JP4767295B2 - シトクロムc捕捉型アポトーシス抑制剤 - Google Patents
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Description
T. Shimizu, Y. Pommier, Leukemia, 11, 1238(1997). I. Petak, R. Mihalik, P.I. Bauer, H.Suli-Vargha, A. Sebestyen,L. Kopper, Cancer Res., 58, 614(1998). G. Migliorati, I. Nicoletti, M.C. Pagliacci,L. D’Adamio, C. Riccardi,Cell Immunol., 146, 52(1993). D. Shinokawa, H. Maruta, S. Tanuma, FEBS Lett., 413, 99(1997).
D. Paul, H.Miyake, S. Shinoda, H. Tsukube,Chem. Eur. J., 12, 1328(2006). R.I. Pakunlu, Y. Wang, M. Saad, J.J. Khandare, V. Starovoytov, T. Minko, J. Control. Release, 114, 153(2006). H. Yang, W.J.Kao, J. Biomater,. Sci.Polymer Ed., 17, 3(2006).
以下の実施例は、式(1)で表されるデンドリマー化合物を予め培養細胞培地に添加しておき、その後アポトーシスを誘導したところ、アポトーシス抑制現象が確認されたことを示すものである。実施例1は用いたデンドリマー化合物の合成例を示す。実施例2は、ケトセラミドが培養細胞(HeLa細胞)においてアポトーシスを誘導することを示す。実施例3は、ケトセラミドによりアポトーシスを誘導された培養細胞(HeLa細胞)からシトクロムcが漏出されていることを確認するものである。実施例4は、実施例2および3に示す系において、比較のために市販のカスパーゼ阻害剤によるアポトーシス阻害効果の有無を確認するものである。実施例5および6は、実施例2および3に示す系において、本発明に従うデンドリマー化合物がアポトーシス阻害効果を有することを示すためのものである。
<デンドリマーヘキサキスエチルエステルの合成> ポルフィリンカルボン酸(0.028mmol)、HOBt(0.039mmol)、HBTU(0.039mmol)、ジイソプロピルアミン(0.078mmol)を脱水ジクロロメタン10mlに溶解し、0℃で20分間撹拌した。デンドリティックペンタキスグルタミン酸ペプチド(0.039mmol)を加え、さらに45分間撹拌し、その後ゆっくりと室温まで上昇させ、TLCで反応を追跡しながら撹拌を続けた。反応終了後、溶媒を減圧留去した後、ジクロロメタンに溶解し、2%クエン酸(10ml)、水(10ml x 2)、飽和NaHCO3溶液(10ml)、水(10ml)、飽和食塩水(10ml)の順に分液した。ジクロロメタン層をMgSO4で乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残さをアルミナ充填材のカラムクロマトグラフィーにより分離精製し、さらにゲルろ過クロマトグラフィー(日本分析工業、JAIGEL 1H-2Hカラム)により精製し、目的物を得た。反応が完結させるのに必要な時間および収率は世代により異なった。2b、24h、77%;3b、60h、80%;4b、85h、52%。
第2世代デンドリマーヘキサキスエチルエステル(0.0064mmol)をTHF(1ml)とMeOH(1ml)の混合溶媒に溶解した。水酸化リチウム(0.056mmol、8.8モル当量)を水(0.5ml)に溶かしたものを加え、室温で撹拌した。反応の進行はキャピラリー電気泳動を用いて追跡した。36h後に溶媒を減圧留去した後、水(1ml)に再溶解し、水酸化リチウム(1.6モル当量)を加えてさらに24h撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、目的物を吸湿性の固体として得た。
なお、C2-ketoCerは非特許文献8に記載された方法で、概略次のように合成した:
まず、L−セリンより3段階でアミノ基及び水酸基を保護したβ−ケトホスホン酸ジエステルを合成し、HWE反応にて長鎖を導入した。酸処理による脱保護の後、WSC試薬を用いてアミノ基を選択的にアセチル化し、C2-ketoCerを得た。
H. Azuma, S. Ijichi, M. Kataoka, A. Masuda, T.Izumi, T. Yoshimoto, T. Tachibana, Bioorg. Med.Chem., 15, 2860(2007).
cells/mL、10% FBS含有RPMI1640)を30mm dishに1mLずつ播種し、24時間培養した(1サンプルにつき2枚)。培養液を捨て、FBS不含RPMI1640 1mLで洗浄後、C2-ketoCer(1−20μmol)を含むFBS不含RPMI1640 1mLを加え、37℃で所定時間インキュベートした。細胞をセルスクレイパーで剥がし、1 x PBSを用いて1.5mLエッペンドルフチューブに集め、4℃、400gで5分間遠心した(2回)。上清を捨て、Sample buffer 100μL(2% SDS、6M urea、1.1M glycerol、62.5mM Tris-HCl(pH 6.8))を加えて懸濁し、4℃で超音波処理を行い、試料溶液とした。試料溶液20μLを用いてSDS-PAGE(8%:PARP、14%:カスパーゼ−3)を行い、PVDF膜に転写後、ウェスタンブロッティングを行った。
転写後、PVDF膜を5%スキムミルクを含む0.1% Tween 20 TBS溶液(pH 7.5)で0℃で一晩ブロッキングし、抗カスパーゼ−3抗体(Anti-caspase-3 antibody produced in rabbit,
Sigma製、1,000倍希釈)、もしくは抗PARP抗体(Anti-PARP antibody produced in mouse, Trevigen製、1,000倍希釈)を用いて一次抗体反応を60分間行った。0.1% Tween 20 TBS溶液(pH 7.5)で10分間、2回洗浄した後、カスパーゼ−3の場合はアルカリホスファターゼ標識抗ラビットIgG抗体(Anti-rabbit IgG antibody, alkaline phosphatase
conjugated, Sigma製、5,000倍希釈)、PARPの場合はアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体(Anti-mouse IgG antibody, alkaline phosphatase conjugated, Sigma製、5,000倍希釈)を用いて二次抗体反応を60分間行った。0.1% Tween 20
TBS溶液(pH 7.5)溶液で10分間、2回洗浄した後、NBT-BCIP溶液(Sigma製)を加えて発色反応を行い、それぞれのタンパクを確認した。
得られたウェスタンブロッティングの解析結果を図3及び図4に示す。
その結果、C2-ketoCer処理により活性化カスパーゼ−3及びPARP分解が見られ、C2-ketoCerはHeLa細胞についてもアポトーシスを強く誘導することが示された。
HeLa細胞(0.5 x 106 cells/mL、10% FBS含有RPMI1640)を30mm dishに1mLずつ播種し、24時間培養した(1サンプルにつき2枚)。培養液を捨て、FBS不含RPMI1640 1mLで洗浄後、ketoCer(1-20μmol)を含むFBS不含RPMI1640 1mLを加え、37℃で所定時間インキュベートした。細胞をセルスクレイパーで剥がし、1 x PBSを用いて1.5mLエッペンドルフチューブに集め、4℃、400gで5分間遠心した(2回)。上清を捨て、Protein inhibitor cocktail(Sigma製)を1μL含むLysis buffer A 100μM(0.25M sucrose、0.5mM digitonin、80mM KCl、0.1mM PMSF、1mM DTT、1mM EDTA、1mM EGTA)を加えて懸濁し、氷冷下、5分間静置した。4℃、10,000gで5分間遠心し、上清(細胞質成分)とペレット(ミトコンドリア成分)に分画した。上清を更に4℃、100,000gで5分間遠心し、沈殿物を除去し、これを細胞質画分とした(−80℃で保存)。
ペレットにLysis buffer B 100μL(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1%NP-40、0.25% Sodium deoxycholate、1mM EGTA)を加えてピペッティングし、4℃で超音波処理を行った。4℃、10,000gで5分間遠心し、沈殿物を除去し、これをミトコンドリア画分とした(−80℃で保存)。細胞質画分、ミトコンドリア画分共にBCA Protein Assay Kitを用いてタンパク量が均一になるように調製し、SDS-PAGE(14%)の後、PVDF膜に転写し、ウェスタンブロッティングを行った。転写後、PVDF膜を5%スキムミルクを含む0.1% Tween
20 TBS溶液(pH 7.5)で0℃で一晩ブロッキングし、抗シトクロムc抗体(Anti-cytochrome c antibody produced in
mouse, Santa Cruz製、1,000倍希釈)、及び抗β−アクチン抗体(Anti−β−actin antibody produced in mouse、Trevigen製、1,000倍希釈)を用いて一次抗体反応を60分間行った。0.1% Tween 20
TBS溶液(pH 7.5)溶液で10分間、2回洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識モノクローナル抗マウスIgG抗体(Monoclonal anti-mouse IgG antibody、alkaline phosphatase
conjugated、Sigma製、5,000倍希釈)を用いて二次抗体反応を60分間行った。Tween T溶液で10分間、2回洗浄した後、NBT-BCIP溶液(Sigma製)を加えて発色反応を行い、それぞれのタンパクを確認した。なお、アクチン染色は各Laneのタンパク量が均一かどうかを判断するために行った。
得られたウェスタンブロッティングの解析結果を図5に示す。その結果、C2-ketoCer処理によりミトコンドリアからシトクロムcの漏出が確認され、誘導されるHeLa細胞のアポトーシスはミトコンドリア経由アポトーシスであることが示された。
得られたWST assayの解析結果を図6に示す。その結果、カスパーゼ−3阻害剤(Lane 2,3)及びカスパーゼ−9阻害剤(Lane 4, 5)処理により4時間まで強いアポトーシス阻害が確認されたが、6時間後では細胞死が確認された。
20mM)を用い、実施例4と同様の操作を行った。
得られたWST assayの解析結果を図7に示す。その結果、カスパーゼ阻害剤で処理した場合と同様、化合物2a処理によりアポトーシス阻害が確認された。
cells/mL、10% FBS含有RPMI1640)を30mm dishに1mLずつ播種し、24時間培養した(1サンプルにつき2枚)。培養液を捨て、FBS不含RPMI1640 1mLで洗浄後、化合物2a(10μM)もしくはDMSOのみを含むFBS不含RPMI1640 1mLを加え、37℃で2時間インキュベートした。5mMケトセラミドストック溶液もしくはエタノールのみをそれぞれの培養液に1μLずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。その後、実施例2と同様の操作を行った。
得られたウェスタンブロッティングの解析結果を図8及びに図9に示す。その結果、化合物2a処理により、カスパーゼ−3の活性化(図8)及びPARP切断(図9)の阻害が見られ、化合物2aのアポトーシス阻害効果が確認された。
Claims (1)
- アポトーシス時にミトコンドリアから漏出するシトクロムcを捕捉し、アポトーシスを抑制するアポトーシス抑制剤であって、下記の式で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス抑制剤。
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