CN1323215A - 使用树枝状聚合物抑制毒物或毒性物质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种预防性或治疗性抑制人体或非人体的动物体患者体内毒物或毒性物质的方法,该方法包括对所述患者给予有效量的带有多个端基的树枝状聚合物的步骤,其中至少一个端基带有与之结合或连接的含阴离子或阳离子的部分。

Description

使用树枝状聚合物抑制毒物或毒性物质

发明领域

本发明涉及抑制毒素和其它毒物或毒性物质的方法，且更具体地说，本发明涉及树枝状聚合物作为毒性肽类、蛋白质或聚胺类和其它毒物或毒性物质的结合剂的用途。

发明背景

树枝状聚合物是以大量表面端基为特征的多分散性较低的3-维聚合物。此外，制备这些物质的形式要求严格控制大小、形状和数量以及表面基团的类型。树枝状物质具有用于作为治疗物质使用的几个特征：以与生物体表面和受体发生相互作用的较大和确定表面存在的固定形状；且较大数量的端基使得与生物靶物发生多重相互作用成为可能。

国际专利申请号PCT/AU95/00350(WO 95/34595)和PCT/AU97/00447(WO 98/03573)中公开了诸如带有多个端基的聚酰氨基胺或聚赖氨酸树枝状聚合物这样的树枝状聚合物，其中至少一个端基带有与之结合或连接的含阴离子或阳离子的部分。将这些公开的国际专利申请的内容引入本文作为参考。

本发明提供了树枝状聚合物在抑制毒物或毒性物质中的用途，其中所述的毒物或毒性物质包括但不限于毒素或毒性肽类诸如来自蛇、蝎子、蜘蛛和蜂毒这样的毒素或毒性肽类以及在细菌或病毒感染过程中释放的毒性肽类或其它毒物或毒性物质。

发明概括

本发明提供了一种预防性或治疗性抑制人体或非人体的动物体患者体内毒物或毒性物质的方法，该方法包括对所述患者给予有效量的带有多个端基的树枝状聚合物的步骤，其中至少一个所说的端基带有与之结合或连接的含阴离子或阳离子的部分。

用于本发明方法的特别优选的化合物是带有下列与其端基连接的部分的树枝状聚合物：含磺酸的部分、含羧酸的部分、含磷酸和膦酸的部分、含硼酸的部分、含神经氨酸或唾液酸的部分或含修饰的神经氨酸或唾液酸的部分；含伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基的部分、含吡啶鎓的部分；含鈲盐的部分；含脒鎓(amidinium)的部分；含苯酚的部分；具有酸性或碱性氢的杂环；含两性离子的部分或上述部分的混合物。

将用于本发明方法的化合物在本文中称作聚离子型树枝状聚合物并将该术语在本说明书的上下文和权利要求中使用，它不仅包括树枝状聚合物本身，而且包括其药物上或兽药上可接受的盐，例如诸如钠、钾或钙盐这样的碱金属盐或碱土金属盐以及诸如氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、柠檬酸根、乙酸根、对甲苯磺酸根等这样的药物上可接受的阴离子。发明详述

用干本发明的优选化合物包括通式Ⅰ的聚离子型树枝状聚合物：其中：I是引发剂核；

Z是内部支化单元；

n是代表树枝状聚合物代数的整数；且

A是可以通过任选的连接基团X与内部支化单元Z连接的含阴离子或阳离子的部分。

树枝状聚合物是大分子的多支化合物，它通过从最初的核分子开始经添加在连续“代(generation)”的连续层或阶段的重迭代反应顺序来构成三维高度有序的聚合物化合物。树枝状聚合物具有下列特征：ⅰ引发剂核(I)可以带有一个或多个反应部位并且是点样或显著大小以便获得最终的树枝状聚合物拓扑结构；ⅱ支化重复单元(Z)层与引发剂核连接；ⅲ官能端基(诸如A部分)任选地通过连接基团(诸如连接基团X)与树枝状聚合物表面结合。本发明使用树枝状结构作为连接离子部分的构架；本发明并不限于本文具体描述的球形树枝状聚合物，而可以以任意树枝状结构为基础。各种形状或结构的树枝状聚合物对本领域技术人员来说是众所周知的。

树枝状聚合物的制备方法是众所周知的且例如通过美国专利4289872和4410688(描述以多层赖氨酸单元为基础的树枝状聚合物)以及美国专利4,507,466、4,558,120、4,568,737和4,587,329(描述以包括聚酰氨基胺或PAMAM树枝状聚合物在内的其它单元为基础的树枝状聚合物)来描述。这些美国专利中所公开的树枝状聚合物被描述为适用于在制备纸中作为诸如作为表面修饰剂、作为金属螯合剂、作为反乳化剂或油/水乳剂、湿强度剂和适用于作为改变诸如漆这样的含水剂粘度的试剂。在美国专利4,289,872和4,410,688中还提示了可以将以赖氨酸单元为基础的树枝状聚合物用作制备药物剂型的基质。

国际专利公开号WO 88/01178、WO 88/01179和WO 88/01180公开了将树枝状聚合物与另一种诸如携带的药物或农业物质这样的物质接合或连接的接合物。此外，国际专利公开号WO 95/24221公开了由至少一种与可以是生物反应修饰剂的载体物质连接的树枝状聚合物和任选的靶物定向剂组成的树枝状聚合物接合物。这些专利公开以及上述美国专利中包括广泛公开的各种树枝状聚合物及其制备方法并将这些公开文献中每一篇的内容均引入本文作为参考。

在最广义的意义上理解本文所用的术语“树枝状聚合物”且在其范围内包括如专利公开号WO 88/01178、WO 88/01179和WO 88/01180中所公开的这些树枝状聚合物的所有形式和组合物。该术语还包括在这些专利公开文献中所公开的连接或桥连的树枝状聚合物。

本发明优选的树枝状聚合物包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核且优选通过至少两代扩展。特别优选的树枝状聚合物是聚酰氨基胺(PAMAM)树枝状聚合物、PAMAM(EDA)树枝状聚合物、聚(丙烯亚胺)(poly(propyleneimine))(PPI)树枝状聚合物和聚赖氨酸树枝状聚合物。

根据本发明，树枝状聚合物表面上端基中的至少一个且优选显著数量的端基带有与之结合的含阴离子或阳离子的部分。树枝状聚合物的分支可以在氨基或其它反应性官能基诸如OH、SH等上封端，随后这些基团与阴离子或阳离子部分反应。如果树枝状聚合物的端基是胺基，那么含阴离子或阳离子的部分可以通过包括酰胺和硫脲键在内的各种官能基与该树枝状聚合物连接。可以与树枝状聚合物端基结合的优选的含阴离子或阳离子的部分包括含磺酸的部分、含羧酸的部分(包括含神经氨酸和唾液酸的部分和含修饰的神经氨酸和唾液酸的部分)、含硼酸的部分、含磷酸和膦酸的部分(包括含酯化的磷酸和膦酸的部分)和含伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基的部分、含吡啶鎓的部分、含鈲盐的部分、含脒鎓的部分、含苯酚的部分、具有酸性或碱性氢的杂环、含两性离子的部分或上述部分的混合物。

可以与氨基或其它端基结合或连接的合适的含阴离子和阳离子的部分包括例如下列基团(其中n是0或正整数，更具体地说，n是0或1-20的整数)：-NH(CH₂)_nSO₃ ^-    -(CH₂)_nSO₃ ^-      -Ar(SO₃ ^-)_n-CH₂CH(SO₃ ^-)COOH -CH(SO₃)CH₂COOH  -ArX(CH₂)_nSO₃ ^-   X=O,S,NH

-ArXP(=O)(OR)₂      X=O,CH₂,CHF,CF₂    R=烷基，芳基，H,Na-ArXP(=O)(OR¹)(NR²R³)X=O,CH₂,CHF,CF₂   R¹=烷基，芳基，H,Na R²,R³=烷基，芳基-Ar[p(=O)(OR)₂]_n    R=烷基，芳基，H,Na n=1-3-Ar[B(OH)₂]_n        n=1-3              -Ar[COOH]_n           n=1-3

R=烷基或芳烷基；R₁、R₂、R₃(可以相同或不同)=烷基或芳烷基

除上述之外，各种含神经氨酸或唾液酸的部分或含修饰的神经氨酸或唾液酸的部分可以与本发明的树枝状聚合物结合或连接。这些部分包括各种N-和O-取代的神经氨酸衍生物，特别是诸如N-乙酰基、O-乙酰基和N-乙醇酰衍生物这样的N-和O-酰基衍生物以及神经氨酸基被修饰的部分。适当修饰的神经氨酸基团包括4-位上被氨基、酰氨基、氰基、叠氮基或胍基所取代的基团以及不饱和神经氨酸基团。这些部分可以通过2-、7-、9-或5-NAc位与树枝状聚合物连接。

优选的情况是，在通式Ⅰ的聚离子型树枝状聚合物中，n是1-20或以上的整数；更优选1-10。另外优选的情况是，树枝状聚合物至少包括3个或更多个端基。

可以起树枝状聚合物与A部分之间间隔基作用的任选的连接基团可以由烷基链(任选地被取代或分支)、烷氧基、聚烷氧基、烷硫基或聚烷硫基链(可以被取代或不被取代)或链烯基、多个链烯基、炔基或多个炔基链(可以被取代或不被取代)组成。合适的间隔基链包括式-(CH₂)_m-Z-(CH₂)_m-的基团，其中Z是-CH₂-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-或-S-，且m是1-15的整数。

通过本领域技术人员众所周知的标准化学方法可以制备本发明的阴离子型或阳离子型树枝状聚合物。合适的方法例如下列实施例中的描述。

如上所述，已经发现本发明的阴离子型或阳离子型树枝状聚合物可抑制毒物或毒性物质。本文所用的术语“毒物或毒性物质”特别用来指来源于生物(动物、植物、微生物或病毒)的毒素，包括但不限于诸如来自蛇、蝎子、蜘蛛和蜂毒这样的毒素或毒性肽类、毒性聚胺类以及在细菌感染(诸如细菌内毒素或外毒素)、原生动物、真菌或病毒感染过程中释放的毒性肽类或其它毒物或毒性物质。

本文所用的术语“抑制”在最广泛的意义上包括对人体或非人体的动物体患者体内毒物或毒性物质的毒性作用的完全或部分抑制或压制作用。该术语还用于包括预防性和治疗性的治疗。

因此，本发明在另一个方面中提供了一种用于预防性或治疗性抑制人体或非人体的动物体患者体内毒物或毒性物质的药物组合物或兽药组合物，它包括如上述概括的树枝状聚合物以及至少一种药物上或兽药上可接受的载体或稀释剂。

这类组合物的制剂对本领域技术人员来说是众所周知的。合适的药物上可接受的载体和/或稀释剂包括任意和所有的常用溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和延缓吸收剂等。这类介质和试剂在活性物质中的应用在本领域中是众所周知的且通过《Remington氏药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)第18版，Mack Publishing Company,Pennsylvania,USA中的实例来描述。除任意常用介质或试剂与活性组分不相容外，所关注的是它们在本发明药物组合物中的应用。还可以将补充的活性组分混入组合物。

特别有利的是配制给药方便和剂量均匀的单位剂型形式的组合物。本文所用的单位剂型指的是适合作为所治疗的人受治疗者的单位剂型的物理上可分散的剂型；含有预定量活性组分与所需药物上可接受载体和/或稀释剂的各剂型适合于产生所需的治疗作用。对本发明新型单位剂型的说明由下列因素来决定并直接取决于下列因素：(a)活性组分的独特特性和所获得的特定治疗作用和(b)化合这类用于特定疗法的活性组分的领域中固有的限制。

在另一个方面中，本发明提供了如上述概括的有效量的树枝状聚合物通过抑制毒物或毒性物质而预防性或治疗性治疗人体或非人体的动物体患者或在制备用于预防性或治疗性治疗人体或非人体的动物体患者的药剂中的用途。

可利用各种给药途径。当然，所选择的特殊方式取决于所治疗的特定疾病和达到治疗功效所需的剂量。一般来说，使用医疗上可接受的任意给药方式、即产生本发明活性成分的治疗水平而不会导致临床上不可接受的不良反应的任意方式可以实施本发明的方法。这类给药方式包括口服、直肠、局部、鼻部、吸入、经皮或非肠道(例如皮下、肌内和静脉内)途径。用于口服给药的制剂包括诸如胶囊、片剂、锭剂等这样的分散单位。其它途径包括直接进入脊髓液的鞘内给药、诸如通过本领域技术人员众所周知的导管和气囊血管成形术装置直接导入和经实质内注入靶向区域。

可以方便地将所述的组合物制成单位剂型且可以通过药物学领域中众所周知的任意方法来制备它们。这类方法包括使活性成分结合入构成一种或多种辅助组分的载体的步骤。一般来说，通过均匀而紧密地使活性成分结合入液体载体、粉碎的固体载体或两者中且然后如果需要使产物成形来制备所述的组合物。

可以将适合于口服给药的本发明组合物制成诸如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂这样的分散单位、在脂质体中含有预定量活性成分的各种剂型或制成诸如糖浆、酏剂或乳剂这样的含水液体或非水液体形式的混悬液。

便于非肠道给药的组合物包括优选与受体血液等渗的活性成分的无菌含水制剂。可以使用那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂、按照公知的方法来配制这种含水制剂。这种无菌注射剂也可以是无菌注射用无毒性非肠道可接受稀释剂或溶剂的溶液或混悬液，例如制成聚乙二醇的溶液。在可接受的载体和溶剂中，可以使用水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，可便利地将无菌固定油用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以使用任意缓和的固定油包括合成的单或二酸甘油酯类。此外，诸如油酸这样的脂肪酸类应用于制备注射剂。

还可以将活性成分配制成用于通过鼻内或通过吸入给予活性成分的转运系统，例如制成含有活性成分的精细分散的气溶胶喷雾剂。

其它转运系统可以包括缓释转运系统。优选的缓释转运系统是那些可以以缓释丸粒或胶囊形式释放本发明活性成分的系统。可以利用许多类型的缓释转运系统。它们包括但不限于：(a)活性成分包含在基质内的浸蚀性系统；和(b)活性成分以受控速率透过聚合物的扩散系统。此外，可以使用以泵为基础的金属构件转运系统，它们中的某些适用于移植。

以预防或治疗有效量给予活性成分。预防或治疗有效量指的是至少部分获得所需作用或延缓所治疗特定疾病的发作或发展发作、抑制它们发展或使两者均停止所必需的量。当然，这样的量取决于所治疗的特定疾病、所述疾病的严重程度和包括年龄、身体情况、高矮、体重和同时进行的疗法在内的个体患者参数。这些因素对本领域技术人员来说是众所周知的且仅根据常规实验就可以确定它们。一般优选使用最大剂量，即根据声音医疗判断的最高安全剂量。然而，本领域技术人员可以理解：可以因医疗因素、心理因素或实际上任意其它因素而给予较低的剂量或耐受性剂量。

一般来说，活性成分的每日口服剂量约为0.01mg/kg/天-1000mg/kg/天。开始可以给予小剂量(0.01-1mg)，随后使剂量增加到约1000mg/kg/天。在这种受治疗者在该剂量下的反应不充分的情况中，甚至可以将剂量使用到患者耐受性所允许的较高的程度(或通过不同的更加集中的转运途径的较高有效剂量)。所关注的是用于获得化合物的合适全身浓度的每日多重剂量。

本发明的活性成分还可以制成适用于兽药组合物的形式，例如，可以通过本领域中常用的方法来制备它们。这类兽药组合物的实例包括适合于下述给药的组合物：

(a)口服给药、外用，例如浸渍液(例如含水或非水溶液或混悬液)；片剂或药丸；用于含有饲料的混合物的粉剂、颗粒或丸粒；施用于舌头的膏剂；

(b)例如通过皮下、肌内或静脉内注射的非肠道给药，例如制成无菌溶液或混悬液；或(如果合适)通过乳房内注射给药，其中将混悬液或溶液经乳头导入乳房；

(c)局部施用，例如制成施用于皮肤的霜剂、软骨或喷雾剂；或

(d)阴道内给药，例如制成阴道栓、霜剂或泡沫。

除非上下文中另有说明，将贯穿于本说明书和权利要求中的术语“包括”或诸如“包括”或“含有”这样的变化术语理解为包括所述的整体或整体组，但不排除任何其它的整体或整体组。

附图简述

在附图中：

附图1-4表示不同浓度的BRI 2923在抑制HIV毒性Vpr肽级分P3中的作用。

从下列为例举而包括但并不用来限定本发明的实施例中可以明显得出本发明的进一步特征。在下列实施例中，PAMAM树枝状聚合物指的是以美国专利4,507,466、4,558,120、4,568,737和4,587,329中具体描述的氨核为基础的聚酰氨基胺树枝状聚合物；PAMAM(EDM)树枝状聚合物指的是以乙二胺核为基础的聚酰氨基胺树枝状聚合物；且BHAlys_xlys_ylys_z树枝状聚合物指的是以如美国专利4,289,872和4,410,688中所述的二苯甲基胺核和赖氨酸支化单元为基础的不对称聚赖氨酸树枝状聚合物。如美国专利4289872、4410688、4507466、4558120、4568737和4587329以及国际专利公开号WO 88/01178、WO88/01179、WO 88/01180和WO 95/24221中所述制备的聚酰氨基胺树枝状聚合物PAMAM1.0、PAMAM2.0、PAMAM3.0、PAMAM4.0、PAMAM5.0或更高的代、PAMAM4.0(EDA)以及聚赖氨酸树枝状聚合物BHAlyslys2、BHAlyslys₂lys₄、BHAlyslys₂lys₄lys₈和BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆、BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂、BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂lys₆₄或更高的代，如上所述。

                        实施例1树枝状聚合物与2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反应生成磺酸封端的树

                   枝状聚合物A PAMAM1.0

将固体碳酸钠(0.13g；1.0mmol)缓慢加入搅拌的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(0.41g；2.0mmol)的水(3ml)溶液中。在气体停止放出后，该溶液的pH为8.0。然后将PAMAM1.0(0.12g；0.33mmol)的水(1ml)溶液加入到上述溶液中，随后加入4滴40％的苄基三甲基氢氧化铵水溶液。接着在60℃下和氮气环境中将该溶液加热3天且然后浓缩。使残余物通过凝胶过滤(Sephadex G10；水)纯化且然后冻干至得到磺酸化的PAMAM1.0树枝状聚合物、为一种灰白色固体(0.51g)。¹H和¹³C nmr光谱证实是二烷基化和一烷基化的PAMAM1.0树枝状聚合物(约70∶30)的混合物。¹³C nmr(D₂O):δ31.0,31.1,37.1,37.7,41.3,48.6,51.5,53.1,53.4,55.6,56.2,61.2,61.5,178.3,179.0,179.8.B   PAMAM2.0

如上所述使PAMAM2.0与2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反应。使粗产物通过凝胶过滤(Sephadex G10；水)纯化且然后冻干至得到一种灰白色固体(0.51g)。¹H和¹³C nmr光谱证实是二烷基化和一烷基化的PAMAM2.0树枝状聚合物(约65∶35)的混合物。

¹³C nmr(D₂O):δ31.0,31.1,37.1,37.7,41.3,48.7,51.5,53.4,55.6,56.2,61.2.61.5,178.4,179.0,179.1,179.6.

当重复上述反应时，略去苄基三甲基氢氧化铵获得了类似的结果。C PAMAM3.0BRI2783

除使用稍过量的碳酸钠且不使用苄基三甲基氢氧化铵外，如上所述使PAMAM3.0与2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反应。¹H和¹³C nmr光谱证实是二烷基化和一烷基化的PAMAM3.0树枝状聚合物(约50∶50)的混合物。¹³C nmr(D₂O):δ31.0,31.1,36.9,37.4,41.1,48.6,51.5,53.4,55.7,56.2,61.1,61.5,

          178.2,178.9,179.0,179.8.D PAMAM4.0BRI2784

如对PAMAM3.0所述使PAMAM4.0与2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反应。¹H和¹³C nmr光谱证实是二烷基化和一烷基化的PAMAM4.0树枝状聚合物(约35∶65)的混合物。¹³C nmr(D₂O):δ31.0,31.1,36.9,37.3,41.1,48.5,51.5,53.5,55.7,56.2,61.1,61.5,178.1,178.9,179.0,179.8.

                        实施例2

        磺基乙酰胺钠封端的树枝状聚合物的制备A   PAMAM1.0

将4-硝基苯基溴乙酸酯(0.40g；1.5mmol)的无水DMF(1ml)溶液加入搅拌的PAMAM1.0(0.18g；0.5mmol)的DMF(3ml)溶液中。当茚三酮试验为阴性时，将所得的黄色溶液在室温下搅拌20分钟。将该溶液浓缩(30°/0.1mmHg)至得到黄色油。使该油分配在水与氯仿之间并分离出水层且用氯仿(2X)洗涤并且最后用乙酸乙酯洗涤。将该水溶液浓缩(35°/25mmHg)至得到溴乙酰化的PAMAM 1.0树枝状聚合物、为一种黄色油(0.36g；100％)。¹³C nmr(D₂O):δ32.8,33.3,43.0,43.5,54.4,174.5,176.4.

将亚硫酸钠(0.2g；1.6mmol)的水(1ml)溶液加入到上述溴乙酰化的PAMAM1.0树枝状聚合物(0.36g；0.5mmol)的水(5ml)溶液中并在室温下使该溶液保持稳定11天。将黄色溶液浓缩至得到一种淡黄色固体(0.60g)。¹³C nmr(D₂O):δ34.4,43.1,43.4,54.0,61.7,171.3,177.2.

通过简单地将亚硫酸钠溶液加入到获自第一次反应的水的粗提取物中可以进行上述反应过程而不需分离溴乙酰化的树枝状聚合物。B   PAMAM2.0方法1：

将4-硝基苯基溴乙酸酯(0.18g；0.7mmol)的无水DMF(1ml)溶液加入搅拌的PAMAM2.0(0.10g；0.1mmol)的DMF(3ml)溶液中。当茚三酮试验为阴性时，将所得的黄色溶液在室温下搅拌20小时。然后在涡旋条件下将该溶液加入水(150ml)中并用氯仿(3X)和乙酸乙酯提取该混合物。将亚硫酸钠(0.1g；0.8mmol)的水(1ml)溶液加入到粗溴乙酰化的树枝状聚合物溶液中并在室温下使该混合物保持稳定3天。接着将淡黄色溶液浓缩至得到黄色固体残余物，使其通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到磺基乙酰胺钠封端的PAMAM2.0树枝状聚合物(103mg)。¹³C nmr(D₂O):δ33.0,35.7,36.0,37.7,40.3,43.0,43.2,53.4,53.7,56.0,61.6,171.2,1 74.6,178.5.方法2：

将固体乙酰硫乙酸琥珀酰亚胺酯(67mg；0.33mmol)加入到PAMAM2.0(52mg；0.05mmol)的无水DMF(2ml)溶液中并将所得的溶液在室温下搅拌2天。然后将该混合物浓缩(30°/10^-3mmHg)至得到一种油状残余物。使该残余物分配在水和氯仿之间并分离出水层且浓缩至得到粘性油(117mg)。¹H和¹³C nmr证实所述的油是乙酰化树枝状聚合物和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。凝胶过滤(Sephadex G10；水)产生了乙酰硫基乙酰胺封端的PAMAM2.0树枝状聚合物的纯样品(29mg)。¹³C nmr(D₂O):δ34.0,34.2,37.3,43.0,43.1,43.3,53.5,54.0,56.3,175.4,177.2,177.5.

然后将上述官能化的树枝状聚合物溶于40％水性甲酸(7ml)所得到的溶液加入到新近制备的冰冷的过甲酸(1.6mmol)的甲酸(2ml)溶液中。在0°下将该混合物搅拌1小时且然后在室温下搅拌20小时。接着加入少量活性炭以便分解任何过量的过酸，将该混合物搅拌30分钟且然后过滤并浓缩至得到一种粘性油。

将粗产物溶于水、用碳酸氢钠水溶液将pH调节至9.0并通过Sephadex G10柱使该物质脱盐。在冻干后获得一种白色固体(20mg)，使其进行基本上与方法1获得的物质相同的分光光度法。¹³C nmr(D₂O):δ33.0,38.7,42.9,43.0,43.1,53.9,54.3,56.5,61.6,171.2,176.4,177.0.

                    实施例3

    磺基琥珀酰胺酸钠封端的树枝状聚合物的制备A   PAMAM1.0

将固体马来酐(0.11g；1.1mmol)加入到搅拌的PAMAM1.0(0.12g；0.33mmol)的无水DMF(3ml)溶液中。该混合物变成稍温和浅棕色溶解的酸酐并将所得的溶液在室温下搅拌过夜。然后将该溶液浓缩(30°/10^-4mmHg)至得到一种粘性油。¹H和¹³C nmr(D₂0)证实PAMAM1.0完全转化成三酰胺以及一些马来酸。¹³C nmr(D₂O):δ33.1,42.8,43.1,54.3,135.0,137.1,169.1,171.9,173.3.

然后将三酰胺粗品溶于水(4ml)并加入固体亚硫酸钠(0.20g；1.6mmol)。使所得的溶液在室温下保持稳定4天且然后浓缩。¹H和¹³Cnmr(D₂O)证实是1∶1的区域异构体磺基琥珀酰胺酸钠封端的PAMAM1.0树枝状聚合物与一些磺基琥珀酸的混合物。使粗产物通过凝胶过滤(Sephadex G10；水)纯化而得到磺基琥珀酰胺酸钠封端的PAMAM1.0树枝状聚合物样品(107mg)。¹³C nmr(D₂O):δ33.3,39.6,40.0,42.9,43.1,54.0,67.9,69.4,173.8,176.3,177.6,181.8.B   PAMAM2.0

如上所述制备区域异构体磺基琥珀酰胺酸钠封端的PAMAM2.0树枝状聚合物的混合物。¹³C nmr PAMAM 2.0磺基琥珀酰胺酸衍生物(D₂O):δ32.8,33.0,38.7,42.9,53.8,54.3,56.5,135.2,136.8,169.2,171.9,173.5,174.6.

                          ¹³C nmr PAMAM2.0磺基琥珀酰胺酸钠衍生物(D₂O):δ37.0,40.1,41.1,43.0,43.2,43.9,53.0,53.3,55.5,68.0,69.4,173.8,177.6,179.1,179.5,179.8,182.3.C   PAMAM4.0BRI6038

将固体马来酐(60mg；0.6mmol)加入到搅拌的PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的无水DMF(2ml)溶液中。开始该混合物变浑浊，而不久即得到澄清溶液，将其在室温下搅拌过夜。然后将该溶液浓缩(35°/10^-4mmHg)至得到一种粘性油。¹H和¹³C nmr(D₂O)证实PAMAM4.0完全转化成聚酰胺以及一些马来酸。然后将聚酰胺粗品溶于水(2ml)并加入亚硫酸钠(126mg；1.0mmol)的水(2ml)溶液。使所得的溶液在室温下保持稳定2天且然后浓缩。¹H和¹³C nmr(D₂O)证实是区域异构体磺基琥珀酰胺酸钠封端的PAMAM4.0树枝状聚合物与一些磺基琥珀酸的混合物。使粗产物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到由24个位置异构的磺基琥珀酰胺酸基团封端的PAMAM4.0树枝状聚合物样品(90mg)。¹H nmr(D₂O):δ2.4-2.6；2.7-3.1；3.2-3.4；3.9-4.0.¹³C nmr(D₂O):δ36.2；39.8；40.5；43.0；43.2；53.5；55.8；68.1；69.5；173.8；177.4；177.6；178.7；182.3.

                            实施例4

    N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺钠封端的树枝状聚合物的制备a N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺酸四丁铵的制备

将固体琥珀酐(0.5g；5.0mmol)加入到搅拌的2-氨乙基磺酸四丁铵(1.83g；5.0mmol)的无水二氯甲烷(30ml)溶液中。琥珀酐缓慢溶解并将所得的浑浊溶液在室温下搅拌过夜。将所得的混合物过滤并将滤液浓缩至得到一种粘性油(2.41g)。¹³C nmr证实完全转化成所需的单胺以及少量琥珀酸。通过将二氯甲烷溶液逐滴加入到大量过量的乙醚来重复沉淀产物而得到N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺酸四丁铵、为一种白色固体(1.762g；76％),mp125-127℃。¹H nmr(CDCl₃):δ0.86(t,12h,4xCH₃),1.28(m,8H,4xCH₂),1.50(m,8H,4xCH₂),2.33(m,2H,CH₂COOH),2.44(m,2H,CH₂CONH),2.76(m,2H,CH₂NHCO),3.12(m,8H,4xCH₂N),3.50(m,2H,CH₂SO₃ ^-),7.53(brt,1H,NH).13C nmr(CDCl₃):δ13.5,19.5,23.8,30.1,30.9,35.6,50.0,58.5,172.0,174.1.b 4-硝基苯基N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺酸四丁铵的制备

将二环己基碳化二亚胺(45mg；0.22mmol)的无水二氯甲烷(1ml)溶液加入到搅拌的N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁铵(94mg；0.20mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中并将该混合物在室温下搅拌过夜。将所得的混悬液过滤并将滤液浓缩至得到活性酯的粗品，不需进一步纯化而使用它。A N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺钠封端的PAMAM树枝状聚合物的制备

PAMAM4.0BRI2786

将粗品4-硝基苯基N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺酸四丁铵(0.30mmol)的无水DMF(1ml)溶液加入到搅拌的PAMAM4.0(51.5mg；0.01mmol)溶于50％DMF水溶液(3ml)所得到的溶液中并将所得的黄色溶液在室温下搅拌过夜。然后该将该混合物浓缩(35°/10^-5mmHg)并使黄色残余物分配在水与氯仿之间。分离出水层、用氯仿(2X)和乙酸乙酯洗涤且然后浓缩至得到黄色油(134mg)。将粗产物通过Amberlite IR120(Na)柱转化成钠盐而得到85mg的物质。将该物质进一步通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)过滤而得到N-(2-磺乙基)琥珀酰胺钠封端的PAMAM4.0树枝状聚合物(45mg)。¹³C nmr(D₂O):δ33.2,33.6,35.5,39.0,39.5.42.8,43.2,53.8,54.1,54.4,56.6,176.5,176.9,177.2,178.9,179.4.

按照类似方法制备相应的用N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺钠基团封端的PAMAM1.0和PAMAM3.0(BRI2785)树枝状聚合物。¹³C nmr PAMAM3.0衍生物(D₂O):δ33.4,35.5,39.0,39.5,42.9,43.2,53.8,54.1,54.3,56.5,176.4,176.9,177.4,178.9,179.4.¹³C nmr PAMAM1.0衍生物(D₂O):δ34.9,35.5,39.5,42.9,43.1,53.7,54.1,179.0.179.1,179.3.B N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺钠封端的聚赖氨酸树枝状聚合物的制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI2789

将三氟乙酸(lml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆(36.5mg；5.0μmol)的无水二氯甲烷(1ml)混悬液中并将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌2小时且然后浓缩。将残余物溶于无水DMSO(2ml)并用三乙胺将pH调节至8.5。接着逐滴加入粗品4-硝基苯基N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁铵(约0.2mmol)的DMSO(1ml)黄色溶液并在室温下将该混合物搅拌过夜。然后将黄色溶液浓缩(50°/10^-5mmHg)并使黄色残余物分配在水和氯仿之间。分离出水层、用氯仿(3X)和乙酸乙酯洗涤且然后浓缩至得到一种油(99mg)。将粗产物通过Amberlite IR120(Na)柱转化成钠盐而得到81mg的物质。将该物质进一步通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到N-(2-磺乙基)琥珀酰胺钠封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆树枝状聚合物(39mg)。¹³C nmr(D₂O):δ27.0,32.3,35.2,35.3.35.6,35.7,39.5,43.5,54.1,58.5,131.5,132.0,133.3,145.1,177.8,178.0,178.4,178.8,178.9,179.2,179.7,179.8.

按照类似方法制备相应的用N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺钠基团封端的BHAlyslys₂、BHAlyslys₂lys₄(BRI2787)、BHAlyslys₂lys₄lys₈(RRI2788)¹³C nmr BHAlyslys₂lys₄lys₈衍生物(D₂O):δ26.9,32.3,35.1,35.3,35.6,35.7,39.5,43.5,54.1,58.5,131.6,131.9,132.2,132.3,133.2,133.3,145.0,145.2,177.2,177.8,177.9,178.0,178.2,178.3,178.6,178.7,178.8,178.9,179.2,179.3,179.7,179.8.¹³C nmr BHAlyslys₂lys₄衍生物(D₂O):δ26.9,32.3,35.1,35.4,35.7,35.8,39.5,43.5,54.1,58.5,61.8,131.7,132.0,132.2,132.3,133.2,133.3,145.0,145.1,177.3,178.0,178.3,178.4,178.7,178.9,179.0,179.3,179.7,179.8.¹³C nmr BHAlyslys₂衍生物(D₂O):δ26.9,27.1,32.2,32.3,34.7,34.8,35.1,35.3,35.6,35.7,39.5,43.4,54.1,58.6,61.8,131.7,131.9,132.2,132.3,133.3,144.9,145.0,177.7,178.4,178.8,179.0,179.3,180.0.

                   实施例5

     4-磺基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备A   PAMAM4.0BRI2791

将固体4-磺基苯基异硫氰酸钠一水合物(500mg；1.96mmol)加入到PAMAM4.0(300mg；0.0582mmol)的水(10ml)溶液中并将所得溶液在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该溶液浓缩并使黄色固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分并冻干至得到4-磺基苯基硫脲钠封端的PAMAM4.0树枝状聚合物、为一种松散的白色固体(370mg)。¹H nmr(D₂O):δ2.28；2.52；2.69；3.15；3.27；3.60；7.32(d,J=9Hz)；7.72(d,J=9Hz).¹³C nmr(D₂O):δ36.9；41.1；43.1；48.3；53.6；55.8；129.0；131.1；144.4；178.5；179.1；184.4.

按照类似方法制备相应的分别用3、6、12和48个4-磺基苯基硫脲钠基团封端的PAMAM1.0、PAMAM2.0(BRI2790)、PAMAM3.0和PAMAM5.0(BRI2991)树枝状聚合物。B   PAMAM4.0(EDA)BRI6045

将固体4-磺基苯基异硫氰酸钠一水合物(130mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(4ml)溶液中并将所得溶液在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该溶液浓缩并使固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分并冻干至得到用32个4-磺基苯基硫脲钠基团封端的PAMAM4.0、为一种松散的白色固体(136mg)。

¹H nmr(D₂O):δ2.30；2.50；2.70；3.18；3.62；7.35(d,J=9Hz)；7.72(d,J=9Hz).¹³C nmr(D₂O):δ36.8；41.0；43.1；48.4；53.6；55.7；128.9；131.0；144.3；178.5；179.0；184.5.C   BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI2792

在氮气环境中将三氟乙酸(4ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆(0.73g；0.1mmol)的无水二氯甲烷(4ml)混悬液中。观察到有短时间的剧烈的气体放出并将所得溶液在室温下搅拌2小时且然后浓缩。将残余的糖浆状物溶于水(5ml)、使该溶液通过Amberlite IRA-401(OH)柱并将滤液浓缩至得到BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆、为一种粘性油(0.49g)。将该油重新溶于水(5ml)并加入N,N-二甲基-N-烯丙基胺缓冲液(pH9.5；3ml)。然后加入固体4-磺苯基异硫氰酸钠一水合物(1.30g；5.1mmol)并将所得溶液在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该溶液浓缩并使浅棕色固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分、过Amberlite IR120(Na)柱并冻干至得到4-磺基苯基硫脲钠封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆树枝状聚合物、为一种松散的白色固体(374mg)。¹H nmr(D₂O):δ1.40；1.72；3.08；3.42；4.24；4.60；7.30；7.40(d,J=9Hz)；7.78(d,J=9Hz).¹³C nmr(D₂O):δ27.3；32.5；35.9；43.7；48.9；58.6；63.3；128.8；131.0；143.7；144.7；145.1；177.7；178.1；183.8；185.2.

按照类似方法制备相应的分别用16、64和128个4-磺基苯基硫脲钠基团封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈、BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂(BRI2992)和BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂lys₆₄(BRI2993)树枝状聚合物。

                        实施例6

    3,6-二磺基萘基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备A   PAMAM4.0BRI2923

将固体3,6-二-磺基萘基异硫氰酸钠(160mg；0.41mmol)加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(3ml)溶液中并将所得溶液在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该溶液浓缩并使棕色固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分并浓缩至得到3,6-二磺基萘基硫脲钠封端的PAMAM4.0树枝状聚合物、为一种棕色固体(73mg)。

¹H nmr(D₂O):δ2.30；2.60；2.74；3.20；3.57；7.75；7.86；8.28.¹³C nmr(D₂O):δ35.0；39.9；43.1；48.1；53.8；56.1；128.4；128.6；129.3；131.0；131.3；136.0；136.8；138.2；145.5；146.0；177.2；177.8；185.5.

按照类似方法制备相应的用3,6-二磺基萘基硫脲钠基团封端的PAMAM2.0树枝状聚合物。B   PAMAM4.0(EDA)BRI6046

将固体3,6-二磺基萘基异硫氰酸钠(220mg；0.57mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(74mg；0.01mmol)的水(4ml)溶液中并将所得溶液在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该溶液浓缩并使浅棕色固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分并浓缩至得到用32个3,6-二磺基萘基硫脲钠基团封端的PAMAM4.0、为一种褐色固体(148mg)。

¹H nmr(D₂O):δ2.30；2.80；3.20；3.54；7.74；7.85；8.25.¹³C nmr(D₂O):δ36.0；40.8；43.1；48.3；53.6；55.9；128.5；129.4；131.0；131.3；136.0；136.8；138.3；145.5；146.0；178.2；185.6.C   BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI2999

在氮气环境中将三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆(73mg；0.01mmol)的无水二氯甲烷(2ml)混悬液中。观察到有短时间的剧烈的气体放出并将所得溶液在室温下搅拌2小时且然后浓缩。将残余的糖浆状物溶于水(5ml)、使该溶液通过Amberlite IRA-401(OH)柱并将滤液浓缩至得到BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆、为一种粘性油。将该油重新溶于水(5ml)并加入N,N-二甲基-N-烯丙基胺缓冲液(pH9.5；3ml)。然后加入固体3,6-二磺基萘基异硫氰酸钠(234mg；0.60mmol)并将所得溶液在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该溶液浓缩并使浅棕色固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分、过Amberlite IR 120(Na)柱并冻干至得到用32个3,6-二磺基萘基硫脲钠基团封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆、为一种松散的灰白色固体(119mg)。¹H nmr(D₂O):δ1.0-2.0；3.18；3.43；4.31；7.22；7.80；7.89；8.25.¹³C nmr(D₂O):δ27.2；32.4；35.3；43.7；49.0；58.5；63.6；128.4；129.1；131.4；136.1；136.6；138.6；139.0；145.1；145.6；178.4；184.8；186.7.

实施例7

   4-磺基萘基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0BRI2997

将固体4-磺基萘基异硫氰酸钠(180mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(5ml)溶液中并将该混合物在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。在减压条件下从所得的混悬液中蒸馏出水并使黄白色固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分并冻干至得到4-磺基萘基硫脲钠封端的PAMAM4.0树枝状聚合物、为一种松散的白色固体(60mg)。

¹H nmr(D₂O):δ2.20；2.60；3.14；3.48；7.23；7.47；7.56；7.77；7.93(d,J=6Hz)；8.56(d,J=6Hz).¹³C nmr(D₂O):δ35.8；40.5；43.1；48.4；53.6；55.9；127.6；128.6；130.3；131.9；132.5；133.5；134.7；140.5；142.7；177.8；178.0；185.4.

                    实施例8

    3,5-二磺基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0BRI6039

将固体3,5-二磺基苯基异硫氰酸钠(110mg；0.32mmol)加入到PAMAM4.0(63mg；0.012mmol)的水(3ml)溶液中并将所得溶液在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该溶液浓缩并使浅棕色固体残余物通过凝胶过滤(Sephadex G25；水)纯化。合并纯的级分并浓缩至得到用24个3,5-二磺基苯基硫脲钠基团封端的PAMAM4.0、为一种灰白色固体(110mg)。¹H nmr(D₂0):δ2.53,3.08；3.36；3.66；7.90；7.95.¹³C nmr(D₂O):δ34.8；41.0；43.1；48.0；53.7；56.2；124.1；128.6；143.5；148.8；177.6；185.0.

                    实施例9

    3,6,8-三磺基萘基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0BRI2998

将固体3,6,8-三磺基萘基异硫氰酸钠(250mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)和N,N-二甲基-N-烯丙基胺缓冲液(pH9.5；1ml)的水(2ml)溶液中并将该混合物在53°下和氮气环境中加热2小时且然后冷却。将该混合物在减压条件下浓缩至得到橙色固体。将残余的固体溶于水(2ml)并使其通过Amberlite IR-120(Na)的短柱。然后将滤液浓缩并使残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化。合并纯的级分并冻干至得到3,6,8-三磺基萘基硫脲钠封端的PAMAM4.0树枝状聚合物、为一种灰白色固体(102mg)。

¹H nmr(D₂O):δ2.65；3.02；3.30；3.66；8.05；8.42；8.59；8.67.¹³C nmr(D₂O):δ33.2；38.7；43.2；43.7；47.8；54.0；54.3；56.7；131.0；131.3；131.9；135.9；138.0；139.6；143.8；144.1；145.6；176.2；176.5；186.0.

按照类似方法制备相应的3,6,8-三磺基萘基硫脲钠封端的树枝状聚合物BHAlys.lys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI7011。

                    实施例10

4-(磺基甲基)苯甲酰胺钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0BRI6040

将固体4-(氯甲基)苯甲酸4-硝基苯基酯(200mg；0.68mmol)加入到搅拌的PAMAM4.0(70mg；0.014mmol)的无水DMSO(4ml)溶液中并将所得的黄色溶液在室温下搅拌2小时。然后将该溶液浓缩(10^-4mmHg；40°)并用水和二氯甲烷(1∶1)的混合物提取残余物。将剩余的固体物质溶于DMSO(5ml)并加入亚硫酸钠(130mg；1mmol)的水(3ml)溶液。使所得的轻度浑浊的混合物保持稳定4天，此后添加过量的水(2ml)而导致形成澄清均匀的黄色溶液。然后将该溶液首先在25mmHg和40°、接着在10^-4mmHg和50°下浓缩至得到粗产物。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex G25；水)纯化而得到用24个4-(磺基甲基)苯甲酰胺钠基团封端的PAMAM4.0(24mg)。¹Hnmr(D₂O):δ2.25；2.66；3.08；3.20；3.33；3.38；4.01；7.40(br d)；7.62(br d).¹³C nmr(D₂O):δ36.7；40.9；43.0；43.6；53.5；55.5；61.0；131.6；135.0；137.2；140.4；174.5；178.6；179.2.

                实施例11

    4-磺基苯甲酰胺封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)BRI6116

将固体N-羟基琥珀酰亚胺基4-磺基苯甲酸钾(100mg；0.3mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(35mg；0.005mmol)溶于0.1M、pH8.5的硼酸盐缓冲液(5ml)所得到的溶液中并将该溶液在室温下搅拌2小时。在该阶段产生的乳白色溶液具有的pH为4.5。然后加入1M碳酸钠溶液(1ml)而得到一种澄清溶液，将该溶液浓缩至得到粗产物、为一种白色固体。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex G25；水)纯化而得到用32个4-磺基苯甲酰胺钠基团封端的PAMAM4.0(EDA)(47mg)。¹H nmr(D₂O):δ2.25；2.42；2.63；3.05；3.18；3.31；3.38；7.72(d,J=8Hz)；7.78(d,J=8Hz).¹³C nmr(D₂O):δ36.0；40.4；43.0；43.7；53.7；55.8；130.2；132.2；140.4；150.1；173.6；178.0；178.5.

                            实施例12

    N-(4-磺基苯基)丙酰胺钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)BRI6117

将固体N-(4-磺基苯基)丙烯酰胺钠(250mg；1mmol)和固体碳酸钠(106mg；1mmol)依次加入到搅拌的PAMAM4.0(EDA)(78mg；0.011mmol)的水(4ml)溶液中。在所得溶液在氮气环境中搅拌4天且然后冻干至得到一种松散的白色固体。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用64个N-(4-磺基苯基)丙酰胺钠基团封端的PAMAM4.0(EDA)(206mg).¹³C nmr证实了有极微量转化成了一烷基化的末端氨基。¹H nmr(D₂O):δ2.10；2.48；2.58；2.79；3.20；7.42(d,J=7Hz)；7.65(d,J=7Hz).¹³C nmr(D₂O):δ36.5；37.9；41.1；53.4；55.6；124.8；130.9；143.0；144.2；177.4；178.5.

                实施例13

    4-磺基苯基脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)BRI6115

将磺胺酸钠(195mg；1mmol)的无水DMSO(3ml)溶液逐滴加入到N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(530mg；2mmol)的无水DMSO(4ml)溶液中并将所得的浅棕色溶液在室温下搅拌20小时。加入PAMAM4.0(EDA)(75mg；0.011mmol)的无水DMSO(1ml)溶液并将该溶液进一步搅拌18小时。然后在高度真空(10^-5mmHg；35°)下将该溶液浓缩至得到一种浅黄色半固体。将该粗产物溶于DMSO(4ml)并将该溶液加入到200ml的经充分搅拌的乙酸乙酯中。通过过滤收集沉淀的白色固体并用乙酸乙酯(2X)和乙醚(2X)洗涤，然后干燥至得到一种白色粉末(275mg)。使该物质进一步通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用32个4-磺基苯基脲钠基团封端的PAMAM4.0(EDA)(106mg)。¹H nmr(D₂O):δ2.31；2.55；2.75；3.19；7.32(d,J=9Hz)；7.63(d,J=9Hz).¹³C nmr(D₂O):δ36.3；40.7；43.3；43.8；53.7；55.7；123.3；130.9；140.9；146.0；161.4；178.2；178.6.

                        实施例14

    N,N,N-三甲基甘氨酰胺氯化物封端的树枝状聚合物的制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI2922

将三氟乙酸(4ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆(220mg；30μmmol)的无水二氯甲烷(2ml)混悬液中并将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌2小时且然后冷却。将残余物溶于无水DMSO(5ml)并用三乙胺将pH调节至8.5。然后加入固体4-硝基苯基N,N,N-三甲基甘氨酸氯化物(0.50g；1.8mmol)并将该混合物在室温下搅拌过夜。接着浓缩浑浊的溶液(50°/10^-5mmHg)并使残余物分配在水与二氯甲烷之间。分离出水层、用二氯甲烷(3X)和乙酸乙酯洗涤且然后浓缩至得到一种油(1.128g)。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到N,N,N-三甲基甘氨酰胺封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆树枝状聚合物(116mg)。¹³C nmr(D₂O):δ25.5,30.5,30.8,33.4,42.1,56.5,57.1,

67.5,68.1,166.7,167.0,167.1,176.0,176.2.

                实施例15

    4-三甲铵苯甲酰胺封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0BRI6043

将1,1’-羰基二咪唑(85mg；0.52mmol)加入到4-三甲铵苯甲酸碘化物(154mg；0.5mmol)的无水DMF(4ml)溶液中并将所得混合物在室温下和氩气环境中搅拌2小时。在此期间，从该溶液中析出白色固体。然后加入PAMAM4.0(58；0.011mmol)的无水DMF(2ml)溶液并将该混合物在室温下搅拌过夜。此后大部分沉淀已经溶解且溶液的茚三酮试验呈阴性。将该混合物浓缩(10^-4mmHg；30°)至得到一种白色固体残余物。使该粗产物进一步通过凝胶过滤(Sephadex LH20；10％AcOH)纯化而得到用24个4-三甲铵苯甲酰胺基团封端的PAMAM4.0、为乙酸盐(89mg)。¹H nmr(D₂O):δ1.96；2.65-2.85；3.25-3.55；3.64；7.92.¹³C nmr(D₂O):δ25.8；33.1；33.5；38.7；43.1；43.5；53.5；54.1；56.4；61.2；124.8；133.6；139.9；153.2；173.2；176.3；176.8；182.6.

按照类似方法制备相应的用6个4-三甲铵苯甲酰胺基团封端的PAMAM2.0树枝状聚合物。

                    实施例16

4-(三甲铵甲基)苯甲酰胺封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0BRI6044

将固体4-(氯甲基)苯甲酸4-硝基苯基酯(150mg；0.5mmol)加入到搅拌的PAMAM4.0(52mg；0.01mmol)的无水DMSO(3ml)溶液中。当茚三酮试验呈阴性(pH约为8.5)时，将所得的黄色溶液在室温下搅拌20小时。然后浓缩该溶液(10^-5mmHg；40°)并将残余物与水和二氯甲烷(1∶1)的混合物一起振摇。通过过滤收集不溶性的凝胶样物质、用水(2X)和二氯甲烷(2X)洗涤且然后风无水。将4-(氯甲基)苯甲酰胺封端的树枝状聚合物粗品溶于25％的三乙胺水溶液(20ml)并使黄色溶液保持稳定过夜。然后将该溶液浓缩、将残余物溶于水(5ml)并使该溶液过Amberlite IRA-401(OH)柱。将无色滤液浓缩至得到一种粘性油，使其通过凝胶过滤(Sephadex G10；10％AcOH)纯化而得到用24个4-(三甲铵甲基)苯甲酰胺基团封端的PAMAM4.0(90mg)。¹H nmr(D₂O):δ1.88；2.65-2.80；2.98；3.10-3.60；7.52(br d,J=9Hz)；7.72(brd,J=9Hz).¹³C nmr(D₂O):δ26.6；33.4；38.8；43.2；43.5；53.6；53.6；54.1；56.8；62.8；73.0；132.1；135.3；137.5；140.0；176.4；176.9；183.6.

                        实施例17N-(2-乙酰氧基乙基)-N,N-(二甲铵)甲基羧酰胺(carboxamide)封端

                  的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0

将固体1,1’-羰基二咪唑(85mg；0.52mmol)加入到溴化N-(2-乙酰氧基乙基)-N-(羧甲基)-N,N-二甲铵(135mg；0.5mmol)的无水DMF(3ml)溶液中并将所得溶液在氮气环境中搅拌2小时。然后加入PAMAM4.0(60mg；0.012mmol)的DMF(2ml)溶液中，该过程瞬间形成可缓慢再溶解的絮状沉淀。将该混合物搅拌2天且然后浓缩(10^-4mmHg；40°)至得到一种粘性油。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex G10；10％AcOH)纯化而得到用24个N-(2-乙酰氧基乙基)-N,N-(二甲铵)甲基羧酰胺基团封端的PAMAM4.0(64mg)。¹Hnmr(D₂O):δ1.93；2.05；2.70；3.10-3.60；3.28；3.93(m)；4.14；4.48(m).¹³C nmr(D₂O):δ24.6；26.2；33.2；38.7；42.8；42.9；53.9；57.4；62.6；67.3；67.5；168.9；176.4；176.8；177.3；183.2.

                        实施例18

            胍基封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0BRI6042

将PAMAM4.0(63mg；0.012mmol)和硫酸甲硫假脲酯(170mg；0.61mmol)的水(5ml)溶液(pH10.5)在80°和氮气环境中加热2小时。然后将该溶液浓缩并使残余物通过凝胶过滤(Sephadex G10；10％AcOH)纯化而得到用24个胍基基团封端的PAMAM4.0、为乙酸盐(107mg)。¹H nmr(D₂O):δ2.00；2.80(brt)；3.09(brt)；3.32；3.45(brt)；3.60(brt).¹³C nmr(D₂O):δ25.2；33.2；33.4；38.7；41.2；42.6；43.4；44.7；53.5；54.0；56.3；176.5；176.7；176.9；181.6.

按照类似方法制备相应的用6个胍基基团封端的PAMAM2.0树枝状聚合物。

                    实施例194-([1,4,8,11-四氮杂环十四烷]甲基)苯甲酰胺封端的树枝状聚合物

                        的制备PAMAM4.0BRI6041

在室温下使1-(4-羧苯基)甲基-1,4,8,11-四氮杂环十四烷四盐酸盐(120mg；0.25mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(60mg；0.52mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(250mg；1.3mmol)溶于pH为7的磷酸盐缓冲液(10ml)所得到的溶液在室温下保持稳定1小时且然后加入PAMAM4.0(32mg；0.006mmol)溶于pH7的磷酸盐缓冲液(10ml)所得到的溶液。使该混合物保持稳定2天且然后浓缩。使残余物通过凝胶过滤(Sephadex G10；10％AcOH)纯化而得到如¹H和¹³C nmr所测定的用约12个4-([1,4,8,11-四氮杂环十四烷]甲基)苯甲酰胺基团封端的PAMAM4.0(80mg)。接着将该产物溶于水并过Amberlite IRA-401(Cl)树脂柱且然后浓缩。将残余物溶于水(1ml)、加入浓HCl(1ml)并用乙醇(30ml)稀释该溶液而沉淀出一种白色固体。通过过滤收集该固体。¹H和¹³C nmr再次证实末端氨基基团中约50％官能化。

¹H nmr(D₂O):δ2.17；2.36；2.50；2.78；2.85；3.25；3.40；3.50；3.60；3.62；4.49；7.63(brd)；7.78(brd).¹³C nmr(D₂O):δ22.7；23.1；33.2；38.8；39.9；40.2；40.3；41.0；41.2；42.0；42.9；43.2；43.6；45.5；46.1；49.1；52.2；53.9；54.3；56.6；62.7；132.5；135.7；137.1；139.7；174.3；176.2；176.3；176.7；177.0；178.2；178.5.

                    实施例20

    4-羧基-3-羟基苄胺封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)BRI6119

将氰基硼氢化钠(32mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)、4-甲酰基-2-羟基苯甲酸(83mg；0.5mmol)和碳酸氢钠(42mg；0.5mmol)的水(4ml)混合物中。将不均匀的橙色混合物在室温下搅拌4小时。在此期间它变均匀。然后将该橙色溶液浓缩并使残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用约32个4-羧基-3-羟基苄胺基团封端的PAMAM4.0(EDA)(91mg)。¹H和¹³C nmr(D₂O)证实末端氨基中大部分一烷基化而某些二烷基化，两种光谱均显示出宽峰。¹³C nmr(D₂O):δ37.0；41.1；50.9；53.4；55.5；55.8；61.5；120.9；122.2；122.4；132.3；132.7；135.0；135.8；163.5；163.7；169.0；178.6；179.3.¹H nmr(D₂O):δ2.20；2.35；2.60；3.15；3.30；3.55；4.25；6.68；7.12；7.55.

                实施例21

    4-羧基苯基酰胺封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)

将固体4-羧苯基异硫氰酸酯(86mg；0.48mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(20ml)溶液中。用饱和NaHCO₃将所得浑浊溶液的pH调节至9并在室温下持续搅拌24小时。然后将反应混合物过滤将滤液浓缩至得到一种白色固体残余物，使其通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化且然后冻干至得到白色松散固体产物(68mg)。

                实施例22

    3,5-二羧苯基酰胺封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)

将固体3,5二羧苯基异硫氰酸酯(112mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(70mg；0.01mmol)的水(5ml)溶液中。用1MNa₂CO₃溶液将所得浑浊溶液的pH调节至10并在53°下和氮气环境中加热2小时。然后将反应混合物过滤将滤液浓缩至得到一种浅棕色固体残余物，使其通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化且然后冻干至得到浅棕色松散固体产物(112mg)。

                实施例23

 4-膦酰基氧基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)

将固体4-膦酰基氧基苯基异硫氰酸钠(251mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(20ml)溶液中。将所得溶液(pH9)在室温下和氮气环境中搅拌24小时。然后将反应混合物浓缩至得到一种白色固体残余物，使其通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化且然后冻干至得到白色松散固体产物(86mg)。

                        实施例24

    4-(膦酰基甲基)苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)

将固体4-(膦酰基甲基)苯基异硫氰酸钠(97mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(30ml)溶液中。将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌3天，通过定期添加饱和NaHCO₃溶液将pH维持在8。然后将反应混合物浓缩至得到一种白色固体残余物，使其通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化且然后冻干至得到白色松散固体产物(102mg)。

                   实施例25

乙基4-(膦酰基甲基)苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)

将固体乙基4-(膦酰基甲基)苯基硫脲异硫氰酸钠(109mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的DMF(30ml)溶液中。将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌17小时，通过定期添加饱和NaHCO₃溶液将pH维持在8。然后将反应混合物浓缩至得到一种白色固体残余物，使其通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化且然后冻干至得到白色松散固体产物(30mg)。

                        实施例26C_n-烷基连接的2-硫代唾液酸糖苷(thiosialoside)封端的树枝状聚

                     合物的制备

通过下列步骤制备[(8-辛酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸(α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onate)甲酯。

向5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-2-S-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖酸(α-D-galacto-2-nonulopyranosonate)甲酯(Hasegawa等，1986)(100mg)的无水二甲基甲酰胺(1ml)溶液中加入8-溴辛酸(41mg)和二乙胺(280mg)并将该溶液在20℃下搅拌17小时。在真空中除去溶剂并使残余物分配在乙酸乙酯和5％冰冷的盐酸之间。将有机层用水洗涤、用硫酸钠干燥并蒸发至得到残余物(130mg)。将其溶于乙酸乙酯(5ml)并加入N-羟基琥珀酰亚胺(26mg)和二环己基碳化二亚胺(46mg)。将该混合物在20℃下搅拌17小时，然后过滤出白色沉淀。浓缩滤液并通过使用乙酸乙酯洗脱的硅胶闪蒸色谱法纯化。合并含有产物的级分并蒸发至得到97mg、71％的白色泡沫。

以类似方式制备下列物质：

[(11-十一酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯；

[(乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯；

[(4-丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯；

[(4-甲基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯。A PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸(α-D-galacto-2-nonulopyranosidoic acid)]₃₂ BRI6112

在惰性气体环境中向PAMAM[EDA]4.0(50mg)的无水二甲亚砜(4ml)溶液中加入[(8-辛酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯(300mg)并将该溶液在20℃下搅拌60小时。在真空中除去溶剂并将残余物溶于甲醇(2ml)。将该溶液在Sephadex LH20上进行大小排阻层析、用甲醇洗脱。在蒸发溶剂时，获得182mg、93％的产物PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]₃₂、为一种白色粉末。

通过下列方法将其转化成游离的唾液酸糖苷(sialoside)：

在20℃下和氩气环境中向PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-o-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]32(182mg)的无水甲醇(3ml)溶液中加入新近制备的0.19M甲醇钠的甲醇(7ml)溶液并将该混合物搅拌2.5小时。蒸发溶剂并将残余物溶于水(10ml)且搅拌3小时。将该溶液在Sephadex LH20上进行大小排阻层析、用水洗脱。在冻干时，获得110mg、77％的产物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂、为一种浅柠檬色粉末。

通过类似步骤制备下列物质：

PAMAM[EDA]4.0[(11-十一酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂ BRI6147；

PAMAM[EDA]4.0[(乙酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂ BRI6121；

PAMAM[EDA]4.0[(4-甲基苯甲酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂ BRI6120；

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂ BRI6169。

在20℃下，将BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆(t-Boc)₃₂(20.3mg)溶于三氟乙酸(2ml)和二氯甲烷(2ml)混合物所得到的溶液搅拌2小时，然后在真空中除去溶剂。将残余物溶于无水二甲亚砜(1ml)并加入二异丙基乙胺(25mg)和[(8-辛酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯(78mg)。在20℃下和氩气环境中将该混合物搅拌60小时，然后在真空中除去溶剂。将残余物溶于新近制备的0.1M甲醇钠的甲醇(2.5ml)溶液并在20℃下和氩气环境中将该混合物搅拌3小时。蒸发溶剂并将残余物溶于水(1ml)并搅拌17小时。将该溶液在Sephadex LH20上进行大小排阻层析、用水洗脱。在冻干后，获得44mg、86％的产物BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂、为一种白色粉末。

                        实施例27

唾液酸4-位上修饰的树枝状唾液酸糖苷(sialoside)的制备

通过下列步骤制备4-叠氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-2-S-乙酰基-3,4,5,-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸甲酯。向4-叠氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-2-氯-3,4,5,-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸甲酯(Sabesan,1994)(5g)的无水二氯甲烷(150ml)溶液中加入细粉状的硫羟乙酸钾(5.8g)并在20℃下将该混悬液剧烈搅拌48小时。将该混合物过滤并蒸发至得到浅棕色泡沫(5.2)。通过制备型反相HPLC[C₁₈,30％乙腈/水]分离所需产物、为一种白色泡沫(3.9g,72％)。

通过下列步骤制备[(8-辛酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)4-叠氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯。

向4-叠氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-2-S-乙酰基-3,4,5,-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸甲酯(300mg)的无水二甲基甲酰胺(3.5ml)溶液中加入8-溴辛酸(155mg)和二乙胺(1.26ml)并在20℃下将该溶液搅拌17小时。在真空中除去溶剂并使残余物分配在乙酸乙酯和10％冰冷的盐酸之间。将有机层用水洗涤、用硫酸钠干燥并蒸发至得到一种黄色泡沫(385mg)。将其溶于乙酸乙酯(20ml)并加入N-羟基琥珀酰亚胺(95mg)和二环己基碳化二亚胺(175mg)。在20℃下将该混合物搅拌17小时，然后过滤出白色沉淀。将滤液浓缩并通过制备型反相HPLC[C₁₈,30％乙腈/水]纯化而得到一种白色泡沫(340mg,83％)。A PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-叠氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂BRI6146

在惰性气体环境中向PAMAM[EDA]4.0(72mg)的无水二甲亚砜(5ml)溶液中加入[(8-辛酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)4-叠氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯(318mg)并将该溶液在20℃下搅拌60小时。在真空中除去溶剂并将残余物溶于甲醇(2ml)。将该溶液在Sephadex LH20上进行大小排阻层析、用甲醇洗脱。在蒸发溶剂时，获得225mg、81％的产物PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酰氨基)4-叠氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]₃₂、为一种白色泡沫。

通过下列方法获得游离的唾液酸糖苷(sialoside)：

在20℃下和氩气环境中向PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酰氨基)4-叠氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]₃₂(215mg)的无水甲醇(1ml)溶液中加入新近制备的1M甲醇钠的甲醇(1ml)溶液并将该混合物搅拌3小时。蒸发溶剂并将残余物溶于水(2ml)且搅拌17小时。将该溶液在Sephadex LH20上进行大小排阻层析、用水洗脱。在冻干时，获得160mg、90％的产物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-叠氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂、为一种松散的白色粉末。B PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-氨基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂ BRI6149

在20℃下使硫化氢气流缓慢通过PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-叠氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂(25mg)溶于吡啶(40ml)和水(20ml)的混合物所得到的溶液中5天。然后用氮气使该溶液发泡2小时以便除去过量的硫化氢。将该溶液蒸发至无水并将残余物溶于水(5ml)且通过0.45μm的滤膜过滤以除去硫。在冻干时，获得23mg、96％的产物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-氨基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]₃₂、为一种松散的白色粉末。

                    实施例28

            硼酸封端的树枝状聚合物的制备4-羧基苯基硼酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

向-羧苯基硼酸(500mg)的无水二甲基甲酰胺(5ml)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(380mg)和二环己基甲酰胺(680mg)。在20℃下将该混合物搅拌64小时，然后过滤出白色沉淀。在真空中除去溶剂并将残余物溶于乙酸乙酯(100ml)。将该溶液用水洗涤、用硫酸钠干燥并蒸发至得到一种白色固体，使其从乙腈/水中结晶、为细针状体(730mg,92％)。PAMAM[EDA]4.0[4-苯甲酰氨基硼酸]₃₂ BRI6160

在惰性气体环境中向PAMAM[EDA]4.0(69mg)的无水二甲亚砜(5ml)溶液中加入4-羧苯基硼酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(130mg)并将该溶液在20℃下搅拌65小时。向该浑浊的淤浆中加入1M碳酸钠溶液(1ml)并将澄清溶液再搅拌24小时。在真空中除去溶剂并将残余物溶于10％的氨溶液(5ml)。将该溶液在Sephadex LH20柱上进行大小排阻层析，用10％氨溶液洗脱。在蒸发溶剂时，获得110mg、94％的产物PAMAM[EDA]4.0[4-苯甲酰氨基硼酸]₃₂、为一种白色松散固体。

                            实施例29

        3,6-二磺基萘基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂

将三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(147mg)的无水二氯甲烷(2ml)搅拌的混悬液中并将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌2小时且然后浓缩。将残余物溶于N,N-二甲基-N-烯丙基胺缓冲液(pH9.5；5ml)且然后加入固体异硫氰酸3,6-二磺基萘基酯(400mg)。接着通过加入1M碳酸钠将该混合物的pH调节至9.5并在53℃下和氮气环境中将该溶液加热3小时。并将该反应混合物浓缩并将残余物重新溶于水且使该溶液过Amberlite IR120(Na)柱。将滤液浓缩至得到粗产物，使其通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用64个3,6-二磺基萘基硫脲钠基团封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂、为一种白色松散固体(175mg)。

                            实施例30

    3,5-二磺基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂

将三氟乙酸(3ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(300mg；0.02ml)的无水二氯甲烷(3ml)搅拌的混悬液中并将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌2小时且然后浓缩。将残余物溶于水并使该溶液过Amberlite IR401(OH)柱并将滤液浓缩至得到一种粘性油(187mg)。将该油溶于吡啶/水的1∶1混合物(8ml)并加入异硫氰酸3,5-二磺苯基酯(680mg；2mmol)。将所得溶液在53℃下和氮气环境中加热3小时。然后将该溶液浓缩至得到一种白色固体残余物。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用64个3,6-二磺基苯基硫脲钠基团封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂、为一种白色松散固体。

                    实施例31

    3,5-二羧基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ BRI6741

将三氟乙酸(3ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(300mg；0.02ml)的无水二氯甲烷(3ml)搅拌的混悬液中并将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌2小时且然后浓缩。将残余物溶于水并使该溶液过Amberlite IR401(OH)柱并将滤液浓缩至得到一种粘性油(186mg)。将该油溶于吡啶/水的1∶1混合物(8ml)并加入异硫氰酸3,5-二羧苯基酯(450mg；2mmol)。将所得溶液在53℃下和氮气环境中加热13小时。然后将该溶液浓缩至得到一种白色固体残余物。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用64个3,6-二羧基苯基脲钠基团封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂、为一种白色松散固体。

以类似方式制备3,5-二羧基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物PAMAM4.0(EDA)BRI 6195。

                        实施例32

    4-膦酰基氧基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ BRI6181

将三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(147mg；0.01ml)的无水二氯甲烷(2ml)搅拌的混悬液中并将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌2小时且然后浓缩至得到一种粘性油。将该油溶于N,N-二甲基-N-烯丙基胺(pH9.5；5ml)并加入固体异硫氰酸4-膦酰基氧基苯基酯(250mg)。用1M碳酸钠将该所得溶液的pH调节至10并在53℃下和氮气环境中将该溶液加热3小时。然后将该溶液浓缩至得到一种白色固体残余物。将该残余物重新溶于水并使该溶液过Amberlite IR120(Na)柱且浓缩滤液。然后使该残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用64个4-膦酰基氧基苯基脲钠基团封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂、为一种白色松散固体(150mg)。

                        实施例33

        4-膦酰基苯基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂

将三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(147mg；0.01ml)的无水二氯甲烷(2ml)搅拌的混悬液中并将所得溶液在室温下和氮气环境中搅拌2小时且然后浓缩至得到一种粘性油。将该油溶于N,N-二甲基-N-烯丙基胺(pH 9.5；5ml)并加入固体异硫氰酸4-膦酰基苯基酯(250mg)。用饱和碳酸氢钠溶液将该所得溶液的pH调节至9并在53℃下和氮气环境中将该溶液加热3小时。然后将该溶液浓缩至得到一种白色固体残余物。将该残余物重新溶于水并使该溶液过Amberlite IR120(Na)柱且浓缩滤液。然后使残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用64个4-膦酰基苯基脲钠基团封端的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ BRI 6196，在冻干后得到一种白色松散固体(152mg)。

                    实施例34

    4,6-二膦酰基萘基硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0

将异硫氰酸4,6-二膦酰基萘基酯(165mg)的水(2ml)溶液加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(2ml)溶液中。用饱和碳酸氢钠溶液将该混合物的pH调节至9.5并将该混合物在室温下剧烈搅拌1小时且然后在53℃下和氮气环境中加热3小时。接着将该混合物过滤并将滤液浓缩至得到一种棕色固体残余物。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex G25；水)纯化而得到用24个4,6-二膦酰基萘基硫脲钠基团封端的PAMAM4.0，在冻干后得到一种棕色固体(81mg)。

                    实施例35

        荧光素硫脲封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)

将固体异硫氰酸荧光素酯(188mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(74mg；0.01mmol)的水(3ml)溶液中。加入饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至9并将所得的均匀溶液在室温下搅拌过夜且然后浓缩。使橙色残余物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用21个荧光素硫脲基团封端的PAMAM4.0(EDA)，在冻干后得到一种松散的橙色固体(193mg)。

                            实施例36

        (苯基-3-硼酸)硫脲钠封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0(EDA)

将固体(苯基-3-硼酸)异硫氰酸酯(100mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(2ml)溶液中。将1M碳酸钠加入到溶解的异硫氰酸酯中(pH约为10)。然后在53℃下和氮气环境中将该混合物加热2小时、接着过滤并将滤液浓缩至得到一种浅棕色固体残余物。使该粗产物通过凝胶过滤(Sephadex LH20；水)纯化而得到用32个(苯基-3-硼酸)硫脲基团封端的PAMAM4.0(EDA)，在冻干后得到一种白色松散固体(87mg)。

                实施例37

十二烷基羧酰氨基吡啶鎓封端的树枝状聚合物的制备PAMAM2.0树枝状聚合物BRI-6807

从0.5ml的MeOH溶液中蒸发出PAMAM2.0代的核(0.0479mmol；50mg)且然后将其重新溶于10ml的水。向该溶液中加入溴化12-十二酸1-N-吡啶鎓(0.14g；0.384mmol)、N-羟基苯并三唑水合物[HOBT](52mg；0.384mmol)、三乙胺(53μl；0.384mmol)和盐酸1-(3-二乙氨基丙基-3-乙基)碳化二亚胺[EDC](74mg；0.384mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压条件下使体积减少至三分之一并使该溶液在LH20柱上进行层析，用水作洗脱剂。收集含有产物的级分并通过冻干分离出溴化十二烷基羧酰胺吡啶鎓PAMAM2.0、为一种松散的白色固体。¹H nmr(D₂0):δ1.15,1.45,1.9,2.15,2.75,2.8,3.15,3.35,3.5,4.55,8.05,8.5,8,8.PAMAM4.0树枝状聚合物BRI-6809

从1.0mml的MeOH溶液中蒸发出PAMAM4.0代的核(0.05mmol；69mg)且然后将其重新溶于15ml的水。向该溶液中加入溴化12-十二酸1-N-吡啶鎓(0.143g；0.4mmol)、N-羟基苯并三唑水合物[HOBT](77mg；0.4mmol)、三乙胺(56μl；0.4mmol)和盐酸1-(3-二乙氨基丙基-3-乙基)碳化二亚胺[EDC](77mg；0.4mmol)。

将该反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压条件下使体积减少至三分之一并使该溶液在LH20柱上进行层析，用1％的三乙胺水溶液作洗脱剂。收集含有产物的级分并通过冻干分离出溴化十二烷基羧酰胺吡啶鎓PAMAM4.0、为一种松散的白色固体。使少量产物与乙酐反应而证实该树枝状聚合物核的NH₂端基被完全封端。¹H nmr(D₂O):δ1.10,1.45,1.9,2.1,2.30,2.5,2.7,3.2,4.5,8.00,8.45,8.80.

                实施例38

        糖精封端的树枝状聚合物的制备PAMAM4.0树枝状聚合物BRI-6157

向乙二胺核PAMAM4.0树枝状聚合物核(275mg；39.8μM)的无水二甲基甲酰胺(25ml)溶液中加入6-(苯并硫酰亚氨基)异硫氰酸酯(400mg；1.67mM)并将该混合物在室温下搅拌24小时。通过用碳酸钠溶液将pH调节至pH10-10.5而使浑浊溶液澄清。将该溶液再搅拌24小时并在旋转蒸发器上除去挥发性物质。将该溶液在大SephadexLH20柱上进行层析并收集前面的级分。收集剩余的级分并重新在小柱上进行层析。蒸发合并的前面的级分并冻干至得到糖精封端的树枝状聚合物产物(450mg；78％)、为一种松散的白色固体。¹H nmr(D₂O):δ2.20,2.50 3.23,3.46,3.63,7.52,7.87.

按照类似方式制备糖精封端的BHA.1ys.lys₂lys₄.lys₈.lys₁₆.lys₃₂…树枝状聚合物BRI-6189。

                    实施例39

        眼镜蛇毒液和蜂毒毒素的抑制A材料和方法细胞生物传感器显微生理测量仪(Cytosensor Mierophysiometer)方案

细胞生物传感器显微生理测量仪(CytosensorMicrophysiometer)(Molecular Devices Inc.,CA)是一种可用于间接测定体外细胞代谢率的轻便可寻址的以电位传感器为基础的装置(Parce等，1989；McConnell等，1992)。通过测定固定在微量体积流量室内部的细胞产生酸性代谢物的比率(rate)来确定代谢情况。

将人CEM细胞离心并重新悬浮于低缓冲的不含血清/不含碳酸氢盐的RPMI1640培养基(Molecular Devices，下文称作“改进的培养基”)中。以60,000-75,000个细胞/荚膜的密度将细胞接种在细胞荚膜盘(Molecular Devices)的聚碳酸酯膜(3μm孔隙度)上。使用琼脂糖截留培养基(Molecular Devices)固定细胞。将接种的细胞荚膜盘转入装有检测pH改变(和由此细胞代谢情况)的硅传感器的传感器室内。用于该组实验的细胞传感器系统包括8个独立的用于测定酸化比例的室。使改进的培养基以100-120μl/分钟的速率泵压通过细胞。来自两个储蓄器之一的流体供各细胞室用。

为了测定酸化速率，定期中断流过的改进的培养基以便累积分泌的酸性代谢物(乳酸和CO₂)。在该组实验中，使流量停止30秒，在此期间，计算适合于一段时间内电压信号改变的最小正方形的斜率即酸化速率(测定为μV/s)。使该速率数据标准化(使用加入化合物前4-5个速率点)以便直接比较来自4个室的信号。每2分钟进行一次酸化情况的测定。将室保持在37℃。

将基础酸化速率监测(不进行任何处理)至少30分钟。此后，使一定浓度范围的毒液/肽类与细胞接触达4小时的期限。选择对细胞显示出显著作用而非最大值的毒素浓度来检测一定浓度范围的BRI2923对这种毒性的抑制作用。在所有实验中，使至少一个室不与任意化合物接触、作为阴性对照。

将BRI2923溶于水并将该溶液的pH调节至7.2。将100μM-1nM的浓度加入到毒液/介质溶液中并培养6分钟(使用该设备的可能的最低培养期限)至1小时的期限且然后将其引入细胞。重复所有实验、一式三份。B结果BRI2923抑制眼镜蛇毒液

检测来自森林眼镜蛇(Najia Malenoleuca)的毒液粗品。加入到CEM细胞中的眼镜蛇毒液开始使细胞代谢增加，随后使细胞死亡(细胞裂解)。眼镜蛇毒液尤其可以破坏细胞，导致开始的代谢增加约80％，随后在第一个10分钟内快速使细胞100％死亡。开始在10、50和100μ/ml下检测毒液。将来自50μ/ml的次最大反应选作大多数实验中的检测剂量。使用两种BRI2923浓度(10^-4和10^-5M)。

在所有培养期限时(6、30和60分钟)，用50μ/ml毒液培养的10^-5MBRI2923使开始代谢率的增加从约80％下降至约5％并经过约15-20分钟延缓了细胞死亡的发作。

用50μ/ml毒液培养的10^-4MBRI2923既阻断了开始代谢率的增加又阻断了随后在这种单独毒液浓度下所观察到的细胞快速死亡。用100μ/ml毒液培养的10^-4MBRI2923也消除了开始的代谢率的增加而在洗涤掉毒液/树枝状聚合物溶液后细胞继续死亡。蛇的毒液由许多毒性成分组成，它们各自具有不同形式的毒性。眼镜蛇毒液含有以与蜂毒毒素蜂毒肽类似方式导致细胞裂解的细胞毒性肽。分离自NajiaMalenoleuca的细胞毒素的氨基酸序列表明这种毒素是高度碱性的(阳离子型)且由此可方便地被聚阴离子型化合物诸如BRI2923所失活。作为降低毒性的基础，这种静电失活得到了实验中所发现的结果的支持，所述的实验结果是6分钟的培养期与所用的30-60分钟的较长培养期具有相同结果。BRI2923抑制蜂毒肽(来自蜂毒的主要毒素)

将10^-5M-10^-7M半对数剂量范围的蜂毒肽加入到CEM细胞中。在开始不激活细胞的条件下两个最高剂量(10^-5M和5×10^-6M)在15分钟内使全部细胞死亡。10^-5M使细胞代谢率瞬时增加，随后细胞裂解，在1小时后完全裂解。5×10^-7M使裂解曲线进一步向右移动且10^-7M没有作用。重复这种剂量反应测定并将10^-6M蜂毒肽选作所用BRI2923的次最大浓度。用10^-6M蜂毒肽将一定浓度范围的BRI2923培养20分钟。10^-4M和10^-5MBRI2923完全抑制了蜂毒肽的毒性作用。10^-5MBRI2923完全阻断了蜂毒肽的毒性约30分钟且在最后30分钟的接触期间代谢率仅比对照细胞下降了约10-15％。10^-7M、5×10^-7M和10^-8M浓度的NRI2923可降低但不能预防毒性。10^-9MBRI2923对10^-6M蜂毒肽没有作用。

                            实施例40

                        HIV(AIDS)毒素的抑制介绍

Vpr是人免疫缺陷病毒(HIV-1)辅助基因产物、即14kDa的96-氨基酸蛋白质。该基因vpr在HIV-1、HIV-2中是高度保守的且Vpr基因产物最适宜HIV感染和疾病发展。(由Cullen综述，1998；Emerman&Malim,1998)。在其作用中，Vpr诱导人细胞和酵母内的编程性细胞死亡和致细胞病变(Stewart等，1997；Zhao等，1996；Macreadie等，1996)。

将Vpr蛋白质分级分离并分离了导致编程性细胞死亡的肽序列且将其命名为Vpr P3。已经发现Vpr P3可透过CD4⁺T淋巴细胞(诸如CEM细胞)并通过编程性细胞死亡而导致其死亡。下列实验使用了这种毒性Vpr肽级分P3(Arunagiri等，1997)。使用细胞传感器显微生理测量仪(Cytosensor Microphysiometer)的方法

将人CEM细胞以1400RPM离心7分钟并重新悬浮于改进的RPMI1640培养基中。然后使用琼脂糖截留培养基固定细胞并将其点在荚膜盘(Molecular Devices Ltd.,CA.)的聚碳酸酯膜中心。以约43,000-75,000个细胞/荚膜盘的密度接种细胞。将接种的荚膜盘转入装有硅传感器的传感器室内并给定在显微生理测量仪上。使改进的培养基以120μl/分钟的速率泵压通过细胞。来自两个储蓄器之一的流体供各细胞室用，该过程可使用软件指令来改变。使细胞在所述室内平衡30-60分钟或直到获得稳定的代谢率为止。在该组实验中，使流量停止30秒，在此期间，计算适合于一段时间内电压信号改变的最小正方形的斜率即酸化速率(测定为μV/s)。使该速率数据标准化(使用加入化合物前4-5个速率点)以便直接比较来自4个室的信号。每2分钟进行一次酸化情况的测定。将室保持在37℃。

对于所有实验来说，以相当于这些细胞的早期至中期对数期生长的1.3×10⁵-1.3×10⁶个细胞/ml使用CEM细胞。

将细胞固定在显微生理测量仪上并在至少30分钟的平衡期后将Vpr P3灌注入细胞室。所用Vpr P3的浓度范围是10^-5M-2×10^-5M。要求Vpr P3与细胞接触2小时以上以便全部毒性作用明显出现。

对于检测由BRI2923抑制Vpr肽毒性的实验来说，将Vpr P3肽类的培养基溶液制成合适的浓度并加入BRI2923，将溶液混合并在置于细胞传感器上之前使之平衡20-30分钟。在进行各抑制实验的同时，还使含有用于检测BRI抑制作用的相同浓度的Vpr P3的阳性对照通道以及时间对照通道运转相同的时间期限。使Vpr P3肽溶液和VprP3/BRI2923溶液与细胞接触2小时30分钟的最低期限至4小时的最高期限。此外，在洗涤掉化合物后，对细胞的代谢率进行短期监测(最少6分钟)。结果

在细胞传感器系统中，对其自身上检测的VPR P3肽在开始导致代谢率增加，随后下降且接着因CEM细胞的编程性细胞死亡而导致细胞死亡。

在附图1所示的实验中，在总量为1ml(改进的RPMI培养基)中用10^-4M(终体积)化合物BRI2923将VPR肽P3(10^-5M)预培养30分钟。然后将溶液稀释至最终体积(25ml)并灌注入细胞。由于10^-4MBRI2923溶液(酸性)和培养基(中性)的pH差异与BRI2923树枝状聚合物本身的内在缓冲作用的结合，所以在BRI2923/Vpr P3室中观察到了代谢率在开始阶段急剧下降。为了解释这种代谢率的下降，将校正因素用于所有使用BRI2923的结果。所用的校正因素是：

a)对添加到所有随后数据点的第一批数据点计算的起始下降和

b)在洗涤后以相同方式从所有点中扣除的计算的洗涤作用。

校正的示意图如附图2中所示。该结果表明10^-4M BRI2923可对由VPR P3在10^-5M下诱导的毒性作用(编程性细胞死亡)起到完全的预防作用。重复进行该实验，一式四份。

测试另外浓度的BRI2923对较高浓度的Vpr P3的作用并将结果表示在附图3和4中。BRI2923在10^-5M下还表现出对2×10^-5MVpr P3-诱导的编程性细胞死亡的抑制作用(一式三份的实验)。10^-6MBRI2923表现出明显使由2×10^-5MVpr P3产生的作用降低(一式三份的实验)。10^-7MBRI2923可将2×10^-5MVpr P3的毒性减弱至代谢率下降比率较低的程度(一式四份的实验)。

与时间对照不同，在含有BRI2923的室内的细胞没有表现出任何与时间相关的代谢率下降。预先的使用BRI2923的细胞传感器实验还提示所述的树枝状聚合物除可抑制由VPR P3导致的编程性细胞死亡外还可以提供细胞保护性作用。

                            实施例41

        测定霍乱毒素抑制作用的钙黄绿素的释放试验材料细胞系

·HPC-8人回盲肠癌上皮细胞钙黄绿素，AM

·分子探针，目录号C-1430

·C₄₆H₄₆N₂O₂₃，分子量994.87

·在小瓶中的100μl试剂级无水二甲亚砜(DMSO)中悬浮1mg至得到10mM的储备溶液。毒素

·霍乱毒素(Sigma目录号C8052)-由5个B亚单位包围的亚单位抑制剂树枝状聚合物

·测试树枝状聚合物-BRI2913和BRI2999。方法

1．在2PBS(磷酸缓冲盐水)洗涤后在2ml/75cm²烧瓶中使对数生长期的HCP-8(粘附人回盲肠癌上皮细胞系)进行胰蛋白酶消化(胰蛋白酶EDTA)。

2．将细胞与胰蛋白酶溶液培养5分钟。

3．将20ml培养基加入到烧瓶中以便使胰蛋白酶失活。

4．将细胞溶液转入50ml离心管并在室温(RT)下以1200RPM旋转7分钟。

5．在PBS中洗涤细胞并在RT下以1200RPM旋转细胞7分钟。

6．将细胞重新悬浮于PBS并计数，然后在RT下以1200RPM旋转7分钟并弃去上清液。

7．将细胞重新悬浮于1mlPBS并加入5μl钙黄绿素且在37℃下培养45分钟。

8．在PBS(约5-20ml)中洗涤细胞并重新悬浮于PBS以便得到最终数量的5×10⁵个细胞/100μl。

9．将100μl细胞溶液(5×10⁵个细胞/孔)加入到使用的含50μl霍乱毒素(溶于H₂O)和50μl树枝状聚合物溶液(制成10mM的DMSO储备溶液并用PBS稀释)的96孔平板中的各孔中。将各浓度重复四次。

10．在37℃下和5％CO₂培养箱中将平板培养2小时。

11．收集上清液并进行荧光测定分析。结果

进行预实验。列出的所有结果是三次重复实验的平均荧光强度。

	荧光强度(FI)	霍乱毒素的抑制％
			0.3mg/ml霍乱毒素100μM BRI2923100μMBRI2999	72.16659.5	0％8.5％17.5％
0.15mg/ml霍乱毒素100μMBRI2923100μMBRI2999	65.86159.4	0％7.3％9.7％
			自发的钙黄绿素释放(SR)	26.8

抑制％=100-(FI_毒素+树枝状聚合物/FI_毒素×100)

参考文献Arunagiri,C.K.,Macreadie,I.G.,Hewish,D.R.和Azad,A.A.(1997):“HIV-1辅助蛋白Vpr的C-末端结构域涉及人CD⁺淋巴细胞的透过、线粒体功能障碍和编程性细胞死亡”-《编程性细胞死亡》(Apoptosis)2,69-76；Cullen.B.R.(1998):HIV-1辅助蛋白：与垂死细胞发生关系-《细胞》(Cell)93,685-692；Emerman,M.和Malim,M.H.(1998)HIV-1调节/辅助基因：不明病毒和宿主细胞生物学的关键-《科学》(Science),280,1880-1883；McConnell,H.K.,Owicki,J.C.,Parce,J.W.,Miller,D.L.,Baxter,G.T.,Wada,H.G.和Pitchford,S.(1992)：“细胞传感器显微生理测量仪(Cytosensor Microphysiometer)：硅技术的生物应用”-《科学》(Science),257,1901-1912；Macreadie,I.G.,Arunagiri,C.K.,Hewish,D.R.White,J.F.和Azad,A.A.(1996)：“胞外添加含有氨基酸序列基元H(S/F)RIG的HIV-1Vpr结构域可导致细胞膜透化和死亡”-《分子微生物学》(Mol.Microbiol)19(6),1185-1192；Parce,J.W.,Owicki,J.C.,Kercso,K.M.,Sigal,G.B.,Wada,H.G.,Muir,V.C.,Bousse,L.J.,Ross,K.L.,Sikic,B.I.和McConnell,H.M.(1989)：“使用硅传感器检测影响细胞的活性剂”-《科学》(Science),246,243-247；Stewart,S.A.,Poon,B.Jowett,J.B.M.和Chen,I.S.(1997)：“人免疫缺陷l型病毒诱导细胞循环抑制后的编程性细胞死亡”-《病毒学杂志》(J.Virol.)71,5579-5592；Zhao,Y.,Cao,J.,O’Gorman,M.R.G.,Yu,M.和Yogev,R.(1996)：“人免疫缺陷1型蛋白质R(Vpr)基因表达对裂殖酵母粟酒裂殖糖酵母的基本细胞功能的作用”-《病毒学杂志》(J.Virol.)70,5821-5826。

Claims (14)

1．一种预防性或治疗性抑制人或非人的动物患者体内毒物或毒性物质的方法，该方法包括对所述患者给予有效量的带有多个端基的树枝状聚合物的步骤，其中至少一个所述端基带有与之结合或连接的含阴离子或阳离子的部分。

2．一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物是树枝状聚合物，它包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核并通过至少两代扩展。

3．一种根据权利要求2所述的方法，其中所述的树枝状聚合物是基于氨核的聚酰氨基胺树枝状聚合物。

4．一种根据权利要求2所述的方法，其中所述的树枝状聚合物是基于乙二胺核的聚酰氨基胺树枝状聚合物。

5．一种根据权利要求2所述的方法，其中所述的树枝状聚合物是基于二苯甲基胺核或其它合适核的聚赖氨酸树枝状聚合物。

6．一种根据权利要求2所述的方法，其中所述的树枝状聚合物是聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物。

7．一种根据权利要求2所述的方法，其中所述的化合物是下列通式Ⅰ的聚离子型树枝状聚合物：

其中：

I是引发剂核；

Z是内部支化单元；

n是代表所述树枝状聚合物代数的整数；

且

A是可以通过任选的连接基团X与内部支化单元Z连接的含阴离子或阳离子的部分。

8．一种根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中在所述的化合物中，所述含阴离子或阳离子的部分或多个部分通过酰胺或硫脲键与胺、硫氢基、羟基或其它反应性端基结合。

9．一种根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中在所述的化合物中，所述含阴离子或阳离子的部分选自下列部分组成的组：含磺酸的部分、含羧酸的部分(包括含神经氨酸和唾液酸的部分和含修饰的神经氨酸和唾液酸的部分)、含硼酸的部分、含磷酸和膦酸的部分(包括含酯化的磷酸和膦酸的部分)、含伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基的部分、含吡啶鎓的部分、含鈲盐的部分、含脒鎓的部分、含苯酚的部分、具有酸性或碱性氢的杂环、和含两性离子的部分。

10．一种根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中在所述的化合物中，与树枝状聚合物氨基或其它的反应性端基结合的部分或多个部分选自下列基团组成的组，其中n是0或正整数：

-NH(CH₂)_nSO₃ ^-     -(CH₂)_nSO₃ ^-         -Ar(SO₃ ^-)_n

-CH₂CH(SO₃ ^-)COOH  -CH(SO₃ ^-)CH₂COOH    -ArX(CH₂)_nSO₃ ^- X=O,S,NH

-ArXP(=O)(OR)₂      X=O,CH₂,CHF,CF₂    R=烷基，芳基，H,Na-ArXP(=O)(OR₁)(NR₂R₃)X=O,CH₂,CHF,CF₂   R¹=烷基，芳基，H,Na R²,R³=烷基，芳基-Ar[p(=O)(OR)₂]_n    R=烷基，芳基，H,Na n=1-3-Ar[B(OH)₂]_n        n=1-3              -Ar[COOH]_n    n=1-3 R=烷基或芳烷基；R₁、R₂、R₃(可以相同或不同)=烷基或芳烷基

11．一种根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述的化合物选自下列物质组成的组：

1．烷基磺酸封端的树枝状聚合物；

2．磺基乙酰胺封端的树枝状聚合物；

3．磺基琥珀酰胺酸封端的树枝状聚合物；

4．N-(2-磺基乙基)琥珀酰胺封端的树枝状聚合物；

5．4-磺基苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

6．3,6-二-磺基萘基硫脲封端的树枝状聚合物；

7．4-磺基萘基硫脲封端的树枝状聚合物；

8．3,5-二-磺基苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

9．3,6,8-三-磺基萘基硫脲封端的树枝状聚合物；

10．4-(磺基甲基)苯甲酰胺封端的树枝状聚合物；

11．4-磺基苯甲酰胺封端的树枝状聚合物；

12．N-(4-磺基苯基)丙酰胺封端的树枝状聚合物；

13．4-磺基苯基脲封端的树枝状聚合物；

14．N,N,N-三-甲基甘氨酰胺封端的树枝状聚合物；

15．4-三甲基铵苯甲酰胺封端的树枝状聚合物；

16．4-(三甲基铵甲基)苯甲酰胺封端的树枝状聚合物；

17．N-(2-乙酰氧基乙基)-N,N-(二甲基铵)甲基-羧酰胺封端的树枝状聚合物；

18．胍基封端的树枝状聚合物；

19．4-([1,4,8,11-四氮杂环十四烷]甲基)苯甲酰胺封端的树枝状聚合物；

20．4-羧基-3-羟基-苄胺封端的树枝状聚合物；

21．4-羧基苯基酰胺封端的树枝状聚合物；

22．3,5-二羧基苯基酰胺封端的树枝状聚合物；

23．4-膦酰基氧基苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

24．4-(膦酰基甲基)苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

25．乙基-4-(膦酰基甲基)苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

26．(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的树枝状聚合物；

27．(11-十一酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的树枝状聚合物；

28．(乙酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的树枝状聚合物；

29．(4-丁酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的树枝状聚合物；

30．(4-甲基苯甲酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的树枝状聚合物；

31．(8-辛酰氨基)-4-叠氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的树枝状聚合物；

32．(8-辛酰氨基)-4-氨基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脱氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的树枝状聚合物；

33．4-苯甲酰氨基硼酸封端的树枝状聚合物；

34．3,5-二羧苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

35．4-膦酰基氧基苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

36．4-膦酰基苯基硫脲封端的树枝状聚合物；

ⅹⅹⅹⅶ．4,6-二膦酰基萘基硫脲封端的树枝状聚合物；

ⅹⅹⅹⅷ．荧光素硫脲封端的树枝状聚合物；

ⅹⅹⅹⅸ．(苯基-3-硼酸)-硫脲封端的树枝状聚合物；

xl．十二烷基羧酰胺吡啶鎓封端的树枝状聚合物；和

xll．糖精封端的树枝状聚合物。

12．一种根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中所述的治疗包括抑制生物来源的毒素和毒性肽类或在细菌、原生动物、真菌或病毒感染过程中释放的毒素和毒性肽类。

13．一种用于预防性或治疗性抑制人或非人的动物患者体内毒物或毒性物质的药物组合物或兽药组合物，它包括如权利要求1-11中任意一项所定义的阴离子型或阳离子型树枝状聚合物以及至少一种药物上或兽药上可接受的载体或稀释剂。

14．如权利要求1-11中任意一项所定义的阴离子型或阳离子型树枝状聚合物在预防性或治疗性抑制人或非人的动物体内毒物或毒性物质，或在制备用于预防性或治疗性抑制人或非人的动物体内毒物或毒性物质的药物中的用途。

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