JP2021532041A - 神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患治療剤としてのグラフェン量子ドット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患に治療活性を示すことができるグラフェン量子ドットを提供する。
本発明は、本発明によるグラフェン量子ドットの用途を提供する。
カーボンファイバー(0.9g)を硫酸(300ml)および硝酸(100ml)混合溶液に添加した後、80℃で24時間の間加熱した(thermo−oxidation process、図1参照)。そして、脱塩水(deionized water)で希釈した後、再生ニトロセルロースメンブレン(Cat#:06−680−2G;MWCO 1,000ダルトン;Fisher Sicentific)で透析して、酸と過量のカーボン断片を完全に除去した。そして、GQD溶液を多孔性無機メンブレンフィルター(Cat#:6809−5002;Whatman−Anodisc 47;GE Healthcare)で真空濾過して、大きい粒子を除去した。その後、溶液を回転蒸発させて、パウダー形態のグラフェン量子ドット(GQDs)を収得した。獲得されたグラフェン量子ドットは、Graphitic domainとエッジ官能基(edge functional groups)を全部含んで主な元素成分である窒素(N)、炭素(C)、水素(H)、硫黄(S)、および酸素(O)の元素分析(elemental analysis;EA)を実施した。元素分析は、Elemental analyzer Flash2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて実施した。その結果は、表1に示した。
nano−GOsを製造するために、従来文献によって改善されたHummer方法により原始(pristine)グラフェンオキシド(GOs)を合成した。収得されたGO粉末を脱塩水に10mg/mlの濃度で添加し、3時間の間チップ−超音波処理して、nano−GOsを収得した。
1.AFMイメージング
AFMイメージングのために、各試料(10μg/ml)およびα−synフィブリル(10μg/ml)を1cm2シリコン酸化物基板の上に落として常温で乾燥させた。XE−100 AFM(Park Systems)を用いて非接触モード(スキャンサイズ:25μm2、スキャン速度:0.8Hz)で分析した。イメージは、XEデータ収集プログラム(XEP 1.8.0)で獲得した。
試料を高真空デシケーターで完全に乾燥させ、通常のKBrペレット方法で製造した。そして、Nicolet 6700 FT−IRスペクトロメーター(Thermo Scientific)でスキャン回数32回、波数範囲4000〜40cm−1の条件で測定した。
ThT分析のために、各試料50μlを16,000×gで30分間遠心分離した。そして、ペレットを10mMグリシン緩衝液(pH9.0)を用いて溶解させた25μM ThT(Cat#:T3516;Sigma−Aldrich)200μlに再懸濁させた。ThT蛍光は、蛍光分光光度計を使用して482nm(440nmで励起)で測定された。
試料を2分間グロー放電された400メッシュカーボンコーティング銅グリッド(EMS社製品)に吸着させた。そして、前記グリッドに迅速に50mM Tris−HCl(pH7.4)溶液を3滴を滴下して洗浄した後、それぞれ30秒間0.75%ギ酸ウラニルを連続的に2滴ずつ流した。ムラは、#1ワットマン濾紙を使用して除去した。試料は、測定前に十分に乾燥して、80kVで作動する電子顕微鏡Phillips CM 120 TEMとAMTのER−80 CCD(8メガピクセル)を使用してデジタル化したイメージを獲得した。ニューロンの場合、1次培養した大脳皮質由来ニューロンをポリ−D−リジンでコーティングされた35mmディッシュの上に100,000細胞/ウェルの密度で培養した。ニューロンは、DIV10に1μg/mlのグラフェン量子ドットを含有したり含有しない1μg/mlのPFFsを処理した。そして、7日後、ニューロンを1%ソジウムナイトライト(pH7.4)含有PBSで洗浄し、3%(v/v)パラホルムアルデヒド(PFA)、1.5%(v/v)グルタルアルデヒド、100mMカコジレートおよび2.5%(v/v)スクロース(pH7.4)からなる固定液を使用して固定し、1時間の間ポスト固定させた。イメージは、Soft Imaging System Megaview IIIデジタルカメラが装着されたPhillips EM 410 TEMで収集された。
Bio−Dot微細濾過装置(Cat#:170645;Bio−Rad)を使用して試料をあらかじめ濡らしたニトロセルロースメンブレン(孔隙サイズ:0.45μm)にローディングし、負圧を用いて前記メンブレンに粘着させた。トリス緩衝食塩水(Tris−buffered saline)で各メンブレンを洗浄した後、5%脱脂粉乳が含まれたツイン20含有トリス緩衝食塩水でメンブレンをブロッキングした。試料を形態特異的anti−α−synフィラメント抗体(Cat#:ab209538;1:1,abcam)で4℃で一晩中結合させ、引き続いて、ウサギから抽出したHRP接合二次抗体(GE Healthcare)と常温で1時間の間培養した。そして、メンブレンをトリス緩衝食塩水で数回洗浄し、ECL溶液を使用してイメージ化し、ImageJソフトウェアを使用して分析した。
BN−PAGEの場合、NativePAGETMサンプル用意キット(Cat#:BN2008;Life technologies)を使用してα−synフィブリルおよびα−syn PFFを用意し、200Vで90分間NativePAGETM Novex 4−16%ビス−トリスゲル(Cat#:BN1002Box;Life technologies)を使用して電気泳動した。カソード(cathode)緩衝溶液は、50mMトリシン(tricine)、15mMビス−トリスおよび0.02%ブリリアントブルーG(pH7.0)を含有し、アノード(anode)緩衝溶液は、50mMビス−トリス(pH7.0)で構成される。ゲルは、SilverQuestTMシルバー染色キット(Cat#:LC6070;Life technologies)を使用して製造社の指針に基づいて染色した。
α−syn PFFは、Volpicelli−Daley et al(Nat Protoc 9,2135−2146,doi:10.1038/nprot.2014.143(2014))により報告された従来の方法によって用意した。マウス組換え全長α−synをアンピシリン耐性バクテリア発現ベクターpRK172にクローニングした。次に、プラスミドをBL21(DE3)RIL−competent E.coli(Cat#:23045,Life technologies)に導入させて使用した。バクテリア培養後、前記言及された文献に従ってα−syn単量体を分離して、アニオン交換、透析およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む様々な精製段階を通じて純粋に精製した。試験管内(in vitro)α−synフィブリルは、エッペンドルフ(Eppendorf)オービタルミキサー(Cat#:538400020)を使用して37℃、1,000rpmで7日間撹拌して凝集させた。α−synフィブリルの断片は、1/8”プローブ−ソニケーターを有する超音波装置を使用して20%強度で総60回のパルス(それぞれ〜0.5秒)を処理して作った。前記断片を1次培養された神経細胞と37℃で7日間培養した後に、前記断片が神経細胞内で自然に成熟したフィブリルに変換され、細胞に対する毒性を示すことを確認した。
機能化(functionalisation)のために、グラフェン量子ドットにカルボキシル基を導入するために、50mgのグラフェン量子ドットを接合緩衝液(conjugation buffer,pH4.7)に溶解させた。引き続いて、12.5mgのEDC試薬(N−3(Dimethylaminopropyl)−N−ethylcarbodiimide hydrochloride,Cat#:03449,Sigma−Aldrich)を加えて、カルボキシル基をグラフェン量子ドットにカルボキシル基を導入した。1時間の間撹拌させた後、EDC−活性化したグラフェン量子ドットに25mgのEZ−Link Amine−PEG3−Biotin(Cat#:21347,Thermo Scientific)を添加して、12時間の間グラフェン量子ドットとビオチンとの間にアミド結合を形成させた。前記溶液を再生ニトロセルロース メンブレン(Cat#:06−680−2G、MWCO 1,000 Daltons,Fisher Scientific)で透析して、未反応ビオチンおよびEDC試薬を除去した。次に、前記溶液を回転濃縮器を使用して粉末形態の最終生成物を収得した。グラフェン量子ドットとα−synフィブリル間の結合分析のために、5mg/mlのα−synフィブリルを5mg/mlのビオチン化したグラフェン量子ドットおよびストレプトアビジン結合0.8nm金ナノ粒子(Cat#:800.099,Aurion)とともに1時間の間培養した。その後、ビオチン化−グラフェン量子ドットに高い親和性で結合されたストレプトアビジン結合超小型金粒子は、GoldEnhanceTM EM Plus溶液(Cat#:2114,Nanoprobes)で5分間増強させた。未反応溶液を100kDa MWCOスピンカラム(Cat#:UFC510024,Millipore−Sigma)で除去した後、TEM分析を行った。
α−syn過発現のために、pRK172ベクターにクローニングされたα−syn遺伝子をE.coli BL21(DE3)で導入した。同位元素−標識されたα−synの製造のために、リットル当たり0.5gの15NH4Clおよび1gの13Cグルコース(Cambridge Isotope Laboratory Inc.,Andover,MA)を含有するM9培地で100μg/mlのアンピシリンと共に37℃で細胞を成長させた。イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した後、熱処理された細胞溶解物をDEAE−Sephacelアニオン交換、Sephacryl S−200のサイズ排除およびS−Sepharoseカチオンクロマトグラフィーを使用して連続的に精製した。前記精製されたα−synを新しい20mM 2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH6.5)12Lで3回透析し、−80℃で1mg/mlの濃度で分注して保管した。実験直前に4℃でNanosep 10Kメンブレン(Pall Gelman、ドイツ)を使用して試料を5mg/mlで濃縮した。
α−synとグラフェン量子ドット間の相互作用に対する詳細なNMR研究は、cryo−genic probeが装着された950MHz分光計(Bruker、ドイツ)を使用して行った。均一に分類された15N−標識α−syn(5mg/ml、100μl)をGQD(5mg/ml、100μl)と37℃で3日間1,000rpmで撹拌して反応させた。1H−15N HSQC測定のために、10%含有20mM MES緩衝液(pH6.5)を使用して15N−標識α−syn試料を製造した。α−synおよびグラフェン量子ドットと反応したα−synの1H−15N HSQCスペクトルは、37℃で得られた。得られたデータをNMRPipe24で処理し、Sparky25で分析した。
分子レベルでグラフェン量子ドットとα−synフィブリル間の相互作用を調査するために、Gromacs 5.1で200nsの分子力学(MD)シミュレーションを行った。α−synの疎水性NACドメイン(残基71〜82)の初期構造は、CHARMM forcefieldを有するssNMR構造(PDB ID:2N0A)から適用され、グラフェン量子ドットの構造は、https://cgenff.paramchem.org.のプロトコルによりCGenFFで設計された。
α−synフィブリル(5mg/ml、100μl)をグラフェン量子ドット水溶液(5mg/ml、100μl)と混合し、7日間37℃、1,000rpmで振とう培養下に解重合させた。far−UV CD測定の場合、試料を蒸留水で希釈(1/2)した。J−815分光偏光計(Jasco、日本)と長さ0.2mmの石英キューベットを使用して190nm〜260nmのCDスペクトルを0.5nm間隔で測定した。緩衝溶液のスペクトルは、試料スペクトルから除外した。CD信号は、平均残留楕円率[θ]に対してdegcm2/dmolの単位で正規化した。α−synフィブリルと解重合されたα−synフィブリルの分画二次構造含量は、DichroWebオンラインサーバーのCONTIN/LLアルゴリズムを使用して計算した。CONTIN/LLを使用して計算するとき、DichroWebの参照セット7を使用し、190〜240nmの波長範囲に合うように最適化した。
マウス大脳皮質由来1次神経細胞は、15日になったC57BL/6マウス胚芽を使用して用意した。分離した神経細胞は、B27補充因子(Cat#:17504044,Life technologies)およびL−グルタミン(Cat#:25030149,Life technologies)を含有するNeurobasal Media(Cat#:21103049,Life technologies)で構成された培養培地に用意して、50μg/mlのポリ−D−リジン(Cat#:P6407,Sigma−Aldrich)でコーティングされた培養ディッシュにプレーティングされた。培養液は、1週間に2回交換して、37℃、7%CO2培養器で維持された。培養されてから5日後に、神経膠細胞(glial cell)の成長を抑制するために、30μMの5−フルオロ−2'−デオキシウリジン(Cat#:F0503,Sigma−Aldrich)を処理した。マウスを使用した実験に対するすべての手続きは、ジョンズ・ホプキンズ大学の動物管理および使用委員会の指針に基づいて承認され遵守された。
細胞生存および細胞毒性分析のために、1次大脳皮質神経細胞をポリ−D−リジン コーティングガラスカバースリップに密度10,000細胞/cm2で培養し、7%CO2培養器で1週間に2回培地を交換しつつ培養した。1次培養された神経細胞の細胞毒性は、グラフェン量子ドット(1μg/ml)の不在または存在下に7日間10DIVマウス大脳皮質神経細胞にα−syn PFFs(1μg/ml)を処理した後、LDH細胞毒性分析キット(Cat#:88954,Pierce)を使用して測定した。また、TUNEL分析キット(Cat#:12156792910,Roche)を使用して細胞死滅を決定した。1次培養された神経細胞の生存力をalamarBlue細胞生存能分析キット(Cat#:DAL1025,Molecular ProbesTM)および神経突起派生物染色キット(Cat#:A15001,Molecular ProbesTM)を使用して測定した。前記神経突起派生物染色キットは、神経突起派生の標識として細胞メンブレン表面を染色するオレンジ色染料、および細胞内エステラーゼにより非蛍光基質から緑色蛍光生成物に転換される細胞透過性染色を含む。
ポリ−D−リジンコーティングをしたカバースリップに20,000細胞/cm2の密度でマウス1次大脳皮質神経細胞をプレーティングした。4%PFAを使用して神経細胞を固定した後、5%正常ロバ血清(Cat#:017−000−121,Jackson ImmunoResearch)、2%ウシ血清アルブミン(Cat#:A7030,Sigma−Aldrich)および0.1%Trion X−100(Cat#:T8787,Sigma−Aldrich)で1時間の間室温でブロッキングした。anti−8−OHG(Cat#:ab62623,1:1,000,abcam)、anti−pS129−α−syn(Cat#:ab59264,1:1,000,abcam)およびanti−MAP2(Cat#:MAB3418,1:1,000,Millipore)抗体と共に4℃で一晩中培養した。試料を0.1%Trion X−100が含有されているPBSで洗浄した後、FITC接合2次抗体(ロバ抗マウスFITC;Cat#:715−095−151,ロバ抗ウサギFITC;Cat#:711−095−152,Jackson ImmunoResearch)およびCy3接合2次抗体(ロバ抗マウスFITC;Cat#:715−165−151,ロバ抗ウサギCY3;Cat#:711−165−1527,Jackson ImmunoResearch)の混合物をカバースリップと共に常温で1時間の間培養した。蛍光イメージは、Zeiss共焦点顕微鏡(LSM 710,Zeiss Confocla)を通じて獲得した。
ミトコンドリア複合体I酵素活性は、複合体I酵素活性マイクロプレート分析キット(Cat#:ab109721,abcam)を使用して製造社の指示によって測定した。簡略に、1次大脳皮質神経細胞は、ポリ−D−リジンでコーティングされた6cm培養ディッシュの上に1,000,000細胞/ディッシュの密度でプレーティングされた。神経細胞は、体外で10日目に1μg/mlのグラフェン量子ドットの存在または不在下にα−syn PFFs 1μg/mlで処理された。7日間処理後、1/10体積の洗剤が含まれたPBSを用いて1次神経細胞からタンパク質を抽出し、氷の上で30分間培養した。試料の最終タンパク質濃度を5.5mg/mlに調節した後、12,000×gで20分間遠心分離し、上澄み液をマイクロプレートウェルに載置し、室温で3時間の間培養した。3時間後、プレートを緩衝液で2回洗浄後、分析溶液200μlを添加した。ミトコンドリア複合体I酵素活性は、OD450で約1分間隔で30分間測定した。
大脳皮質1次神経細胞は、ポリ−D−リジンでコーティングされたガラスカバースリップ上に10,000細胞/cm2の濃度でプレーティングされた。1次培養された大脳皮質神経細胞は、DIV10で1μg/mlのグラフェン量子ドットの存在または不在下にα−syn PFF 1μg/mlで処理した。7日間処理後、神経細胞は、製造社の指針に基づいてMitoTracker(登録商標)Orange CMTMRosプローブ(Cat#:M7510,Life technologies)で染色された。簡略に、1次神経細胞を100nMのMitoTracker(登録商標)Orange CMTMRosプローブとともに30分間培養した後、細胞イメージング溶液(Cat#:A1429DJ、Life technologies)で洗浄した。染色されたミトコンドリアは、Zeiss共焦点顕微鏡(LSM710)を使用して映像化し、長さまたは縦横比(AP、ミトコンドリアと同等な楕円の長軸と短軸の比)のようなミトコンドリア形態学的特徴をImageJソフトウェアを使用して分析した。
酸素消費率(Oxygen Consumption Rate,OCR)は、Seahorse XF cell mitoストレステストキット(Cat#:103015,Agilent)を使用して製造社の指針を次のように修正して測定した。簡単に、1次培養した大脳皮質神経細胞をタツノオトシゴXF24細胞培養プレートの上に500,000細胞/ウェルの濃度でプレーティングした。神経細胞は、DIV10で1μg/mlグラフェン量子ドットの存在または不在下にα−syn PFF 1μg/mlで処理された。7日間処理後、ニューロンを暖かいPBSで洗浄し、タツノオトシゴ分析培地で37℃、1時間の間培養した。その後、プレートをXF24 Extracellular Flux Analyzer(Seahorse Biosicince)に入れ、酸素消費率を測定した。酸素消費率は、1分間混合、1分間待機および2分間測定のプロトコルで37℃で測定した後、CO2がない培養器で45分間培養した後、XF24分析器で分析した。オリゴマイシン、カルボニルシアニド−m−クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)およびロテノンを順次に注入して、基礎呼吸、呼吸鎖のカップリングおよびミトコンドリア呼吸容量を評価した。測定された酸素消費率は、各ウェルのタンパク質濃度を使用して標準化した。データは、対照群と比較してその変化を百分率で表示した。
低速共焦点ライブイメージングのために、1次大脳皮質神経細胞は、ポリ−D−リジンでコーティングされたガラスボトムディッシュ(Cat#:150682,NuncTM)の上に10,000の細胞をプレーティングし、37℃、7%CO2培養器で培養した。DIV7で、1次培養された神経細胞をFITC標識されたα−syn PFFs、1μg/ml GQDs−ビオチンおよびストレプトアビジンQdot複合体および細胞イメージングソリューションを含有する100nM LysoTrackerTM Blue DND−22(Cat#:L7525,Life technologies)とともに1時間の間培養した。培養ディッシュを温度調節されたCO2培養システムが装着されたZeiss共焦点顕微鏡(LSM710)に装着した後、488nmおよび561nmレーザー励起(excitation)で指定された間隔で低速イメージをキャプチャーした。
トリプルコンパートメント微細流体装置(Triple−compartment microfluidic device)は、Xona Microfluidic(Cat#:TCND1000)を使用した。ガラスカバースリップは、微細流体装置に付着される前にポリ−D−リジンでコーティングした。チャンバー当たり約100,000個の神経細胞をプレーティングし、DIV7に0.5μgのGQDsをチャンバー1(C1)またはチャンバー2(C2)に前処理した後、チャンバー1(C1)に0.5μgのα−syn PFFを処理した。第1チャンバーでα−syn PFFの処理は、すべての試験グループで行われて、次のチャンバーに適切な伝送条件を生成した。流体フローの方向を調節するために、3つの区画の間には、培地体積の50μl−差異が維持された。神経細胞は、α−syn PFFs処理後、14日に4%PFAを含むPBSを使用して固定した。チャンバー内の固定された神経細胞は、5%正常ロバ血清、2%ウシ血清アルブミン、0.1%トリトンX−100を含有するブロッキング溶液を使用して常温で1時間の間培養した。神経細胞は、4℃で一晩中anti−pS129−α−syn(Cat#:ab59264,1:1,000,abcam)およびanti−MAP2(Cat#:MAB3418,1:1,000,Millipore)抗体で培養し、チャンバーを0.1%Triton X−100を含むPBSを使用して洗浄後、常温でFITC接合2次抗体(Jackson ImmunoResearch)およびCy3接合2次抗体(Jackson ImmunoResearch)の混合物で室温で1時間の間培養した。蛍光イメージは、Zeiss共焦点顕微鏡を通じて収得した。
ジョンズ・ホプキンス医学研究所の動物管理および使用委員会の承認を得た国立動物健康管理研究所の動物管理および使用ガイド指針に基づいてすべての実験手続きを行った。ヒトのα−syn−A53T形質転換マウス(B6.Cg−Tg,Prnp−SNCA* A53T;23 Mkle/J、stock#:006823)は、Jackson Labから購入した。
体外血液脳関門(Blood−Brain−Barrier,BBB)透過実験のための1次培養したマウス星状細胞(astrocyte)は、C58BL/6マウス10匹を用いて用意した。簡単に、1次培養された混合された神経膠細胞は、(neuroglia)は、1−d−old C57BL/6マウスを用いて用意した。隔離された大脳皮質から髄膜(meninges)を除去し、19ゲージ、0.5インチのニードルを付着した30ml注射器で大脳皮質を破砕した。引き続いて、細胞を10%FBS、1mM HEPES、2mMグルタミンおよび抗生剤/抗菌剤(Life technologies)が補充されたDMEMで75cm2 T−フラスコにプレーティングした。混合された神経膠細胞は、37℃で5%CO2培養器で維持され、培養液は、週2回交替された。2週後、星状細胞隔離キット(Cat#:130−096−053,Miltenyl Biotec)を使用して純粋な星状細胞を分離した。C57BL/6マウスの1次脳微細血管内皮細胞(BMEC)は、Cell Biologics社から購入した。高純度(>95%)星状細胞とBMECは、細胞特異マーカーGFAP(星状細胞用)とCD31(BMEC用、Cat#:ab28364,1:500,abcam)マーカーを染色してモニタリングした。体外血液脳関門の製作のために、コラーゲンコーティングされた0.4μmのtranswell inserts(Cat#:CLS3491,Sigma−Aldrich)の下面に106細胞/mlの星状細胞を添加し、37℃、5%CO2条件下で48時間の間培養した。引き続いて、107細胞/mlのBMECがインサートの上にプレーティングされた6ウェルプレートの上にチャンバーを用心深く位置させた。体外BBBの構造的完全性を確認するために、BMECシーディング後、0、2、4、6および8日に上皮ボルト/オーム(TEER)計測器(Cat#:300523,EVOM2,world precision instruments)を使用して上皮電気抵抗を測定した。完全性を確認するために、トランスウェルの内部(血液側)に血液脳関門透過性3kDaデキストラン−フルオレセイン(Cat#:D3306,Life technologies)をローディングし、蛍光分光光度計(デキストラン−フルオレセインに対してEx=494nm/Em=521nm、血液脳関門不透過性デキストランローダミンに対してEx=555nm/Em=580nm)で比率を測定した。内部(血中側)および外部(細胞膜)のFluoroBriteTM DMEM培地(Cat#:A1896701,Life technologies)を使用して520nm(Ex=310nm)で残っているグラフェン量子ドット、ビオチン−グラフェン量子ドット、nano−GOおよびrGQDsの濃度を測定した。
放出されたエクソソームでグラフェン量子ドット−ビオチンの濃度を測定するために、BMECまたは星状細胞を6cm培養ディッシュに敷設し、5μgのグラフェン量子ドット−ビオチンを12時間の間処理した。12時間後、培養培地を交換した後、24時間および48時間後にエクソソーム分離試薬(Cat#:4478359,ThermoFisher)を使用してエクソソームを分離した。
グラフェン量子ドット−ビオチンの生体内免疫染色のために、8週齢のC57BL/6マウスに2mg/kgグラフェン量子ドット−ビオチンを腹腔注射した。脳を分離し、4%PFAで6時間の間固定させた後、48時間の間30%スクロースに脱水化過程を行い、免疫組織化学分析を行った。嗅球(olfactory bulb)、新皮質(neocortex)、中脳(midbrain)および小脳(cerebellum)のグラフェン量子ドット−ビオチン信号をDABキットを使用して視覚化した。上記で言及した領域の細胞でのグラフェン量子ドット−ビオチン陽性信号は、製造社の指針に基づいてGoldEnhanceTMEM Plus溶液を使用して20分間培養した後、免疫EM染色で確認した。生体内血液脳関門実験で、8週齢のC57BL/6マウスは、ビオチン(2mg/kg)またはビヒクルを腹腔または静脈注射した。7日および14日に、脳および血液を収得し、脳を1%TX−100を含むPBSで均質化させた。常温で30分間放置して全血を凝固させ、凝固物を2,000×gで10分間遠心分離して除去した。グラフェン量子ドット−ビオチンの濃度は、QuantTagビオチン定量キット(Cat#:BDK−2000,Vector Laboratories)を使用して測定した。グラフェン量子ドット−ビオチンの脳/血しょう濃度の比率は、脳/血しょうの比率に対して計算した。
すべての実験手続きは、ジョンズ・ホプキンス医学研究所の動物管理および使用委員会の承認を得た国立動物健康管理研究所の動物管理および使用ガイド指針に基づいて行われた。8〜10週齢の雄C57BL6マウスをJackson実験室から購入した。マウスをペントバルビタール(60mg/kg)で麻酔させ、stereotaxic instrument(Cat#:Model 900;David KOPF instruments)を用いて2μlのPBSまたはPFFs(5μg/2μl)を線条体(striatum)の片方半球に注射した。実験群には、50μlのGQD(マウス当たり50μg)を6ヶ月間隔週で腹腔注射した。注射6ヶ月後、マウスをPBSに引き続いて4%PFAで灌流した。12時間の間4%PFAで固定した後、脳を30%スクロースで脱水し、免疫組織化学法で分析した。中脳黒質(SN,substantia nigra)を含む脳全体を50μmの冠状切片で切って、毎4番目の切片を死滅細胞数の分析に使用した。ウサギ多クローンanti−TH(Cat#:NB300−19;1:1,000;Novus Biologicals))、ウサギ多クローンanti−pS129−α−syn(Cat#:ab59264;1:1,000;abcam)をブロッキング溶液と共に培養した。DABキット(Cat#:SK−4100;Vector Laboratories)を使用して視覚化した後、ビオチン化した2次抗体およびストレプトアビジン接合ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)(Cat#:PK−6101;Vector Laboratories)で培養した。染色された組織切片をスライドの上に載置した後、チオニンを使用してNisslボディーを染色した。SNでTHおよびNissl陽性神経細胞の総数をStereo Investigatorソフトウェア(MBF Bioscience)のOptical Factionatorプローブプログラムを使用して測定した。
動物の脳をPBSおよび4% PFAで灌流した。死後固定後、凍結させた後、切片を作って、anti−Iba−1抗体(Cat#:019−19741;1:1,000;Wako)またはanti−GFAP抗体(Cat#:Z0334;1:2,000;Dak)とともに培養した。培養した組織は、再びビオチン接合されたantiウサギ抗体およびABC試薬(Cat#:PK−6101;Vector Laboratories)と共に培養した後、DABペルオキシダーゼ基質(Cat#:SK−4100;Vector Laboratories)を使用して各切片を染色した。SNでの神経膠細胞の数および密度は、ImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/、NIH)で測定した。主要な器官病理組織検査のために、8〜10週齢の雄C57BL/6マウスにグラフェン量子ドット50μgを6週間隔週で腹腔注射した。6ヶ月の注射後、動物をPBSと4%PFAを使用して灌流および固定した。肝、腎臓および脾臓を分離し、H&E染色キット(Cat#:H−3502;Vector Laboratories)で染色した。
HEK293T細胞をガラススライド上にプレーティングし、A53T変異があるmyc−標識α−syn変異体(pCMV5−myc−SNCA−A53T、kindly gifted by Dr.Thomas C.Sudof)を有するpCMV5ベクターでトランスフェクションした後、PBS(pH7.4)またはグラフェン量子ドット(0.1μg/ml)を処理した。処理48時間後、HEK293T細胞をPBSで3回洗浄し、4%PFAを含有するPBSを使用して20分間室温で固定した。そして、PBSで3回洗浄した後、固定された細胞を0.1%Triton X−100(Sigma Aldrich)が含有されたPBSを用いて4分間洗浄した。その後、細胞をPBSで3回さらに洗浄し、5%ロバ血清が含有されたPBSで20分間ブロッキングさせた。α−syn発現は、α−syn抗体(Cat#:610787;1:1,000;BD Biosciences)を使用してモニタリングした。レーザースキャニング共焦点顕微鏡で550nmおよび570nmに現れる信号をイメージ化した。フィールド当たり免疫陽性凝集体の数を測定した後、ImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/,NIH)を使用して定量し、DAPIで染色された細胞の数を用いて標準化した。
(1)シリンダーテスト(cylinder test)
非対称的な前肢の使用をテストに用いた。20cmの透明プラスチックシリンダーに実験動物を入れ、シリンダー壁に前足が接触する回数を測定した。動物当たり20〜30回程度(接触に対して前方/後方および正反対に完全に実行された場合)の壁接触を測定した。損傷した大脳に相当する前肢接触の回数は、全体前肢接触の回数で割って百分率で表現された。互いに異なるグループに対して盲目の審査官がすべての分析を行った。
すべての動物は、行動実験に先立って30分間順応させた。行動実験用ポールは、包帯ガーゼで包まれた直径9mmの75cm金属ポールを使用して作った。マウスを柱の頂で(極の頂から7.5cm)頭を上に向かうように配置し、電柱の柱に到達するのにかかる総時間を記録した。実際実験に先立ってすべてのマウスを2日間連続訓練させた。各訓練セッションは、3回の個別的な訓練で構成し、試験当日にすべてのマウスを3回のセッションで評価し、総時間を記録した。テストおよび録画を中断する最大遮断時間は、60秒であった。ターンダウン、下り坂、総時間(秒)に対する結果を記録した。
hA53Tα−synマウスの場合、後肢のクラスピングがテストされた。尻尾を掴んだ動物の後肢のクラスピングを10秒間観察し、各テストに対する点数は、下記の基準によって決定された。
1)点数0:後肢が外側に持続的に広がって腹部から遠ざかる場合。
2)点数1:1つの後肢が腹部側に5秒以上後退した場合。
3)点数2:2つの後肢が部分的に腹部側に5秒以上後退した場合。
4)点数3:両側の後肢が完全に後退して5秒以上腹部に触れた場合。
データは、少なくとも3回の独立的な実験から平均±標準偏差で測定された。統計的有意性を評価するために、Prism6ソフトウェア(GraphPad)を使用してBonferroni事後分析と共に Student’s tテストやANOVAテストを行った。p<0.05の評価は、有意なものと見なされた。
1.α−synフィブリル化およびフィブリル分解に対するグラフェン量子ドットの効果
図1aは、本発明によって製作されたグラフェン量子ドットの有無によるα−synフィブリル化およびフィブリル分解効果に対する模式図である。
図2aは、ビオチン化したグラフェン量子ドットとα−synフィブリル間の結合をTEMを使用して低倍率および高倍率で確認した結果である。三角形形状の矢印は、超小型金−ストレプトアビジンナノ粒子と結合したビオチン化したグラフェン量子ドットを示す。図2aに示されたように、グラフェン量子ドットとα−synフィブリルとが結合されていることを確認することができた。
図3a〜図3cは、10DIVマウス由来大脳皮質神経細胞で7日間(n=4)グラフェン量子ドット(1μg/ml)の不在および存在下にα−syn PFFs(1μg/ml)を処理し、TUNELにより評価された神経細胞の死滅(図3a)、alamar Blue(図3b)およびLDH分析(図3c)結果を示すグラフである。図3a〜図3cに示されたように、グラフェン量子ドットは、細胞に毒性を示さず、α−syn PFFsにより現れる細胞毒性を有意的に減少させることを確認することができた。
図4aは、C57BL/6マウスの線条体にα−syn PFFs(5μg)を注入した座標を示す模式図である。50μgのグラフェン量子ドットまたはPBSを隔週で6ヶ月間腹腔注射した。
図5は、in vitroおよびin vivoでの病理学的α−syn凝集現象の転移および増殖により誘発された病因に対するグラフェン量子ドットの抗凝集効能に対する模式図である。グラフェン量子ドットがない場合、病理学的α−syn単量体は、自発的線維化を経て線維状凝集体を形成し、結局、ドーパミン性ニューロン、LB/LN類似体構成および行動異常を誘導する。反面、グラフェン量子ドットは、α−synのフィブリル化を抑制し、形成されたフィブリルを単量体に分解して、ドーパミン性神経細胞の損失、異常なα−synフィブリルにより誘発されるLB/LN類似体および行動障害を予防および治療することができる。
図6aは、カーボンファイバーで熱酸化切断で合成されるグラフェン量子ドットを示す模式図である。
図7aは、多様な反応時点(0、6、12、24および72時間、各時点でn=50フィブリル)でα−synフィブリル長さの分布を示すグラフである。図7aに示されたように、反応前には、600nm以上の長いα−synフィブリルが観察されたが、反応時間が長くなるほど単量体形態のα−synが観察されることを確認することができた。
図8aは、グラフェン量子ドット(5mg/ml)の不在(上段)および存在(下段)下に1時間の間反応させた線維化α−syn PFFs(5mg/ml)の代表的なTEMイメージであり、図8bは、1時間の間反応させた後、α−syn PFFsの終端間長さ(n=286;PFFs、n=249;PFFs+GQDs、***P<0.001;Student’s t−テスト、エラーバーは標準偏差)を示すグラフである。図8aおよび図8bに示されたように、グラフェン量子ドットが線維化α−syn PFFsを分解して終端間長さが減少したことを確認することができた。
図9aは、15N−標識α−syn単量体(黒色)のみが培養された場合とグラフェン量子ドットと共に培養されたα−syn(赤色)の1H−15N HSQCスペクトルが完全に重なることを示す。割り当てられた残基は、15N−標識α−syn単量体グループだけで現れた。図9bは、グラフェン量子ドットと共に培養された15N−標識α−syn単量体の完全なHSQCスペクトルを示す。15N−標識α−syn単量体グループのピーク強度に基づいて、ピーク強度での非減少または最小減少を有する残留物(赤色)、ピーク強度での顕著な減少を有する残留物(青色)および消えた残留物(黒色)は、目立って現れる。これを通じて、グラフェン量子ドットがα−synを構成するアミノ酸のN−末端または正電荷を帯びる残基と結合することを確認した。
図10aは、代表的なTUNEL−陽性神経細胞のイメージである。DIV10 1次大脳皮質神経細胞にグラフェン量子ドット(1μg/ml)の不在および存在下でα−syn PFFs(1μg/ml)を処理した。TUNEL分析は、7日間培養した後に行われた。図10aに示されたように、α−syn PFFsのみを処理した実験群の場合には、赤色蛍光が多数観察される反面、α−syn PFFsとグラフェン量子ドットを共に処理した実験群の場合には、赤色蛍光が減少して、α−syn PFFsによる細胞死滅が減少したことを確認することができた。
図11aは、グラフェン量子ドット(1μg/ml)の不在および存在下でα−syn PFFs(1μg/ml)を処理し7日間培養した主な大脳皮質神経細胞の代表的な8−OHG(8−hydroxyguanine)免疫染色イメージであり(各グループ当たりn=4)、図11bは、8−OHGの量を免疫蛍光レベルで定量化したグラフである。図11aおよび図11bに示されたように、α−syn PFFsを単独で処理した場合には、酸化ストレスが増加するが、α−syn PFFsとグラフェン量子ドットを共に処理した場合には、α−syn PFFsによる酸化ストレスが減少することを確認することができた。
10DIVマウスの大脳皮質神経細胞に3日前(n=4,Before)、同時(n=4,Simul)およびグラフェン量子ドット処理(1μg/ml)後に培養3日目(n=4,After)にα−syn PFFs(1μg/ml)を処理した。
図13aは、血液脳関門透過性体外実験の模式図である。
図14aは、低倍率および高倍率のSNでIba−1に対する代表的な免疫組織化学染色を実施したイメージである。α−syn PFFsが注入されたSN半球に属するミクログリアを特異的マーカーであるIba−1(イオン化カルシウム結合タンパク質、ミクログリア/マクロファージの特異的マーカー)で染色した。そして、図14bは、染色されたIba−1−陽性ミクログリアを定量化したグラフである(n=5)。図14aおよび図14bに示されたように、α−syn PFFsにより増加したIba−1−陽性ミクログリアがグラフェン量子ドットにより抑制されることを確認することができた。
本発明のグラフェン量子ドットが脳幹で膠質細胞の活性化に及ぼす影響を確認するために、hA53Tα−syn Tgマウスの脳幹の青斑(locus coeruleus;LC)を用いて実験を進めた。
図16aは、alamarBlueおよびLDH分析法で7日間培養したDIV10大脳皮質神経細胞でグラフェン量子ドットの細胞毒性を測定したグラフである(n=4、各時点、NSは、有意でない、post−hoc Bonferroniテストを使用する1−way ANOVA、エラーバーは標準偏差)。図16aに示されたように、グラフェン量子ドットは、長期間培養時にも細胞毒性を示さないことを確認することができた。
図17aは、機能的グループに対する指定されたピークを有する原始グラフェン量子ドット(黒色)、nano−GOs(ナノグラフェンオキシド、緑色)および還元GQDs(rGQDs、紫色)のFT−IRスペクトルを示すグラフである。そして、図17bは、代表的なラインプロファイルを有するnano−GOsおよびグラフェン量子ドットのAFMイメージである。図17bに示されたように、nano−GOsは、平均5nm程度の高さを示すが、グラフェン量子ドットの場合には、0.1〜3nmの高さを示すことを確認することができた。
Claims (17)
- 表面が負電荷を示し、
平均直径が0.5〜10nmであり、平均高さが0.1〜3nmであり、
炭素と酸素のwt%比率が4.0〜6.5:3.0〜6.0の比率で構成されたものである、グラフェン量子ドット。 - 前記グラフェン量子ドットは、末端官能基としてカルボキシル基を含むものである、請求項1に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記末端官能基は、FT−IRスペクトルでカルボキシル基の−C=Oピークおよび芳香族−C=C−ピークの吸光度の比率が1:1以上である、請求項2に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記吸光度の比率が1:1〜2:1である、請求項3に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記−C=Oピークは、1700〜1750cm−1に現れ、前記芳香族−C=C−ピークは、1600〜1650cm−1に現れるものである、請求項3に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記平均直径が1〜5nmである、請求項1に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記平均高さが0.5〜2.5nmである、請求項1に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記グラフェン量子ドットは、α−synフィブリル化を抑制したり、またはα−synフィブリルを分解するものである、請求項1に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記グラフェン量子ドットは、血液脳関門(BBB)を通過するものである、請求項1に記載のグラフェン量子ドット。
- 前記グラフェン量子ドットは、体内毒性がないものである、請求項1に記載のグラフェン量子ドット。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のグラフェン量子ドットを有効成分として含む、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患は、退行性神経疾患、炎症性疾患または代謝性疾患である、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記退行性神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、認知症、脳卒中、アミロイド症、線維症、脳症および多発性硬化症よりなる群から選ばれた1つ以上である、請求項12に記載の薬学的組成物。
- 前記炎症性疾患は、紅斑、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋肉痛、甲状腺機能低下症、甲状腺機能昂進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、重症筋無力症、メニエール症候群(Meniere’s syndrome)、ギラン・バレー症候群(Guilian−Barre syndrome)、シェーグレン症候群(Sjogren’s syndrome)、子宮内膜症、乾癬、白斑、全身性強皮症および潰瘍性大腸炎よりなる群から選ばれた1つ以上である、請求項12に記載の薬学的組成物。
- 前記代謝性疾患は、糖尿病、高血圧、高脂血症、脂質異常症および非アルコール性脂肪肝疾患よりなる群から選ばれた1つ以上である、請求項12に記載の薬学的組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のグラフェン量子ドットを有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のグラフェン量子ドットを有効成分として含む組成物の神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療用途。
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