CN102743411A - 聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用 - Google Patents
聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102743411A CN102743411A CN2012102590517A CN201210259051A CN102743411A CN 102743411 A CN102743411 A CN 102743411A CN 2012102590517 A CN2012102590517 A CN 2012102590517A CN 201210259051 A CN201210259051 A CN 201210259051A CN 102743411 A CN102743411 A CN 102743411A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- mice
- pamam
- mouse
- esbls
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2.0-4.0代聚酰胺胺型树枝状大分子。本发明所涉及的聚酰胺胺型树枝状大分子用于预防或治疗脓毒血症具有药效显著、毒性低的优势，可显著延长患者的生存时间，提高生存率，减轻脏器损伤。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化合物的新用途，特别涉及聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用。
背景技术
脓毒血症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS），临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶。虽然脓毒血症是由感染引起，但是一旦发生后，其发生发展遵循其自身的病理过程和规律，故从本质上讲脓毒血症是机体对感染性因素的反应。
脓毒血症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒血症病例，美国每年有75万例脓毒血症患者，并且这一数字还以每年1.5%～8.0%的速度上升。脓毒血症的病情凶险，病死率高，全球每天约14,000人死于其并发症，美国每年约21.5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒血症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒血症的病死率仍高达30%～70%。另外，脓毒血症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。
脓毒血症的根本发病机制尚未明了，涉及到复杂的全身炎症网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关。目前对脓毒血症的治疗还没有根本性突破，原因在于脓毒血症的发病根本机制仍未能阐明。因此针对脓毒血症的治疗仍然更多集中于纠正脓毒血症引起的病理生理后果上。脓毒血症发病机制的复杂性在于感染导致释放的炎症介质通过神经-内分泌-免疫系统动员了全身多种细胞和多个脏器系统，构成了复杂的网络机制，这一系统具有级联放大、相互制约的特点，寻找在这个网络结构中的关键平衡点进行免疫调理可能会对脓毒血症的治疗带来新的突破。
聚酰胺-胺（polyamidoamine, PAMAM）是一种人工合成的纳米级大分子化合物，由于具有单分散性、内部空腔及表面丰富的可修饰基团等独特结构优势，PAMAM在生物医药领域，如基因药物载体、助溶剂、高效催化剂及纳米材料等方面，有非常广泛的应用和研究。PAMAM-NH2合成方法成熟，目前市售有G1.0-G10.0等数十种，随着代数的增加，PAMAM纳米尺寸、末端氨基数目、形状和结构特征也会随之变化。
目前，现有技术没有关于聚酰胺胺型树枝状大分子预防或治疗脓毒血症的文献报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过大量试验对聚酰胺胺型树枝状大分子（PAMAM-NH2）进行体外活性研究，提供一种聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的新用途。
本发明创造性地分别用ESBLs-EC菌悬液、ESBLs-EC和MRSA混合菌悬液，通过腹腔注射构建两种BALB/c脓毒血症感染模型，第一次证实10+10 mg/kg和20 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2可显著提高BALB/c小鼠的生存率，延长小鼠生存时间，改善小鼠生存质量。令人振奋的是，在两种脓毒血症模型中，同时观察到10+10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2组治疗效果明显优于20 mg/kg 组，表明多次低剂量给药优于单次高剂量给药，且提前给药可明显预防感染。这可能与药物在体内的吸收、代谢、分布和消除有关。
另外，本发明人通过腹腔注射G2.0观察 BALB/c小鼠急性毒性反应，并第一次证实G2.0 PAMAM-NH2的半数致死剂量为84.04 mg/kg， 小鼠最大耐受量在30-47 mg/kg，至少是体内给药剂量（10-20 mg/kg）的1.5-3倍。
因此，根据上述研究结果，发明人提供了聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2.0-4.0代聚酰胺胺型树枝状大分子。
优选地，所述脓毒血症是感染耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA或/和产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌ESBLs-EC后引起的脓毒血症。
进一步优选地，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2.0代聚酰胺胺型树枝状大分子。
本发明所涉及的聚酰胺胺型树枝状大分子用于预防或治疗脓毒血症具有如下优势：
（1）药效显著。具体表现在：ESBLs-EC 所致的BALB/c 小鼠败血症模型实验中，10+10 mg/kg和20 mg/kg组G2.0 PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间，提高生存率，降低小鼠血液CFU计数，明显减轻小鼠肺脏和肝脏损伤，且前者给药方式显著优于后者，提示多次低剂量给药效果好于单次高剂量给药。ESBLs-EC和MRSA所致的BALB/c 小鼠败血症模型实验中，10+10 mg/kg和20 mg/kg组G2.0 PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间，提高生存率，且前者给药方式显著优于后者，提示多次低剂量给药效果好于单次高剂量给药，且提前给药可预防感染。
（2）毒性低。体内急性毒性评价结果表明，G2.0 PAMAM-NH2体内生物相容性较好，腹腔注射对BALB/c小鼠半数致死剂量为84.04 mg/kg，高剂量对小鼠的脏器损伤主要表现为不同程度微血栓的形成。
附图说明
图1： BALB/c小鼠肺脏、脾脏、肝脏、肾脏和心脏的HE染色结果图（放大倍数，×200）；其中：（A-E）为正常对照组；（A’-E’）腹腔注射G2.0 PAMAM-NH2180 mg/kg 1 h后小鼠脏器HE染色组；（A”-E”）为腹腔注射G2.0 PAMAM-NH2 400 mg/kg 1 h后小鼠脏器HE染色组。
图2： G2.0 PAMAM-NH2 体内抗感染治疗效果图；其中：（A）BALB/c小鼠腹腔注射ESBLs-EC (7.12×105 CFU)后，分别给予腹腔注射G2.0 PAMAM-NH2 10 mg/kg (●)，20 mg/kg (▲), or 10+10 mg/kg (◆) (感染前12 h 和感染后0.5 h分别给予10 mg/kg)，对照组给予腹腔注射氨苄西林20 mg/kg (*)，模型组给予不含药物的稀释液(■)；(B) 感染7天后BALB/c 小鼠的生存率. *P<0.05, **P<0.01与模型组相比；#P<0.05, ##P<0.01与氨苄西林组相比(n = 12只/组)。
图3： BALB/c 小鼠血液中ESBLs-EC的平板克隆计数图；BALB/c 小鼠腹腔注射ESBLs-EC后12 h，尾静脉取血倍比稀释，涂布于琼脂平板，37°C培养24 h后计数CFU.“—”表示每组CFU的平均数（n=6只/组），*P<0.05, **P<0.01 与模型组相比。
图4： BALB/c小鼠肺脏的HE染色结果图（放大倍数，×200）；其中：（A）正常对照组；（B）模型组；（C）20 mg/kg 氨苄西林组；（D）10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2; (E) 20 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2; (F) 10+10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2（感染前12 h 和感染后0.5 h分别给予10 mg/kg）。
图5 ：BALB/c小鼠肝脏的HE染色结果图（放大倍数，×200）；其中：（A）正常对照组；（B）模型组；（C）20 mg/kg 氨苄西林组；（D）10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2；(E) 20 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2；(F) 10+10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2（感染前12 h 和感染后0.5 h分别给予10 mg/kg）。
图6 ：G2.0 PAMAM-NH2 体内抗感染治疗效果图。其中：（A）BALB/c小鼠腹腔注射ESBLs-EC (8.02×105CFU)和MRSA（6.56×108CFU）后，分别给予腹腔注射G2.0 PAMAM-NH2 10 mg/kg (●), 20 mg/kg (▲), or 10+10 mg/kg (◆) (感染前12 h 和感染后0.5 h分别给予10 mg/kg); 对照组给予腹腔注射氨苄西林20 mg/kg (*); 模型组给予不含药物的稀释液(■).(B) 感染7天后BALB/c 小鼠的生存率(n = 10只/组). *P<0.05, **P<0.01与模型组相比; #P<0.05与氨苄西林组相比。
具体实施方式
本发明创造性地通过试验对聚酰胺胺型树枝状大分子（PAMAM-NH2）进行体内活性研究，为PAMAM-NH2开发成新一代的临床抗菌药物奠定了基础。以下以G2.0 PAMAM-NH2为例，研究其毒性及其治疗小鼠脓毒血症模型的疗效。
实施例1： G2.0 PAMAM-NH
2
的毒性研究及其治疗小鼠脓毒血症模型的试验研究
1，材料和方法
1.1， 实验菌株
ESBL-EC和MRSA菌株（见表1）用于本部分实验。
表1试验所用的2株耐药菌株
| 中文名称 | 英文名称 | 英文缩写 |
| 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 | methicillin resistant S. aureus XJ75302 | MRSA |
| 产ESBLs的大肠杆菌 | ESBLs-producing E. coli ATCC 35218 | ESBLs-EC |
1.2， 实验动物
无特殊病原体的BALB/c，雌雄各半，18-22 g，购自第四军医大学实验动物管理中心。本研究所有动物实验均符合第四军医大学动物管理中心和伦理委员会相关规定。
1.3， 试剂和药品
G2.0 PAMAM-NH2 (10.04% w/w 水溶液) 购自美国Dendritech公司；营养肉汤培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；牛血清白蛋白（BSA）；购自美国Gibico公司；乙酸、无水乙醇、甘油、石蜡、二甲基亚砜、二甲苯和甲醛等分析纯试剂购自天津试剂公司。抗生素氨苄西林购自中国药品生物制品检定所。
1.4 ，主要溶液配方
营养肉汤培养基：1.9 g营养肉汤干粉，加入100 mL冷蒸馏水混匀，静置10 min，微火煮沸（隔石棉铁丝网或磁力加热搅拌器），待干粉完全溶解后，高压灭菌121℃，20 min。
PBS缓冲液：准确称量KCl 0.2 g, KH2PO4 0.24 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4 ·2H2O 1.56 g, 加入100 mL去离子水充分溶解后，调pH到7.4，定容100 mL后分装， 高压灭菌121℃，20 min，即为0.1M PBS母液。将其用无菌水稀释10倍，即为0.01M PBS溶液，现用现配。
2，方法
2.1， 小鼠急性毒性实验
观察受试药品依次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况，详细记录小鼠的中毒表现，并采用改良寇氏法（Karber氏法）计算半数致死量（LD50）或最大耐受量，用以评价药物的安全性。
2.1.1动物准备：BALB/c小鼠，雌雄各半，18-20 g，饲养于代谢笼内，给予自由饮水，普通颗粒饲料喂养。动物实验室环境湿度50%±10%，早6点到晚6点进行12 h照明，其余时间为黑暗，温度23±2℃，适应饲养2 d后，随机分组。
2.1.2，预实验：取健康BALB/c小鼠，每组5只，通过腹腔注射给药，观察小鼠死亡情况至少7天，找到100%（LD100）及0%（LD0）小鼠死亡的剂量。
2.1.3， LD 50 测定：根据预实验结果确定剂量和分组数，按照公式2-1计算从高到低相邻两个剂量组的等比系数r，
2.1.4，药物等比稀释：以每20 g体重小鼠腹腔注射体积0.4 mL计算，按照LD100剂量制备100 mL，取出部分作为LD100剂量组用药，再用PBS（0.01M）稀释剩余药液作为下一剂量组用药，依次类推，稀释至LD0剂量组用药为止。
2.1.5，给药及观察：按照剂量分组，腹腔注射给药后，24 h内严密观察小鼠，记录中毒表现和死亡情况，随后持续观察一周。解剖死亡小鼠，完整取出心、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠及脑组织，用生理盐水冲洗干净后，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，组织包蜡后切片，做HE染色观察脏器损伤。
2.1.6，HE染色：将固定好的组织经70%、80%、90、95%、95%、100%、100%酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡等过程制成蜡块后，行5 μm 厚度切片，粘片，烘烤后进行以下脱蜡至水及染色步骤。① 脱蜡至水步骤：二甲苯Ⅱ脱蜡5min；二甲苯Ⅲ脱蜡5 min；无水乙醇浸洗 1 min；95%乙醇Ⅰ浸洗 1 min； 95%乙醇Ⅱ浸洗 1 min；80%乙醇浸洗1 min；自来水冲洗3-5 min；② 染色步骤： 组织切片脱蜡至水(见上)；Harris苏木精液3-5 min；自来水洗 1 min；75%盐酸乙醇液分化数秒钟；自来水流水冲洗5 min至细胞核呈蓝色；0.5%伊红水溶液1 min； 95%乙醇Ⅰ、乙醇Ⅱ依次脱水 1 min；无水乙醇Ⅰ、乙醇Ⅱ依次脱水1 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次透明1 min；中性树胶封固，显微镜下观察组织特征。
2.2 ，G2.0 PAMAM对ESBLs-EC所致BALB/c小鼠脓毒血症的治疗
2.2.1 ，动物准备：BALB/c小鼠，雄性，18-20 g，饲养于代谢笼内，给予自由饮水，普通颗粒饲料喂养。动物实验室环境湿度50%±10%，早6点到晚6点进行12 h照明，其余时间为黑暗，温度23±2℃，适应饲养2 d后，随机分组，每组16只。
2.2.2， 菌液制备：分别从生长ESBLs-EC的琼脂平板上，挑取单克隆菌落，接种于3 mL新鲜无菌营养肉汤中，37℃培养16-18 h后，用营养肉汤倍比稀释，涂布于琼脂平板，其余菌液置于4℃冰箱保存。根据次日平板菌落计数结果，计算菌液浓度，按照实验预定的浓度，用营养肉汤稀释菌液，备用。
2.2.3 ，细菌致BALB/c小鼠100%死亡的最小剂量确定：将新鲜培养的ESBLs-EC 用营养肉汤10倍比稀释成5个浓度，每一浓度腹腔注射感染4只小鼠，观察动物死亡状况。通过预实验确认ESBLs-EC 在1~2d 导致BALB/c 小鼠100%死亡的最小菌量是7.12×105 CFU，即腹腔注射ESBLs-EC悬液1.78×106 CFU/mL，400 μL/20 g。
2.2.4 ，药物稀释和治疗剂量的选择： G2.0用无菌0.2%BSA溶液（含0.01%乙酸）稀释备用；预实验设三个剂量组，每组4只动物，找到合适的药物剂量浓度，即高剂量可保护50%以上的感染动物，低剂量组不低于80%的感染动物死亡。
2.2.5， 实验分组及处理：80只小鼠随机分为5组，每组16只，每只小鼠均腹腔注射ESBLs-EC悬液，每组分别给予不同的处理：① 模型组：腹腔注射等量无菌0.2%BSA（含0.01%乙酸）稀释液；② 治疗药物20 mg/kg：细菌感染后0.5 h腹腔注射给予治疗药物20 mg/kg；③ 治疗药物10 mg/kg：细菌感染后0.5 h腹腔注射给予治疗药物10 mg/kg；④治疗药物10+10 mg/kg：细菌感染前12 h和感染后0.5 h分别腹腔注射给予治疗药物10 mg/kg；⑤ 氨苄西林治疗组：腹腔注射氨苄西林20 mg/kg。每组取12只BALB/c小鼠连续观察7天，记录死亡情况。
2.2.6， 全血CFU计数和组织切片：感染12 h后，每组6只小鼠经尾穿刺静脉取血后处死。每只小鼠取0.1 mL血样进行10倍比稀释，吸取100 μL稀释菌液均匀涂布于M-H琼脂培养基表面，37℃恒温孵育24 h，计数CFU。小鼠处死后，剪开小鼠腹腔，完整取出心、肝、脾、肺、肾，用生理盐水冲洗后，浸泡于4%多聚甲醛固定液中24 h。组织包蜡后切片，以备做HE染色。
2.3， G2.0 PAMAM对ESBLs-EC和MRSA混合感染所致BALB/c小鼠脓毒血症的治疗
2.3.1 ，动物准备：BALB/c小鼠，雄性，18-20 g，饲养于代谢笼内，给予自由饮水，普通颗粒饲料喂养。动物实验室环境湿度50%±10%，早6点到晚6点进行12 h照明，其余时间为黑暗，温度23±2℃，适应饲养2 d后，随机分组，每组16只。
2.3.2， 菌液制备：分别从生长ESBLs-EC和MRSA的琼脂平板上，挑取单克隆菌落，接种于3 mL新鲜无菌营养肉汤中，37℃培养16-18 h后，用营养肉汤倍比稀释，涂布于琼脂平板，其余菌液置于4℃冰箱保存。方法同2.2.2部分。
2.3.3， 细菌致BALB/c小鼠100%死亡的最小剂量确定：预实验结果表明ESBLs-EC和MRSA混合感染导致BALB/c小鼠100%死亡的最小菌量是4.02× 105 CFU ESBLs-EC和6.56 × 108 CFU MRSA，即腹腔注射含有1× 106 CFU/mL ESBLs-EC和1.64 × 109 CFU/mL MRSA的混合菌液，400 μL/20 g。
2.3.4 ，药物稀释和治疗剂量的选择：G2.0用无菌0.2%BSA溶液（含0.01%乙酸）稀释备用；预实验设三个剂量组，每组4只动物，找到合适的药物剂量浓度，即高剂量可保护50%以上的感染动物，低剂量组不低于80%的感染动物死亡。
2.3.5 ，实验分组及处理：80只小鼠随机分为5组，每组16只，每只小鼠均腹腔注射ESBLs-EC悬液，每组分别给予不同的处理：① 模型组：腹腔注射等量无菌0.2%BSA（含0.01%乙酸）稀释液；② 治疗药物20 mg/kg：细菌感染后0.5 h腹腔注射给予治疗药物20 mg/kg；③ 治疗药物10 mg/kg：细菌感染后0.5 h腹腔注射给予治疗药物10 mg/kg；④治疗药物10+10 mg/kg：细菌感染前12 h和感染后0.5 h分别腹腔注射给予治疗药物10 mg/kg；⑤ 氨苄西林治疗组：腹腔注射氨苄西林20 mg/kg。每组取12只BALB/c小鼠连续观察7天，记录死亡情况。
2.4，结果观察与统计分析：
体内抗菌实验结果经SPSS软件Kaplan-Meier 生存分析，其余结果经SPSS单因素方差分析和Student’s t 检验，P<0.05认为具有统计学差异。
3，结果
3.1， 腹腔注射G2.0致BALB/c小鼠急性毒性
3.1.1， 小鼠急性毒性实验：体外细胞毒性结果表明G2.0 PAMAM-NH2的毒性较小，为了全面评价其毒性，我们通过腹腔注射BALB/c小鼠，测定了G2.0 PAMAM-NH2半数致死剂量（LD50）。预实验观察到小鼠100%（LD100）及0%（LD0）死亡的剂量分别是180 mg/kg和30 mg/kg。实验设计分5组，根据公式2-1计算等比系数r为1.565。按照等比系数计算各分组剂量分别为30、47、73.5、115和180 mg/kg。每组小鼠10只，给予一次腹腔注射，连续观察一周，记录死亡情况（见表2）。
A,小鼠中毒症状：我们实验发现，180 mg/kg组给药后10 min，一雌一雄共2只小鼠发生严重抽搐，眼球凸出，尾巴僵直，大小便失禁，给药15 min后震颤死亡；另有1只小鼠后肢瘫痪，其他几只无攻击性，畏寒发抖，2小时之后10只小鼠全部死亡。30 mg/kg组给药后无明显症状，小鼠精神状态活跃，饮食饮水正常；47 mg/kg组给药后，小鼠发抖，有嗜睡现象，72 h后死亡1只；73.5 mg/kg组给药后部分小鼠精神萎靡，20 h后死亡1只；115 mg/kg组给药后，部分小鼠呼吸急促，畏寒发抖，3 h后死亡1只，60 h 后死亡2只。观察一周，统计结果见表2。
表2腹腔注射G2.0 PAMAM-NH2 后BALB/c小鼠死亡率
B,统计并计算实验结果：根据表2结果和公式2-2、2-3和2-4计算各指标。计算得知LD50为84.04 mg/kg，logLD50的标准误SX50为0.0567，LD50的可信区间为65.07-108.52 mg/kg，LD50的平均可信区间为84.04±21.72 mg/kg。
① 改良寇氏法计算半数致死量：
（logLD50）X50=Xm－i（∑P－0.5）
则LD50=log－1 X50 公式2-2
Xm：最大剂量的对数（log180=2.2553）；P：各组动物的死亡率，用小数表示；∑P：各组动物死亡率的总和；i：相邻两组剂量对数值之差，即log180－log115=0.1946。
② logLD50的标准误SX50：
SX50=i×
公式2-3
n：每组动物只数。
③ LD50的可信区间：
LD50的95%可信区间=lg-1（X50±1.96SX50） 公式2-4
LD50的平均可信区间=LD50 ±（LD50高限-LD50低限）/2 公式2-5 。
C．小鼠脏器HE染色观察：HE染色结果显示，小鼠腹腔注射180 mg/kg和400 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2后，小鼠各脏器（心、肝、脾、肺、肾）均有微血栓形成，400 mg/kg处理组小鼠脏器可见明显的血管内凝血和出血，这提示PAMAM对小鼠急性毒性表现为多脏器损伤，其中肝脏、肾脏最为严重，肺脏损伤较轻，仅见纤维结缔组织轻度增生，血栓形成较少见（见图1）。该结果进一步表明高浓度的G2.0 PAMAM-NH2可能导致小鼠发生急性弥漫性血管内凝血，系统性血栓-凝血紊乱可能是致小鼠急性中毒死亡的主要原因。
3.2， G2.0对ESBLs-EC 所致的BALB/c小鼠脓毒血症的治疗作用
3.2.1，BALB/c小鼠造模后观察： BALB/c小鼠腹腔感染ESBLs-EC后，1 h即可内出现毒血症症状。主要表现为精神萎靡、不思饮食和饮水；畏寒、寒战，继而出现高热，伴有不规则颤抖；小鼠四肢末梢厥冷，呼吸急促，心率加快，血压下降；有出汗，但出汗后症状不见缓解； 模型组BALB/c小鼠24 h内全部死亡。
3.2.2，BALB/c 小鼠生存时间和生存率的测定：小鼠腹腔注射ESBLs-EC 混悬液构建败血症模型，给予小鼠不同浓度的G2.0 PAMAM-NH2，连续观察7天，记录小鼠的生存时间。
① 模型组和氨苄西林组：24 h内模型组和氨苄西林治疗组小鼠全部死亡，存活率为0%，表明高剂量氨苄西林对ESBLs-EC感染小鼠没有任何疗效（P > 0.05，见图2（A））。
② G2.0 PAMAM-NH2单次给药治疗组：结果发现，单次给予10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2，不能有效改善小鼠生存状况，24 h内死亡小鼠9只，生存分析结果与模型组和氨苄西林组小鼠无统计学差异；而单次给予20 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2，可明显延长小鼠生存时间，改善小鼠脓毒血症症状，感染后7 d，小鼠存活率41.67%，与模型组和氨苄西林组比较有统计学差异（P<0.05，见图2（A））。
③ G2.0 PAMAM-NH2 10+10 mg/kg治疗组： 感染前和感染后分别给予10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2 可完全保护小鼠，7 d之内小鼠零死亡，存活率100%，与模型组和氨苄西林组比较有显著差异（P<0.01，见图2（B））。结果提示，多次低剂量给药抗感染疗效明显优于单次高剂量给药，提前给药可预防感染，增强小鼠抵抗力，这可能与G2.0 PAMAM-NH2的体内代谢，分布有关。
3.2.3，感染小鼠全血CFU计数：感染后12 h，我们检测了各处理组小鼠血液CFU计数，琼脂平板菌落计数结果与小鼠生存曲线及生存率结果一致（见图3）。模型组与氨苄西林组小鼠全血CFU计数均大于107，明显高于其他3组；10 mg/kg、20 mg/kg、10+10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2治疗12 h后，小鼠血液培养物CFU计数显著下降，分别为7.47×106（与模型组和氨苄西林组比较P<0.05）、1.17×106 和 6.16×104（与模型组和氨苄西林组比较P<0.01）（见图3）。结果表明多次低剂量（10+10 mg/kg）给予G2.0 PAMAM-NH2，可持续抑制和杀灭体内细菌，提高脓毒血症小鼠的生存率。
3.2.4，感染小鼠肺脏组织的HE染色观察：ESBLs-EC感染BALB/c小鼠12 h后，各处理组小鼠肺脏HE染色观察，结果与整体动物生存率结果保持一致（见图4）.A为正常BALB/c 小鼠的肺脏HE 染色；B为ESBLs-EC 感染模型组；C 为ESBLs-EC 感染后给予20 mg/kg 氨苄西林治疗组；D-F分别为ESBLs-EC 感染后，给予10 mg/kg、20 mg/kg和10+10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2治疗组。
① 正常组和模型组：正常小鼠肺组织可见大量半球形小囊状肺泡，相邻肺泡紧密相贴，仅隔薄层肺泡隔肺泡壁很薄，有基膜，见图4（A）；而模型组肺脏严重充血、出血，肺泡壁明显增厚，炎性细胞浸润，成纤维细胞增生，肺泡腔变窄或消失，支气管及动脉周围间质显著增宽，结缔组织增生，有大量炎性细胞浸润，肺泡腔中有淡红的浆液渗出，混有少量淋巴细胞和脱落的肺泡上皮细胞，表现为弥散性急性肺炎，见图4（B）。
② 氨苄西林组：与模型组肺组织非常相似，可见肺泡结构消失，肺组织坏死液化，大量中性白细胞及脓球积聚，支气管及动脉周围间质显著增宽，结缔组织增生，有大量炎性细胞浸润，表明高剂量氨苄西林不能抑制ESBLs-EC 对小鼠肺脏的损伤，见图4（C）。
③ 药物治疗组：10 mg/kg和20 mg/kg治疗组肺脏损伤程度剂量依赖性减轻。10 mg/kg 组可观察到大量融合的肺泡结构，大量中性粒细胞浸润，见图4（D）；20 mg/kg组可见部分融合的肺泡结构，肺泡间隔增厚，中性粒细胞浸润，见图4（E）；10+10 mg/kg组和正常对照组的肺组织相似，可见到正常的肺泡结构，仅有少量融合，肺泡壁略有有增厚，见图4（F）。说明10+10 mg/kg 组治疗效果明显优于其他给药组，可显著抑制ESBLs-EC对小鼠肺脏的损伤。
3.2.5，感染小鼠肝脏组织的HE染色观察：ESBLs-EC感染BALB/c小鼠12 h后，各处理组小鼠肝脏HE染色观察，结果与整体动物生存率保持一致（见图5）A为正常BALB/c 小鼠的肺脏HE 染色；B为ESBLs-EC 感染模型组；C 为ESBLs-EC 感染后给予20 mg/kg 氨苄西林治疗组；D-F分别为ESBLs-EC 感染后，给予10 mg/kg、20 mg/kg和10+10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2治疗组。与正常组相比，模型组和氨苄西林组小鼠肝组织损伤严重，有大量血栓形成，有炎细胞侵润，肝细胞有不同程度的变性和肿胀，枯否细胞增生；10 mg/kg和20 mg/kg治疗组肝脏损伤程度呈剂量依赖性减轻；10+10 mg/kg组和正常对照组的肝脏组织相似，可见到正常的肝细胞，仅有少量血栓，说明10+10 mg/kg 组治疗效果明显优于其他给药组，可显著抑制ESBLs-EC对小鼠肝脏的损伤。
3.3 ，G2.0对ESBLs-EC和MRSA混合感染致BALB/c小鼠脓毒血症的治疗
小鼠腹腔注射ESBLs-EC和MRSA混悬液构建败血症模型，给予小鼠不同浓度的G2.0 PAMAM-NH2，连续观察7天，记录小鼠的生存时间。
① 模型组和氨苄西林组：24 h内模型组小鼠全部死亡，存活率为0%；氨苄西林组仅存活1只，与模型组没有显著差异，表明高剂量氨苄西林对ESBLs-EC和MRSA混合感染小鼠没有任何疗效，见图6（A）。
② G2.0 PAMAM-NH2单次给药治疗组：结果发现，单次给予10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2，不能有效改善小鼠生存状况，24 h内死亡小鼠7只存活3只，生存分析结果与模型组和氨苄西林组小鼠无统计学差异（见Fig 2-6A）；而单次给予20 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2，可明显延长小鼠生存时间，改善小鼠脓毒血症症状，感染后7 d，小鼠存活率40%，与模型组比较有统计学差异（P<0.05, 见图6（B））。
③ G2.0 PAMAM-NH2 10+10 mg/kg治疗组：感染前和感染后分别给予10 mg/kg G2.0 PAMAM-NH2 可显著延长小鼠的生存时间，感染后7 d小鼠存活率60%，与模型组和氨苄西林组比较有显著差异（P<0.05，见图6（B））。结果进一步证实多次低剂量给药抗感染疗效明显优于单次高剂量给药，提前给药可预防感染，增强小鼠抵抗力。
4，结论
1. 体内急性毒性评价结果表明，G2.0 PAMAM-NH2体内生物相容性较好，腹腔注射对BALB/c小鼠半数致死剂量为84.04 mg/kg，高剂量对小鼠的脏器损伤主要表现为不同程度微血栓的形成。
2. ESBLs-EC 所致的BALB/c 小鼠败血症模型实验中，10+10 mg/kg和20 mg/kg组G2.0 PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间，提高生存率，降低小鼠血液CFU计数，明显减轻小鼠肺脏和肝脏损伤，且前者给药方式显著优于后者，提示多次低剂量给药效果好于单次高剂量给药。
3. ESBLs-EC和MRSA所致的BALB/c 小鼠败血症模型实验中，10+10 mg/kg和20 mg/kg组G2.0 PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间，提高生存率，且前者给药方式显著优于后者，提示多次低剂量给药效果好于单次高剂量给药，且提前给药可预防感染。
Claims (2)
1.聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2.0-4.0代聚酰胺胺型树枝状大分子。
2.根据权利要求1所述聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，其特征在于：所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2.0代聚酰胺胺型树枝状大分子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012102590517A CN102743411A (zh) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | 聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012102590517A CN102743411A (zh) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | 聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102743411A true CN102743411A (zh) | 2012-10-24 |
Family
ID=47024141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012102590517A Pending CN102743411A (zh) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | 聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102743411A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1323215A (zh) * | 1998-09-14 | 2001-11-21 | 星药有限公司 | 使用树枝状聚合物抑制毒物或毒性物质 |
-
2012
- 2012-07-25 CN CN2012102590517A patent/CN102743411A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1323215A (zh) * | 1998-09-14 | 2001-11-21 | 星药有限公司 | 使用树枝状聚合物抑制毒物或毒性物质 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 薛小燕等: "低代数聚酰胺-胺树状聚合物体内外抗菌活性", 《中国药理学与毒理学杂志》, vol. 25, 30 September 2011 (2011-09-30) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | The antibacterial activity and antibacterial mechanism of a polysaccharide from Cordyceps cicadae | |
| Pereira et al. | Galleria mellonella as an infection model: an in-depth look at why it works and practical considerations for successful application | |
| CN105801670B (zh) | 具抗菌活性的多肽及其应用 | |
| Wang et al. | Thymol kills bacteria, reduces biofilm formation, and protects mice against a fatal infection of Actinobacillus pleuropneumoniae strain L20 | |
| Aliabadi et al. | Pharmacokinetic–pharmacodynamic integration of danofloxacin in the calf | |
| CN102228479B (zh) | 一种治疗口腔疾病的药物及其制备方法 | |
| US10577404B2 (en) | Polypeptide derivatives from grass carp interferon and application thereof | |
| Palicz et al. | Application of a low molecular weight antifungal protein from Penicillium chrysogenum (PAF) to treat pulmonary aspergillosis in mice | |
| Meng et al. | Antimicrobial peptide nanoparticles coated with macrophage cell membrane for targeted antimicrobial therapy of sepsis | |
| Thorn et al. | Liquid Crystal Nanoparticles Enhance Tobramycin Efficacy in a Murine Model of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Wound Infection | |
| Cai et al. | Myeloid Differentiation Protein-2–Dependent and–Independent Neutrophil Accumulation during Escherichia coli Pneumonia | |
| CN110151761B (zh) | 一种替代抗生素的药物--褪黑素抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的应用 | |
| Hess et al. | Escherichia coli and TNF-α modulate macrophage phagocytosis of Candida glabrata | |
| US20080031868A1 (en) | Human lysozyme medicine, its manufacturing method and application thereof | |
| CN102743411A (zh) | 聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用 | |
| Filippone et al. | Evaluation of the efficacy of xyloglucan, pea protein and Opuntia ficus-indica extract in a preclinical model of psoriasis | |
| Cherkasova | Experimental Modeling of Sepsis | |
| CN103920144A (zh) | 重组人的脱氧核糖核酸酶i的新应用 | |
| CN105663126A (zh) | 盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用 | |
| CN107412344B (zh) | 用于治疗宠物皮肤病的药物组合物及其制备方法 | |
| CN113425719B (zh) | H2dpa及其衍生物作为金属β-内酰胺酶抑制剂在抗菌中应用 | |
| CN104771753B (zh) | 一种布氏菌病治疗制剂 | |
| Sarheed et al. | The toxicity of Castor beans and its treatment with Doxycycline in local rabbits | |
| CN116270966B (zh) | 多肽rk12作为活性成分的应用 | |
| Mohamed et al. | Histological Studies in Animal Model of Helicobacter pylori Infection Treated with Attacin A Antimicrobial Peptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121024 |