JP2007518732A - アジュバント活性を有する複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アジュバント特性を有する複合体に関する。
病原生物への曝露に対する防御免疫は、免疫応答の2つの異なるアームの統合によって達成される。それらは、自然応答及び抗原特異的(適応とも呼ばれる)応答である。自然免疫応答は、侵入する病原体からの幅広いキューを検出及び応答することによって、感染の後直ぐ(数分以内)に働く。対照的に、適応免疫応答は、効果的になるために時間を要するが(2週間まで)、それは、病原体の完全な排除及び免疫記憶の生成のために必要である優れた抗原特異性を提供する。自然免疫系による病原体の抗原に独立的な認識は、免疫エフェクター及び制御機構の即座の可動化へ導き、宿主に3つの重要なサバイバルアドバンテージ(survival advantages)を提供する:
(i)免疫応答(自然及び適応性の両方)の迅速な開始、及び抗原認識のために必要な炎症及び共刺激環境(co-stimulatory environment)の生成。
(ii)適応応答の成熟化の間に病原体を抑制するための第1ラインの防御の確立。
(iii)特定の感染因子に対する防御にとって最も効果的である細胞性又は体液性エレメントの免疫応答に向けて適応免疫応答を指揮すること。
本発明は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと
(i)病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は
(ii)ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は
(iii)抗原及び免疫原から選択される1つ以上の作用物質
を含む複合体を提供する。
“アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー”という用語はここにおいて、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマー、例えばここに記載されるポリマーの1つは、例えばメタクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマー、例えばポリメタクリル酸又はその塩、例えばそのナトリウム塩を表す。該ポリマーはアクリル酸(例えば、アクリル酸若しくはメタクリル酸又はその塩)のホモポリマー又はコポリマーのいずれかであり得る。
上記に開示されるように、本発明は病原生物による感染の治療における、ガンの治療における及び/又は免疫増強アジュバントとしてのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーの種々の使用に関し、そしてまたアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと(i)病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は(ii)ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は(iii)抗原及び免疫原から選択される1つ以上の作用物質を含む複合体に関する。
a)白癬;輪癬;鵞口瘡;マラセチア感染(でん風、マラセチア毛包炎、脂漏性皮膚炎、及びスキタリジウム症を含む);外耳道真菌症;及び角膜真菌症を含む、表在性真菌症を引起す生物。
(i)病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は
(ii)ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は
(iii)抗原及び免疫原から選択される1つ以上の作用物質
を含む。
a)それは静脈投与後のアンフォテリシンBの肝臓、脾臓、リンパ節への効果的な器官送達を可能にする。これらは、動物及びヒトにおいてリーシュマニアによって主に感染される器官である。
b)それは静脈に与えられた場合、アンフォテリシンBのリーシュマニア感染したマクロファージへの効果的な細胞内送達を可能にする。
c)アンフォテリシンB−ポリ(メタクリル酸、ナトリウム塩)複合体は、リーシュマニア無鞭毛体が生残り、増殖し、残存する細胞内細胞小器官中に蓄積し、これはリーシュマニア無鞭毛体の細胞内殺傷を促進する。
d)内臓リーシュマニア症の動物モデルにおけるin vivo試験は、臨床グレードのアンフォテリシンB、商業的なリポソームアンフォテリシンB製剤AmBisome及びアンフォテリシンB−ポリ(メタクリル酸、ナトリウム塩)製剤の抗リーシュマニア活性は互いに顕著に異ならないことを示した。アンフォテリシンB−ポリ(メタクリル酸、ナトリウム)製剤は、内臓リーシュマニア症の動物モデルにおいて商業的リポソームアンフォテリシンB製剤AmBisomeと同程度効果的であった。
e)ポリ(メタクリル酸、ナトリウム塩)は組織マクロファージ中のアンフォテリシンBから放出され、それは次いでβ−ケモカイン及びインターフェロン−γの放出を促進する。これは局所Th1アジュバント応答を生成する。
f)ケモカイン及びサイトカイン発現の局所誘発は、自然免疫システムの細胞の該サイトへのリクルートメント及び活性化を促進する。これは未成熟樹状細胞及びCD4+Tリンパ球を含む。これらはマクロファージを刺激して更なるTNF−α、IL−1β及びIL−6を産生させる。
g)自然免疫システムの活性化は、樹状細胞が成熟し、組織からそれらの新たに放出された抗原が提示される局所リンパ節に移動することを誘発する。これは結果としてCD4+T細胞応答及びエフェクターCD8+T細胞応答の誘発及び生成を生じる。
h)従って、抗原提示細胞中のリーシュマニアの殺傷及びTh1促進アジュバントの直ぐ近くにおけるリーシュマニア抗原の後のアベイラビリティーは感染したマクロファージを細胞ワクチンへ変換する。
i)抗原提示細胞の近接性、アンフォテリシンBの殺傷活性によるリーシュマニア抗原の放出、及び適切且つ局所のTh1サイトカイン/ケモカイン環境の同時促進のため、細胞免疫応答は顕著に促進される。
j)同時発生の疾患の治療及び治療エフェクター細胞免疫応答、即ちワクチン接種の生成は、個体が感染した器官に対する長期の防御免疫を生成する。
k)従って、疾患の治療及び治療ワクチン接種は同時且つ外部アジュバント又は外部源のリーシュマニア抗原を投与する必要なく達成される。
l)単回投与治療は、典型的に15〜20の投与を必要とするアンフォテリシンBと異なって効果的である。
m)製剤は、商業的に利用可能であるリポソームアンフォテリシンB製剤よりも特に熱帯で見られるより高い周囲温度でより安定である。
n)ヒトにおいて静脈投与された場合によく見られるフリーアンフォテリシンの毒性は、該製剤が使用される場合最小限に下げられる。
o)アンフォテリシンB及びPMAA−Na間の複合体を形成することによって、薬剤の化学的誘導体化が回避される。結果として、リーシュマニア種に対するアンフォテリシンBの効力は、変化又は低下されない。これは、アンフォテリシンBの糖部分におけるアミノ基に特に関連する(この基がこの薬剤の薬理学的活性を媒介することにおいて重要であるため)。糖部分のアミンは、その反応性のために結合点として以前に使用された(Conover C.D. et al. Utility of poly (ethylene glycol) conjugation to create prodrugs of amphotericin B. Bioconjugate Chem. 2003; 14: 661-666)。
を含むポリマーであり得る。
を含むブロックコポリマーを含む。
を有し得る。
基Qを含むユニットを含むポリマー、即ちユニット(III)を含むポリマー又はユニット(IV)を含むポリマーは対応する前駆体ポリマー(IIIa)又は(IVa)から作製され得る。
ポリ(メタクリル酸、ナトリウム塩)(PMAA−Na)2は、水酸化ナトリウムを用いてポリ(N−メタクリルオキシスクシンイミド(PMOSu)1の加水分解によって調製された(スキーム1)。
(b)DMSOを用いた希釈及び急速な冷却によって2.5分後に反応を停止した。
(B)沈殿重合:THF、酢酸エチル、トルエン及びアセトンなどの溶媒中のモノマー3の銅媒介重合はまた、狭いMWDポリマー1を与えた。ポリマーの分子量に依存して収率は10〜95%の範囲であった。より高い分子量のポリマー1(25,000g/モルまで)がTHFと炭酸エチレンなどの混合溶媒系中に得られた。10,000g/モルよりも高い分子量において収率は時々、重合がDMSO又はDMF中で実施された場合に見られたものよりも低かった。例証的な0.5gモノマー1を使用する銅媒介重合は、70℃で16時間以上THF中で実施され、表2に列挙される。これらのTHF反応で使用される銅キレートレジェンドは、N,N,N’,N”,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA)であった。さらなる沈降反応がイニシエーターとして使用される2−ブロモ−2−メチルプロピオン酸(BMA)と共に表3中に列挙される。
b新たに蒸留されたTHF
PMOSu1(1.00g、Mn=24,800g/モル、Mw/Mn=1.20、DMF溶出剤、PMMA標準)はDMF(5.0ml)中に溶解され、次いで2Mの水性水酸化ナトリウム(6.0ml)が撹拌下で滴下され、ポリマーの幾らかの沈殿を生じた。反応容器は直ぐに温かくなり、均質な溶液が直ぐに続いた。溶液は次いで24時間70℃に加熱され、その後更なる水が添加された(約50ml)。希釈された溶液は次いで再生セルロース膜(MWCO2000、SpectraPor)を用いて水に対して透析された。透析された溶液の凍結乾燥は、白色固体プロダクトPMAA−Na2(0.3g)を生じた。GPC(PBS溶出剤、PMAA−Na標準)Mn=22,000g/モル及びMw/Mn=1.28;FT−IR(ATR)1675cm−1、1547cm−1、1194cm−1。
PMOSu1(200mg、Mn=32,200g/モル、Mw/Mn=1.24、DMF溶出剤、PMMA標準)はDMSO(2ml)中に撹拌下で溶解された。1M水性水酸化ナトリウム(2.2ml)を滴下した。典型的に、幾らかの沈殿が生じた。更なる水(23ml)が水酸化ナトリウムの添加に続いて直ぐに添加され、混合溶液は室温で1時間撹拌された。結果生じる反応溶液は次いで44mlに希釈され、Visking透析膜(MWCO7000、Medicell International)を使用して1Lの水に対して24時間透析された。透析の間、水は6回代えられた。透析された溶液は0.2μmフィルターを通して濾過され、次いで0.2gのPMAA−Naプロダクト2を得るために凍結乾燥された。GPC(トリプル検出、NaNO3 0.2M/10% CH3CN)Mn=35,700g/モル及びMw/Mn=1.18)。
アセトン(30.0ml)中のメタクリルオキシスクシンイミド3(3g)及びAIBN(0.135g)のアルゴンでパージされた溶液は、閉じた容器の中で24時間50℃に加熱された。形成された白い沈殿物は、濾過によって単離され、DMSO(6.0ml)中に溶解され、急速に撹拌しているアセトン中で再沈殿された。濾過による単離の後、真空で乾燥し、DMSO(4.8ml)中の乾燥したPMOSu1の幾らかは、1N水酸化ナトリウム(5.2ml)及び水(56ml)と混合された。結果生じる溶液は、室温で1時間撹拌され、その後それは新たな水を用いて105mlに希釈され、Visking透析膜(MWCO 7000、Medicell International)を用いて5Lの水に対して24時間透析された。5Lの水は、6回代えられた。透析された溶液は、0.2μmのフィルターを通して濾過され、次いで凍結乾燥され、固体プロダクトとしてPMAA−Na2(0.56g)を与えた;Mw 26、100 Da、Mn 15,200g/モル、Mw/Mn 1.7(SEC 0.2M水性NaNO3/10%CH3CN、PMAA−Na標準物)。
圧力管はメタクリルオキシスクシンイミド3(0.5−1.0g)、4,4’−アゾビス(シアノ吉草酸)(15−30重量%)及び溶媒(例えば、アセトン、新たに蒸留されたTHF又はトルエンと炭酸エチレンを含むこれら溶媒の混合物)でチャージされ及び結果生じる溶液はシールされアルゴンを用いて15分間パージされた。シールされたフラスコは次いで70〜120℃で0.25〜2.5時間加熱された。実施例の反応条件については表4を参照。PMOSu1は、濾過によって白色沈殿物として単離され、真空で乾燥され、PMMA標準物を使用してDMF中でGPCが測定された。
重合及び加水分解反応はスキーム3に示され、例は以前に記載される(Brocchini S. J and Godwin A. “Block Copolymers.” 国際特許公開番号WO/059973及びPedone et al, information rich biomedical polymer library, J. Mat. Chem., 2003, 13, 2825-2837)。
PEGマクロイニシエーター5は、Jankova等(Macromolecules (1998), 31, 538-541)の手順によって調製された。15mlの無水CH2Cl2中のトリエチルアミン(12.5×10−3モル、1.265g、1.75ml)は、冷却器、滴下漏斗、ガスインレット及び磁気スターラーを備えた250mlの三つ口丸底フラスコに添加された。0℃に冷却した後、10mlのCH2Cl2中の2,2−ブロモイソブチリルブロマイド(12.5×10−3モル、2,847g、1.55ml)が添加され、混合液は窒素でパージされた。次いで50mlのCH2Cl2中のモノメトキシキャップされたPEG(Mn=2,000g/モル)(5×10−3モル、10g)が窒素下で1時間滴下された。PEGは以前にトルエン中で共沸蒸留によって乾燥され、残留トルエンは真空中で除去された。反応混合物の温度は室温まで上げられ、反応は18時間継続した。溶液は濾過され、溶媒の半分が真空下で蒸発し、プロダクトが冷たいエーテル中で析出した。析出物は無水エタノール中で再結晶化された(冷蔵庫で一晩保存された)。マクロイニシエーター5は濾過され、冷エーテルで洗浄され、真空下で乾燥された。粗製プロダクトは80mlの水中に4g溶解させることによって精製された。過剰なi−BuBrを加水分解するために、溶液のpHはpH8に上げられた。次いで溶液はCH2Cl2(70ml)で抽出された。安定なエマルジョンが得られ、完全な相分離のために数時間が必要であった。溶媒は真空中で除去された。プロダクトは熱EtOH中で溶解され、結晶化するために冷蔵庫中に置かれた。次いでそれは濾過されエーテルで洗浄され、真空下で乾燥された。精製されたプロダクト5は白色であった。置換度は、H MNRスペクトルで計算された。この手順はPEG5000及びPEG10000由来のPEGマクロイニシエーター5を調製するためにも使用された。
モノマー3(WO01/18080中で合成される)の混合物、炭酸エチレン及びビピリジンはセプタムでシールされたチューブ中に配置され、それは5分間アルゴンでパージされCuBrが添加された。混合物は溶液(濃い茶色)を形成するために緩やかに加熱され更に30分間アルゴンでパージされた。次いで炭酸エチレン中の表5において特定されるモノマーと相対的な量のPEGマクロイニシエーター5溶液(エチレンカーボン及び5の両方を液化されるために緩やかに加熱される)は、10分間アルゴンでパージされ、アルゴンで洗浄されたシリンジでモノマー溶液に添加された。混合溶液はオイルバス中に配置され、撹拌された。反応は空気への曝露、冷却及びDMFでの希釈によって停止された。次いで溶液はアルミナ及びメタノール中で沈殿したポリマーで充填されたカラムを通過させた。PEG−PMOSu6沈殿物は濾過され、エーテルで洗浄され、真空下で乾燥された。PEG−PMOSu6は白色粉末として得られた。表5は、分子量2000g/モルのPEG由来のミクロイニシエーター5を用いて実施された重合の重合条件、収率及び分子量特性を示す。
2ゲル浸透クロマトグラフィーはPMMA標準物を有するDMF溶出剤を使用した。
3反応混合物は1時間アルゴンでパージされた。
銅(I)ブロマイド(31.2mg、0.2mmol)、bpy(68.4mg、0.4mmol)及びN−メタクリルオキシスクシンイミド3(3.67g、20mmol)及び炭酸エチレン(2g)は丸底フラスコに添加され、それは次いでセプタムでシールされた。結果生じる茶色混合物は、溶液が形成されるまで緩やかに加熱され、次いで約15分間アルゴンでパージされた。炭酸エチレン(0.6g)中のPEG2000−マクロイニシエーター5(430mg、0.2mmol)のアルゴンでパージされた溶液は、次いで混合物中に注入され、フラスコはオイルバス中で1時間80℃に加熱された。粘性のある反応混合物は次いで熱から離され、急速に冷却された。結果生じる粗製のポリマープロダクトはDMF(8ml)中に溶解され、結果生じる溶液は、撹拌されたメタノール(500ml)にゆっくりと添加され白色固体としてPEG−PMOSu6(Mn=37,160g・モル−1 Mw/Mn=1.32 SEC(DMF 0.1% LiCl))を析出した。1H NMR(DMSO−d6)δ1.38(br、3H、CH3)、2.42(br m、2H、CH2C)、2.78(br、4H、CH2CH2)、3.50(s、4H、OCH2CH2O)。
銅(I)ブロマイド(10.4mg、0.072mmol)、2,2’−ビピリジン(bpy、22.6mg、0.145mmol)及びN−メタクリルオキシスクシンイミド(2.0g、10.8mmol)及びPEG5000−マクロイニシエーター5(362mg、0.072mmol)及び炭酸エチレン(2.362g)はシュレンクフラスコに添加され、それは次いで隔膜でシールされた。結果生じる茶色混合物は凍結融解法によってガス抜きされた。混合物はオイルバス中で2時間110℃に加熱された。粘性にある反応混合物は次いで熱処理から除かれ、急速に冷却された。結果生じる粗製ポリマープロダクトは次いでDMF(8ml)中に溶解された。結果生じる溶液は、撹拌されたメタノール/ジエチルエーテル(2:1v/v、300ml)にゆっくりと添加され、白色固体(1.8g、76%)としてPEG−PMOSu6を沈殿した(1.8g、76%)Mn=32,860g・モル−1 Mw/Mn=1.36(SEC(DMF0.1%LiCl)。1H NMR(DMSO−d6)δ1.38(br、3H、CH3)、2.24(br m、2H、CH2C)、2.78(br、4H、CH2CH2)、3.50(s、4H、OCH2CH2O)。
実施例C1:ポリマー、PMOSu(40mg)はDMSO(0.4ml)中に溶解され、該溶液はアンフォテリシンB(“薬剤”)(50mg)を含むバイアルに添加された。撹拌下、1M水性水酸化ナトリウム(0.44ml)が結果生じる薬剤混合物に滴下された。典型的に幾らかの沈殿が見られた。更なる水(4.7ml)は水酸化ナトリウムの添加に直ぐ続いて添加され、結果生じる混合物は室温で1時間撹拌された。反応溶液は次いで8.8mlに希釈され、ビスキング透析膜(MWCO7000、Medicell International)を用いて24時間水(1L)に対して透析された。透析中、水は6回代えられた。透析された溶液は0.2μmフィルターで濾過され、次いで0.9gの黄色固体プロダクトを得るために凍結乾燥された。FT−IR(ATR)1676cm−1、1568cm−1、1404cm−1、1070cm−1、1021cm−1。
全ての実験は初代ヒト細胞で実施された。
ヒト赤血球の2%v/v溶液はRPMI 1640中で調製された。PMAA−Na(“薬剤”)のストック溶液はRPMI 1640中で調製された。TritonX−100の1%溶液は100%細胞溶解のためのポジティブリファレンスとして使用された。デキストラン及びポリ−L−リシンは各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。サンプル及び赤血球の等量は96ウェルマイクロタイター(microtitre)プレート中にアリコートされ、37℃でインキュベートされた。1時間及び24時間の後、各サンプルは遠心分離され(2,000g、10分)上清は96ウェルマイクロタイタープレートに添加された。吸光度は分光計を用いて490nmで測定された。溶解(lysis)の程度はTritonX−100によって引き起こされた100%溶解のパーセントとして表された。図1に示されるように、1時間又は24時間後、2,000μg/mlまでの濃度で、3人のドナー(A,B,C)からのヒト赤血球を用いて、PMAA−Naに顕著な毒性は見られなかった。
ヒト全血の2%v/v溶液はRPMI 1640中にドナーDから調製された。PMAA−Na(“薬剤”)のストック溶液は、RPMI 1640中に調製された。Triton X−100の1%溶液は、100%細胞溶解のためのポジティブリファレンスとして使用された。デキストラン及びポリ−L−リシンは、各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。等量のサンプル及び全血は96ウェルマイクロタイタープレート中にアリコートされ、37℃でインキュベートされた。1時間、6時間及び24時間後、各サンプルは遠心分離され(500g、10分)そして上清が96ウェルマイクロタイタープレートに添加された。吸光度は分光計を用いて490nmで測定された。溶解の程度は、Triton X−100によって引き起こされる100%溶解のパーセントとして表された。図2に示されるように、1時間後又は6時間後又は24時間後に、500μg/mlの濃度までのヒト全血を用いて、PMAA−Naに顕著な毒性は見られなかった。
a)単球由来マクロファージ
単球は一人のドナーからの新鮮な血液から分離され、RPIM 1640、20mM L−グルタミン、ペニシリン(200IU/ml)、ストレプトマイシン(200μg/ml)及び10%ヒト血清中で培養され、1×106細胞/mlの密度でプレートされた。単球はさらに3日の粘着性によって単球由来マクロファージ(MDMs)に分化させた。PMAA−Na含有培地が次いで0〜2,000μg/mlの濃度範囲で細胞に添加された。細胞はチアゾリルブルー(MTT、Sigma、5mg/ml)の添加の前に71時間インキュベートされた。細胞培養物の生存率は任意の化合物の存在無しで増殖した細胞の生存率のパーセントで表された。デキストラン及びポリ(L−リシン)は各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。PMAA−Naは、図3aに示されるようにMTTアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された最高濃度2,000μg/mlにおいてMDMsに対して毒性でなかった。
ヒト腹膜細胞はRPMI 1640培地、20mM L−グルタミン、10%混合ドナーのヒト血清、200 IU/mlペニシリン及び200μg/mlストレプトマイシン中で培養され、それらの密度は1×106細胞/mlに調節された。PMAA−Na含有培地は次いで0〜2,000μg/mlの濃度範囲で細胞に添加された。細胞はMTTの添加前に71時間インキュベートされた。細胞の生存率は、任意の化合物の存在無しで増殖した細胞の生存率のパーセントとして表された。デキストラン及びポリ(L−リシン)は各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。PMAA−Naは、500μg/mlまで腹腔マクロファージに対して毒性でなかった。500μg/m〜2,000μg/mlの間で、図3bに示されるように、中程度の量の毒性がMTTアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて見られた。
実施例E1:抗凝血活性は、プロトロンビン時間(PT)、カオリン部分トロンボプラスチン時間(APTT)、トロンビン時間(TT)、フィブリノゲン及び抗Xa活性の測定として測定された。化合物はホスフェート緩衝生理食塩水溶液に溶解され、血漿/ベロナールバッファー(1:1)と50:50で混合され、試験された。抗Xa活性はヘパリン
/ml(HEP(Xa)(V/ml)のユニットとして表された。PMAA−Naは、APTT及びTTを延長したがPTに影響しなかった。抗Xaアッセイはネガティブであった。従って、これら分子の抗凝血活性は、“ヘパリン様”活性ではなかった(表6を参照)。
3人のドナー(A、B及びC)からのヒト腹膜細胞は、PMAA−Na(500μg/ml)と培養され、36時間後に収穫された培養上清はMIP−1βについて分析された。全ての試薬及びPMAA−Naは、リムルス試験(Pyrotell, Associates of Cape Cod, US)を用いて測定されるように、<0.06エンドトキシンユニット/ml(EU/ml)を含んだ。
これは注射用水についての欧州共同体基準値である。図4に示されるように、PMAA−Naの存在下でMIP−1βの有意な放出があった。
2人のドナー(A及びB)からのヒト腹膜細胞はPMAA−Na(500μg/ml及び2,000μg/ml)と培養され、36時間後に収穫された培養上清はTNF−αについて分析された。全ての試薬及びPMAA−Naは、<0.06エンドトキシンユニット/mlを含んだ。図5に示される様に、両方の濃度においてPMAA−Naの存在下でTNF−αの有意な放出があった。
ヒト腹膜細胞はPMAA−Na(500μg/ml)と培養され、36時間後に収穫された培養上清は炎症性ケモカインMIP−1α、MIP−1β及びIL−8、並びに炎症性サイトカインTNF−α、IL−1β及びIL−6について分析された。全ての試薬及びPMAA−Naは、<0.06エンドトキシンユニット/mlを含んだ。3人までの異なるヒトドナー(A、B及びC)からの細胞での結果が図6に示される。組織抗原提示細胞からのこれらのケモカイン及びサイトカインの放出は、ヒトにおける薬理学的Th1応答を促進するレベルであったが、ヒトにおいて顕著な有害副作用を引き起こすのに十分高くはなかった。
血液由来単球由来マクロファージは、2,000μg/mlまでの濃度のPMAA−Naと培養された。全ての試薬及びPMAA−Naは、<0.06エンドトキシンユニット/mlを含んだ。MIP−1βの放出は見られなかった。3人の異なるヒトドナー(A、B及びC)からの細胞での結果が図7に示される。従って、マクロファージ起源の細胞及び組織ボディーベースコンパートメントからの他の抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)と比較した血液単球起源の細胞上にPMAA−Naの特異な免疫調節効果が存在する。
実施例G1:
ヒト腹腔マクロファージは、MWt’s範囲(Mn=1,300、22,100及び129,000g/モル)且つ狭い分子量分布の商業的に入手可能なPMAA−Na(Polymer Standards Service, Germany)と培養された。全ての試薬及びPMAA−Naは<0.06エンドトキシンユニット/mlを含んだ。商業的に入手可能なPMAA−Naの1つは、我々のPMAA−Na(Mn=22,000g/モル)の合成調製物と同等のMWtを有した。培養上清は36時間後に収穫された。MIP−1βの放出は無かった。図8は、2人のヒトドナー(A及びB)からの個別結果を示す。
ヒト腹腔マクロファージは、MWt’sの範囲(Mn=1,300、22,100及び129、000g/モル)且つ狭い分子量分布の商業的に入手可能なPMAA−Na(Polymer Standards Service, Germany)と培養された。商業的に入手可能なPMAA−Naの1つは我々のPMAA−Na(Mn=22,000g/モル)の合成調製物と同等のMWtを有した。全ての試薬及びPMAA−Naは<0.06エンドトキシンユニット/mlを有した。培養上清は36時間後に収穫された。TNF−αの放出は無かった。図9は、2人のヒトドナー(A及びB)からの個別結果を示す。
実施例H1:赤血球
方法は実施例D1について記載される通りであった。臨床グレードのアンフォテリシンB及びアンフォテリシンB−PMAA−Na調製物(どちらも図において“薬剤”と呼ばれる)間で比較が行われた。試験のための化合物のストック溶液はMGM中に調製された。ヒト赤血球溶血は、3人の異なるドナー(A、B及びC)において、1時間(図10)、6時間(図11)及び24時間(図12)のインキュベーション後に測定された。1時間のインキュベーションの後、アンフォテリシンB−PMAA−Na調製物について毒性は見られなかった。6時間のインキュベーションの後、アンフォテリシンB−PMAA−Na調製物の毒性は、臨床グレードのアンフォテリシンBのものよりも顕著に低かった。インキュベーション時間が24時間に増加された場合、臨床グレードのアンフォテリシンBの毒性は100%に上昇したが、アンフォテリシンB−PMAA−Na調製物の毒性には更なる上昇は存在しなかった。
方法は実施例H1について記載される通りであった。アンフォテリシンB−PMAA−Na調製物(“薬剤”)による赤血球溶血度は、1時間及び24時間のインキュベーション後に、1,000μg/mlまでの濃度について測定された。結果は図13に示される。
末梢血単核細胞(PBMCs)はRPMI培地、10%混合ドナーヒト血清、200 IU/mlペニシリン及び200μg/mlストレプトマイシン(1×105細胞における)中に懸濁され、37℃で5%CO2を有する96ウェルの組織培養プレート中で培養された。アンフォテリシンB−PMAA−Na調製物(“薬剤”)を含有する培地は、100μl/ウェルの終量において0〜70μg/mlの濃度範囲で細胞に添加された。細胞はMTT(5mg/ml)の添加の前に、1日又は2日又は6日間インキュベートされた。MTT溶液は1時間後に除去され、MTT結晶を溶解するためにDMSO(100μl)が添加された。光学密度はプレートリーダー(Molecular Devices, Wokingham, UK)を用いて550nmで測定された。細胞培養物の生存率は、任意の化合物の存在なしで増殖した細胞の生存率のパーセントとして表された。デキストラン及びポリ(L−リシン)は、各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。化合物は、1日の培養の後、2日の培養の後、6日の培養の後、MTTアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された最高濃度70μg/mlにおいて末梢血単核細胞に対して毒性が無かった。図14は、3人までの代表的ヒトドナーからの個別結果を示す。各ドナーからの結果は図14における線グラフとして示される。
単球由来マクロファージ(MDM)細胞は、密度勾配遠心法により1人のドナーからの新鮮な血液から分離され、RPMI 1640、20mM L−グルタミン、ペニシリン(250IU/ml)、ストレプトマイシン(250μg/ml)及び10%ヒト血清を含むマクロファージ増殖培地(MGM)において培養された。それらは1×106細胞/mlの密度でプレートされ、3日間MDMに分化された。該化合物(“薬剤”)を含有する培地は次いで125μg/mlの濃度まで細胞に添加された。細胞はMTTの添加前2日又は3日の間インキュベートされた。細胞生存率は、任意の化合物の存在無しで増殖した細胞の生存率のパーセントとして表された。デキストラン及びポリ(L−リシン)は、各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。アンフォテリシンB−PMAA−Na調製物は、図15に示されるように、培養の2日及び3日後のMTTアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された125μg/mlまでの濃度の全てにおいて臨床グレードのアンフォテリシンBよりも低毒性であった。
実施例J1:
前鞭毛期メキシコリーシュマニアがこれら実験に使用された。それらは、15%ウシ胎児血清(56℃で1時間熱不活性化された)及びゲンタマイシン(1mg/100ml)の添加されたSchneider’s Drosophila増殖培地(Invitorogen)中に維持された。寄生体濃度は2×106寄生体/mlに調節された。試験化合物の二倍希釈物は、増殖培地における所望の終濃度の2倍で調製された。等量の薬剤及び寄生体サスペンジョンは次いで96ウェルプレート中で混合され、26℃で24時間インキュベートされた。ここで、MTT(5mg/ml)が添加され、プレートはさらに24時間26℃でインキュベートされた。プレートは次いで遠心分離され(2000g、5分)、上清は廃棄され、ペレットは100μlDMSO中に再懸濁された。吸光度は分光計を用いて570nmで測定された。結果は、コントロールウェル中の前鞭毛期を複製する未処理のODを用いて測定される100%生存率の前鞭毛期のパーセント生存率として表された。
前鞭毛期ドノバンリーシュマニアがこれらの実験のために使用された。それらは、ウシ胎児血清(56℃で1時間熱不活性化された)及びゲンタマイシン(1mg/100ml)の添加されたSchneider’s Growth Media199中に維持された。寄生体濃度は2×106寄生体/mlに調節された。試験化合物の2倍希釈物は、増殖培地における所望最終濃度の二倍で調製された。等量の薬剤及び寄生体懸濁液が次いで96ウェルプレート中で混合され、26℃で24時間インキュベートされた。今回、MTT(5mg/ml)が添加され、プレートは26℃でさらに24時間インキュベートされた。該プレートは次いで遠心分離され(2000g、5分)、上清は廃棄され、ペレットは100μl DMSO中に再懸濁された。吸光度は分光計を用いて570nmで測定された。結果は、コントロールウェル中の前鞭毛期を複製する未処理のODを用いて測定される100%生存率を有する前鞭毛期のパーセント生存率として表された。
無鞭毛期メキシコリーシュマニアは、10%ヒト血清(56℃で1時間熱不活性化された)及び200 IU/mlペニシリン及び200μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI 1640(Invitrogen)中に維持されたヒト単球由来のマクロファージを感染するために使用された。細胞は106細胞/mlでLab−Tek Chamber Slides(Nunc)中にプレートされ、37℃/5%CO2において3日間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、等量の新しい培地が添加して戻され、ここにおいて無鞭毛期の濃度は5:1の寄生体:細胞感染比率を与えるように調節されている。細胞は次いで、マクロファージの感染が確立されることを可能とするために、32℃で20時間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、試験化合物の二倍希釈物と置換された。細胞は次いで32℃で72時間インキュベートされた。PBSでの洗浄の後、チャンバは分離され、スライドは乾燥させられ、次いでメタノール中に固定された。各スライドは次いでギエムザで染色され、顕微鏡で調べられた。全体で250細胞が感染した及び感染していない細胞の数の測定のためにカウントされた。
無鞭毛期ドノバンリーシュマニアは、10%ヒト血清(56℃で1時間熱不活性された)、200 IU/mlペニシリン及び200μg/mlストレプトマイシンを添加したRPIM 1640(Invitrogen)中に維持されたヒト単球由来のマクロファージを感染するために使用された。細胞は106細胞/mlでLab−Tek Chamber Slides(Nunc)中にプレートされ、37℃/5%CO2で3日間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、等量の新たな培地が添加して戻され、ここにおいて無鞭毛期の濃度は5:1の寄生体:細胞感染比率を与えるように調節されている。細胞は次いで、マクロファージの感染が確立されることを可能にするために、32℃で20時間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、試験化合物の二倍希釈物と置換された。細胞は次いで32℃で72時間インキュベートされた。PBSで洗浄したのち、チャンバは分離され、スライドは乾燥させられ、次いでメタノール中で固定された。各スライドは、次いでギエムザで染色され、顕微鏡で調べられた。全体で250細胞が感染した及び感染していない細胞の数を測定するためにカウントされた。
L)アンフォテリシンB−PMAA−Na調製物のインターフェロンγ放出、Th1アジュバント活性
マクロファージ及び樹状細胞を含むヒト腹膜細胞は、各化合物と共にマクロファージ増殖培地中で培養された。全ての試薬及び化合物は、<0.06エンドトキシンユニット/mlを含有した。培養上清は24時間後に収穫された。インターフェロンγは、EIAによって測定された。腹腔マクロファージからのTh1促進サイトカイン、インターフェロンγの放出は、図23に示されるように、コントロールのみ、臨床グレードアンフォテリシンB、商業的PMAA−Na又はPMAA−Naの細胞と比較してアンフォテリシンB−PMAA−Na調製物(100μg/ml)の存在下で有意により高かった。エンドトキシンの無いアンフォテリシンB−PMAA−Na調製物を用いたインターフェロンγ放出のレベルは、ヒトにおいて薬理学的Th1応答を促進するために十分であるが、ヒトにおいて顕著な有害副作用を引き起こす程高くはない。
このセクションに記載される実験の目的は、抗原及びPMAA−Naの調製物もTh1ヘルパー応答を刺激するかどうかを確証するためである。
ヒトPBMCsは単離され、10%ヒト血清、200μg/mlペニシリン及び200 IU/mlストレプトマイシンを添加したRPMI 1640中に2×105細胞/ウェルに調節された。全ての試薬及び化合物は<0.06エンドトキシンユニット/mlを含有した。PBMCs及び化合物はヒトインターフェロンγモノクローナル抗体(R&D Systems UK)でコートされたELISpot PVDF−バックドマイクロプレート(backed microplate)のウェル中で混合された。刺激されていない細胞がネガティブコントロールとして使用され、組換えヒトインターフェロンγがポジティブコントロールとして使用された。プレートは24時間37℃/5%CO2でインキュベートされた。次いで、製造者の指示書に従いマイクロプレートを確立し、インターフェロンγについての陽性スポットの数を数えた。各スポットは1つのインターフェロンγ分泌細胞を示した。図25はツベルクリンPPD−PMAA−Na調製物が、初代ヒトTリンパ球からのインターフェロンγの放出を刺激することにおいてツベルクリン抗原のみよりも有意により効果的であったことを示す。Tリンパ球からのインターフェロンγ分泌のこの上昇は、50μg/mlのツベルクリンPPD−PMAA−Na調製物及び100μg/mlのツベルクリンPPD−PMAA−Na調製物で見られた。
無鞭毛期ドノバンリーシュマニア種(MHOM/ET/67/L82)は、重篤に感染したドナーSyrian Hamster−Mesocritetus auratusの脾臓から集められた。7.5〜10×107の無鞭毛期/ml含有接種源が調製された。特定病原体フリーであるメスBALB/cマウス(20g)は、0日目に、200μL(1.5〜2×107無鞭毛期に等しい)を用いて静脈から感染された。感染の最終点は、14日目に一つのマウスにおける感染のレベルを調べるための顕微鏡読み、及び感染後21日目に総寄生体負荷量を測定するためのギエムザ染色された肝臓のインプレッションによって評価された。
a)感染後、未処理のコントロール。
b)感染後、14、16及び18日目、0.5mg/kgのブランクリポソーム。
c)感染後、14、16及び18日目、8mg/kgのPMAA−Na。
d)感染後、14、16及び18日目、1mg/kgの臨床グレートアンフォテリシンB。
e)感染後、14、16及び18日目、0.5mg/kgのAmBisome。
f)感染後、14、16及び18日目、0.5mg/kgのアンフォテリシンB−PMAA−Na調製物。
g)感染後、14、16及び18日目、1mg/kgのアンフォテリシンB−PMAA−Na調製物。
h)感染後、14、16及び18日目、2mg/kgのアンフォテリシンB−PMAA−Na調製物。
異なる分子量のPMAA−Naコンストラクトの生成−
PMAA−Na前駆体(PMOSu)の合成の間、19kD〜37kDの範囲の分子量を有する幾つかのポリマーを生成するために、重合条件は実施例Aに記載される様に変更された。分子量及び多分散性指数はゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて確立された。
凍結乾燥されたアンフォテリシンB−PMAA−Naは4ヶ月間アルゴン下4℃で保存された。それはまた、5%デキストロース中に1mg/mlの濃度で溶解され、アルゴン下で7ヶ月間4℃で保存された。この期間の終りに、アンフォテリシンB−PMAA−Na複合体の安定性が、それをヒト赤血球とインキュベートすることによって測定された。以前の実験はアンフォテリシンB−PMAA−Na複合体はアンフォテリシンBよりも遥かに毒性が低いことを示した。従ってこのアッセイは、数ヶ月間の複合体の保存の後に繰返された。
National Collection of Pathogenic FungiからのCryptococcus neoformans mucoidal strains var neoformans 3003及びvar gattii 3216が試験された。var neoformansの非ムコイド臨床分離株及びver gattiiの非ムコイド臨床分離株も試験された。該生物は、32℃で5%CO2で加湿されたチャンバ中のクロラムフェニコール(Oxoid,UK)を添加したサブロー(Sabouraud)デキストロース寒天プレート上に維持された。
Candida albicans (ATCC 90028)及びCandida glabrata(ATCC 90030)が使用された。それぞれの場合において、菌株は5%CO2で加湿されたチャンバ中のクロラムフェニコール(Oxoid, UK)を添加したサブローデキストロース寒天プレート上に32℃で維持された。それは、その濃度が2×105CFU/mlに調節される前に、48時間サブローデキストロース寒天上で継代培養された。サンプルの二倍希釈物は、×2酵母窒素ベース(YNB、Anachem)中の所望終濃度の二倍において作製された。等量のサンプル及び酵母懸濁物が96ウェル平底プレートに添加され、32℃でインキュベートされた。1日後、プレートは、酵母の増殖をウェルに亘って均一に分散させるために全体に振盪された。濁度が分光計を用いて測定された(490nm)。100%生存率は、コントロールウェルにおける未処理酵母の光学密度を用いて確立された。
Claims (77)
- アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと;
(i)病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は
(ii)ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は
(iii)抗原及び免疫原から選択される1つ以上の作用物質(agent)
を含む複合体。 - 該病原生物が、排他的ではないが主として細胞内生物である、請求項1に記載の複合体。
- 該病原生物が、マクロファージ起源の細胞及び/又は樹状細胞などの他の抗原提示細胞において存在及び/又は持続する細胞内生物である、請求項2に記載の複合体。
- 該病原生物が以下の生物から選択される、請求項1に記載の複合体:
a)白癬;輪癬;鵞口瘡を含む表在性真菌症;でん風、マラセチア毛包炎、脂漏性皮膚炎、及びスキタリジウム症(Scytalidium Infection)を含むマラセチア感染;外耳道真菌症;及び角膜真菌症を引き起こす生物;
b)Candida albicans、Candida tropicalis及びCandida glabrataを含む侵入性及び慢性真菌感染を引き起こすCandida種;Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus及びAspergillus nigerを含むAspergillus種;Cryptococcus neoformans;例えばAbsidia、Rhizopus及びRhizomucor種によって引き起こされるムコール症;Fusarium種;Trichosporon種;ブラストミセス症;Sporothrix種;Sporotrichum種;例えばHistoplasma capsulatum var. capsulatumによって引き起こされるヒストプラズマ症;例えばHistoplasma capsulatum var. duboisiiによって引き起こされるアフリカヒストプラズマ症;例えばBlastomyces dermatitidisによって引き起こされるブラストミセス症;例えばCoccidioides immitisによって引き起こされるコクシジオイデス症;例えばParacoccidiodes brasiliensisによって引き起こされるパラコクシジオイデス症;及びPenicillium marneffeiによって引き起こされる感染;
c)例えば結核菌、異型結核菌、及びライ菌などのマイコバクテリウムファミリーのメンバーによって引き起こされる、例えば結核及びハンセン病等のマイコバクテリア症を引き起こす生物;
d)例えばSchitosoma haematobium、Schistosoma mansoni、Schistosoma japonicum、Schistosoma intercalatum及びSchistosoma mekongi等の住血吸虫症を引き起こすSchistosomaファミリーのメンバー;
e)例えばセロタイプA、B、C及びDのサルモネラファミリーのメンバー等のチフス及びパラチフス熱を引き起こす生物;
f)例えばToxoplasma gondiiなどのトキソプラズマ症を引き起こす生物;
g)例えばTrypanosoma brucei gambiense又はTrypanosoma brucei gambienseなどのヒトアフリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物;
h)例えばTrypanosoma cruziなどのアメリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物;
i)例えばPlasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale及びPlasmodium malariaeなどのマラリアを引き起こす生物;
j)HIV及びHTLV感染を引き起こす生物;
k)Pneumocystis carinii感染を引き起こす生物。 - 該病原生物がリーシュマニア症を引き起こす、請求項1に記載の複合体。
- 該物質が、請求項2〜5のいずれか1つに定義される生物を殺す又は崩壊することができる、該病原生物に対する薬理学的活性を有する、請求項1に記載の複合体。
- 該薬理学的活性物質がアンフォテリシンBである、請求項6に記載の複合体。
- 抗原又は免疫原が、結核、破傷風、炭疽、コレラ、ジフテリア、麻疹、耳下腺炎、風疹、A型肝炎、B型肝炎、インフルエンザ、帯状疱疹、灰白髄炎、狂犬病、痘瘡、黄熱、水痘、帯状疱疹、単純ヘルペス、インフルエンザ又はリーシュマニア症を引き起こす生物から直接的又は間接的に由来する、請求項1に記載の複合体。
- 抗原又は免疫原がインフルエンザ菌タイプB,髄膜炎菌、百日咳菌、肺炎連鎖球菌、又はチフス菌から直接的若しくは間接的に由来する、請求項1に記載の複合体。
- 抗原又は免疫原が請求項2〜6のいずれか1つに定義される生物から直接的又は間接的に由来する、請求項1に記載の複合体。
- 抗原又は免疫原が自然源から得られる、又は組換えDNA技術若しくは化学合成、若しくは前記方法のいずれか1つ以上によって作製される、請求項1、請求項9又は請求項10に記載の複合体。
- ガンに対する薬理学的活性を有する該物質が細胞障害剤である、請求項1に記載の複合体。
- 薬学的に好適なキャリアと混合して又はそれとともに、請求項1〜12のいずれか1つに記載の複合体を含む薬学的製剤。
- 送達システムアジュバントを含む、請求項13に記載の薬学的製剤。
- 薬剤としての使用のための請求項1〜14のいずれか1つに記載の複合体。
- 病原生物による感染の治療における使用及び/又は病原生物に対する免疫応答の誘発のための複合体であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む、複合体。
- 病原生物による感染をこのような治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー及び該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該病原生物に対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該病原生物が請求項2〜5のいずれか1つに定義される、請求項16〜18のいずれか1つに記載の複合体又は方法。
- 該病原生物に対する薬理学的活性を有する該物質が、請求項6に定義されるものである、請求項16〜18のいずれか1つに記載の複合体又は方法。
- リーシュマニア症の治療及び/又はその臨床的形態のいずれかであるリーシュマニア症を引き起こす生物に対する免疫応答を誘発するための、請求項16〜18のいずれか1つに記載の複合体又は方法。
- リーシュマニア症を引き起こす生物に対する薬理学的活性を有する物質がアンフォテリシンBである、請求項21に記載の複合体又は方法。
- 該免疫応答が病原生物に対する治療用及び/又は予防用ワクチン接種を含む、請求項16〜22のいずれかに記載の複合体又は方法。
- ガンの治療における使用のための複合体であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む、複合体。
- ガンをその治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- ガンに対する免疫応答を、その必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該ガンに対する薬理学的活性を有する物質が細胞障害剤である、請求項24〜26のいずれか1つに記載の複合体又は方法。
- 該免疫応答が該ガンに対する治療用及び/又は予防用ワクチン接種を含む請求項24〜27のいずれか1つに記載の複合体又は方法。
- アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマーと抗原及び免疫原から選択される1つ以上の作用物質を含む、該抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発するための複合体。
- 抗原又は免疫原に対する免疫応答を被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該抗原又は免疫原を含む複合体の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該抗原又は免疫原がそれに対する防御免疫応答が必要である生物から直接的又は間接的に由来する、請求項10〜12のいずれか1つに記載の複合体又は方法。
- 該抗原又は免疫原が請求項8〜11のいずれか1つに定義される、請求項29又は30に記載の複合体又は方法。
- 該免疫応答が該病原生物に対する治療用及び/又は予防用ワクチン接種を含む、請求項29〜32のいずれか1つに記載の複合体又は方法。
- 該病原生物による感染の治療及び/又は該病原生物に対する免疫応答を誘発するための、病原生物に対する薬理学的活性を有する物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
- 病原生物による感染をその治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該病原生物に対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該免疫応答が、該病原生物に対する治療用及び/又は予防用ワクチン接種を含む、請求項34に記載のポリマー又は請求項36記載の方法。
- 該病原生物が請求項2〜5のいずれか1つに定義される、請求項34〜37のいずれか1つに記載のポリマー又は方法。
- 該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質が請求項6に定義される、請求項34〜38のいずれかに記載のポリマー又は方法。
- リーシュマニア症の治療及び/又はその臨床形態のいずれかであるリーシュマニア症を引き起こす生物に対する免疫応答を誘発するための、請求項34〜37のいずれかに記載のポリマー又は方法。
- リーシュマニア症を引き起こす該生物に対する薬理学的活性を有する物質がアンフォテリシンBである、請求項40に記載のポリマー又は方法。
- 該抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発するための、抗原及び免疫原から選択される1つ以上の作用物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
- 抗原又は免疫原に対する免疫応答をそのような治療の必要な被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該抗原又は免疫原の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該抗原又は免疫原が請求項31又は請求項32に定義される、請求項42又は43に記載のポリマー又は方法。
- 該免疫応答が治療用及び/又は予防用ワクチン接種を含む、請求項42〜44のいずれか1つに記載のポリマー又は方法。
- 該ガンの治療及び/又は該ガンに対する免疫応答を誘発するための、ガンに対する薬理学的活性を有する物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
- ガンをその治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- ガンに対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
- 該免疫応答が治療用及び/又は予防用ワクチン接種を含む、請求項46又は請求項48に記載のポリマー。
- 該ポリマー及び他の物質が一緒に又は別個に投与される、請求項34〜49のいずれか1つに記載のポリマー又は方法。
- 該ポリマー及び該薬理学的活性物質が別個に投与される場合、それらが実質的に同時に又は一方が他方の前に投与される、請求項50に記載のポリマー又は方法。
- ワクチンの製造における免疫増強アジュバントとしての使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
- それに対して免疫応答が誘発される抗原又は免疫原を含むワクチンの製造における免疫増強アジュバントとしての使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
- ワクチン製造のための方法における、免疫増強アジュバントとしてアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーの使用を含む改良。
- アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーが、1.7以下の多分散性を有する、前記請求項のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
- 該ポリマーが1.4未満、例えば1.2未満の多分散性を有する、請求項55に記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
- 血液中に存在する場合に該ポリマーが腎臓を通過する間及び後に実質的に循環血液中に残るような分子量を有する、前記請求項のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
- 該ポリマーが例えば100.000以下、例えば100,00未満、例えば80,000以下、例えば75,000以下、例えば65,000以下、例えば55,000以下、例えば45,000以下の分子量を有する、前記請求項のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
- 該ポリマーが4,000以上、例えば約5,000以上、例えば約10,000以上、例えば約20,000以上、例えば約30,000以上、例えば約40,000以上の分子量を有する、前記請求項のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 該ポリマーが、80,000〜4,000、75,000〜5,000、65,000〜10,000、55,000〜10,000、45,000〜10,000、50,000〜4,000、40,000〜25,000又は45,000〜10,000の範囲内の分子量を有する、前記請求項のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 該ポリマーが、ポリマー前駆体の加水分解を含むプロセスによって作製される、前記請求項のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマーが、アクリル酸由来のユニット中のアクリレートカルボン酸の水素原子の代わりに加水分解によって切断されて酸を与え得る基を有する対応する前駆体ポリマーの加水分解によって作製される、請求項61に記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 加水分解によって切断され得る基が、例えば適切な脱離基、例えば電子吸引基、例えばアシレーティング基であり、これは好ましくは一般的にN−スクシンイミジル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニル、ジニトロフェニル、N−フタルイミド、N−ボルニル、シアノメチル、ピリジル、トリクロロトリアジン、5−クロロキノリノ、及びイミダゾリル基から成る群から選択され、好ましくは、N−スクシンイミジル又はイミダゾリル基、そして特にN−スクシンイミジル基であるカルボキシレート活性化である、請求項62に記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 加水分解が塩基性薬剤、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩基、例えばナトリウム、カリウム、セシウム、カルシウム、マグネシウム、又はリチウム塩基であり、このような塩基は、例えば、水酸化物、炭酸塩又は炭酸水素塩、例えば水酸化ナトリウムであり得る、請求項61〜63のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 該ポリマーがポリ(メタクリル酸)又はその塩である、前記請求項のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 該ポリ(N−メタクリルオキシスクシンイミド)(PMOSu)が銅媒介原子移動ラジカル重合法を用いてメタクリルオキシスクシンイミドの均質重合によって作製される、請求項65に記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 該ポリマーが以下のユニット(I):
、或いは該ポリマーが以下のユニット(II):
である、又はユニット(II)を含む、請求項1〜64のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。 - 該ポリマーが原子媒介原子移動ラジカル重合法、例えば、銅媒介原子移動ラジカル重合法を用いてスクシンイミド前駆体の均質重合によって作製される、請求項1〜68のいずれか1つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
- 該ポリマーを形成するために、ポリマー前駆体を加水分解することを含む方法(ここで、該加水分解は前記請求項のいずれか1つに定義される成分(i)、(ii)又は(iii)の存在下で行われる)によって作製される、前記請求項のいずれかに記載の複合体。
- 該加水分解が塩基性薬剤、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩基、例えばナトリウム、カリウム、セシウム、カルシウム、マグネシウム、又はリチウム塩基を用いて行われ、このような塩基は、例えば、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、例えば、水酸化ナトリウムであり得る、請求項70に記載の複合体。。
- リーシュマニア症に対する薬理学的活性を有する物質とアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを含む、請求項1に記載の複合体。
- 該薬理学的活性物質がアンフォテリシンBである、請求項72に記載の複合体。
- 該ポリマーが請求項55〜71のいずれか1つに定義されるものである、請求項72又は73に記載の複合体。
- 請求項72〜74のいずれか1つに記載の複合体を薬学的に好適なキャリア及び必要に応じて送達システムアジュバントとの混合で含む薬学的製剤。
- その臨床形態のいずれかでのリーシュマニア症の治療における使用のための、請求項72〜74のいずれか1つに記載の複合体又は請求項75に記載の薬学的製剤。
- リーシュマニア症をその治療の必要な被験体において治療する方法であって、請求項72〜74のいずれか1つに記載の複合体又は請求項75に記載の薬学的製剤の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
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