ES2308432T3 - Complejos con actividad de adyuvante. - Google Patents

Abstract

Complejo que comprende un polímero que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, dicho polímero teniendo una polidispersidad de 1,7 o inferior; un peso molecular de 100.000 o inferior; y que incluyen unidades de la fórmula general (I): (Ver fórmula) donde R es hidrógeno, metilo o ácido carboxílico y R 1 es hidrógeno o C1-6 alquilo; o una sal del mismo; y (i) una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, o (ii) una sustancia con actividad farmacológica contra un cáncer, o (iii) uno o más agentes seleccionados de antígenos e inmunógenos.

Description

Complejos con actividad de adyuvante.

La presente invención se refiere a complejos que tienen propiedades de adyuvantes.

Antecedentes de la invención

La inmunidad protectora contra la exposición a agentes patógenos se consigue por la integración de dos ramas diferentes de respuestas inmunes. Éstas son la respuesta innata y la respuesta específica de los antígenos, también llamada adaptativa. La respuesta inmune innata actúa enseguida después de la infección, en algunos minutos, detectando y respondiendo a señales amplias de agentes patógenos invasores. Por contraste, la respuesta inmunitaria adaptativa requiere tiempo, hasta dos semanas, para hacerse eficaz, pero proporciona la especificidad fina antigénica que es requerida para completar la eliminación del patógeno y para la generación de memoria inmunológica. El reconocimiento independiente de antígenos de agentes patógenos por el sistema inmunológico innato conduce a la movilización inmediata de mecanismos inmunes ejecutadores y reguladores que proporcionan al huésped tres ventajas de supervivencia importantes:

(i)

iniciación rápida de respuestas inmunes, tanto innatas como adaptativas, y la creación del entorno inflamatorio y coestimulador requerido para el reconocimiento de antígenos.

(ii)

Establecimiento de una primera línea de defensa para mantener el patógeno en control durante la maduración de la respuesta adaptativa.

(iii)

direccionamiento de la respuesta inmune adaptativa hacia los elementos celulares o humorales de la respuesta inmune que son más eficaces para la protección contra un agente infeccioso particular.

Así, aunque el objetivo global de la vacunación es la activación de la inmunidad específica de los antígenos, las vacunas no pueden conseguir este objetivo óptimamente sin activar primero y eficazmente los mecanismos de detección de patógenos de la respuesta inmune innata.

Muchas vacunas comprenden antígenos y adyuvantes. Éstas se definen en general por su capacidad funcional para realzar la inmunogenicidad in vivo de los antígenos con los cuales éstas son coadministradas. Como tales, los adyuvantes representan componentes importantes de la mayoría de las vacunas exitosas, particularmente vacunas basadas en subunidades de patógenos incluyendo fracciones aisladas de los patógenos destruidos y/o antígenos recombinantes. No obstante, como consecuencia de la apreciación de desarrollo de mecanismos inmunológicos innatos, y de detalles del procesamiento y de la presentación de antígenos, se requieren adyuvantes nuevos y más sofisticados. En consecuencia, los adyuvantes tradicionales y los nuevos están ahora siendo separados cada vez más entre aquellos que actúan como un sistema de entrega y aquellos que actúan como potenciadores inmunológicos. Mientras que la función principal de un sistema de entrega es localizar los componentes de la vacuna para las células que presentan antígenos, los potenciadores inmunológicos directamente activan las células que presentan antígenos a través de receptores específicos que incluyen receptores tipo peaje.

Es importante tener en cuenta que los agentes infecciosos y la mayoría de vacunas autorizadas, particularmente los productos celulares completos vivos, atenuadas y destruidos, contienen todos los componentes necesarios para activar una respuesta inmunitaria integrada. Esto es así porque los patógenos usados en tales vacunas poseen todos los antígenos pertinentes en una forma granulosa, como una célula en conjunto, que también contiene muchos moduladores inmunológicos potentes; es decir, modelos moleculares asociados a los patógenos. No obstante, la tendencia en el desarrollo de vacunas de subunidades es alejarse de estos productos hacia vacunas de definidas más seguras y mejores que son producidas como proteínas recombinantes altamente purificadas. Desafortunadamente, tales antígenos recombinantes son frecuentemente poco inmunogénicos porque carecen de actividad potenciadora inmunológica intrínseca. El reto en el desarrollo de vacunas de subunidades es por lo tanto la reintroducción de señales selectivas para la activación de la respuesta inmunitaria innata que sería suficiente para imitar enfoques de infección natural o de vacunación de células patógenas enteras. Los sistemas de entrega y los potenciadores inmunológicos usados para mejorar la potencia de vacunas de subunidades deberían ser de bajo coste, más eficaces y más seguras que las vacunas de células enteras.

Aunque los términos "sistema de entrega" y "adyuvante" han sido usados generalmente de forma intercambiable en relación con las vacunas, una distinción clara puede hacerse frecuentemente y el papel respectivo de cada una puede ser claramente definido. En las listas de "adyuvantes" de vacunas se incluyen varios sistemas de entrega en forma granulosa, p. ej., emulsiones, liposomas, complejos inmunoestimulantes, virus como partículas y micropartículas, cuyo modo de acción fundamental es promover la entrega de antígenos en las células que presentan células que presentan antígenos claves responsables de la inducción de respuestas inmunológicas. No obstante, estos son moduladores inmunológicos pobres y su potencia en consecuencia necesita ser mejorada significativamente por la adición de un inmunopotenciador. A menos que se especifique lo contrario, el término "adyuvante" se utiliza en este caso para indicar un inmunopotenciador. El impedimento principal al desarrollo de adyuvantes nuevos y mejorados como potenciadores inmunológicos ha sido la seguridad porque las vacunas nuevas deben tener un número mínimo de efectos adversos para que sean aceptables para el uso clínico. Como resultado, aunque muchos adyuvantes han sido ampliamente evaluados preclínicamente y clínicamente, sólo las fuentes de aluminio, genéricamente llamadas "alumbre", han sido autorizadas de forma exitosa para el uso como un adyuvante vacunal en Norteamérica. El alumbre es pobre en cuanto a la generación de inmunidad de las células T CD8 citotóxicas. Preferentemente induce una respuesta inmune Th2 desviada mejor que una respuesta inmune Th1 desviada.

Aunque se ha establecido una prueba de concepto en animales para el uso de muchas moléculas del modelo molecular asociadas a patógenos naturales como adyuvantes de potenciadores inmunológicos, la tendencia para el futuro es diseñar análogos sintéticos. Esto se debe principalmente a los costes de fabricación más bajos y a menos impedimentos reguladores asociados a los potenciadores inmunológicos sintéticos definidos y estandarizados.

Fue demostrado ya en 1968 que diferentes polímeros sintéticos polianiónicos protegen a los ratones desafiados con una dosis letal de virus de Meningo y que los macrófagos peritoneales de la murina producen factores que inhiben los virus de la estomatitis vesicular cuando se exponen al copolímero de carboxilato o una sal del mismo in vitro (Merigan & Finkelstein. Interferon stimulating and in vivo antiviral effects of various synthetic anionic polymers. Virology 1968. 35: 363-374).

Más recientemente, los alginatos (polímeros aislados de algas marinas) han demostrado que suscitan la liberación de TNF-\alpha, IL-1 y IL-6 (Otterlei M et al. Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate. J. Immunother. 1991. 10: 286-291). Las fracciones de ácido 1-4-\beta-manurónico de alginatos también indujeron la liberación de TNF-\alpha a través de un mecanismo mediado por el receptor 4 CD14/tipo peaje de los monocitos. Los derivados de lignina y fucoidano también suscitan la liberación de TNF-\alpha de los macrófagos (Sorimachi K et al. Secretion of TNF-\alpha from macrophages following induction with a lignin derivative. Cell Biol. Int. 1995; 19: 833-838; Heinzelmann et al. Modulation of LPS-induced monocyte activation by heparin-binding protein and fucoidan. Infect. Immun. 1998. 66: 5842-5847). Los fucanos sulfatados y el sulfato de dextrano también han demostrado que aumentan espectacularmente los niveles circulantes de IL-6, IL-8, MCP-1, M-CSF y G-CSF cuando se inyectan en macacos cola de cerdo (Sweeney EA et al. Mobilization of stem/progenitor cells by sulphated polysaccharides does not require selectin presence. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. 6: 6544-6549).

Las quimiocinas son un grupo heterogéneo de citoquinas quimioatractivas proinflamatorias inducibles que incluyen TNF-\alpha, IL-1 y IL-6. Las \beta-quimiocinas, que incluyen MIP-1\alpha y MIP-1\beta, actúan como quimioatrayentes para monocitos, eosinófilos, basófilos y linfocitos (Luster AD. Chemokines - chemotactic cytokines that mediate inflammation. New Eng. J. Med. 1998; 338:436-446). La unión de quimiocinas a sus receptores respectivos conduce a una cascada de activación celular incluyendo la generación de trifosfato de inositol, la liberación de calcio intracelular, y la activación de la proteína quinasa C. Por lo tanto, las quimiocinas activan los mecanismos celulares que controlan la quimiotaxis. Como tales, éstas juegan un papel fundamental en el reclutamiento de leucocitos en las áreas en las que estos se acumulan y en la generación de respuestas inmunes locales.

No obstante, una liberación excesiva de citoquinas proinflamatorias por los polímeros mencionados arriba significa que éstas son demasiado tóxicas para ser administradas de forma segura en el hombre. En consecuencia, aunque muchos polímeros han demostrado que tienen propiedades inmunomoduladoras, estos nunca han sido aprovechados eficazmente para el uso terapéutico en el hombre por los problemas asociados a su aislamiento de fuentes naturales, a la reproductibilidad del aislamiento, a la síntesis de los polímeros sintéticos en el laboratorio, y a la toxicidad de los polímeros cuando estos son administrados en animales.

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Resumen de la invención

La presente invención proporciona un complejo tal y como se define en la reivindicación 1, que comprende un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, y

(i)

una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, o

(ii)

una sustancia con actividad farmacológica contra un cáncer, o

(iii)

uno o más agentes seleccionados de antígenos e inmunógenos.

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La presente invención también proporciona una preparación farmacéutica que comprende un complejo de la presente invención en mezcla o en relación con un portador farmacéuticamente adecuado.

La presente invención además proporciona un complejo de la invención para el uso como un medicamento.

La invención también proporciona un complejo para el uso en el tratamiento de una infección por un organismo patógeno y/o para inducir una respuesta inmune al organismo patógeno, dicho complejo comprende un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1 y una sustancia con actividad farmacológica contra el organismo patógeno.

La invención además proporciona un complejo para el uso en el tratamiento de un cáncer, dicho complejo comprende un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1 y una sustancia con actividad farmacológica contra el cáncer.

La invención además proporciona un complejo que comprende un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1, y uno o más agentes seleccionados de antígenos e inmunógenos, para inducir una respuesta inmune al antígeno o inmunógeno.

La invención además proporciona un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal derivada, para el uso con una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno para el tratamiento de una infección por el organismo patógeno y/o para inducir una respuesta inmune al organismo patógeno.

La invención además proporciona un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal derivada, para el uso con uno o más agentes seleccionados de antígenos e inmunógenos para inducir una respuesta inmune al antígeno o inmunógeno.

La invención además proporciona un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1 para el uso con una sustancia que tiene actividad farmacológica contra un cáncer para el tratamiento del cáncer y/o para inducir una respuesta inmune al cáncer.

La invención además proporciona un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1, para el uso como un adyuvante inmunopotenciador en la producción de una vacuna.

La invención además proporciona un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1, para el uso como un adyuvante inmunopotenciador en la producción de una vacuna que comprende un antígeno o inmunógeno contra el cual debe ser inducida una respuesta inmune.

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Definiciones

El término "un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo" como se utiliza en este caso se refiere a un polímero que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, como se describe en este caso, por ejemplo, un polímero que incluye unidades derivadas de ácido metacrílico o una sal del mismo, por ejemplo, un ácido polimetacrílico o una sal del mismo, por ejemplo una sal sódica del mismo. El polímero puede ser bien un homopolímero o copolímero de un ácido acrílico, por ejemplo, de ácido acrílico o ácido metacrílico o una sal del mismo.

El polímero tiene una distribución estrecha del peso molecular, es decir, una polidispersidad de 1,7 o inferior, por ejemplo 1,6 o inferior, por ejemplo 1,5 o inferior, por ejemplo 1,4 o inferior, por ejemplo 1,2 o inferior, por ejemplo inferior a 1,7, por ejemplo inferior a 1,6, por ejemplo inferior a 1,5, por ejemplo inferior a 1,4, por ejemplo, inferior a 1,2. En general, cuanto más baja es la polidispersividad, mejor. Por consiguiente, una polidispersividad inferior a 1,2 es generalmente preferida.

El polímero generalmente tiene un peso molecular de manera que, cuando está presente en la sangre, el polímero permanece sustancialmente en la sangre circulante después de pasar a través del riñón, con poco o nada del polímero sometido a filtración a través del aparato glomerular. La filtración renal (también conocida como filtración glomerular) de moléculas grandes es una función entre otras cosas del tamaño y de la forma de la molécula, que en parte es dependiente del peso molecular. En general, para cualquier polímero particular, hay un umbral de peso molecular o una gama estrecha de pesos moleculares por debajo de la cual ocurre la filtración renal y por encima de la cual ocurre poca o ninguna filtración renal. El umbral de peso molecular para cualquier polímero particular puede ser determinado por pruebas estándares, por ejemplo, usando un polímero radiomarcado.

El polímero tiene un peso molecular de 100.000 o inferior, por ejemplo, 80.000 o inferior, por ejemplo, 75.000 o inferior, por ejemplo, 65.000 o inferior, por ejemplo, 55.000 o inferior, por ejemplo, 45.000 o inferior, por ejemplo. El polímero generalmente tiene un peso molecular de 4.000 o superior, por ejemplo, 5.000 o superior, por ejemplo, 10.000 o superior, por ejemplo, 20.000 o superior, por ejemplo, 30.000 o superior, por ejemplo, 40.000 o superior. Un polímero puede tener un peso molecular dentro de una gama que combina cualquiera de los valores de peso molecular superiores proporcionados arriba con cualquiera de los valores de peso molecular inferiores proporcionados arriba. Ejemplos de tales gamas incluyen pero no se limitan a gamas de 80.000 a 4.000, 75.000 a 5.000, 65.000 a 10.000, 55.000 a 10.000, y 45.000 a 10.000. Ejemplos adicionales incluyen las gamas de 50.000 a 4.000, por ejemplo, de 40.000 a 25.000. Pesos moleculares en la gama de 45.000 a 10.000 pueden ser preferidos.

El término "PMAA-Na" se utiliza en este caso para referirse a la sal sódica del ácido polimetacrílico. A menos que se indique lo contrario, se refiere a una sal sódica del ácido polimetacrílico preparada como se describe en los Ejemplos A1 a A4.

El término "complejo" se utiliza en este caso para indicar una asociación entre un polímero de distribución estrecha de peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo y otra sustancia tal y como se define en la presente, la asociación entre los componentes siendo principalmente no covalente, por ejemplo, implicando una cualquiera o más de las fuerzas fónicas, electroestáticas y de van der Waals. Aunque un complejo según la presente invención predominantemente implica la asociación no covalente entre los componentes, puede sin embargo haber algún enlace covalente.

Breve descripción de las figuras Figura 1

La Figura 1 muestra la tisis de glóbulos rojos tras la incubación de células con PMAA-Na en RPMI.

Una solución al 2% v/v de glóbulos rojos humanos fue incubada con una solución de PMAA-Na ("fármaco") en medios RPMI 1640 durante 1 h y 24 h a 37°C. No se observó ninguna toxicidad significante con la PMAA-Na hasta una concentración de 2.000 \mug/ml después de 1 h o después de 24 horas. La figura muestra los resultados para 3 donantes humanos (A, B y C). La Figura 1a muestra los resultados obtenidos para el donante A, la Figura 1b los resultados obtenidos para el donante C y la Figura 1c los resultados para el donante B. Los resultados obtenidos tras la incubación durante 1 hora están mostrados como círculos, los resultados tras la incubación durante 24 horas están mostrados como diamantes.

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Figura 2

La Figura 2 muestra la tisis de glóbulos rojos en toda la sangre tras la incubación con PMAA-Na en RPMI.

Una solución al 2% v/v de toda la sangre humana (donante D) fue incubada con una solución de PMAA-Na ("fármaco") en RPMI 1640. No se observó ninguna toxicidad significante con la PMAA-Na usando toda la sangre humana hasta una concentración de 500 \mug/ml después de 1 h (mostrado como cruces), después de 6 h (mostrado como triángulos) o después de 24 horas (mostrado como círculos).

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Figura 3

La Figura 3 muestra la falta de toxicidad de PMAA-Na en macrófagos derivados de monocitos humanos (figura 3a) y en macrófagos peritoneales primarios humanos (figura 3b).

La Figura 3a muestra los resultados obtenidos cuando los macrófagos derivados de monocitos fueron incubados con medios que contenían PMAA-Na por encima de la gama de concentración de 0 a 2.000 \mug/ml. Las células fueron incubadas durante 71 h antes de la adición de azul de tiazolilo (MU, Sigma 5 mg/ml). Los resultados obtenidos usando PMAA-Na están mostrados como cuadrados cerrados, los resultados con poli(L-lisina), usada como control, están mostrados como círculos. PMAA-Na no fue tóxica para MDMs en la concentración máxima de 2.000 \mug/ml evaluado usando el ensayo MTT y el ensayo de azul tripán.

La Figura 3b muestra los resultados obtenidos cuando las células peritoneales humanas fueron cultivadas con PMAA-Na por encima de la gama de concentración de 0 a 2.000 \mug/ml. Las células fueron incubadas durante 71 h antes de la adición de MTT. Los resultados obtenidos usando PMAA-Na están mostrados como cuadrados cerrados, los resultados con poli(L-lisina), usados como control, están mostrados como círculos. PMAA-Na no fue tóxica para los macrófagos peritoneales hasta 500 \mug/ml. Entre 500 \mug/m y 2.000 \mug/ml, una cantidad modesta de toxicidad fue vista usando el ensayo MTT y los ensayos de azul tripán.

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Figura 4

La Figura 4 muestra la liberación de MI P-1\beta de macrófagos peritoneales humanos por PMAA-Na sin endotoxina.

Las células peritoneales humanas de 3 donantes A, B y C) fueron cultivadas con PMAA-Na sin endotoxina (500 \mug/ml) y los sobrenadantes del cultivo cosechados después de 36 h fueron analizados para MIP-1\beta. Todos los reactivos y la PMAA-Na contenían <0,06 unidades de endotoxina/ml (EU/ml).

La Figura 4a muestra los resultados obtenidos para el donante A, la Figura 4b para el donante B y la Figura 4c para el donante C. Hubo una liberación significante de MIP-1\beta en presencia de PMAA-Na.

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Figura 5

La Figura 5 muestra la liberación de TNF-\alpha de macrófagos peritoneales humanos por PMAA-Na sin endotoxina. Las células peritoneales humanas de 2 donantes (A y B, Figuras 5a y 5b, respectivamente) fueron cultivadas con PMAA-Na sin endotoxina (500 \mug/ml y 2.000 \mug/ml) y los sobrenadantes del cultivo cosechados después de 36 h fueron analizados para TNF-\alpha. Hubo una liberación significante de TNF-\alpha en presencia de PMAA-Na con ambas concentraciones.

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Figura 6

La Figura 6 muestra la liberación de quimiocinas y citoquinas de macrófagos peritoneales humanos de un donante único incubados con control del medio o con PMAA-Na.

Las células peritoneales humanas fueron cultivadas con PMAA-Na (500 \mug/ml) y los sobrenadantes del cultivo cosechados después de 36 h fueron analizados para las quimiocinas proinflamatorias MIP-1\alpha, MIP-1\beta y IL-8, y para las citoquinas proinflamatorias TNF-\alpha, IL-1\beta y IL-6. Los resultados con células de hasta 3 donantes humanos diferentes (A, B y C) están mostrados. Los resultados obtenidos con el control del medio están mostrados como bloques abiertos, aquellos obtenidos con PMAA-Na como bloques negros. La liberación de MIP-1 está mostrada en la figura 6a, TNF-\alpha en la figura 6b, MIP-1\beta en la figura 6c, IL-8, y para las citoquinas proinflamatorias TNF-\alpha, IL-1\beta en la figura 6d, IL-8 en la figura 6e, y IL-6 en la figura 6f. La liberación de estas quimiocinas y citoquinas de células que presentan antígenos tisulares se hizo a un nivel que promovió una respuesta Th1 farmacológica en el hombre pero no fue lo suficiente alta para causar efectos secundarios adversos significantes en el hombre.

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Figura 7

La Figura 7 muestra la liberación de MIP-1\beta de macrófagos derivados de monocitos humanos por PMAA-Na sin endotoxina.

Los macrófagos derivados de monocitos fueron cultivados con PMAA-Na a concentraciones de 100 \mug/ml, 500 \mug/ml y 2.000 \mug/ml. Los resultados con células de 3 donantes humanos diferentes A, B y C están mostrados en las Figuras 7a, 7b y 7c, respectivamente. No se vio ninguna liberación de MIP-1\beta. Hay en consecuencia un efecto inmunomodulador diferencial de PMAA-Na en células provenientes de monocitos sanguíneos en comparación con células provenientes de macrófagos de compartimentos del cuerpo tisular.

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Figura 8

La Figura 8 muestra la liberación de MIP-1\beta de macrófagos peritoneales humanos por PMAA-Na pero no por PMAA-Na comercialmente disponible.

Los macrófagos peritoneales humanos fueron cultivados con PMAA-Na comercialmente disponible (Polymer Standards Service, Alemania) de una gama de MWfs (M_{n} = 1.300, 22.100 y 129.000 g/mol) y distribución estrecha del peso molecular y con PMAA-Na producida como se describe en este caso. Una de las PMAA-Na comercialmente disponibles tenía un Peso molecular comparable a PMAA-Na preparada como se describe en los Ejemplos Al a A4 (Mn = 22.000 g/mol) (PMAA-Na en la Figura). En cada caso se usaron 500 \mug/ml de la PMAA-Na. Los sobrenadantes del cultivo fueron cosechados después de 36 h. No hubo liberación de MIP-1\beta. Figuras 8a y 8b muestran los resultados individuales de 2 donantes humanos A y B, respectivamente.

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Figura 9

Figura 9 muestra la liberación de TNF\alpha- de macrófagos peritoneales humanos por PMAA-Na pero no por PMAA-Na comercialmente disponible.

Los macrófagos peritoneales humanos fueron cultivados con PMAA-Na comercialmente disponible (Polymer Standards Service, Alemania) de una gama de pesos moleculares (M_{n} = 1.300, 22.100 y 129.000 g/mol) y una distribución estrecha del peso molecular y con PMAA-Na producida como se describe en este caso. Una de las PMAA-Na comercialmente disponibles tenía un Peso molecular comparable para nuestra preparación sintética de PMAA-Na (M_{n} =
22.000 g/mol) (PMAA-Na en la Figura). Se usó en cada caso 500 \mug/ml de la PMAA-Na. Los sobrenadantes del cultivo fueron cosechados después de 36 h. No hubo liberación de TiVF-\alpha. Figuras 9a y 9b muestran los resultados individuales de dos donantes humanos A y B, respectivamente.

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Figuras 10, 11 y 12

Figuras 10, 11 y 12 muestran lisis de glóbulos rojos tras la incubación con anfotericina B o con complejo anfotericina B-PMAA-Na.

El método fue como se describe para la Figura 1. La comparación fue hecha entre la anfotericina B de categoría clínica (anfo B, los resultados se muestran como cuadrados abiertos) y el complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el Ejemplo C. (anfo B-PMAA-Na, los resultados se muestran como círculos abiertos). Se prepararon soluciones concentradas de los compuestos para la prueba en MGM. La tisis de glóbulos rojos humanos fue determinada después de 1 hora (figura 10), 6 horas (figura 11) y 24 horas (figura 12) de incubación. En cada caso las células obtenidas de 3 donantes diferentes (A, B y C) fueron usadas. Cada línea representa los resultados de un único donante humano.

Las Figuras 10a, 10b y 10c muestran los resultados de una incubación de 1 hora con células de los donantes A, B y C, respectivamente.

Las Figuras 11a, 11b y 11c muestran los resultados de una incubación de 6 horas con células de los donantes A, B y C, respectivamente.

Las Figuras 12a, 12b y 12c muestran los resultados de una incubación de 24 horas con células de los donantes A, B y C, respectivamente. No se vio ninguna toxicidad con la preparación de anfotericina B-PMAA-Na después de una incubación de 1 hora. Después de una incubación de 6 horas, la toxicidad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na fue considerablemente inferior que aquella de la anfotericina B de categoría clínica. Cuando el período de incubación fue aumentado a 24 h, la toxicidad de la anfotericina de categoría clínica B aumentó al 100% pero no hubo ningún aumento adicional en la toxicidad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na.

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Figura 13

La Figura 13 muestra la tisis de glóbulos rojos en un único donante tras la incubación con el complejo de anfotericina B-PMAA-Na.

El método fue tal y como se describe para la figura 11, el complejo de anfotericina B-PMAA-Na siendo preparado como se describe en el Ejemplo C. El grado de tisis de glóbulos rojos por la preparación de anfotericina B-PMAA-Na ("fármaco") fue determinada después de una incubación de 1 hora y 24 horas para concentraciones de hasta 1.000 \mug/ml. Los resultados obtenidos después de una incubación de 1 hora están mostrados como cuadrados abiertos, los resultados después de una incubación de 24 horas como círculos cerrados.

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Figura 14

La Figura 14 muestra la falta de toxicidad del complejo de anfotericina B-PMAA-Na después de un cultivo de 1, 2 y 6 días con células PBMN. PBMCs en medio RPMI fueron cultivadas con medios que contenían el complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el ejemplo C ("fármaco") sobre la gama de concentración de 0 a 70 \mug/ml. Las células fueron incubadas durante el 1 día o 2 días o 6 días antes de la adición de MTT (5 mg/ml). El compuesto no fue tóxico para PBMCs en la concentración máxima de 70 \mug/ml evaluado usando el ensayo MTT y el ensayo de azul tripán después de 1 día de cultivo, 2 días de cultivo o después de 6 días de cultivo. La Figura 14 muestra los resultados individuales de hasta 3 donantes humanos representativos. Cada línea representa un único donante. Las Figuras 14a, 14b y 14c muestran los resultados tras la incubación durante 1 día, 2 días y 6 días, respectivamente.

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Figura 15

La Figura 15 muestra toxicidad del complejo de anfotericina B-PMAA-Na después de 2 y 3 días de cultivo con macrófagos derivados de monocitos.

Los macrófagos derivados de monocitos (MDM) fueron cultivados con medios que contenían los compuestos ("fármacos") hasta una concentración de 125 \mug/ml. Las células fueron incubadas durante 2 días o 3 días antes de la adición de MTT. La obtención de resultados usando anfoteracina B están mostrados como círculos abiertos, los resultados con el complejo de anfoteracina B-PMAA-Na preparado como se describe en el Ejemplo C están mostrados como cuadrados abiertos. La Figura 15a muestra los resultados obtenidos después de 2 días de cultivo, la Figura 15b los resultados después de 2 días de cultivo. La preparación de anfotericina B-PMAA-Na fue menos tóxica que la anfotericina B de categoría clínica en todas las concentraciones hasta 125 \mug/ml evaluado usando el ensayo MTT y el ensayo de azul tripán después de 2 días y después de 3 días de cultivo.

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Figura 16

La Figura 16 muestra viabilidad de promastigotes de Leishmania mexicana tratados con anfotericina o con complejo de anfotericina B-PMAA-Na.

Los promastigotes de Leishmania mexicana usados para estos experimentos fueron mantenidos en un medio de crecimiento con Drosophila de Schneider (Invitrogen) suplementado con un 15% de suero fetal de ternera (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y gentamicina (1 mg/100 ml). El 50% de la dosis letal (LD_{50}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania mexicana fue 0,14 \mug/mi (Figura 16d). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania mexicana fue 1,49 \mug/ml (figura 16d). Los resultados de 3 experimentos con el complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el Ejemplo C están mostrados en las Figuras 16a, 16b y 16c. El 50% de la dosis letal (LD50) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania mexicana fue 0,10 a 0,19 \mug/ml (Figuras 16a, 16b y 16c). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania mexicana fue 1,02 a 1,49 \mug/ml (Figuras 16a, 16b y 16c). La actividad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na contra los promastigotes de Leishmania mexicana fue similar a aquella de la anfotericina B de categoría clínica en una base de peso por peso.

Figura 17

La Figura 17 muestra la viabilidad de los promastigotes de Leishmania donovani tratados con anfotericina o con complejo de anfotericina B-PMAA-Na.

Los promastigotes de Leishmania donivania usados para estos experimentos fueron mantenidos en medios de crecimiento de Schneider 199 suplementados con un 15% de suero fetal de ternera (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y gentamicina (1 mg/100 ml). El 50% de la dosis letal (LD_{50}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania donovani fue 0,08 \mug/ml (Figura 17d). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania donovania fue 1,91 \mug/ml (Figura 17d). Los resultados de 3 experimentos con el complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el Ejemplo C están mostrados en las Figuras 17a, 17b y 17c. El 50% de la dosis letal (LD_{50}) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania donivani fue 0,10 a 0,17 \mug/ml (Figuras 17a, 17b y 17c). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania donivani fue 0,98 a 1,28 \mug/ml (Figuras 17a, 17b y 17c). La actividad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na contra los promastigotes de Leishmania donivani fue en consecuencia similar a aquella de la anfotericina B de categoría clínica en una base de peso-por-peso.

Figuras 18 & 19

La Figura 18 muestra la inhibición del crecimiento de los amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana por el complejo de anfotericina B-PMAA-Na en macrófagos derivados de monocitos humanos. La Figura 19 muestra la inhibición correspondiente usando la anfotericina B de categoría clínica o AmBiosome (anfotericina B liposomal, Gilead Sciences, Great Abingdon, Cambridge, Reino Unido). Los amastigotes de Leishmania mexicana fueron usados para infectar macrófagos derivados de monocitos humanos que fueron mantenidos en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con el 10% de suero humano (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y 200 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina. El índice de infección fue calculado como el número promedio de parásitos/células multiplicado por el porcentaje de células infectadas. Los resultados de cuatro experimentos usando el complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el Ejemplo C están mostrados en las Figuras 18a a 18d. La inhibición usando la anfotericina B de categoría clínica está mostrada en la figura 19a y usando AmBiosome (Gliead Sciences) en la figura 19b. Una inhibición del 50% del crecimiento de amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana fue conseguida con 0,18 a 0,32 \mug/ml de la preparación anfotericina B = PMAA-Na (Figuras 18a a 18d) en comparación con 0,14 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica (figura 19a) o 0,45 \mug/ml de Ambisome (Figura 19b). Una inhibición del 90% del crecimiento de amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana fue conseguida usando 1,18 a 1,55 \mug/ml de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na (Figuras 18a a 18d) en comparación con 0,95 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica (Figura 19a) o 3,89 \mug/ml de Ambisome (Figura 19b).

Figura 20

La Figura 20 muestra la inhibición del crecimiento de amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana en macrófagos humanos por el complejo de anfotericina B PMAA-Na en comparación con AmBiosome.

El gráfico mostrado en la figura 20 compara la pendiente de la actividad relativa del complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el ejemplo C (mostrado como cuadrados abiertos; IC_{50} = 0,3 \mug/ml) y Ambisome (anfotericina b liposomal, Gilead Sciences, Great Abingdon, Cambridge, Reino Unido) (mostrado como círculos cerrados; IC_{50} = 1,7 \mug/ml) contra los amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana. Demuestra que la curva de destrucción para la preparación anfotericina B-PMAA-Na es más pronunciada que la curva de destrucción para Ambisome.

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Figuras 21 y 22

Figuras 21 y 22 muestran la inhibición de los amastigotes intracelulares de Leishmania donivani desarrollados por el complejo de anfotericina B-PMAA-Na en macrófagos derivados de monocitos humanos (cuatro experimentos, mostrados en las Figuras 21a a 21d), por la anfotericina B de categoría clínica (figura 22a) y por AmBiosome (Gilead Sciences, como arriba) (figura 22b).

Los amastigotes de Leishmania donivani fueron usados para infectar macrófagos derivados de monocitos humanos que fueron mantenidos en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con un 10% de suero humano (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y 200 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina. El índice de infección fue calculado como el número medio de parásitos/células multiplicado por el porcentaje de células infectadas. Una inhibición del 50% del crecimiento de los amastigotes intracelulares de Leishmania donivani fue conseguida con 0,30 a 0,71 \mug/ml de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na preparada como se describe en el Ejemplo C (Figuras 21a a 21d) en comparación con 0,54 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica (figura 22a) o 1,96 \mug/ml de AmBisome (figura 22b). Una inhibición dei 90% del crecimiento de los amastigotes intracelulares de Leishmania donivani fue conseguida usando 2,18 a 3,18 \mug/ml del complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el ejemplo C (Figuras 21a a 21d) en comparación con 2,31 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica (Figura 22a) o >8 \mug/ml de AmBisome (Figura 22b).

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Figura 23

La Figura 23 muestra la liberación del interferon-\gamma de macrófagos peritoneales humanos después del cultivo con compuestos diferentes durante 24 horas.

Las células peritoneales humanas fueron cultivadas en un medio de crecimiento de macrófagos con cada compuesto en las concentraciones mostradas. Los compuestos usados fueron el complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el ejemplo C, la anfotericina B de categoría clínica comercial PMAA-Na, y PMAA-Na preparada como se describe en los Ejemplos A1 a A4. Todos los reactivos y compuestos contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Los sobrenadantes del cultivo fueron cosechados 24 h más tarde. El interferon-\gamma fue medido por inmunoanálisis enzimático (EIA) (R & D systems). La liberación de la citoquina promotora de Th1, el interferon-\gamma, de macrófagos peritoneales fue significativamente más alta en presencia de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na (100 \mug/ml) en comparación con células control sólo, la anfotericina B de categoría clínica, PMAA-Na comercial, o PMAA-Na.

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Figura 24

La Figura 24 muestra la proliferación de células PMBC tras la incubación con complejo de

\hbox{tuberculina-PMAA-Na.}

PBMCs fueron resuspendidas en RPMI 1640 suplementado con el 10% de suero humano, 200 \mug/ml de penicilina y 200 IU/ml de estreptomicina. El complejo de tuberculina-PMAA-Na (también llamado tuberculina PPD-PMAA-Na) fue preparado como se describe en el Ejemplo L2. Todos los reactivos y compuestos contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml según fue determinado usando el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus, (Pyrotell, Associates of Cape Cod, EEUU).

Las células (10^{5} células/pocillo) y cada compuesto (tuberculina PPD y tuberculina-PMAA-Na en las concentraciones mostradas) fueron mezcladas por duplicado e incubadas a 37°C/5% CO_{2} durante 4 días. [^{3}H]-timidina (actividad específica 20-30 Ci/mmol; Amersham BioSciences, Reino Unido) fue añadido a 1 \muCi/pocillo durante otras 18 horas. Las células fueron luego cosechadas y la proliferación fue determinada usando un contador de centelleo líquido. Los resultados fueron expresados como la media de cuentas/minuto (cpm) \pm sem. La Figura 24a muestra los resultados obtenidos para la proliferación de PBMC después de 6 días de incubación de las células del donante A con la preparación de tuberculina-PMAA-Na.

La Figura 24a muestra que hubo una proliferación significativamente aumentada de linfocitos T cuando éstas fueron cultivadas con 1 \mug/ml de la preparación de tuberculina-PMAA-Na. Hubo incluso más proliferación de linfocitos T cuando éstas fueron cultivadas con 10 \mug/ml de preparación de tuberculina-PMAA-Na (P = 0,001). La Figura 24b muestra los resultados para la proliferación de PBMC después de 5 días de incubación de las células del donante B con tuberculina PPD y con la preparación de tuberculina-PMAA-Na. Hubo significativamente más proliferación de linfocitos T con 10 \mug/ml de la preparación de tuberculina-PMAA-Na que con 10 \mug/ml de antígeno de tuberculina (P = 0,002). Esto indica que la preparación de tuberculina-PMAA-Na causa significativamente más proliferación de linfocitos T que el antígeno de tuberculina por sí solo.

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Figura 25

La Figura 25 muestra la producción de IFN-\gamma por PMBCs humanas que fueron estimuladas con el antígeno del donante A durante 24 horas. PBMCs humanas fueron aisladas y ajustadas a 2 x 10^{5} células/pocillo en RPMI 1640 suplementado con el 10% de suero humano, 200 \mug/ml de penicilina y 200 IU/ml de estreptomicina. Todos los reactivos y los compuestos contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Las PBMCs y los compuestos (tuberculina y complejo de tuberculina-PMAA-Na, también llamada tuberculina PPD-PMAA-Na, preparada como se describe en el Ejemplo L2, en las concentraciones mostradas) fueron mezclados en los pocillos de una microplaca con PVDF de ELISpot revestida con el anticuerpo monoclonal del interferon-\gamma humano (R&D Systems, Reino Unido). Células sin estimular fueron usadas como el control negativo y el interferon-\gamma recombinante humano fue usado en el control positivo. La placa fue incubada durante 24 horas a 37°C/5% CO_{2}. A continuación, se siguieron las instrucciones del fabricante para desarrollar la microplaca y se contó el número de manchas positivas para el interferon-\gamma. Cada mancha representó una única célula segregadora de interferon-\gamma.

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La Figura 25 muestra el número de células productoras de IFN-\gamma. La Figura 25 muestra que la preparación de tuberculina PPD-PMAA-Na fue significativamente más eficaz que el antígeno de tuberculina solo en la estimulación de la liberación de interferon-\gamma de linfocitos T primarios humanos. Este aumento en la secreción de interferon-\gamma de linfocitos T fue vista con 50 \mug/ml de la preparación de tuberculina PPD-PMAA-Na y con 100 \mug/ml de la preparación de tuberculina PPD-PMAA-Na.

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Figura 26

La Figura 26 muestra la supervivencia de los amastigotes de Leishmania donovani en macrófagos hepáticos de ratón después del tratamiento intravenoso con la anfotericina B de categoría clínica, AmBisome o anfotericina B-PMAA-Na, con controles sin tratar y liposomas vacíos como controles.

Los distintos compuestos fueron usados en las concentraciones mostradas en la Figura 26. El número de amastigotes/500 células hepáticas fue contado microscópicamente y los resultados expresados como un porcentaje del control sin tratar. Hubo actividad destructora significante (P<0,0001) del complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el Ejemplo C a 1 mg/kg de amastigotes de Leishmania donivani en comparación con los controles. Estos resultados muestran que la preparación de anfotericina B-PMAA-Na fue eficaz en este modelo animal de Leishmaniasis visceral.

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Figura 27

La toxicidad de los constructos de PMAA-Na de diferentes pesos moleculares para glóbulos rojos fue establecida usando un ensayo MTT.

Las Figuras 27a a 27c muestran la falta de toxicidad de constructos de PMAA-Na con pesos moleculares variables y producidos como se describe en el Ejemplo N para un único donante de glóbulos rojos. En cada caso la concentración del constructo de PMAA-Na es dada en \mug/ml y la tisis de los glóbulos rojos es dada como un porcentaje. Los cuadrados representan los resultados obtenidos usando un constructo de PMAA-Na de peso molecular 19 kDa, los triángulos los resultados usando un constructo de PMAA-Na de 28 kDa, y los triángulos invertidos los resultados usando un constructo de PMAA-Na de 37 kDa (n=3). La Figura 27a muestra la tisis de los glóbulos rojos (RBCs) tras la incubación durante 1 hora con los constructos de PMAA-Na, la Figura 27b muestra la Tisis de los RBCs después de 5 horas y la Figura 27c muestra la tisis de los RBCs después de 24 horas. Los constructos de PMAA-Na no causaron la tisis de glóbulos rojos a una concentración de 2 mg/ml después de una incubación de 1 h, 5 h y 24 h. Estos resultados no fueron afectados por el peso molecular de los constructos de PMAA-Na realizados.

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Figura 28

La toxicidad de los constructos de PMAA-Na de diferentes pesos moleculares para células mononucleares de la sangre periférica (PMBCs) fue establecida usando un ensayo MTT.

En las Figuras 28a y 28b, la concentración de los constructos PMAA-Na, producidos como se describe en el ejemplo, N, está representada contra el porcentaje de las PMBCs. Los cuadrados representan los resultados obtenidos usando un constructo de PMAA-Na de peso molecular 19 kDa, los triángulos los resultados usando un constructo de PMAA-Na de 28 kDa y los círculos los resultados usando un constructo de PMAA-Na de 37 kDa (n=3). La Figura 28a muestra la viabilidad de las PMBCs tras la incubación durante 1 día con los constructos de PMAA-Na, la Figura 28b muestra la viabilidad de las PMBCs tras la incubación durante 2 días con los constructos. Los constructos no usados fueron tóxicos para células mononucleares de la sangre periférica a 2 mg/ml tras la incubación durante 1 día y durante 2 días. Los resultados no fueron afectados por el peso molecular de los constructos de PMAA-Na realizados.

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Figura 29

La Figura 29 muestra el efecto del almacenamiento de un complejo de anfotericina B-PMAA-Na bajo condiciones complejas diferentes en cuanto a su toxicidad para glóbulos rojos.

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Figura 29a muestra la falta de toxicidad para glóbulos rojos (RBCs, del inglés red blood cells) de un complejo de PMAA-Na que ha sido preparado como se describe en el ejemplo C y almacenado como un polvo liofilizado a 4°C durante 4 meses. El complejo fue incubado con los RBCs durante 1 hora a varias concentraciones y se midió el porcentaje de tisis de los RBCs. La Figura 29a muestra que el complejo de anfotericina B-PMAA-Na no fue tóxico para los glóbulos rojos después del almacenamiento como un polvo liofilizado a 4°C durante 4 meses.

La Figura 29b muestra los resultados obtenidos cuando el complejo de anfotericina B-PMAA-Na que ha sido preparado según el Ejemplo C y almacenado en dextrosa al 5% a 4°C durante 7 meses fue incubado con RBCs durante una hora. La tisis está mostrada como un porcentaje. La recién preparada anfotericina B de categoría clínica fue usada como una referencia para la comparación. Las incubaciones fueron realizadas durante 1 h y 6 h; los resultados para la incubación de 1 hora están mostradas. La Figura 29b muestra que el complejo de anfotericina B-PMAA-Na no fue tóxico para los glóbulos rojos después del almacenamiento en dextrosa al 5% a 4°C durante 7 meses.

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Figura 30

La Figura 30 muestra la inhibición de los amastigotes y los promastigotes de Leishmania por un complejo de anfotericina B-PMAA-Na que ha sido almacenado bajo condiciones diferentes.

La Figura 30a muestra la inhibición del crecimiento de amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana en MDMs por el complejo de anfotericina B-PMAA-Na que ha sido preparado según el Ejemplo C y almacenado como un polvo liofilizado durante 4 meses a 4°C. El índice de infección es fijado contra la concentración del complejo. La LD_{50} fue 0,21 \mug/ml.

La Figura 30b muestra la viabilidad de los promastigotes de Leishmania mexicana después de 2 días de incubación con amastigotes intracelulares en MDMs por el complejo de anfotericina B-PMAA-Na que ha sido preparado según el Ejemplo C y almacenado durante 7 meses a 4°C en dextrosa al 5%. El porcentaje de viabilidad es fijado contra la concentración del complejo. La recién preparada anfotericina B de categoría clínica fue usada como una referencia para la comparación. La LD_{50} del complejo fue 0,4 \mug/ml. La Id50 de la anfoteracina B fue 0,3 \mug/ml. Los resultados obtenidos con el complejo están mostrados por cuadrados sólidos, los resultados con ampoteracina b como círculos abiertos.

La actividad de anfotericina B-PMAA-Na no se vio afectada por el almacenamiento como un polvo liofilizado durante 4 meses a 4°C durante 7 meses a 4°C en dextrosa al 5%.

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Figura 31

La Figura 31 muestra la inhibición de varias cepas de Cryptococcus neoformans que han infectado macrófagos derivados de monocitos humanos.

La inhibición fue medida después de usar varias concentraciones de complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparadas como se describe en el ejemplo C (cuadrados sólidos) durante tres días, con anfoteracina B (círculos abiertos) como una referencia para la comparación. Se contó el número de macrófagos infectados y no infectados, y el número de CFU de levadura grampositivas. Los resultados fueron expresados como el índice de infección, que fue calculado como el número medio de CFU/porcentaje de células infectadas. Los valores de LD_{50} fueron también determinados.

La Figura 31a muestra la inhibición del aislado 1 clínico de C. neoformans var neoformans,

La Figura 31b muestra la inhibición de C. neoformans var neoformans NCPF 3003,

La Figura 31c muestra la inhibición del aislado clínico de C. neoformans var gattii, y

La Figura 31d muestra la inhibición del aislado clínico de C. neoformans var gattii. La LD_{50} para anfotericina B (0,9-1,4 \mug/ml) y para anfotericina B-PMAA-Na (1,6-2,7 \mug/ml) son similares. En consecuencia, el complejo es tan activo contra cryptococci como la anfotericina B sola.

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Figura 32

La Figura 32 muestra la viabilidad de varias cepas de Cryptococcus neoformans que han infectado macrófagos derivados de monocitos humanos.

La viabilidad fue medida después de usar varias concentraciones de complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el Ejemplo C (cuadrados sólidos) durante tres días, con la anfoteracina B (círculos abiertos) como una referencia para la comparación.

La Figura 32a muestra los resultados para C. neoformans var neoformans NCPF 3003,

la Figura 32b muestra los resultados para el aislado clínico de C. neoformans var neoformans,

la Figura 32c muestra los resultados para C. neoformans var gatti NCPF 3216, y

la Figura 32d muestra los resultados para el aislado clínico de C. neoformans var gatti cuando estos organismos han infectado macrófagos derivados de monocitos humanos.

La LD_{50} para anfotericina B y para anfotericina B-PMAA-Na fueron similares en los 4 experimentos realizados y también similares a los 4 experimentos mostrados en las Figuras 31a a 31d. En el caso de C. neoformans var neoformans, la LD_{50} para anfotericina B fue 0,9 a 1,4 \mug/ml y aquella para anfotericina B-PMAA-Na fue similar a 1,6 a 2,7 \mug/ml. Para C. neoformans var gatti la LD_{50} para la anfotericina B fue 0,06 a 1,0 \mug/ml y aquella para anfotericina B-PMAA-Na fue similar a 0,1 a 0,5 \mug/ml. En consecuencia, el complejo es tan activo contra cryptococci como la anfotericina B sola.

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Figura 33

La Figura 33a muestra la viabilidad de Candida albicans ATCC 90028 y la figura 33b la viabilidad de Candida glabrata ATCC 90030 después del tratamiento durante un día con anfoteracina B (referencia) o complejo de anfotericina B-PMAA-Na en varias concentraciones.

La viabilidad se expresa como un porcentaje. La viabilidad fue determinada por la turbidez, medida usando un espectrofotómetro (490 nm). El 100% de la viabilidad fue establecido usando la densidad óptica de la levadura sin tratar en pocillos de control.

La LD_{50} para la anfotericina B (0,9 a 1,8 \mug/ml) y para el complejo de anfotericina B-PMAA-Na preparado como se describe en el ejemplo C (1,6 a 2,3 \mug/ml) son similares para Candida albicans (Figura 33a) y la Figura 33b muestra los resultados para Candida glabrata. En consecuencia, el complejo es tan activo contra Candida sp. como la anfotericina B sola.

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Descripción detallada de la invención

Como se ha descrito arriba, la presente invención se refiere a varios usos de un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo en el tratamiento de infecciones por organismos patógenos, en el tratamiento contra el cáncer, y/o como un adyuvante inmunopotenciador, y también se refiere a complejos que comprenden un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo y (i) una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, o (ii) una sustancia con actividad farmacológica contra un cáncer, o (iii) uno o más agentes seleccionados de antígenos e inmunógenos.

La presente invención se basa en nuestra observación de que un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo indujo la liberación de las beta-quimiocinas MIP-1\alpha y MtP-1\beta y del interferon-\gamma de macrófagos de tejidos primarios humanos, es decir, células que presentan antígenos que tampoco inducen la liberación de cantidades tóxicas de citoquinas proinflamatorias. El polímero no fue tóxico para las células humanas en concentraciones altas. El polímero evaluado fue producido según los métodos descritos en la presente. Sin limitarse a la siguiente teoría, consideramos que las observaciones anteriores indican que un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo tiene el potencial de actuar como un adyuvante inmunopotenciador de Th1 estimulando los receptores de la superficie celular que incluyen receptores tipo peaje, es decir, para actuar como una sustancia que aumenta las propiedades inmunoestimuladoras de un antígeno.

Hemos demostrado en la práctica que un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo actúa de hecho como un adyuvante inmunopotenciador de Th1. Un complejo que comprende un antígeno, es decir derivado proteico BP purificado de tuberculina, y un homopolímero de sal sódica de ácido metacrílico (PMAA-Na) producido como se describe en la presente provocó más proliferación de linfocitos T que el antígeno de tuberculina por sí solo, y también aumentó la secreción de interferon-\gamma de linfocitos T más de lo que lo hizo el antígeno de tuberculina solo.

Un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo puede en consecuencia ser usado como un adyuvante inmunopotenciador en conjunción con antígenos y/o inmunógenos según se utiliza en vacunas convencionales, por ejemplo, antígenos e inmunógenos que son derivados directa o indirectamente de organismos contra los cuales se desea la vacunación terapéutica y/o protectora. Tales antígenos e inmunógenos son, por ejemplo, antígenos y/o inmunógenos obtenidos de fuentes naturales, es decir, derivados directamente del organismo pertinente, y subunidades de antígenos e inmunógenos, y antígenos e inmunógenos producidos por la tecnología del ADN recombinante y/o por síntesis química, dichos antígenos e inmunógenos son derivados indirectamente de los organismos pertinentes. El polímero puede ser formulado en composiciones vacunales con el (los) antígeno(s) apropiado(s) y/o inmunógeno(s). Los portadores y excipientes pueden estar presentes, como también pueden los adyuvantes del sistema de entrega. El polímero y el antígeno y/o inmunógeno pueden ser usados en forma de un complejo de la invención, o pueden ser coadministrados, véase abajo.

Ejemplos de vacunas y de antígenos e inmunógenos para el uso en tales vacunas incluyen pero no se limitan a vacunas dirigidas contra difteria, tétanos, tifoidea, tos ferina, sarampión, rubeola, paperas, polio, H. influenza por ejemplo tipo b, meningitis, hepatitis A, hepatitis B, cólera, rabia, encefalitis (de varios tipos), fiebre amarilla, y gripe, y antígenos e inmunógenos usados y adecuados para el uso en tales vacunas. Tales antígenos e inmunógenos pueden ser usados según la presente invención.

No obstante, un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo no sólo tiene un efecto inmunopotenciador en antígenos e inmunógenos coadministrados, también tiene la capacidad, en ausencia de antígenos o inmunógenos coadministrados, de promover respuestas inmunes de Th1 protectoras contra organismos patógenos, por ejemplo, un organismo patógeno que es predominantemente pero no exclusivamente un organismo intracelular, en particular contra un organismo que existe y persiste predominantemente en células de origen macrófago y/o en otras células que presentan antígenos, incluidas las células dendríticas. Esta administración puede ser conseguida por el polímero y una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno (llamado aquí un "fármaco"), por ejemplo, un organismo patógeno que es predominantemente pero no exclusivamente un organismo intracelular, en particular un organismo patógeno que existe y persiste en células de origen macrófago y/o en otras células que presentan antígenos, incluidas las células dendríticas, especialmente una sustancia que mata o que por el contrario disgrega tal organismo. La destrucción o ruptura del organismo resulta en la liberación de material antigénico. La presencia del polímero potencia la respuesta inmune al antígeno porque las células dendríticas que son reclutadas en este microambiente alterado absorben y procesan los antígenos liberados. Las células dendríticas luego inician la activación de células T CD4+ que promueve la generación de respuestas de los linfocitos T citotóxicos destructores. Algunas de estas respuestas será dirigida terapéuticamente contra cualquier organismo persistente en las células infectadas restantes de manera crónica y también en los organismos del entorno de tales células. Otras respuestas de las células T citotóxicas destructoras serán capaces de proporcionar respuestas basadas en vacunas protectoras contra futuras reinfecciones. El tratamiento farmacológico, vacunación terapéutica y vacunación protectora son en consecuencia conseguidas.

La invención en consecuencia se refiere a un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, los polímeros para el uso con una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno en el tratamiento de una infección por el organismo patógeno y/o para inducir una respuesta inmune al organismo patógeno. La invención también se refiere a un método de tratamiento de una infección por un organismo patógeno y/o de inducción de una respuesta inmune al organismo patógeno en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, que comprende la administración al sujeto de un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo y una sustancia que tiene actividad farmacológica contra el organismo patógeno.

El polímero y la sustancia farmacológicamente activa están preferiblemente en forma de un complejo de la invención, o de forma alternativa estos pueden ser coadministrados, véase abajo.

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Los patógenos contra los cuales se debe inducir una respuesta inmune son principalmente aquellos que se replican y/o persisten intracelularmente, en particular aquellos que se replican y/o persisten en macrófagos localizados en los tejidos y otras células que presentan antígenos, por ejemplo, las células dendríticas. Tales organismos, y enfermedades y trastornos provocados por tales organismos, incluyen los siguientes:

a)

Organismos que causan micosis superficiales, incluyendo dermatofitosis; tiña; candidiasis; infecciones por Malassezia, incluyendo pitiriasis versicolor, Malassezia folliculitis, dermatitis seborreica e infecciones por Scytalidium; Otomicosis; y queratomicosis.

b)

especies de Candida que causan infecciones fúngicas invasivas y crónicas, incluyendo Candida albicans, Candida tropicalis y Candida glabrata; especies de Aspergillus, incluyendo Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus y Aspergillus Niger; Cryptococcus neoformans; Mucormicosis, por ejemplo, provocadas por especies de Absidia, Rhizopus y Rhizomucor, especies de Fusarium; especies de Trichosporon; Blastomicosis; especies de Sporothrix; especies Sporotrichum; Histoplasmosis, por ejemplo, provocada por Histoplasma capsulatum var. capsulatum; Histoplasmosis africana, por ejemplo, provocada por Histoplasma capsulatum var. duboisii; Blastomicosis, por ejemplo, provocada por Blastomyces dermatitidis; Coccidioidomicosis, por ejemplo, provocada por Coccidioides immitis; Paracoccidioidomicosis, por ejemplo, provocada por Paracoccidiodes brasiliensis; e infecciones provocadas por Penicillium marneffei.

c)

Organismos que causan enfermedades micobacterianas, por ejemplo, tuberculosis y lepra provocada por elementos de la familia micobacteriana, por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis, micobacterias atípicas, y mycobacterium leprae.

d)

elementos de la familia de schistosoma que causan Schistosomiasis, por ejemplo, Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum, y Schistosoma mekongi.

e)

Organismos que causan fiebres tifoidea y paratifoide, por ejemplo, elementos de la familia de Salmonella de serotipos A, B, C y D.

f)

Organismos que causan toxoplasmosis, por ejemplo, Toxoplasma gondii.

g)

Organismos que causan Tripanosomiasis africana humana, por ejemplo, Tripanosoma brucei gambiense o Tripanosoma brucei gambiense.

h)

Organismos que causan Tripanosomiasis americana, por ejemplo, Trypanosoma cruzi.

i)

Organismos que causan malaria, por ejemplo, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae.

j)

Organismos que causan infecciones por VIH y HTLV, por ejemplo HIV-1 y HIV-2 y HTLV y HTLV-11.

k)

Organismos que causan infecciones Pneumocystis carinii.

l)

Organismos que causan leishamaniasis, por ejemplo, la forma visceral, p. ej., kala azar o la forma cutánea, por ejemplo, L. donovani y L. mexicana.

Sustancias farmacológicamente activas (fármacos) usadas para tratar enfermedades de este tipo y trastornos son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo, Principles and Practice of infectious Diseases. por Mandell G.L, Bennett J.E., & Dolin R., Quinta edición. Churchill Livingstone. (2000). Manson's Tropical Diseases. por Cook & Zumla. Vigésimo primera edición. Saunders. (2003), y fármacos adicionales están siendo desarrollados.

Ejemplos de sustancias que tienen actividad farmacológica contra organismos patógenos incluyen pero no se limitan a clotrimazol, flucitosina, fluconazol, griseofulvina, itraconazol, cetoconazol, miconazol, pirazinamida, ciprofloxacina, rifampicina, tiacetazona, cicloserina, clofazimina, dapsona, rotionamida, metrifonato, oxamniquina, praziquantel, co-trimoxazol, pirimetamina, sulfadoxina, espiramicina, melarsoprol, nifurtimox, amodiaquina, cloroquina, mefloquina, primaquina, proguanil, quinina, cidovudina, efavirenz, indinavir, ribavirina, vidarabina, levamisol, y aciclovir.

Para el uso según este aspecto de la presente invención no es necesario que un tratamiento sea completamente exitoso, es decir, que cure al sujeto o que elimine completamente el organismo puesto que la respuesta inmune al organismo que está siendo generada proporcionará una "segunda vía" de defensa eficaz. Cualquier organismo residual será eliminado por las respuestas efectoras de los linfocitos T citotóxicos generadas porque éstas serán terapéuticamente dirigidas contra cualquier organismo persistente en las restantes células infectadas de manera crónica. Lo necesario es que algunos organismos sean destruidos, liberando así antígenos. Una de las ventajas de la presente invención es que aunque el tratamiento no elimina completamente el organismo, la inducción de respuestas efectoras de los linfocitos T citotóxicos proporcionará respuestas basadas en vacunas protectoras contra una futura reinfección. En consecuencia, se obtiene un tratamiento farmacológico, vacunación terapéutica y vacunación protectora.

Las mismas consideraciones se aplican al cáncer. El uso de un complejo de la invención que comprende un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo y una sustancia que tiene actividad farmacológica contra el cáncer, especialmente un agente citotóxico que mata o mata parcialmente o por el contrario disgrega las células transformadas, es decir, cancerígenas. La destrucción o ruptura de las células resulta en la liberación de material antigénico del cual una cantidad será "vista" por macrófagos y células que presentan antígenos como no autoantígenos. La presencia del polímero potencia la respuesta inmune al (los) antígeno(s) porque las células dendríticas que son reclutadas en este microambiente alterado absorben y procesan el (los) antígeno(s) liberado(s). Las células dendríticas luego inician la activación de las células T CD4+ que promueve la generación de respuestas efectoras de los linfocitos T citotóxicos. Algunas de estas respuestas serán dirigidas terapéuticamente contra otras células cancerosas y en consecuencia proporcionarán respuestas basadas en vacunas protectoras contra la recurrencia del cáncer y el crecimiento de cualquier micrometástasis restante. Estas respuestas serán mayores para aquellos cánceres en los que están presentes grandes cantidades de macrófagos y células presentadoras de antígenos. Esto es especialmente así en linfomas y leucemias. En consecuencia, se consigue el tratamiento farmacológico, vacunación terapéutica y vacunación protectora.

Las sustancias que tienen actividad farmacológica contra el cáncer son bien conocidos en la técnica y nuevos agentes activos son desarrollados, véase por ejemplo, Cancer Principles and practice of oncology. V.T. DeVita, S Hellman & S.A. Rosenburg, publicado por Lippincott Williams & Wilkins, 6a Edición, 2001. Ejemplos de agentes anticáncer incluyen pero no se limitan a aclarubicina, dactinomicina, amsacrina, azacitidina, bleomicina, carmustina, clorambucil, cisplatina, dacarbazina, daunorubicina, hidroxiurea, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina C, mitozantrona, tresulfan, vinblastina, vincristina y crisantaspasa.

Como se ha indicado anteriormente, es generalmente preferible que el polímero, la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, o una sustancia con actividad farmacológica contra un cáncer (ambos llamados "fármacos") sean administrados en forma de un complejo de la invención. Tal complejo es retomado por las células que presentan antígenos más eficazmente que el fármaco solo, y también asegura que el fármaco y el polímero estén ambos presentes al mismo tiempo en la misma célula de modo que cuando el fármaco mata al organismo y los antígenos son liberados, el polímero está preparado in situ para generar un micromedio que potencia las respuestas inmunes Th1. No obstante, el polímero y el fármaco pueden ser coadministrados, bien en la misma preparación farmacéutica, o en preparaciones separadas. En este caso, una preparación puede ser administrada antes que la otra, pero es generalmente preferible administrar las dos preparaciones sustancialmente simultáneamente.

Es también generalmente preferible administrar el polímero y los antígenos y/o inmunógenos en forma de un complejo según la invención. No obstante, el polímero y los antígenos y/o inmunógenos pueden ser coadministrados, bien en la misma preparación farmacéutica, o en preparaciones separadas. En este caso una preparación puede ser administrada antes que la otra, pero es generalmente preferible administrar las dos preparaciones sustancialmente simultáneamente.

Un complejo de la invención comprende un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo y

(i)

una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, tal y como se define en la reivindicación 1, o

(ii)

una sustancia con actividad farmacológica contra un cáncer, o

(iii)

uno o más agentes seleccionados de antígenos e inmunógenos.

Organismos patógenos, sustancias con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, sustancias con actividad farmacológica contra un cáncer, y antígenos e inmunógenos son, por ejemplo, tal y como se ha descrito anteriormente.

Un complejo de la invención, o un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, puede estar en forma de una preparación farmacéutica que comprende el complejo y un portador farmacéuticamente adecuado. La preparación puede ser o considerarse como una preparación farmacéutica convencional o como una vacuna, o ambas, dependiendo de los componentes, en particular de la naturaleza de las sustancias (i), (ii) y (iii). Si se destina para el uso para la inducción de una respuesta inmune, también podrá estar presente un adyuvante del sistema de entrega, por ejemplo, alumbre.

Si un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo debe ser coadministrado con una sustancia (i), (ii) o (iiii) tal y como se ha definido anteriormente, en vez de ser administrado en forma de un complejo con la sustancia, el polímero y la sustancia (i), (ii) o (iii) pueden ser formulados en la misma preparación farmacéutica o pueden ser formulados en preparaciones separadas, en cada caso en mezcla con un portador farmacéuticamente adecuado. Si se encuentran en preparaciones separadas, una puede ser administrada antes que la otra, pero puede ser preferible administrar las dos preparaciones sustancialmente simultáneamente.

Como se ha indicado arriba, la presente invención comprende tanto el tratamiento convencional farmacéutico de enfermedades y trastornos provocados por organismos patógenos y cáncer, como la inducción de respuestas inmunes para tales enfermedades, trastornos y cáncer. Será entendido que una respuesta inmune inducida en un sujeto en necesidad de la misma es preferiblemente una respuesta inmune terapéutica y/o profiláctica. Una respuesta inmune terapéutica ayuda en el tratamiento de la enfermedad o trastorno. Tal respuesta puede ser una respuesta a corto plazo. Una respuesta inmune profiláctica proporciona protección a más largo plazo, por ejemplo, contra una recurrencia de la enfermedad o trastorno, o una posterior infección o reinfección, o el crecimiento y extensión de la micrometástasis del cáncer. Tales respuestas son frecuentemente llamadas "vacunación" terapéutica y profiláctica.

El uso de un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo y una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno en el tratamiento de una enfermedad provocada por el organismo patógeno y, al mismo tiempo, induciendo una respuesta inmune ha sido ilustrado en el caso de la leishmaniasis. La infección por leishmaniasis puede ser de la forma visceral, p. ej., kala azar o de la forma cutánea. La leishmaniasis visceral es una infección protozoaria diseminada. Durante muchos años, la terapia convencional ha consistido en antimonio pentavalente administrado una vez al día por inyección intravenosa o intramuscular durante 28 días. No obstante, desde 1990, el fracaso del tratamiento de antimonio a gran escala en India ha conducido a la introducción del deoxicolato de anfotericina B (AmB) como un agente antileishmanial eficaz. Unos índices de cura a largo plazo del 97% son obtenidos por la administración intravenosa de la anfotericina B bien a diario o, más normalmente, cada dos días durante un total de 15 = 20 infusiones a una dosis de 0,75-1 mg/kg/día. Estas duraciones prolongadas de tratamiento están asociadas a una alta carga de los hospitales y a costes sustanciales. Consecuentemente, esto frecuentemente conduce a la no adaptabilidad o al abandono del régimen de tratamiento por los eventos adversos asociados que ocurren frecuentemente.

Los complejos a base de lípidos de anfotericina B se acumulan en macrófagos basados en tejidos: ellos han demostrado ser muy eficaces contra un gran número de levaduras y hongos que pueden crecer en macrófagos humanos. Se ha demostrado que las formulaciones lipídicas de la anfotericina B tienen un nivel elevado de eficacia contra leishmaniasis visceral y que éstas suponen un índice de cura superior al 90% cuando se administran durante 5-10 días. Sundar et al. ha demostrado que una duración corta, es decir, 5 días de tratamiento con anfotericina B liposomal (AmBisome; Gilead Sciences) administrada a diario en infusiones de 1,5 mg/kg/día curó al 93% de los pacientes. En otra prueba de seguimiento, una infusión de una única dosis total de 5 mg/kg de anfotericina B liposomal curó al 91% de los pacientes. Se produjeron muy pocos eventos adversos. (Sundar, S et al. Treatment of Indian visceral leishmaniasis with single or daily infusion of low dose liposomal amphotericin B: a randomised trial. Brit. Med. J. 2001. 323: 419-422. Sundar, S. et al. Single-dose liposomal amphotericin B in the treatment of visceral leishmaniasis in India: a multicenter study. Clin. Inf. Dis. 2003: 37. 800-804). En consecuencia, el tratamiento con anfotericina B liposomal en monodosis puede ser considerado seguro y eficaz para el tratamiento de la leishmaniasis visceral en India. No obstante, incluso en monodosis el tratamiento es costoso, y una desventaja práctica es que las formulaciones de anfotericina B a base de lípidos no son estables durante el almacenamiento a largo plazo, particularmente con las altas temperaturas de los trópicos donde ocurren muchos de los casos de leishmaniasis visceral.

La respuesta inmune que promueve la curación y limpieza de parásitos en leishmaniasis es dominada por una respuesta Th-1 mediada por el interferón gamma. Aunque los macrófagos ingieren la leishmania eficazmente, ellos no son activados por la ingestión del organismo; en consecuencia, no se liberan quimiocinas proinflamatorias, citoquinas proinflamatorias ni interferon-\gamma. A diferencia de los macrófagos, las células dendríticas absorben parásitos maduros de leishmania y luego promueven el desarrollo de respuestas celulares inmunes. En modelos animales, se ha demostrado que si los macrófagos infectados pueden ser activados, a continuación ocurrirá la destrucción del parásito. En consecuencia, dos procesos diferentes, es decir, el tratamiento con antígenos y la maduración/activación celular deben ser combinados para una respuesta celular de la vacuna eficaz. Como se ha demostrado por los microbios, las sustancias que poseen tanto un componente antigénico como un componente de activación/maduración de células dendríticas puede propulsar las células dendríticas hacia una respuesta mediada por Th1. Las formulaciones de anfotericina B a base de lípidos no tienen actividad inmunomoduladora o adyuvante.

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Un complejo de anfotericina B y sal sódica del ácido poli(metacrilico) (PMAA-Na) según la invención fue preparado y evaluado, como se describe con detalle en los ejemplos. El complejo demostró tener las siguientes propiedades únicas:

a)

Permite la entrega eficaz en el órgano de la anfotericina B al hígado, bazo y ganglios linfáticos después de la administración intravenosa. Estos son los órganos principalmente infectados por leishmaniasis en animales y en el hombre.

b)

Permite la entrega eficaz intracelular de la anfotericina B a los macrófagos infectados por Leishmania cuando se administran por vía intravenosa.

c)

El complejo de anfotericina B-sal sódica del ácido poli(metacrílico) se acumula en los organelos intracelulares dentro de los cuales los amastigotes de Leishmania sobreviven, se multiplican y persisten, y esto aumenta la destrucción intracelular de los amastigotes de Leishmania.

d)

Estudios in vivo en un modelo animal de Leishmaniasis visceral demostraron que las actividades antileishmaniales de la anfotericina B de categoría clínica, la preparación comercial de anfotericina B liposomal Ambisome, y la preparación de anfotericina B-sal sódica del ácido poli(metacrílico) no fueron muy diferentes entre sí. La preparación de anfotericina B-sal sódica del ácido poli(metacrílico) fue tan eficaz como la preparación comercial liposomal de anfotericina B AmBisome en el modelo animal de leishmaniasis visceral.

e)

La sal sódica del ácido poli(metacrílico) es liberada de la anfotericina B dentro de los macrófagos tisulares y luego promueve la liberación de \beta-quimiocinas y de interferon-\gamma. Esto genera una respuesta Th1 local del adyuvante.

f)

La inducción local de quimiocina y la expresión de citoquina facilita el reclutamiento y la activación de células del sistema inmunológico innato al sitio. Esto incluye las células dendríticas inmaduras y los linfocitos T CD4+. Estos estimulan los macrófagos para producir más TNF-\alpha, IL-1\beta y IL-6.

g)

La activación del sistema inmunológico innato induce a las células dendríticas a madurar y migran desde el tejido a los ganglios linfáticos regionales donde se presentan sus antígenos recién liberados. Esto resulta en la inducción y generación de respuestas de las células T CD4+ y respuestas de células T CD8+ efectoras.

h)

En consecuencia, la destrucción de leishmania dentro de las células que presentan antígenos y la disponibilidad posterior de antígenos de leishmania en la proximidad inmediata de un adyuvante promotor de Th1 convierte el macrófago infectado en una vacuna celular.

i)

La respuesta inmune celular es significativamente mejorada por la proximidad cercana de las células que presentan antígenos, la liberación de antígenos de leishmania por la actividad destructora de la anfotericina B, y la promoción simultánea de un entorno local y apropiado de citoquina/quimiocina de Th1.

j)

Las curas simultáneas de la enfermedad y la generación de una respuesta inmune celular efectora terapéutica, es decir, la vacunación, genera inmunidad protectora a largo plazo contra el organismo con el cual el individuo fue infectado.

k)

La cura de la enfermedad y la vacunación terapéutica son en consecuencia conseguidas simultáneamente y sin la necesidad de administrar un adyuvante externo o una fuente externa de antígenos de Leishmania.

l)

El tratamiento en monodosis es eficaz, a diferencia de la anfotericina B, que normalmente requiere 15-20 dosis.

m)

La preparación es más estable, especialmente a las temperaturas ambientes más altas de los trópicos que en las preparaciones comercialmente disponibles de anfotericina B liposomal.

n)

La toxicidad de la anfotericina libre que se ve frecuentemente cuando es administrada por vía intravenosa en el hombre es reducida a un mínimo cuando se usa la preparación.

o)

Formando un complejo entre la anfotericina B y la PMAA-Na, la derivación química del fármaco es evitada. En consecuencia, la eficacia de la anfotericina B contra la Leishmania sp. no es cambiada ni reducida. Esto es particularmente pertinente para el grupo amino en la fracción de azúcar de anfotericina B porque este grupo es importante para mediar la actividad farmacológica de este fármaco. La amina en la fracción de azúcar ha sido usada previamente como un punto de conjugación por su reactividad (Conover C. D. et al. Utility of poly(ethylene glycol) conjugation to create prodrugs of amphotericin B. Bioconjugate Chem. 2003: 14: 661-666).

Como se ha declarado arriba, la presente invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende un complejo de la presente invención o un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1 en mezcla o en conjunción con un portador farmacéuticamente adecuado.

Una preparación farmacéutica de la invención puede estar en una forma adecuada para la administración por vía intravenosa, por vía intraarterial, en la circulación linfática, en un ganglio linfático, oralmente, intraperitonealmente, tópicamente, por vía bucal, por vía rectal, en la superficie de la piel, por vía transdérmica, por vía subcutánea, por vía intramuscular, en el espacio articular, por vía intranasal, por vía intravítrea, o por vía pulmonar, directamente a un órgano, alrededor de un órgano, por inyección en un órgano, o por infusión directa a través de un órgano. La presente invención incluye la administración de un complejo polimérico conforme a la invención a través de cualquiera de tales vías. Una preparación farmacéutica de la invención puede estar en forma de una preparación de depósito o de reserva, o una preparación de aerosol. Las formulaciones adecuadas para las vías de administración anteriores y otras son conocidas en la técnica, véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martín. Véase también Wang, Y. J. y Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S, 1988.

Un complejo de la invención o un polímero de distribución estrecha del peso molecular, incluidas las unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, pueden ser "asociados en particulas". Tales partículas pueden ser producidas por procesos de emulsión, homogenización y secado por atomización, que son conocidos en la técnica. Para una revisión de tales formulaciones véase por ejemplo, Hanes J, Cleland JL & Langer R, Adanced Drug Delivery Reviews 28 (1997) 97-119. Composiciones farmacéuticas que comprenden tales complejos asociados en partículas de la invención pueden ser administradas por vía mucosa, por una vía pulmonar o nasal, por ingestión, o por vía parenteral no mucosa, especialmente por vía subcutánea o intramuscular.

En una preparación farmacéutica de la invención en forma líquida, la concentración del polímero puede ser, por ejemplo, de 0,1 a 2.500 \mug/ml, por ejemplo, de 1 a 500 \mug/ml. Otras formulaciones pueden comprender el polímero en cantidades análogas, por ejemplo, calculadas basándose en las preparaciones líquidas.

La presente invención se refiere a un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo y con complejos que comprenden tal polímero y un antígeno o inmunógeno, o una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer. El polímero puede ser un homopolímero o copolímero que tenga unidades derivadas de un ácido acrílico, por ejemplo, derivadas de ácido acrílico o ácido metacrílico, o una sal del mismo. Algunos polímeros que incluyen unidades derivadas de un ácido acrílico son conocidos. Como se ha indicado anteriormente, la polidispersividad es de 1,7 o inferior, por ejemplo 1,6 o inferior, por ejemplo 1,5 o inferior, por ejemplo de 1,4 o inferior, por ejemplo, de 1,2 o inferior, por ejemplo inferior a 1,7, por ejemplo, inferior a 1,6, por ejemplo, inferior a 1,5, por ejemplo, inferior a 1,4, por ejemplo, inferior a 1,2. En general, cuanto más baja es la polidispersividad, mejor. Por consiguiente, una polidispersividad inferior a 1,2 es generalmente preferida. Por consiguiente, una polidispersividad inferior a 1,2 es generalmente preferida.

El polímero generalmente tiene un peso molecular tal que el polímero cuando está presente en la sangre permanece sustancialmente en la sangre circulante durante y después del paso a través del riñón, con poco o nada del polímero sometido a filtración a través del aparato glomerular. La filtración renal (también conocida como filtración glomerular) de moléculas grandes es una función, entre otras, del tamaño y forma de la molécula, que en parte es dependiente del peso molecular. En general, para cualquier polímero particular, hay un umbral de peso molecular o una gama estrecha de pesos moleculares por debajo de la cual ocurre la filtración renal y por encima de la cual ocurre poca o ninguna filtración renal. El umbral de peso molecular para cualquier polímero particular puede ser determinado por pruebas estándares, por ejemplo, usando un polímero radiomarcado.

El polímero tiene un peso molecular de 100.000 o inferior, por ejemplo, inferior a 100.00, por ejemplo, 80.000 o inferior, por ejemplo, 75.000 o inferior, por ejemplo, 65.000 o inferior, por ejemplo, 55.000 o inferior, por ejemplo, 45.000 o inferior, por ejemplo. El polímero generalmente tiene un peso molecular de 4.000 o más, por ejemplo, 5.000 o más, por ejemplo, 10.000 o más, por ejemplo, 20.000 o más, por ejemplo, 30.000 o más, por ejemplo, 40.000 o más. Un polímero puede tener un peso molecular dentro de una gama que combina cualquiera de los valores de peso molecular superiores provistos arriba con cualquiera de los valores de peso molecular inferiores provistos arriba. Ejemplos de tales gamas incluyen pero no se limitan a las gamas de 80.000 a 4.000, 75.000 a 5.000, 65.000 a 10.000, 55.000 a 10.000, y 45.000 a 10.000. Otros ejemplos incluyen las gamas de 50.000 a 4.000, por ejemplo, de 40.000 a 25.000. Pesos moleculares en la gama de 45.000 a 10.000 pueden generalmente ser preferidos.

Es generalmente deseado que el polímero o el complejo permanezca en la sangre circulante durante un periodo de tiempo apropiado. Como es conocido por el experto en la materia, el periodo de tiempo que es apropiado dependerá de varios factores incluyendo, en el caso de un complejo, la naturaleza de la sustancia en complejo con el polímero. Como un ejemplo, el polímero o complejo puede permanecer en la circulación durante varias horas, por ejemplo, durante hasta 24 horas, por ejemplo, aproximadamente de 4 a 6 horas hasta aproximadamente 24 horas.

El polímero que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo comprende una unidad (I)

1

donde R es hidrógeno, metilo o ácido carboxílico, y R^{1} es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno y grupos C_{1}-C_{6} alquilo; y sales derivadas, por ejemplo, sales de metales alcalinos, por ejemplo, sales sódicas, o sales amónicas derivadas.

Preferiblemente, R es hidrógeno o metilo. Preferiblemente R^{1} es, independientemente de R, hidrógeno o metilo. En particular R es hidrógeno y R^{1} es metilo.

Ejemplos de copolímeros en bloque que incluyen unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo incluyen copolímeros en bloque que comprenden la unidad (II)

2

donde R y R^{1} se definen como anteriormente y R^{2} es un enlace; R^{3} es seleccionado del grupo que consiste en C_{1}-C_{18} alquileno, C_{2}-C_{18} alquenileno, C_{7}-C_{18} araiquileno, C_{7}-C_{18} alcarileno, y C_{6}-C_{18} arileno; L es un enlazador bivalente que une los bloques; y m y n es cada uno un número entero 1 o mayor que 1.

De la forma más preferible R es seleccionado de hidrógeno y metilo.

Preferiblemente R^{1} es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o isómeros de los mismos. De la forma más preferible R^{1} es seleccionado de hidrógeno y metilo.

Preferiblemente los grupos R^{3}, que pueden ser iguales o diferentes, son seleccionados del grupo que consiste en grupos C_{1}-C_{8} alquileno, preferiblemente 1,2-alquileno, y grupos C_{6}-C_{12} arileno, de la forma más preferible metileno, etileno, 1,2-propileno y 1,3-propileno. Preferiblemente todos los grupos R^{3} son los mismos, de la forma más preferible todos son 1,2-etileno6 o 1,2 propileno.

L preferiblemente comprende un grupo C_{1}-C_{18} alquileno o C_{6}-C_{18} arileno que puede ser sustituido y/o interrumpido con 1 o más heteroátomos. Preferiblemente L comprende un grupo seleccionado del grupo que consiste en C_{1}-C_{6} alquileno, C_{6}-C_{12} arileno, C_{1}-C_{12} oxialquileno y C_{1}-C_{6} acilo. Donde L comprende un grupo alquileno, éste puede ser ramificado, lineal o cíclico, sustituido o insustituido con uno o más grupos alquilo, y es preferiblemente metileno, 1,2-etileno, 1,2-propileno, 1,3-propileno, ^{terc}butileno, ^{sec}butileno, hexileno u octileno. L cuando comprende un grupo arileno, es preferiblemente bencileno, tolileno o xilileno. De la forma más preferible, L comprende un grupo -COR^{a}, donde R^{a} es seleccionado del grupo que consiste en C_{1}-C_{6} alquileno o C_{6}-C_{12} arileno, preferiblemente metileno, 1,2-etileno, 1,2-propileno, 1,3-propileno, ^{terc}butileno y ^{sec}butileno.

Un polímero puede ser un homopolímero que incorpora una unidad (I) o puede ser un copolímero o copolímero en bloque que incorpora otras unidades poliméricas, oligoméricas o monoméricas, por ejemplo, un copolímero en bloque que comprende unas unidades (II) como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, otras unidades poliméricas incorporadas en un homopolímero o copolímero o copolímero en bloque pueden comprender polímeros acrílicos, polímeros de alquileno, polímeros de uretano, polímeros de amida, polímeros de polipéptidos, de polisacáridos y de ésteres. Preferiblemente, cuando el polímero es un heteropolímero, componentes poliméricos adicionales comprenden polietilenglicol, ácido poliaconítico o poliésteres.

Por ejemplo, un polímero que tiene unidades (i) o (ii) puede también comprender unidades adicionales que permiten, por ejemplo, la solubilización del polímero precursor y/o que permiten el control del número de grupos ácidos sin acrilato (y por lo tanto, grupos formadores de sales) en el polímero para ser usado según la invención. Por ejemplo, un polímero que comprende unidades (I) puede tener la estructura (III) o (IV)

3

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4

donde R, R^{1}, R^{2} y R^{3}, L, m y n se definen como anteriormente, R^{4}, R^{5} y R^{6} son seleccionados, independientemente, de los mismos grupos que R, R^{1} y R^{2}, respectivamente; Q denota un grupo que no está dividido o no está sustancialmente dividido según las condiciones usadas para producir el polímero; y p denota un número entero 1 o mayor que 1. Si se desea, Q puede ser un grupo diana, es decir un grupo que dirige el polímero a un tipo de célula, por ejemplo los macrófagos, o a un órgano por ejemplo el hígado.

Q puede ser, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en C_{1}-C_{12} alquilo, C_{2}-C_{12} alquenilo, C_{7}-C_{12} aralquilo, C_{7}-C_{12} alcarilo, C_{1}-C_{12} alcoxi, C_{1}-C_{12} hidroxialquilo, C_{1}-C_{12} alquilamino, C_{1}-C_{12} alcanoilo, C_{1}-C_{12} aminoalquilo o cualquier C_{1}-C_{12} alquilo, C_{2} -C_{12} alquenilo, C_{7}-C_{12} aralquilo, C_{7}-C_{12} alcarilo, C_{1}-C_{12} alcoxi, C_{1}-C_{12} hidroxialquilo, C_{1}-C_{12} alquilamino, C_{1}-C_{12} alcanoil sustituido con un grupo amino, hidróxilo o tiol. Preferiblemente Q comprende un grupo amino, por ejemplo, un grupo C_{1}-C_{12} hidroxialquilamino, por ejemplo, una fracción de 2-hidroxipropilamino o de hidroxietilamino.

El grupo Q puede ser un grupo de solubilización para el polímero en soluciones acuosas. Por ejemplo, el polímero puede ser un homo- o copolímero de poliacrilamida soluble en agua, preferiblemente un homo- o copolímero de polimetacrilamida o polietacrilamida. Además, cuando los grupos Q no son divididos (o la mayoría de grupos Q no son divididos) bajo condiciones bajo las cuales se produce el polímero, la presencia de los grupos Q permite el control del número de grupos ácidos sin acrilato (y por lo tanto los grupos formadores de sales) en el polímero. Por ejemplo, la proporción de unidades que contienen Q con respecto al número de unidades que contienen X del grupo de salida en el polímero precursor puede ser seleccionada. La proporción relativa de las unidades que contienen Q con respecto al número de unidades que contienen X del grupo de salida determinará el número de grupos ácidos o de sales de acrilato en el producto polimérico. Como se establece más abajo, la naturaleza polianiónica del polímero puede influir en su actividad biológica. La capacidad para manipular la naturaleza fónica del polímero es en consecuencia útil en la producción de un polímero que tiene las propiedades deseadas.

Un polímero para el uso según la presente invención, por ejemplo, para formar un complejo de la invención, puede ser, por ejemplo, un ácido polimetacrílico que tiene una polidispersividad de 1,7 o inferior, por ejemplo 1,6 o inferior, por ejemplo 1,5 o inferior, por ejemplo 1,4 o inferior, por ejemplo 1,2 o inferior, por ejemplo, inferior a 1,7, por ejemplo, inferior a 1,6, por ejemplo, inferior a 1,5, por ejemplo, inferior a 1,4, por ejemplo, inferior a 1,2. En general, cuanto más baja es la polidispersividad, mejor. Por consiguiente, una polidispersividad inferior a 1,2 es generalmente preferida. El peso molecular del polímero es generalmente como se describe en la sección Definiciones anterior. Ejemplos de tales ácidos polimetacrílicos y sales de los mismos y de su producción están provistos en los ejemplos de la presente. Tales ácidos polimetacrílicos y sales de los mismos pueden ser particularmente útiles en la práctica de la presente invención.

Hemos encontrado que la liberación de \beta-quimiocinas e interferon-\gamma de macrófagos de tejidos primarios, es decir, células que presentan antígenos inducidas por los complejos de sal sódica del ácido polimetacrílico (PMAA-Na) producidos como se describe en este caso, no fue vista con muestras comercialmente disponibles de homopolímeros de sal sódica de ácido metacrílico con una distribución estrecha del peso molecular similar. Las diferencias observadas en la liberación de quimiocinas y citoquinas de los macrófagos tisulares sugieren que pueden haber diferencias estructurales entre la PMAA-Na preparada como se describe en este caso y la PMAA-Na comercialmente disponible. Puesto que el M_{n} de la PMAA-Na preparada como se describe en este caso fue comparable a una de las muestras comerciales (es decir, M_{n} \sim 22 kg/mol), un efecto inmunológico que es debido a la influencia de peso molecular parece improbable. PMAA-Na es un polianión. Se ha sugerido que los efectos biológicos de los polianiones podrían ser dependientes de las características estructurales tales como peso molecular, densidad de la carga y tacticidad (Ottenbrite, R., et al., Biological activity of poly(carboxylic acid) polymers., in Polymeric Drugs, L. Donaruma y O. Vogl, Editors. 1978, Academic Press: Nueva York. p. 263-304). Mientras que no se limite por las hipótesis anteriores y posteriores sobre la actividad biológica de los polímeros usados según la presente invención, consideramos que los datos biológicos indican que puede ser el método de preparación que dio el detalle estructural el cual resultó en la PMAA-Na que tiene las únicas propiedades biológicas descritas.

El polímero usado en los ejemplos de la presente es la sal sódica del ácido polimetacrílico, que fue producida por hidrólisis de poli(N-metacriloxisuccinimida) (PMOSu) usando hidróxido sódico. Tal método, y métodos similares, en particular que implica(n) la hidrólisis del polímero precursor, puede(n) ser útil(es) para la producción de éste y otros polímeros para el uso según la presente invención.

Por ejemplo, un polímero para el uso según la invención puede ser producido por un método que implica la hidrólisis de un polímero precursor usando un agente básico, por ejemplo, un metal alcalino o base de metal alcalinotérreo, por ejemplo, una base de sodio, potasio, cesio, calcio, magnesio, o litio. Tal base puede ser, por ejemplo, un hidróxido, carbonato o hidrogenocarbonato, por ejemplo, hidróxido sódico. El polímero precursor puede ser PMOSu, o puede ser otro polímero precursor adecuado, por ejemplo, un polímero precursor como se describe más abajo. La hidrólisis se realiza en un solvente adecuado. Como los polímeros precursores son moléculas generalmente hidrofóbicas, la reacción es generalmente realizada en un solvente orgánico, por ejemplo, DMF, DMSO, DMPU o dimetilaclamida. La hidrólisis puede ser realizada bajo condiciones moderadas, por ejemplo, temperatura y presión ambientes y calentamiento suave, por ejemplo, 40 a 60°C, por ejemplo durante 2 a 16 horas, o bien se pueden usar condiciones más fuertes.

Los polímeros producidos por este método pueden tener propiedades biológicas análogas a alguna o a todas las propiedades biológicas demostradas por la PMAA-Na producida como se describe en la presente.

La POMSu usada como el polímero precursor en la producción de PMAA-Na como se describe en este caso fue producida como se describe en WO 01/18080 y en el Ejemplo A4 en la presente por polimerización homogénea de metacriloxisuccinimida usando un método de polimerización por radicales mediante transferencia atómica, en particular, un método mediado por cobre. Tal método para la producción puede ser útil para la producción de éste y otros polímeros precursores para el uso según la presente invención, pero la invención no está limitada a tales métodos, ni a los polímeros precursores producidos por tales métodos, ni a los polímeros producidos de tales polímeros precursores.

Un polímero que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo para el uso según la invención puede ser producido por hidrólisis de un polímero precursor correspondiente teniendo, en lugar del átomo de hidrógeno del ácido carboxílico acrilado en las unidades derivadas de un ácido acrílico, un grupo que puede ser dividido por hidrólisis para dar el ácido, por ejemplo, dividido por hidrólisis moderada.

Un grupo que puede ser dividido por hidrólisis es, por ejemplo, un grupo de salida apropiado, por ejemplo, un grupo eliminador de electrones, por ejemplo, un grupo acilante, que es preferiblemente un activador de carboxilato, generalmente seleccionado del grupo que consiste en los grupos N-succinimidilo, pentaclorofenilo, pentafluorofenilo, para-nitrofenilo, dinitrofenilo, N-ftalimido, N-bornilo, cianometilo, piridilo, triclorotriazina, 5-cloroquinolina, e imidazolilo, preferiblemente un grupo N'-succinimidilo o imidazolilo, y especialmente un grupo N-succinimidilo. La hidrólisis puede ser realizada usando un agente básico, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, usando hidróxido sódico, y puede ser realizada bajo condiciones moderadas, por ejemplo, temperatura y presión ambientes y calentamiento suave, por ejemplo, 40 a 60°C, por ejemplo, durante 2 a 16 horas.

Un polímero que comprende las unidades (I) o (II) como se ha descrito anteriormente puede ser producido a partir de un polímero (un "polímero precursor") descrito en WO 01/18080 o de un polímero similar, o de un polímero descrito en WO 03/059973 o un polímero similar. Tales polímeros precursores incluyen polímeros que comprenden la unidad (Ia) y polímeros que comprenden la unidad (IIa)

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donde R, R^{1}, R^{2}, R^{3}, L, m y n son tal como se ha definido anteriormente, y X denota un grupo de salida, por ejemplo, un grupo acilante, que es preferiblemente un activador de carboxilato, generalmente seleccionado del grupo que consiste en grupos N-succinimidilo, pentaclorofenilo, pentafluorofenilo, para-nitrofenilo, dinitorfenilo, N'-ftalimido, N-bornilo, cianometilo, piridilo, trichlorotriazina, 5-cloroquinolina, y imidazolilo, X preferiblemente denota un grupo N-succinimidilo o imidazolilo.

Un polímero que comprende una unidad que comprende el grupo Q es decir un polímero que comprende la unidad (III) o un polímero que comprende la unidad (IV) puede ser producida a partir de un polímero precursor correspondiente (IIIa) o (IVa)

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donde R, R^{1}, R^{2} y R^{3}, R^{4}; R^{5} y R^{6}, L, Q, X, m, n y p se definen tal y como se ha definido anteriormente. m, n y p pueden cada uno representar un número entero hasta 500, y preferiblemente el total de m, n y p no es mayor que aproximadamente 500.

Un polímero precursor que tiene la polidispersidad deseada puede ser producido por el método de polimerización por radicales mediante transferencia atómica, por ejemplo, una polimerización por radicales mediante transferencia atómica mediada por cobre, o bien se pueden usar otros métodos que incluyen la polimerización por radicales libres. Tales métodos están descritos en WO 01/18080 y en WO 03/059973. Los Ejemplos están provistos más abajo.

Cuando la polimerización se realiza por polimerización por radicales mediante transferencia atómica, un iniciador de radicales adecuado es utilizado. Tales iniciadores comprenden comúnmente alquilhaluros, preferiblemente alquilbromuros. En particular, el iniciador es 2-bromo-2-metil-(2-hidroxietil)propanoato. La polimerización es también realizada en presencia de un mediador de la polimerización que comprende un complejo Cu(I). Tales complejos son normalmente complejos Cu(I)Br, formado en complejo mediante un ligando quelante. Mediadores típicos son Cu(I)Br (Bipy)2. Cu(I)Br(Bipi), Cu(I)Br (Pentametil dietileno), Cu(I)Br[metil]6 tris(2-aminoetil)amina] y Cu(I)Br(N,N'-,N'',N'''-pentametildietilentriamina).

La reacción debería ocurrir en presencia de un solvente adecuado. Tales solventes son solventes generalmente apróticos, por ejemplo, tetrahidrofurano, acetonitrilo, dimetilformamida, dimetilsulfóxido y sulfolano y sus mezclas. De forma alternativa, se puede usar agua. Solventes particularmente preferidos son dimetilsulfóxido y dimetilformamida y sus mezclas.

En cuanto a las propiedades biológicas de un complejo de la invención, hemos encontrado que los diferentes métodos de producción de un complejo de la invención pueden influir en las propiedades del complejo. Resulta ventajoso el hecho de formar un complejo de la invención hidrolizando el polímero precursor, especialmente bajo condiciones moderadas, para formar el polímero en presencia del antígeno o inmunógeno o la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer, mejor que formar un complejo entre un polímero preformado y el antígeno o inmunógeno o la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer.

La hidrólisis del polímero precursor en presencia del antígeno o inmunógeno o la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer debería generalmente efectuarse bajo condiciones tales que el antígeno, inmunógeno o sustancia no se vea afectado sustancialmente de forma adversa, por ejemplo, la hidrólisis debería generalmente efectuarse bajo condiciones moderadas. Por ejemplo, las condiciones deberían ser tales que el antígeno, inmunógeno o sustancia no se vea sustancialmente descompuesto, degradado o por el contrario obligado a perder su actividad relevante.

Por ejemplo, la hidrólisis del polímero precursor en presencia del antígeno o inmunógeno o la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer puede ser realizada usando un agente básico, por ejemplo, una base de metal alcalino o de metal alcalinotérreo, por ejemplo, una base de sodio, potasio, cesio, calcio, magnesio, o litio. Tal base puede ser, por ejemplo, un hidróxido, carbonato o hidrogenocarbonato, por ejemplo, hidróxido sódico. La hidrólisis se realiza en un solvente adecuado, por ejemplo, un solvente orgánico, por ejemplo, DMF, DMSO, DMPU o dimetilactamida. La hidrólisis puede ser realizada bajo condiciones moderadas, por ejemplo, bajo temperatura y presión ambientes y calentamiento suave, por ejemplo, de 40 a 60°C. La reacción puede ser realizada, por ejemplo durante 2 a 16 horas.

Un método para producir un complejo de la invención mediante la producción de un polímero para el uso según la invención, por ejemplo, hidrolizando un polímero precursor, en presencia del antígeno o inmunógeno o la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, forma parte de la presente invención, puesto que se trata de un complejo obtenible por tal método.

Se considera que, en un complejo de la invención, la asociación entre el polímero y la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o el antígeno o el cáncer es predominantemente no covalente (es decir, mediante enlace iónico o de Van der Waal), pero que algunas moléculas de la sustancia farmacológicamente activa o el antígeno pueden ser unidos de manera covalente al polímero. La extensión del enlace covalente puede ser dependiente de la naturaleza de la sustancia o del antígeno farmacológicamente activo y de la naturaleza del polímero.

Como se ha establecido anteriormente, el término "complejo" se utiliza en este caso para indicar una asociación entre el polímero y la sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o el antígeno o el cáncer que predominantemente no es covalente, pero que puede incluir algunos enlaces covalentes.

Los complejos de la invención son polielectrolitos que tienen grupos acídicos. La extensión de la desprotonación puede variar según el entorno del complejo. Un complejo de la invención puede estar en forma de una sal. Una sal puede ser, por ejemplo, con un contraión monovalente, bivalente, trivalente o tetravalente. Un contraión monovalente puede ser, por ejemplo, un ión de metal alcalino, por ejemplo, un ión sodio o un ión potasio o amonio. Un contraión bivalente puede ser, por ejemplo, un ión de metal alcalinotérreo, por ejemplo, un ión calcio o magnesio. Otros contraiones incluyen iones de metales de transición, por ejemplo, hierro, estaño etc. Más de un tipo de contraión puede estar presente y asociado al polímero. Además, el número y proporción de grupos formadores de sales pueden ser controlados, por ejemplo, por el uso de precursores de polímeros apropiados, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Será apreciado que, como el polímero tiene grupos acídicos y por lo tanto una carga negativa, la sustancia o agente para formar un complejo con el polímero deberían generalmente ser capaces de mantener una carga positiva para permitir la formación directa del complejo mediante interacciones no covalentes que incluyen fuerzas electroestáticas debidas a las cargas oponentes. Por ejemplo, la sustancia o agente usados para la formación del complejo pueden tener propiedades básicas, catiónicas o zwitteriónicas o pueden ser adaptados para tener tales propiedades. De forma alternativa, es posible variar la composición del polímero, en particular mediante una selección apropiada del grupo Q de modo que una sustancia deseada o agente pueda formar un complejo, por ejemplo, mediante asociación con el grupo Q.

En una forma de realización de la invención, el polímero usado en un complejo de la invención o en conjunción con un antígeno o inmunógeno, o una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer es un ácido polimetacrílico (PMAA) o una sal del mismo, por ejemplo, una sal sódica, con una polidispersidad inferior a 1,4, preferiblemente inferior a 1,2. El peso molecular del polímero es generalmente tal y como se describe en la sección Definiciones anterior. Puede ser ventajoso producir el polímero como se describe o como se describe sustancialmente en los ejemplos de la presente, por ejemplo, para hidrolizar un polímero precursor, por ejemplo, un polímero precursor con un grupo de salida de N-succinimida, usando hidróxido sódico. Puede ser ventajoso formar un complejo con un antígeno o inmunógeno, o con una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno o un cáncer in situ durante la producción del polímero.

La presente invención se refiere en particular a un complejo de la invención que comprende un complejo de la invención que comprende una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, por ejemplo, contra leishmaniasis, por ejemplo, la anfoteracina b, a una preparación farmacéutica comprendiendo tal complejo, por ejemplo, una preparación farmacéutica como se ha descrito anteriormente, y a los distintos usos de tal complejo para el tratamiento de una enfermedad o trastorno provocado por el patógeno y/o para inducir una respuesta inmune contra el patógeno como se ha descrito anteriormente. El componente del polímero del complejo es un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, tal y como se define en la reivindicación 1 por ejemplo un polímero de ácido polimetacrílico o sal del mismo como se ha descrito anteriormente.

La presente invención particularmente proporciona un complejo que comprende anfotericina B y un polímero de ácido polimetacrílico o una sal del mismo como se ha descrito anteriormente, especialmente un polímero de PMAA o una sal del mismo, producido como se describe en los ejemplos de la presente, y proporciona una preparación farmacéutica comprendiendo tal complejo, por ejemplo, una preparación farmacéutica como se ha descrito anteriormente. La invención también proporciona los distintos usos de tal complejo para el tratamiento de la leishmaniasis y/o para inducir una respuesta inmune contra un patógeno que causa la leishmaniasis, incluyendo la obtención de una vacunacón terapéutica y/o profiláctica contra la leishmanisis, como se ha descrito anteriormente.

En un método alternativo para tratar la leishmaniasis y/o para inducir una respuesta inmune contra un patógeno que produce la leishmaniasis, obteniendo una vacunación terapéutica y/o profiláctica contra la leishmanisis, un polímero de la invención y una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, por ejemplo, contra la leishmaniasis, por ejemplo, la anfotericina B, pueden ser coadministrados en preparaciones separadas, tal y como se describe de forma general más arriba. Una preparación puede ser administrada antes que la otra, pero es generalmente preferible administrar las dos preparaciones sustancialmente simultáneamente.

Los ejemplos siguientes no limitativos ilustran la invención.

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Ejemplos Ejemplo A1 Síntesis química: preparación del homopolímero de la sal sódica del ácido metacrílico

La sal sódica del ácido poli(metacrílico) (PMAA-Na) 2 fue preparada por la hidrólisis de poli(N-metacriloxisuccinimida) (PMOSu) 1 con hidróxido sódico (Esquema 1).

La PMOSu 1 ha sido previamente sintetizada por la polimerización de metacriloxisuccinimida 3 (Esquema 2) usando un procedimiento de polimerización por radicales mediante transferencia atómica (ATRP) (Brocchini S. J., y Godwin A., "Uniform molecular weight precursors", Publicaciones de Patente Internacional Números WO 01/18080A1 & EP 99307152.1 (15 Marzo 2001)).

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Esquema 1

Preparación de PMAA-Na 2 a partir de PMOSu 1

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Ejemplo A2 Síntesis de PMOSu 1

Esquema 2

Preparación de PMOSu 1 a partir de metacriloxisuccinimida 3

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Síntesis de metacriloxisuccinimida 3. A N-hidroxisuccinimida (6,6 g, 57 mmol) en diclorometano (12 ml) se le añadió gota a gota una solución de diclorometano (12 ml) de cloruro de metacriloil (6,0 g, 57 mmol) simultáneamente con una solución de diclorometano (12 ml) de trietilamina (5,8 g, 57 mmol) manteniendo la temperatura debajo de 5°C. Después de una adición completa, la mezcla reactiva fue agitada adicionalmente durante 1 h y luego lavada con hidrogenocarbonato de sodio acuoso (0,1 M) y agua (3 veces). La fase orgánica fue luego aislada y secada con sulfato de magnesio. El solvente fue eliminado para dejar el producto como un sólido blanco que fue recristalizado de acetato de etilo:hexano. Masa 8 g, p.f.= 102°C.

(^{1}H, 500 MHz, DMSO-d_{6}): 2,00 (3H, s, CH3), 2,84 (4H, s, (CH_{2})_{2}), 6,09 (1H, s, =CH_{2}), 6,34 (1 H, s, =CH_{2}).

Polimerización homogénea: Esta reacción está mostrada en el Esquema 2. En una polimerización mediada por cobre típica usando DMSO como solvente en la concentración de peso preferida del 56% en el monómero 3, se añadieron bromuro de cobre(I) (31,3 mg, 0,2 mmol), 2-2'-bipiridina (Bpy) (68,3 mg, 0,4 mmol) y monómero 3 (2,00 g, 10,9 mmol) en un matraz de fondo redondo que fue luego sellado con un septo. En el matraz se inyectó después DMSO (1,3 g). La mezcla marrón resultante fue suavemente calentada hasta que se formara una solución y luego fue purgada con argón durante aproximadamente 5 min. Una solución purgada con argón de 2-bromo-2-metil-(2-hidroxietil)propaneato 4 (46,1 mg, 0,2 mmol) en DMSO (0,2 g) fue luego inyectada en la mezcla y el matraz fue calentado a 100 °C en un baño de aceite. La mezcla reactiva se volvió viscosa después de algunos minutos y se retiró del calor después de 10-15 minutos y se enfrió rápidamente. El producto polimérico fue aislado por adición de 7-8 ml de DMSO para disolver la mezcla de producto bruto que fue añadida lentamente a una solución agitada de acetona (100 ml) para precipitar PMOSu 1 como un sólido blanco. La solución de acetona se volvió de un color verde durante la precipitación del polímero 1 debido a la disolución de las especies de cobre y el ligando. El análisis por absorción atómica indicó que el contenido de cobre en el polímero 1 cuando se encontraba a una concentración de 28,0 mg/ml en DMF fue 0,153 ppm. La precipitación del polímero 1 de la solución reactiva de DMSO en acetona puede ofrecer una alternativa viable para la cromatografía por alúmina que ha sido normalmente usada en polimerizaciones mediadas por cobre para eliminar el cobre del polímero del producto. El rendimiento aislado del polímero 1 fue 1,78 g (89%). El peso molecular promedio en número fue 22.700 g/mol y el índice de polidispersidad fue 1,20. Los pesos moleculares aparentes y las distribuciones del peso molecular para PMOSu 1 fueron determinados usando columnas de Waters Styragel HR4 y HR3 (7,3 X 300 mM) acopladas a un detector de índice de refracción Gibson 133, estándares de calibración de poli(metil metacrilato) PMMA y DMF con eluyente LiCl al 0,1%.

Las polimerizaciones fueron realizadas con proporciones diferentes de monómero 3 e iniciador 4 para dar una MWD (distribución del peso molecular) estrecha PMOSu 1 con diferentes pesos moleculares. Estos experimentos están catalogados en la tabla 1 y han sido realizados en escalas de reacción que varían de 2-6 g en metacriloxisuccinimida 3. Estas condiciones de polimerización homogénea en DMSO dieron el polímero 1 en cuestión de minutos (p. ej. el experimento 6 en la tabla 1 fue apagado después de 2 minutos para dar un rendimiento significante de la MWD estrecha del polímero 1).

Las polimerizaciones fueron conducidas a temperaturas entre 80-130°C para mantener la homogeneidad de la solución en metacriloxisuccinimida 3 en proporciones de solvente en peso que abarcan el 33-91%. El solvente preferido fue DMSO, pero se obtuvieron resultados similares con DMF. La proporción en peso de monómero 3 para el solvente polar (DMSO o DMF) fue fundamental para los resultados de la polimerización. En DMSO en proporciones en peso inferiores al 56% de monómero 3 (p. ej. 50 y 41%) resultó en rendimientos inferiores de polímero (52 y 40% respectivamente). Con concentraciones en peso superiores al 60% de monómero 3 en DMSO, la solución de polimerización se solidificó. Asimismo en DMF, la concentración en peso de monómero fue fundamental para los resultados de la reacción de polimerización, no obstante el rendimiento máximo en DMF fue inferior que en DMSO. Un 50% de rendimiento del polímero 1 fue aislado en la proporción en peso de monómero 3:DMF del 61%. Ningún polímero fue aislado cuando la reacción fue realizada en una proporción en peso de monómero 3 del 33%. Con concentraciones en peso de monómero mayores (por encima del 75%), la mezcla reactiva se solidificó.

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TABLA 1

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(B) Polimerización de la precipitación: Las polimerizaciones mediadas por cobre de monómero 3 en solventes tales como THF, acetato de etilo, tolueno y acetona también dieron una MWD estrecha del polímero 1. Los rendimientos abarcaban entre el 10-95% dependiendo del peso molecular del polímero. El peso molecular del polímero 1 más alto, hasta 25.000 g/mol se obtuvo en sistemas de solventes mezclados tales como THF y carbonato de etileno. A pesos moleculares por encima de 10.000 g/mol los rendimientos fueron a veces inferiores a aquellos observados cuando la polimerización fue conducida en DMSO o DMF. Las polimerizaciones mediadas por cobre ejemplares usando 0,5 g en el monómero 1 fueron conducidas en THF en un periodo de tiempo de 16 h a 70°C y están catalogadas en la Tabla 2. La leyenda quelante de cobre usada en estas reacciones de THF fue N, N, N', N'', N''-pentametildietilenotriamina (PMDETA). Las reacciones de precipitación adicionales están catalogadas en la tabla 3 con ácido 2-bromo-2-metil propiónico (BMA) usado como iniciador.

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TABLA 2

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TABLA 3

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Ejemplo A3 Hidrólisis de PMOSu 1 para dar PMAA-Na 2 (Esquema 1)

PMOSu 1 (1,00 g, M_{n} = 24.800 g/mol, M_{w}/M_{n} = 1,20, DMF eluyente, estándares de PMMA) fue disuelto en DMF (5,0 ml) y luego 2 M de hidróxido sódico acuoso (6,0 ml) fue añadido gota a gota con agitación provocando algo de precipitación del polímero. El recipiente de reacción se calentó rápidamente y pronto siguió una solución homogénea. La solución fue luego calentada a 70°C durante 24 h, pasado este tiempo se añadió más agua (aproximadamente 50 ml). La solución diluida fue luego dializada contra agua usando membrana de celulosa regenerada (MWCO 2000, SpectraPor). La liofilización de la solución dializada dio un producto sólido de color blanco, PMAA-Na 2 (0,3 g). GPC (eluyente PBS, PMAA-Na estándares) M_{n} = 22.000 g/mol y M_{w}/M_{n} = 1,28. FT-IR (ATR) 1675 cm^{-1}, 1547 cm^{-1}, 1194 cm^{-1}.

El valor de peso molecular para PMAA-Na 2 puede utilizarse para determinar el grado de polimerización (DP) para conocer el número de unidades de repetición para cualquier polímero derivado de 1. En este ejemplo el peso molecular de la unidad de repetición de PMAA Na 2 es 108, el DP para esta muestra fue aproximadamente 203 (es decir, 22.000 g/mol \div 108 g/mol). Esto significa que el DP para PMOSu 1 es 203, y como el peso molecular de la unidad de repetición de PMOSu 1 es 183 g/mol, entonces el peso molecular promedio en número absoluto de PMOSu 1 en este ejemplo fue 37.149 g/mol (es decir, 183 g/mol \Box 203). El valor de 203 para el DP de MWD estrecha de PMOSu 1 puede ser usado en una forma análoga para determinar el peso molecular absoluto de los polímeros derivados de 1.

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Ejemplo A4 Hidrólisis de PMOSu 1

PMOSu 1 (200 mg, M_{n} = 32.200 g/mol, M_{w}/M_{n} =1,24, eluyente DMF, estándares de PMMA), fue disuelto en DMSO (2 ml) y con agitación, 1 M de hidróxido sódico acuoso (2,2 ml) fue añadido gota a gota. Normalmente, se produjo alguna precipitación. Se añadió agua adicional (23 ml) inmediatamente después de la adición de hidróxido sódico y la mezcla se dejó en agitación a la temperatura ambiente durante 1 h. La solución de reacción resultante fue luego diluida hasta 44 ml y dializada contra 1 L de agua durante 24 h usando la membrana de diálisis Visking (MWCO 7000, Medicell International). Durante la diálisis, el agua fue cambiada 6 veces. La solución dializada fue filtrada a través de un filtro de 0,2 pm y luego liofilizada para dar 0,2 g de producto PMAA-Na 2. GPC (detección triple, NaNO_{3} 0,2 M/10% CH_{3}CN) M_{n} = 35.700 g/mol y M_{w}/M_{n} = 1,18).

Cada preparación de PMAA-Na 2 que fue preparada fue caracterizada usando resonancia magnética nuclear ^{1}H y espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier y resultó ser consecuente con el producto deseado.

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Ejemplo A5 Síntesis de PMOSu 1 por polimerización de radicales libres con AIBN seguida de hidrólisis para dar PMAA-Na 2

[0110] Una solución purgada con argón de metacriloxi succinimida 3 (3 g) y AIBN (0,135 g) en acetona (30,0 ml) fue calentada a 50°C en un vaso cerrado durante 24 h. El precipitado de color blanco formado fue aislado por filtración, disuelto en DMSO (6,0 ml) y precipitado de nuevo en acetona con agitación rápida. Después del aislamiento por filtración y secado al vacío, algunas PMOSu 1 secas (0,48 g) en DMSO (4,8 ml) fueron mezcladas con 1 N de hidróxido sódico (5,2 ml) y agua (56 ml). La resultante solución permitió ser agitada durante 1 h a la temperatura ambiente a partir de lo cual fue diluida a 105 ml con agua dulce y dializada contra 5 L de agua durante 24 H usando una membrana de diálisis Visking (MWCO 7000, Medicell International). Los 5 L de agua fueron cambiados 6 veces. La solución dializada fue filtrada a través de un filtro de 0,2 pm y luego liofilizada para dar PMAA-Na 2 (0,56 g) como un producto sólido; Mw 26.100 Da, Mn 15.200 g/mol, Mw/Mn 1,7 (SEC 0,2 M acuoso NaNO_{3}/10% CH_{3} CN, estándares de PMAA-Na).

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Ejemplo A6 Síntesis de PMOSu 1 por polimerización por radicales libres con ácido 4,4 -azobis(cianovalérico) seguida de hidrólisis para dar PMAA-Na 2

Un tubo de presión fue cargado con metacriloxisuccinimida 3 (0,5-1,0 g), y ácido 4,4'-azobis(cianovalérico) (15-30 peso %) y solvente (para ejemplo, acetona, THF recién destilado, o mezclas de estos solventes incluyendo carbonato de tolueno y de etileno) y la solución resultante fue sellada y purgada con argón durante 15 min. El matraz sellado fue luego calentado a 70-120°C durante 0,25-2,5 horas. Véase Tabla 4 para las condiciones de las reacciones ejemplares. PMOSu 1 fue aislada como un precipitado blanco por filtración y secado al vacío y GPC fue determinada en DMF usando estándares de PMMA.

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TABLA 4

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Ejemplo B Síntesis del copolímero en bloque PEG-PMOSu 6 e hidrólisis del mismo para dar el copolímero en bloque PEG-PMAA-Na 7

La polimerización y reacción de hidrólisis está mostrada en el Esquema 3 y ejemplos han sido descritos previamente (Brocchini S. J and Godwin A. "Block Copolymers". Publicación de Patente Internacional número WO 03/059973 y Pedone et al, An information rich biomedical polymer library, J. Mat. Chem., 2003, 13, 2825-2837).

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Esquema 3

Síntesis de copolímeros en bloque PEG-PMOSu 6 y PEG-PMAA-Na 7

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(A) Preparación de macroiniciadores 5

Los macroiniciadores de PEG 5 fueron preparados por el procedimiento de Jankova et al (Macromolecules (1998), 31, 538-541). Trietilamina (12,5 x 10^{-3} mol, 1,265 g, 1,75 ml) en 15 ml de CH_{2}Cl_{2} seco fue añadida a un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 250 ml equipado con un condensador, embudo de goteo, entrada de gas y un agitador magnético. Tras el enfriamiento a 0°C, se añadió bromuro de 2,2-bromoisobutirilo (12,5 x 10^{-3} mol, 2,874 g'' 1,55 ml) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} y la mezcla fue purgada con nitrógeno. Luego monometoxi PEG (Mn = 2.000 g/mol) (5 x 10^{-3} mol, 10 g) en 50 ml de CH_{2}Cl_{2} fue añadido gota a gota durante 1 h en nitrógeno. PEG ha sido previamente secado por destilación azeotrópica en tolueno y el tolueno residual fue eliminado al vacío. La temperatura de la mezcla reactiva fue dejada aumentar hasta la temperatura ambiente y la reacción continuó durante 18 h. La solución fue filtrada, la mitad del solvente se evaporó al vacío y el producto fue precipitado en éter frío. El precipitado fue recristalizado en etanol absoluto (almacenado durante toda la noche en la nevera). El macroiniciador 5 fue filtrado, lavado con éter frío y secado al vacío. El producto bruto fue purificado disolviendo 4 g en 80 ml de agua. El pH de la solución fue aumentado a pH 8 para hidrolizar el exceso de i-BuBr. Luego la solución fue extraída con CH_{2}Cl_{2} (70 ml). Se obtuvo una emulsión estable y se necesitaron varias horas para completar la separación de las fases. El solvente fue eliminado al vacío. El producto fue disuelto en EtOH caliente y puesto en una nevera para cristalizar. Luego fue filtrado y lavado con éter y secado al vacío. El producto purificado 5 fue de color blanco. El grado de sustitución fue calculado por los espectros H MNR. Este procedimiento fue también usado para preparar macroiniciadores de PEG 5 derivados de PEG 5000 y PEG 10000.

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(B) Preparación representativa de PEG-PMOSu 6 en bloque

Una mezcla de monómero 3 (como se sintetiza en WO 01/18080), carboato de etileno y bipiridina fue colocada en un tubo sellado con un septo y se purgó con argón durante 5 minutos y se añadió el CuBr. La mezcla fue calentada suavemente para formar una solución (de color marrón oscuro) y purgada con argón durante otros 30 minutos. Luego una solución del macroiniciador de PEG 5 en la cantidad relativa al monómero especificada en la tabla 5 en carbonato de etileno (suavemente calentado para licuar el carbono de etileno y 5) fue purgada con argón durante 10 minutos y añadida a la solución del monómero por jeringa lavada con argón. La mezcla fue colocada en un baño de aceite y agitada. La reacción fue detenida por exposición al aire, enfriándose y diluyéndose con DMF. Luego la solución fue pasada a través de una columna llenada con alúmina y el polímero fue precipitado en metanol. El precipitado de PEG-PMOSu 6 fue filtrado, lavado con éter y secado al vacío. La PEG-PMOSu 6 se obtuvo como un polvo blanco. La Tabla 5 muestra condiciones de polimerización, rendimiento y características del peso molecular de la polimerización conducida con el microiniciador 5 derivado de PEG de peso molecular 2000 g/mol.

TABLA 5

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(C) Ejemplo detallado de la síntesis de PEG-PMMA-Na 7 derivada de poli(etilenglicol) de peso molecular 2000 g/mol

Bromuro de cobre(I) (31,2 mg, 0,2 mmol), bpy (68,4 mg, 0,4 mmol) y N-metacriloxisuccinimida 3 (3,67 g, 20 mmol) y carbonato de etileno (2 g) fueron añadidos a un matraz de fondo redondo que luego fue sellado con un septo. La mezcla marrón resultante fue suavemente calentada hasta que se formó una solución y luego fue purgada con argón durante aproximadamente 15 min. Una solución purgada con argón de PEG2000-macroiniciador 5 (430 mg, 0,2 mmol) en carbonato de etileno (0,6 g) fue luego inyectada en la mezcla y el matraz fue calentado a 80°C en un baño de aceite durante 1 h. La mezcla reactiva viscosa fue luego retirada del calor y enfriada rápidamente. El producto crudo polimérico resultante fue disuelto en DMF (8 ml) y la solución resultante fue añadida lentamente a metano) agitado (500 ml) para precipitar PEG-PMOSu 6 como un sólido de color blanco (3,8 g, 92%); M_{n} = 37.160 g.mol^{-1} M_{w}/M_{n} = 1,32 SEC (DMF 0,1% LiCl). ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) \delta 1,38 (br, 3H, CH_{3}), 2,42 (br m, 2H, CH_{2}C), 2,78 (br, 4H, CH_{2}CH_{2}), 3,50 (s, 4H, OCH_{2}CH_{2}O).

Se realizó la hidrólisis de PEG-PMOSu 6 en bloque. Su hidrólisis a sal PEG-PMAA-Na fue realizada añadiendo lentamente 2M de NaOH (0,6 ml) gota a gota a una solución agitada de precursor de polímero en bloque (0,1 g, 0,54 mmol) en DMF (0,5 ml) en un matraz de fondo redondo de 10 ml. La mezcla reactiva fue calentada a 60°C durante 16 horas y se añadió más agua (5,0 ml). La solución diluida luego fue dializada usando un tubo de Visking (MWCO 12.000-14.000) y el producto dializado fue liofilizado para dar un producto sólido blanco de PEG_{2000}-sal PMAA-Na 7 (95% de rendimiento) M_{n} = 34,110 g.mol^{-1} M_{w}/M_{n} = 1,34 (triple detección-SEC; NaNO_{3} 0,2 M/10% CH_{3}CN). ^{1}H-NMR (D_{2}O) \delta 0,85-0,96 (br s, 3H, CH_{3}) 1,60, 1,88 (br, m, 2H, CH_{2}) y 3,58 (s, 4H, OCH_{2}CH_{2}O) confirmando que el enlace estérico impedido al bloque de PEG_{2000} no fue hidrolizado.

(D) Ejemplo detallado de la síntesis de PEG-PMMA-Na 7 derivada de poll(etilenglicol) de peso molecular 5000 g/mol

Bromuro de cobre (I) (10,4 mg, 0,072 mmol), 2,2'-bipiridina (bpy, 22,6 mg, 0,145 mmol), y N-metacriloxisuccinimida (2,0 g, 10,8 mmol), y PEG_{5000}-macroiniciador 5 (362 mg, 0,072 mmol) y carbonato de etileno (2,362 g) fueron añadidos a un matraz de Schlenk que fue luego sellado con un septo. La mezcla marrón resultante fue desgasificada por el método de congelación/descongelación. La mezcla fue calentada a 110°C en un baño de aceite durante 2 h. La mezcla reactiva viscosa fue luego retirada del calor y enfriada rápidamente. El producto polimérico bruto resultante fue luego disuelto en DMF (8 ml). La solución resultante fue añadida lentamente a metanol/dietileter agitado (2:1 v/v, 300 ml) para precipitar PEG-PMOSu 6 como un sólido blanco (1,8 g, 76%). M_{n} = 32.860 g.mol^{-1} M_{w}/M_{n} = 1,36 (SEC (DMF 0,1% LiCl). ^{1}H R.M.N. (DMSO-d_{6}) \delta 1,38 (br, 3H, CH_{3}), 2,42 (br m, 2H, CH_{2}C), 2,78 (br, 4H, CH_{2}CH_{2}), 3,50 (s, 4H, OCH_{2}CH_{2}O).

Hidrólisis de PEG-PMOSu 6 fue realizada añadiendo lentamente 2M de NaOH (0,6 ml) gota a gota a una solución agitada del precursor del polímero en bloque 6 (0,1 g, 0,54 mmol) en DMF (0,5 ml) en un matraz de fondo redondo de 10 ml. La mezcla reactiva fue calentada a 60°C durante 16 h y se añadió más agua (5,0 ml). La solución diluida luego fue dializada usando un tubo de Visking (MWCO 12.000-14.000) y el producto dializado fue liofilizado para dar PEG-sal PMAA-Na 7 como producto sólido blanco PEG_{5000}-sal PMAA-Na (75% rendimiento); M_{n} = 29,360 g.mol^{-1} M_{w}/M_{n} = 1,28 (triple detección-SEC; NaNO_{3} 0,2 M/10% CH_{3}CN). ^{1}H-NMR (D_{2}O) b 0,87-0,97 (br s, 3H, CH_{3}) 1,63, 1,89 (br, m, 2H, CH_{2}) y 3,58 (s, 4H, OCH_{2}CH_{2}O) confirmando que el enlace estérico impedido al bloque de PEG_{5000} no fue hidrolizado.

Ejemplo C) Preparación de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na

Ejemplo C1

El polímero, PMOSu (40 mg), fue disuelta en DMSO (0,4 ml) y la solución fue añadida a un frasco que contenía anfotericina B (el "fármaco") (50 mg). Con agitación, 1 M de hidróxido sódico acuoso (0,44 ml) fue añadido gota a gota a la mezcla de fármaco resultante. Normalmente, se observó algún precipitado: se añadió agua adicional (4,7 ml) inmediatamente después de la adición de hidróxido sódico y la mezcla resultante fue agitada a la temperatura ambiente durante 1 h. La solución de reacción luego fue diluida a 8,8 ml y dializada contra agua (1 L) durante 24 h usando una membrana de diálisis de Visking (MWCO 7000, Medicell International). Durante la diálisis, el agua fue cambiada 6 veces. La solución dializada fue filtrada a través de un filtro de 0,2 \mum y luego fue liofilizada para dar 0,9 g de un producto sólido amarillo. FT-IR (ATR) 1676 cm^{-1}, 1568 cm^{-1}, 1404 cm^{-1}, 1070 cm^{-1}, 1012 cm^{-1}.

La presencia de fármaco y polímero en las preparaciones fue confirmada por ^{1}H RMN y espectroscopia FT-IR. El porcentaje en peso (%peso) de anfotericina B en las preparaciones fue estimado usando espectrometría UV a 419,5 nm contra una curva de calibración hecha usando anfotericina B obtenida de Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals Ltd. El %peso en el ejemplo C1 se estimó que fuera 44 a 48%.

Antes de su evaluación biológica, las soluciones acuosas de homopolímeros y copolimeros de la sal sódica de ácido metacrílico fueron tratados para eliminar endotoxina usando columnas de carbón activado o de polimixina B. Los niveles de endotoxina fueron determinados usando el ensayo del lisado de amebocito limulus (LAL) y los compuestos usados en los experimentos descritos contenían <0,06 unidades de endotoxina/ml. Éste es el estándar de la Comunidad Europea para el agua para inyección.

D) Toxicidad celular del homopolímero y copolímeros de la sal sódica del ácido metacrílico en células primarias

Todos los experimentos fueron realizados en células humanas primarias.

Ejemplo D1

Glóbulos rojos humanos

Una solución del 2% v/v de glóbulos rojos humanos fue preparada en RPMI 1640. Una solución stock de PMAA-Na ("fármaco") fue preparada en RPMI 1640. Una solución del 1% de Triton X-100 fue usada como una referencia positiva para el 100% de la tisis celular. Dextrano y poli-L-lisina fueron usados como controles negativos y positivos respectivamente. Un volumen igual de la muestra y de glóbulos rojos fue dividido en partes alícuotas en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubó a 37°C. Después de 1 h y después de 24 h, cada muestra fue centrifugada (2.000 g, 10 min) y el sobrenadante fue añadido a una placa de microtitulación de 96 pocillos. La absorbencia fue medida a 490 nm usando un espectrofotómetro. El grado de lisis fue expresado como un porcentaje del 100% de la tisis provocada por Triton X-100. No se vio ninguna toxicidad significante con la PMAA-Na usando glóbulos rojos humanos de 3 donantes (A, B y C) hasta una concentración de 2.000 \mug/ml después de 1 h o después de 24 horas como se muestra en la Figura 1.

Ejemplo D2

Sangre humana total

Una solución del 2% v/v de sangre humana total fue obtenida a partir del donante D en RPMI 1640. Una solución stock de PMAA-Na ("fármaco") fue preparada en RPMI 1640. Una solución del 1% de Triton X-100 fue usada como una referencia positiva para el 100% de la tisis celular. Dextrano y poli-L-lisina fueron usados como controles negativos y positivos respectivamente. Un volumen igual de la muestra y de sangre fue dividido en partes alícuotas en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubó a 37°C. Después de 1 h, 6 h y después de 24 h, cada muestra fue centrifugada (500 g, 10 min) y el sobrenadante fue añadido a una placa de microtitulación de 96 pocillos. La absorbencia fue medida a 490 nm usando un espectrofotómetro. El grado de Tisis fue expresado como un porcentaje del 100% de la tisis provocada por Triton X-100. Ninguna toxicidad significante fue vista con la PMAA-Na usando sangre humana hasta una concentración de 500 \mug/ml después de 1 h o después de 6 h o después de 24 horas como se muestra en la Figura 2.

Ejemplo D3

a) Macrofagos derivados de monocitos

Los monocitos fueron separados de la sangre fresca de donantes únicos y cultivados en RPMI 1640, 20 mM de L-glutamina, penicilina (200 IU/ml), estreptomicina (200 \mug/ml) y el 10% de suero humano y fueron colocados en placas a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml. Los monocitos pudieron ser diferenciados de los macrófagos derivados de monocitos (MDMs) por otros 3 días de adherencia. Medios que contenían PMAA-Na luego fueron añadidos a las células por encima de la gama de concentración de 0-2.000 \mug/ml. Las células fueron incubadas durante 71 h antes de la adición de azul de tiazolilo (MTT, Sigma 5 mg/ml). La viabilidad del cultivo celular fue expresada como un porcentaje de la viabilidad de células crecidas en la ausencia de cualquier compuesto. Dextrano y poli(L-Iisina) fueron usadas como controles negativos y positivos respectivamente. PMAA-Na no fue tóxica para MDMs en la concentración máxima de 2.000 \mug/ml evaluada usando el ensayo de MU y el ensayo de azul tripán como se muestra en la Figura 3a.

b) Macrófagos del tejido peritoneal

Células peritoneales humanas fueron cultivadas en un medio de RPMI 1640, 20 mM de L-glutamina, 10% de suero de donante humano mezclado, 200 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina y su densidad fue ajustada a 1 x 10^{6} células/ml. Medios conteniendo PMAA-Na fueron luego añadidos a las células por encima de la gama de concentración de 0-2.000 \mug/ml. Las células fueron incubadas durante 71 h antes de la adición de MTT. La viabilidad de las células fue expresada como un porcentaje de la viabilidad de células que crecieron en ausencia de cualquier compuesto. Dextrano y poli(L-lisina) fueron usados como controles negativos y positivos respectivamente. PMAA-Na no fue tóxica para los macrófagos peritoneales hasta 500 \mug/ml. Entre 500 \mug/m y 2.000 \mug/ml, una cantidad modesta de toxicidad fue vista usando el ensayo de MTT y los ensayos de azul tripán como se muestra en la Figura 3b.

E) Actividad anticoagulante

Ejemplo E1

La actividad anticoagulante fue determinada como una medida del tiempo de protrombina (PT), tiempo parcial de tromboplastina y caolín (APTT), tiempo de trombina (TT), fibrinógeno y actividad anti-Xa. Los compuestos fueron solubilizados en solución salina tamponada con fosfato y fueron mezclados 50: 50 con plasma/tampón veronal (1: 1) y evaluados. La actividad anti-Xa fue expresada como unidades de heparina/ml (HEP (Xa) (V/ml)). PMAA-Na prolongó el APTT y el TT pero no afectó al PT. El ensayo anti-Xa fue negativo. En consecuencia, la actividad anticoagulante de estas moléculas no se debió a la actividad "tipo heparina", véase Tabla 6.

TABLA 6 Actividad anticoagulante de PMAA-Na

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Las células peritoneales de pacientes con diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD) fueron cultivadas con cada compuesto y los sobrenadantes del cultivo fueron cosechados después de 36 h de incubación. Las quimiocinas proinflamatorias y citoquinas proinflamatorias fueron medidas por inmunoanálisis enzimático (EIA) (R & D Systems).

Ejemplo F1

Las células peritoneales humanas de 3 donantes (A, B y C) fueron cultivadas con PMAA-Na (500 \mug/ml) y los sobrenadantes del cultivo cosechados después de 36 h fueron analizados para MIP-1\beta. Todos los reactivos y la PMAA-Na contenían <0,06 unidades de endotoxina/ml (EU/ml) según fue determinado usando el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus, (Pyrotell, Associates of Cape Cod, EEUU). Éste es el valor estándar de la Comunidad Europea para el agua para inyección. Hubo una liberación significante de MIP-1\beta en presencia de PMAA-Na como se muestra en la Figura 4.

Ejemplo F2

Las células peritoneales humanas de 2 donantes (A y B) fueron cultivadas con PMAA-Na (500 \mug/ml y 2,000 \mug/ml) y los sobrenadantes de cultivo cosechados después de 36 h fueron analizados para TNF-\alpha. Todos los reactivos y la PMAA-Na contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Hubo una liberación significante de TNF-\alpha en presencia de PMAA-Na con ambas concentraciones según se muestra en la Figura 5.

Ejemplo F3

Las células peritoneales humanas fueron cultivadas con PMAA-Na (500 \mug/ml) y los sobrenadantes del cultivo cosechados después de 36 h fueron analizados para las quimiocinas proinflamatorias MIP-1\alpha, MIP-18 y IL-8, y para las citoquinas proinflamatorias TNF-\alpha, IL-1\beta y IL-6. Todos los reactivos y la PMAA-Na contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Los resultados con células de hasta 3 donantes humanos diferentes (A, B y C) están mostrados en la Figura 6. La liberación de estas quimiocinas y citoquinas de células que presentan antígenos tisulares se hizo a un nivel que promovía una respuesta farmacológica Th1 en el hombre pero no lo suficientemente elevada para causar efectos secundarios adversos significantes en el hombre.

Ejemplo F4

Macrófagos derivados de monocitos sanguíneos fueron cultivados con PMAA-Na a concentraciones de hasta 2.000 \mug/ml. Todos los reactivos y la PMAA-Na contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Ninguna liberación de MI P-1\beta fue vista. Los resultados con células de 3 donantes humanos diferentes (A, B y C) están mostrados en la figura 7. Hay, en consecuencia, un efecto diferencial inmunomodulador de PMAA-Na en células provenientes de monocitos sanguíneos en comparación con células de origen de macrófagos y otras células que presentan antígenos (p. ej., células dendríticas) de compartimentos basados en el cuerpo tisular.

G) Falta de actividad del adyuvante de Th1 de PMAA-Na comercialmente disponible

Ejemplo G1

Los macrófagos peritoneales humanos fueron cultivados con PMAA-Na comercialmente disponible (Polymer Standards Service, Alemania) de una gama de pesos moleculares (M_{n} = 1.300, 22.100 y 129.000 g/mol) y distribución estrecha del peso molecular. Todos los reactivos y la PMAA-Na contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Una de las PMAA-Na comercialmente disponibles poseían un peso molecular comparable a nuestra preparación sintética de PMAA-Na (M_{n} = 22.000 g/mol). Los sobrenadantes del cultivo fueron cosechados después de 36 h. No hubo liberación de MIP-1\beta. La Figura 8 muestra los resultados individuales de 2 donantes humanos (A y B).

Ejemplo G2

Los macrófagos peritoneales humanos fueron cultivados con PMAA-Na comercialmente disponible (Polymer Standards Service, Alemania) de una gama de pesos moleculares (M_{n} = 1.300, 22.100 y 129.000 g/mol) y distribución estrecha del peso molecular. Una de las PMAA-Na comercialmente disponibles poseía un peso molecular comparable para nuestra preparación sintética de PMAA-Na (M_{n} = 22.000 g/mol). Todos los reactivos y la PMAA-Na contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Los sobrenadantes del cultivo fueron cosechados después de 36 h. No hubo liberación de TNF-\alpha. La Figura 9 muestra los resultados individuales de 2 donantes humanos (A y B).

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H) Toxicidad celular de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na en células primarias humanas

Ejemplo H1

Glóbulos rojos

El método fue tal y como se describe por el Ejemplo D1. La comparación fue hecha entre la anfotericina B de categoría clínica y la preparación de anfotericina B-PMAA-Na (ambas llamadas "fármaco" en la figura). Las soluciones concentradas de los compuestos para la prueba fueron preparadas en MGM. La Tisis de glóbulos rojos humanos fue determinada después de 1 hora (figura 10), 6 horas (figura 11) y 24 horas (figura 12) de incubación en 3 donantes diferentes (A, B y C). Ninguna toxicidad fue vista con la preparación de anfotericina B-PMAA-Na después de una incubación de 1 hora. Después de una incubación de 6 horas, la toxicidad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na fue considerablemente inferior a aquella de la anfotericina B de categoría clínica. Cuando el período de incubación fue aumentado a 24 h, la toxicidad de la anfotericina B de categoría clínica aumentó al 100% pero no hubo ningún aumento adicional en la toxicidad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na.

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Ejemplo H2

Glóbulos rojos

El método fue tal y como se describe por el Ejemplo H1. El grado de tisis de glóbulos rojos por la preparación de anfotericina B-PMAA-Na ("fármaco") fue determinada después de una incubación de 1 hora y de 24 horas para concentraciones hasta 1.000 \mug/ml. Los resultados están mostrados en la Figura 13.

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Ejemplo H3

Células mononucleares de la sangre periférica

Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) fueron suspendidas en un medio RPMI, 10% de suero de donante humano mezclado, 200 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina a 1 x 10^{5} células y se cultivaron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a 37°C con el 5% de CO_{2}. Los medios conteniendo la preparación de anfotericina B-PMAA-Na ("fármaco") fueron añadidos a las células por encima de la gama la concentración de 0-70 \mug/ml en un volumen final de 100 \mul/pocillo. Las células fueron incubadas durante 1 día o 2 días o 6 días antes de la adición de MTT (5 mg/ml). La solución de MTT fue eliminada después de 1 h y se añadió DMSO (100 \mul) para disolver los cristales de MTT. La densidad óptica fue medida a 550 nm usando un lector de placas (Molecular Devices, Wokingham, Reino Unido). La viabilidad del cultivo celular fue expresada como un porcentaje de la viabilidad de las células desarrolladas en ausencia de cualquier compuesto. Dextrano y poli(L-lisina) fueron usados como controles negativos y positivos respectivamente. El compuesto no fue tóxico para las células mononucleares de la sangre periférica en la concentración máxima de 70 \mug/ml evaluada usando el ensayo MTT y el ensayo de azul tripán después de 1 día de cultivo, 2 días de cultivo o después de 6 días de cultivo. La Figura 14 muestra los resultados individuales de hasta 3 donantes humanos representativos. Los resultados de cada donante están mostrados como gráficos de líneas en la la Figura 14.

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Ejemplo H4

Macrófagos derivados de monocitos

Las células de macrófagos derivados de monocitos (MDM) fueron separadas de la sangre fresca de donantes únicos por centrifugado de gradiente de densidad y cultivadas en un medio de crecimiento macrófago (MGM) conteniendo RPMI 1640, 20 mM de L-glutamina, penicilina (250 IU/ml), estreptomicina (250 \mug/ml) y 10% de suero humano. Se colocaron en placas a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml y se diferenciaron para MDMs durante 3 días. Los medios que contenían los compuestos ("fármacos") fueron luego añadidos a las células hasta una concentración de 125 \mug/ml. Las células fueron incubadas durante 2 días o 3 días antes de la adición de MTT. La viabilidad celular fue expresada como un porcentaje de la viabilidad de células desarrolladas en ausencia de cualquier compuesto. Dextrano y poli(L-lisina) fueron usados como controles negativos y positivos respectivamente. La preparación de anfotericina B-PMAA-Na fue menos tóxica que la anfotericina B de categoría clínica en todas las concentraciones hasta 125 \mug/ml evaluadas usando el ensayo de MTT y el ensayo de azul tripán después de 2 días y después de 3 días de cultivo como se muestra en la Figura 15.

J) Determinación de la actividad antileishmanial de la preparación de anfotericina B-PMAA- Na contra promastigotes de Leishmania

Ejemplo J1

Promastigotes de Leishmania mexicana fueron usados para estos experimentos. Estos fueron mantenidos en un medio de crecimiento de Drosophila de Schneider (Invitrogen) suplementado con el 15% de suero fetal de ternera (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y gentamicina (1 mg/100 ml). La concentración de parásito fue ajustada a 2 x 10^{6} parásitos/ml. Diluciones duplicadas del compuesto de prueba fueron preparadas en dos veces la concentración final deseada en medios de crecimiento. Un volumen igual del fármaco y la suspensión de parásitos fueron luego mezclados en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 26°C. En ese momento, MTT (5 mg/ml) fue añadido y la placa fue incubada durante otras 24 h a 26°C. La placa fue luego centrifugada (2000 g, 5 min), el sobrenadante fue descartado y el granulado fue resuspendido en 100 \mul de DMSO. La absorbencia fue medida a 570 nm usando un espectrofotómetro. Los resultados fueron expresados como la viabilidad porcentual de los promastigotes con el 100% de la viabilidad siendo determinada usando la OD de los promastigotes de replicación no tratados en los pocillos de control.

El 50% de la dosis letal (LD_{50}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania mexicana fue de 0,14 \mug/ml (inserción en la Figura 16). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania mexicana fue de 1,49 \mug/ml (inserción en la Figura 16). Los resultados de 3 experimentos con la preparación de anfotericina B-PMAA-Na están mostrados en la Figura 16. El 50% de la dosis letal (LD_{50}) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania mexicana fue de 0,10-0,19 \mug/ml (Figura 16). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania mexicana fue de 1,02-1,49 \mug/ml (Figura 16). La actividad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na contra promastigotes de Leishmania mexicana fue similar a aquella de la anfotericina B de categoría clínica en un peso por base de peso.

Ejemplo J2

Promastigotes de Leishmania donivania fueron usados para estos experimentos. Estos fueron mantenidos en medios de crecimiento de Schneider 199 suplementados con el 15% de suero fetal de ternera (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y gentamicina (1 mg/100 ml). La concentración de parásitos fue ajustada a 2 x 10^{6} parásitos/ml. Diluciones duplicadas del compuesto de prueba fueron preparadas con el doble de la concentración deseada final en los medios de crecimiento. Un volumen igual del fármaco y de la suspensión de parásitos fue luego mezclado en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 24 h a 26°C. En ese momento, MTT (5 mg/ml) fue añadido y la placa fue incubada durante otras 24 h a 26°C. La placa fue luego centrifugada (2000 g, 5 min), el sobrenadante fue descartado y el granulado resuspendido en 100 \mul de DMSO. La absorbencia fue medida a 570 nm usando un espectrofotómetro. Los resultados fueron expresados como la viabilidad porcentual de los promastigotes con el 100% de viabilidad siendo determinada usando la OD de los promastigotes de replicación no tratados, en los pocillos de control.

El 50% de la dosis letal (LD_{50}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania donivani fue de 0,08 \mug/ml (inserción en la Figura 17). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la anfotericina B de categoría clínica para los promastigotes de Leishmania donivania fue de 1,91 \mug/ml (inserción en la Figura 17). Los resultados de 3 experimentos con la preparación de anfotericina B-PMAA-Na están mostrados en la Figura 17. El 50% de la dosis letal (LD_{50}) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania donivani fue de 0,10-0,17 \mug/ml (Figura 17). El 90% de la dosis letal (LD_{90}) de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na para los promastigotes de Leishmania donivani fue de 0,98-1,28 \mug/ml (Figura 17). La actividad de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na contra los promastigotes de Leishmania donivani fue en consecuencia similar a aquella de la anfotericina B de categoría clínica en una base de peso-por-peso.

K) Determinación de la actividad antileishmanial de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na contra los amastigotes de Leishmania

Ejemplo K1

Los amastigotes de Leishmania mexicana fueron usados para infectar macrófagos derivados de monocitos humanos que fueron mantenidos en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con el 10% de suero humano (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y 200 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina. Las células fueron colocadas en placas con 10^{6} células/ml en portaobjetos para cámara de Lab-Tek (Nunc) y se incubaron a 37°C/5% de CO_{2} durante 3 días. Los medios fueron luego aspirados de los portaobjetos para cámara y un volumen igual de medios frescos fue añadido de nuevo, en el cual la concentración de amastigotes había sido ajustada para dar una proporción parásito:infección celular de 5:1. Las células fueron luego incubadas a 32°C durante 20 h para permitir el establecimiento de la infección de los macrófagos. Los medios fueron luego aspirados de los portaobjetos para cámara y sustituidos con diluciones duplicadas del compuesto de prueba. Las células fueron luego incubadas a 32°C durante 72 h. Después del lavado con PBS, las cámaras fueron separadas, los portaobjetos se dejaron secar y luego se fijaron en metanol. Cada portaobjetos fue luego teñido con Giemsa y examinado microscópicamente. Un total de 250 células fueron contadas para determinar el número de células infectadas y no infectadas.

El índice de infección fue calculado como el número medio de parásitos/célula multiplicado por el porcentaje de células infectadas. Una inhibición del 50% del crecimiento de amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana fue conseguido con 0,18-0,32 \mug/ml de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na (Figura 18) en comparación con 0,14 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica (Figura 19a) o 0,45 \mug/ml de Ambisome (Figura 19b). Una inhibición del 90% del crecimiento de amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana fue conseguida usando 1,18-1,55 \mug/ml de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na en comparación con 0,95 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica o 3,89 \mug/ml de Ambisome.

Estos gráficos de las Figuras 19 y 20 comparan las pendientes de la actividad relativa de la anfotericina B de categoría clínica y Ambisome (anfotericina B liposomal, Gilead Sciences, Great Abingdon, Cambridge, Reino Unido) y la preparación de anfotericina B-PMAA-Na contra los amastigotes intracelulares de Leishmania mexicana. Estos demuestran que la curva de destrucción para la preparación de anfotericina B-PMAA-Na es más acentuada que la curva de destrucción para Ambisome.

Ejemplo K2

Los amastigotes de Leishmania donivani fueron usados para infectar los macrófagos derivados de monocitos humanos que fueron mantenidos en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementados con el 10% de suero humano (inactivado por calor a 56°C durante 1 hora) y 200 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina. Las células fueron colocadas en placas con 106 células/ml en portaobjetos para cámara de Lab-Tek (Nunc) y se incubaron a 37°C/5% de CO_{2} durante 3 días. Los medios fueron luego aspirados de los portaobjetos para cámara y un volumen igual de medios frescos fue reañadido en el que la concentración de amastigotes fue ajustada para dar una proporción parásito:infección celular de 5:1. Las células fueron luego incubadas a 32°C durante 20 h para permitir el establecimiento de la infección de los macrófagos. Los medios fueron luego aspirados de los portaobjetos para cámara y sustituidos con diluciones duplicadas del compuesto de prueba. Las células fueron luego incubadas a 32°C durante 72 h. Después del lavado con PBS, las cámaras fueron separadas, los portaobjetos se dejaron secar y luego se fijaron en metanol. Cada portaobjetos fue luego teñido con Giemsa y examinado microscópicamente. Un total de 250 células fueron contadas para determinar el número de células infectadas y no infectadas.

El índice de infección fue calculado como el número medio de parásitos/célula multiplicado por el porcentaje de células infectadas. Una inhibición del 50% del crecimiento de amastigotes de Leishmania donivani intracelular fue conseguida con 0,30-0,71 \mug/ml de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na (figura 21) en comparación con 0,54 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica (figura 22a) o 1,96 \mug/ml de Ambisome (Figura 22b). Una inhibición del 90% del crecimiento intracelular de amastigotes de Leishmania donivani fue conseguido usando 2,18-3,18 \mug/ml de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na en comparación con 2,31 \mug/ml de la anfotericina B de categoría clínica o >8 \mug/ml de Ambisome.

L) Liberación del interferón-\gamma, actividad de adyuvante de Th1 de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na

Ejemplo L1

Células peritoneales humanas que incluían macrófagos y células dendríticas fueron cultivadas en un medio de crecimiento de macrófagos con cada compuesto. Todos los reactivos y compuestos contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Los sobrenadantes del cultivo fueron cosechados 24 h más tarde. El interferón-\gamma fue medido por EIA. La liberación de la citoquina promotora de Th1, interferón-\gamma, de los macrófagos peritoneales fue significativamente más alta en presencia de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na (100 \mug/ml) en comparación con las células control sólo, la anfotericina B de categoría clínica comercial PMAA-Na, o el PMAA-Na como se muestra en la figura 23. El nivel de liberación de interferón-\gamma con la preparación de anfotericina B sin endotoxina-PMAA-Na sería suficiente para promover una respuesta farmacológica de Th1 en el hombre pero no será lo suficientemente alta para causar efectos secundarios adversos significantes en el hombre.

Ejemplo L2

El propósito de los experimentos descritos en esta sección fue el de establecer si una preparación de un antígeno y PMAA-Na podría también suscitar una respuesta auxiliar de Th1.

La preparación de tuberculina-PMAA-Na se hizo como sigue. El homopolímero, PMAA-Na (30 mg), preparado como se describe en los Ejemplos A1 a A4 fue añadido al derivado proteico BP purificado de tuberculina (10 ml, 100.000 unidades/ml, Evans Vaccines) y la solución resultante fue agitada durante 1,5 h a la temperatura ambiente. La solución fue luego dializada contra 1 litro de agua usando la membrana de diálisis de Visking (MWCO 7000, Medicell International) por encima de 24 h, cambiando el agua seis veces. La solución dializada fue filtrada a través de un filtro de 0,2 pm y liofilizado para dar un producto sólido de color hueso (20 mg). FT-IR (ATR) 1648 cm^{-1}, 1545 cm^{-1}, 1450 cm^{-1}, 1398 cm^{-1}, 1259 cm^{-1}. PBMCs fueron luego aisladas de la sangre usando Ficoll-Paque y se resuspendieron en RPMI 1640 suplementado con el 10% de suero humano, 200 \mug/ml de penicilina y 200 IU/ml de estreptomicina. Todos los reactivos y compuestos contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml según está determinado usando el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus, (Pyrotell, Associates of Cape Cod, EEUU). Las células (10^{5} células/pocillo) y cada compuesto fueron mezclados por duplicado e incubados a 37°C/5% de CO_{2} durante 4 días. [^{3}H]-timidina (actividad específica 20-30 Ci/mmol; Amersham BioSciences, Reino Unido) fue añadida a 1 \muCi/pocillo durante otras 18 horas. Las células fueron luego cosechadas y la proliferación fue determinada usando un contador de centelleo líquido. Los resultados fueron expresados como la media de cuentas/minuto (cpm) \pm sem. La Figura 24a muestra que hubo una proliferación significativamente aumentada de linfocitos T cuando éstas fueron cultivadas con 1 \mug/ml de la preparación de tuberculina-PMAA-Na. Hubo incluso más proliferación de linfocitos T cuando éstas fueron cultivadas con 10 \mug/ml de preparación de tuberculina-PMAA-Na (P = 0,001).

La Figura 24b muestra los resultados para el donante B. Hubo significativamente más proliferación de linfocitos T con 10 \mug/ml de la preparación de tuberculina-PMAA-Na que con 10 \mug/ml de antígeno de tuberculina (P = 0,002). Esto muestra que la preparación de tuberculina-PMAA-Na causa significativamente más proliferación de linfocitos T que el antígeno de tuberculina por sí solo.

Ejemplo L3

Ensayo de ELISpot para células segregadoras de Interferon-\gamma

PBMCs humanas fueron aisladas y ajustadas a 2 x 10^{5} células/pocillo en RPMI 1640 suplementado con el 10% de suero humano, 200 \mug/ml de penicilina y 200 IU/ml de estreptomicina. Todos los reactivos y los compuestos contenían <0,06 unidad de endotoxina/ml. Los PBMCs y los compuestos fueron mezclados en los pocillos de una microplaca con PVDF de ELISpot revestida con el anticuerpo monoclonal de Interferon-\gamma humano (R&D Systems, Reino Unido). Las células no estimuladas fueron usadas como el control negativo y el Interferon-\gamma recombinante humano fue usado en el control positivo. La placa fue incubada durante 24 horas a 37°C/5% de CO_{2}. Las instrucciones del fabricante fueron luego seguidas para desarrollar la microplaca y el número de manchas positivas para el Interferon-\gamma fue contado. Cada mancha representó una única célula segregadora del interferon-\gamma. La Figura 25 muestra que la preparación de tuberculina PPD PMAA-Na fue significativamente más eficaz que el antígeno de tuberculina solo para la estimulación de la liberación de Interferon-\gamma de linfocitos T primarios humanos. Este aumento en la secreción de interferon-\gamma a partir de los linfocitos T fue visto con 50 \mug/ml de la preparación de tuberculina PPD-PMAA-Na y con 100 \mug/ml de la preparación de tuberculina PPD-PMAA-Na.

M) Determinación de la actividad antileishmanial de la preparación de anfotericina B-PMAA-Na contra Leishmania donivani en un modelo de ratón de leishmaniasis visceral

Ejemplo M1

Los amastigotes de la cepa de Leishmania donivani (MHOM/ET/67/L82) fueron recogidos de los bazos de Hamsters sirios donantes gravemente infectados con Mesocritefus auratus. Un inóculo que contenía 7,5-10 x 10^{7} amastigotes/ml fue preparado. Ratones Balb/C hembras (20 g) que fueron específicos sin patógenos fueron infectados por vía intravenosa con 200 \mul (equivalente a 1,5 - 2 x 10^{7} amastigotes) en el día 0. El punto final de la infección fue evaluado por lectura microscópica en el día 14 para controlar el nivel de infección en un ratón, y en el día 21 postinfección de impresiones de hígado teñidas con Giemsa para determinar la carga total de parásitos.

Los compuestos siguientes fueron administrados por vía intravenosa según los siguientes regímenes:

a)

control no tratado después de la infección.

b)

0,5 mg/kg de liposoma vacío en los días 14, 16 y 18 después de la infección.

c)

8 mg/kg de PMAA-Na en los días 14: 16 y 18 después de la infección.

d)

1 mg/kg de la anfotericina B de categoría clínica en los días 14, 16 y 18 después de la infección.

e)

0,5 mg/kg de Ambisome en los días 14, 16 y 18 después de la infección.

f)

0,5 mg/kg de preparación de anfotericina B-PMAA-Na en los días 14, 16 & 18 después de la infección.

g)

1 mg/kg de preparación de anfotericina B-PMAA-Na en los días 14, 16 y 18 después de la infección.

h)

2 mg/kg de preparación de anfotericina B-PMAA-Na en los días 14, 16 y 18 después de la infección.

Hubo 5 animales en cada grupo. La solución de portador para las inyecciones intravenosas de PMAA-Na y para la preparación de anfotericina B-PMAA-Na fue dextrosa al 5%. Todas preparaciones de fármacos fueron filtradas usando un filtro de jeringa de 0,2 \mul. El volumen intravenoso de inyección fue de 200 \mul por inyección.

Los grupos de ratones fueron pesados antes y después del tratamiento como una medida de la toxicidad y del cambio observado en el porcentaje de peso. En el día 21 después de la infección (que fue 3 días después de la finalización del tratamiento), la carga de parásitos fue determinada microscópicamente a partir de portaobjetos con impresiones del hígado fijadas con metanol teñidos con el 10% de Giemsa. El número de amastigotes/500 células hepáticas fue contado microscópicamente y los resultados expresados como un porcentaje del control no tratado.

La Figura 26 muestra que los liposomas vacíos y la PMAA-Na no tuvieron actividad antileishmanial. Hubo una actividad destructora significante (P<0,0001) por la anfotericina B de categoría clínica, por Ambisome, por la preparación de anfotericina B-PMAA-Na a 1 mg/kg, y por la preparación de anfotericina B-PMAA-Na a 2 mg/kg de amastigotes de Leishmania donivani en comparación con los controles. Las actividades antileishmaniales de la anfotericina B de categoría clínica, Ambisome, y la anfotericina B-PMAA-Na (2 mg/kg) no fueron significativamente diferentes entre sí (P<0,05). Estos resultados en consecuencia muestran que la preparación de anfotericina B-PMAA-Na fue tan eficaz como Ambisome en este modelo animal de leishmaniasis visceral.

Ejemplo N Síntesis de PMAA-Na Generación de constructos de PMAA-Na de peso molecular variable

Durante la síntesis del precursor de PMAA-Na, PMOSu, las condiciones de polimerización fueron alteradas como se describe en el Ejemplo A para crear diferentes polímeros con pesos moleculares que variaban de 19 kD a 37 kD. El peso molecular y el índice de polidispersidad fueron establecidos usando la cromatografía de permeación en gel (GPC).

La toxicidad de los constructos de PMAA-Na de diferentes pesos moleculares para células humanas primarias (lisis de glóbulos rojos y células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs)) fue establecida usando un ensayo de MTT. Los constructos de PMAA-Na no causaron la Tisis de los glóbulos rojos a una concentración de 2 mg/ml después de una incubación de 1 h, 5 h y 24 h, véase la Figura 27. Además, no fueron tóxicos para las células mononucleares de la sangre periférica a 2 mg/ml tras la incubación durante 1 día y durante 2 días, véase la Figura 28. Estos resultados no fueron afectados por el peso molecular de los constructos de PMAA-Na realizados.

Ejemplo O Estabilidad del complejo de anfotericina B-PMAA-Na durante el almacenamiento

Anfotericina B liofilizada - PMAA-Na fue almacenada a 4°C en argón durante 4 meses. Fue también solubilizado en dextrosa al 5% a una concentración de 1 mg/ml y se almacenó a 4°C durante 7 meses en argón. Transcurrido este tiempo, la estabilidad del complejo de anfotericina B-PMAA-Na fue determinada incubándola con glóbulos rojos humanos. Experimentos anteriores han demostrado que el complejo de anfotericina B-PMAA-Na es mucho menos tóxico que la anfotericina B. Este ensayo fue en consecuencia repetido después del almacenamiento del complejo durante varios meses.

El experimento se efectuó tal y como se ha descrito anteriormente. La anfotericina B de categoría clínica, recién preparada fue usada como una referencia para la comparación. Se realizaron incubaciones durante 1 h y 6 h. La Figura 29 muestra que el complejo de anfotericina B-PMAA-Na no fue tóxico para los glóbulos rojos después del almacenamiento. El complejo fue en consecuencia estable cuando fue almacenado como un polvo liofilizado durante 4 meses, y también cuando fue almacenado en dextrosa al 5% a 4°C durante 7 meses.

La actividad antileishmanial del complejo después del almacenamiento fue también determinada como se describe en los Ejemplos J1 y K1 anteriores. La Figura 30 muestra la actividad antileishmanial de la anfotericina B-PMAA-Na contra los promastigotes sin Leishmania y contra los amastigotes intracelulares. La actividad de anfotericina B-PMAA-Na no se vio afectada por el almacenamiento como un polvo durante 4 meses a 4°C. La actividad de la anfotericina B-PMAA-Na no se vio afectada por el almacenamiento durante 7 meses a 4°C en dextrosa al 5%.

Ejemplo P Cryptococcus neoformans

Cepas de Cryptococcus neoformans mucoidales var neoformans 3003 y var gattii 3216 de la National Collection of Pathogenic Fungi fueron evaluadas. Un aislado clínico no mucoidal var neoformans y un aislado clínico no mucoidal var gattii fueron evaluados. Los organismos fueron mantenidos en placas de agar de dextrosa de Sabouraud suplementados con cloranfenicol (Oxoid, Reino Unido) a 32°C en una cámara humedecida con el 5% de CO_{2}.

Las cepas fueron subcultivadas en agar de dextrosa de Sabouraud durante 48 h antes de ser suspendidas en agua estéril y su concentración fue ajustada a 4 x 10^{4} unidades formadoras de colonias (CFU) por ml. Las diluciones duplicadas de la muestra fueron hechas duplicando la concentración deseada final en x2 base nitrogenada de levadura (YNB, Anachem). Volúmenes iguales de muestra y suspensión de levadura fueron luego añadidos a una placa de fondo plano de 96 pocillos y se incubó a 32°C. Después de 3 días de incubación, la placa fue agitada íntegramente para dispersar la levadura igualmente a través de pocillos y la turbidez fue medida usando un espectrofotómetro (490 nm). El 100% de viabilidad fue definido usando la densidad óptica de la levadura no tratada en pocillos de control.

Para la infección de macrófagos primarios humanos, las cepas de Cryptococcus fueron subcultivadas en YNB suplementadas con el 10% de suero humano durante 48 h en presencia del 5% de CO_{2} para permitirles formar una cápsula. Los macrófagos peritoneales humanos o macrófagos derivados de monocitos (\sim750,000) fueron colocados en placas sobre portaobjetos para cámara (Lab-Tek, EEUU) y se dejaron adherirse durante 24 h. Las células de levadura fueron centrifugadas, lavadas, y resuspendidas en RPMI suplementado con el 10% de suero humano y el 2% de glucosa; esto facilita el crecimiento de la levadura. Esta suspensión fue añadida multiplicando por 15 veces la concentración de los macrófagos y la infección permitió proceder durante -21 h a 37°C en una cámara humedecida con el 5% de CO_{2}. Los medios fueron luego aspirados y los macrófagos lavados con PBS. Las diluciones duplicadas de la muestra de la prueba fueron luego añadidas en RPMI suplementado con el 10% de suero humano, y se incubaron a 37°C en una cámara humedecida con el 5% de CO_{2} durante 3 días. Los medios fueron aspirados y los macrófagos lavados abundantemente con PBS para eliminar cualquier cryptococci extracelular. Las cámaras fueron eliminadas y los portaobjetos fueron secados antes de la fijación con metanol y calor, y luego teñidos con Gram. El número de macrófagos infectados y no infectados y el número de CFU de levadura grampositivas fue contado. Los resultados fueron expresados como el índice de infección, que fue calculado como el número medio de CFU/porcentaje de células infectadas.

La Figura 31 (i) y (ii) muestran los resultados para Cryptococcus neoformans var neoformans, y la Figura 31 (iii) y (iv) muestran los resultados para Cryptococcus neoformans var gatti. La LD_{50} para anfotericina B (0,9-1,4 \mug/ml) y para anfotericina B-PMAA-Na (1,6-2,7 \mug/ml) son similares. La Figura 32 (i) y (II) muestran los resultados para Cryptococcus neoformans var neoformans, y la Figura 32 (iii) y (iv) muestran los resultados para Cryptococcus neoformans var gatti cuando estos organismos han infectado los macrófagos derivados de monocitos. La LD_{50} para anfotericina B y para anfotericina B-PMAA-Na fueron similares en los 8 experimentos realizados. En el caso de Cryptococcus neoformans var neoformans, la LD_{50} para la anfotericina B fue 0,9-1,4 \mug/ml y aquella para la anfotericina B-PMAA-Na fue similar a 1,6-2,7 \mug/ml. Para Cryptococcus neoformans var gatti la LD_{50} para anfotericina B fue 0,06-1,0 \mug/ml y aquella de la anfotericina B-PMAA-Na fue similar a 0,1-0,5 \mug/ml. En consecuencia, el complejo es tan activo contra cryptococci como la anfotericina B sola.

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Ejemplo Q Candida sp.

Candida albicans (ATCC 90028) y Candida glabrata (ATCC 90030) fueron usadas. En cada caso la cepa fue mantenida en placas de agar de dextrosa de Sabouraud suplementadas con cloranfenicol (Oxoid, Reino Unido) a 32°C en una cámara humedecida con el 5% de CO_{2}. Se subcultivó en agar de dextrosa de Sabouraud durante 48 h, antes de que su concentración fuera ajustada a 2x10^{5} CFU/ml. Se hicieron diluciones duplicadas de la muestra duplicando la concentración deseada final en x2 base nitrogenada de levadura (YNB, Anachem). Volúmenes iguales de muestra y de la suspensión de levadura fueron añadidos a una placa de fondo plano de 96 pocillos y se incubó a 32°C. Después de 1 día, la placa fue agitada íntegramente para dispersar el crecimiento de levadura igualmente a través de los pocillos. La turbidez fue medida usando un espectrofotómetro (490 nm). El 100% de la viabilidad fue establecido usando la densidad óptica de la levadura no tratada en pocillos de control.

La Figura 33 (i) muestra los resultados para Candida albicans y la Figura 33 (II) muestra los resultados para Candida glabrata. La LD_{50} para la anfotericina B (0,9-1,8 \mug/ml) y para la anfotericina B-PMAA-Na (1,6-2,3 \mug/ml) son similares. En consecuencia, el complejo es tan activo contra Candida sp. como la anfotericina B sola.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Patentes citadas en la descripción

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Claims (18)

1. Complejo que comprende un polímero que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, dicho polímero teniendo una polidispersidad de 1,7 o inferior; un peso molecular de 100.000 o inferior; y que incluyen unidades de la fórmula general (I):

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donde R es hidrógeno, metilo o ácido carboxílico y R^{1} es hidrógeno o C_{1-6} alquilo; o una sal del mismo; y

(i) una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, o

(ii) una sustancia con actividad farmacológica contra un cáncer, o

(iii) uno o más agentes seleccionados de antígenos e inmunógenos.

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2. Complejo según la reivindicación 1, donde el organismo patógeno es predominantemente, pero no exclusivamente, un organismo intracelular.

3. Complejo según la reivindicación 2, donde el organismo patógeno es un organismo intracelular que existe y/o persiste en células de origen macrófago y/o en otras células que presentan antígenos.

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4. Complejo según la reivindicación 1, donde el organismo patógeno es seleccionado de los organismos siguientes:

a) Organismos que causan micosis superficial; tiña; candidiasis; infecciones por Malassezia; otomicosis; y queratomicosis.

b) Especies de Candida que causan infecciones fúngicas invasivas y crónicas; especies de Aspergillus; Cryptococcus neoformans; Mucormicosis; especies de Fusarium; especies de Trichosporon; Blastomicosis; especies de Sporothrix; especies de Sporotrichum; Histoplasmosis; Histoplasmosis africana; Blastomicosis; Coccidioidomicosis; Paracoccidioidomicosis; e infecciones provocadas por Penicillium marneffei.

c) Organismos que causan enfermedades micobacterianas.

d) Elementos de la familia de schistosoma que causan esquistosomiasis.

e) Organismos que causan fiebres tifoidea y paratifoidea.

f) Organismos que causan toxoplasmosis.

g) Organismos que causan tripanosomiasis africana humana.

h) Organismos que causan tripanosomiasis americana.

i) Organismos que causan malaria.

j) Organismos que causan infecciones por VIH y HTLV.

k) Organismos que causan infecciones por Pneumocystis carinii.

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5. Complejo según la reivindicación 1, donde el organismo patógeno causa leishmaniasis.

6. Complejo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la sustancia farmacológicamente activa es anfotericina B.

7. Complejo según la reivindicación 1, donde un antígeno o inmunógeno es derivado directo o indirecto de un organismo que causa tuberculosis, tétanos, ántrax, cólera, difteria, sarampión, paperas, sarampión, hepatitis A, hepatitis B, gripe, herpes zóster, poliomielitis, rabia, botulismo, fiebre amarilla, varicela, herpes zóter, herpes simple, gripe o leishmaniasis.

8. Complejo según la reivindicación 1, donde un antígeno o inmunógeno es derivado directo o indirecto de un organismo tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

9. Complejo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el polímero tiene un peso molecular de 4.000 o superior.

10. Complejo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el polímero es un ácido poli(metacrílico) o una sal del mismo.

11. Preparación farmacéutica que comprende un complejo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en mezcla o conjunción con un portador farmacéuticamente adecuado.

12. Preparación farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende un adyuvante del sistema de entrega.

13. Complejo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o preparación farmacéutica según se reivindica bien en la reivindicación 11 o en la reivindicación 12, para el uso como un medicamento.

14. Polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, dicho polímero con una polidispersidad de 1,7 o inferior; un peso molecular de 100.000 o inferior; y que incluye unidades de la fórmula general (I):

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donde R es hidrógeno o metilo y R^{1} es, independientemente de R, hidrógeno o metilo; o una sal del mismo; para el uso con (i) una sustancia con actividad farmacológica contra un organismo patógeno, para el tratamiento de una infección por el organismo patógeno y/o para inducir una respuesta inmune al organismo patógeno; (ii) una sustancia con actividad farmacológica contra un cáncer para el tratamiento del cáncer; o (iii) un antígeno o inmunógeno, para inducir una respuesta inmune al antígeno o inmunógeno.

15. Complejo, preparación o polímero según se reivindica bien en la reivindicación 13 o bien en la reivindicación 14, para el uso en el tratamiento de una infección por un organismo patógeno y/o para inducir una respuesta inmune al organismo patógeno, dicho complejo comprendiendo un polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o un derivado de sal, dicho polímero teniendo una polidispersidad de 1,7 o inferior; un peso molecular de 100.000 o inferior; e incluyendo unidades de la fórmula general (1):

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donde R es hidrógeno o metilo y R^{1} es, independientemente de R, hidrógeno o metilo; o una sal del mismo; y una sustancia con actividad farmacológica contra el organismo patógeno.

16. Complejo, preparación o polímero según se reivindica bien en la reivindicación 13 o en la reivindicación 14, para el tratamiento de leishmaniasis y/o para inducir una respuesta inmune para un organismo que causa leishmaniasis en cualquiera de sus formas clínicas.

17. Complejo, preparación o polímero según se reivindica bien en la reivindicación 13 o en la reivindicación 14, para el uso en el tratamiento de un cáncer o para inducir una respuesta inmune para un antígeno o inmunógeno.

18. Polímero de distribución estrecha del peso molecular que incluye unidades derivadas de un ácido acrílico o una sal del mismo, dicho polímero teniendo una polidispersidad de 1,7 o inferior; un peso molecular de 100.000 o inferior; e incluyendo unidades de la fórmula general (I):

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donde R es hidrógeno o metilo y R^{1} es, independientemente de R, hidrógeno o metilo; o una sal del mismo; para el uso como un adyuvante inmunopotenciador en la producción de una vacuna.