプチドについては、参考文献23および24は、fH結合が破壊された突然変異体においても見られる固有の不安定性を報告している。不安定性は、N末端β-バレルドメインから生じると考えられ、参考文献23は、このバレル中の置換が不安定性を促進し得ると警告している。

国際公開第99/57280号 国際公開第03/063766号 国際公開第2011/051893号 国際公開第2010/046715号 国際公開第2011/126863号

Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799. Welsch et al. (2004) J Immunol 172:5605-15. Hou et al. (2005) J Infect Dis 192(4):580-90. Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100. Zhu et al. (2005) Infect Immun 73(10):6838-45. Cendron et al. (2011) Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 67:531-5. Mascioni et al. (2009) J Biol Chem 284:8738-46. Pizza et al. (2008) Vaccine 26 Suppl 8:I46-8. Malito et al. (2013) PNAS USA 110:3304-9. Marshall et al. (2012) Pediatr Infect Dis J 31:1061-8. McNeil et al. (2013) Microbiol Mol Biol Rev 77:234-52. Serruto et al. (2012) Vaccine 30 Suppl 2: B87-97. Scarselli et al. (2011) Sci Transl Med 3:91ra62. Schneider et al. (2009) Nature 458:890-5. Beernink et al. (2010) Clin Vaccine Immunol 17:1074-8. Beernink et al. (2011) J Immunol 186:3606-14. Rossi et al. (2013) Vaccine 31:5451-7. van der Veen et al. (2014) Infect Immun PMID 24379280. Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981. Pajon et al. (2012) Infect Immun 80:2667-77. Granoff et al. (2013) Clin Vaccine Immunol 20:1099-107.

本発明の目的は、安定性が増強された、さらなるfHbp v2およびv3突然変異体を提供することである。

v2中の2996株に由来する完全長fHbpは、以下のアミノ酸配列(配列番号2):

を有する。

成熟リポタンパク質は、配列番号2の最初の19アミノ酸(下線付き；配列番号4を提供する)を欠き、配列番号2のΔG形態は最初の26アミノ酸(配列番号5)を欠く。

v3中のM1239株に由来する完全長fHbpは、以下のアミノ酸配列(配列番号3):

を有する。

成熟リポタンパク質は、配列番号3の最初に19アミノ酸(下線付き；配列番号40を提供する)を欠き、配列番号3のΔG形態は最初の31アミノ酸(配列番号17)を欠く。

本発明者らは、ポリペプチドの安定性を増大させるように改変することができる配列番号2および配列番号3内の残基を同定した。これらの残基は一般に、v2およびv3配列にわたって存在し、したがって、それらの改変は安定性が増強されたv2およびv3 fHbp配列を提供することができる。さらに、本発明者らは、安定性の増大と同様、これらの残基の突然変異がヒトH因子(fH)への結合を有意に低下させることができることも示した。さらに、しかしながら、本明細書に開示される突然変異を、他の突然変異と組み合わせて、例えば、ヒトH因子(fH)への結合を低下させることができ、いくつかの突然変異が既に当業界で公知である。

かくして、一般に、本発明は、野生型fHbpと比較して(例えば、配列番号2または3と比較して)安定性が増大し、場合により、野生型fHbpよりも(例えば、配列番号2または3と比較して)ヒトH因子に対する親和性が低い、v2またはv3 fHbp突然変異体を提供する。安定性の増大および必要に応じたfH親和性の低下は、好ましくは同じ突然変異から生じるが、いくつかの実施形態においては、それらは組み合わせた突然変異の別々の効果に起因するものであってもよい。安定性が増大し、かつfH親和性が低下したfHbpタンパク質突然変異体が好ましい。

第1の実施形態において、本発明は、fHbp v2アミノ酸配列突然変異体を含むポリペプチドであって、(a)アミノ酸配列が、配列番号5に対して少なくともk%の配列同一性を有する、および/もしくは配列番号5の断片を含むが、(b)アミノ酸配列が以下の残基:S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239、および/もしくはE240の1つ以上において配列番号5と異なる、前記ポリペプチドを提供する。

特徴(a)が断片に関する場合、断片は(b)に列挙される残基の少なくとも1つを含むが、その残基は、配列番号5中のその残基と比較した場合、異なる。(a)の断片は、一般に、配列番号5に由来する、少なくとも7アミノ酸長、例えば、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60個以上の連続するアミノ酸である。断片は、典型的には、配列番号5に由来する少なくとも1つのエピトープを含む。エピトープ同定およびマッピングは、fHbpについて確立されている[11; 27〜31]。少なくとも30個の連続するアミノ酸と配列番号5との共有は典型的であり、通常、fHbp v2アミノ酸配列突然変異体は、配列番号5に由来するいくつかの(例えば、2、3、4、5つ以上の)断片を含む。全体として、fHbp v2アミノ酸配列突然変異体は、少なくともk%の配列同一性を有し、配列番号5のいくつかの断片を含んでもよい。

kの値は、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99以上から選択することができる。それは、好ましくは90であり(すなわち、fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が配列番号5に対して少なくとも90%の同一性を有する)、より好ましくは95である。

ポリペプチドは、宿主動物への投与後、配列番号4からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起する。これらの抗体は、理想的には殺菌性である(以下を参照されたい)。これらの抗体は、v1またはv3ポリペプチド(例えば、配列番号46からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドおよび配列番号40からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチド)を認識しないいくつかの抗体を含んでもよいが、それらはv1および/またはv3ポリペプチドと交差反応するいくつかの抗体を含んでもよい。

ポリペプチドは、同じ実験条件下では、(b)の配列の差異はないが、同じポリペプチドよりも高い安定性を有する、例えば、配列番号4からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドよりも高い安定性を有する。安定性の増強を、例えば、参考文献32および33で考察されたような、示差走査熱量測定(DSC)を用いて評価することができる。DSCは、v2 fHbpの安定性を評価するために以前から用いられてきた[24]。安定性を評価するためのDSCにとって好適な条件は、100〜200mMのNaCl(例えば、150mM)を含む、pH6〜8(例えば、7〜7.5)を有する緩衝溶液(例えば、25mM Tris)中の20μMのポリペプチドを用いることができる。

いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドは、配列番号5と比較してトランケートされている。野生型成熟配列と比較して、配列番号5は、ポリグリシン配列(配列番号4および5を比較する)を含むそれ以下のN末端で既にトランケートされているが、配列番号5はC末端でトランケートされていてもよく、および/またはN末端でさらにトランケートされていてもよい。

安定性の増大は、理想的には少なくとも5℃、少なくとも10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃以上である。これらの温度は、DSCにより評価された場合、温度遷移中点(Tm)の増大を指す。野生型fHbpは、アンフォールディング中に2つのDSCピークを示し(1つはN末端ドメインに関するものであり、1つはC末端ドメインに関するものである)、本発明のポリペプチドが、そのようなドメインの両方を含む場合、増大はN末端ドメインの安定性を指し、野生型v2配列に関しては40℃以下でも起こり得る[24](その一方、C末端ドメインは80℃以上のTmを有してもよい)。かくして、本発明のfHbp v2アミノ酸配列突然変異体は、好ましくは、少なくとも45℃、例えば、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、またはさらには80℃以上のTmを有するN末端ドメインを有する。

第2の実施形態において、本発明は、fHbp v3アミノ酸配列突然変異体を含むポリペプチドであって、(a)アミノ酸配列が配列番号17に対する少なくともj%の配列同一性を有する、および/もしくは配列番号17の断片を含むが、(b)アミノ酸配列が以下の残基: S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242、および/もしくはE243の1つ以上において配列番号17と異なる、前記ポリペプチドを提供する。

特徴(a)が断片に関する場合、断片は(b)に列挙される残基の少なくとも1つを含むが、残基は配列番号17中のその残基と比較した場合、異なる。(a)の断片は一般に、配列番号17に由来する、少なくとも7アミノ酸長、例えば、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60個以上の連続するアミノ酸である。断片は、典型的には、配列番号17に由来する少なくとも1つのエピトープを含む。エピトープ同定およびマッピングは、fHbpについて確立されている[11; 27〜31]。少なくとも30個の連続するアミノ酸と配列番号17との共有は典型的であり、通常、fHbp v3アミノ酸配列突然変異体は、配列番号17に由来するいくつかの(例えば、2、3、4、5つ以上の)断片を含む。全体として、fHbp v3アミノ酸配列突然変異体は、少なくともj%の配列同一性を有し、配列番号17のいくつかの断片を含んでもよい。

jの値は、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99以上から選択することができる。それは、好ましくは90であり(すなわち、fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が配列番号17に対して少なくとも90%の同一性を有する)、より好ましくは95である。

ポリペプチドは、宿主動物への投与後、配列番号40からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起する。これらの抗体は、理想的には殺菌性である(以下を参照されたい)。これらの抗体は、v1またはv2ポリペプチド(例えば、配列番号46からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドおよび配列番号4からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチド)を認識しないいくつかの抗体を含んでもよいが、それらはv1および/またはv2ポリペプチドと交差反応するいくつかの抗体を含んでもよい。

ポリペプチドは、同じ実験条件下では、(b)の配列の差異はないが、同じポリペプチドよりも高い安定性を有する、例えば、配列番号40からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドよりも高い安定性を有する。安定性の増強を、例えば、参考文献32および33で考察されたような、示差走査熱量測定(DSC)を用いて評価することができる。DSCは、v3 fHbpの安定性を評価するために以前から用いられてきた[23]。安定性を評価するためのDSCにとって好適な条件は、100〜200mMのNaCl(例えば、150mM)を含む、pH6〜8(例えば、7〜7.5)を有する緩衝溶液(例えば、25mM Tris)中の20μMのポリペプチドを用いることができる。

いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドは、配列番号17と比較してトランケートされている。野生型成熟配列と比較して、配列番号17はポリグリシン配列(配列番号40および17を比較する)を含むそれ以下のN末端で既にトランケートされているが、配列番号17はC末端でトランケートされていてもよく、および/またはN末端でさらにトランケートされていてもよい。

安定性の増大は、理想的には少なくとも5℃、少なくとも10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃以上である。これらの温度は、DSCにより評価された場合、温度遷移中点(Tm)の増大を指す。野生型fHbpは、アンフォールディング中に2つのDSCピークを示し(1つはN末端ドメインに関するものであり、1つはC末端ドメインに関するものである)、本発明のポリペプチドが、そのようなドメインの両方を含む場合、増大はN末端ドメインの安定性を指し、野生型v3配列に関しては約60℃以下で起こり得る[24](その一方、C末端ドメインは80℃以上のTmを有してもよい)。かくして、本発明のfHbp v3アミノ酸配列突然変異体は、好ましくは、少なくとも65℃、例えば、70℃以上、75℃以上、またはさらには80℃以上のTmを有するN末端ドメインを有する。

配列番号5と比較した突然変異
本発明の第1の実施形態のポリペプチドは、配列番号5に対する少なくともk%の同一性を有する、および/または配列番号5の断片を含む、アミノ酸配列を含む。しかしながら、配列番号5と比較して、このアミノ酸は、アミノ酸残基S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239、および/またはE240の1つ以上において、例えば、これらの17の残基の2、3、4、5個以上において改変を有する。これらの残基は、配列番号5にしたがって番号付けられ、新生野生型配列(配列番号2)と一致させるために、番号付けは+26に変化させるべきであり(すなわち、配列番号5のSer-32は配列番号2のSer-58である)、成熟野生型配列(配列番号4)と一致させるために、番号付けは+7に変化させるべきである(また、参考文献25との容易な比較を可能にする)。

突然変異のための好ましい残基は、S32、V100、L123、V124、S125、G126、L127、G128、H239、および/またはE240である。これらの残基での突然変異は、野生型v2と比較して良好な安定性を有するタンパク質を与える。このサブセット内で、好ましい残基は、S32、L123、V124、S125、G126、L127、および/またはG128である。最も好ましい位置は、S32、L123、V124、S125、G126、L127、および/またはG128であり、残基S32および/またはL123、例えば、S32VおよびL123Rが特に好ましい。V100、S125、および/またはG126の1つ以上が突然変異される場合、このトリオ以外の残基も突然変異させるのが好ましい。

特定の残基を欠失させてもよいが、好ましくは、それを異なるアミノ酸によって置換する。例えば、Ser-32を、他の19の天然アミノ酸のいずれかによって置換してもよい。置換を行う場合、いくつかの実施形態においては、置き換えアミノ酸は、グリシンまたはアラニンなどの単純なアミノ酸であってもよい。他の実施形態においては、置き換えアミノ酸は、保存的置換である、例えば、それは以下の4群：(1)酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；(2)塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および(4)非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン内で行われる。他の実施形態においては、置換は、非保存的である。いくつかの実施形態においては、置換は、アラニンを用いない。

特定の残基での好ましい置換は、以下の通りである：S32V; V33C; L39C; L41C; F69C; V100T; I113S; F122C; L123R; V124I; S125GまたはS125T; G126D; L127I; G128A; S151C; H239R; E240H。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がE240に置換を含む場合、この置換は、E240のみが突然変異される場合、アラニンとのものでないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、E240およびH239残基が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。理想的には、E240はそのままで突然変異されず、したがって、E240に置換を有するfHbp v2アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に、例えば、E240とH239の両方に置換を含むべきである(突然変異体#1および#11を参照されたい)。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がF122に置換を含む場合、この置換は、F122のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、F122およびS151残基が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。理想的には、F122はそのままで突然変異されず、したがって、F122に置換を有するfHbp v2アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。ジスルフィド架橋の形成を可能にするために、F122が置換される場合、S151もまた置換される、例えば、両方ともシステインで置換されるのが好ましい(突然変異体#10を参照されたい)。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がL123に置換を含む場合、この置換は、L123のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、L123およびS32残基が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。理想的には、L123はそのままで突然変異されず、アルギニンとの置換が好ましい(例えば、突然変異体#4を参照されたい)。しかしながら、いくつかの実施形態においては、L123はそのままで突然変異されず、したがって、L123に置換を有するfHbp v2アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含んでもよい。L123が置換される場合、(i)突然変異体#3に見られるように、S32も置換され、場合により、突然変異体#20および#22に見られるように、S125も置換される；または(ii)例えば、突然変異体#12に見られるように、残基124〜128の1つ以上もまた置換されるのが好ましいことがある。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がV124に置換を含む場合、この置換は、V124のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないのが好ましいが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、残基123〜128の1つ以上も突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。V124がそのままで突然変異される場合、イソロイシンとの置換が好ましい。しかしながら、理想的には、V124はそのままで突然変異されず、したがって、V124に置換を有するfHbp v2アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。V124が置換される場合、残基124〜128の1つ以上もまた、例えば、突然変異体#12に見られるように、置換されるのが好ましい。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がL127に置換を含む場合、この置換は、L127のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないのが好ましいが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、残基123〜128の1つ以上も突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。L127がそのままで突然変異される場合、イソロイシンとの置換が好ましい。しかしながら、理想的には、L127はそのままで突然変異されず、したがって、L127に置換を有するfHbp v2アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。L127が置換される場合、残基124〜128の1つ以上もまた、例えば、突然変異体#12に見られるように、置換されるのが好ましい。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がS32に置換を含む場合、この置換は、S32のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないのが好ましいが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、残基L123とS32が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。S32がそのままで突然変異される場合、バリンとの置換が好ましい。しかしながら、理想的には、S32はそのままで突然変異されず、したがって、S32に置換を有するfHbp v2アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。S32が置換される場合、(i)L123も、例えば、突然変異体#3に見られるように置換され、場合により、S125も、突然変異体#20および#22に見られるように置換される；または(ii)S125も、例えば、突然変異体#19および#21に見られるように置換されるのが好ましい。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がI113に置換を含む場合、この置換は、I113のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、それはアラニンであってもよい。I113がそのままで突然変異される場合、例えば、突然変異体#7に見られるように、セリンとの置換が好ましい。

fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がV33に置換を含む場合、これは、好ましくは、イソロイシンとのものではない。fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がI113に置換を含む場合、これは、好ましくは、トレオニンまたはアラニンとのものではない。fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がS151に置換を含む場合、これは、好ましくは、フェニルアラニンとのものではない。fHbp v2アミノ酸配列突然変異体がH239とE240の両方に置換を含む場合、これは、好ましくは、R239およびQ240に対するものではない。

2つ以上の置換を行う場合、これらのものは、以下のように、2A〜2Oの群から選択することができる：
2A:残基239および240、例えば、突然変異体#1、
2B:残基32および123、例えば、突然変異体#3、
2C:残基125および126、例えば、突然変異体#5、
2D:残基100、125および126、例えば、突然変異体#6、
2E:残基33および39、例えば、突然変異体#8、
2F:残基41および69、例えば、突然変異体#9、
2G:残基122および151、例えば、突然変異体#10、
2H:残基100、125、126、239および240、例えば、突然変異体#11、
2I:残基32および125、例えば、突然変異体#19および#21、
2J:残基32、123および125、例えば、突然変異体#20および#22、
2K:両方ともCysにより置換された、残基33および39、例えば、突然変異体#8、
2L:両方ともCysにより置換された、残基41および69、例えば、突然変異体#9、
2M:両方ともCysにより置換された、残基122および151、例えば、突然変異体#10、
2N:残基123、124、125、126、127および128、例えば、突然変異体#12、
2O:残基32、123、124、125、126、127および128。

かくして、例えば、残基239を置換しようとする場合、置換のための好ましい第2の残基は、240(すなわち、2A群)である；さらに、残基100、125および126も改変してもよい(すなわち、2A群と2D群の組合せである、2H群)。2A〜2Nおよび2O群内で、特定の位置での好ましい置換は、上記に列挙されたものである。2K、2Lおよび2M群について、意図は、ジスルフィド架橋を導入することである。2A〜2N群内で、好ましい突然変異体は2A、2B、2C、2D、2I、2J、および2Nである。より好ましくは、2C、2I、および2Nであり、2Nが特に好ましい。2B群は、最も好ましい突然変異、特に、S32VおよびL123R(例えば、配列番号20および45)を提供する。2O群は、2B、2Cおよび3つのさらなる突然変異(例えば、配列番号58を与える)を組み合わせる、別の好ましいセットの突然変異である。

v2配列中の突然変異について記載されるアミノ酸残基は、2996株に由来する、配列番号5と比較して番号付けられる。他の任意の株に由来するv2 fHbp中の対応するアミノ酸残基を、配列アラインメントにより容易に同定することができ、例えば、ペアワイズアラインメントアルゴリズム(例えば、以下に詳述される、Needleman-Wunsch全体アラインメントアルゴリズム)を用いて配列番号5と整列された場合、本明細書に記載のアミノ酸と整列するアミノ酸である。アミノ酸は配列番号5に見られるものと同じであることが多いが(例えば、残基32はセリンである)、これが当てはまらない場合、アラインメントは容易に同定する。

安定性を増大させることを目的とする上記の突然変異に加えて、本発明のポリペプチドは、例えば、親鉄剤とのポリペプチドの相互作用を破壊するため、より好ましくは、fHに結合するポリペプチドの能力を破壊するための1つ以上のさらなる突然変異を含んでもよい。

参考文献19および25は、fHとv2 fHbpとの相互作用を、残基R80、D211、E218、E248、T220+H222(二重突然変異)、およびG236での突然変異により破壊することができると報告している。配列番号5にしたがって番号付けられる場合、これらの残基は、R73、D203、E210、E240、T213+H215、およびG228である。参考文献25は、これらの突然変異体中の重要なエピトープに損傷はないと報告しているため、これらの位置のうち、D203、E210またはT213+H215で突然変異されたポリペプチドが好ましい。参考文献25で研究された特定の置換は、R73A、D203A、E210A、T213A+H215A、G228I、およびE240Aであった；これらの置換は、本発明による使用にとって好適である。

参考文献24は、fHとv2 fHbpとの相互作用を、残基R145、S193、F194、L195、A265、E267、K268、V272、I273、L274、E283、T286、H288、F292、T304、およびE313およびE283+T304(二重突然変異)での突然変異により破壊することができると報告している。配列番号5にしたがって番号付けられる場合、これらの残基は、R73、S121、F122、L123、A192、E194、K195、V199、I200、L201、E210、T213、H215、F219、T231、およびE240およびE210+T231である。これらのうちの4つは参考文献25と重複する(E210、T213、H215、E240)。参考文献24で研究された特定の置換はアラニンを用いたものであり(A265PおよびT304Eを除く)、これらの置換は本発明による使用にとって好適である。

参考文献24は、v2におけるある特定の置換がfHに対する親和性を増大させることができ、意図がfHへの結合を破壊するためのものである、例えば、配列番号5中のE85(参考文献24中の残基157)である場合、これらのものを避けるべきである。

親鉄剤と相互作用する残基を、例えば、本明細書における配列番号5を、参考文献16の配列番号4と整列させて、親鉄剤、例えば、カテコレート、ヒドロキサメートまたはカルボキシレートと相互作用することができる残基を同定することにより、参考文献16および34における指針を用いて突然変異させることができる。

突然変異させることができるさらなる残基としては、限定されるものではないが、例えば、参考文献35で示唆された突然変異を用いる、S23、L24、D30、Q31、R34、D95、および/またはL102が挙げられる。

第1の実施形態のポリペプチドは、配列番号18〜36のいずれかを含んでもよい。同様に、「ΔG」突然変異(すなわち、天然のポリ-Gly配列を含むそれ以下の新生N末端のトランケーション)を考慮に入れて、第1の実施形態のポリペプチドは、そのアミノ酸1〜26を除く、配列番号18〜36のいずれかを含んでもよい。例えば、第1の実施形態のポリペプチドは、配列番号45を含んでもよく、または配列番号58を含んでもよい。

さらなる点突然変異(例えば、親鉄剤および/またはfHとの相互作用を破壊するため)の可能性を考慮すると、第1の実施形態のポリペプチドは、配列番号18〜36のいずれか(または配列番号45などの、そのアミノ酸1〜26を除く配列番号18〜36のいずれか)を含んでもよいが、改変された配列が、宿主動物への投与後に、配列番号46のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができるという条件で、5個までの単一のアミノ酸変化(すなわち、1、2、3、4または5個の単一のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入)により改変することができる。そのようなアミノ酸変化は、野生型配列と比較してこれらの配列中の突然変異を復帰させるべきではない、例えば、配列番号45を、V32またはR123で突然変異させるべきではない。

本発明はまた、v2アミノ酸配列が、突然変異がアラニンに対する置換ではない(例えば、突然変異がアルギニンに対する置換である場合)という条件で、配列番号5のLeu-123に対応するアミノ酸位置での突然変異を除いてv2野生型アミノ酸配列と同一である、fHbp v2アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、配列番号5を含んでもよいが、L123に突然変異(L123A以外)を有してもよい。

配列番号59および60は、v2突然変異体の2つのさらなる例、すなわち、8047株の突然変異体#3および#4の成熟形態である。

配列番号17と比較した突然変異
本発明の第2の実施形態のポリペプチドは、配列番号17に対する少なくともj%の同一性を有する、および/または配列番号17の断片を含む、アミノ酸配列を含む。しかしながら、配列番号17と比較して、このアミノ酸は、アミノ酸残基S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242、および/またはE243の1つ以上において、例えば、これらの17の残基の2、3、4、5個以上において改変を有する。これらの残基は、配列番号17にしたがって番号付けられ、新生野生型配列(配列番号3)と一致させるために、番号付けは+31に変化させるべきであり(すなわち、配列番号17のSer-32は配列番号3のSer-63である)、成熟野生型配列(配列番号40)と一致させるために、番号付けは+12に変化させるべきである。

突然変異のための好ましい残基は、S32、V103、L126、V127、S128、G129、L130、G131、H242、および/またはE243である。このサブセット内で、好ましい残基は、S32、L126、V127、S128、G129、L130、および/またはG131である。最も好ましい位置は、S32、L126、V127、S128、G129、L130、および/またはG131であり、残基S32および/またはL126、例えば、S32VおよびL126Rが特に好ましい。

特定の残基を欠失させてもよいが、好ましくは、それを異なるアミノ酸によって置換する。例えば、Ser-32を、他の19の天然アミノ酸のいずれかによって置換してもよい。置換を行う場合、いくつかの実施形態においては、置き換えアミノ酸は、グリシンまたはアラニンなどの単純なアミノ酸であってもよい。他の実施形態においては、置き換えアミノ酸は、保存的置換である、例えば、それは以下の4群：(1)酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；(2)塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および(4)非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン内で行われる。他の実施形態においては、置換は、非保存的である。いくつかの実施形態においては、置換は、アラニンを用いない。

特定の残基での好ましい置換は、以下の通りである：S32V; I33C; L39C; L41C; F72C; V103T; T116S; F125C; L126R; V127I; S128GまたはS128T; G129D; L130I; G131A; S154C; H242R; E243H。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がE243に置換を含む場合、この置換は、E243のみが突然変異される場合、アラニンとのものでないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、E243およびH242残基が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。理想的には、E243はそのままで突然変異されず、したがって、E243に置換を有するfHbp v3アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に、例えば、E243とH242の両方に置換を含むべきである。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がF125に置換を含む場合、この置換は、F125のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、F125およびS154残基が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。理想的には、F125はそのままで突然変異されず、したがって、F125に置換を有するfHbp v3アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。ジスルフィド架橋の形成を可能にするために、F125が置換される場合、S154もまた置換される、例えば、両方ともシステインで置換されるのが好ましい。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がL126に置換を含む場合、この置換は、L126のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、L126およびS32残基が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。L126がそのままで突然変異される場合、アルギニンとの置換が好ましい。しかしながら、いくつかの実施形態においては、L126はそのままで突然変異されず、したがって、L126に置換を有するfHbp v3アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含んでもよい。L126が置換される場合、(i)S32も置換され、場合により、S128も置換される；または(ii)残基127〜131の1つ以上もまた置換されるのが好ましいことがある。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がV127に置換を含む場合、この置換は、V127のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないのが好ましいが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、残基126〜131の1つ以上も突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。V127がそのままで突然変異される場合、イソロイシンとの置換が好ましい。しかしながら、理想的には、V127はそのままで突然変異されず、したがって、V127に置換を有するfHbp v3アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。V127が置換される場合、残基127〜131の1つ以上もまた、置換されるのが好ましい。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がL130に置換を含む場合、この置換は、L130のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないのが好ましいが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、残基126〜131の1つ以上も突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。L130がそのままで突然変異される場合、イソロイシンとの置換が好ましい。しかしながら、理想的には、L130はそのままで突然変異されず、したがって、L130に置換を有するfHbp v3アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。L130が置換される場合、残基127〜131の1つ以上もまた、置換されるのが好ましい。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がS32に置換を含む場合、この置換は、S32のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないのが好ましいが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、例えば、残基L126とS32が両方とも突然変異される場合、それはアラニンであってもよい。S32がそのままで突然変異される場合、バリンとの置換が好ましい。しかしながら、理想的には、S32はそのままで突然変異されず、したがって、S32に置換を有するfHbp v3アミノ酸配列突然変異体も、第2の残基に置換を含むべきである。S32が置換される場合、(i)L126も置換され、場合により、S128も置換される；または(ii)S128も置換されるのが好ましい。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がT113に置換を含む場合、この置換は、T113のみが突然変異される場合、アラニンとのものではないが、(b)に列挙されるさらなるアミノ酸が置換される場合、それはアラニンであってもよい。T113がそのままで突然変異される場合、セリンとの置換が好ましい。

fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がI33に置換を含む場合、これは、好ましくは、バリンとのものではない。fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がT116に置換を含む場合、これは、好ましくは、イソロイシンとのものではない。fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がG129に置換を含む場合、これは、好ましくは、セリンとのものではない。fHbp v3アミノ酸配列突然変異体がH242とE243の両方に置換を含む場合、これは、好ましくは、R242およびQ243に対するものではない。

2つ以上の置換を行う場合、これらのものは、以下のように、3A〜3Oの群から選択することができる：
3A:残基242および243、
3B:残基32および126、
3C:残基128および129、
3D:残基103、128および129、
3E:残基33および39、
3F:残基41および72、
3G:残基125および154、
3H:残基103、128、129、242および243、
3I:残基32および128、
3J:残基32、126および128、
3K:両方ともCysにより置換された、残基33および39、
3L:両方ともCysにより置換された、残基41および72、
3M:両方ともCysにより置換された、残基125および154、
3N:残基126、127、128、129、130および131、
3O:残基32、126、127、128、129、130および131。

かくして、例えば、残基242を置換しようとする場合、置換のための好ましい第2の残基は、243(すなわち、3A群)である；さらに、残基103、128および129も改変してもよい(すなわち、3A群と3D群の組合せである、3H群)。3A〜3Nおよび3O群内で、特定の位置での好ましい置換は、上記に列挙されたものである。3K、3Lおよび3M群について、意図は、ジスルフィド架橋を導入することである。3A〜3N群内で、好ましい突然変異体は3A、3B、3C、3D、3I、3J、および3Nである。より好ましくは、3C、3I、および3Nであり、3Nが特に好ましい。3B群は、最も好ましい突然変異、特に、S32VおよびL126R(例えば、配列番号44)を提供する。3O群は、3B、3Cおよび3つのさらなる突然変異(例えば、配列番号61を与える)を組み合わせる、別の好ましいセットの突然変異である。突然変異L126Rは単独で配列番号53を提供する。

v3配列中の突然変異について記載されるアミノ酸残基は、M1239株に由来する、配列番号17と比較して番号付けられる。他の任意の株に由来するv3 fHbp中の対応するアミノ酸残基を、配列アラインメントにより容易に同定することができ、例えば、ペアワイズアラインメントアルゴリズム(例えば、以下に詳述される、Needleman-Wunsch全体アラインメントアルゴリズム)を用いて配列番号17と整列された場合、本明細書に記載のアミノ酸と整列するアミノ酸である。アミノ酸は配列番号17に見られるものと同じであることが多いが(例えば、残基32はセリンである)、これが当てはまらない場合、アラインメントは容易に同定する。

安定性を増大させることを目的とする上記の突然変異に加えて、本発明のポリペプチドは、例えば、親鉄剤とのポリペプチドの相互作用を破壊するため、または、より好ましくは、fHに結合するポリペプチドの能力を破壊するための1つ以上のさらなる突然変異を含んでもよい。

参考文献24は、fHとv3 fHbpとの相互作用を、残基Q107、I147、L156、A157、L195、V196、V272、E283、T286、T304、V311、E313およびE283+T304 (二重突然変異)での突然変異により破壊することができると報告している。配列番号17にしたがって番号付けられる場合、これらの残基は、Q35、I78、L87、A88、L126、V127、V202、E213、T216、T234、V241、E243およびE213+T234である。参考文献24で研究された特定の置換はアラニンを用いたものであり(A157EおよびT231Eを除く)、これらの置換は本発明による使用にとって好適である。残基T216およびE243はまた、参考文献23にも報告されている。参考文献36は、fHとv3 fHbpとの相互作用を、残基H288およびG318(配列番号17にしたがって番号付けられたH218およびG248)での突然変異により破壊することができると報告しており、これらの置換、例えば、H218R、G248Dは、本発明による使用による使用にとって好適である。

参考文献24は、v3におけるある特定の置換がfHに対する親和性を増大させることができ、意図がfHへの結合を破壊するためのものである、例えば、配列番号17中のP44(参考文献24中の残基106)である場合、これらのものを避けるべきである。

親鉄剤と相互作用する残基を、例えば、本明細書における配列番号17を、参考文献16の配列番号4と整列させて、親鉄剤、例えば、カテコレート、ヒドロキサメートまたはカルボキシレートと相互作用することができる残基を同定することにより、参考文献16および34における指針を用いて突然変異させることができる。

第2の実施形態のポリペプチドは、配列番号41〜44のいずれかを含んでもよい。さらなる点突然変異(例えば、親鉄剤および/またはfHとの相互作用を破壊するため)の可能性を考慮すると、第1の実施形態のポリペプチドは、配列番号41〜44のいずれかを含んでもよいが、改変された配列が、宿主動物への投与後に、配列番号40のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができるという条件で、5個までの単一のアミノ酸変化(すなわち、1、2、3、4または5個の単一のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入)により改変することができる。そのようなアミノ酸変化は、野生型配列と比較してこれらの配列中の突然変異を復帰させるべきではない、例えば、配列番号44を、V32またはR126で突然変異させるべきではない。

本発明はまた、fHbp v3アミノ酸配列が、突然変異がアラニンに対する置換ではない(例えば、突然変異がアルギニンに対する置換である場合)という条件で、配列番号17のLeu-126に対応するアミノ酸位置での突然変異を除いてv3野生型アミノ酸配列と同一である、fHbp v3アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、配列番号17を含んでもよいが、L126に突然変異(L126A以外)を有してもよい。

ポリペプチド
本発明のポリペプチドを、様々な手段により、例えば、化学的合成により(少なくとも部分的に)、プロテアーゼを用いてより長いポリペプチドを消化することにより、RNAからの翻訳により、細胞培養物から (例えば、組換え発現または髄膜炎菌培養物から)の精製などにより調製することができる。大腸菌宿主中での異種発現が、好ましい発現経路である。

本発明のポリペプチドは、理想的には少なくとも100アミノ酸長、例えば、150aa、175aa、200aa、225aa、またはそれ以上である。それらは、fHbp v2および/またはv3アミノ酸配列突然変異体を含み、fHbp v2またはv3アミノ酸配列突然変異体は同様に少なくとも100アミノ酸長、例えば、150aa、175aa、200aa、225aa、またはそれ以上であるべきである。

fHbpは、髄膜炎菌中では天然にリポタンパク質である。それはまた、大腸菌中で発現される場合は脂質化されることもわかっており、その天然のリーダー配列または異種リーダー配列を含む。本発明のポリペプチドは、例えば、通常はトリパルミトイル-S-グリセリル-システインを形成する、パルミトイル基を含む、脂質化されていてもよい、N末端システイン残基を有してもよい。他の実施形態においては、ポリペプチドは脂質化されていない。

ポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な、または実質的に単離された形態で調製される(すなわち、他のナイセリア菌または宿主細胞ポリペプチドを実質的に含まない)。一般に、ポリペプチドは、非天然の環境中で提供される、例えば、それらはその天然の環境から分離される。ある特定の実施形態においては、ポリペプチドは、出発材料と比較してポリペプチドについて富化された組成物中に存在する。かくして、精製されたポリペプチドが提供され、それにより、精製されたとは、ポリペプチドが他の発現されたポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、それにより、実質的に含まないとは、組成物中の全ポリペプチドの50%を超えるもの(例えば、75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、または99%以上)が本発明のポリペプチドであることを意味する。

ポリペプチドは、様々な形態(例えば、天然、融合物、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、ジスルフィド架橋など)を取ってもよい。

配列番号4、5、17および40は、N末端メチオニンを含まない。本発明のポリペプチドが生物宿主中での翻訳により産生される場合、多くの宿主においてN末端メチオニンを提供する、開始コドンが必要である。かくして、本発明のポリペプチドは、少なくとも新生段階で、前記配列番号の配列の上流にメチオニン残基を含む。

新生配列の切断は、fHbp v2またはv3アミノ酸配列突然変異体がそれ自身で、ポリペプチドのN末端を提供し得ることを意味する。しかしながら、他の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、fHbp v2またはv3アミノ酸配列突然変異体の上流にN末端配列を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、N末端に単一のメチオニン、その直後に、fHbp v2またはv3アミノ酸配列突然変異体を有する；他の実施形態においては、より長い上流配列を用いることができる。そのような上流配列は、短くてもよい(例えば、40個以下のアミノ酸、すなわち、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例としては、タンパク質輸送を指令するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列(例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、His_n(ここで、n=4、5、6、7、8、9、10以上である))が挙げられる。他の好適なN末端アミノ酸配列は、当業者には明らかであり、例えば、配列番号2または配列番号3中に存在する天然の上流配列がある。

本発明のポリペプチドはまた、fHbp v2またはv3アミノ酸配列突然変異体の最後のアミノ酸の下流にアミノ酸を含んでもよい。そのようなC末端伸長物は、短くてもよい(例えば、40個以下のアミノ酸、すなわち、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個)。例としては、タンパク質輸送を指令する配列、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列(例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、His_n(ここで、n=4、5、6、7、8、9、10以上である)を含む)が挙げられる。他の好適なC末端アミノ酸配列は、当業者には明らかである。

いくつかの実施形態においては、本発明は、C末端に、ヒスチジンタグ(参考文献24および25を参照)、特に、ヘキサヒスチジンタグを含むポリペプチドを排除する。

用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、線状または分枝状であってもよく、それは改変されたアミノ酸を含んでもよく、それは非アミノ酸により中断されていてもよい。この用語はまた、天然に、または介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、または標識化成分とのコンジュゲーションなどの、任意の他の操作もしくは改変により改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体(例えば、非天然アミノ酸などを含む)、ならびに当業界で公知の他の改変を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは、単一の鎖または会合した鎖として存在してもよい。

本発明のポリペプチドを、固相支持体に結合させるか、または固定することができる。

本発明のポリペプチドは、検出可能な標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識を含んでもよい。これは、特に、イムノアッセイ技術において有用である。

参考文献164に開示されたように、fHbpは、A、BおよびCと呼ばれる3つのドメインに分割することができる。配列番号1を取ると、3つのドメインは、(A)1〜119、(B)120〜183および(C)184〜274：

である。

そのN末端のCys-20からLys-119までの成熟形態のドメイン「A」は、「A_成熟」と呼ばれる。

複数のfHbp配列が公知であり、これらのものを標準的な方法を用いて容易に整列させることができる。そのようなアラインメントにより、当業者であれば、(a)MC58配列中の座標との比較により任意の所与のfHbp配列中のドメイン「A」(および「A_成熟」)、「B」および「C」、ならびに(b)例えば、置換を同定するための、複数のfHbp配列中の単一の残基を同定することができる。しかしながら、参照を容易にするために、ドメインは以下のように定義される。

- 所与のfHbp配列中のドメイン「A」は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号1と整列させた場合、配列番号1のMet-1と整列されたアミノ酸から始まり、配列番号1のLys-119と整列されたアミノ酸で終わる、その配列の断片である。

- 所与のfHbp配列中のドメイン「A_成熟」は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号1と整列させた場合、配列番号1のCys-20と整列されたアミノ酸から始まり、配列番号1のLys-119と整列されたアミノ酸で終わる、その配列の断片である。

- 所与のfHbp配列中のドメイン「B」は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号1と整列させた場合、配列番号1のGln-120と整列されたアミノ酸から始まり、配列番号1のGly-183と整列されたアミノ酸で終わる、その配列の断片である。

- 所与のfHbp配列中のドメイン「C」は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号1と整列させた場合、配列番号1のLys-184と整列されたアミノ酸から始まり、配列番号1のGln-274と整列されたアミノ酸で終わる、その配列の断片である。

ドメインを定義するための好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ(例えば、EBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる、ギャップオープニングペナルティ=10.0、ギャップ伸長ペナルティ=0.5を用いる)を用いる、Needleman-Wunsch全体アラインメントアルゴリズム[158]である。このアルゴリズムは、EMBOSSパッケージ中のneedleツール中に都合よく実装される[159]。

いくつかの実施形態においては、本発明のfHbp v2またはv3アミノ酸配列突然変異体は、そのドメインAを除去するためにトランケートされる。しかしながら、一般に、fHbp v2またはv3アミノ酸配列突然変異体は、N末端β-バレルとC末端β-バレルの両方を含むことが好ましい。

いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、N末端の最大10個のアミノ酸(すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個)および/またはC末端の最大10個のアミノ酸(すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個)が欠失されていることを除いて、上記のアミノ酸配列を含む。

本発明のポリペプチドは、典型的には、人工のアミノ酸配列、すなわち、任意の天然の髄膜炎菌中には存在しない配列からなる。

H因子に対する親和性を、例えば、固定されたfHと共に、参考文献18および21〜24に開示された表面プラズモン共鳴を用いて定量的に評価することができる。少なくとも10倍、理想的には少なくとも100倍の親和性低下(すなわち、解離定数K_Dの増大)を提供する突然変異が好ましい(同じポリペプチドであるが、突然変異を有さないものと比較して同じ実験条件下で測定された場合)。

核酸
本発明は、上記に定義される本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。

本発明の核酸を、多くの方法で、例えば、全体的または部分的な化学的合成(例えば、DNAのホスホラミダイト合成)により、ヌクレアーゼ(例えば、制限酵素)を用いてより長い核酸を消化することにより、より短い核酸またはヌクレオチドを連結することにより(例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを用いる)、ゲノムまたはcＤＮＡライブラリーからなどにより調製することができる。

本発明の核酸は、様々な形態、例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識された、標識されていない形態などを取ってもよい。

本発明の核酸は、好ましくは、単離された、または実質的に単離された形態にある。

用語「核酸」は、DNAおよびRNA、ならびにまた、改変骨格を含有するもの、およびまたペプチド核酸(PNA)などのその類似体を含む。

本発明による核酸を、例えば、放射性または蛍光標識で標識することができる。

本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター(プラスミドなど)(例えば、核酸免疫化にとって好適なものなどのクローニングまたは発現ベクター)ならびにそのようなベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。

殺菌応答
本発明の好ましいポリペプチドは、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。殺菌抗体応答は、マウスにおいて都合よく測定され、ワクチン効能の標準的な指標である(例えば、参考文献37の巻末の注14；また、参考文献38も参照されたい)。

本発明の第1の実施形態のポリペプチドは、好ましくは、v2 fHBp配列を発現する髄膜炎菌株、例えば、株961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013 (=M01-240013)、e32、m1090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、c11、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38、および/またはL93/4286のうちの1つ以上に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。殺菌応答は、例えば、var2株M2091(ATCC 13091)に対して評価することができる。

本発明の第1の実施形態の好ましいポリペプチドは、血清殺菌アッセイにおいてM2091株に対して殺菌性であるマウスにおいて抗体を惹起することができる。

本発明の第2の実施形態のポリペプチドは、好ましくは、v3 fHbp配列を発現する髄膜炎菌株、例えば、株M1239、16889、gb355 (=M01-240355)、m3369、m3813、ngp165のうちの1つ以上に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。殺菌応答は、例えば、完全に配列決定されたナイセリア菌MLST参照株(参考文献39におけるid 19265)である、var3株M01-240355に対して評価することができる(EMBL ID CP002422[40]を参照されたい)。

本発明の第2の実施形態の好ましいポリペプチドは、血清殺菌アッセイにおいてM01-240355株に対して殺菌性であるマウスにおいて抗体を惹起することができる。

例えば、これらのポリペプチドを含む免疫原性組成物は、ヒト補体を用いるGoldschneiderアッセイ[41〜43]を用いた場合、1:4以上の血清殺菌力価を提供し、および/または子ウサギ補体を用いた場合、1:128以上の血清殺菌力価を提供することができる。

免疫化
本発明のポリペプチドを、免疫原性組成物の活性成分として用いることができ、したがって、本発明は、本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)を提供する。

本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において抗体応答を生じさせる方法も提供する。抗体応答は、好ましくは、防御および/または殺菌性抗体応答である。本発明はまた、そのような方法における使用のための本発明のポリペプチドも提供する。

本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、ナイセリア菌(例えば、髄膜炎菌)感染に対して哺乳動物を防御するための方法も提供する。

本発明は、薬剤(例えば、免疫原性組成物もしくはワクチン)として、または診断試薬としての使用のための本発明のポリペプチドを提供する。本発明はまた、哺乳動物におけるナイセリア菌(例えば、髄膜炎菌)感染を防止するための薬剤の製造における、本発明の核酸またはポリペプチドの使用も提供する。

哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。ヒトは、成人、または好ましくは、小児であってもよい。ワクチンが予防的使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくは小児(例えば、幼児または乳児）である；ワクチンが治療的使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくは成人である。小児用を意図するワクチンを、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するために、成人に投与してもよい。

前記使用および方法は、限定されるものではないが、髄膜炎(特に、髄膜炎菌性髄膜炎などの細菌性髄膜炎)および菌血症などの疾患を防止/処置するのに特に有用である。例えば、それらは髄膜炎菌(例えば、血清群B)により引き起こされる侵襲性髄膜炎菌疾患に対する個体の能動免疫化にとって好適である。

治療的処置の有効性を、本発明の組成物の投与後にナイセリア菌感染をモニタリングすることにより試験することができる。予防的処置の有効性を、組成物の投与後にfHbpに対する免疫応答をモニタリングすることにより試験することができる。本発明の組成物の免疫原性を、それらを被験体(例えば、12〜16ヶ月齢の小児、または動物モデル)に投与した後、血清殺菌抗体(SBA)およびELISA力価(GMT)を含む標準的なパラメータを決定することにより、決定することができる。これらの免疫応答は一般に、組成物の投与の約4週間後に決定し、組成物の投与前に決定された値と比較する。少なくとも4倍または8倍のSBAの増加が好ましい。2以上の用量の組成物が投与される場合、2回以上の投与後の決定を行ってもよい。

本発明の好ましい組成物は、許容されるパーセンテージのヒト被験者にとってそれぞれの抗原性成分に対する血清保護のための基準より優れている患者における抗体力価を提供することができる。宿主が抗原に対して血清転換されると考えられるものより上の関連抗体力価を有する抗原は周知であり、そのような力価はWHOのような組織により公開されている。好ましくは、80%を超える、より好ましくは、90%を超える、さらにより好ましくは、93%を超える、最も好ましくは、96〜100%の、被験体の統計的に有意な試料が血清転換される。

本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接的送達を、非経口注射(例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間質腔への)により、または直腸、経口、経膣、局所、経皮、鼻内、眼内、経耳、経肺、もしくは他の粘膜投与により達成することができる。大腿部または上腕部への筋肉内投与が好ましい。注射は、針(例えば、皮下注射針)によるものであってよいが、あるいは無針注射を用いてもよい。典型的な筋肉内用量は、約0.5mlである。

本発明を用いて、全身および/または粘膜免疫を惹起することができる。

用量処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであってもよい。複数用量を、初回免疫化スケジュールおよび/または追加免疫化スケジュールにおいて用いることができる。初回用量スケジュールの後、追加用量スケジュールを行ってもよい。初回用量間 (例えば、4〜16週間)、および初回と追加の間の好適なタイミングを、日常的に決定することができる。

本発明の免疫原性組成物は、一般に、それ自身では組成物を受ける患者に対して有害な抗体の産生を誘導せず、過度の毒性なしに投与することができる任意の物質であってもよい、製薬上許容し得る担体を含む。製薬上許容し得る担体は、水、塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含んでもよい。湿潤剤または乳化剤などの補助物質、ｐH緩衝物質などが、そのようなビヒクル中に存在してもよい。好適な担体の完全な考察は、参考文献44で利用可能である。

ナイセリア菌感染は、身体の様々な領域に影響し、したがって、本発明の組成物を様々な形態で調製することができる。例えば、組成物を、液体溶液または懸濁液として、注射可能なものとして調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の溶液、または懸濁液にとって好適な固体形態を調製することもできる。組成物を、局所投与のために、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として調製することができる。組成物を、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（必要に応じて、風味を付ける)として調製することができる。組成物を、経肺投与のために、例えば、細末またはスプレーを用いる、吸入剤として調製することができる。組成物を、座剤またはペッサリーとして調製することができる。組成物を、経鼻、経耳または眼内投与のために、例えば、滴下剤として調製することができる。非経口注射にとって好適な組成物が最も好ましい。

組成物は、好ましくは無菌性である。それは、好ましくは、発熱源を含まない。それは、好ましくは、例えば、pH6〜pH8、一般には、約pH7で緩衝化される。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジンバッファーを用いるのが好ましい[45]。本発明の組成物は、ヒトに関して等張性であってもよい。

免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の免疫原、ならびに必要に応じて、他の任意の特定成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単回用量での、または連続用量の一部としての、個体へのその量の投与が、処置または防止にとって有効であることを意味する。用語「防止」とは、疾患の進行が減少する、および/もしくは除去されること、または疾患の開始が除去されることを意味する。例えば、被験体の免疫系をプライミング(例えば、ワクチン接種による)して、免疫応答を誘発し、疾患の開始が除去されるように感染を撃退することができる。ワクチン接種された被験体は、かくして、感染してもよいが、対照被験体よりも感染を良好に撃退することができる。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望ましい防御の程度、ワクチンの製剤、医学的状況の処置する医師による評価、ならびに他の関連する因子に応じて変化する。その量は、比較的広範囲にあると予想され、日常的な治験により決定することができる。用量処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュール(例えば、追加用量を含む)であってもよい。組成物を、他の免疫調節剤と一緒に投与してもよい。

本発明の組成物において用いることができるアジュバントとしては、限定されるものではないが、不溶性金属塩、水中油乳濁液(例えば、MF59もしくはAS03、両方ともスクアレンを含有する)、サポニン、LPSの非毒性誘導体(モノホスホリルリピドAもしくは3-O-脱アシル化MPLなど)、免疫刺激オリゴヌクレオチド、解毒された細菌ADP-リボシル化毒素、微粒子、リポソーム、イミダゾキノロン、またはその混合物が挙げられる。免疫刺激剤として作用する他の物質は、参考文献46の第7章に開示されている。

水酸化アルミニウムおよび/またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、ポリペプチドは一般に、これらの塩に吸着される。これらの塩としては、オキシ水酸化物およびヒドロキシホスフェートが挙げられる(例えば、参考文献46の第8章および第9章を参照されたい)。塩は、任意の好適な形態(例えば、ゲル、結晶、非結晶質など)を取ってもよい。

さらなる抗原性成分
本発明の組成物は、v2および/またはv3 fHbp配列突然変異体を含む。組成物が抗原の複合体または未定義の混合物を含むべきではない場合、例えば、組成物中に外膜ベシクルを含まないことが好ましい場合、それは有用である。本発明のポリペプチドを、好ましくは、異種宿主中で組換え発現した後、精製するのが好ましい。

fHbpポリペプチドを含むのと同様、本発明の組成物は、細菌あたり2つ以上の免疫原を標的とするワクチンとして、エスケープ変異体を選択する可能性を低下させる1つ以上のさらなるナイセリア菌免疫原を含んでもよい。かくして、組成物は、哺乳動物に投与した場合、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起する第2のポリペプチドを含んでもよい。第2のポリペプチドは、髄膜炎菌fHbpであってよいが、fHbpではないことが多い、例えば、それはNHBA配列、NadA配列などであってもよい。

任意のそのようなナイセリア菌免疫原は、本発明のv2もしくはv3 fHbp突然変異体とは別のポリペプチドとして存在してもよく、または改変型fHbpとの融合ポリペプチドとして存在してもよい。例えば、髄膜炎菌936ポリペプチドおよびfHbpポリペプチドの融合物が公知である[55、56]。必要に応じて、配列番号44および/または配列番号45が、本明細書の他の場所に記載されるように最大5個の単一のアミノ酸変化(すなわち、1、2、3、4または5個の単一のアミノ酸置換、欠失および/または挿入)により改変された、配列番号44および/または配列番号45を含む融合タンパク質が特に好ましい。

本発明の組成物は、NHBA抗原を含んでもよい。NHBA抗原は、NMB2132(GenBank受託番号GI:7227388; 本明細書では配列番号6)として、髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。多くの株に由来するNHBA抗原の配列がそれ以来公開されている。例えば、NHBAの対立遺伝子形態を、参考文献48の図5および図15、ならびに参考文献1の例13および図21(そこでは配列番号3179〜3184)に見出すことができる。NHBA抗原の様々な免疫原性断片も報告されている。本発明と共に使用するための好ましい287種の抗原は、(a)配列番号6に対する50%以上の同一性(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上)を有する；および/または(b)配列番号6の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸(ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である)の断片を含む、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号6に由来するエピトープを含む。本発明の最も有用なNHBA抗原は、被験体への投与後に、配列番号6のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明と共に使用するための有利なNHBA抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。

本発明の組成物は、NadA抗原を含んでもよい。NadA抗原は、NMB1994遺伝子(GenBank受託番号GI:7227256；本明細書では配列番号7)として髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。多くの株に由来するNadA抗原の配列が、それ以来公開されており、ナイセリア菌アドヘシンとしてのタンパク質の活性が文書で十分に立証されている。NadAの様々な免疫原性断片も報告されている。本発明と共に使用するための好ましいNadA抗原は、(a)配列番号7に対する50%以上の同一性(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上)を有する；および/または(b)配列番号7の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸(ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である)の断片を含む、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号7に由来するエピトープを含む。本発明の最も有用なNadA抗原は、被験体への投与後に、配列番号7のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明と共に使用するための有利なNadA抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。配列番号15は1つのそのような断片である。

本発明の組成物は、NspA抗原を含んでもよい。NspA抗原は、NMB0663遺伝子(GenBank受託番号GI:7225888；本明細書では配列番号8)として髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。この抗原は参考文献49および50から以前に公知であった。多くの株に由来するNspA抗原の配列が、それ以来公開されている。NspAの様々な免疫原性断片も報告されている。本発明と共に使用するための好ましいNspA抗原は、(a)配列番号8に対する50%以上の同一性(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上)を有する；および/または(b)配列番号8の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸(ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である)の断片を含む、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号8に由来するエピトープを含む。本発明の最も有用なNspA抗原は、被験体への投与後に、配列番号8のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明と共に使用するための有利なNspA抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。

本発明の組成物は、髄膜炎菌HmbR抗原を含んでもよい。完全長HmbR配列は、NMB1668遺伝子(本明細書では配列番号9)として髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。本発明は完全長HmbR配列を含むポリペプチドを用いてもよいが、部分的HmbR配列を含むポリペプチドを用いることが多い。かくして、いくつかの実施形態においては、本発明にしたがって用いられるHmbR配列は、配列番号9に対して少なくともi%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、iの値は、50、60、70、80、90、95、99以上である。他の実施形態においては、本発明にしたがって用いられるHmbR配列は、配列番号9に由来する少なくともj個の連続するアミノ酸の断片を含んでもよく、ここで、jの値は、7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上である。他の実施形態においては、本発明にしたがって用いられるHmbR配列は、(i)配列番号9に対して少なくともi%の配列同一性を有する、および/または(ii)配列番号9に由来する少なくともj個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでもよい。j個のアミノ酸の好ましい断片は、配列番号9に由来するエピトープを含む。そのようなエピトープは通常、HmbRの表面上に位置するアミノ酸を含む。有用なエピトープは、これらのエピトープに結合する抗体は宿主ヘモグロビンに結合する細菌の能力を遮断することができるため、ヘモグロビンへのHmbRの結合に関与するアミノ酸を有するものを含む。HmbRのトポロジー、およびその重要な機能的残基は、参考文献51で精査された。本発明の最も有用なHmbR抗原は、被験体への投与後に、配列番号9のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明と共に使用するための有利なHmbR抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。

本発明の組成物は、NhhA抗原を含んでもよい。NhhA抗原は、NMB0992遺伝子(GenBank受託番号GI:7226232；本明細書では配列番号10)として髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。多くの株に由来するNhhA抗原の配列が、例えば、参考文献48および52以来公開されており、NhhAの様々な免疫原性断片も報告されている。それは、Hsfとしても公知である。本発明と共に使用するための好ましいNhhA抗原は、(a)配列番号10に対する50%以上の同一性(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上)を有する；および/または(b)配列番号10の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸(ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である)の断片を含む、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号10に由来するエピトープを含む。本発明の最も有用なNhhA抗原は、被験体への投与後に、配列番号10のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明と共に使用するための有利なNhhA抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。

本発明の組成物は、App抗原を含んでもよい。App抗原は、NMB1985遺伝子(GenBank受託番号GI:7227246；本明細書では配列番号11)として髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。多くの株に由来するApp抗原の配列が、それ以来公開されている。Appの様々な免疫原性断片も報告されている。本発明と共に使用するための好ましいApp抗原は、(a)配列番号11に対する50%以上の同一性(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上)を有する；および/または(b)配列番号11の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸(ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である)の断片を含む、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号11に由来するエピトープを含む。本発明の最も有用なApp抗原は、被験体への投与後に、配列番号11のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明と共に使用するための有利なApp抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。

本発明の組成物は、Omp85抗原を含んでもよい。Omp85抗原は、NMB0182遺伝子(GenBank受託番号GI:7225401；本明細書では配列番号12)として髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。多くの株に由来するOmp85抗原の配列が、それ以来公開されている。Omp85に関するさらなる情報を、参考文献53および54に見出すことができる。Omp85の様々な免疫原性断片も報告されている。本発明と共に使用するための好ましいOmp85抗原は、(a)配列番号12に対する50%以上の同一性(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上)を有する；および/または(b)配列番号12の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸(ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である)の断片を含む、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号12に由来するエピトープを含む。本発明の最も有用なOmp85抗原は、被験体への投与後に、配列番号12のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明と共に使用するための有利なOmp85抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。

本発明の組成物は、936抗原を含んでもよい。936抗原は、NMB2091遺伝子(本明細書では配列番号13)として髄膜炎菌血清群B株MC58[47]の公開されたゲノム配列中に含まれていた。本発明と共に使用するための好ましい936抗原は、(a)配列番号13に対する50%以上の同一性(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上)を有する；および/または(b)配列番号13の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸(ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である)の断片を含む、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号13に由来するエピトープを含む。本発明の最も有用な936抗原は、被験体への投与後に、配列番号13のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。936抗原は、fHbpのための良好な融合パートナーである(例えば、参考文献55および56を参照されたい)。

組成物は、配列番号14を含むポリペプチド；配列番号15を含むポリペプチド；およびfHbp v2アミノ酸配列突然変異体と配列番号13とを含む本発明のポリペプチドを含んでもよい(参考文献55および56を参照されたい)。

組成物は、配列番号14を含むポリペプチド；配列番号15を含むポリペプチド；およびfHbp v3アミノ酸配列突然変異体と配列番号13とを含む本発明のポリペプチドを含んでもよい(参考文献55および56を参照されたい)。

いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドを、さらなる髄膜炎菌fHbp配列と組み合わせる。特に、v2ポリペプチドを、v1および/またはv3ポリペプチドと組み合わせて、株包含率の範囲を増大させることができる[162]。かくして、組成物は、(i)fHbp v2アミノ酸配列突然変異体を含む本発明のポリペプチド；ならびに(ii)v1 fHbpポリペプチドおよび/またはv3 fHbpポリペプチドを含んでもよい。他の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、(i)fHbp v2アミノ酸配列突然変異体ならびに（ii)v1 fHbpアミノ酸配列および/またはv3 fHbpアミノ酸配列を含んでもよい。かくして、v1および/またはv3配列を、組成物中で、または融合ポリペプチド内で、別々の実体としてv2配列突然変異体と組み合わせることができる。

同様に、v3ポリペプチドを、v1および/またはv2ポリペプチドと組み合わせて、株包含率の範囲を増大させることができる[162]。かくして、組成物は、(i)fHbp v3アミノ酸配列突然変異体を含む本発明のポリペプチド；ならびに(ii)v1 fHbpポリペプチドおよび/またはv2 fHbpポリペプチドを含んでもよい。他の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、(i)fHbp v3アミノ酸配列突然変異体ならびに（ii)v1 fHbpアミノ酸配列および/またはv2 fHbpアミノ酸配列を含んでもよい。かくして、v1および/またはv2配列を、組成物中で、または融合ポリペプチド内で、別々の実体としてv3配列突然変異体と組み合わせることができる。

さらに、v2およびv3ポリペプチド突然変異体を、互いに組み合わせて、株包含率を増大させることができる。かくして、組成物は、(i)fHbp v2アミノ酸配列突然変異体を含む本発明のポリペプチド；(ii)fHbp v3アミノ酸配列突然変異体を含む本発明のポリペプチド；および(iii)fHbp v1ポリペプチドを含んでもよい。他の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、(i)fHbp v2アミノ酸配列突然変異体；(ii)v3 fHbpアミノ酸配列突然変異体；および(iii)fHbp v1アミノ酸配列を含んでもよい。かくして、v2およびv3配列突然変異体を、組成物中で、または融合ポリペプチド内で、別々の実体としてv1配列と組み合わせることができる。v1配列は、野生型配列または突然変異配列であってもよい。

v1 fHbpは、(a)配列番号16に対して少なくともk%の同一性を有するアミノ酸配列、および/または(b)配列番号16の断片を含んでもよい。「k」および断片に関する情報は、上に与えられている。断片は、典型的には、配列番号16に由来する少なくとも1つのエピトープを含み、v1 fHbpポリペプチドは本発明のv2またはv3アミノ酸配列中には存在しない少なくとも1つのエピトープを含み、v1 fHbpにより惹起された抗体はv1株を認識することができる。理想的には、v1 fHbpは、v1株、例えば、MC58株(「BAA-335」としてATCCから入手可能)に対して殺菌性である抗体を惹起することができる。v1 fHbpは、fHに結合するその能力を破壊するアミノ酸突然変異を含んでもよい。

v2 fHbpは、(a)配列番号5に対して少なくともk%の同一性を有するアミノ酸配列、および/または(b)配列番号5の断片を含んでもよい。「k」および断片に関する情報は、上に与えられている。断片は、典型的には、配列番号5に由来する少なくとも1つのエピトープを含み、v2 fHbpポリペプチドは本発明のv3アミノ酸配列中には存在しない少なくとも1つのエピトープを含み、v2 fHbpにより惹起された抗体はv2株を認識することができる。理想的には、v2 fHbpは、v2株、例えば、M2091株(ATCC13091)に対して殺菌性である抗体を惹起することができる。v2 fHbpは、第1の実施形態のポリペプチドであってもよい。

v3 fHbpは、(a)配列番号17に対して少なくともk%の同一性を有するアミノ酸配列、および/または(b)配列番号17の断片を含んでもよい。「k」および断片に関する情報は、上に与えられている。断片は、典型的には、配列番号17に由来する少なくとも1つのエピトープを含み、v3 fHbpポリペプチドは本発明のv2アミノ酸配列中には存在しない少なくとも1つのエピトープを含み、v3 fHbpにより惹起された抗体はv3株を認識することができる。理想的には、v3 fHbpは、v3株、例えば、M01-240355に対して殺菌性である抗体を惹起することができる。v3 fHbpは、第2の実施形態のポリペプチドであってもよい。

かくして、例えば、本発明は、単一のポリペプチド鎖内に、(i)fHbp v1アミノ酸配列；(ii)fHbp v2アミノ酸配列突然変異体；および(iii)fHbp v3アミノ酸配列突然変異体のそれぞれを含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、宿主動物への投与後に、配列番号46のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチド；配列番号4のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチド；および配列番号40のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチドのそれぞれに結合する抗体を惹起することができる。(i)の配列は、配列番号16に対して少なくともk%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。(ii)の配列は、配列番号5に対して少なくともk%の同一性を有するが、以下の残基：S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239、および/またはE240の1つ以上において配列番号5とは異なるアミノ酸配列を含んでもよい。(iii)の配列は、配列番号17に対して少なくともk%の同一性を有するが、以下の残基：S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242、および/またはE243の1つ以上において配列番号17とは異なるアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態においては、(i)の配列は、必要に応じて、最大5個の単一アミノ酸変化(すなわち、1、2、3、4または5個の単一アミノ酸置換、欠失および/または挿入)により改変された、配列番号16を含む；(ii)の配列は、必要に応じて、最大5個の単一アミノ酸変化(すなわち、1、2、3、4または5個の単一アミノ酸置換、欠失および/または挿入)により改変された、配列番号45を含むが、ただし、そのようなアミノ酸変化は、野生型配列と比較してこれらの配列中の突然変異を復帰させない；ならびに(iii)の配列は、必要に応じて、最大5個の単一アミノ酸変化(すなわち、例えば、配列番号53を与える、1、2、3、4または5個の単一アミノ酸置換、欠失および/または挿入)により改変された、配列番号44を含むが、ただし、そのようなアミノ酸変化は、野生型配列と比較してこれらの配列中の突然変異を復帰させない。アミノ酸配列(i)、(ii)および(iii)を、任意の順序でポリペプチド中のN末端からC末端に向かって配置することができるが、好ましくは、その順序は、(ii)、次いで(iii)、次いで(i)である。例えば、本発明は、式-A-B-C-(式中、Aは、必要に応じて、最大3個の単一アミノ酸置換により改変された配列番号45を含み；Bは、必要に応じて、最大3個の単一アミノ酸置換により改変された配列番号44を含み；およびCは、必要に応じて、最大3個の単一アミノ酸置換により改変された配列番号16を含む)のポリペプチドを提供する(例えば、fHへの結合を破壊するための置換)。好ましいCは、Arg-34残基が参考文献21中の「R41S」について報告されたようにSerに突然変異された、配列番号49を含む。

特に好ましいポリペプチドは、配列番号47のアミノ酸配列を含む。この配列は、N末端からC末端に向かって、v2突然変異体(配列番号45)；v3突然変異体(配列番号44)；およびv1突然変異体(配列番号49)を含む。これらの3つのfHbp配列突然変異体の間に、それぞれリンカー配列、配列番号50が存在する。一実施形態においては、ポリペプチドは、N末端メチオニンを有する配列番号48のアミノ酸配列、次いで、配列番号37、次いで、配列番号47を含む。

必要に応じて、配列番号47(単独で、または配列番号48内)を、最大5個の単一アミノ酸変化(すなわち、1、2、3、4または5個の単一アミノ酸置換、欠失および/または挿入)により改変することができるが、ただし、そのようなアミノ酸変化は、野生型配列と比較してv1、v2、およびv3配列中の突然変異を復帰させない、すなわち、配列番号47のアミノ酸残基V32、R123、V285、R379、およびS543を、S32、L123、S285、L379、およびR543に突然変異させるべきではない。しかしながら、1つの例外的な実施形態においては、V285はS285に復帰させてもよく、および/またはV32はS32に復帰させてもよい。

突然変異融合物は、理想的には、配列番号46のアミノ酸配列からなる野生型v1髄膜炎菌fHbpポリペプチド；配列番号4のアミノ酸配列からなる野生型v2髄膜炎菌fHbpポリペプチド；および配列番号40のアミノ酸配列からなる野生型v3髄膜炎菌fHbpポリペプチドのそれぞれに結合する抗体を惹起することができる。

ナイセリア菌ポリペプチド抗原に加えて、組成物は、他の疾患または感染に対して免疫化するための抗原を含んでもよい。例えば、組成物は、以下のさらなる抗原：
- 血清群Cに由来する参考文献57(参考文献58も参照されたい)または参考文献59に開示された糖などの、髄膜炎菌血清群A、C、W135および/またはYに由来する糖抗原、
- 肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来する糖抗原[例えば、60、61、62]、
- 不活化ウイルスなどの、A型肝炎ウイルスに由来する抗原[例えば、63、64]、
- 表面抗原および/またはコア抗原などの、B型肝炎ウイルスに由来する抗原[例えば、64、65]、
- ジフテリアトキソイド[例えば、参考文献66の第3章]などのジフテリア抗原、例えば、CRM₁₉₇突然変異体[例えば、67]、
- 破傷風トキソイドなどの、破傷風抗原(例えば、参考文献66の第4章)、
- 場合により、ペルタクチンならびに/またはアグルチノゲン2および3とも組み合わせた、百日咳菌(Bordetella pertussis)に由来する百日咳ホロ毒素(PT)および線維性ヘマグルチニン(FHA)などの百日咳菌に由来する抗原(例えば、参考文献68および69)、
- インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)Bに由来する糖抗原[例えば、58]、
- IPVなどのポリオ抗原[例えば、70、71]、
- 麻疹、おたふく風邪および/または風疹抗原(例えば、参考文献66の第9、10および11章)、
- ヘマグルチニンおよび/またはノイラミニダーゼ表面タンパク質などの、インフルエンザ抗原(例えば、参考文献66の第19章)、
- モラクセラ・カタラリス(Moraxella catarrhalis)に由来する抗原[例えば、72]、
- ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)(B群連鎖球菌)に由来するタンパク質抗原[例えば、73、74]、
- ストレプトコッカス・アガラクチエ(B群連鎖球菌)に由来する糖抗原、
- 化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)(A群連鎖球菌)に由来する抗原[例えば、74、75、76]、
- 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に由来する抗原[例えば、77]
のうちの1つ以上を含んでもよい。

組成物は、これらのさらなる抗原の1つ以上を含んでもよい。

毒性タンパク質抗原を、必要に応じて解毒してもよい(例えば、化学的および/または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒[69])。

ジフテリア抗原が組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含むことが好ましい。かくして、DTPの組合せが好ましい。

糖抗原は、好ましくは、コンジュゲートの形態にある。コンジュゲートのための担体タンパク質は、以下でより詳細に考察される。

組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも1μg/mlの濃度で存在する。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を惹起するのに十分なものである。

本発明の免疫原性組成物を、治療的に(すなわち、存在する感染を処置するため)、または予防的に(すなわち、将来の感染を防止するため)用いることができる。

本発明の免疫原性組成物中でタンパク質抗原を用いる代わりとして、抗原をコードする核酸(自己複製性RNAなどのRNA、またはプラスミドなどのDNAであってもよい)を用いてもよい。

いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、fHbp配列に加えて、髄膜炎菌血清群A、C、W135およびYのうちの1、2、3または4つに由来するコンジュゲート化莢膜糖抗原を含む。他の実施形態においては、本発明の組成物は、fHbp配列に加えて、少なくとも1つのコンジュゲート化肺炎球菌莢膜糖抗原を含む。

髄膜炎菌血清群Y、W135、CおよびA
現在の血清群Cワクチン(Menjugate(商標)[57、78]、Meningitec(商標)およびNeisVac-C(商標))は、コンジュゲート化糖を含む。Menjugate(商標)およびMeningitec(商標)は、CRM₁₉₇にコンジュゲートされたオリゴ糖抗原を有するが、NeisVac-C(商標)は、破傷風トキソイド担体にコンジュゲートされた完全な多糖(脱-O-アシル化されている)を用いる。Menactra(商標)ワクチンは、血清群Y、W135、CおよびAのそれぞれに由来するコンジュゲート化莢膜糖抗原を含有する。

本発明の組成物は、抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、および/またはオリゴ糖である、髄膜炎菌血清群Y、W135、CおよびAのうちの1つ以上に由来する莢膜糖抗原を含んでもよい。例えば、組成物は、血清群C；血清群AおよびC；血清群A、CおよびW135；血清群A、CおよびY；血清群C、W135およびY；または血清群A、C、W135およびYの4つ全部に由来する莢膜糖抗原を含んでもよい。

用量あたりのそれぞれの髄膜炎菌糖抗原の典型的な量は、1μg〜20μg、例えば、約1μg、約2.5μg、約4μg、約5μg、または約10μgである(糖として表される)。

混合物が血清群AとCの両方に由来する莢膜糖を含む場合、MenA糖：MenC糖の比(w/w)は、1より高くてもよい(例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1以上)。混合物が血清群Yと、血清群CおよびW135の一方または両方とに由来する莢膜糖を含む場合、MenY糖：MenW135糖の比は、1より高くてもよい(例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1以上)、ならびに/またはMenY糖：MenC糖の比(w/w)は1未満であってもよい(例えば、1:2、1:3、1:4、1:5以下)。血清群A:C:W135:Yに由来する糖の好ましい比(w/w)は、1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; および2:2:2:1である。血清群C:W135:Yに由来する糖の好ましい比(w/w)は、1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; および2:1:1である。実質的に等しい質量のそれぞれの糖を用いるのが好ましい。

莢膜糖は、オリゴ糖の形態で用いることができる。これらのものを、精製された莢膜多糖の断片化(例えば、加水分解による)により都合よく形成させ、通常、この後、所望のサイズの断片の精製を行う。

多糖の断片化を、好ましくは、30未満(例えば、10〜20、好ましくは、血清群Aについては約10；血清群W135およびYについては15〜25、好ましくは、約15〜20；血清群Cについては12〜22など)のオリゴ糖中の最終平均重合度(DP)を得るために実施する。DPを、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色アッセイにより測定することができる[79]。

加水分解を行う場合、一般に、加水分解物を切断して、短い長さのオリゴ糖を除去する[58]。これを、限外濾過、次いで、イオン交換クロマトグラフィーなどの様々な方法で達成することができる。血清群Aについては、約6未満またはそれと等しい重合度を有するオリゴ糖を除去するのが好ましく、血清群W135およびYについては約4未満のものを除去するのが好ましい。

好ましいMenC糖抗原は、Menjugate(商標)で用いられるように、参考文献78に開示されている。

糖抗原を、化学的に改変することができる。これは特に、血清群Aのために加水分解を減少させるのに有用である[80]。髄膜炎菌糖の脱-O-アセチル化を実施することができる。オリゴ糖については、改変は脱重合の前または後に行ってもよい。

本発明の組成物がMenA糖抗原を含む場合、抗原は、好ましくは、天然の糖上の1つ以上のヒドロキシル基が遮断基により置き換えられた改変された糖である[80]。この改変は、加水分解に対する耐性を改善する。

共有的コンジュゲーション
本発明の組成物中の莢膜糖は、通常、担体タンパク質にコンジュゲートされる。一般に、コンジュゲーションは、糖をT細胞非依存的抗原からT細胞依存的抗原に転換し、かくして、免疫学的記憶のためのプライミングを可能にするため、糖の免疫原性を増強する。コンジュゲーションは、小児用ワクチンにとって特に有用であり、周知の技術である。

典型的な担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくは破傷風毒素、またはそのトキソイドもしくは突然変異体などの細菌毒素である。CRM₁₉₇ジフテリア毒素突然変異体[81]は有用であり、PREVNAR(商標)製品中の担体である。他の好適な担体タンパク質としては、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体[82]、合成ペプチド[83、84]、熱ショックタンパク質[85、86]、百日咳タンパク質[87、88]、サイトカイン［89］、リンホカイン[89]、ホルモン[89]、増殖因子[89]、N19[91]、インフルエンザ菌に由来するプロテインD[92〜94]、ニューモリシン[95]またはその非毒性誘導体[96]、肺炎球菌表面タンパク質PspA[97]、鉄取込みタンパク質[98]、クロストリジウム・ディフィシル(C.difficile)に由来する毒素AまたはB[99]、組換え緑膿菌エキソプロテインA(rEPA)[100]などの、様々な病原体由来抗原[90]に由来する複数のヒトCD4⁺T細胞エピトープを含む人工タンパク質が挙げられる。

必要に応じて、任意の好適なリンカーと共に、任意の好適なコンジュゲーション反応を用いることができる。

糖は、典型的には、コンジュゲーションの前に活性化または官能化される。活性化は、例えば、CDAP(例えば、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸[101、102など])などのシアニル化試薬を含んでもよい。他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUなどを用いる。

リンカー基を介する結合を、任意の公知の手順、例えば、参考文献103および104に記載の手順を用いて作製することができる。1つの型の結合は、得られるアミノ基を、アジピン酸リンカー基の一方の末端とカップリングさせた後、タンパク質を、アジピン酸リンカー基の他方の末端にカップリングさせる、多糖の還元的アミノ化を含む[105、106]。他のリンカーとしては、B-プロピオンアミド[107]、ニトロフェニル-エチルアミン[108]、ハロゲン化ハロアシル[109]、グリコシド結合[110]、6-アミノカプロン酸[111]、ADH[112]、C₄〜C₁₂部分[113]などが挙げられる。リンカーを用いる代わりとして、直接的結合を用いることができる。タンパク質への直接的結合は、例えば、参考文献114および115に記載されたような、多糖の酸化、次いで、タンパク質との還元的アミノ化を含んでもよい。

糖へのアミノ基の導入(例えば、末端=O基を-NH₂で置き換えることによる)、次いで、アジピン酸ジエステル(例えば、アジピン酸N-ヒドロキシスクシンイミドジエステル)を用いる誘導体化および担体タンパク質との反応を含むプロセスが好ましい。別の好ましい反応は、例えば、MenAまたはMenCのために、プロテインD担体を用いるCDAP活性化を用いる。

外膜ベシクル
本発明のいくつかの組成物は、OMVの典型的な特徴である、抗原の複合体または未定義の混合物を含まない。しかしながら、fHbpは、特にOMV調製のために用いられる株において本発明のポリペプチドを過剰発現することにより、その有効性を増強することがわかっているため[4]、本発明を、OMVと共に用いることができる。以下も参照されたい。

この手法を、一般的には、髄膜炎菌血清群Bマイクロベシクル[116]、「天然のOMV」[117]、ブレブまたは外膜ベシクル[例えば、参考文献118〜123など]の調製物を改良するために用いることができる。これらのものを、例えば、免疫原性を増大させるため(例えば、免疫原を超発現させる)、毒性を低下させるため、莢膜多糖合成を阻害するため、PorA発現を下方調節させるためなどに遺伝的に操作された細菌から調製することができる[124〜127]。それらを、高ブレブ形成性株[128〜131]から調製することができる。非病原性ナイセリア菌に由来するベシクルを含有させることができる[132]。OMVを、界面活性剤を使用することなく調製することができる[133、134]。それらは、その表面上に非ナイセリア菌タンパク質を発現してもよい[135]。それらをLPS枯渇させてもよい。それらを、組換え抗原と混合してもよい[118、136]。異なるクラスI外膜タンパク質サブタイプを有する細菌に由来するベシクル、例えば、それぞれ、3つのサブタイプを展示する2つの異なる遺伝子操作されたベシクル集団を用いて、6つの異なるサブタイプ[137、138]を、またはそれぞれ3つのサブタイプを展示する3つの異なる遺伝子操作されたベシクル集団を用いて、9つの異なるサブタイプなどを用いることができる。有用なサブタイプとしては、P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1; P1.18-1,3,6が挙げられる。

宿主細胞
本発明は、本発明のポリペプチドを発現する細菌を提供する。細菌は、髄膜炎菌または大腸菌であってもよい。細菌は、ポリペプチドを構成的に発現してもよいが、いくつかの実施形態においては、発現は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。細菌は、ポリペプチドを超発現してもよい(参考文献139を参照されたい)。ポリペプチドの発現は、理想的には、相変異性(phase variable)ではない。

本発明はまた、本発明の細菌から(特に、髄膜炎菌から)調製された外膜ベシクルも提供する。本発明はまた、本発明の細菌からベシクルを製造するためのプロセスも提供する。これらの株から調製されたベシクルは、好ましくは、本発明のポリペプチドを含み、それはベシクル中で免疫学的に利用可能な(immunoaccessible)形態にあるべきある、すなわち、本発明の精製されたポリペプチドに結合することができる抗体は、ベシクル中に存在するポリペプチドにも結合することができるべきである。

これらの外膜ベシクルは、外膜のタンパク質成分を含むそれに由来するベシクルを形成する髄膜炎菌外膜の破壊またはそれからのブレブ形成により得られた任意のプロテオリポソームベシクルを含む。かくして、この用語は、OMV(「ブレブ」と呼ばれることもある)、マイクロベシクル(MV[116])および「天然OMV」(「NOMV」［117])を含む。

MVおよびNOMVは、細菌増殖中に自発的に形成し、培養培地中に放出される天然に存在する膜ベシクルである。ブロス培養培地中でナイセリア菌を培養すること、ブロス培養培地中のより小さいMVから全細胞を分離すること(例えば、細胞のみを沈降させ、より小さいベシクルを沈降させないように、濾過または低速遠心分離により)、次いで、細胞を枯渇させた培地からMVを収集すること(例えば、濾過、MVの示差的沈降もしくは凝集、MVを沈降させるための高速遠心分離による)により、MVを取得することができる。MVの生産における使用のための株を、一般的には、培養物中で産生されるMVの量に基づいて選択することができる。例えば、参考文献130および131は、MV産生が高いナイセリア菌を記載する。

OMVは、細菌から人工的に調製され、界面活性剤処理(例えば、デオキシコレートを用いる)を用いて、または非界面活性剤手段(例えば、参考文献134を参照されたい)により調製することができる。OMVを形成させるための技術は、界面活性剤を沈降させないような十分に高いpHで、胆汁酸塩界面活性剤(例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩であるが、デオキシコール酸ナトリウム[140および141]がナイセリア菌を処理するのに好ましい)で細菌を処理することを含む[142]。他の技術を、超音波処理、ホモジェナイゼーション、マイクロフルイダイゼーション、キャビテーション、浸透圧衝撃、破砕、フレンチプレス、混合などの技術を用いて、実質的には界面活性剤[134]の非存在下で行うことができる。界面活性剤を用いない、または少量の界面活性剤を用いる方法は、NspAおよびfHbpなどの有用な抗原を保持することができる[134]。かくして、方法は、約0.5%以下、例えば、約0.2%、約0.1%、0.05%未満、またはゼロのデオキシコレートと共にOMV抽出バッファーを用いてもよい。

OMV調製のための有用なプロセスは、参考文献143に記載されており、高速遠心分離の代わりにむしろ、粗OMV上での限外濾過を含む。プロセスは、限外濾過を行った後、超遠心分離の工程を含んでもよい。OMVはまた、参考文献154に記載された2段階のサイズ濾過プロセスを用いて精製することもできる。

本発明と共に用いるためのベシクルを、任意の髄膜炎菌株から調製することができる。ベシクルは通常、血清群B株に由来するが、A、C、W135またはYなどの、B以外の血清群からそれらを調製することもできる(例えば、参考文献142は、血清群Aに関するプロセスを開示する)。株は、任意の血清型(例えば、1、2a、2b、4、14、15、16など)、任意の血清亜型、および任意の免疫型(例えば、L1；L2；L3；L3,3,7；L10など)のものであってもよい。髄膜炎菌は、高侵襲性および高ビルレント系列を含む任意の好適な系列、例えば、以下の7つの高ビルレント系列のいずれか：サブグループI；サブグループIII；サブグループIV-1；ET-5複合体；ET-37複合体；A4クラスター；系列3に由来するものであってもよい。本発明の細菌は、本発明のポリペプチドをコードすることに加えて、1つ以上のさらなる改変を有してもよい。例えば、それらは改変されたfur遺伝子[144]を有してもよい。nspA発現の発現を、porAおよびcpsの同時ノックアウトを用いて上方調節することができる。OMV産生のための髄膜炎菌のさらなるノックアウト突然変異体は、例えば、参考文献150に開示されている。参考文献145は、6つの異なるPorAサブタイプを発現するように改変された株からのベシクルの構築を開示する。LPS生合成に関与する酵素のノックアウトにより達成される、低内毒素レベルを有するナイセリア菌突然変異体を用いることもできる[146、147]。LPSのリピドA部分を毒性にするのに関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、lpxl1遺伝子の発現を低下させるか、またはそのスイッチを切るように操作されたナイセリア菌突然変異体を、本発明と共に用いることができる[148]。同様に、莢膜多糖合成または輸出に関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、synXおよび/またはctrA遺伝子の発現を低下させるか、またはそのスイッチを切るように操作されたナイセリア菌突然変異体を、本発明と共に用いることができる。これらの、またはその他の突然変異体は全て、本発明と共に用いることができる。

かくして、本発明と共に用いられる株は、いくつかの実施形態においては、2つ以上のPorAサブタイプを発現する。6価および9価PorA株は、以前に構築されている。この株は、2、3、4、5、6、7、8または9つのPorAサブタイプ：P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1および/またはP1.18-1,3,6を発現することができる。他の実施形態においては、株は、PorA発現について下方調節されていてもよく、例えば、PorAの量は、野生型レベルと比較して(例えば、H44/76株と比較して)、少なくとも20%(例えば、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上など)低下しているか、またはさらにはノックアウトされている。

いくつかの実施形態においては、株は、ある特定のタンパク質を超発現してもよい(対応する野生型株と比較して)。例えば、株は、NspA、タンパク質287[118]、fHbp［139］(本発明のfHbpを含む)、TbpAおよび/またはTbpB[136]、Cu,Zn-スーパーオキシドジスムターゼ、HmbRなどを超発現してもよい。

本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌染色体中に組み込むことができるか、またはそれは例えば、プラスミド内に、エピソーム形態で存在してもよい。

ベシクル生産にとって有利には、髄膜炎菌を遺伝子操作して、ポリペプチドの発現が相変異を受けないことを確保することができる。髄膜炎菌中での遺伝子発現の相変異性を低下させるか、または除去するための方法は、参考文献149に開示されている。例えば、遺伝子を、構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下に置くか、またはその相変異性の原因となるDNAモチーフを除去するか、もしくは置き換えることができる。

いくつかの実施形態においては、株は、参考文献122、124、128、および150に開示されたノックアウトおよび/または超発現突然変異のうちの1つ以上を含んでもよい。例えば、これらの4つの文献における指針および命名法にしたがえば、下方調節および/またはノックアウトのための有用な遺伝子としては、(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、および/もしくはTbpB; (b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、および/もしくはTbpB ; (c) ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、および/もしくはTbpB; または(d) CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB、SynXおよび/もしくはSynCが挙げられる。

突然変異株を用いる場合、いくつかの実施形態においては、それは、以下の特徴：(i)髄膜炎菌LOSをトランケートするためのLgtBおよび/またはGalEの下方調節またはノックアウト；(ii)TbpAの上方調節；(iii)NhhAの上方調節；(iv)Omp85の上方調節；(v)LbpAの上方調節；(vi)NspAの上方調節；(vii)PorAのノックアウト；(viii)FrpBの下方調節またはノックアウト；(ix)Opaの下方調節またはノックアウト；(x)Opcの下方調節またはノックアウト；(xii)cps遺伝子複合体の欠失のうちの1つ以上、または全部を有してもよい。トランケートされたLOSは、シアル-ラクト-N-ネオテトラオースエピトープを含まないものであってもよい、例えば、それはガラクトース欠損LOSであってもよい。LOSは、α鎖を有さなくてもよい。

ベシクルを調製するために用いられる髄膜炎菌株に応じて、それらは株の天然のfHbp抗原を含んでも、または含まなくてもよい[151]。

1つの好ましい実施形態においては、髄膜炎菌は、機能的なMltAタンパク質を発現しない。参考文献152および153で考察されるように、髄膜炎菌中のMltA(GNA33としても知られる、膜結合型溶解性トランスグリコシラーゼ)のノックアウトは、培養培地中に大量の膜ベシクルを自発的に放出する細菌を提供し、それらを容易に精製することができる。例えば、ベシクルを、(i)ベシクルをその異なるサイズに基づいて細菌から分離し、ベシクルを濾液中に通過させる第1の濾過工程；および(ii)ベシクルを保持液中に保持する第2の濾過工程を含む、参考文献154の2段階のサイズ濾過プロセスを用いて精製することができる。MltA突然変異(下方調節またはノックアウト)は、「GMMA」ワクチン[155]中で用いられており、特に、LPSのリピドA部分を毒性にするのに関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、lpxl1および/または莢膜多糖合成もしくは輸出に関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、synXおよび/またはctrA遺伝子のさらなる下方調節またはノックアウトと都合よく組み合わせることができる。GMMA(膜抗原のための一般化モジュール)は、反応原性が低下し、免疫原性が増大したGMMAを放出するように操作された髄膜炎菌株から産生される遺伝的に解毒されたOMVである。GMMAは、単球活性化試験(MAT)において試験した場合、OMVよりも少ない前炎症性サイトカインを誘導する。

この手法を用いる「GMMA」ワクチンのための好ましい髄膜炎菌株は、本発明のv2 fHbp突然変異体および/またはv3 fHbp突然変異体を発現し、その発現を強力なプロモーターにより誘導することができる。この株により放出されるベシクルは、免疫原性形態のv2および/またはv3 fHbpタンパク質突然変異体を含み、ベシクルの投与は、参考文献155に考察されるような殺菌性抗体応答を提供することができる。この株は、v1 fHbpを発現することもできるか、またはその代わりにv1 fHbpを可溶性形態で別々の組換えタンパク質として提供することができる(および上記で考察されたように、v1 fHbpは野生型または例えば、fHに結合する能力を破壊するように突然変異された、突然変異配列であってもよい)。本発明は、そのような株を提供し、また、これらの株が、例えば、株の増殖後に培養培地から精製されたものとして放出するベシクルも提供する。これらの株中での発現のための好ましいv2突然変異体は、本明細書で考察されるようにS32および/またはL123に突然変異を有し、これらの株中での発現のための好ましいv3突然変異体は、本明細書で考察されるようにS32および/またはL126に突然変異を有する。かくして、これらのv2およびv3 fHbp配列突然変異体を発現する髄膜炎菌から調製されるベシクルは、本発明のワクチンにおける使用のための特に好ましい免疫原である。この方法での突然変異誘発のための有用な野生型v2配列は、配列番号51または配列番号54(配列番号55に由来するΔGを含む)を含み、この方法での突然変異誘発のための有用な野生型v3配列は、配列番号52を含む。

そのような株における使用のための有用なプロモーターとしては、参考文献156および157に開示されたものが挙げられる。例えば、プロモーターは、(a)特に、髄膜炎菌に由来する、ポリン遺伝子、好ましくは、porAもしくはporBに由来するプロモーター；または(b)特に、髄膜炎菌に由来するrRNA遺伝子プロモーター(16S rRNA遺伝子など)であってもよい。髄膜炎菌ポリンプロモーターを用いる場合、それは好ましくは、porAに由来し、さらにより特には、髄膜炎菌porA遺伝子プロモーターに由来する-10領域、および/もしくは髄膜炎菌porA遺伝子プロモーターに由来する-35領域(好ましくは、-10領域と-35領域が10〜20個のヌクレオチドの介在配列により隔てられている場合、および介在配列がポリ-G配列を含有しないか、もしくは8個を超える連続するGヌクレオチドを有さないポリ-G配列を含む場合)である。rRNA遺伝子プロモーターを用いる場合、それはより特には、(i)髄膜炎菌rRNA遺伝子プロモーターに由来する-10領域および/または(ii)髄膜炎菌rRNA遺伝子プロモーターに由来する-35領域を含んでもよい。また、例えば、porAプロモーターに由来する-10領域とrRNAプロモーターに由来する-35領域(コンセンサス-35領域であってもよい)とを有する、(a)と(b)のハイブリッドを用いることもできる。かくして、有用なプロモーターは、(i)(特に、髄膜炎菌)rRNA遺伝子に由来する-10領域と(特に、髄膜炎菌)porA遺伝子に由来する-35領域、または(ii)(特に、髄膜炎菌)porA遺伝子に由来する-10領域と(特に、髄膜炎菌)rRNA遺伝子に由来する-35領域のいずれかを含むプロモーターであってもよい。

LOSがベシクル中に存在する場合、そのLOSとタンパク質成分とを連結するためにベシクルを処理することができる(「ブレブ内」コンジュゲーション[150])。

一般
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」ならびに「からなる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物は、Xのみからなってもよく、またはさらなる何か、例えば、X+Yを含んでもよい。「含む(comprising)」(または「含む(comprises)」に対する参照は、必要に応じて、「からなる(consisting of)」(または「からなる(consists of)など)に対する参照により置き換えてもよい。用語「本質的にからなる(consisting essentially of)」は、特許請求の範囲を、特定の材料または工程、および特許請求された発明の「基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないもの」に限定する。

数値xと関連する用語「約」は、任意のものであり、例えば、x±10%を意味する。

単語「実質的に」は、「完全に」を排除しない、例えば、Y「を実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まないものであってもよい。必要に応じて、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略してもよい。

「配列同一性」は、ギャップオープンペナルティ=12およびギャップ伸長ペナルティ=1のパラメータと共にアフィンギャップサーチを用いて、MPSRCHプログラム(Oxford Molecular)中に実装されたSmith-Watermanホモロジーサーチアルゴリズムにより決定することができるが、好ましくは、デフォルトパラメータ(例えば、EBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる、ギャップオープニングペナルティ=10.0、およびギャップ伸長ペナルティ=0.5)を用いて、Needleman-Wunsch全体アラインメントアルゴリズム[158]により決定される。このアルゴリズムは、EMBOSSパッケージ[159]中のneedleツール中に都合よく実装される。適用が特定の配列番号に対する配列同一性を指す場合、同一性をその配列番号の全長にわたって算出するべきである。

ポリペプチド配列を参照した用語「断片」は、ポリペプチドが完全長タンパク質の一部であることを意味する。そのような断片は、完全長タンパク質と共通する定性的生物活性を有してもよく、例えば、断片は、完全長配列に関して断片に対する同様の免疫応答を生じさせる、免疫優勢エピトープなどの1つ以上のエピトープを含有するか、またはコードしてもよい。ポリペプチド断片は、一般に、天然タンパク質と比較した場合であるが、断片の残りのアミノ酸配列が天然タンパク質のアミノ酸配列と同一である場合、欠失されたアミノ(N)末端部分および/またはカルボキシ(C)末端部分を有する。ポリペプチド断片は、例えば、約8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262個の連続するアミノ酸、例えば、参照ポリペプチド配列の間の全ての整数、例えば、参照ポリペプチド配列の50〜260、50〜255、50〜250、50〜200、50〜150個の連続するアミノ酸を含有してもよい。断片という用語は、完全長fHbpポリペプチドおよびその成熟リポタンパク質を明示的に排除する。

血清群の後、髄膜炎菌の分類は、血清型、血清亜型および次いで、免疫型を含み、標準的な命名法は、それぞれ、コドン、例えば、B:4:P1.15:L3,7,9により隔てられた、血清群、血清型、血清亜型、および免疫型を列挙する。血清群B内では、いくつかの系列は頻繁に疾患を引き起こし(高侵襲性)、いくつかの系列は他のものよりも重篤な形態の疾患を引き起こし(高ビルレント)、他のものは疾患を引き起こすことは稀である。7つの高ビルレント系列、すなわち、サブグループI、IIIおよびIV-1、ET-5複合体、ET-37複合体、A4クラスターおよび系列3が認識される。これらのものは多遺伝子座酵素電気泳動(MLEE)により定義されているが、多遺伝子座配列タイピング(MLST)も、髄膜炎菌を分類するために用いられてきた。4つの主要な高ビルレントクラスターは、ST32、ST44、ST8およびST11複合体である。

一般に、本発明は、参考文献2、3、5、6、7、160、161、162、163、164、165、166および167に具体的に開示された様々なfHbp配列を包含しない。

キモトリプシン切断に対するfHbp変異体の異なる感受性を示す。矢印は完全長fHbpタンパク質の位置を示す。 v2突然変異体のウェスタンブロット分析を示す。レーンは、(1および2)組換え精製されたv2野生型；(4)v2野生型溶解物；(5)突然変異体#1；(6)突然変異体#2；(7)突然変異体#4；(8)突然変異体#5；(9)突然変異体#7；(10)突然変異体#8；(11)突然変異体#12；(12)突然変異体#14；(13)突然変異体#15；(14)fHbp var2 NΔG-trx対照、すなわち、N末端配列GPDSDRLQQRR(配列番号37)がGSKDISS(配列番号38)により置き換えられたv2タンパク質である。レーン2〜14は、キモトリプシンを含んでいた。Mは分子マーカーである。 v2突然変異体のさらなるウェスタンブロット分析を示す。レーンは、(1および2)突然変異体#3；(3および4)突然変異体#6；(5および6)突然変異体#9；(7および8)突然変異体#10；(9および10)突然変異体#13；(11および12)Δgono；(13および14)v2野生型；(15および16)突然変異体#22である。奇数レーンは、キモトリプシンを用いずにインキュベートされたタンパク質に関するものであるが、偶数レーンは、キモトリプシンと共にインキュベートされたタンパク質に関するものであった。「Δgono」タンパク質は、N末端配列(配列番号37)が除去された組換えv2である。 v2突然変異体のさらなるウェスタンブロット分析を示す。レーンは、(1および2)突然変異体#11；(3および4)N-trx；(5〜7)突然変異体#19；(8および9)突然変異体#20；(10および11)突然変異体#21である。レーン2、4、7、9および11はキモトリプシンと共にインキュベートされたタンパク質であったが、他のレーンはキモトリプシンを有していなかった。「N-trx」タンパク質は、N末端配列(配列番号37)が配列番号39により置き換えられた組換えv2である。 野生型およびS58V/L149R v2 fHbp突然変異体に関するDSCの結果を示す。C末端ドメインは突然変異によって影響されなかったが、N末端ドメインのTmは20℃を超えて増大した(矢印で示す)。y軸はCp(kcal/mol/℃)を示すが、x軸は温度(℃)を示す。 野生型(実線)および突然変異体(破線)v2 fHbpのSPR応答を示す。 野生型(上)として、または様々な突然変異を有する、v3 fHbpのSPR応答を示す。 配列番号48の三重融合タンパク質に関するDSCの結果を示す。軸は図5に記載の通りである。

発明の特定の実施形態
本発明は、以下の特定の番号の実施形態を提供する。

1. 野生型fHbpと比較して増大した安定性を有し、好ましくは、野生型fHbpよりもヒトH因子に対する親和性が低いv3またはv2 fHbpであって、例えば、
(A)fHbp v2アミノ酸配列突然変異体を含むポリペプチドであって、(a)アミノ酸配列が、配列番号5に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、および/もしくは少なくとも7アミノ酸長である配列番号5の断片を含み、(b)に列挙される少なくとも1つの残基を含有するが、(b)アミノ酸配列が、以下の残基：32、33、39、41、69、100、113、122、123、124、125、126、127、128、151、239、および/もしくは240の1つ以上において配列番号5と異なるが、ただし、
・fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基32にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基113にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基122にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基123にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基124にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基127にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；および
・fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基240にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
前記ポリペプチド
または
（B)fHbp v3アミノ酸配列突然変異体を含むポリペプチドであって、(a)アミノ酸配列が、配列番号17に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、および/もしくは少なくとも7アミノ酸長である配列番号17の断片を含み、(b)に列挙される少なくとも1つの残基を含有するが、(b)アミノ酸配列が、以下の残基：32、33、39、41、72、103、116、125、126、127、128、129、130、131、154、242、および/もしくは243の1つ以上において配列番号17と異なるが、ただし、
・fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基32にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基113にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基125にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基126にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基127にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
・fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基130にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；および
・fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基243にのみ置換を含む場合、この置換はアラニンとのものではないか、もしくは(b)に列挙された少なくとも1つのさらなる残基が置換される；
前記ポリペプチド。

2. アミノ酸配列が、(b)に列挙された残基の1つ以上における置換によって配列番号17と異なる、例えば、置換がS32V; I33C; L39C; L41C; F72C; V103T; T116S; F125C; L126R; V127I; S128GまたはS128T; G129D; L130I; G131A; S154C; H242R; およびE243Hからなる群から選択される、実施形態1(B)に記載のポリペプチド。

3. (b)に列挙され、上記の3A〜3O群から選択される残基において2個以上の置換を含む、実施形態1(B)または実施形態2に記載のポリペプチド。

4. アミノ酸配列が、(b)に列挙された残基の1つ以上における置換によって配列番号5と異なる、例えば、置換がS32V; V33C; L39C; L41C; F69C; V100T; I113S; F122C; L123R; V124I; S125GまたはS125T; G126D; L127I; G128A; S151C; H239R; およびE240Hからなる群から選択される、実施形態1(A)に記載のポリペプチド。

5. (b)に列挙され、上記の2A〜2O群から選択される残基において2個以上の置換を含む、実施形態1(A)または実施形態4に記載のポリペプチド。

6. ヒトH因子に結合するポリペプチドの能力を破壊する1つ以上のさらなる突然変異も含む、例えば、v2中では、R73、D203、E210、G228、S121、F122、L123、A192、E194、V199、I200、L201、T213、H215、F219、T231、およびE240の1つ以上に置換を含む、またはv3中では、Q35、I178、L87、A88、L126、V127、V202、E213、T216、T234、V241、およびE243の1つ以上に置換を含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のポリペプチド。

7. 下記：
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号40(例えば、1、2、もしくは3個の単一アミノ酸置換を有する配列番号44のアミノ酸配列を含む)のアミノ酸配列からなるが、V32もしくはR126残基において突然変異されていない髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができる、配列番号44のアミノ酸配列；
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号2(例えば、1、2、もしくは3個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む)のアミノ酸配列からなるが、V32もしくはR123残基において突然変異されていない髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができる、配列番号45のアミノ酸配列；
・v3アミノ酸配列が、配列番号17のLeu-126に対応するアミノ酸位置での突然変異を除いてv3野生型アミノ酸配列と同一であるが、ただし、突然変異がアラニンへの置換ではない(例えば、突然変異がアルギニンへの置換である)、fHbp v3アミノ酸配列；
・v2アミノ酸配列が、配列番号5のLeu-123に対応するアミノ酸位置での突然変異を除いてv2野生型アミノ酸配列と同一であるが、ただし、突然変異がアラニンへの置換ではない(例えば、突然変異がアルギニンへの置換である)、fHbp v2アミノ酸配列；または
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号46のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチド；配列番号4のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチド；および配列番号40のアミノ酸配列からなる(例えば、配列番号48のアミノ酸配列からなる)髄膜炎菌fHbpポリペプチドのそれぞれに結合する抗体を惹起することができる、配列番号47のアミノ酸配列
を含むポリペプチド。

8. 実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の核酸。

9. 例えば、細胞が、mltAの下方調節またはノックアウトを有し、また、場合により、(i)LPSのリピドA部分を毒性にするのに関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、lpxl1；および/または(ii)莢膜多糖合成もしくは輸出に関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、synXおよび/もしくはctrAの下方調節またはノックアウトを有する髄膜炎菌細胞などの、髄膜炎菌細胞である、実施形態8のプラスミドで形質転換された宿主細胞。

10. ベシクルが実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドを含む、実施形態9に記載の宿主細胞から調製される膜ベシクル。

11. 実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、または実施形態10に記載のベシクルを含む免疫原性組成物。

12. 哺乳動物に投与された場合、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起する、第2のポリペプチドをさらに含む、実施形態11に記載の組成物。

13. (i)髄膜炎菌血清群A、C、W135および/もしくはYに由来するコンジュゲート化莢膜糖ならびに/または(ii)肺炎連鎖球菌に由来するコンジュゲート化莢膜糖をさらに含む、実施形態11または12に記載の組成物。

14. 実施形態11〜13のいずれか1つに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物における抗体応答を生じさせるための方法。

発明を実施するための様式
fHbp突然変異
v2 fHbpは不安定であると認識されている。この不安定な特性に関する原因となる構造的理由を分析するために、安定性を改善するために配列を操作することを目的として、本発明者らは、fHbpポリペプチドの配列アラインメントおよび3D構造を分析した。特定の目的の1つの領域は、N末端ドメインとC末端ドメインとの間の構造的境界面であった[168]。

本発明者らは、表1で説明される突然変異を同定した。突然変異について同定された3つの位置は参考文献24および25と重複するが、本発明は先行技術において報告されたポリペプチドを包含しない、すなわち、ポリペプチドはこれらの位置でのみ、アラニンによる置換を含む。例えば、v1と一致させるためにE240をヒスチジンで置換することができ、それは理想的には残基H239での置換と対形成させる(突然変異体#1および#11)。同様に、F122が置換される場合、それを、好ましくはS151で両方ともシステインと置換と対形成させ、ジスルフィド架橋の形成を可能にする(突然変異体#10)。また、L123が置換される場合、それをアルギニンと置換することができ(アラニンよりもむしろ)、またはそれを他の残基、例えば、S32(突然変異体#3を参照されたい)、S125(突然変異体#20および#22を参照されたい)での置換、または残基124〜128(突然変異体#12を参照されたい)での置換と対形成させることができる。

安定性試験
不安定なタンパク質はあまり折り畳まれない傾向があり、この理由から、プロテアーゼによる切断および消化を受けやすい。図1は、v2 fHbpがv1およびv3よりもキモトリプシン消化に対して感受性であり、したがってこの試験を用いて、突然変異タンパク質の安定性を評価することができる。

図1については、野生型fHbp v1、v2およびv3を、50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8中、0.5mg/μLで調製した。キモトリプシンを、1:100(w/w)比で添加した。試料を、24℃、50mL用量で、振盪せずにインキュベートした。試料を抽出し、0、1、3または6時間沸騰させた後、12%ビス-Trisゲル(MESバッファー)上で泳動した。^*の印を付けた、左手側のレーンは、プロテアーゼを用いずに6時間インキュベートされた試料を示す。

組換えタンパク質を発現する大腸菌の細胞溶解物を、25℃で3時間、1:100 w/wの比のキモトリプシンと共にインキュベートした。分解パターンを、3つ全部のfHbp変異体に対してウサギ中で惹起された免疫ポリクローナル血清と共にインキュベートした後、ウェスタンブロッティングにより分析した。より低い見かけの分子量の切断産物の存在(図2〜4)は、不安定性の指示と解釈されるが、約30kDaの見かけのMWに対応するバンドの持続性は安定性の増大の指示と解釈される。突然変異体#1〜6、#12および#22は全て、野生型v2と比較してキモトリプシン切断に対する耐性の増大を示した。

DSCは、精製された組換えfHbp v2タンパク質の安定性に対する突然変異の効果を評価するための独立した手法として用いられてきた。DSCにより測定されたT_m(融点)は、分析されたタンパク質の50%が折り畳まれた状態にあり、50%が折り畳まれていない状態にある温度に対応する。タンパク質のコンフォメーションを安定化させる変化はT_mを増加させるが、脱安定化変化はT_mを低下させる。参考文献24の図3Dに見られるように、野生型v2 fHbpのDSCプロファイルは、2つのT_m値：N末端ドメインの融点に対応する、約40℃のT_m1、およびC末端ドメインの融点に対応する約80℃のT_m2を示す。分析された突然変異体に関するT_m1およびT_m2の値を、表1に示す。突然変異体#2、#4、#5、#12、#19および#21は、野生型タンパク質と比較したN末端ドメインのT_mの増大を示し、この効果は突然変異体#2、#4および#12についてより顕著であった。

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、モノマータンパク質のパーセンテージを評価し、また、結果を表1に示す。

突然変異体#2、#3、および#4
突然変異体#3(2B群)は、v2安定性試験において最良の全体的な結果を与えた。このタンパク質(配列番号20)は、それぞれ、ValおよびArgによる置換を有する、Ser-58(配列番号5ではS32)およびLeu-149(配列番号5ではL123)での突然変異を含む。v2タンパク質突然変異体(配列番号45を含む、配列番号20)を、DSCにより分析し、野生型配列と比較したところ、そのN末端ドメインのT_mは20℃を超えて高い(図5)。

血清殺菌アッセイにおいて、このv2突然変異体は、野生型v2配列を用いて生じさせたヒト抗体への結合について競合することができた。

S58VおよびL149R突然変異は安定性を改善するために導入され、実施にこの目標を達成したが、図6は、v2ポリペプチド突然変異体(点線)が驚くべきことに、固定されたfHに対して表面プラズモン共鳴により測定された場合、野生型v2配列(実線)と比較してfHへのはるかに低い結合を示したことを示している。S58V突然変異はそのままでfH結合に対してほとんど影響はなく、S58V/L149R二重突然変異体はL149R突然変異体のみを担持するfHbpよりも高いfH結合を示した。

突然変異体#3をv2中の「E313A」突然変異とさらに組み合わせた場合、SPRにより評価した場合にfH結合の完全な喪失が見られた。

等価な突然変異をv3配列(配列番号17)中に導入して、v3突然変異体である配列番号44を得た。fH結合に対する個々のS58VおよびL149R突然変異の効果を、v3において試験した(すなわち、v2突然変異体#2および#4のv3等価物)。かくして、配列番号17にしたがって番号付けられた、突然変異S32VまたはL126Rを、v3配列中に導入した。これらの2つの突然変異体を、2つの異なる野生型v3配列、およびまた、v3におけるfH結合を破壊することが知られる「E313A」突然変異体と比較した。

図7に示されるように、野生型v3はfH(上2つの線)に結合する。安定性を改善するように設計されたS58V突然変異は、SPRピーク値を約2倍低下させた。最も驚くべきことに、L149R突然変異(再度、安定性を改善するように設計された)は、既知のE313A突然変異体(下2つの線)と同様のレベルまでfH親和性を低下させた。

v3中のS58VおよびL149R突然変異もDSCにより試験したところ、野生型と比較してN末端T_mを5.5℃(S58V)または6.7℃(L149R)増加させることがわかった。両突然変異体のT_mは、v2二重突然変異体に見られるものよりも高かった(63.5℃、表1を参照されたい)。L149R v3突然変異体はまた、そのC末端ドメインについてはより高いT_m値を示したが、S58V v3突然変異体についてはここでのシフトはほとんどなかった。SPRは、突然変異体#2によるfH結合が約半分低下するが、突然変異体#4については、fH親和性が既知のE313A突然変異体(v2に関しても見られる通り)と同様のレベルまで低下することを示していた。2つの突然変異を組み合わせた場合(すなわち、突然変異体#3)、野生型と比較したT_mの増加は11.2℃であった。「E313A」突然変異を突然変異体#3に付加した場合、fH結合はほぼ完全に除去されたが、N末端ドメインのT_mも突然変異体#3と比較した場合、2.9℃低下した(しかし、v3野生型よりも8.3℃高いままであった)。「E313A」突然変異のみでは、野生型よりもはるかに安定性が低く、6.3℃のT_m低下を示した。

かくして、突然変異#2および#4を、単独で、または組み合わせて(すなわち、突然変異体#3)、必要に応じて、さらなる突然変異と共に用いて、v2またはv3 fHbpを安定化するだけでなく、fH親和性も破壊することができる。

血清殺菌アッセイを、v2およびv3における突然変異体#3および#4の免疫原性有効性を評価するために用いた。さらに、「E313A」突然変異体もv2およびv3において、単独で、または#3突然変異と組み合わせて試験した。野生型v2およびv3 fHbpも比較のために試験した。タンパク質を、水酸化アルミニウムアジュバントと共に20μg/用量で投与し、得られた血清を、出発野生型fHbp配列(すなわち、v2配列2.16およびv3配列3.42)と同じfHbpを発現する株を含む、7つの株のパネル(4つのv2株、3つのv3株)に対する殺菌活性について試験した。

v2タンパク質に関する結果は、以下の通りであった(配列番号はΔG形態に関するものである；^*=相同なfHbp)。

v3タンパク質に関する結果は以下の通りであった。

突然変異体#2と#12の組合せ
突然変異体#2および#12はそれぞれ、v2安定性の改善を示したので、これらの2つの突然変異体を単一のfHbp中で組み合わせた(配列番号58、ΔG形態)。突然変異体#12と比較して、この組み合わせた突然変異体のN末端T_mはさらに4.2℃増加し、試験したv2タンパク質突然変異体のいずれかのうち最も高いT_mが得られた。さらに、それは、強力に低下したfH結合を示した(SPRピーク値は約8x低下した)。

突然変異融合タンパク質
v2およびv3配列突然変異体を、GSGGGGリンカー(配列番号50)を介して、また、v1配列突然変異体とも融合させて、配列番号48を得た。この配列は、v2とv3の両方についてはS58VおよびL149R突然変異を、v1についてはR41S突然変異[21]を含む。配列番号47は、N末端からC末端に向かって、配列番号50のグリシンリッチリンカー配列により接続された、v2突然変異体#3(配列番号45)；v3突然変異体#3(配列番号44)；およびv1「R41S」突然変異体(配列番号49)を含む。Met-[配列番号37]-のN末端配列を付加し、かくして、配列番号48の成熟タンパク質を提供することにより、融合タンパク質を都合よく発現させることができる。

かくして、この融合タンパク質は、突然変異体#3がv2とv3の両方について、安定性の大きな増大(T_m)およびfH親和性の大きな低下を提供するという観察をうまく利用する。v1について、R41S突然変異は、熱安定性に対する効果はほとんどないが、fH結合を強力に低下させる。

三重融合タンパク質のDSC試験(図8)は、3つのN末端遷移が68℃を中心とする広いピークで同じになることを示している。3つのC末端遷移も同じになる。UPLCは、タンパク質が94.9%純粋であることを示し、HPLC分析はオリゴマーが1.5%未満であることを示した。

「GMMA」膜ベシクル中で発現される突然変異タンパク質
v1髄膜炎菌株を、mltA、lpxL1およびsynXのノックアウトを用いて調製して、「GMMA」ワクチン中の「ST2」プロモーター[157]の制御下でv2およびv3 fHbpリポタンパク質を超発現させるための遺伝的背景を提供した。v2遺伝子を欠失したlpxL1遺伝子座でゲノム中に組み込んだが、v3遺伝子をsynX遺伝子座で組み込んだ。さらに、v2およびv3を干渉なしに試験することができるように、天然のv1 fHbp遺伝子を欠失させた。

突然変異体#3および#4をv2について試験し、突然変異体#4をv3について試験した。さらに、v2とv3突然変異体#4の両方を含む株を調製した。これらの細菌について、fHbp発現およびfH結合を、FACSにより評価した。

v2 fHbpのみを発現する株について、FACSは、様々なタンパク質が、バックグラウンドΔfhbp株よりも2log高いレベルで、同様のレベルで発現されることを示した。しかしながら、fH結合に関して、突然変異体#3および#4は、はるかに少ない結合を示し、突然変異体#4における結合はバックグラウンドよりもわずかに上に過ぎなかった。これらの結果は、組換えv2タンパク質に関して得られたSPRデータを反映する。

v3突然変異体#4を発現する株について、FACSは、fHbpの完全な発現を示したが、そのfH結合は無効化された(「H222R」突然変異に関して見られたfH結合と一致する[19、25])。

v2およびv3に由来する突然変異体#4を発現する株について、両方のfHbpタンパク質を、FACSにより検出することができたが、fH結合はバックグラウンドΔfhbp株に見られるものよりもわずかに上に過ぎなかった。

ウェスタンブロット分析を用いて、液体培養中で6日間増殖させた場合の、これらの細菌中でのfHbp発現の安定性を試験した。v2タンパク質突然変異体の発現は、v3を同時発現させた場合でも長時間にわたって安定なままであった。v3タンパク質突然変異体の発現も、v3発現が長時間低下した、v2およびv3突然変異体の両方を発現する株におけるものを除いて、安定なままであった。

本発明はほんの一例として上記で説明され、本発明の範囲および精神内に残しながら改変を行うことができることが理解される。

配列表

参考文献
[1] WO99/57280.
[2] Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799.
[3] Welsch et al. (2004) J Immunol 172:5605-15.
[4] Hou et al. (2005) J Infect Dis 192(4):580-90.
[5] WO03/063766.
[6] Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100.
[7] Zhu et al. (2005) Infect Immun 73(10):6838-45.
[8] Cendron et al. (2011) Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 67:531-5.
[9] Mascioni et al. (2009) J Biol Chem 284:8738-46.
[10] Pizza et al. (2008) Vaccine 26 Suppl 8:I46-8.
[11] Malito et al. (2013) PNAS USA 110:3304-9.
[12] Marshall et al. (2012) Pediatr Infect Dis J 31:1061-8.
[13] McNeil et al. (2013) Microbiol Mol Biol Rev 77:234-52.
[14] Serruto et al. (2012) Vaccine 30 Suppl 2: B87-97.
[15] Scarselli et al. (2011) Sci Transl Med 3:91ra62.
[16] WO2011/051893.
[17] WO2010/046715.
[18] Schneider et al. (2009) Nature 458:890-5.
[19] WO2011/126863.
[20] Beernink et al. (2010) Clin Vaccine Immunol 17:1074-8.
[21] Beernink et al. (2011) J Immunol 186:3606-14.
[22] Rossi et al. (2013) Vaccine 31:5451-7.
[23] van der Veen et al. (2014) Infect Immun PMID 24379280.
[24] Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981.
[25] Pajon et al. (2012) Infect Immun 80:2667-77.
[26] Granoff et al. (2013) Clin Vaccine Immunol 20:1099-107.
[27] Beernink et al. (2008) Infect Immun 76:4232-40.
[28] Scarselli et al. (2009) J Mol Biol 386:97-108.
[29] Giuntini et al. (2012) PLoS One 7:e34272.
[30] Vu et al. (2012) Sci Rep 2:341.
[31] Faleri et al. (2013) FASEB J fj.13-239012.
[32] Johnson (2013) Arch Biochem Biophys 531:100-9.
[33] Bruylants et al. (2005) Current Medicinal Chemistry 12:2011-20.
[34] Veggi et al. (2012) Biochemistry 51:9384-93.
[35] WO2014/030003.
[36] Jongerius et al. (2013) PLoS Pathog 9(8): e1003528.
[37] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.
[38] WO2007/028408.
[39] http://pubmlst.org/ neisseria/
[40] Budroni et al. (2011) PNAS USA 108:4494-99.
[41] Goldschneider et al. (1969) J. Exp. Med. 129:1307-26.
[42] Santos et al. (2001) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 8:616-23.
[43] Frasch et al. (2009) Vaccine 27S:B112-6.
[44] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[45] WO03/009869.
[46] Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.
[47] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.
[48] WO00/66741.
[49] Martin et al. (1997) J Exp Med 185(7):1173-83.
[50] WO96/29412.
[51] Perkins-Balding et al. (2003) Microbiology 149:3423-35.
[52] WO01/55182.
[53] WO01/38350.
[54] WO00/23595.
[55] Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 103:10834-9.
[56] WO2004/032958.
[57] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698.
[58] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263.
[59] WO03/007985.
[60] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.
[61] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.
[62] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.
[63] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.
[64] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.
[65] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.
[66] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0.
[67] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.
[68] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355.
[69] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238.
[70] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.
[71] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.
[72] McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101-107.
[73] Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6.
[74] WO02/34771.
[75] Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.
[76] Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663.
[77] Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; see also pages 1218-1219.
[78] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.
[79] Ravenscroft et al. (1999) Vaccine 17:2802-2816.
[80] WO03/080678.
[81] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002).
[82] EP-A-0372501.
[83] EP-A-0378881.
[84] EP-A 0427347.
[85] WO93/17712.
[86] WO94/03208.
[87] WO98/58668.
[88] EP A 0471177.
[89] WO91/01146.
[90] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.
[91] Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7.
[92] EP-A-0594610.
[93] Ruan et al. (1990) J Immunol 145:3379-3384.
[94] WO00/56360.
[95] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.
[96] Michon et al. (1998) Vaccine. 16:1732-41.
[97] WO02/091998.
[98] WO01/72337.
[99] WO00/61761.
[100] WO00/33882
[101] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198.
[102] WO95/08348.
[103] US patent 4,882,317
[104] US patent 4,695,624
[105] Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919.s
[106] EP-A-0208375
[107] WO00/10599
[108] Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165 : 171-288 (1979).
[109] US patent 4,057,685.
[110] US patents 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.
[111] US patent 4,459,286.
[112] US patent 4,965,338
[113] US patent 4,663,160.
[114] US patent 4,761,283
[115] US patent 4,356,170
[116] WO02/09643.
[117] Katial et al. (2002) Infect Immun 70:702-707.
[118] WO01/52885.
[119] European patent 0301992.
[120] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096.
[121] Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2951-2958.
[122] WO02/09746.
[123] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333.
[124] WO01/09350.
[125] European patent 0449958.
[126] EP A 0996712.
[127] EP A 0680512.
[128] WO02/062378.
[129] WO99/59625.
[130] US patent 6,180,111.
[131] WO01/34642.
[132] WO03/051379.
[133] US patent 6,558,677.
[134] WO2004/019977.
[135] WO02/062380.
[136] WO00/25811.
[137] Peeters et al. (1996) Vaccine 14:1008-1015.
[138] Vermont et al. (2003) Infect Immun 71:1650-1655.
[139] WO2006/081259.
[140] European patent 0011243.
[141] Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80.
[142] WO01/91788.
[143] WO2005/004908.
[144] WO98/56901.
[145] Claassen et al. (1996) 14(10):1001-8.
[146] WO99/10497.
[147] Steeghs et al. (2001) The EMBO Journal 20:6937-6945.
[148] Fisseha et al. (2005) Infect Immun 73:4070-80.
[149] WO2004/015099.
[150] WO2004/014417.
[151] WO2004/046177.
[152] WO2006/046143.
[153] Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun 72:1914-19.
[154] WO2011/036562.
[155] Koeberling et al. (2014) Vaccine 32:2688-95.
[156] WO2013/033398.
[157] WO2013/113917.
[158] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453.
[159] Rice et al. (2000) Trends Genet 16:276-277.
[160] WO01/64920.
[161] WO03/020756.
[162] WO2004/048404.
[163] WO2004/094596
[164] WO2006/024954.
[165] WO2007/060548.
[166] WO2009/104097.
[167] WO2013/132452.
[168] Krissinel & Henrick (2007) J. Mol. Biol. 372:774-97.

本発明は以下の実施形態を包含する。
[１] (A)fHbp v2アミノ酸配列突然変異体を含むポリペプチドであって、(a)アミノ酸配列が、配列番号5に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、および/もしくは少なくとも7アミノ酸長である配列番号5の断片を含み、配列番号5に由来するS32を含有するが、(b)アミノ酸配列が、残基S32において配列番号5とは異なり、ただし、fHbp v2アミノ酸配列突然変異体が残基32のみに置換を含む場合、この置換はアラニンとの置換ではないか、もしくは以下の残基：V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239、および/もしくはE240の少なくとも1つが置換される、前記ポリペプチド；または
(B)fHbp v3アミノ酸配列突然変異体を含むポリペプチドであって、(a)アミノ酸配列が、配列番号17に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、および/もしくは少なくとも7アミノ酸長である配列番号17の断片を含み、配列番号17に由来するS32を含有するが、(b)アミノ酸配列が、残基S32において配列番号17とは異なり、ただし、fHbp v3アミノ酸配列突然変異体が残基32のみに置換を含む場合、この置換はアラニンとの置換ではないか、もしくは以下の残基：I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242、および/またはE243の少なくとも1つが置換される、前記ポリペプチド
である、v3またはv2 fHbp突然変異体。
[２] (A)アミノ酸配列が、S32ならびにV33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239、および/もしくはE240の1つ以上における置換により配列番号5と異なる、例えば、置換が、S32V; V33C; L39C; L41C; F69C; V100T; I113S; F122C; L123R; V124I; S125GもしくはS125T; G126D; L127I; G128A; S151C; H239R; E240Hからなる群から選択される；または(B)アミノ酸配列が、S32ならびにI33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242、および/もしくはE243の1つ以上における置換により配列番号17と異なる；例えば、置換が、S32V; I33C; L39C; L41C; F72C; V103T; T116S; F125C; L126R; V127I; S128GもしくはS128T; G129D; L130I; G131A; S154C; H242R; およびE243Hからなる群から選択される、１に記載のポリペプチド。
[３] 複数の残基が、以下のような2B、2I、2Jまたは2O群：
2B：残基32および123；
2I：残基32および125；
2J：残基32、123および125；または
2O：残基32、123、124、125、126、127および128
から選択される、複数の残基に置換を含む、１(A)に記載のポリペプチド。
[４] 配列番号5と比較してS32VおよびL123R置換を含み、場合により、V124I、S125G、G126D、L127I、G128A置換をさらに含む、例えば、配列番号20または配列番号45または配列番号58を含む、３に記載のポリペプチド。
[５] 複数の残基が、以下のような3B、3I、3Jまたは3O群：
3B：残基32および126；
3I：残基32および128；
3J：残基32、126および128；または
3O：残基32、126、127、128、129、130および131
から選択される、複数の残基に置換を含む、１(B)に記載のポリペプチド。
[６] 配列番号17と比較してS32VおよびL126R置換を含み、場合により、V127I、S128G、G129D、L130I、G131A置換をさらに含む、例えば、配列番号44または配列番号61を含む、５に記載のポリペプチド。
[７] ヒトH因子に結合するポリペプチドの能力を破壊する1つ以上のさらなる突然変異も含む、例えば、v2中では、R73、D203、E210、G228、S121、F122、A192、E194、V199、I200、L201、T213、H215、F219、T231、およびE240残基の1つ以上における置換、またはv3中では、Q35、I178、L87、A88、V127、V202、E213、T216、H218、T234、V241、E243、およびG248残基の1つ以上における置換を含む、１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[８] 下記：
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号2(例えば、1、2、もしくは3個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む)のアミノ酸配列からなるが、V32もしくはR123残基において突然変異されていない髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができる、配列番号45のアミノ酸配列；
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号40(例えば、1、2、もしくは3個の単一アミノ酸置換を有する配列番号44のアミノ酸配列を含む)のアミノ酸配列からなるが、V32もしくはR126残基において突然変異されていない髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができる、配列番号44のアミノ酸配列；
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号2(例えば、1、2、もしくは3個の単一アミノ酸置換を有する配列番号58のアミノ酸配列を含む)のアミノ酸配列からなるが、V32残基において突然変異されていない髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができる、配列番号58のアミノ酸配列；
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号2(例えば、1、2、もしくは3個の単一アミノ酸置換を有する配列番号61のアミノ酸配列を含む)のアミノ酸配列からなるが、V32残基において突然変異されていない髄膜炎菌fHbpポリペプチドに結合する抗体を惹起することができる、配列番号61のアミノ酸配列；
・v3アミノ酸配列が、配列番号17のLeu-126に対応するアミノ酸位置での突然変異を除いてv3野生型アミノ酸配列と同一であるが、ただし、突然変異がアラニンへの置換ではない(例えば、突然変異がアルギニンへの置換である)、fHbp v3アミノ酸配列；
・v2アミノ酸配列が、配列番号5のLeu-123に対応するアミノ酸位置での突然変異を除いてv2野生型アミノ酸配列と同一であるが、ただし、突然変異がアラニンへの置換ではない(例えば、突然変異がアルギニンへの置換である)、fHbp v2アミノ酸配列；または
・場合により、1、2、3、4、もしくは5個の単一アミノ酸置換、欠失および/もしくは挿入を有し、ポリペプチドが配列番号46のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチド；配列番号4のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌fHbpポリペプチド；および配列番号40のアミノ酸配列からなる(例えば、配列番号48のアミノ酸配列からなる)髄膜炎菌fHbpポリペプチドのそれぞれに結合する抗体を惹起することができる、配列番号47のアミノ酸配列
を含むポリペプチド。
[９] １〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の核酸。
[１０] 例えば、細胞が、mltAの下方調節またはノックアウトを有し、また、場合により、(i)LPSのリピドA部分を毒性にするのに関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、lpxl1；および/または(ii)莢膜多糖合成もしくは輸出に関与する少なくとも1つの遺伝子、特に、synXおよび/もしくはctrAの下方調節またはノックアウトを有する髄膜炎菌細胞などの、髄膜炎菌細胞である、９に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
[１１] ベシクルが１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、９に記載の宿主細胞から調製される膜ベシクル。
[１２] １〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または１１に記載のベシクルを含む免疫原性組成物。
[１３] 哺乳動物に投与された場合、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起する、第2のポリペプチドをさらに含む、１２に記載の組成物。
[１４] (i)髄膜炎菌血清群A、C、W135および/もしくはYに由来するコンジュゲート化莢膜糖ならびに/または(ii)肺炎連鎖球菌に由来するコンジュゲート化莢膜糖をさらに含む、１２または１３に記載の組成物。
[１５] １２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物における抗体応答を生じさせるための方法。

Claims (12)

1. (A)突然変異体fHbp v2アミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が、配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、かつ配列番号５の32位のセリンに対応する位置がバリンに置換されており、該アミノ酸配列を有するポリペプチドが配列番号４からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することのできる抗体を惹起しうる、前記アミノ酸配列；または
   (B)突然変異体fHbp v3アミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が、配列番号17に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、かつ配列番号17の32位のセリンに対応する位置がバリンに置換されており、該アミノ酸配列を有するポリペプチドが配列番号４０からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することのできる抗体を惹起しうる、前記アミノ酸配列
   を含むポリペプチド。
2. (A)該fHbp v2アミノ酸配列が、アミノ酸置換L123Rを含む、あるいは(B)該fHbp v3アミノ酸配列が、アミノ酸置換L126Rを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. ・配列番号45のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び／又は
   ・配列番号44のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
   を含むポリペプチド。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の核酸。
5. 請求項４に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
6. 髄膜炎菌細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
7. 前記細胞が、mltAの下方調節またはノックアウトを有し、また、場合により、(i)LPSのリピドA部分を毒性にするのに関与する少なくとも1つの遺伝子、もしくは、lpxl1遺伝子；ならびに/あるいは(ii)莢膜多糖合成もしくは輸出に関与する少なくとも1つの遺伝子、または、synXおよび/もしくはctrA遺伝子の下方調節またはノックアウトを有してもよい、髄膜炎菌細胞である、請求項５または６に記載の宿主細胞。
8. ベシクルが請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の宿主細胞から調製される膜ベシクル。
9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項８に記載のベシクルを含む免疫原性組成物。
10. 哺乳動物に投与された場合、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起する、第2のポリペプチドをさらに含む、請求項９に記載の組成物。
11. (i)髄膜炎菌血清群A、C、W135および/もしくはYに由来するコンジュゲート化莢膜糖ならびに/または(ii)肺炎連鎖球菌に由来するコンジュゲート化莢膜糖をさらに含む、請求項９または１０に記載の組成物。
12. 哺乳動物における抗体応答を生じさせるための請求項９〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

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