TW202346315A - 治療及診斷劑以及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供具有以下一或多者(較佳全部)的結合分子：與人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白的高度特異性結合、與健康(未感染)細胞的極低程度非特異性結合、及/或病毒株未定性(strain-agnostic)結合能力；以及編碼該等結合分子之核酸分子。該等結合分子經設計以結合於人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之胞外域1 (ECD1)內新鑑別之抗原決定基區，該胞外域1為由US28展現之四個胞外域中之第一個，對應於如由SEQ ID NO: 5所定義的US28蛋白序列之位置1至37。已證實本發明之結合分子具有極佳結合特性，包括針對侵襲性及/或轉移性HCMV感染之癌症，包括乳癌之特定結合特異性。在某些較佳實施例中，該結合分子係選自抗體(包括例如BiTE抗體)及嵌合抗原受體(CAR)或其功能變體、片段、融合蛋白及/或結合物。亦提供表現該等結合分子之細胞，諸如表現CAR之細胞，包括CAR-T細胞、CAR-NK細胞及CAR-M細胞。
Description
本發明係關於病毒學領域。更特定言之，本發明係關於靶向如由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白之特定區的治療劑及診斷劑，及與其相關之療法，包括但不限於HCMV感染癌症及與潛伏或裂解HCMV感染相關之其他病況。
參考文獻
在本說明書中對明顯先前已出版之文獻的列舉或論述不必被視為承認該文獻為目前先進技術之一部分或為公共常識。所揭示之參考文獻以引用的方式特此併入本文中，以便其對本文所述內容提供示例性程序化或其他細節補充。
人類巨細胞病毒(HCMV)，亦稱為人類疱疹病毒5 (HHV-5)，為由全球56-94%人口攜帶之普遍機會性DNA病毒(Geisler等人, 《癌症(
Cancers)》, 2019,
11: 1842; Zuhair等人, 《醫學與病毒學評論(
Rev Med Virol)》, 2019.
29(3): 第e2034頁)。
在大部分免疫活性個體中，HCMV感染無症狀、未確診且被視為無害的，因為宿主免疫系統能很好地控制病毒複製(Boeckh及Geballe, 《《臨床研究雜誌》(J Clin Invest)》, 2011.
121(5): 第1673-80頁)。
與所有疱疹病毒類似，HCMV在初次感染之後建立終生持久性潛伏感染。潛伏感染之特徵在於低程度病毒複製或不存在病毒複製，其中病毒基因體主要駐存於CD34
+造血前驅細胞群中，該造血前驅細胞群駐存於骨髓中(Collins-McMillen等人, 《病毒(
Viruses)》, 2018.
10(8))。
假定，潛伏HCMV除非被宿主免疫系統持續控制，否則可以隨機方式間歇地再活化。出於此原因，該病毒可在某些情況下引起併發症，例如在免疫功能不全患者中，在該等患者中不僅初級HCMV感染而且再感染或再活化亦可引起危及生命的疾病，侵襲許多器官，導致相當大發病率及死亡率(Boeckh及Geballe, 同上; Griffiths等人,
《病理學雜誌(
J Pathol)》, 2015.
235(2): 第288-97頁)。
HCMV為最常見先天性病毒感染之一及出生缺陷之最重要原因(Davis等人,
《出生缺陷研究(
Birth Defects Res)》, 2017.
109(5): 第336-346頁)。愈來愈清楚的是，在生命過程中HCMV感染亦可能在動脈粥樣硬化、自體免疫疾病及若干惡性病，尤其多形性膠質母細胞瘤之發病機制方面發揮作用(Soderberg-Naucler, 《《內科醫學雜誌》(
J Intern Med)》, 2006,
259(3): 第219-46頁; Cobbs, 《病毒學新觀點(Curr Opin Virol)》, 2019.
39: 第49-59頁)。另外，HCMV血清狀態可能影響灼傷、創傷及敗血症之臨床病程(Soderberg-Naucler, 2006, 同上; Limaye等人,
JAMA, 2008.
300(4): 第413-22頁; Osawa及Singh, 《重症監護(
Crit Care)》, 2009.
13(3): 第R68頁)。
潛伏HCMV感染可能在發炎過程期間在前驅細胞分化成單核球/浸潤巨噬細胞或樹突狀細胞(DC)時經再活化，且此等細胞可將病毒散播至周邊器官(Soderberg-Naucler等人, 《細胞(
Cell)》, 1997,
91: 119-126)。由此等發炎細胞攜載之再活化HCMV可到達所有身體組織，且感染廣泛數目之細胞類型並在其中複製(Ljungman等人, 《北美傳染病診所(
Infect.
Dis. Clin. North. Am.)》, 2010,
24: 319-337)。由所有體液，包括唾液及母乳進一步傳播該感染(Hamprecht等人, 《柳葉刀(
Lancet)》, 2001,
357: 513-518)。百分之九十的來自HCMV血清反應呈陽性的女性之母乳樣本含有該病毒，且在一歲兒童中導致約30% HCMV患病率。因此，哺乳及親代接觸構成嬰兒早期或兒童期獲HCMV感染的重要途徑(Hamprecht等人, 2001, 同上)。
巨細胞病毒基因體及遺傳多樣性：
如Berg等人, 2019, 《公共科學圖書館：綜合(PLoS ONE)》
14(9): e0222053中所論述，CMV基因體由單一線性雙股DNA組成且尺寸大約為235 kb。其含有超過750個經轉譯ORF (Stern-Ginossar等人, 《科學(
Science)》, 2012,
338(6110):1088-93)，該等ORF可被分成兩個區：獨特長(UL)區及獨特短(US)區，該等區側接有末端及內部反向重複序列。
巨細胞病毒已調適多種策略以避開免疫偵測且促進感染散播。此等策略係基於在感染期間對宿主免疫反應之操控及調節，其例如藉由表現對人類免疫系統正常功能重要的受體及配位體之經病毒編碼同源物而實現。CMV藉由編碼比其他人類疱疹病毒多2至3倍數目之基因產物(許多該等基因產物已展示與人類免疫系統之相互作用且操控人類免疫系統(Mocarski, 《微生物學趨勢(
Trends Microbiol.)》, 2002;
10(7):332-9))，具有可供用於調節宿主之免疫反應之全所未有的工具數目。
流行CMV病毒株之間的遺傳變異較大，且近期研究報導75%病毒株在若干基因中含有斷裂性突變及多態性(Sijmons等人,
《病毒學雜誌(
J. Virol.)》, 2015, 89(15): 7673-7695)。為了排除由於連續繼代所致之斷裂性突變，研究作者僅使用繼代1至2次之病毒株且直接自臨床樣本驗證大部分所觀察到之突變。對於基因UL40及UL111A，分別於9.9%及5.5%之所研究病毒株中發現引起功能性剔除之突變(Sijmons等人, 2015, 同上)。UL111A係可抑制正常免疫反應之功能性介白素10同源物(Mocarski, 2002, 同上; Engel及Angulo, 《實驗醫學與生物學進展(
Adv Exp Med Biol.)》, 2012,
738:256-76)。UL40之信號肽促進HLA-E在感染細胞表面上表現，該HLA-E為自然殺手細胞抑制受體之配位體(Wilkinson等人, 《臨床病毒學期刊(
J Clin Virol.)》, 2008;
41(3):206-12)。
其他亦高度可變之CMV基因為其中已鑑別出14種不同基因型的趨化介素同源物UL146 (Dolan等人, 《普通病毒學期刊(
J Gen Virol.)》, 2004,
85(Pt 5):1301-12)及趨化介素清道夫受體(scavenging receptor) (Kledal等人, 《歐洲生化學會聯合會快報(
FEBS Lett.)》, 1998;
441(2):209-14)以及其中已報導了大量N端多態性的G蛋白偶合受體US28 (Goffard等人, 《病毒基因(
Virus Genes)》, 2006;
33(2):175-81; Arav-Boger等人, 《傳染病學雜誌(
J Infect Dis.)》, 2002;
186(8):1057-64)。
Berg等人, 2019 (同上)報導對於其他人類疱疹病毒未觀測到此遺傳多樣性程度(Sijmons等人, 2015, 同上)且引起以下問題：CMV為何在重要的免疫調節基因中施加此類變化及其如何影響病毒-宿主相互作用。
認為，大部分HCMV發病機制與病毒潛伏期相關，該病毒潛伏期與病毒經由多個機制避開體液免疫反應及細胞宿主免疫反應之能力密切有關(Manandhar等人,
《國際分子科學雜誌(
Int J Mol Sci)》, 2019.
20(15))。此類機制中最重要的一點包括HCMV之此高度的、不斷變化的遺傳多樣性。HCMV基因體在不同個體之間且甚至在相同宿主內變化(Gorzer等人, 《病毒學雜誌》, 2010,
84(14): 7195-7203; Renzette等人,
《PLoS病原體(
PLoS Pathog)》, 2011,
7(5): e1001344; Renzette等人, 《病毒學新觀點》, 2014.
8: 109-15; Renzette等人, 《美國國家科學院院刊(
Proc Natl Acad Sci USA)》, 2015,
112(30): E4120-8; Renzette等人, 《病毒學雜誌》, 2017,
91(5))。新的宿主感染產生對各經感染個體獨特之病毒株，且產生選擇事件，在該等選擇事件中，由於免疫反應之選擇性壓力，新基因型變得顯性(Renzette等人, 2011, 同上)。有可能病毒及宿主因素均會有助於在HCMV感染期間促進病毒遺傳漂移(Vabret等人, 《免疫趨勢(
Trends Immunol)》, 2017,
38(1): 53-65; Christensen及Paludan,
《細胞與分子免疫學(
Cell Mol Immunol)》, 2017,
14(1): 4-13)。另外，各患者很可能感染有如文獻中先前充分報導之多個CMV病毒株(Renzette等人, 2015, 同上)。相同個體中存在多個病毒株使得能夠自不同HCMV病毒株重組。重組被視為代表HCMV遺傳多樣性之主要驅動因素(Suarez等人,
《傳染病學雜誌》, 2019,
220(5): 781-791; Sijmons等人, 2015, 同上; Lassalle等人, 《病毒進化(
Virus Evol)》, 2016,
2(1): vew017; Cudini等人, 《美國國家科學院院刊》, 2019,
116(12): 5693-5698)。對高度多樣性區再分類將產生新組合以確保有效的免疫逃避，此亦可影響病毒之病原性。一致地，混合HCMV感染已與若干研究中免疫功能不全個體之較差臨床結果相關(Coaquette等人, 《臨床傳染病(
Clin Infect Dis)》, 2004,
39(2): 155-161; Lisboa等人, 《移植感染性疾病(
Transpl Infect Dis)》, 2012,
14(2): 132-140; Houldcroft等人, 《微生物學前沿(
Front Microbiol)》, 2016,
7: 1317)。
此外，HCMV多樣性藉由遺傳多態性驅動，該等遺傳多態性在整個基因體中不均勻分佈(Sijmons等人, 2015，同上)。在暴露於病毒粒子表面上之蛋白質區中及對於在胞外域中之宿主細胞膜處表現之病毒蛋白，選擇較強(Mozzi等人, 《PLoS病原體》, 2020,
16(5): e1008476)。宿主免疫系統施加之選擇性壓力很可能在流行HCMV病毒株當中的基因多樣性之形成中發揮主要作用。因此，藉由正向選擇靶向之若干位點位於人類抗體識別之抗原決定基內或直接與參與免疫反應之宿主分子相互作用之蛋白質區中(Sijmons等人, 2015, 同上; Mozzi等人, 2020, 同上)。此等特徵與HCMV與人類免疫系統之間的持續捉迷藏式相互作用(hide and seek interplay)一致。
病毒株變化性及不斷突變之病毒使得對病毒診斷學與HCMV疫苗及藥物開發兩者要求苛刻且為當前抗病毒藥治療設定了限制。多年來，HCMV疫苗開發一直為醫學界之高度優先事項，但迄今為止尚未有有效的HCMV疫苗獲得批准。
HCMV之致癌特性
HCMV編碼之蛋白質顯示不同致癌功能(Geisler等人, 2019，同上)。在進入宿主細胞後，諸如pUL48之HCMV病毒粒子之被膜蛋白經釋放，從而使細胞固有免疫反應及先天性免疫反應失能，且促進宿主細胞之增強的代謝活動(Kumari等人, 《細胞死亡和分化(
Cell Death Dis.)》, 2017,
8: e3078)。此等HCMV編碼之蛋白質可使得細胞能夠越過G1期以促進快速細胞分裂(Kumari等人, 2017，同上)。經由上調抗凋亡基因及下調促凋亡基因，細胞進入增強的存活狀態。
在病毒DNA進入細胞核之後，細胞RNA聚合酶I及II (Pol I及II)用於藉由結合至主要即刻早期啟動子(MIEP)來轉錄病毒基因(Kostopoulou等人, 《腫瘤標靶(
Oncotarget)》, 2017,
8: 96536-96552)。經表現之第一基因為即刻早期(IE)基因。衍生自該等基因之IE蛋白質充當控制早期及晚期病毒基因表現及直接宿主基因表現之轉錄因子。該等蛋白質必需建立裂解感染且對於潛伏期之病毒再活化至關重要(Kumari等人, 2017, 同上; Tamrakar等人, 《病毒學雜誌》, 2005,
79: 15477-15493)。裂解HCMV感染導致細胞週期失調，且IE基因產物干擾關鍵細胞因子，包括視網膜母細胞瘤蛋白家族(Rb)、細胞週期蛋白、p53、Wnt、磷脂醯肌醇3-激酶/Akt、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)及NF-κB，以增加感染細胞之永生特性(Moussawi等人, 《科學報告(
Sci. Rep.)》, 2018,
8: 12574)。此等路徑通常在癌細胞中活化。由諸如Fos及Myc之原致癌基因遞送之促細胞分裂信號的活化可藉由HCMV感染細胞中之IE蛋白誘導(Hagemeier等人, 《病毒學雜誌》, 1992,
66: 4452-4456)。此外，在HCMV感染細胞中誘導MYB基因，類似於在HPV相關癌瘤中增強MYB基因表現(Moussawi等人, 2018, 同上)。除促細胞分裂信號以外，HCMV感染經由惡化DNA修復路徑而引起染色體畸變，引起感染細胞中之遺傳不穩定性(Straat等人, 《國立癌症研究所雜誌(
J. Natl. Cancer Inst.)》, 2009,
101: 488-497; Siew等人, 《生醫科學雜誌(
J. Biomed. Sci.)》, 2009,
16: 107)。此推動了基因突變之發展。
據報導，包括US27、US28、UL33及UL78的各種HCMV編碼G蛋白偶合受體(GPCR)樣蛋白顯示重要致癌功能(Heukers等人, 《致癌基因(
Oncogene)》, 2018,
37: 4110-4121)。G蛋白活化代謝及致癌關鍵信號傳導路徑，諸如cAMP及PI3K信號傳導路徑，其中後者對於出現上皮細胞之錨定非依賴性生長及致癌性轉型至關重要(Moussawi等人, 2018, 同上; Boroughs等人, 《自然細胞生物學(
Nat. Cell Biol.)》, 2015,
17: 351-359)。HCMV-2.7早期基因轉錄物為長的非編碼(lnc) RNA，其直接與粒線體中之呼吸鏈之複合物I相互作用，藉由抑制Fas-配位體相互作用及藉由與凋亡蛋白酶8結合抑制顆粒酶B、改善感染細胞中之氧化能力及維持能量產生來防止粒線體誘導之細胞死亡(Reeves等人, 《科學》, 2007,
316: 1345-1348)。
HCMV亦產生了若干方式操控先天性及適應性免疫反應，以減少對其免疫監視且提高其在其免疫活性宿主中之存活率，此可能很好地解釋了HCMV感染癌細胞中之重要的免疫逃避機制。HCMV編碼調節感染細胞之NK細胞識別的多種蛋白質(Fielding等人, 《PLoS病原體》, 2014,
10: e1004058)，且增加CD8
+T細胞對病毒蛋白之耐受性。HCMV編碼之蛋白質可刺激DC之不成熟表型之發展，此減少CD4
+T細胞反應之活化(Wagner等人, 《白細胞生物學雜誌(
J. Leukoc Biol.)》, 2008,
83: 56-63)，且另外減少CD8
+細胞毒性T細胞對感染細胞之消除。
HCMV治療目標：
當前，針對HCMV可用之唯一抗病毒療法依賴於核苷類似物，諸如更昔洛韋(ganciclovir，GCV)及纈更昔洛韋(valganciclovir，VAL-GCV)(Rawlinson等人, 《柳葉刀感染病學(
Lancet Infect Dis)》, 2017,
17(6): e177-e188; James及Kimberlin, 《兒科新觀點(
Curr Opin Pediatr)》, 2016,
28(1): 81-85)，該等核苷類似物具有若干缺點，諸如較差生物可用性、毒副作用及產生抗藥性之風險。當前結果指示，DNA聚合酶(UL54)及病毒磷酸轉移酶(UL97)此兩種高度多態HCMV基因在針對GCV之抗藥性中發揮重要作用(Komatsu等人, 《抗病毒研究(
Antiviral Res)》, 2014,
101: 12-25)。
另外，重要地，現有抗病毒劑僅可用於治療裂解HCMV感染，但不可清除潛伏病毒。根除或減少潛伏池(latent reservoir)將有利於減少若干患者群組中HCMV相關疾病之負擔。
先前研發之抗HCMV藥，諸如更昔洛韋(GCV)、膦甲酸(foscarnet，FOS)及西多福韋(cidofovir，CDV)，均靶向UL54病毒DNA聚合酶。然而，在移植環境中，抗病毒毒性及HCMV抗病毒抗藥性構成越來越大的治療挑戰，且因此急需具有新穎病毒目標之新型抗HCMV藥(Burrel等人, 2014, 「人類巨細胞病毒(HCMV)對當前抗病毒藥敏感，缺乏對HCMV編碼之US28趨化介素受體多態性的影響(
Lack of influence of human cytomegalovirus(HCMV)susceptibility to current antiviral drugs on HCMV-encoded US28 chemokine receptor polymorphism)」, 巴塞隆納ECCMID 2014之海報展示)。
Burrel等人, 2014(同上)教示，由於HCMV編碼之US28在病毒散播及持久性以及在平滑肌細胞遷移及腫瘤形成方面之潛在作用，該蛋白質構成新穎抗病毒療法之潛在目標。
HCMV US28為一種七次跨膜蛋白，屬於G蛋白偶合受體(GCPR)一類。GCPR構成由經批准藥物靶向之蛋白質的最大家族(Sriram及Insel, 《分子藥理學(
Mol Pharmacol)》, 2018.
93(4): 251-258)，且共有共同架構，各自由以下組成：具有胞外N端、胞內C端及由三個胞外環連接(ECL1-3)之七個疏水性跨膜域(TM1-TM7)的單一多肽(Alexander等人, 《英國藥理學雜誌(
Br J Pharmacol)》, 2019,
176 期增刊 1: S21-S141)。
如由HCMV病毒株DB (寄存編號KT959235)編碼之US28之全序列在本申請案中提供為SEQ ID NO: 5，其中：
-N端胞外域(在本文中亦稱為ECD1，因其為第一胞外域)在本文中提供為SEQ ID NO: 1且對應於SEQ ID NO: 5之位置1-37，
-第一胞外環(ECL1；儘管在本文中亦稱為ECD2，因其為第二胞外域)在本文中提供為SEQ ID NO: 2且對應於SEQ ID NO: 5之位置91-101，
-第二胞外環(ECL2；儘管在本文中亦稱為ECD3，因其為第三胞外域)在本文中提供為SEQ ID NO: 3且對應於SEQ ID NO: 5之位置167-183；及
-第三胞外環(ECL3；儘管在本文中亦稱為ECD4，因其為第四胞外域)在本文中提供為SEQ ID NO: 4且對應於SEQ ID NO: 5之位置250-273。
Burrel等人(同上)評定US28蛋白在HCMV臨床病毒株當中的多態性程度，且得出結論，US28在臨床病毒株當中的多態性程度高於先前報導的其他HCMV編碼之蛋白質(諸如UL97磷酸轉移酶及UL44持續合成因子(processivity factor))之多態性程度，儘管此多態性並不根據HCMV易感性或對當前審批通過之抗病毒藥(亦即，GCV、FOS及CDV)的抗性而顯著變化，因此支持以下觀點：HCMV編碼之US28趨化介素受體可構成用於抗HCMV藥的有前景的病毒目標，尤其在HCMV抗性的情況下。
WO 2019/151865作者採取US28聚焦方法，如亦在等效期刊文章De Groof等人, 2019, 《分子藥物學(
Mol. Pharmaceutics)》,
16: 3145-3156中報導。該等作者報導其已生成單一重鏈可變域抗體(VHH)，由特定VHH示例，稱為VUN100 (本申請案之SEQ ID NO: 60)，據稱該抗體特異性偵測神經膠母細胞瘤(GBM)組織中之US28且抑制配位體依賴性及組成性US28活性，且該等作者報導該抗體因而在原位異種移植模型中活體外及活體內削弱US28依賴性GBM生長。
VUN100展示與不連續抗原決定基之結合，該抗原決定基包含US28之N端胞外區(完整N端胞外區，在本文中亦稱為ECD1，對應於位置1-37)內的多個結合位置，且進一步受US28之第三胞外環(ECL3，位置250-273，在本文中亦稱為ECD4)的存在之影響，如WO 2019/151865之實例3中(第36頁,第11-32列)及De Groof等人, 2019(同上)之圖2圖例中所論述。De Groof等人(2019, 同上)確定，N端胺基酸位置1-22之移除不引起結合，且進一步確定，VUN100不結合胺基酸位置11-15，但需要胺基酸位置16。此外，WO 2019/151865之圖8D中與VUN100及不同HCMV病毒株之結合相關的結果展示HCMV之VHL/E、Merlin及TB40/E病毒株之間之結合差異，其中在病毒株TB40/E (B1型)中之結合尤其減少了，僅約針對Merlin病毒株所觀測到之結合程度的一半。由TB40/E病毒株編碼之US28與由Merlin及VHL/E病毒株兩者編碼之US28的不同之處在於N端內之位置8、18及19 (參見本申請案之表3)，此表明此等位置中之一或多個(及1-10區及16-22區中之可能其他胺基酸)亦形成VUN100結合之抗原決定基的一部分。因此，VUN100最可能在N端之胺基酸位置1-10及16-22之間結合。此外，ECD4區替換成CCR5之相應區可防止VUN100結合，此意謂VUN100之結合需要介於N端之位置1-22 (包括至少16，及8、18及/或19中之一或多個)與ECD4內之胺基酸之間的不連續抗原決定基。
如上文所指出，臨床病毒株當中US28之多態性程度高於先前報導的其他HCMV編碼之蛋白質之多態性程度(Burrel等人, 同上)，且已報導US28之大量N端多態性(Goffard等人, 2006, 同上；Arav-Boger等人, 2002, 同上)。如申請人確定且本申請案之表3中所示，由VUN100結合之US28之N端區對病毒株間的多態性尤其敏感。
因此，本發明人考慮了以下可能性：在如由VUN100結合之US28之N端區及第三胞外環(「ECD4」)的特定部分中存在的高程度多態性可能使得VUN100 VHH分子不能與不同HCMV病毒株編碼之US28形式一致地維持針對US28之結合特徵。當在該情形下考慮時，如上所指出，VUN100與不同HCMV病毒株(WO 2019/151865之圖8D)之結合展示HCMV之VHL/E、Merlin及TB40/E病毒株之間之結合差異，其中在病毒株TB40/E (B1型)中之結合尤其減少了，僅約針對Merlin病毒株所觀測到之結合程度的一半。此外，在可在線獲得之De Groof等人, 2020 (doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.071860)的預印文章中報導了VUN100之進一步表徵，其中補充資料之圖2提供由VUN100結合之CD14+單核球之細胞核中誘導之IE表現%之結果。測試之所有細胞均來自HCMV血清反應呈陽性的個體，且確認為潛伏感染HCMV，但感染各供體之HCMV病毒株待定。由與此等來自四名不同患者中之每一者之HCMV陽性CD14+細胞結合之VUN100誘導的IE表現量實質上不同，其中對於供體1-4報導之數字分別為57%、33%、22%及4% (差值範圍大於14倍)。VUN100與所確認之HCMV陽性細胞結合後的此高程度反應變化似乎最可能歸因於不同HCMV病毒株感染供體中之每一者，且因此有力指示VUN100之結合能力在不同HCMV病毒株之間將顯著變化。同一圖式亦展示在二價形式之VUN100 (De Groof等人, 2020 (同上)稱為VUN100b，由本申請案之SEQ ID NO: 63表示)與相同組之來自供體1-4的HCMV陽性細胞結合之後的高程度反應變化(差值程度超過7倍)，再次提供指示病毒株特異性結合敏感性之結果。De Groof等人, 2021, 《藥理學評論(
Pharmacol Rev)》
73:828-846亦描述HCMV之連續繼代如何引起具有在胞外環3中具有過早終止密碼子之截短US28的抗性突變體的發展，從而引起US28之表面表現減少。此類抗性對VUN100可能具有不良影響，VUN100依賴於第三胞外環中之部分抗原決定基。
此外，應注意關於比較VUN100 Ab與表現US28之HEK293T膜相比於與經模擬轉染之HEK293T膜之結合的分析展示，20%經模擬轉染之細胞由VUN100結合，且表現US28之HEK293T膜僅達成4之相對特異性分數(De Groof等人, 2019(同上)，在其支持資訊、其圖S1.A及本申請案之表2中)。區分表現US28之細胞與US28陰性細胞之明顯能力(特異性分數僅約4，尤其結合與模擬細胞之此高脫靶結合)可能為次佳的，且引發關於VUN100向HCMV感染細胞提供特異性靶向作用同時避免健康細胞中不可接受程度之脫靶副作用之能力的擔憂。其亦引起關於VUN100在分析(包括診斷分析，諸如供免疫組織化學(IHC)之用)中可靠地鑑別表現US28之細胞(特定言之，HCMV感染細胞)之情形下適用的能力的擔憂。此外，在另一公開案中，已確認，US28靶向奈米抗體之效能需要在病毒及潛在活體內環境中驗證(De Groof等人, 2021, 同上)中證實。
特別需要提供在活體內及/或在分析(包括IHC)中使用時特異性結合至表現US28之細胞(特定言之，HCMV感染細胞)及/或使與不表現US28之細胞(特定言之，未感染HCMV之細胞)的脫靶結合降至最低的能力實質上大於VUN100的結合分子。
為了利用US28作為治療目標，重要的是解決上述一或多個最重要的問題，包括已報導的針對本領域已知之VUN100分子的相對較高程度之非特異性結合活性，相對較高之針對VUN100所觀測到之脫靶結合活性，及/或提供解決病毒株多樣性、病毒突變、突變漂移及病毒在病毒潛伏期間躲避免疫系統之能力的問題的US28結合分子。
因此，本發明之目標為提供可與表現US28及/或對於HCMV感染呈陽性之生物材料高度特異性地結合(相較於應低得多之健康人類細胞)及/或使與健康人類細胞之脫靶結合的絕對程度降至最低的結合分子。舉例而言，提供結合分子對抗HCMV感染及與其相關之病況受到廣泛關注，該等結合分子向結合分子所結合之細胞提供或導引細胞毒性作用，且本發明之一目標為提供可以最小化或避免健康人類細胞中脫靶細胞毒性作用之不可接受(例如治療不可接受)程度的方式靶向此等作用之結合分子。特定言之，本發明的目標之一為提供在針對與表現US28及/或對於HCMV感染呈陽性之生物材料(例如，細胞)相比於不表現US28且對於HCMV感染不呈陽性之生物材料(例如等效細胞)結合之特異性評估時，針對US28及/或HCMV感染細胞具有比WO 2019/151865及De Groof等人, 2019(同上)之VUN100 Ab及/或比De Groof等人, 2020(同上)之VUN100b二價分子高的特異性程度的結合分子。
本發明之另一目標為提供針對US28之結合分子，其對表現US28及/或對於經HCMV感染之表現US28之細胞呈陽性的生物材料相比於不表現US28之對應生物材料(諸如健康人類細胞)之結合具有特異性，及/或其顯示比如上所述之VUN100 Ab分子明顯低的與健康人類細胞之脫靶結合之絕對程度。
本發明之另一目標為提供病毒株未定性(strain-agnostic)且因此理想情況下能夠靶向所有或實質上所有HCMV感染(無論存在HCMV之病毒株或病毒株之組合)及/或能夠在HCMV感染之治療過程期間提供持續的作用之結合分子，而不管在所治療之個體內感染病毒株增加一或多個HCMV突變之可能性。特定言之，與VUN100 Ab相比，具有展示出較大程度之病毒株未定性結合性的結合特徵之針對US28之結合分子備受關注。
本發明提供具有以下中之一或多者(較佳全部)的結合分子：與人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白的高度特異性結合、與健康(未感染)細胞的極低程度之非特異性結合及/或病毒株未定性結合能力；以及編碼該等結合分子之核酸分子。
本發明之結合分子經設計以結合人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之N端(本文中亦稱為胞外域1 (ECD1))內由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基且展示對該抗原決定基具有特異性之結合。本申請人已意外地鑑別出，不同於HCMV之US28蛋白之N端區(ECD1)的許多區域，TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列在所有已知之HCMV病毒株之間高度保守，且此外適合為免疫原性的且適用作用於生成具有以下中之一或多者(諸如全部)的抗US28抗體的抗原：例如與如上論述之先前技術之單價及二價VUN100抗體相比，改善的病毒株未定性結合特性、改善的(亦即相對較高)結合特異性及/或改善的(亦即相對較低)脫靶結合活性。
本申請人亦已意外地鑑別出，HCMV之US28蛋白的ECD3在所有已知之HCMV病毒株之間高度保守(僅具有單一位置多態性，如下所論述)，且此外適合為免疫原性的且適用作用於生成具有以下中之一或多者(諸如全部)的抗US28抗體的抗原：例如與如上論述之先前技術之單價及二價VUN100抗體相比，改善的病毒株未定性結合特性、改善的(亦即相對較高)結合特異性及/或改善的(亦即相對較低)脫靶結合活性。因此，視情況，本發明之結合分子亦經設計以結合HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的第二抗原決定基且展示對該抗原決定基具有特異性之結合。對第一及第二抗原決定基具有結合特異性之該結合分子可呈多特異性型式。
在另一選項中，對HCMV之US28蛋白之ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的本發明之結合分子為與對HCMV之US28蛋白之ECD3內的第二抗原決定基具有結合特異性的第二結合分子一起調配的第一結合分子，其中該第二抗原決定基較佳地如本文中進一步描述。
已證實本發明之結合分子具有極佳結合特性，包括上文所描述且如本文進一步描述之彼等結合特性。舉例而言，出人意料地，亦已證實本發明之結合分子提供針對侵襲性及/或轉移性HCMV感染癌症(包括乳癌)尤其有利的結合特異性。
在某些較佳實施例中，結合分子係選自抗體(包括例如BiTE抗體)及嵌合抗原受體(CAR)或其功能變體、片段、融合蛋白及/或結合物，以及編碼其之核酸分子。該結合分子可例如包括或結合至細胞毒性組分或其他效應組分，能夠對結合分子所結合之任何細胞施加影響(諸如抑制或殺死)。該結合分子可例如包括或結合至可募集其他藥劑(例如其他蛋白質、藥物、細胞或任何其他所選物質)之組分，以此方式使得所募集之藥劑具有特異性靶向之能力以對結合分子所結合之細胞施加影響(諸如抑制或殺死)；因此，非限制性實例為BiTE分子，其具有募集T細胞以作用於該BiTE所結合之細胞上的能力。亦提供表現該等結合分子之細胞，包括其中結合分子為CAR之實例，且該等細胞可為表現CAR之細胞，包括CAR-T細胞、CAR-NK細胞及CAR-M細胞。
本發明之此等及其他揭示內容藉由以下描述及隨附申請專利範圍及圖式更詳細地描述。
因此，本發明之第一態樣提供包含一或多條多肽鏈之結合分子，該結合分子對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的至少第一抗原決定基具有結合特異性。
視情況，本發明之第一態樣之結合分子亦對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的第二抗原決定基具有結合特異性(及/或其中該結合分子為與對HCMV之US28蛋白之ECD3內的第二抗原決定基具有結合特異性的第二結合分子一起調配的第一結合分子。舉例而言，本發明之第一態樣之結合分子可為一種多特異性(例如，雙特異性或三特異性)結合分子，其分別包含對由HCMV編碼之US28蛋白之ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一或多個區域且進一步包含對由HCMV編碼之US28蛋白之ECD3內的第二抗原決定基具有結合特異性的一或多個區域。
根據本發明，US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3各自包含存在於由HCMV病毒株編碼之US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)之DB病毒株編碼之US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。
例如(但不限於)，本發明之第一態樣之結合分子可選自抗體或嵌合抗原受體(CAR)。
本發明之第一態樣之結合分子可例如對完全存在於SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的第一抗原決定基具有結合特異性，及/或視情況第二抗原決定基完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD3內。
本發明之第一態樣之結合分子可例如對SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內之第一線性抗原決定基，及/或視情況對US28蛋白之ECD3內之第二線性抗原決定基具有結合特異性。
本發明之第一態樣之結合分子可例如對HCMV之US28蛋白之ECD1中SEQ ID NO: 177之胺基酸序列及/或ECD3內的抗原決定基具有病毒株未定性結合特異性。舉例而言，結合分子可：
- 對HCMV之US28蛋白之ECD1的SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的第一抗原決定基具有結合特異性，其中該結合特異性對兩種或更多種(諸如全部) HCMV病毒株係未定性，例如對在N端內具有不同序列之兩種或更多種變異株，諸如展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)的多種HCMV病毒株係未定性，例如其中該多種病毒株為兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種選自由DB、Toledo、Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、AD169、VHL/E、Davis及BL組成之群組之不同病毒株；及/或
- 該結合分子可對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，其中該結合特異性對兩種或更多種(諸如全部) HCMV病毒株係未定性，例如對以下病毒株係未定性：4D變異株及4N變異株(各自如本文中進一步描述)；及
- 在任一情況下，視情況兩種或更多種(諸如全部)選自由DB、Towne、AF1、VHL/E、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR及VR1814 (FIX)組成之群組之HCMV病毒株。
因此，本發明之第一態樣之結合分子可例如對HCMV之US28蛋白之ECD1的SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的第一抗原決定基具有結合特異性，無論US28蛋白之ECD1是否包含已知變體之突變，其限制條件為該第一抗原決定基包含如在由以下HCMV病毒株編碼之US28之ECD1中發現的序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)：DB、Towne、AF1、VHL/E、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR及VR1814 (FIX)。序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)在所有列出之臨床病毒株當中完全保守且據本申請人所知，在所有已知之HCMV病毒株中保守。
視情況，本發明之第一態樣之結合分子可例如對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，無論US28蛋白之ECD3是否包含4D變體或4N變體之序列：
- 其中該4D變體包含如在由諸如以下之第一組HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的序列TKK
DNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)：Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、JP、Ad169、AF1、VHL/E、BL及DAVIS；且
- 其中該4N變體包含如在由諸如以下之第二組HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的序列TKK
NNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)：Toledo、TR及DB病毒株。
藉由利用本文所描述之方案，本申請人一致地且反覆地生成具有上述一或多種有益結合特性的對HCMV之US28蛋白之ECD1的SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的第一抗原決定基具有結合特異性的大量抗體和對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的大量抗體，包括在本文中藉由以下名稱所提及之抗體(其序列亦提供於下文)：
針對 SEQ ID NO: 177 之示例性抗體：US28-4-4H3C3、US28-4-7B1F3、US28-4-2F5B11、US28-4-4A11A11、US28-4-2G2B3、US28-4-5D6H11、US28-4-9G3B9、US28-4-5E8F7、US28-4-6G3D6及US28-4-5E1E4；及
針對 ECD3 之示例性抗體：US28-13-5G6-1D3、US28-13-1C10-1C10、US28-13-1H3-1A10、US28-14-2C2-1G4、US28-13-1C10-1G9及US28-14-4E4-1E8。
在一個實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義之抗體US28-4-4H3C3 (本文中通常縮寫為「4H3C3」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體4H3C3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
視情況，根據此實施例之結合分子可包含：
(a)分別如由SEQ ID NO: 196、197及198所定義之抗體4H3C3的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(b)分別如由SEQ ID NO: 199、200及201所定義之抗體4H3C3的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之結合分子可包含：
(a)對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其中該V
H多肽包含分別具有SEQ ID No: 196、197及198之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(b)對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其中該V
L多肽包含分別具有SEQ ID NO: 199、200及201之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的4H3C3抗體之以下序列：
| 4H3C3 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 178 | SEQ ID NO: 180 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 179 | SEQ ID NO: 181 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 182 | SEQ ID NO: 186 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 183 | SEQ ID NO: 187 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 184 | SEQ ID NO: 188 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 185 | SEQ ID NO: 189 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 190 | SEQ ID NO: 196 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 191 | SEQ ID NO: 197 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 192 | SEQ ID NO: 198 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 193 | SEQ ID NO: 199 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 194 | SEQ ID NO: 200 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 195 | SEQ ID NO: 201 |
在一些實施例中，4H3C3結合分子經人類化(本文中稱為「4H3C3人類化變體」)，且視情況結合分子可包含：
(a)如藉由SEQ ID NO: 196所描述之V
H-CDR1；
(b)如藉由SEQ ID NO: 197、293及294中之任一者所描述之V
H-CDR2；
(c)如藉由SEQ ID NO: 198所描述之V
H-CDR3；
(d)如藉由SEQ ID NO: 199或295所描述之V
L-CDR1；
(e)如藉由SEQ ID NO: 200或222所描述之V
L-CDR2；及/或
(f)如藉由SEQ ID NO: 201所描述之V
L-CDR3。
在一些實施例中，4H3C3結合分子經人類化且視情況包含：
(a)選自由SEQ ID NO: 256-259組成之群組之可變重鏈；及/或
(b)選自由SEQ ID NO: 260-263組成之群組之可變輕鏈。
在另一實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於分別如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義之抗體US28-4-7B1F3 (本文中通常縮寫為「7B1F3」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體7B1F3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
視情況，根據此實施例之結合分子可包含：
(a)分別如由SEQ ID NO: 219、220及221所定義之抗體7B1F3之V
H之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(b)分別如由SEQ ID NO: 199、222及223所定義之抗體7B1F3之V
L之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之結合分子可包含：
(a)對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的至少一個V
H多肽，其中該V
H多肽包含分別具有SEQ ID NO: 219、220及221之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個V
H多肽包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(b)對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的至少一個V
L多肽，其中該V
L多肽包含分別具有SEQ ID NO: 199、222及223之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中V
L多肽包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的7B1F3抗體之以下序列：
| 7B1F3 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 202 | SEQ ID NO: 204 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 203 | SEQ ID NO: 205 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 206 | SEQ ID NO: 210 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 207 | SEQ ID NO: 211 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 208 | SEQ ID NO: 212 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 209 | SEQ ID NO: 213 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 214 | SEQ ID NO: 219 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 215 | SEQ ID NO: 220 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 216 | SEQ ID NO: 221 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 251 | SEQ ID NO: 199 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 217 | SEQ ID NO: 222 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 218 | SEQ ID NO: 223 |
在一些實施例中，7B1F3結合分子經人類化(本文中稱為「7B1F3人類化變體」)，且視情況結合分子可包含：
(a)如藉由SEQ ID NO: 219所描述之V
H-CDR1；
(b)如藉由SEQ ID NO: 220、296及297中之任一者所描述之V
H-CDR2；
(c)如藉由SEQ ID NO: 221或298所描述之V
H-CDR3；
(d)如藉由SEQ ID NO: 199或295所描述之V
L-CDR1；
(e)如藉由SEQ ID NO: 222所描述之V
L-CDR2；及/或
(f)如藉由SEQ ID NO: 223所描述之V
L-CDR3。
在一些實施例中，7B1F3結合分子經人類化且視情況包含：
(a)選自由SEQ ID NO: 264-267、270或271組成之群組之可變重鏈；及/或
(b)選自由SEQ ID NO: 268、261、269及263組成之群組之可變輕鏈。
在一些較佳實施例中，7B1F3結合分子之可變重鏈已發生突變以移除V
H-CDR3域中之糖基化位點。較佳地，V
H-CDR3係選自SEQ ID NO: 270或271。
在另一實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於分別如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義之抗體US28-4-2F5B11 (本文中通常縮寫為「2F5B11」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
視情況，根據此實施例之結合分子可包含：
(a)分別如由SEQ ID NO: 242、243及244所定義之抗體2F5B11之V
H之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(b)分別如由SEQ ID NO: 199、245及246所定義之抗體2F5B11之V
L之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之結合分子可包含：
(a)對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的至少一個V
H多肽，其中該V
H多肽包含分別具有SEQ ID NO: 242、243及244之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個V
H多肽包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(b)對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的至少一個V
L多肽，其中該V
L多肽包含分別具有SEQ ID NO: 199、245及246之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中V
L多肽包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的2F5B11抗體之以下序列：
| 2F5B11 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 224 | SEQ ID NO: 226 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 225 | SEQ ID NO: 227 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 228 | SEQ ID NO: 232 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 229 | SEQ ID NO: 233 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 230 | SEQ ID NO: 234 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 231 | SEQ ID NO: 235 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 236 | SEQ ID NO: 242 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 237 | SEQ ID NO: 243 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 238 | SEQ ID NO: 244 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 239 | SEQ ID NO: 199 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 240 | SEQ ID NO: 245 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 241 | SEQ ID NO: 246 |
在另一實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於以下共同CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者(其中特定位置之置換胺基酸在括弧中指示，且*指示該位置處不存在胺基酸)：
(a) V
H-CDR1對應於(S/N)YW(M/I)H (SEQ ID NO: 247)；
(b) V
H-CDR2對應於Y(I/V)NP(S/R/N)T(G/A)Y(A/T)E(Y/F)NQKF(K/M)D (SEQ ID NO: 248)或Y(I/V)NP(S/R/N)T(G/A)Y(A/T)E(Y/F)NQ(K/Q)(F/L)(K/M/Q)(D/G) (SEQ ID NO: 299)；
(c) V
H-CDR3對應於(L/I)(R/L)(F/N/S)(G/D)(S/*/R)(S/T)GFAY (SEQ ID NO: 249)或(L/I)(R/L)(F/N/S/Q)(G/D)(S/*/R)(S/T)GFAY (SEQ ID NO: 300)；
(d) V
L-CDR1對應於KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 199)或(K/R)SSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 301)；
(e) V
L-CDR2對應於WAST(W/R)E(S/Y) (SEQ ID NO: 250)；及/或
(f) V
L-CDR3對應於QQYYSFPLT (SEQ ID NO: 201)。
如上文針對抗體4H3C3、7B1F3、及/或2F5B11中之任一者所定義的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的V
H-CDR1、V
H-CDR2、V
H-CDR3、V
L-CDR1、V
L-CDR2及/或V
L-CDR3序列中之任一者或多者的功能變體可視情況包含具有如上文針對V
H-CDR1、V
H-CDR2、V
H-CDR3、V
L-CDR1、V
L-CDR2及/或V
L-CDR3序列分別藉由SEQ ID NO: 247、248或299、249或300、199或301、250及201所闡述之對應共同序列的序列。
視情況，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義之抗體13-5G6-1D3 (本文中通常縮寫為「1D3」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1D3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
舉例而言，根據本發明之第一態樣之此選項的結合分子可進一步包含(a)分別如由SEQ ID NO: 8、9及10所定義之抗體1D3之可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或(b)分別如由SEQ ID NO: 14、15及16所定義之抗體1D3之可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在此選項中，結合分子可進一步包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID No: 8、9及10之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 12之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO:18之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的US28-13-5G6-1D3抗體之以下序列：
| 1D3 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 34 | SEQ ID NO: 20 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 35 | SEQ ID NO: 21 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 25 | SEQ ID NO: 11 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 26 | SEQ ID NO: 12 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 31 | SEQ ID NO:17 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 32 | SEQ ID NO: 18 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 22 | SEQ ID NO: 8 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 23 | SEQ ID NO: 9 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 24 | SEQ ID NO: 10 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 28 | SEQ ID NO: 14 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 29 | SEQ ID NO: 15 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 30 | SEQ ID NO: 16 |
在另一選項中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體13-1C10-1C10 (本文中通常縮寫為「1C10」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1C10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
舉例而言，根據本發明之第一態樣之此選項的結合分子可進一步包含(a)分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義之抗體13-1C10-1C10之V
H之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或(b)分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義之抗體13-1C10-1C10之V
L之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在此選項中，根據此實施例之結合分子可進一步包含：(a)至少一個V
H多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 112、113及114之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個V
H多肽包含SEQ ID NO: 104之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個V
L多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 117、83及118之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中V
L多肽包含SEQ ID NO: 108之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的US28-13-1C10-1C10抗體之以下序列：
| 1C10 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 155 | SEQ ID NO: 157 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 156 | SEQ ID NO: 158 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 101 | SEQ ID NO: 103 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 102 | SEQ ID NO: 104 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 105 | SEQ ID NO: 107 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 106 | SEQ ID NO: 108 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 109 | SEQ ID NO: 112 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 110 | SEQ ID NO: 113 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 111 | SEQ ID NO: 114 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 115 | SEQ ID NO: 117 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 80 | SEQ ID NO: 83 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 116 | SEQ ID NO: 118 |
在另一選項中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體13-1H3-1A10 (本文中通常縮寫為「1A10」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1A10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
舉例而言，根據本發明之第一態樣之此選項的結合分子可進一步包含(a)分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義之抗體13-1H3-1A10之V
H之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或(b)分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義之抗體13-1H3-1A10之V
L之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在此選項中，根據此實施例之結合分子可進一步包含：(a)至少一個V
H多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 112、113及114之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個V
H多肽包含SEQ ID NO: 122之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個V
L多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 117、83及118之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中V
L多肽包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的US28-13-1H3-1A10抗體之以下序列：
| 1A10 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 159 | SEQ ID NO: 161 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 160 | SEQ ID NO: 162 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 119 | SEQ ID NO: 121 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 120 | SEQ ID NO: 122 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 123 | SEQ ID NO: 125 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 124 | SEQ ID NO: 126 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 109 | SEQ ID NO: 112 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 110 | SEQ ID NO: 113 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 111 | SEQ ID NO: 114 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 115 | SEQ ID NO: 117 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 80 | SEQ ID NO: 83 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 116 | SEQ ID NO: 118 |
在另一選項中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於分別如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義之抗體13-1C10-1G9 (本文中通常縮寫為「1G9」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1G9之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
舉例而言，根據本發明之第一態樣之此選項的結合分子可進一步包含(a)分別如由SEQ ID NO: 76、77及78所定義之抗體13-1C10-1G9之V
H之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或(b)分別如由SEQ ID NO: 82、83及84所定義之抗體13-1C10-1G9之V
L之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在此選項中，根據此實施例之結合分子可進一步包含：(a)至少一個V
H多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 76、77及78之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個V
H多肽包含SEQ ID NO: 68之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個V
L多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 82、83及84之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中V
L多肽包含SEQ ID NO: 72之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的US28-13-1C10-1G9抗體之以下序列：
| 1G9 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 147 | SEQ ID NO: 149 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 148 | SEQ ID NO: 150 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 65 | SEQ ID NO: 67 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 66 | SEQ ID NO: 68 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 69 | SEQ ID NO: 71 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 70 | SEQ ID NO: 72 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 73 | SEQ ID NO: 76 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 74 | SEQ ID NO: 77 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 75 | SEQ ID NO: 78 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 79 | SEQ ID NO: 82 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 80 | SEQ ID NO: 83 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 81 | SEQ ID NO: 84 |
在另一選項中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於分別如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義之抗體14-4E4-1E8 (本文中通常縮寫為「1E8」)之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1E8之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
舉例而言，根據本發明之第一態樣之此選項的結合分子可進一步包含(a)分別如由SEQ ID NO: 76、95及96所定義之抗體14-4E4-1E8之V
H之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或(b)分別如由SEQ ID NO: 82、99及100所定義之抗體14-4E4-1E8之V
L之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者。
另外或替代地，在此選項中，根據此實施例之結合分子可進一步包含：(a)至少一個V
H多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 76、95及96之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個V
H多肽包含SEQ ID NO: 88之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個V
L多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 82、99及100之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中V
L多肽包含SEQ ID NO: 92之序列、基本上由其組成或由其組成。
參考下文所描述之序列鑑別編號(SEQ ID NO)，鑑別本文中的US28-14-4E4-1E8抗體之以下序列：
| 1E8 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 151 | SEQ ID NO: 153 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 152 | SEQ ID NO: 154 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 85 | SEQ ID NO: 87 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 86 | SEQ ID NO: 88 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 89 | SEQ ID NO: 91 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 90 | SEQ ID NO: 92 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 73 | SEQ ID NO: 76 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 93 | SEQ ID NO: 95 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 94 | SEQ ID NO: 96 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 79 | SEQ ID NO: 82 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 97 | SEQ ID NO: 99 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 98 | SEQ ID NO: 100 |
在另一選項中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於以下共同CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者(其中特定位置之置換胺基酸在括弧中指示，且*指示該位置處不存在胺基酸)：
(a) V
H-CDR1對應於S(Y/H)A(M/L)S (SEQ ID NO: 167)；
(b) V
H-CDR2對應於SISS(G/R)G(S/R)TYYPDSVKG (SEQ ID NO: 168)；
(c) V
H-CDR3對應於GG(S/T)(T/R/H)(M/H/Y)(I/S)(T/Y) (T/G)(G/N)(L/*)GF(A/D)(Y/F) (SEQ ID NO: 169)；
(d) V
L-CDR1對應於S(A/V)SSSVSYMH (SEQ ID NO: 170)；
(e) V
L-CDR2對應於D(T/S)SKLAS (SEQ ID NO: 171)；及/或
(f) V
L-CDR3對應於QQW(S/T/*)SN(*/N)PP(I/L)T (SEQ ID NO: 172)。
在另一選項中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，對應於以下共同CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者(其中特定位置之置換胺基酸在括弧中指示，且*指示該位置處不存在胺基酸)：
(a) V
H-CDR1對應於S(Y/H)A(M/L)S (SEQ ID NO: 167)；
(b) V
H-CDR2對應於SISS(G/R)GRTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 174)；
(c) V
H-CDR3對應於GG(S/T)(T/R/H)(M/H/Y)(I/S)(T/Y) (T/G)(G/N)GF(A/D)(Y/F) (SEQ ID NO: 175)；
(d) V
L-CDR1對應於S(A/V)SSSVSYMH (SEQ ID NO: 170)；
(e) V
L-CDR2對應於D(T/S)SKLAS (SEQ ID NO: 171)；及/或
(f) V
L-CDR3對應於QQW(T/*)SN(*/N)PPIT (SEQ ID NO: 176)。
如上文針對抗體US28-13-5G6-1D3、13-1C10-1C10、13-1H3-1A10、13-1C10-1G9、14-4E4-1E8中之任一者所定義的對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的V
H-CDR1、V
H-CDR2、V
H-CDR3、V
L-CDR1、V
L-CDR2及/或V
L-CDR3序列中之任一者或多者的功能變體可視情況包含具有如上文分別在前兩段中之任一者中針對V
H-CDR1、V
H-CDR2、V
H-CDR3、V
L-CDR1、V
L-CDR2 及/或V
L-CDR3序列所闡述之對應共同序列的序列。
對應於上述SEQ ID NO之序列在本申請案之名為「序列」之部分中給出，該部分在本申請案中之實例之後。
在某些實施例中，根據本發明之第一態樣之結合分子可選自由以下組成之群組：
(a) 二價抗體，諸如IgG-scFv抗體(例如，其中第一結合域係完整IgG，且第二結合域係scFv，該scFv在IgG之輕鏈之N端及/或在輕鏈之C端及/或在重鏈之N端及/或在重鏈之C端處附接至該第一結合域，或反之亦然)，包括但不限於對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內之第一抗原決定基具有結合特異性且對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內之第二抗原決定基具有結合特異性的二價抗體，例如其中第一及/或第二抗原決定基如本申請案進一步所定義；
(b) 單價抗體，諸如
DuoBody
® 或『臼包杵(knob-in-hole)』雙特異性抗體(例如scFv-KIH、scFv-KIH
r、BiTE-KIH或BiTE-KIH
r)；
(c) scFv
2-Fc抗體；
(d) 雙特異性抗體，諸如雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體；
(e) 雙重可變域(DVD)-Ig抗體；
(f) 基於雙親和力再靶向(DART)之抗體(例如，DART
2-Fc或DART)；
(g) 三特異性抗體，諸如DNL-Fab
3抗體或對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內之第一抗原決定基具有結合特異性且對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內之第二抗原決定基具有結合特異性且對第三抗原決定基、諸如免疫細胞呈現之抗原決定基具有結合特異性的三特異性抗體，例如其中第一及/或第二抗原決定基如本申請案所定義，視情況其中三特異性抗體為三特異性免疫細胞接合子抗體，例如三特異性T細胞接合子(TiTE)，且視情況其中TiTE抗體包含CD3結合域；
(h) scFv-HSA-scFv抗體；
(i) 單域抗體；
(j) 僅重鏈IgG (hcIgG)，諸如駱駝IgG (例如VHH抗體)及鯊魚免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)，及其單鏈抗體；及
(k) 嵌合抗原受體(CAR)，其包含構成根據本發明之第一態樣之結合分子、基本上由其組成或由其組成的胞外域，例如包含此清單之選項(a)至(h)中之任一者或其組合的胞外域。
另外或替代地，根據本發明之第一態樣之結合分子可選自由以下組成之群組：
(i) 雙特異性免疫細胞接合子抗體，例如雙特異性T細胞接合子(BiTE)，且視情況其中該BiTE抗體包含CD3結合域；或
(ii) 單株抗體，視情況重組單株抗體，例如由CHO細胞重組產生之單株抗體。
本發明之第一態樣亦提供如上文所定義之結合分子之功能片段，其中該功能片段：
(a) 包含如前述技術方案中任一項所定義之結合分子之抗原結合片段或其變體、融合體或衍生物或由其組成，該抗原結合片段或其變體、融合體或衍生物係選自由以下組成之群組：Fv片段(諸如單鏈Fv片段(scFv)或二硫鍵結合Fv片段)、Fab樣片段(諸如Fab片段、Fab'片段或F(ab)
2片段)及單域抗體(dAb，包括單一型式及雙重型式，諸如dAb-連接子-dAb及奈米抗體)；
(b) 提供如本文所定義之本發明之第一態樣之結合分子的結合特徵中之一或多者；
(c) 包含如本文所定義之本發明之第一態樣之結合分子之CDR序列；及/或
(d) 包含如本文所定義之本發明之第一態樣之結合分子的V
H及/或V
L序列。
本發明之第一態樣之結合分子的融合亦提供於本文中。舉例而言，提供如上文所定義之結合分子或如上文所定義之該結合分子之功能片段，其中該結合分子或其功能片段包含融合多肽序列，該融合多肽序列包含融合至第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，其中該第一胺基酸序列包含該結合分子或其功能片段之多肽鏈中的至少一者或由其組成，且該第二胺基酸序列為融合搭配物。
在某些實施例中，本發明之第一態樣之結合分子為嵌合抗原受體(CAR)或包含於該嵌合抗原受體內。因此，本發明之第一態樣亦提供CAR，其包含：
(i) 胞外域，其中該胞外域包含以下或由以下組成：如本文所定義之本發明之第一態樣的結合分子或如本文所定義之該結合分子的功能片段；
(ii) 跨膜域；及
(iii) 胞內域；
其中該CAR之胞外域對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白的ECD1內之由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且視情況亦對ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且
其中US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3各自包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。
視情況，在該CAR中：
(a) 該CAR之胞外域對完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，及/或對完全存在於ECD3內的第二抗原決定基具有結合特異性；
(b) 該CAR之胞外域對US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一線性抗原決定基具有結合特異性，及/或對ECD3內之第二線性抗原決定基具有結合特異性；
(c) 該CAR之胞外域對HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性，例如，對HCMV之US28蛋白之ECD1內的抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性係選自由以下組成之群組的HCMV病毒株中之兩者或更多者(諸如全部)未定性：DB、Towne、AD169、DAVIS、BL、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR、VHL/E及VR1814 (FIX)，及/或對HCMV之US28蛋白之ECD3內的第二抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性，例如對HCMV之US28蛋白之ECD3內的抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性係選自由以下組成之群組的HCMV病毒株中之兩者或更多者(諸如全部)未定性：DB、Towne、AD169、DAVIS、BL、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR、VHL/E及VR1814 (FIX)；
(d) 該CAR之胞外域對多種HCMV病毒株之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有特異性，無論該多種HCMV病毒株是否展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)，例如其中該多種病毒株為兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種選自由DB、Toledo、Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、AD169、VHL/E、Davis及BL組成之群組之不同病毒株；及/或
(e) 該CAR之胞外域對HCMV之US28蛋白之ECD3內的第二抗原決定基具有特異性，無論US28蛋白之ECD3是否包含以下序列：
- 如在由大部分HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)，或
- 如在由少數HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)。
在某些實施例中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義之抗體4H3C3之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體4H3C3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體(諸如4H3C3人類化變體)；
(b) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 196、197及198所定義之抗體4H3C3的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者，或如由其4H3C3人類化變體所定義；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 199、200及201所定義之抗體4H3C3的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者，或如由其4H3C3人類化變體所定義；及/或
(c) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 196、197及198之序列的CDR 1、2及3序列(或其4H3C3人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成(或其4H3C3人類化變體)；及/或
(ii) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 199、200及201之序列的CDR 1、2及3序列(或其4H3C3人類化變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成(或其4H3C3人類化變體)。
在另一實施例中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義之抗體7B1F3之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體7B1F3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體(諸如7B1F3人類化變體)；
(b) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 219、220及221所定義之抗體7B1F3的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者，或如由其7B1F3人類化變體所定義；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 199、222及223所定義之抗體7B1F3的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者，或如由其7B1F3人類化變體所定義；及/或
(c) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 219、220及221之序列的CDR 1、2及3序列(或其7B1F3人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成(或其7B1F3人類化變體)；及/或
(ii) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 199、222及223之序列的CDR 1、2及3序列(或其7B1F3人類化變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成 (或其7B1F3人類化變體).
在另一實施例中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義之抗體2F5B11之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 242、243及244所定義之抗體2F5B11的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 199、245及246所定義之抗體2F5B11的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(c) 該CAR之胞外域對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 242、243及244之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(ii) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 199、245及246之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些選項中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義之抗體1D3之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1D3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 8、9及10所定義之抗體1D3的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 14、15及16所定義之抗體1D3的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(c) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：(i)至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 8、9及10之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 12之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(ii)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 18之序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些其他選項中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體1C10之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1C10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義之抗體1C10的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義之抗體1C10的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(c) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 112、113及114之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 104之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(ii) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 117、83及118之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 108之序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些其他選項中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體1A10之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1A10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義之抗體1A10的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義之抗體1A10的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(c) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 112、113及114之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 122之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(ii) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 117、83及118之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些其他選項中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義之抗體1G9之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1G9之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 76、77及78所定義之抗體1G9的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 82、83及84所定義之抗體1G9的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(c) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 76、77及78之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 68之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(ii) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 82、83及84之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 72之序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些其他選項中，在根據本發明之第一態樣之CAR中：
(a) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義之抗體1E8之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1E8之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 分別如由SEQ ID NO: 76、95及96所定義之抗體1E8的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(ii) 分別如由SEQ ID NO: 82、99及100所定義之抗體1E8的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者；及/或
(c) 該CAR之胞外域進一步對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性，且包含：
(i) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID No: 76、95及96之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 88之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(ii) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含分別具有SEQ ID NO: 82、99及100之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 92之序列、基本上由其組成或由其組成。
視情況，在該CAR中，胞外域為抗體，例如單鏈可變片段(scFv)。
根據本發明之第一態樣之CAR的跨膜域可例如包含蛋白質跨膜域，例如跨膜受體蛋白之跨膜域，且視情況其中跨膜域包含選自由以下組成之群組的蛋白質的跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD8、CD45及CD4。
根據本發明之第一態樣之CAR的胞外域可例如藉由鉸鏈區連接至跨膜域。
根據本發明之第一態樣之CAR的胞內域可例如包含胞內信號傳導域，例如其中：(a)胞內信號傳導域包含一或多種基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)；及/或(b)胞內信號傳導域包含CD3ζ、Fc受體γ、Fc受體β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之信號傳導域。
根據本發明之第一態樣之CAR的胞內域可例如包含一或多個共刺激域，例如：(a)其中一或多個共刺激域包括一或多個自選自由CD28、41BB、OX40、ICOS、CD27及DAP10組成之群組的蛋白質獲得的功能性信號傳導域；(b)其中胞內域併有接近胞內信號傳導域之共刺激域，(c)其中胞內域包含兩個或更多個共刺激域，例如兩個串聯共刺激域，及/或(d)其中胞內域併有單獨細胞介素信號。
根據本發明之第一態樣之CAR可例如另外包含前導序列。
本發明之第二態樣提供核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中核酸分子包含，或多個不同核酸分子之組合共同包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合形式編碼本發明之第一態樣之結合分子，例如根據本發明之第一態樣之抗體或CAR。
本發明之第三態樣提供一種載體，該載體包含(或多個不同載體之組合共同包含)根據本發明之第二態樣之核酸分子或根據本發明之第二態樣之多個不同核酸分子的組合。本發明之第三態樣之載體或各載體可例如選自由以下組成之群組：反轉錄病毒載體、質體、慢病毒載體及腺病毒載體。
視情況，根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第三態樣之載體包含一或多個額外序列，其中該額外序列或各額外序列編碼一或多個可選標記。
本發明之第四態樣提供一種細胞或細胞群(視情況均質或異質細胞群)，其包含根據本發明之第二態樣的核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第三態樣的載體，視情況其中細胞表現根據本發明之第一態樣之一或多個結合分子(諸如一或多個抗體及/或一或多個CAR)，該一或多個結合分子及/或CAR由根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據本發明之第三態樣之載體編碼。該等細胞可視情況選自經分離之細胞、離體細胞及活體外細胞。
根據本發明之第四態樣之細胞可例如包含：(a)根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中所編碼之結合分子為根據本發明之第一態樣之抗體、該抗體之功能片段或包含融合多肽序列之抗體或其功能片段；及/或(b)根據本發明之第三態樣之載體，其中該載體包含如由此段落之選項(a)所定義的核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
根據本發明之第四態樣之細胞可例如包含：(a)根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中所編碼之結合分子為根據本發明之第一態樣之CAR；及/或(b)根據本發明之第三態樣之載體，其中該載體包含如由此段落之部分(a)所定義的核酸分子或多個不同核酸分子之組合。在無限制下，該細胞可例如選自由以下組成之群組：T細胞、自然殺手(NK)細胞及巨噬細胞。因此，細胞可視情況為CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR巨噬細胞，且視情況，當細胞為CAR-T細胞時，則例如T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
本發明之第四態樣亦提供一種細胞，其包含根據本發明之第一態樣之結合分子及/或編碼該結合分子之核酸，視情況其中該核酸為分別如由本發明之第二或第三態樣所定義之核酸或載體。舉例而言，結合分子可為根據本發明之第一態樣之抗體、根據本發明之第一態樣之該抗體的功能片段或根據本發明之第一態樣之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段，且視情況其中該抗體為單株抗體，且進一步例如其中該細胞為重組表現單株抗體之哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。
本發明之第四態樣亦提供一種細胞，其包含根據本發明之第一態樣之CAR及/或編碼該CAR之核酸，視情況其中該核酸為分別如由本發明之第二或第三態樣所定義之核酸或載體。在無限制下，該細胞可例如選自由以下組成之群組：T細胞、自然殺手(NK)細胞及巨噬細胞。因此，細胞可視情況為CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR巨噬細胞，且視情況，當細胞為CAR-T細胞時，則例如T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
本發明之第五態樣提供一種產生細胞，更尤其重組細胞或此類細胞之群體(視情況均質或異質細胞群)之方法，該方法包含將根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第三態樣之載體引入至細胞中。
該方法視情況進一步包含選擇根據本發明之第五態樣之細胞的步驟；例如自異質細胞群中選擇該等細胞，由此產生富集及/或均質細胞群。該選擇步驟可包括選擇根據本發明之第二態樣的核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第三態樣之載體中存在之一或多個可選標記的存在。
本發明之第六態樣提供一種產生根據本發明之第一態樣之結合分子，例如根據本發明之第一態樣之抗體或CAR的方法，該方法包含：在細胞，更特定言之，重組細胞或此類細胞之群體(視情況，均質或異質細胞群)中表現根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，及/或根據本發明之第三態樣之載體。視情況，本發明之第六態樣之方法亦可包含以下步驟：自細胞分離如此產生之結合分子；舉例而言，其中結合分子為根據本發明之第一態樣之抗體、該抗體之功能片段或根據本發明之第一態樣之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段。該等細胞可視情況選自經分離之細胞、離體細胞及活體外細胞。
本發明之第七態樣提供藉由本發明之第六態樣之方法獲得或可藉由其獲得的經分離之結合分子，視情況其中該經分離之結合分子經進一步調配以用於向個體投與。
本發明之第八態樣提供一種結合物，該結合物包含與如本發明之第一態樣所定義之結合分子結合的部分，或與該結合分子之功能片段結合的部分。在無限制下，該部分可例如為治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性部分。在一些實施例中，部分為藥物(例如其中結合物係抗體-藥物結合物(「ADC」))及/或放射性部分(例如其中結合物適用於放射免疫療法(「RIT」))。
本發明之第九態樣提供一種產生根據本發明第八態樣之結合物的方法，該方法包含以下步驟：
(a) 提供如本發明之第一態樣所定義的結合分子或該結合分子之功能片段；及
(b) 使部分與該結合分子或與該結合分子之功能片段結合。
本發明之第九態樣之方法可另外包含分離如此產生之結合物之步驟。經分離之結合物可因此以分離形式，例如以如下組合物形式展現，其中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或實質上100%(以莫耳比)之結合分子或該結合分子之功能片段以結合物形式存在。另外或替代地，結合物之經分離之形式可為如下組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或實質上100%(以莫耳比)之部分以結合物形式存在。本發明之第九態樣進一步提供經分離之結合物或包含該經分離之結合物的組合物。
在本發明之第八態樣之結合物或本發明之第九態樣之方法的某些較佳實施例中，結合分子為根據本發明之第一態樣之抗體、該抗體之功能片段或根據本發明之第一態樣之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段。
本發明之第十態樣提供一種藉由本發明之第九態樣之方法獲得或可藉由其獲得的經分離之結合物，視情況其中該經分離之結合物經進一步調配以用於向個體投與。
本發明之第十一態樣提供一種對抗HCMV或與HCMV相關之疾病或病況的方法，該方法包含向個體或離體或活體外細胞物質投與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑：
i. 根據本發明之第一態樣之結合分子，
ii. 根據本發明之第一態樣之該結合分子的功能片段，
iii. 根據本發明之第七態樣之經分離之結合分子，
iv. 根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據本發明之第三態樣之載體，
vi. 根據本發明之第四態樣的細胞，
vii. 根據本發明之第八態樣之結合物，及
viii. 根據本發明之第十態樣之經分離之結合物。
換言之，本發明之第十一態樣提供該等藥劑中之一或多者以用於對抗個體或離體或活體外細胞物質中與HCMV相關之疾病或病況。
此外，本發明之第十一態樣提供該等藥劑中之一或多者之用途，其用於製造供對抗個體或離體或活體外細胞物質中與HCMV相關之疾病或病況用之藥物。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為HCMV感染或與HCMV感染相關。在一個實施例中，HCMV感染可為單株感染。視情況，在一替代實施例中，HCMV感染包含多株HCMV感染，其中多株HCMV感染包含用一種以上不同HCMV病毒株，例如編碼不同US28蛋白序列之兩個或更多個HCMV病毒株進行感染。該兩個或更多個病毒株可編碼US28蛋白，該等蛋白質在胞外區，諸如N端(ECD1)區、第一胞外環(ECD2)區、第二胞外環(ECD3)區及/或第三胞外環(ECD4)區中之一或多者上不同。
在一個相關實施例中，多株HCMV感染中之兩個或更多個HCMV病毒株各自編碼至少在N端(ECD1)區之一或多個位置上彼此不同的US28蛋白；例如其在N端(ECD1)區中之1、2、3、4、5、6、8、9、10或更多個胺基酸位置處可不同。舉例而言，多株HCMV感染中之兩個或更多個HCMV病毒株可展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)，例如其中該多種病毒株包含至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種選自由DB、Toledo、Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、AD169、VHL/E、Davis及BL組成之群組之不同病毒株。
另外或替代地，在另一相關實施例中，多株HCMV感染中之兩個或更多個HCMV病毒株各自編碼在第二胞外(ECD3)區之一或多個位置處彼此不同的US28蛋白，例如，多株HCMV感染中之HCMV病毒株中之一或多者可編碼如下US28蛋白，該蛋白質編碼ECD3之4N變體，且多株HCMV感染中之其他HCMV病毒株中之一或多者可編碼如下US28蛋白，該蛋白質編碼ECD3之4D變體。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為潛伏HCMV感染(例如，單株或多株潛伏HCMV感染)或與潛伏HCMV感染(視情況，多株潛伏HCMV感染)相關。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)或與裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)相關。
根據本發明第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為先天性HCMV感染(例如，單株或多株感染)，諸如潛伏先天性單株或多株HCMV感染或裂解先天性單株或多株HCMV感染。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為癌症，例如HCMV感染癌症(視情況單株或多株HCMV感染癌症)，諸如潛伏HCMV感染癌症(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為上皮癌；視情況其中該上皮癌為乳癌；例如，其中該乳癌為三陰性乳癌(TNBC)或HER2陽性乳癌。HER2陽性乳癌可例如為HER2+ HR- (其中HR-意謂激素受體陰性，且係指雌激素受體陰性(ER-)及孕酮受體陰性(PR-)狀態)；或HER2+ ER+ PR-；或HER2+ ER- PR+；或作為HER2+ ER+ PR+之三陽性形式之乳癌「TPBC」。應注意HER2+ HR-為特定侵襲形式之乳癌且對於根據本發明之診斷治療而言受到高度關注。該等形式之上皮癌可視情況為單株或多株形式之HCMV感染上皮癌，例如潛伏HCMV感染形式之上皮癌(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
根據本發明第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為轉移及/或侵襲形式之癌症。該等形式之轉移及/或侵襲癌症可視情況為單株或多株形式之HCMV感染之轉移及/或侵襲癌症，例如潛伏HCMV感染形式之轉移及/或侵襲癌症(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為神經膠母細胞瘤。在本文所述之其他實施例中，該疾病或病況不為神經膠母細胞瘤及/或該待處理之個體不具有及/或尚未診斷為患有神經膠母細胞瘤。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之個體(或離體或活體外細胞物質)可能具有及/或已經診斷有或具有HCMV感染癌細胞，諸如潛伏HCMV感染癌細胞。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之個體可為或意欲為細胞物質，諸如細胞產物供給之受體。該細胞產物可例如包含離體活細胞物質、基本上由其組成或由其組成，該離體活細胞物質係選自包括以下之群組：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。視情況，細胞產物可直接或間接來源於活的供體。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之個體可為或意欲為細胞物質之供體，諸如細胞產物之供體。該細胞產物可包含來自該供體之細胞、組織或器官中之任一者或多者、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之離體或活體外細胞物質可為離體細胞產物。該離體細胞產物可例如包含離體活細胞物質、基本上由其組成或由其組成，該離體活細胞物質係選自包括以下之群組：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。視情況，細胞產物可直接或間接來源於活的供體。
在一個實施例中，根據本發明第十一態樣的待使用之一或多種藥劑可例如選自由以下組成之群組(或包括選自由以下組成之群組的一或多種藥劑)：
i. 如由本發明之第一態樣所定義的治療性抗體，
ii. 如由本發明之第一態樣所定義之該治療性抗體的功能片段，
iii. 如由本發明之第一態樣所定義之包含融合多肽序列之治療性抗體；及
iv. 如由本發明之第一態樣所定義之包含融合多肽序列之該治療性抗體之功能片段。
舉例而言，根據本發明第十一態樣使用之一或多種藥劑可為(或包括選自以下之一或多種藥劑)如由本發明之第一態樣所定義之雙特異性抗體。在無限制下，此可以為雙特異性免疫細胞接合子抗體。其示例性實施例為雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體，視情況其中除包含對US28蛋白之ECD1區具有結合特異性的本發明之第一態樣之結合分子的區以外，BiTE抗體進一步包含T細胞接合域，諸如CD3結合域。
在另一實施例中，根據本發明第十一態樣使用之一或多種藥劑可為(或包括選自以下之一或多種藥劑)如由本發明之第一態樣所定義之三特異性抗體。其示例性實施例為三特異性抗體，其中除包含對US28蛋白之ECD1區內的由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的本發明之第一態樣之結合分子的區以外，該抗體進一步包含T細胞接合域，諸如CD3結合域，及ECD3接合域，諸如本文所描述之ECD3結合分子。
在另一實施例中，根據本發明第十一態樣的待使用之一或多種藥劑可例如為(或包括)根據本發明第八態樣及/或本發明第十態樣之結合物，諸如作為抗體-藥物結合物(「ADC」)之結合物，或包含放射性部分之結合物，諸如適用於放射免疫療法(「RIT」)之結合物。
在一些實施例中，ADC包含抗有絲分裂有效負載(例如微管蛋白抑制劑，諸如美登素(maytansine)等)。在一些實施例中，ADC包含作為DNA損傷劑之有效負載(例如，拓樸異構酶抑制劑，諸如SN38等)。在一些實施例中，ADC包含作為轉錄抑制劑之有效負載(例如RNA Pol II抑制劑，諸如瓢菌素(amanitin)等)。在一些實施例中，ADC包含選自由以下組成之群組之有效負載：美登醇(maytansinoid) (諸如美登素、DM1、DM3及DM4)；奧里斯他汀(auristatin)有效負載(諸如多拉斯他汀(Dolastatin) 10、MMAE、MMAF及PF-06380101)；特吡萊辛(tubulysin) (諸如特吡萊辛A、特吡萊辛B、特吡萊辛C、特吡萊辛G及特吡萊辛I)；艾瑞布林(eribulin)；紫杉醇衍生物(諸如多西紫杉醇(doxetaxel)及太平洋紫杉醇(paclitaxel))；DNA損傷劑(諸如卡奇黴素(Calicheamicin)；基於安麴黴素(Anthramycin)之二聚體，包括吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、吲哚啉并苯并二氮呯二聚體(IGN)及吡啶并苯并二氮呯(PDD)；基於倍癌黴素(Duocarmycin)之有效負載；蒽環黴素類(Anthracyclines)，艾黴素(Doxorubicin)、艾達黴素(Ladirubicin)及PNU-159682；及基於喜樹鹼之分子，包括喜樹鹼、依喜替康(Exatecan)及SN-38 (7-乙基-10-羥基喜樹鹼))。
在另一實施例中，根據本發明第十一態樣的待使用之一或多種藥劑可例如為(或包括)細胞(或細胞群，例如均質細胞群)，其中該細胞或各細胞包含根據本發明第四態樣之CAR。該細胞或細胞群通常經分離及/或調配以用於向個體投與。該細胞或各細胞可例如包含根據本發明之第一態樣之CAR及/或編碼該CAR之核酸，視情況其中該核酸為分別如由本發明之第二或第三態樣所定義之核酸或載體。該細胞或各細胞可例如為根據本發明之第四態樣的細胞。在無限制下，該一或多種細胞可例如選自由以下組成之群組：T細胞、自然殺手(NK)細胞及巨噬細胞。因此，細胞可視情況為CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR巨噬細胞，且視情況，當細胞為CAR-T細胞時，則例如T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
視情況，根據本發明之第十一態樣，可向個體投與另一物質，諸如另一治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性物質(諸如本文所描述之ECD3結合分子)，且視情況其中該另一物質可與一或多種藥劑中之每一者分開、依序或同時投與。
因此，本發明之第十一態樣亦提供一種治療有需要之個體的方法，其係藉由向個體投與治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性物質執行，其中亦分開、依序(例如之前或之後)或同時用一或多種藥劑中之任一者治療個體。
在同時治療之實施例中，接著根據本發明第十一態樣使用的一或多種藥劑可與治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性物質組合調配及/或投與；或可分開調配但作為兩種單獨調配物同時投與。
舉例而言，在一個實施例中，待治療之疾病或病況可為一種形式之癌症(諸如一或多種形式如上文所揭示之癌症)，且可使其他治療性、預防性、診斷性、預後或治療診斷物質靶向癌症。
本發明之第十二態樣提供一種用於藥物之藥劑，其中該藥劑係選自由以下組成之群組：
i. 根據本發明之第一態樣之結合分子，
ii. 如本發明之第一態樣所定義之該結合分子的功能片段，
iii. 根據本發明之第七態樣之經分離之結合分子，
iv. 根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據本發明之第三態樣之載體，
vi. 根據本發明之第四態樣的細胞，
vii. 根據本發明之第八態樣之結合物，及
viii. 根據本發明之第十態樣之經分離之結合物。
就本發明之第十一態樣而言，該藥劑可例如為如上文所定義之藥劑。
本發明之第十三態樣提供一種肽或多肽，其包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)、基本上由其組成或由其組成，或包含SEQ ID NO: 177之免疫原性片段的序列。該肽或多肽並非US28蛋白。較佳地，該肽或多肽中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列及/或該肽或多肽不含與在US28蛋白中在除包含SEQ ID NO: 177之序列之區以外之位置發現的同等長度之相連胺基酸序列之序列一致的3、4、5、6、7、8、9、10個或超過10個相連胺基酸之任何序列。
本發明之第十四態樣提供一種肽或多肽，其包含序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)及/或TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)、基本上由其組成或由其組成，或包含SEQ ID NO: 6 及/或7之免疫原性片段的序列。該肽或多肽並非US28蛋白。視情況，該肽或多肽亦包含SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列。較佳地，該肽或多肽中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 6 及/或7之序列或SEQ ID NO: 6 及/或7之免疫原性片段之序列，且視情況，亦為SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列。
根據本發明之第十三或第十四態樣，包含參考序列SEQ ID NO: 177之免疫原性片段、基本上由其組成或由其組成之肽或多肽包含少於參考序列之全序列，且較佳包含參考序列SEQ ID NO: 177之至少3、4、5、6、7、8、9、10或11個連續胺基酸。
分別根據本發明之第十四態樣，參考序列SEQ ID NO: 6及/或7之免疫原性片段包含少於參考序列之全序列，且較佳包含參考序列之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續胺基酸。
在一個實施例中，本發明之第十四態樣之肽或多肽之免疫原性片段包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7共有的且存在於該等序列內的序列。
本發明之第十三及第十四態樣亦提供肽或多肽，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：
(i) 參考序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之免疫原性片段或變體，其包含與如本文所描述之抗體4H3C3、7B1F3及/或2F5B11中之任一者所結合的SEQ ID NO: 177內之抗原決定基之序列(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID No: 187、211及233所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
H序列的V
H多肽序列，以及具有分別如由SEQ ID No: 189、213及235所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
L序列的V
L多肽序列)；較佳地，該等肽或多肽由4H3C3、7B1F3及/或2F5B11特異性結合。
(ii) 分別選自TKKNNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO: 6)及/或TKKDNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO: 7)之參考序列的免疫原性片段或變體，其中該免疫原性片段或變體包含與如本文所描述之抗體1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8中之任一者所結合的US28之ECD3內的抗原決定基之序列(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID NO: 12、104、122、68及88所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
H序列的V
H多肽序列，以及具有分別如由SEQ ID NO: 18、108、126、72及92所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
L序列的V
L多肽序列)。較佳地，該等肽或多肽由1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8特異性結合。
本發明之第十五態樣提供至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合，其包含第一肽或多肽及第二肽或多肽(及視情況至少第三肽或多肽)，其中：
(a)第一肽或多肽包含序列 TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段、基本上由其組成或由其組成，諸如如由本發明之第十三態樣所定義之免疫原性片段；及
(b)第一肽或多肽包含序列TKKNNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO: 6)或其免疫原性片段、基本上由其組成或由其組成，諸如如由本發明之第十四態樣所定義之免疫原性片段，條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO: 6之4N胺基酸；或
(c)第二肽或多肽包含序列TKKDNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO: 7)或其免疫原性片段、基本上由其組成或由其組成，諸如如由本發明之第十四態樣所定義之免疫原性片段，條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO: 7之4D胺基酸、基本上由其組成或由其組成；且
視情況其中該組合包含第三多肽，且若第二肽或多肽如由選項(b)所定義，則第三肽或多肽對應於選項(c)，或其中若第二肽或多肽如由選項(c)所定義，則第三 肽或多肽對應於選項(b)。
本發明之第十六態樣提供一種融合蛋白，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：直接或經由一或多個連接胺基酸序列融合至第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，其中第一胺基酸序列為如由本發明之第十三或第十四態樣所定義之肽或多肽之序列；且第二胺基酸序列為融合搭配物。
視情況，融合搭配物為攜載蛋白質，諸如經選擇以提供適合於針對第一胺基酸序列進行免疫接種及產生抗體之融合蛋白的攜載蛋白質。舉例而言，攜載蛋白質可選自由以下組成之群組：匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、經遺傳修飾之白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)及流感嗜血桿菌蛋白質D (HiD)。
本發明之第十七態樣提供至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合，該等融合蛋白包含第一融合蛋白及第二融合蛋白(及視情況至少第三融合蛋白)，其中：
(a)根據本發明之第十六態樣之第一融合蛋白包含作為第一融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成；及
(b)根據本發明之第十六態樣之第二融合蛋白包含作為第一融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO: 6之4N胺基酸；或
(c)根據本發明之第十六態樣之第二融合蛋白包含作為第二融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO: 7之4D胺基酸；且
視情況其中該組合包含第三不同融合蛋白，且若第二融合蛋白如由選項(b)所定義，則第三融合蛋白對應於選項(c)，或其中若第二融合蛋白如由選項(c)所定義，則第三融合蛋白對應於選項(b)。
本發明之第十八態樣提供一種結合物，其包含與如由本發明之第十三及第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽結合的部分，或與如由本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白結合的部分。
該結合物之部分可直接結合至如由本發明之第十三及第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽，或結合至如由本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白。替代地，該結合物之部分可諸如經由連接子而與如由本發明之第十三及第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽或與如由本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白間接結合。
視情況，該部分可為攜載體，例如攜載蛋白質，諸如選自以下之攜載體：匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、經遺傳修飾之白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)及流感嗜血桿菌蛋白質D (HiD)。
本發明之第十九態樣提供至少兩種(例如三種)不同結合物之組合，其中該組合包含：
(a)根據本發明之第十八態樣之第一結合物，其中該第一結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成；及
(b)根據本發明之第十八態樣之第二結合物，其中該第二結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO: 6之4N胺基酸；或
(c)根據本發明之第十八態樣之第二結合物，其中該第二結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO: 7之4D胺基酸；且
視情況其中該組合包含第三不同結合物，且若第二結合物如由選項(b)所定義，則第三結合物對應於選項(c)，或其中若第二結合物如由選項(c)所定義，則第三結合物對應於選項(b)。
本發明之第二十態樣提供一種產生根據本發明之第十九態樣之結合物的方法，該方法包含以下步驟：
(a) 提供如由本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽、如由本發明之第十五態樣所定義之其組合或如由本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白；及
(b) 將部分與其結合。
本發明之第二十一態樣提供一種產生如由本發明之第十九態樣所定義之至少兩種(例如三種)不同結合物之組合的方法。
在一個實施例中，該方法包含以下步驟：(a)藉由根據本發明之第二十態樣之方法提供或產生如由本發明之第十八態樣所定義之第一結合物；(b)藉由根據本發明之第二十態樣之方法提供或產生如由本發明之第十八態樣所定義之第二結合物(其中第一結合物與第二結合物不同)；(c)藉由根據本發明之第二十態樣之方法提供或產生如由本發明之第十八態樣所定義之第三結合物(其中第一結合物、第二結合物及第三結合物不同)；及(d)組合第一結合物與第二結合物及視情況第三結合物，由此形成根據本發明之第十九態樣之組合。
在另一實施例中，該方法包含以下步驟：(a)提供根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合，或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合；及(b)使部分與根據本發明之第十五態樣之至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽的組合結合，或與根據本發明之第十七態樣之至少兩種(例如三種)不同融合蛋白的組合結合，由此形成根據本發明之第十九態樣之組合。
本發明之第二十或第二十一態樣之方法視情況包含分離如此產生之結合物或結合物之組合的步驟。
本發明之第二十二態樣提供藉由本發明之第二十或第二十一態樣中之任一者之方法獲得或可藉由其獲得的經分離之結合物或結合物之組合，視情況其中該經分離之結合物經進一步調配以用於向個體投與。
本發明之第二十三態樣提供核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中核酸分子包含，或多個不同核酸分子之組合共同包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合形式編碼根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽及/或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合。
根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或各核酸分子可例如各自獨立地選自DNA或RNA分子。根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或各核酸分子可例如各自獨立地選自單股或雙股核酸分子。
本發明之第二十四態樣提供一種載體，其包含根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。可使用任何載體，儘管(但不限於)該載體可視情況選自由以下組成之群組：反轉錄病毒載體、質體、慢病毒載體及腺病毒載體。
本發明之第二十五態樣提供一種細胞，其包含根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據本發明之第二十四態樣之載體。視情況，該細胞表現選自本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合。
本發明之第二十六態樣提供一種細胞，其暴露於及/或包含選自本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣之結合物、根據本發明之第十九態樣之至少兩種(例如三種)不同結合物之組合、根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第二十四態樣之載體。
本發明之第二十七態樣提供一種分離及/或富集包含T細胞受體(TCR)之細胞的方法，該T細胞受體對US28之ECD1中之由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基(及視情況ECD3中之第二抗原決定基)具有特異性(例如天然存在之T細胞，或表現根據本發明之第一態樣之CAR之重組細胞，例如CAR T細胞、CAR NK細胞及/或CAR巨噬細胞)，其中該方法包含使用一或多種藥劑分離及/或富集對SEQ ID No: 177之序列或其免疫原性片段具有結合特異性且視情況亦對SEQ ID NO: 6及/或7之序列中之一者或兩者或任一者之免疫原性片段具有結合特異性之細胞的步驟
其中一或多種藥劑係選自由以下組成之群組：根據本發明之第十三及/或第十四態樣中任一者或兩者之肽或多肽、根據本發明之第十五態樣之至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽的組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物及/或根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合。
在本發明之第二十七態樣之方法的一個實施例中，可將序列調配為MHC四聚體，例如用於抗原特異性CD8
+T細胞偵測之I類MHC四聚體、用於抗原特異性CD4
+T細胞偵測之II類MHC四聚體或用於流動式細胞測量術或螢光顯微術之螢光團標記四聚體。視情況，T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
本發明之第二十八態樣提供一種MHC四聚體，其包含根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合，視情況其中該肽或各肽包含或對應於SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 6及/或SEQ ID NO: 7，或任一者或兩者之免疫原性片段，例如其中該MHC四聚體為用於抗原特異性CD8
+T細胞偵測之I類MHC四聚體、用於抗原特異性CD4
+T細胞偵測之II類MHC四聚體、用於流動式細胞測量術或螢光顯微術之螢光團標記四聚體。MHC四聚體可進一步用於分離及/或富集包含對US28之ECD1及/或ECD3中之由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有特異性的T細胞受體(TCR)之細胞，例如選自由以下組成之群組的T細胞：CD8
+T細胞、CD4
+T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型及/或表現根據本發明之第一態樣的CAR之重組細胞，例如CAR T細胞、CAR NK細胞及/或CAR巨噬細胞。
本發明之第二十九態樣提供適用於針對與人類巨細胞病毒(HCMV)相關之疾病或病況進行接種疫苗、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況或對抗該疾病或病況的疫苗組合物。疫苗可為主動或被動疫苗。根據本發明之第二十九態樣之主動疫苗可觸發針對存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基的免疫反應。視情況，主動疫苗亦觸發及/或提供針對存在於HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基的免疫反應。根據本發明之第二十九態樣之被動疫苗可為提供針對第一抗原決定基之免疫反應的組合物，該第一抗原決定基存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內。視情況，被動疫苗亦提供針對第二抗原決定基之免疫反應，該第二抗原決定基存在於HCMV之US28蛋白之ECD3內。如上文所論述，在本發明之其他態樣之情形下，US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3包含存在於由HCMV之病毒株編碼之US28蛋白中如下位置處之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)之DB病毒株編碼之US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。
在一些實施例中，本發明之第二十九態樣之疫苗組合物針對以下觸發及/或提供免疫反應：
(a) 完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的一或多個抗原決定基，及/或完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD3內的一或多個抗原決定基；
(b) HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的一或多個線性抗原決定基，及/或存在於HCMV之US28蛋白之ECD3內的一或多個線性抗原決定基；
(c) HCMV之US28蛋白之ECD3內的一或多個抗原決定基，其為以相同形式存在於HCMV之該等4D變異株及該等4N變異株兩者中之一個抗原決定基或多個抗原決定基，其中HCMV之該4D變異株編碼包含具有TKKDNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO:7)之序列之ECD3的US28蛋白，且其中HCMV之該4N變異株編碼包含具有TKKNNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO:6)之序列之ECD3的US28蛋白；
(d)其中由該疫苗觸發或提供之該免疫反應對展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)的多種HCMV病毒株係HCMV病毒株未定性，例如其中該多種病毒株為兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種選自由DB、Toledo、Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、AD169、VHL/E、Davis及BL組成之群組之不同病毒株；及/或
(e)其中由該疫苗觸發或提供之該免疫反應對HCMV之該等4D變異株及該等4N變異株係HCMV病毒株未定性，且觸發及/或提供針對選自Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、JP、Ad169、VHL/E、BL、AF1及DAVIS的該等4D變異HCMV病毒株中之一或多者且亦針對選自Toledo、TR及DB的該等4N變異HCMV病毒株中之一或多者的免疫反應。
該疫苗組合物可為被動疫苗，及/或視情況包含：(a)根據本發明之第一態樣之一或多個結合分子，(b)如由本發明之第一態樣所定義之該一或多個結合分子之功能片段，(c)根據本發明之第七態樣之一或多個經分離之結合分子，(d)根據本發明之第二態樣之一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合；(e)根據本發明之第三態樣之一或多種載體；(f)根據本發明之第四態樣之一或多種細胞；(g)根據本發明之第八態樣之一或多種結合物；及/或(h)根據本發明之第十態樣之一或多種經分離之結合物。
替代地，該疫苗組合物可為主動疫苗，及/或視情況包含：
(a)根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白、根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物及/或根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合；
(b)根據本發明之第二十三態樣的一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第二十四態樣的載體；及/或
(c)細胞，諸如抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)，或該等細胞之均質或異質群體，其中該等細胞或該等細胞中之每一者負載有以下中之一或多者：根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白、根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物、根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合、根據本發明之第二十三態樣的一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第二十四態樣的載體。
本發明之第三十態樣提供一種針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法，該方法包含向個體投與根據本發明之第二十九態樣之疫苗。
本發明之第三十態樣提供根據本發明之第二十九態樣之疫苗，其用於針對個體之與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況。
本發明之第三十態樣提供根據本發明之第二十九態樣之疫苗的用途，其用於製造供針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況用之藥物。
與HCMV相關之該疾病或病況可例如為如上文在本發明第十一態樣之情形下所揭示的與HCMV相關之疾病或病況。視情況，疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
在一些實施例中，針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法可包含僅向個體投與疫苗一次。
在其他實施例中，針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法可包含向個體投與疫苗兩次或多次。舉例而言，在其中疫苗為主動疫苗之實施例中，可適於向個體分開投與初始劑量及後續加強劑量。
本發明之第三十一態樣提供一種評定個體及/或離體生物材料之一或多種生物病況及/或生物特徵的方法，其中該方法包含：(a)使個體及/或離體生物材料與例如如由本發明之第一態樣所定義之結合分子或例如如由本發明之第八態樣或第十態樣所定義之結合物接觸；及(b)基於結合分子或結合物與個體及/或離體生物材料之結合的直接及/或間接量測來評定個體及/或離體生物材料。
在一些實施例中，評定(其可包括診斷)個體及/或離體生物材料之一或多個生物病況及/或生物特徵之方法係藉由原位雜交(ISH)特異性偵測由HCMV編碼之一或多個核酸序列來進行，最佳其中該ISH不偵測由健康(亦即不感染HCMV)個體及/或健康離體生物材料編碼之核酸序列。藉助於非限制性實例，ISH可使用如本申請案之實例中所論述之核酸序列。在一些實施例中，該生物病況係癌症及/或該等生物特徵係關於癌症。在一些實施例中，該癌症係選自本文所指定之癌症中之一或多者，視情況其中該癌症不為神經膠母細胞瘤。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：乳癌(例如HER2+乳癌或三陰性乳癌)、星形細胞瘤、神經膠母細胞瘤、腎上腺皮質癌、腎癌、心臟肉瘤、肝癌及血管平滑肌癌；視情況其中該癌症不為神經膠母細胞瘤。
在一些實施例中，評定(其可包括診斷)個體及/或離體生物材料之一或多種生物病況及/或生物特徵之方法係藉由免疫組織化學(IHC)特異性偵測由HCMV編碼之一或多個蛋白質序列來進行，最佳其中該IHC不偵測由健康(亦即不感染HCMV)個體及/或健康離體生物材料編碼之蛋白質序列。在一些實施例中，IHC使用結合分子，其允許特異性偵測僅由潛伏HCMV感染表現或僅由其表面表現之一或多種蛋白質序列。在一些實施例中，IHC使用結合分子，其允許特異性偵測一或多個僅由裂解HCMV感染表現或僅由其表面表現之蛋白質序列。在一些實施例中，IHC使用結合分子，其允許特異性偵測由裂解及潛伏HCMV感染兩者表現，例如由其表面表現之一或多個蛋白質序列。在一些實施例中，可以執行IHC(例如使用尚未滲透細胞之生物組織)以僅允許偵測細胞表面表現之蛋白質。在其他實施例中，可以執行IHC(例如使用已滲透細胞之生物組織)以允許偵測細胞內蛋白質。作為非限制性實例，IHC可以使用基於抗體之分子特異性偵測如本申請案之實例中所論述由HCMV編碼之一或多個蛋白質序列，及/或使用本發明之結合分子中之一或多者。在一些實施例中，該生物病況係癌症及/或該等生物特徵係關於癌症。在一些實施例中，該癌症係選自本文所指定之癌症中之一或多者，視情況其中該癌症不為神經膠母細胞瘤。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：乳癌(例如HER2+乳癌或三陰性乳癌)、星形細胞瘤、神經膠母細胞瘤、腎上腺皮質癌、腎癌、心臟肉瘤、肝癌及血管平滑肌癌；視情況其中該癌症不為神經膠母細胞瘤。
其中已由本發明之第三十二態樣確診HCMV感染為陽性之個體及/或活的離體生物材料可為可根據如本文所描述之本發明之其他態樣處理的示例性個體及/或材料。
本發明之第三十二態樣提供一種對抗活的離體生物材料之HCMV感染(諸如潛伏HCMV感染及/或裂解HCMV感染及/或多株HCMV感染)之方法，該方法包含使活的離體生物材料與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑接觸：
i. 根據本發明之第一態樣之結合分子，
ii. 如本發明之第一態樣所定義之該結合分子的功能片段，
iii. 根據本發明之第七態樣之經分離之結合分子，
iv. 根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據本發明之第三態樣之載體，
vi. 根據本發明之第五態樣之細胞，
vii. 根據本發明之第八態樣之結合物，及
viii. 根據本發明之第十態樣之經分離之結合物。
本發明之第三十二態樣亦提供藉由此態樣之方法獲得或可藉由其獲得的活的離體生物材料。
在本發明之第三十二態樣之方法及/或由此獲得或可由此獲得之活的離體生物材料的一個實施例中，該離體活生物材料包含選自包括以下之群組的活的離體生物材料、基本上由其組成或由其組成：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體胞器；一或多種類型之離體胞器培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。
本發明之第三十三態樣提供一種治療有需要之個體的方法，其包含向個體投與如本發明之第三十二態樣所定義之離體活生物材料。
舉例而言，該方法可為移植離體活生物材料，諸如器官移植或組織移植之方法。該方法可用於預防移植接受者之HCMV傳播及感染或與HCMV感染相關之疾病或病況，或降低其風險。
本發明之第三十四態樣提供一種篩選對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性及/或結合親和力之結合分子的方法，該方法包含：
(a) 提供一或多種肽或多肽，其包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段、基本上由其組成或由其組成，
較佳地其中存在於該一或多種肽或多肽內的僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 177之序列或其免疫原性片段，諸如由抗體4H3C3、7B1F3及/或2F5B11結合之片段；
(b) 提供一或多種候選結合分子；
(c) 測定一或多種候選結合分子對該一或多個肽之結合特異性及/或結合親和力，從而選擇對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一或多種結合分子；及
視情況，其中該方法進一步涉及藉由額外方法步驟(可在步驟(a)-(c)之前或之後進行)篩選對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的抗原決定基具有結合特異性的該等結合分子，該等額外方法步驟包含：
(i) 提供一或多種肽或多肽，其對應於存在於US28蛋白之ECD3中的胺基酸序列，
較佳地其中存在於該一或多種肽內的僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 6 及/或7之序列或任一者之免疫原性片段，諸如由抗體1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8結合之片段；
(ii) 提供一或多種候選結合分子，視情況其中步驟(a)-(c)在步驟(i)-(iii)之前進行且其中步驟 (ii)之該等候選結合分子為步驟(c)之產物；
(iii) 測定一或多種候選結合分子對一或多種肽或多肽之結合特異性及/或結合親和力，該一或多種肽或多肽對應於存在於US28蛋白之ECD3中的胺基酸序列，視情況其中步驟(a)-(c)在步驟(i)-(iii)之後進行且其中步驟(b)之該等候選結合分子為此技術方案之步驟(iii)之產物。
本發明之第三十五態樣提供一種產生包含結合分子之多個複本的組合物之方法，該方法包含使得所選候選結合分子複製，該候選結合分子已根據本發明之第三十四態樣之方法經選擇。
本發明之第三十六態樣提供一種評定所選候選結合分子的方法，該結合分子已根據本發明之第三十四態樣之方法經選擇及/或根據本發明之第三十五態樣之方法產生，該方法包含鑑別所選候選結合分子內之結構，該結構提供該候選結合分子結合特徵(特定言之，對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基之結合特異性及/或結合親和力，及視情況對ECD3內之第二抗原決定基之結合特異性及/或結合親和力)，例如藉由鑑別作為抗體或CAR之所選候選結合分子中的該CDR序列或各CDR序列。
本發明之第三十七態樣提供一種產生組合物之方法，該組合物包含對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內之由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基(及視情況對ECD3內之第二抗原決定基)具有結合特異性及/或結合親和力的結合分子之多個複本，其中根據本發明之第三十六態樣之方法，該結合分子包含已在所選候選結合分子內經鑑別為提供其結合特徵的結構(例如CDR序列)或該(等)結構中之每一者，該方法包含使結合分子複製。
本發明之第三十七態樣進一步提供藉由相同態樣獲得之結合分子之組合物。
本發明係關於靶向如由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白之特定區之藥劑及與其相關之治療性、預防性及診斷性方法，包括但不限於HCMV感染癌症及其他與潛伏或裂解HCMV感染相關之病況。
HCMV US28蛋白表現靶向HCMV感染(包括潛伏儲集器)之極佳潛力，因為：
(1)在裂解及潛伏HCMV感染期間US28蛋白之某些部分於細胞表面上表現(Elder等人,
iScience, 2019,
12: 13-26)；
(2)US28為GCPR，其向質膜遷移允許其經結合分子直接靶向且其由於其胞吞作用而用作有效負載之轉運蛋白，該胞吞作用為組成性的或由於配位體結合而發生。GCPR一般構成由經批准藥物靶向之最大蛋白質家族(Sriram及Insel,
《分子藥理學》, 2018,
93(4): 251-258)；及
(3)與許多靶向由人類DNA編碼之GCPR的經批准藥物相比，HCMV US28完全由病毒DNA編碼，因此採用僅僅位於感染HCMV中但不位於健康人類細胞中之高度特異性藥物目標。
A. 針對US28之結合分子 當考慮到針對US28之結合分子之設計時，本發明人指出，N端域為US28蛋白之配位體結合部分，以物理方式自質膜延伸且因此最可能暴露於宿主抗體產生、免疫反應及遺傳選擇壓力(Mozzi等人, 2020, 同上)。一致地，其亦為已知含有較高病毒株間變化性及突變之區域(Arav-Boger等人, 2002, 同上)。較不保守之位點，亦即本發明人尤其在N端區中鑑別出始終在包含N端區之胺基酸位置1至25之區域中的位點，亦更易產生可改變治療反應的新突變，該治療隨時間推移經靶向此等區域(Komatsu等人, 《抗病毒研究》, 2014,
101: 12-25)。包含胺基酸位置1至25之區域內之許多此類N端多態性在所鑑別之HCMV病毒株內已知，如本申請案之表3中所概述。因此，HCMV基因中之新突變很可能產生於此類較不保守之位點中，其由不同病毒株之間的變化精確找到。大多數結構抗體最可能針對US28蛋白之N端部分產生(De Groof等人, 《分子製藥學(
Mol Pharm)》, 2019,
16(7): 3145-3156)，因此亦可為人體中天然抗體之情況(Elder等人, 2019, 同上)。
根據吾等瞭解，迄今為止已鑑別出三種類型之HCMV高風險致癌病毒株。最近已鑑別出DB(KT95923)及BL(MW980585)臨床HCMV分離株以促成致癌分子路徑，活體外建立錨定非依賴性生長且在小鼠模型中產生致瘤性，且因此被命名為高風險致癌病毒株(Kumar等人, 2018及Ahmad等人, 2021)。另外，Soroceanu等人在10個HCMV陽性神經膠母細胞瘤腫瘤中定序US28基因之C端部分。結果(呈現於NIHMS323374-supplement-1.pdf原始公開案中)之比對展示所有此等病毒株將類似於HCMV VHL/E臨床分離株(L20501.1)。高風險致癌病毒株DB、BL及VHL/E在US28基因中，尤其在N端部分(表3)中皆展示不同突變。N端部分在位置E18D；A19E；F25L(VHL/E)及A19D、T21A、F25L(BL)中不同於DB病毒株。因此，胺基酸位置18、19、21及25在此等高風險致癌病毒株中均突變；且亦已知其他病毒株在位置8及/或15處具有突變(表3)。
由於在N端區中報導之高程度多態性，且在本發明之前，似乎US28之此區域可為設計抗US28抗體及其他抗US28結合分子之次佳目標，尤其因為針對US28之結合活性接著實質上取決於所存在之HCMV病毒株為呈現與該結合活性匹配之N端的病毒株。此外，由於顯而易見在HCMV感染期間可出現基因漂移，所以此類漂移可集中在高度多態區域中，使得HCMV感染可在感染過程期間發展以避免對抗US28抗體及其他靶向此類N端序列之抗US28結合分子之結合敏感性。
實際上，如本申請案之背景部分中已經論述，先前描述的稱為VUN100的抗N端VHH抗體展示結合於不連續抗原決定基，該不連續抗原決定基在US28之N端胞外區中包含多個結合位置，且進一步受US28之第三細胞外環(亦在本文中稱為ECD4)之存在影響，如WO 2019/151865之實例3 (第36頁，第11-32行)及De Groof等人, 2019 [同上]之圖2之圖例中所論述。
值得注意的是，WO 2019/151865之圖8D中與VUN100及不同HCMV病毒株之結合相關的結果展示HCMV之VHL/E、Merlin及TB40/E病毒株之間之結合差異，其中在病毒株TB40/E (B1型)中之結合尤其減少了，僅約針對Merlin病毒株所觀測到之結合程度的一半。此外，在可在線獲得之De Groof等人, 2020 (doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.071860)的預印文章中報導了VUN100之進一步表徵，其中補充資料之圖2提供由VUN100結合之CD14+單核球之細胞核中誘導之IE表現%之結果。測試之所有細胞均來自HCMV血清反應呈陽性的個體，且確認為潛伏感染HCMV，但感染各供體之HCMV病毒株待定。由與此等來自四名不同患者中之每一者之HCMV陽性CD14+細胞結合之VUN100誘導的IE表現量實質上不同，其中對於供體1-4報導之數字分別為57%、33%、22%及4% (差值範圍大於14倍)。VUN100與所確認之HCMV陽性細胞結合後的此高程度反應變化似乎最可能歸因於不同HCMV病毒株感染供體中之每一者，且因此有力指示VUN100之結合能力在不同HCMV病毒株之間將顯著變化。同一圖式亦展示在二價形式之VUN100 (De Groof等人, 2020 (同上)稱為VUN100b，由本申請案之SEQ ID NO: 63表示)與相同組之來自供體1-4的HCMV陽性細胞結合之後的高程度反應變化(差值程度超過7倍)，再次提供指示病毒株特異性結合敏感性之結果。De Groof等人, 2021, 《藥理學評論(
Pharmacol Rev)》
73:828-846亦描述HCMV之連續繼代如何引起具有在胞外環3中具有過早終止密碼子之截短US28的抗性突變體的發展，從而引起US28之表面表現減少。此類抗性對VUN100可能具有不良影響，VUN100依賴於第三胞外環中之部分抗原決定基。
儘管其高度可變序列，本發明人認為存在的US28蛋白之N端部分之特定區(ECD1)是否可為針對US28之高度特異性及病毒株未定性抗體之適當目標。
本發明人亦確定US28之ECD2及ECD3在不同HCMV病毒株之間高度保守；ECD2不具有任何已知突變，而本發明人對來自許多不同HCMV病毒株之ECD3之已知序列的分析揭露存在僅一個已知突變。在已知高風險致癌病毒株中，DB病毒株為ECD3 N170N (在本文中亦稱為「4N」變體形式，因為US28蛋白之位置170對應於ECD3之位置4)，而BL及VHL/E病毒株表示N170D (在本文中亦稱為「4D」)變體(表3)。本發明人鑑別出編碼US28 ECD4 DNA的DNA序列含有多個多態位點，其中僅一個產生較常見的胺基酸變化(R267K)。值得注意的是，高風險致癌BL病毒株含有ECD4變體V250L及R267K兩者(表3)。
出人意料地，本研究證明ECD2及ECD4蛋白之保守部分不為小鼠之適當免疫原，而本申請人能夠開發一種鑑別針對對應於位置26至37且包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之HCMV US28之ECD1的特定區域(本發明人之分析確定該區域在所有已知病毒株中明顯保守)的高度特異性、病毒株未定性結合分子以及針對HCMV US28之ECD3區之高度特異性、病毒株未定性結合分子的新方法。如本申請案之實例中所報導，許多單株抗體展示良好且特異性結合於過度表現US28之US28-CHO-A1細胞及感染HCMV之人類肺組織上的表示ECD1內之此保守抗原決定基的肽。此外，ECD3單株抗體展示良好且特異性結合在以下上：US28 ECD3肽之兩種基因變體，過度表現US28之US28-CHO-A1細胞、經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞、來自HCMV血清反應呈陽性之個體之初級PBMC、感染HCMV之人類肺組織及若干類型之侵襲性人類腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤。
因此，本申請人已提供高度特異性的針對由HCMV編碼之US28蛋白的ECD1結合分子，其能夠提供HCMV病毒株未定性結合(及/或可根據本申請案之教示進行修改以進一步包括高度特異性且HCMV病毒株未定性之ECD3結合域)，包括但不限於特定言之，抗體及嵌合抗原受體(『CAR』)，以及其用途，例如用於與HCMV相關之診斷性、預防性及治療性用途及方法中。亦提供HCMV疫苗及適合用於產生該等結合分子之其他藥劑。
本發明之第一態樣提供一種結合分子，其包含一或多條多肽鏈，該結合分子對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且視情況，其中該結合分子亦對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的第二抗原決定基具有結合特異性(及/或其中該結合分子為與對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的第二結合分子一起調配的第一結合分子)，其中US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。如下文進一步論述，根據本發明之第一態樣之該結合分子的非限制性但尤其較佳實例包括抗體及嵌合抗原受體(CAR)。
抗原決定基：
如上文所指出，根據本發明之第一態樣之結合分子對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且視情況，其中該結合分子亦對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的第二抗原決定基具有結合特異性(及/或其中該結合分子為與對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的第二結合分子一起調配的第一結合分子)，其中US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。
本發明之第一態樣之結合分子所針對而具有結合特異性的第一抗原決定基可例如較佳完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內。本發明之第一態樣之結合分子所針對而具有結合特異性的視情況存在之第二抗原決定基可例如較佳完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD3內。
第一及第二抗原決定基或其中每一者可例如為US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽及/或ECD3內(較佳完全在其內)的線性抗原決定基。替代地，第一及第二抗原決定基或其中每一者可為US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽及/或ECD3內(較佳完全在其內)的不連續及/或構形抗原決定基。
第一抗原決定基可例如包含12個或更少的SEQ ID NO: 177之序列之胺基酸或由其組成，例如其可包含以下或由以下組成：11、10、9、8、7、6、5、4、3個或更少的SEQ ID NO: 177之序列之胺基酸，其可視情況為US28之ECD1內的SEQ ID NO: 177之序列內之連續胺基酸。
視情況存在之第二抗原決定基可例如包含17個或更少的HCMV之US28蛋白之ECD3之胺基酸或由其組成，例如其可包含以下或由以下組成：16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3個或更少的HCMV之US28蛋白之ECD3之胺基酸，其可視情況為US28之ECD3中之連續胺基酸。
存在於US28蛋白中對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白之位置1至37 (ECD1)及/或位置167至183 (ECD3)的位置處之胺基酸序列可能未必與SEQ ID NO: 5之該區中發現的序列一致，因為在不同HCMV病毒株中，US28之ECD1及/或ECD3之序列可存在病毒株間變化。因此，在此情形下，「對應於」之術語係指胺基酸發現於具有由任何HCMV相關病毒株編碼之US28蛋白之對應位置(亦即：分別(i)第1個胞外環，亦可交換地稱為ECD1區及N端；及/或(ii) 第2個胞外環，亦稱為ECD3區)的區中。
在分析來自許多不同臨床及實驗室HCMV病毒株之US28蛋白之序列之後，本申請人已鑑別出明顯在所有已知之HCMV病毒株內的對應於SEQ ID NO: 177之US28之N端(ECD1)內存在保守區域，且在經HCMV編碼之US28之ECD3內存在僅單一多態性，因此存在有利ECD1序列及兩個替代ECD3序列。兩個替代ECD3序列在本文中稱為4D變體及4N變體。
如由SEQ ID NO: 177所定義之US28之有利ECD1序列明顯在所有已知之HCMV病毒株內保守，該等病毒株包括但不限於HCMV病毒株DB、Towne、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR、VHL/E及VR1814 (FIX)。
4D變體係指存在於如由第一群組HCMV病毒株編碼的US28之ECD3中之序列變異，且呈現出較為常見的形式；如藉由BLAST搜索所鑑別，約90%之由不同HCMV病毒株編碼之US28序列展示4D變異序列。4D變體之特徵在於在US28之ECD3中包含序列TKK
DNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7；其中位置4帶下劃線，為D)。具有US28之4D變體之第一群組之示例性HCMV病毒株包括Towne、VR1814、TB40/E、VHL/E、Merlin、JP、Ad169、AF1、BL及DAVIS病毒株。
4N變體係指存在於如由第二群組HCMV病毒株編碼的US28之ECD3中之替代序列變異，且呈現出較不常見的形式。4D變體之特徵在於在US28之ECD3中包含序列TKK
NNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO:6；其中位置4帶下劃線，為N)。具有US28之4N變體之第二群組之示例性HCMV病毒株包括Toledo、TR及DB病毒株。展示US28之ECD3中之4N變異序列的此等及其他HCMV病毒株展示於表1中。
本發明之第一態樣之結合分子(諸如本發明之第一態樣之HMCV病毒株未定性結合分子)所針對而具有結合特異性的第一抗原決定基為存在於序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)內之抗原決定基。換言之，本發明之第一態樣之結合分子所針對而具有結合特異性的US28之ECD1內之抗原決定基較佳排除US28之N端區之位置1至25處的胺基酸。
在其中第一抗原決定基為序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)內(較佳完全在其內)之不連續及/或構形抗原決定基的另一選項中，則不連續抗原決定基可包括序列SEQ ID NO: 177之任3、4、5、6、7、8、9、10或11個胺基酸。
序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之線性、不連續或構形第一抗原決定基可排除SEQ ID NO: 177之一或多個胺基酸，其包含對應於TDVLNQSKPVTL之序列內的第1至第11位置。
另外或替代地，由本發明之結合分子，諸如本發明之第一態樣之HMCV病毒株未定性結合分子結合之線性、不連續或構形第一抗原決定基中可排除TDVLNQSKPVTL之一或多個胺基酸。
舉例而言，SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第1位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第2位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第3位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第4位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第5位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第6位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第7位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第8位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第9位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第10位置。SEQ ID NO: 177內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第11位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第12位置。
本發明之第一態樣之結合分子，諸如本發明之第一態樣之HMCV病毒株未定性結合分子所針對而具有結合特異性的第一抗原決定基較佳為大於90%之已知臨床及/或實驗室HCMV病毒株(包括至少本申請案中所揭示之所有HCMV病毒株)，例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或實質上100% (例如，90%與100%之間、91%與100%之間、92%與100%之間、93%與100%之間、95%與100%之間、96%與100%之間、97%與100%之間、98%與100%之間、99%與100%之間)之臨床及/或實驗室HCMV病毒株(包括至少本申請案中所揭示之所有HCMV病毒株)共有的且存在於其內的抗原決定基。
在一個較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子所針對而具有結合特異性之第一抗原決定基中的胺基酸可包括由以下結合的ECD1內之抗原決定基中的胺基酸或與該等胺基酸一致：如本文所描述之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11抗體中之任一者或多者(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID NO: 187、211、233所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
H序列的V
H多肽序列及具有分別如由SEQ ID NO: 189、213及235所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
L序列的V
L多肽序列)，或與該抗原決定基相差不超過5、4、3、2或1個胺基酸。
本發明之第一態樣之結合分子，諸如本發明之第一態樣之HMCV病毒株未定性結合分子所針對而視情況亦具有另外結合特異性的第二抗原決定基較佳為序列TKKNNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO: 6，對應於US28之ECD3之4N變體)及序列TKKDNQCMTDYDYLEVS(SEQ ID NO: 7，對應於ECD3之4D變體)共有的且存在於該等序列內的抗原決定基。換言之，本發明之第一態樣之結合分子所針對而視情況亦具有結合特異性的US28之ECD3內的抗原決定基較佳排除SEQ ID NO: 6及7中之每一者之第4個胺基酸殘基，其對應於4N變體中之N及4D變體中之D。
在線性ECD3抗原決定基之情況下，則視情況，4N變體及4D變體共有的且存在於此兩者內且排除第4變異胺基酸殘基的抗原決定基可包括序列NQCMTDYDYLEVS之所有13個胺基酸，或其任何12、11、10、9、8、7、6、5、4、3個或更少的胺基酸，其可視情況為該序列之連續胺基酸。
在其中第二抗原決定基為US28蛋白之ECD3內(較佳完全在其內)之不連續及/或構形抗原決定基的另一選項中，則不連續抗原決定基可包括TKK
NNQCMTDYDYLEVS之4N變體ECD3序列及/或TKK
DNQCMTDYDYLEVS之4D變體ECD3序列的17個胺基酸中的任何3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個。
ECD3內之線性不連續或構形抗原決定基可排除US28之ECD3之一或多個胺基酸，其包含對應於4N變體中之TKK
NNQCMTDYDYLEVS及4D變體中之TKK
DNQCMTDYDYLEVS之序列內的第1至第17位置。
在一個較佳實施例中，ECD3內之線性不連續或構形第二抗原決定基較佳排除已知在不同HCMV病毒株之間變化之第4位置(N/D)。
另外或替代地，視情況由本發明之結合分子，諸如本發明之第一態樣之HMCV病毒株未定性結合分子結合的線性不連續或構形第二抗原決定基中可排除US28之ECD3之一或多個胺基酸。
舉例而言，ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第1位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第2位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第3位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第5位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第6位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第7位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第8位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第9位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第10位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第11位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第12位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第13位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第14位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第15位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第16位置。ECD3內之線性、不連續或構形抗原決定基可另外或替代地排除第17位置。
本發明之第一態樣之結合分子(諸如本發明之第一態樣之HMCV病毒株未定性結合分子)所針對而視情況亦具有結合特異性的第二抗原決定基較佳為大於90%之已知臨床及/或實驗室HCMV病毒株(包括至少本申請案中所揭示之所有HCMV病毒株)，例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或實質上100% (例如，90%與100%之間、91%與100%之間、92%與100%之間、93%與100%之間、95%與100%之間、96%與100%之間、97%與100%之間、98%與100%之間、99%與100%之間)之臨床及/或實驗室HCMV病毒株(包括至少本申請案中所揭示之所有HCMV病毒株)共有的且存在於其內的抗原決定基。
在一個較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子所針對而可視情況具有結合特異性的第二抗原決定基中之胺基酸可包括由以下結合的ECD3內之抗原決定基中的胺基酸或與該等胺基酸一致：如本文所描述之US28-13-5G6-1D3、13-1C10-1C10、13-1H3-1A10、13-1C10-1G9、14-4E4-1E8抗體(在本文中通常分別縮寫為「1D3」、「1C10」、「1A10」、「1G9」及「1E8」)中之任一者或多者(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID NO: 12、104、122、68及88所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
H序列的V
H多肽序列及具有分別如由SEQ ID NO: 18、108、126、72及92所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
L序列的V
L多肽序列)，或與該抗原決定基相差不超過5、4、3、2或1個胺基酸。
結合特性：
如本申請案之實例中所報導，針對US28之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽的多種單株抗體藉由使用本文所描述之方法產生，且展示其良好且特異性結合於過度表現US28之US28-CHO-A1細胞及感染HCMV之人類肺組織上的表示ECD1內之保守抗原決定基之肽。
此外，針對US28之ECD3的多種單株抗體藉由使用本文所描述之方法產生，且展示其良好且特異性結合在US28 ECD3肽之遺傳變體及過度表現US28之US28-CHO-A1細胞上，且自其之某些示例性抗體經進一步測試且展示向以下提供極佳結合特性：經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞、來自HCMV血清反應呈陽性之個體之初級PBMC、感染HCMV之人類肺組織及若干類型之侵襲性人類腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤。
此等單株抗體為根據本發明之ECD1及ECD3結合分子的示例性實施例，其可以多特異性型式組合。
本文描述可用於評估根據本發明之第一態樣之結合分子之特性的各種分析。在此等分析中，「參考結合分子」被指定為一種比較，其係關於本文針對ECD1或ECD3所展示之特定參考結合分子。在根據本發明之第一態樣之結合分子能夠結合於ECD1中之由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的抗原決定基的情況下，參考結合分子將為ECD1參考結合分子，諸如4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4。在根據本發明之第一態樣之結合分子亦能夠結合於ECD3內的抗原決定基的情況下，參考結合分子將為用於評估ECD3結合之ECD3參考結合分子，諸如1D3、1C10、1A10、1G4及/或1E8。因此，多特異性結合分子可具有針對ECD1參考結合分子評估之其ECD1結合域及針對ECD3參考結合分子評估之其ECD3結合域。
更特定言之，對於ECD1，如本文所描述之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11抗體(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID NO: 187、211及233所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
H序列的V
H多肽序列及具有分別如由SEQ ID NO: 189、213及235所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
L序列的V
L多肽序列)為根據本發明之較佳示例性結合分子，儘管已產生其他結合分子且本發明之第一態樣之範疇不僅不限於4H3C3、7B1F3及/或2F5B11，而且亦不限於自其衍生之結合分子(諸如共有4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之CDR的其他結合分子)，不過此等可表示各種較佳實施例。然而，4H3C3、7B1F3及/或2F5B11抗體(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID NO: 187、211及233所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
H序列的V
H多肽序列及具有分別如由SEQ ID NO: 189、213、235所定義之4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之V
L序列的V
L多肽序列)可提供用於表徵根據本發明之第一態樣之其他結合分子之結合特性的有用基準。
此外，對於ECD3，如本文所描述之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8抗體(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID No: 12、104、122、68及88所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
H序列的V
H多肽序列及具有分別如由SEQ ID No: 18、108、126、72及92所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
L序列的V
L多肽序列)為根據本發明之較佳示例性結合分子，儘管已產生其他結合分子且本發明之第一態樣之範疇不僅不限於1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8，而且亦不限於自其衍生之結合分子(諸如共有1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之CDR的其他結合分子)，不過此等可表示各種較佳實施例。然而，1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8抗體(其中其亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID No: 12、104、122、68及88所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
H序列的V
H多肽序列及具有分別如由SEQ ID No: 18、108、126、72及92所定義之1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
L序列的V
L多肽序列)可提供用於表徵進一步包括對ECD3之特異性的根據本發明之第一態樣之其他結合分子之結合特性的有用基準。
舉例而言，當在分別與4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4相同之條件下測試時，對US28蛋白之ECD1內之由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性(且視情況亦對ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性)的根據本發明之第一態樣之結合分子可展現與4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4 (及視情況當在分別與1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8相同之條件下測試時，與1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8)中之任一者或多者之結合特性類似或實質上等效的結合特性。
在結合分子對ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽及對ECD3均具有特異性的多特異性型式中，根據本發明之第一態樣之結合分子可展現與如本文所描述之適當ECD1結合分子(諸如4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4中之任一者或多者)之結合特性類似或實質上等效的ECD1結合特性；及/或與如本文所描述之適當ECD3結合分子(諸如1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8中之任一者或多者)之結合特性類似或實質上等效的ECD3結合特性。
在彼等情形下，當在分別與4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4相同之條件下測試時，若根據本發明之第一態樣之結合分子顯示與4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4 (及/或視情況1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8)類似或實質上等效的結合特異性、類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性及/或類似或實質上等效的結合親和力，則該結合分子可視為具有與4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4 (及/或視情況當在分別與1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8相同之條件下測試時，與1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8)「類似或實質上等效的結合特性」。此類測試可例如對應於本申請案中所報導用於評定4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4 (及/或視情況1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8)之結合特性的測試中之任一者或多者，例如為測定與在以下之上的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽、US28 ECD3肽之結合所進行的測試中之任一者或多者：過度表現US28之US28-CHO-A1細胞、經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞、來自HCMV血清反應呈陽性之個體之初級PBMC、感染HCMV之人類肺組織及若干類型之侵襲性人類腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤。
若在用以測定特異性結合至以下之能力的任一或多個測試下：US28 ECD1及/或ECD3肽(相比於陰性對照，諸如BSA)、表現US28之細胞(相比於不表現US28的等效細胞)、HCMV感染細胞(相比於不具有HCMV感染之等效細胞)、來自HCMV血清反應呈陽性之個體的初級PBMC (相比於來自HCMV血清反應呈陰性之個體之初級PBMC)、感染HCMV之人類肺組織(相比於未經感染HCMV之人類肺組織)及/或HCMV感染之人類腫瘤之類型，尤其侵襲性腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤(相比於未感染HCMV之等效非癌細胞)，根據本發明之第一態樣之結合分子顯示本發明之一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子的至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或實質上100%之結合特異性，則結合分子可視為具有與各別ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的結合特異性。在前述測試中之任一者或多者下，根據本發明之第一態樣之某些結合分子可具有與ECD1及/或ECD3參考結合分子之結合特異性類似或實質上等效的結合特異性，儘管如此，其仍然低於各別ECD1及/或ECD3參考結合分子之結合特異性；然而在前述測試中之任一者或多者下，根據本發明之第一態樣之某些其他結合分子可具有比各別ECD1及/或ECD3參考結合分子高的結合特異性。
若在用以測定特異性結合至以下的能力的任一或多個測試下：如本文所描述之SEQ ID NO: 177之ECD1保守抗原決定基及/或4D及4N變體US28 ECD3肽中之每一者(均相比於陰性對照，諸如BSA)、4D及4N變體表現US28之細胞中之每一者(各自相比於不表現US28之等效細胞；且視情況其中US28之4D及4N變體分別為由TB40/E及HCMV之病毒株編碼之US28序列，及/或進一步視情況其中細胞為CHO細胞)、4D及4N變體US28編碼HCMV病毒株感染細胞中之每一者(各自相比於不具有HCMV感染之等效細胞)、來自4D及4N變體US28編碼HCMV病毒株血清反應呈陽性之個人的初級PBMC (相比於來自HCMV血清反應呈陰性之個人的初級PBMC)、經4D及4N變體US28編碼HCMV病毒株感染之人類肺組織中之每一者(相比於未感染HCMV之人類肺組織)及/或HCMV感染之人類腫瘤之4D及4N變體US28編碼HCMV病毒株類型中之每一者，尤其侵襲性腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤(相比於未感染HCMV之等效非癌細胞)，根據本發明之第一態樣之結合分子顯示與ECD1參考結合分子相比與HCMV病毒株無關之結合，及/或與由ECD3參考結合分子所示之等效結合類似或實質上等同(例如±30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小)的與4D及4N變體之等效結合，則結合分子可視為具有與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性。
若在用以測定與以下之背景結合的任一或多個測試下：不表現US28之細胞(相比於經工程改造以表現US28之等效細胞)、HCMV未感染之細胞(相比於經HCMV感染之等效細胞)、來自HCMV血清反應呈陰性之個體的初級PBMC (相比於來自HCMV血清反應呈陽性之初級PBMC)、未感染HCMV之人類肺組織(相比於感染HCMV之人類肺組織)及/或未感染HCMV之人類腫瘤的類型(相比於感染HCMV之等效癌細胞，尤其侵襲性腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤)，背景結合分子顯示至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或實質上100%的一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子之背景結合，則根據本發明之第一態樣之結合分子可視為具有與各別ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效之背景結合。在前述測試中之任一者或多者下，根據本發明之第一態樣之某些結合分子可具有與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子之背景結合類似或實質上等效的背景結合，儘管如此，其仍然高於各別ECD1及/或ECD3參考結合分子之背景結合；然而在前述測試中之任一者或多者下，根據本發明之第一態樣之某些其他結合分子可具有比各別ECD1及/或ECD3參考結合分子低的結合特異性。替代地或另外，在以上測試中之任一者或多者下，與VUN100 (單價VUN100及/或二價VUN100)之背景結合相比，根據本發明之第一態樣的某些結合分子可具有較低背景結合(例如，小於95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%或小於1%)。
若在用以測定與以下之結合親和力的任一或多個測試下：US28 ECD1及/或ECD3肽、表現US28之細胞、HCMV感染細胞、來自HCMV血清反應呈陽性之個人的初級PBMC、感染HCMV之人類肺組織及/或感染HCMV之人類腫瘤之類型，尤其侵襲性腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤，根據本發明之第一態樣之結合分子顯示以Kd形式表示的在一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子之結合親和力之例如6、5、4、3、2或1個數量級內的結合親和力，則結合分子可視為具有與各別ECD1及/或ECD3參考結合分子實質上等效(例如，±20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小)的結合親和力。在前述測試中之任一者或多者下，根據本發明之第一態樣之某些結合分子可具有比一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子低的結合親和力；然而在前述測試中之任一者或多者下，根據本發明之第一態樣之某些其他結合分子可具有比一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子高的結合親和力。應注意，例如在尤其高結合親和力可能欠佳之CAR的情形下，較高結合親和力並非必需始終合乎需要的，且具有較高結合特異性之CAR一般產生比高結合親和力之CAR更大的治療效益。
根據本發明之第一態樣之結合分子可視為具有前述特性中之任一者或多者。舉例而言，結合分子可視為具有以下特性中之一或多者(其中之每一者更詳細地描述於上文)：
1. 與一或多種ECD1參考結合分子類似或實質上等效的結合特異性；
2. 與一或多種ECD3參考結合分子類似或實質上等效的結合特異性；
3. 與一或多種ECD1參考結合分子類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性；
4. 與一或多種ECD3參考結合分子類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性；
5. 與一或多種ECD1參考結合分子類似或實質上等效的背景結合；
6. 與一或多種ECD3參考結合分子類似或實質上等效的背景結合；
7. 與VUN100 (單價VUN100及/或二價VUN100)之背景結合相比，較低背景結合；
8. 與VUN100 (單價VUN100及/或二價VUN100)之結合相比，更大的病毒株未定性結合；
9. 與VUN100 (單價VUN100及/或二價VUN100)之結合相比，更高的結合特異性；
10. 與一或多種ECD1參考結合分子實質上等效的結合親和力；及/或
11. 與一或多種ECD3參考結合分子實質上等效的結合親和力。
舉例而言，結合分子可具有(i)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性；及(ii)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的背景結合，在其他實施例中，結合分子可具有(i)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性；及(ii)比VUN100 (單價VUN100及/或二價VUN100)之背景結合低的背景結合。在其他實施例中，結合分子可具有(i)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性；(ii)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的背景結合；及(iii)比VUN100 (單價VUN100及/或二價VUN100)之背景結合低的背景結合。在其他實施例中，結合分子可具有(i)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的病毒株未定性結合特性；(ii)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的背景結合；(iii)比VUN100 (單價VUN100及/或二價VUN100)之背景結合低的背景結合；及(iv)與一或多種ECD1及/或ECD3參考結合分子類似或實質上等效的結合特異性。
在下文論述用於表徵根據本發明之第一態樣之結合分子之結合特性的其他視情況選用之分析。
(a) 分析 1 ：如本申請案的圖5中所示，根據本發明的示例性ECD3結合分子，針對來源於US28之ECD3之肽序列產生的單株抗體1D3與陰性對照BSA相比具有特異性結合於來源於US28之ECD3之肽序列的能力。
該分析中所用之肽序列命名為肽-1，其具有序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6，對應於ECD3之4N變體)，及肽-2，其具有序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7，對應於ECD3之4D變體)。
如圖5中所指示，相比於BSA對照，1D3抗體展示與肽1及2中之每一者多大致27至28倍的特異性結合；且觀測到的1D3與肽1及2之結合程度(均作為絕對程度且在針對相應BSA對照標準化時)基本上相同(例如，差異小於5%，且很可能在實驗誤差之區內)。此等結果清楚地展示1D3對US28之ECD3具有特異性，且亦係病毒株未定性。
相比之下，WO 2019/151865之VUN100 (具有本申請案之SEQ ID NO: 60之序列)的結合特性極其不同。據報導，其結合於US28之N端區(在不同HCMV病毒株之間具有較高序列變化程度之US28之區)中之抗原決定基。VUN100展示具有相對較低的結合特異性程度；De Groof等人, 2019(同上)在其支持資訊、其圖S1.A及本申請案表2中報導特異性分數為4。另外，VUN100展示HCMV之VHL/E、Merlin與TB40/E病毒株之間相當大的結合差異，其中結合在病毒株TB40/E (B1類型)中尤其減少，僅約針對Merlin病毒株所觀測到之結合程度的一半(WO 2019/151865之圖8D)。在可在線獲得之De Groof等人2020 (doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.071860)之預印文章中報導了VUN100之進一步表徵，其中補充資料之圖2給出來自四個不同HCMV血清反應呈陽性之供體之由VUN100結合之經誘導HCMV IE陽性CD14+單核球%之結果，其中未測定各供體內之HCMV之病毒株。由與此等細胞結合之VUN100誘導之IE陽性程度在不同供體之間變化至多14倍。此可視為VUN100之結合能力在感染不同HCMV病毒株之細胞之間顯著變化的另一指示。與本發明的結合分子相比，VUN100的此等不利特性在本申請案的實例中進一步得到證實，具體參看圖21A-E、圖22及圖23。
因此，在一個實施例中，除抗SEQ ID NO: 177結合特異性外具有抗ECD3結合特異性之本發明之第一態樣之結合分子(及/或本發明之第一態樣之結合分子可一起組合成調配物的具有抗ECD3結合特異性之第二結合分子)的特徵可在於，在結合分析中，在其中參考抗體(其中該參考抗體為1D3)相比於相同陰性對照顯示與肽1及/或肽2 (較佳兩者)更大程度地結合的條件下，若結合分子顯示相比於陰性對照(諸如BSA)，與肽1及/或肽2 (較佳兩者)更大程度地結合，則其具有與HCMV之US28蛋白之ECD3內的抗原決定基之結合特異性。在另一實施例中，參考結合分子可選自由1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8組成之群組。
在另一或替代實施例中，具有抗SEQ ID NO: 177結合特異性之本發明之第一態樣之結合分子(視情況其中該結合分子另外具有抗ECD3結合特異性，及/或具有抗ECD3結合特異性之結合分子可一起組合成調配物的具有抗SEQ ID NO: 177結合特異性之第一結合分子)的特徵可在於，在結合分析中，在其中參考抗體(其中該參考抗體為4H3C3、7B1F3及/或2F5B11)相比於相同陰性對照顯示與肽-N更大程度地結合的條件下，若結合分子顯示相比於陰性對照(諸如BSA)，與肽-N更大程度地結合，則其對HCMV之US28蛋白之SEQ ID NO: 177內的抗原決定基具有結合特異性。
在另一或替代實施例中，除抗SEQ ID NO: 177特異性外具有抗ECD3結合特異性之本發明之第一態樣之結合分子(及/或本發明之第一態樣之結合分子可一起組合成調配物的具有抗ECD3結合特異性之第二結合分子)的特徵可在於，若在前述分析中所觀測到的結合分子針對肽1及2中之每一者的各別結合程度(呈絕對程度及/或當針對各別陰性對照(諸如BSA)對照所觀測到之結合程度標準化時)基本上相同，諸如在彼此的30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內，則結合分子具有與ECD3之病毒株未定性結合性。
除抗SEQ ID NO: 177特異性外具有抗ECD3結合特異性之本發明之第一態樣之結合分子(及/或本發明之第一態樣之結合分子可一起組合成調配物的具有抗ECD3結合特異性之第二結合分子)對US28蛋白之ECD3內之抗原決定基的結合特異性可例如在ELISA，諸如如本申請案之實例中所述的方法，或藉由該方法之變體，諸如藉由在微量滴定盤中之第一組孔中塗佈來源於ECD3之肽(諸如生物肽1及/或生物肽2)及在第二微量滴定盤中塗佈陰性對照(諸如BSA)來評定。第一組孔可視情況進一步再分為第一組孔之第一子組，其包含US28之ECD3之4N變體之序列，及第一組孔之第二子組，其包含US28之ECD3之4D變體之序列，以准許測定針對各變體之相對結合特異性。在塗佈第一組及第二組孔之後，相關結合分子可在第一組及第二組孔中之每一者中培育，視情況其中在對應的第一組及第二組孔中額外測試陽性對照(例如1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8中之任一者或多者)。在培育之後，可洗滌孔且隨後與酶結合之二級抗體一起培育。在進一步洗滌之後，可添加用於結合酶之受質，其經歷可量測之反應(例如顏色變化、吸光度)，與結合分子及對照之結合量相關，此提供結合特異性及/或病毒株未定性結合特徵之指示。因此，在一些實施例中，相較於與陰性對照(諸如BSA)的結合，相關結合分子在ELISA之後具有吸光度值，該值指示與第一組孔中來源於ECD3的肽1及/或2中的一或多者(較佳兩者)的陽性結合。
藉由「陽性結合」，吾等包括相關結合分子與陰性對照(例如BSA)之結合程度相比，可具有較高的與肽1及/或2中之一或多者(較佳兩者)的結合程度，其指示較高的結合特異性。
其例如在抗體1D3顯示與肽1及/或肽2之結合比諸如BSA之陰性對照大約27倍至28倍的條件下，顯示與肽1及/或肽2之結合比諸如BSA之陰性對照大至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、約26倍、約27倍或約28倍。如在此情形下所用之術語「約」可包括所陳述值之±50%、40%、30%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的值(例如至少約10倍之±10%係指9倍至11倍之範圍)。舉例而言，用於此類分析之條件可經選擇與用於產生圖5中所示之結果的分析中所用之條件相同或等效。
替代地或另外，「陽性結合」可包括相關結合分子具有與陽性對照(例如1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8)相比類似(例如至少±50%、40%、30%、20%、10%、5%或更小)或更高/增加/提高/改進的吸光度程度。
(b)
分析 2 ：
在另一實施例中，較佳地，例如在1:50 (w/v)稀釋下，例如如藉由流動式細胞測量術分析所測定，相比於本發明之結合分子與US28陰性細胞(諸如野生型CHO細胞)之結合，其優先與表現US28之細胞(諸如經工程改造以表現US28之CHO細胞)結合。表現US28之細胞較佳為以展示US28蛋白細胞表面表現為特徵之細胞。US28之表面表現通常特徵在於在細胞表面上展示US28之胞外域(ECD 1、2、3及4分別對應於由如由SEQ ID NO: 5之序列所定義的HCMV病毒株DB或其他HCMV病毒株之等效序列編碼之US28蛋白之位置1-37、位置91-101、位置167-183及位置250-273)。
本申請案之圖4、7及表2展現本申請案之示例性抗ECD3結合分子，針對US28之ECD3產生的單株抗體1D3，具有與US28陰性對照CHO細胞相比特異性結合於表現US28之中國倉鼠卵巢(CHO-US28-A1)細胞的能力，其中特異性分數在所用結合條件下為約15至21.5。此可使用任何適合技術，例如使用FACS分析來分析，以測定結合的總細胞計數百分比。如本申請案之實例1中進一步報導，特別參考表2，儘管純系US28-13-5G6-1D3 (編碼抗體1D3)經最充分表徵，但針對US28之ECD3產生的其他選殖單株抗體在同其與US28陰性對照CHO細胞之結合相比時，展示對CHO-US28-A1細胞之極佳結合特異性。如實例2中進一步報導，在同其與US28陰性對照CHO細胞之結合相比時，針對US28之ECD3產生的其他選殖單株抗體仍然展示對CHO-US28-A1細胞之極佳結合特異性，尤其在同其與US28陰性對照CHO細胞之結合相比時，具有極低的脫靶結合(例如與由VUN100展現之更高的脫靶結合程度相比)且在許多情況下亦會展示對CHO-US28-A1細胞之較高結合特異性。
此等資料清楚地證實，藉由遵循本申請案之教示內容，提供一致的產生針對US28之ECD3產生之抗體的途徑，該等抗體相比於US28陰性細胞(諸如US28陰性CHO細胞)之結合，可提供與表現US28之細胞(諸如CHO細胞)之高度特異性結合，較佳具有較低的脫靶結合程度，為VUN100並不共有之一組特徵。
相比之下，WO 2019/151865之VUN100 (具有本申請案之SEQ ID NO: 60之序列)的結合特性極其不同。據報導，其結合於US28之N端區與ECD4區之間，在不同HCMV病毒株之間具有較高序列變化程度之US28之區內的抗原決定基。當測試VUN100與表現US28之HEK293T膜(HEK+US28)或經模擬轉染之HEK293T膜之結合時，其展示具有相對低程度之結合特異性：De Groof等人, 2019(同上)在其支持資訊、其圖S1.A (且概述於本申請案之表2中)中報導特異性分數為4。VUN100顯然不能夠提供與US28的高度特異性結合。與本發明的結合分子相比，VUN100的此等不利特性在本申請案的實例中進一步得到證實，具體參看圖21A-E、圖22、圖23及圖24。
因此，在一個較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子將顯示特異性結合，其特徵在於：與US28陰性細胞(諸如CHO細胞)相比，其對於表現US28之細胞(諸如CHO-US28-A1細胞，視情況其中US28序列對應於由HCMV之病毒株DB或TB40/E編碼之序列)的結合特異性大於由VUN100達成之特異性程度。舉例而言，本發明之第一態樣之結合分子的特異性程度可比VUN100在相同分析中相同莫耳濃度下達成的特異性程度大至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約80%、約90%、約100% (亦即約2倍)、約150倍、約200% (亦即約3倍)、約300% (亦即約4倍)、約400% (亦即約5倍)或約500% (亦即約6倍)。在此情形下，VUN100比較物可指代一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO: 60-64之序列中之任一者或多者的序列、基本上由其組成或由其組成(例如單價VUN100、二價VUN100或其混合物，諸如其1:1混合物，各如本文中進一步描述)。在SEQ ID NO: 61及63之情形下，此可包括具有或不具有指定信號肽序列之蛋白質。
在另一較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子將顯示特異性結合，其特徵在於在相同分析中相同莫耳濃度下，其對於表現US28之細胞(諸如CHO-US28-A1細胞，視情況其中US28序列對應於由HCMV之病毒株DB或TB40/E編碼之序列)相比於US28陰性細胞(諸如CHO細胞)的結合特異性與4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4 (及/或視情況1D3、1C10、1A10、1G4及/或1E8)中之任一者或多者至少約為相同特異性程度。如在此情形下所用之術語「約」可包括在相同分析中相同莫耳濃度下，1D3、1C10、1A10、1G4及/或1E8中之任一者或多者之特異性程度之±80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的值。
在此情形下，4H3C3、7B1F3及/或2F5B11比較物可指包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的抗體分子：
如由SEQ ID NO: 180所定義之4H3C3之重鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)及如由SEQ ID NO: 181所定義之4H3C3之輕鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)；
如由SEQ ID NO: 204所定義之7B1F3之重鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)及如由SEQ ID NO: 205所定義之7B1F3之輕鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)；或
如由SEQ ID NO: 226所定義之2F5B11之重鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)及如由SEQ ID NO: 227所定義之2F5B11之輕鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)。
視情況，在此情形下，1D3、1C10、1A10及/或1E8比較物可指包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的抗體分子：
如由SEQ ID NO: 20所定義之1D3之重鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)及如由SEQ ID NO: 21所定義之1D3之輕鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)；
如由SEQ ID NO: 157所定義之1C10之重鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)及如由SEQ ID NO: 158所定義之1C10之輕鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)；
如由SEQ ID NO: 161所定義之1A10之重鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)及如由SEQ ID NO: 162所定義之1A10之輕鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)；或
如由SEQ ID NO: 153所定義之1E8之重鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)及如由SEQ ID NO: 154所定義之1E8之輕鏈多肽序列(在移除指定N端前導序列之後)。
可例如進行此類分析以測定與表現US28之細胞(諸如CHO-US28-A1細胞，視情況其中US28序列對應於由HCMV之病毒株DB或TB40/E編碼之序列)及與US28陰性細胞(諸如CHO細胞)之相對結合，例如以等效於4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之1:5 (w/v)稀釋及視情況1D3、1C10、1A10及/或1E8之1:50 (w/v)稀釋的莫耳比，例如如藉由流動式細胞測量分析測定。
(c)
分析3：
在另一實施例中，較佳地，與本發明之第一態樣之結合分子同不具有HCMV感染之等效細胞之結合相比，該結合分子可優先結合於HCMV感染細胞(諸如MRC-5細胞；cat#CCL-171, RRID: CVCL_0440, 美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC), Manassas, VA 20110 USA)。如本申請案之圖8中所示，當使用流動式細胞測量術分析進行分析時，根據本申請案之示例性ECD3結合分子，針對US28之ECD3產生之單株抗體1D3，具有結合於經HCMV感染之MRC-5細胞但不結合於未感染(模擬)細胞之能力。在所使用之分析條件下，相比於與未感染(模擬)細胞之0%結合，1D3展示與HCMV感染細胞之約5.4%結合。如圖9中所示，進一步測試展示，1D3與經HCMV感染之HRC-5細胞相比於未感染細胞之表面特異性結合(具有大大致16倍之特異性)。
因此，在另一較佳實施例中，與同不具有HCMV感染之等效細胞之結合相比，本發明之第一態樣之結合分子將顯示與HCMV感染細胞(諸如MRC-5細胞)之優先結合，該優先結合大或至少大5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍或約16倍。此類分析可例如根據用於產生本申請案之圖8或圖9中所示之結果的方案或使用等效方案進行。如在此情形下所用之術語「約」可包括為所陳述值之±50%、40%、30%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的值。
在另一較佳實施例中，與同不具有HCMV感染之等效細胞之結合相比，本發明之第一態樣之結合分子將顯示與HCMV感染細胞(諸如MRC-5細胞)之優先結合，該優先結合大於由VUN100達成之優先結合程度。舉例而言，本發明之第一態樣之結合分子之優先結合程度可比由VUN100在相同分析中相同莫耳濃度下達成之優先結合程度大至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約80%、約90%、約100% (亦即約2倍)、約150倍、約200% (亦即約3倍)、約300% (亦即約4倍)、約400% (亦即約5倍)或約500% (亦即約6倍)。在此情形下，VUN100比較物可指代一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO: 60-64之序列中之任一者或多者的序列、基本上由其組成或由其組成(例如單價VUN100、二價VUN100或其混合物，諸如其1:1混合物，各如本文中進一步描述)。在SEQ ID NO: 61及63之情形下，此可包括具有或不具有指定信號肽序列之蛋白質。
相比於本發明之第一態樣之結合分子與不具有HCMV感染之等效細胞的結合，該結合分子可例如顯示與HCMV感染細胞之優先結合，該優先結合為或至少為本發明之參考抗體(例如4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4中之任一者或多者，及視情況1D3、1C10、1A10、1G4、1G9及/或1E8中之任一者或多者)在相同條件下之優先結合活性的約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或實質上100%。如在此情形下所用之術語「約」可包括為所陳述值之±50%、40%、30%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的值(例如10%之±50%係指5%至15%之範圍)。舉例而言，此類分析之條件可經選擇以與用於產生圖8或圖9中所示之結果的分析中所用之條件相同或等效。
(d)
分析 4：
在另一實施例中，較佳地，與由「清單A」及/或「清單B」 (參見實例4)表示之標記物中之任一者或多者，諸如全部相比，本發明之第一態樣之結合分子可優先結合於SEQ ID NO: 177內之抗原決定基。與SEQ ID NO: 177內之抗原決定基的優先結合可使用例如「肽3」 (TDVLNQSKPVTL)評定。
優先結合之測定視情況可使用實例4中所描述之技術評定。例如，與來自清單A及/或清單B之任一或多個目標，包括但不限於HSPD1 (亦稱為HSP60)及/或ITGA6 (整合素α 6，亦稱為CD49f)相比，對肽3之優先結合可為至少10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍、10,000倍或更高的光點強度(F635)/AU。
替代地或另外，優先結合之測定可使用實例5中所描述之技術評定。例如，相比於由清單C定義之其他人類質膜蛋白及/或由清單D定義之人類雜二聚體中之任一者或多者，諸如全部，優先結合可為增加之肽3命中率(基於藉由分析ImageQuant上之螢光(例如使用AF647及ZsGreen 1)之一式兩份光點)。
(e)
分析 5 ：
在另一實施例中，較佳地，本發明之第一態樣之結合分子展現與US28之SEQ ID NO: 177內之抗原決定基病毒株的未定性結合性。病毒株未定性結合性可使用例如由HCMV病毒株VHL/E、DB、TB40/E及/或Merlin中之兩者、三者或全部四者編碼之US28蛋白評定。
病毒株未定性結合性之測定可例如使用實例8中所描述之技術評估。舉例而言，病毒株未定性結合性之特徵可在於，由HCMV病毒株VHL/E、DB、TB40/E及/或Merlin中之兩者、三者或全部四者編碼之US28蛋白之間的結合變化程度小於如由實例8中所用的二價VUN100所展現的在相同US28蛋白之間的結合變化程度(諸如小至少50、40、30、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2倍)。另外或替代地，病毒株未定性結合性之特徵可在於，顯示由HCMV病毒株VHL/E、DB、TB40/E及/或Merlin中之兩者、三者或全部四者編碼之US28蛋白之間的結合變化程度與如實例8中所描述的抗體2F5B11、4H3C3及7B1F3中之任一者或多者所展現的變化程度實質上等效。在本文使用之上下文中，術語實質上等效可視情況包括當在一致條件下測試時與抗體2F5B11、4H3C3及7B1F3中之任一者或多者所展現的變化程度相差小於50、40、30、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2的程度。
多肽
根據本發明之第一態樣之結合分子包含一或多條多肽鏈、基本上由其組成或由其組成。
「多肽」在本文中以其最廣泛意義使用，係指兩種或更多種子單元胺基酸、胺基酸類似物或其他肽模擬物之化合物。因此，術語「多肽」包括短肽序列且亦包括較長多肽及蛋白質。如本文所用之術語「胺基酸」包括標準二十種基因編碼胺基酸及其呈『D』形式(與天然『l』形式相比)之對應立體異構體、ω-胺基酸、其他天然存在之胺基酸、非習知胺基酸(例如α,α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸等)及化學衍生胺基酸(參見下文)。
本文中之胺基酸可藉由全稱、三字母編碼或單字母編碼指代。當具體列舉胺基酸，諸如「丙胺酸」或「Ala」或「A」時，除非另外明確說明，否則該術語係指l-丙胺酸及d-丙胺酸兩者。其他非習知胺基酸亦可為本發明之多肽之適合組分，只要多肽保留所需功能特性即可。對於所示肽，各編碼胺基酸殘基適當時由單一字母名稱表示，該名稱對應於習知胺基酸之常用名。
在一個實施例中，如本文所定義之多肽包含l-胺基酸或由其組成。
熟習此項技術者應瞭解，本發明及/或如本文結合本發明所描述使用之多肽可包含已經修飾或衍生之一或多個胺基酸或由其組成。
一或多個胺基酸之化學衍生物可藉由與功能側基反應來達成。此類衍生分子包括例如已衍生游離胺基形成胺鹽酸鹽、對甲苯磺醯基、羧基苯氧基、三級丁氧基羰基、氯乙醯基或甲醯基之彼等分子。游離羧基可經衍生以形成鹽、甲酯及乙酯或其他類型之酯及醯肼。游離羥基可經衍生以形成O-醯基或O-烷基衍生物。亦包括含有二十種標準胺基酸之天然存在之胺基酸衍生物的彼等肽作為化學衍生物。舉例而言：4-羥脯胺酸可取代脯胺酸；5-羥離胺酸可取代離胺酸；3-甲基組胺酸可取代組胺酸；高絲胺酸可取代絲胺酸及鳥胺酸取代離胺酸。衍生物亦包括含有一或多個添加或缺失之肽，只要維持必需的活性即可。其他所包括之修飾為醯胺化、胺基端醯化(例如乙醯化或硫代乙醇酸醯胺化)、末端羧基醯胺化(例如用氨或甲胺)及其類似末端修飾。
熟習此項技術者應進一步瞭解，肽模擬化合物亦可為有用的。術語『肽模擬物』係指模擬特定肽之構形及期望特徵作為治療劑的化合物。
舉例而言，該多肽不僅包括胺基酸殘基藉由肽(-CO-NH-)鍵聯接合之分子，而且包括其中肽鍵發生逆轉之分子。此類逆轉肽模擬物可使用此項技術中已知之方法，例如Meziere等人(1997, 《免疫學雜誌(
J. Immunol.)》,
159(7): 3230-3237)中所述之方法製成。此方法涉及製成含有涉及主鏈而非側鏈之方向之變化的假肽。含有NH-CO鍵而非CO-NH肽鍵之逆轉肽對蛋白水解之抗性大得多。替代地，該多肽可為其中胺基酸殘基中之一或多者經-y(CH
2NH)-鍵而非習知醯胺鍵連接之肽模擬化合物。
在另一替代方案中，可完全省去肽鍵，條件為使用保留胺基酸殘基之碳原子之間的間距之適當連接部分；其可有利於連接部分具有與肽鍵實質上相同之電荷分佈及實質上相同之平面度。
亦應瞭解，該多肽可宜在其N端或C端處阻斷，以便幫助降低對胞外蛋白水解消化之易感性。
多種未經編碼或經修飾之胺基酸，諸如D-胺基酸及N-甲基胺基酸亦用於修飾哺乳動物肽。此外，假定生物活性構形可藉由共價修飾(諸如環化)或藉由併入內醯胺或其他類型之橋鍵而穩定化，例如參見Veber等人(1978, 《美國國家科學院院刊(
Proc. Natl. Acad. Sci. USA)》,
75:2636)及Thursell等人(1983, 《生物化學與生物物理研究通訊(
Biochem. Biophys.Res. Comm.)》
111:166)，其以引用之方式併入本文中。
結合分子結構：
根據本發明之第一態樣之「結合分子」通常包含一或多個多肽、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，結合分子(或其一部分)可經由多個多肽之組合形成。舉例而言，V
H多肽可與V
L多肽組合，在其中形成Fab片段。多肽之組合可為來自一個示例性ECD1結合分子之V
H多肽，其與同一示例性ECD1結合分子之V
L多肽組合，或與不同示例性ECD1結合分子之V
L多肽組合。在進一步包含ECD3結合域之多特異性型式中，ECD3結合域之多肽之組合可為來自一個示例性ECD3結合分子之V
H多肽，其與同一示例性ECD3結合分子之V
L多肽組合，或與不同示例性ECD3結合分子之V
L多肽組合。
在一些較佳實施例中，結合分子係選自由以下組成之群組：抗體及嵌合抗原受體(CAR)。
如上文所論述且進一步闡明於實例1之表2中以及實例2中，本申請案描述根據本文所描述之方法針對US28之ECD1之由SEQ ID NO: 177組成之多肽或ECD3產生之大量抗體，其對US28具有高度有益的結合特性，包括ECD1抗體4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及5E1E4；及ECD3抗體13-5G6-1D3 (本文中一般縮寫為「1D3」)、13-5C6-1B5、14-1H3-1A6、13-1C10-1C10 (本文中一般縮寫為「1C10」)、14-1H3-1A10 (本文中一般縮寫為「1A10」)、14-2C2-1G4 (本文中一般縮寫為「1G4」)、13-1C10-1G9 (本文中一般縮寫為「1G9」)及14-4E4-1E8 (本文中一般縮寫為「1E8」)。
如在本申請案之部分N中所進一步論述，本申請案亦提供一種根據本發明之第三十四態樣獲得對HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性之其他抗體的方法。舉例而言，該方法可包含：
(a) 提供一或多種對應於US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽中所存在之胺基酸序列的肽，其中該一或多種肽各自包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：多肽序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)及/或其免疫原性片段；
(b) 提供一或多種候選抗體(其視情況已響應於該肽而產生)；及
(c) 測定一或多種候選抗體與該一或多個肽之該結合特異性及/或結合親和力。
如在本申請案之部分N中所進一步論述，本申請案亦提供一種根據本發明之第三十四態樣獲得對HCMV之US28蛋白之ECD3內的抗原決定基具有結合特異性之其他抗體的方法。舉例而言，該方法可包含：
(a) 提供一或多種對應於US28蛋白之ECD3中所存在之胺基酸序列的肽，諸如一或兩個包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的該(等)肽：多肽序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)及/或TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)及/或任一者或兩者之免疫原性片段；
(b) 提供一或多種候選抗體(其視情況已響應於該等肽中之一或兩者而產生)；及
(c) 測定一或多種候選抗體對該等肽中之一或兩者的結合特異性及/或結合親和力。
在一些較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義之抗體4H3C3之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體4H3C3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體(諸如4H3C3人類化變體)，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義之抗體4H3C3之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 196 | SYWMH | 4H3C3之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 197 | YINPSTGYAEYNQKFKD | 4H3C3之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 198 | LRFGSSGFAY | 4H3C3之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 199 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 4H3C3之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 200 | WASTWES | 4H3C3之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 201 | QQYYSFPLT | 4H3C3之V L-CDR3序列 |
4H3C3人類化抗體之CDR序列之序列及一致性可藉由以下SEQ ID NO定義：
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 196 | SYWMH | 4H3C3之V H-CDR1序列 |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 197 | YINPSTGYAEYNQKFKD | 4H3C3之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 293 | YINPSTGYAEYNQKFQG | ||
| SEQ ID NO: 294 | YINPSTGYAEYNQKLQG | ||
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 198 | LRFGSSGFAY | 4H3C3之V H-CDR3序列 |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 199 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 4H3C3之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 295 | RSSQSLLYSSNQKNYLA | ||
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 200 | WASTWES | 4H3C3之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 222 | WASTRES | ||
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 201 | QQYYSFPLT | 4H3C3之V L-CDR3序列 |
在一些較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義之抗體7B1F3之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體7B1F3之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體(諸如7B1F3人類化變體)，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義之抗體7B1F3之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 219 | NYWMH | 7B1F3之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 220 | YVNPRTGYTEYNQKFKD | 7B1F3之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 221 | ILNGTGFAY | 7B1F3之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 199 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 7B1F3之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 222 | WASTRES | 7B1F3之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 223 | QQYYSFPLT | 7B1F3之V L-CDR3序列 |
7B1F3人類化抗體之CDR序列之序列及一致性可藉由以下SEQ ID NO定義：
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 219 | NYWMH | 7B1F3之V H-CDR1序列 |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 220 | YVNPRTGYTEYNQKFKD | 7B1F3之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 296 | YVNPRTGYTEYNQKFQG | ||
| SEQ ID NO: 297 | YVNPRTGYTEYNQQLQG | ||
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 221 | ILNGTGFAY | 7B1F3之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 298 | ILQGTGFAY | ||
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 199 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 7B1F3之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 295 | RSSQSLLYSSNQKNYLA | ||
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 222 | WASTRES | 7B1F3之V L-CDR2序列 |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 223 | QQYYSFPLT | 7B1F3之V L-CDR3序列 |
在一些較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義之抗體2F5B11之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義之抗體2F5B11之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 242 | SYWIH | 2F5B11之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 243 | YINPNTAYTEFNQKFMD | 2F5B11之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 244 | LRSDRTGFAY | 2F5B11之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 199 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 2F5B11之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 245 | WASTREY | 2F5B11之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 246 | QQYYSFPLT | 2F5B11之V L-CDR3序列 |
在一些較佳實施例中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含(及/或可結合本發明之第一態樣之結合分子使用及/或調配之第二結合分子包含)對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義之抗體1D3之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1D3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中該或各結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義之抗體1D3之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 8 | GFTFTDYY | 1D3之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 9 | IRSKANGYTT | 1D3之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 10 | ARDERRTAWLAY | 1D3之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 14 | QSIVHSNGNTY | 1D3之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 15 | KVS | 1D3之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 16 | FQGSHVPTWT | 1D3之V L-CDR3序列 |
在另一實施例中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含(及/或可結合本發明之第一態樣之結合分子使用及/或調配之第二結合分子包含)對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體1C10之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1C10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中該或各結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體1C10之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 112 | SHALS | 1C10之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 113 | SISSRGRTYYPDSVKG | 1C10之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 114 | GGTHYSYGNGFDF | 1C10之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 117 | SVSSSVSYMH | 1C10之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 83 | DTSKLAS | 1C10之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 118 | QQWSNNPPIT | 1C10之V L-CDR3序列 |
在另一實施例中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含(及/或可結合本發明之第一態樣之結合分子使用及/或調配之第二結合分子包含)對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體1A10之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1A10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中該或各結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義之抗體1A10之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 112 | SHALS | 1A10之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 113 | SISSRGRTYYPDSVKG | 1A10之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 114 | GGTHYSYGNGFDF | 1A10之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 117 | SVSSSVSYMH | 1A10之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 83 | DTSKLAS | 1A10之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 118 | QQWSNNPPIT | 1A10之V L-CDR3序列 |
在另一實施例中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含(及/或可結合本發明之第一態樣之結合分子使用及/或調配之第二結合分子包含)對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義之抗體1G9之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1G9之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中該或各結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義之抗體1G9之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 76 | SYAMS | 1G9之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 77 | SISSGGSTYYPDSVKG | 1G9之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 78 | GGSTMITTGLGFAY | 1G9之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 82 | SASSSVSYMH | 1G9之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 83 | DTSKLAS | 1G9之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 84 | QQWSSNPPLT | 1G9之V L-CDR3序列 |
在另一實施例中，本發明之第一態樣之結合分子進一步包含(及/或可結合本發明之第一態樣之結合分子使用及/或調配之第二結合分子包含)對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於分別如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義之抗體1E8之CDR序列中的任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者，及/或抗體1E8之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體，且視情況其中該或各結合分子係選自抗體及CAR。
如下為如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義之抗體1E8之CDR序列之序列及一致性：
| SEQ ID NO: 76 | SYAMS | 1E8之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 95 | SISSGGRTYYPDSVKG | 1E8之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 96 | GGTRHSYGNGFDY | 1E8之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 82 | SASSSVSYMH | 1E8之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 99 | DSSKLAS | 1E8之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 100 | QQWTSNPPIT | 1E8之V L-CDR3序列 |
在其他實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於任何其他對US28之ECD1之SEQ ID NO: 177內的抗原決定基具有結合特異性(且較佳為病毒株未定性結合特異性)之抗體的CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者(及/或該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體)，該等抗體諸如4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6及/或5E1E4；及/或視情況進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於任何其他對US28之ECD3具有結合特異性(且較佳為病毒株未定性結合特異性)之抗體的CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者(及/或該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體)，該等抗體諸如如本文所描述之抗體13-5C6-1B5及14-1H3-1A6中之任一者，及/或藉由如上文所描述的獲得其他對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內之抗原決定基具有結合特異性之抗體的方法獲得的任何抗體。
應瞭解，含有三個或更少CDR區(在一些情況下，僅單個CDR或其一部分)之分子能夠保持衍生一或多個CDR之抗體的抗原結合活性。舉例而言，Gao等人(1994, 《生物化學雜誌(
J Biol Chem)》 269: 32389-93)描述對其受質具有高親和力之完整V
L鏈(包括全部三個CDR)。
含有兩個CDR區之分子例如由Vaughan及Sollazzo (2001, 《組合化學及高通量篩選(
Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening)》, 4: 417-430)描述。在第418頁(右欄-3 吾等之設計策略)上，描述了僅包括穿插於構架區內之H1及H2 CDR高變區之微型抗體。微型抗體描述為能夠與目標結合。Vaughan及Sollazzo參考了Pessi等人(1993, 《自然(Nature)》, 362: 367-9)及Bianchi等人(1994, 《分子生物學雜誌(
J. Mol. Biol.)》, 236: 649-59)且更詳細地描述H1及H2微型抗體及其特性。Qiu等人(2007, 《自然生物技術(
Nature Biotechnology)》, 25:921-9)證實由兩個連接之CDR組成之分子能夠結合抗原(摘要及第926頁，右欄)。Quiocho (1993,《自然》, 362: 293-4)提供Pessi等人「微型抗體」技術之概述。Ladner (2007，《自然生物技術》，25:875-7)檢閱Qiu等人之論文且評述含有兩個CDR之分子能夠保持抗原結合活性(第875頁，右欄)。
Laune等人(1997,
JBC, 272: 30937-44)描述了含有單個CDR區之分子，證實一系列來源於CDR之己肽顯示抗原結合活性(摘要)，且應注意，完全單個CDR之合成肽顯示較強結合活性(第30942頁，右欄)。Monnet等人(1999,
JBC, 274: 3789-96)展示一系列12-聚體肽及相關構架區具有抗原結合活性(摘要)，且評述單獨CDR3樣肽能夠結合抗原(第3785頁，左欄)。Heap等人(2005,《普通病毒學雜誌(
J. Gen. Virol.)》，86: 1791-1800)報導「微抗體」(含有單個CDR之分子)能夠結合抗原(摘要及第1791頁，左欄)，且展示來自抗HIV抗體之環肽具有抗原結合活性及功能。Nicaise等人(2004,《蛋白質科學(
Protein Science)》, 13:1882-91)展示單個CDR可賦予其溶菌酶抗原之抗原結合活性及親和力。
當提及抗體之特定CDR序列之功能變體時，應瞭解，如所定義之抗體中之一或多個CDR可變化。因此，在抗體定義為包含各具有特定序列之輕鏈或重鏈CDR (例如CDR 1-3)的情況下，彼等特定序列中之至多一者、兩者或三者可變化。類似地，當抗體定義為包含各自具有特定序列之輕鏈及重鏈CDR (例如六個CDR)時，彼等特定序列中之至多一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者可變化。功能變體通常為如下文進一步描述之保守性胺基酸取代及/或可包括胺基酸缺失及/或插入。另外或替代地，功能變體可為本文所描述之人類化變體。
舉例而言，1D3之V
H-CDR1序列為8-胺基酸序列GFTFTDYY (SEQ ID NO: 8)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7或8個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。4H3C3、7B1F3、2F5B11、1C10、1A10、1G9及1E8之V
H-CDR1序列為5-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 196、219、242、112、112、138、76及76)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4或5個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1或2個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。
1D3之V
H-CDR2序列為10-胺基酸序列IRSKANGYTT (SEQ ID NO: 9)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6或7個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。1C10、1A10、1G9及1E8之V
H-CDR2序列為16-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 113、113、77及95)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。4H3C3、7B1F3及2F5B11之V
H-CDR2序列為17-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 197 (或人類化變體SEQ ID NO: 293及294)、220 (或人類化變體SEQ ID NO: 296及297)及243)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。
1D3之V
H-CDR3序列為12-胺基酸序列ARDERRTAWLAY (SEQ ID NO: 10)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。1G9之V
H-CDR3序列為14-胺基酸序列(SEQ ID NO: 78)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。1C10、1A10及1E8之V
H-CDR3序列為13-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 114、114及96)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。4H3C3及2F5B11之V
H-CDR3序列為10-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 198及244)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6或7個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。7B1F3之V
H-CDR3序列為9-胺基酸序列(SEQ ID NO: 221或人類化變體SEQ ID NO: 298)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5或6個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。
1D3之V
L-CDR1序列為11-胺基酸序列QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 14)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7或8個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。1C10、1A10、1G9及1E8之V
L-CDR1序列為10-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 117、117、82及82)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6或7個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。4H3C3、7B1F3及2F5B11之V
L-CDR1序列為17-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 199 (或人類化變體SEQ ID NO: 295)、199 (或人類化變體SEQ ID NO: 295)及199)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。
1D3之V
L-CDR2序列為3-胺基酸序列KVS (SEQ ID NO: 15)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。4H3C3、7B1F3、2F5B11、1C10、1A10、1G9及1E8之V
L-CDR2序列為7-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 200 (或人類化變體SEQ ID NO: 222)、222、245、83、83、145、83及99)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6或7個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。
1D3之V
L-CDR3序列為10-胺基酸序列FQGSHVPTWT (SEQ ID NO: 16)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6或7個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。1C10、1A10、1G9及1E8之V
L-CDR3序列為10-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 118、118、84及100)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6或7個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。4H3C3、7B1F3及2F5B11之V
L-CDR3序列為9-胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 201、223及246)。其功能變體可包括一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個)如下文進一步描述之保守性胺基酸取代，及/或可包括一或多個(例如1、2、3、4、5或6個)胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸插入。
該等CDR中之一或多者之功能變體可藉由此項技術中熟知之各種方法中之任一者產生。舉例而言，包含1、2、3、4、5或6個CDR之結合分子之結合特性可藉由成熟方法產生。舉例而言，結合分子之CDR提供之結合親和力可藉由成熟步驟修飾(增加或減少)；及/或結合分子之CDR提供之結合特異性可藉由成熟步驟修飾(一般而言，增加)。應理解，對US28之較高或增加之結合親和力程度可能並非始終合乎需要，尤其是在以對諸如健康人類細胞之脫靶不可接受之高程度的結合親和力為代價時不合乎需要。結合分子，包括但不限於CAR及表現CAR之細胞，例如可得益於結合親和力之較低程度，但一般將始終得益於結合特異性之最佳化程度。
在成熟方法之一個實例中，可在抗原結合篩選期間使用單價顯示噬菌粒系統修改親合力效應。兩種替代或組合方法非靶向誘變及寡核苷酸定向誘變可用於構築隨機或限定子庫以引入大量原始結合分子之突變體。接著藉由修改篩選條件，諸如在嚴格度分析中，選擇結合至表現US28之細胞及/或HCMV感染細胞，具有所需經修飾特性(諸如增加之特異性及/或增加或減少之親和力)之結合分子。
本發明之第一態樣之結合分子包含對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基提供結合特異性的一或多個序列，其中該一或多個序列包含以下抗體之一個、兩個、三個、四個、五個或全部六個CDR序列中之任一者的功能變體：
(a) 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義；
(b) 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義；及/或
(c) 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義；
(d) 4H3C3人類化變體，分別如由SEQ ID NO: 196；293或294；198；199或295；200或222；及201所定義；
(e) 7B1F3人類化變體，分別如由SEQ ID NO: 219；296或297；221或298；199或295；222；及223所定義；
且如上文進一步描述，當分別在與4H3C3、7B1F3及/或2F5B11相同之條件下測試時，較佳具有一或多個與4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之結合特性類似或實質上等效的針對具有SEQ ID NO: 177之序列之肽及/或針對US28蛋白之結合特性。
視情況例如如前面段落中所描述之本發明之第一態樣之結合分子進一步包含對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的第二抗原決定基具有結合特異性的一或多個序列，其中該一或多個序列包含(及/或可結合本發明之第一態樣之結合分子使用及/或調配之第二結合分子包含)以下抗體之一個、兩個、三個、四個、五個或全部六個CDR序列中之任一者的功能變體：
(f) 1D3，分別如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義；
(g) 1C10，分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義；
(h) 1A10，分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義；
(i) 1G9，分別如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義；及/或
(j) 1E8，分別如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義；
且如上文進一步描述，當分別在與1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8相同之條件下測試時，較佳具有一或多個與1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之結合特性類似或實質上等效的針對具有HCMV之US28蛋白之ECD3的4N及/或4D變體中之任一者或兩者之序列的肽及/或針對具有4D及/或4N變體ECD3序列中之任一者或兩者之US28蛋白的結合特性。
在一個實施例中，本發明之第一態樣之結合分子可包含：
(a) 以下抗體之可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 196、197及198所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
ii. 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 219、220及221所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
iii. 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 242、243及244所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
且視情況進一步包含：
iv. 1D3，分別如由SEQ ID NO: 8、9及10所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
v. 1C10，分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
vi. 1A10，分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
vii. 1G9，分別如由SEQ ID NO: 76、77及78所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
viii. 1E8，分別如由SEQ ID NO: 76、95及96所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
及/或
(b) 抗體之可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 199、200及201所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
ii. 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 199、222及223所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
iii. 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 199、245及246所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
且視情況進一步包含：
iv. 1D3，分別如由SEQ ID NO: 14、15及16所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
v. 1C10，分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
vi. 1A10，分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
vii. 1G9，分別如由SEQ ID NO: 82、83及84所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
viii. 1E8，分別如由SEQ ID NO: 82、99及100所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)。
另外或替代地，本發明之第一態樣之結合分子可包含：
(a) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含具有以下序列之CDR 1、2及3序列：
i. 分別SEQ ID NO: 196、197及198 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
ii. 分別SEQ ID NO: 219、220及221 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；及/或
iii. 分別SEQ ID NO: 242、243及244 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
及視情況：
iv. 分別SEQ ID NO: 8、9及10 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 12之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
v. 分別SEQ ID NO: 112、113及114 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 104之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
vi. 分別SEQ ID NO: 112、113及114 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 122之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
vii. 分別SEQ ID NO: 76、77及78 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 68之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；及/或
viii. 分別SEQ ID NO: 76、95及96 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 88之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
及/或
(b) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含具有以下序列之CDR 1、2及3序列：
i. 分別SEQ ID NO: 199、200及201 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
ii. 分別SEQ ID NO: 199、222及223 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；及/或
iii. 分別SEQ ID NO: 199、245及246 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
及視情況：
iv. 分別SEQ ID NO: 14、15及16 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 18之序列、基本上由其組成或由其組成；
v. 分別SEQ ID NO: 117、83及118 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 108之序列、基本上由其組成或由其組成；
vi. 分別SEQ ID NO: 117、83及118 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成；
vii. 分別SEQ ID NO: 82、83及84 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 72之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
viii. 分別SEQ ID NO: 82、99及100 (及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 92之序列、基本上由其組成或由其組成。
如下為分別如由SEQ ID NO: 187及189所定義之抗體4H3C3之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 187 | QVQLQQSGAE LAKPGASVKM SCKASGYTFT SYWMHWVKQR PGQGLEWIGY INPSTGYAEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARLR FGSSGFAYWG QGTLVTVSS | 4H3C3之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 189 | QIVLTQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YSSNQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTW ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVKAEDLA VYYCQQYYSF PLTFGAGTKL EIK | 4H3C3之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
如下可為抗體4H3C3之人類化可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 256 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKFQGRATLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為4H3C3 VH1。 |
| SEQ ID NO: 257 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYAEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為4H3C3 VH2。 |
| SEQ ID NO: 258 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKLQGRATLTADKSSSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為4H3C3 VH3。 |
| SEQ ID NO: 259 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYAEYNQKLQGRVTMTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為4H3C3 VH4。 |
| SEQ ID NO: 260 | QIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTWESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為4H3C3 VL1。 |
| SEQ ID NO: 261 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為4H3C3 VL2。 |
| SEQ ID NO: 262 | QIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTWESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為4H3C3 VL3。 |
| SEQ ID NO: 263 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為4H3C3 VL4。 |
如下為分別如由SEQ ID NO: 211及213所定義之抗體7B1F3之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 211 | EVQLQQSGAE LAKPGASVKM SCKASGYTFT NYWMHWVKQR PGQGLEWIGY VNPRTGYTEY NQKFKDKATL TADKSSRTAY MQLSSLTSED SAVYSCARIL NGTGFAYWGQ GTLVTVSA | 7B1F3之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 213 | DIVLTQSPSS LTVSVGEKFT MSCKSSQSLL YSSNQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLA ISSVKPEDLA IYYCQQYYSF PLTFGAGTKL EIK | 7B1F3之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
如下可為抗體7B1F3之人類化可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 264 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFQGRATLTADKSSRTAYMELSSLRSEDTAVYSCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為7B1F3 VH1。 |
| SEQ ID NO: 265 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為7B1F3 VH2。 |
| SEQ ID NO: 266 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQQLQGRATLTADKSSRTAYMELRSLRSDDTAVYSCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為7B1F3 VH3。 |
| SEQ ID NO: 267 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQQLQGRVTMTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為7B1F3 VH4。 |
| SEQ ID NO: 270 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFQGRATLTADKSSRTAYMELSSLRSEDTAVYSCARILQGTGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為7B1F3 VH5。 |
| SEQ ID NO: 271 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARILQGTGFAYWGQGTLVTVSS | 本文中亦稱為7B1F3 VH6。 |
| SEQ ID NO: 268 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為7B1F3 VL1。 |
| SEQ ID NO: 261 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為7B1F3 VL2。 |
| SEQ ID NO: 269 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為7B1F3 VL3。 |
| SEQ ID NO: 263 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 本文中亦稱為7B1F3 VL4。 |
如下為分別如由SEQ ID NO: 233及235所定義之抗體2F5B11之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 233 | EVQLQESGAE LAKPGASVKM SCKASGYTFS SYWIHWIKQR PGQGLEWIGY INPNTAYTEF NQKFMDKATL TADKSSSTAY MQLTSLTSED SAVYYCARLR SDRTGFAYWG QGTLVTVSA | 2F5B11之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 235 | QIVLTQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YSSNQKNYLA WYQQKPGQSP KVLIYWASTR EYGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVKAEDLA VYYCQQYYSF PLTFGAGTKL EIK | 2F5B11之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
如下為分別如由SEQ ID NO: 12及18所定義之抗體1D3之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 12 | EVKLVESGGG LVQPGGSLRL ACATSGFTFT DYYMSWVRQP PGKALEWLGF IRSKANGYTT EYSASVKGRF TISRDNSQSI LYLQMNTLRS EDSATYYCAR DERRTAWLAY WGQGTLVTVS A | 1D3之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 18 | DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLDW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP TWTFGGGTKL EIK | 1D3之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
如下為分別如由SEQ ID NO: 104及108所定義之抗體1C10之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 104 | EVKLVESGGV LVKPGGSLKF SCAASGFTFS SHALSWVRQT PEKRLEWVAS ISSRGRTYYP DSVKGRFTVS RDNARNILYL QVSSLRSEDT AMYYCTRGGT HYSYGNGFDF WGQGTTLTVS S | 1C10之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 108 | QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSVSSSVS YMHWYQQKSG TSPKRWIYDT SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISTMEAE DAATYYCQQW SNNPPITFGA GTKLELK | 1C10之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
如下為分別如由SEQ ID NO: 122及126所定義之抗體1A10之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 122 | EVKLVESGGV LVKPGGSLKF SCAASGFTLS SHALSWVRQT PEKRLEWVAS ISSRGRTYYP DSVKGRFTVS RDNARNILYL QVSSLRSEDT AMYYCTRGGT HYSYGNGFDF WGQGTTLTVS S | 1A10之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 126 | QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSVSSSVS YMHWYQQKSG TSPKRWIYDT SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISTMEAE DAATYYCQQW SNNPPITFGA GTKLELK | 1A10之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
如下為分別如由SEQ ID NO: 68及72所定義之抗體1G9之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
如下為分別如由SEQ ID NO: 88及92所定義之抗體1E8之可變重鏈(V
H)可變輕鏈(V
L)多肽序列的序列及一致性：
| SEQ ID NO: 68 | EVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYAMSWVRQT PEKRLEWVAS ISSGGSTYYP DSVKGRFTIS RDNARNILYL QMSSLRSEDT AMYYCARGGS TMITTGLGFA YWGQGTLVTV SA | 1G9之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 72 | QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMHWYQQKSG TSPKRWIYDT SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW SSNPPLTFGA GTKLELK | 1G9之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 88 | EVKLVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYAMSWVRQT PEKRLEWVAS ISSGGRTYYP DSVKGRFTIS RDNARNILYL QMSSLRSEDT AIYYCARGGT RHSYGNGFDY WGQGTTLTVS S | 1E8之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 92 | QIVLSQSPTI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMHWYQQKSG TSPKRWIYDS SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW TSNPPITFGA GTKLELK | 1E8之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
在其他實施例中，本發明之第一態樣之結合分子包含(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含對US28之ECD1中之由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性(且較佳為病毒株未定性結合特異性) (且視情況其中該結合分子亦對ECD3中之第二抗原決定基具有結合特異性)之另一抗體之V
H鏈的CDR 1、2及3序列(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)，及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含對US28之ECD1中之由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性(且較佳為病毒株未定性結合特異性) (且視情況其中該結合分子亦對ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性)之相同其他抗體的V
L鏈之CDR 1、2及3序列(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)。該其他抗體可例如為如本文所描述之抗體4A11A11、2G2B3、5D6H11、9G3B9、5E8F7、6G3D6、5E1E4、13-5C6-1B5及14-1H3-1A6中之任一者，及/或藉由如上文所描述的獲得對HCMV之US28蛋白之ECD1之SEQ ID NO: 177及/或ECD3內的抗原決定基具有結合特異性的其他抗體之方法獲得的另一抗體。
當抗體定義為具有包含特定胺基酸序列之輕鏈可變區及具有特定胺基酸序列之重鏈可變區時，應瞭解彼等序列中之至多一或兩者可根據定義而變化。變異可僅在序列之非CDR區內、僅在序列之CDR區內，或在序列之非CDR區及CDR區內。通常，變異在CDR區之外，且因此輕鏈可變區及重鏈可變區之變體可包含本文所定義之特定CDR序列中之任一者。
在抗體包含如本文所定義之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之變體(例如，選自SEQ ID NO: 187、211、233、12、104、122、130、68及88之V
H及/或選自SEQ ID NO: 189、213、235、18、108、126、134、72及92之V
L)的情況下，變體可具有至少1、2、3、4或5個胺基酸取代。通常，變體不具有超過30、20或10個胺基酸取代。因此，變體可具有至少1、2、3、4或5個胺基酸取代，但不超過30、20或10個胺基酸取代。
在抗體包含如本文所定義之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之變體(例如，選自SEQ ID NO: 187、211、233、12、104、122、130、68及88之V
H及/或選自SEQ ID NO: 189、213、235、18、108、126、134、72及92之V
L)的情況下，變體一般與所定義之胺基酸序列具有至少70%序列一致性，例如至少75%、80%、85%、90%、或95%序列一致性，且更一般而言與所定義之胺基酸序列具有95-99%序列一致性(例如96%、97%、98%或99%序列一致性)。變異程度可僅適用於非CDR區。舉例而言，如本文所定義之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之變體(例如選自SEQ ID NO: 187、211、233、12、104、122、130、68及88之V
H及/或選自SEQ ID NO: 189、213、235、18、108、126、134、72及92之V
L)可與所定義之胺基酸序列具有至少70%一致性(例如75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)，但包含一或多個(諸如全部)如本文所定義之相同CDR。
兩種多肽之間的序列一致性百分比可使用適合電腦程式，例如威斯康辛大學遺傳計算組(the University of Wisconsin Genetic Computing Group)之GAP程式來確定，且應瞭解，一致性百分比係相對於已最佳比對序列之多肽來計算。可使用Clustal W程式(Thompson等人,(1994)《核酸研究(
Nucleic Acids Res)》
22, 4673-80)替代地進行比對。所用參數可如下：快速成對比對參數：K-元組(字語)大小；1，窗大小；5，空隙罰分；3，頂部對角線之數目；5，計分方法：x%。多序列比對參數：空隙開放罰分；10，空隙擴展罰分；0.05。計分矩陣：BLOSUM。
本發明之第一態樣之結合分子，其包含如由以下所定義之抗體4H3C3、7B1F3及/或2F5B11的可變重鏈(V
H)及/或可變輕鏈(V
L)多肽序列的功能變體：分別對於V
H，為SEQ ID NO: 187、211及233，且對於V
L，為SEQ ID NO: 189、213及235，或4H3C3或其7B1F3人類化變體，如上文進一步描述，當在分別與4H3C3、7B1F3及/或2F5B11相同之條件下測試時，較佳具有一或多個與4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之結合特性類似或實質上等效的結合特性。視情況，在多特異性型式中，本發明之第一態樣之結合分子，其進一步包含如由以下所定義之抗體1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8的可變重鏈(V
H)及/或可變輕鏈(V
L)多肽序列的功能變體：分別對於V
H，為SEQ ID NO: 12、104、122、68及88，且對於V
L，為SEQ ID NO: 18、108、126、72及92，如上文進一步描述，當在分別與1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8相同之條件下測試時，較佳具有一或多個與1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之結合特性類似或實質上等效的結合特性。
通常，較佳地，本文所揭示之變體之胺基酸取代為保守性胺基酸取代，例如其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。保守性胺基酸取代為此項技術中所熟知且包括(原始殘基à取代)Ala (A)à Val、Gly或Pro；Arg (R)à Lys或His；Asn (N)à Gln；Asp (D)à Glu；Cys (C)à Ser；Gln (Q) à Asn；Glu (G)à Asp；Gly (G)à Ala；His (H)à Arg；Ile (I)à Leu；Leu (L)à Ile、Val或Met；Lys (K)à Arg；Met (M)à Leu；Phe (F)à Tyr；Pro (P)à Ala；Ser (S)à Thr或Cys；Thr (T)à Ser；Trp (W) à Tyr；Tyr (Y)à Phe或Trp；及Val (V)à Leu或Ala。
抗體：
在一個非限制性但較佳實施例中，根據本發明之第一態樣之結合分子可包含抗體。
如本文所用之術語「抗體」視情況包括該抗體之抗原結合片段。如本文所用之術語「嵌合抗原受體(CAR)」視情況包括該CAR之抗原結合片段。
藉由「抗體或其抗原結合片段」，吾等包括實質上完整之抗體分子，以及嵌合抗體、人類化抗體、經分離之人類抗體、單鏈抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鏈之均二聚體及雜二聚體，及其抗原結合片段及衍生物。適合的抗原結合片段及衍生物包括Fv片段(例如單鏈Fv及二硫鍵結合Fv)、Fab樣片段(例如Fab片段、Fab'片段及F(ab)2片段)、單一可變域(例如VH及VL域)及單域抗體(dAb，包括單一型式及雙重型式[dAb-連接子-dAb]，以及奈米抗體)。使用抗體片段而非全抗體之潛在優勢為多重的。片段之較小尺寸可得到改善的藥理特性，諸如更好地穿透實體組織。此外，諸如Fab、Fv、ScFv及dAb抗體片段之抗原結合片段可在重組源(例如CHO細胞、大腸桿菌等)中表現且自重組源分泌，因此可輕鬆生產大量該等片段。
藉由「抗體」或「其抗原結合片段」，吾等包括實質上完整的抗體分子，以及嵌合抗體、人類化抗體及經分離之人類抗體。
包括「其抗原結合片段」、CAR或其抗原結合片段及/或根據本發明之第一態樣之其他結合分子的「抗體」可例如：
i. 具有「n」之價數，其中n為整數一或多，且因此例如，可為單價、二價、三價或多價的；及/或
ii. 對一種抗原或兩種或更多種不同抗原具有結合特異性，例如其可具有特異性結合至「x」個不同抗原的能力，其中x為整數一或二或更多，需滿足至少一種抗原為US28蛋白之ECD3的要求；例如其可具有單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性結合特異性。
抗體或其抗原結合片段之示例性形式可包括單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或抗體輕鏈之均二聚體及雜二聚體以及其抗原結合片段及衍生物中之任一者或多者。適合的抗原結合片段及衍生物包括Fv片段(例如單鏈Fv及二硫鍵結合Fv)、Fab樣片段(例如Fab片段、Fab'片段及F(ab)2片段)、單一可變域(例如VH及VL域)及單域抗體(dAb，包括單一型式及雙重型式[dAb-連接子-dAb]，以及奈米抗體)。使用抗體片段而非全抗體之潛在優勢為多重的。片段之較小尺寸可得到改善的藥理特性，諸如更好地穿透實體組織。此外，諸如Fab、Fv、單鏈Fv(ScFv)及dAb抗體片段之抗原結合片段可在重組宿主細胞，諸如大腸桿菌中表現，且自重組宿主細胞分泌，由此可輕鬆生產大量該等片段。
如本文所用之術語「雙特異性」意謂多肽能夠特異性結合至少兩個目標實體。此等目標實體中之每一者可為衍生自同一蛋白質之抗原決定基(例如結合至同一蛋白質，例如US28之第一抗原決定基及第二抗原決定基)。替代地，目標實體可為衍生自不同蛋白質之抗原決定基(例如結合至第一蛋白質之第一抗原決定基及第二個不同目標(諸如不同蛋白質)之第二抗原決定基)。
藉由「ScFv分子」，吾等意謂其中V
H及V
L搭配域經由可撓性寡肽連接的分子。經工程改造之抗體，諸如ScFv抗體，可使用此項技術中已知之技術及方法製成。使用抗體片段而非全抗體之優勢為多重的。片段之較小尺寸可得到改善的藥理特性，諸如更好地穿透至目標位點。移除全抗體之效應功能，諸如補體結合。Fab、Fv、ScFv及dAb抗體片段均可在大腸桿菌中表現且自大腸桿菌分泌，因此使得可輕鬆生產大量片段。全抗體，F(ab')
2片段為「二價」。藉由「二價」，吾等意謂抗體及F(ab')
2片段具有兩個抗原結合位點。相比之下，Fab、Fv、ScFv及dAb片段為單價，僅具有一個抗原組合位點。
片語「抗體」或「其抗原結合片段」亦意欲涵蓋抗體模擬物(例如具有高度穩定性但允許在某些位置引入變化性的非抗體骨架結構)。生物化學領域的技術人員將熟悉許多此類分子，如Gebauer及Skerra, 2009中所論述。示例性抗體模擬物包括：親和抗體(亦稱為特林奈汀(Trinectin)；Nygren, 2008, 《FEBS期刊(
FEBS J)》, 275, 2668-2676)；CTLD (亦稱為四連接素(Tetranectin)；《醫藥技術創新(
Innovations Pharmac. Technol.)》(2006), 27-30)；阿德奈汀(adnectin)(亦稱為單功能抗體；《分子生物學方法(
Meth. Mol. Biol.)》, 352(2007), 95-109)；抗運載蛋白(anticalin)(《最新藥物(
Drug Discovery Today)》(2005), 10, 23-33)；達爾潘蛋白(DARPin)(錨蛋白；《自然生物科技(
Nat. Biotechnol.)》(2004), 22, 575-582)；高親合性多聚體(avimer)(《自然生物科技》(2005), 23, 1556-1561)；微體(《FEBS期刊》,(2007), 274, 86-95)；肽適體(《生物治療專家意見(
Expert. Opin. Biol. Ther.)》(2005), 5, 783-797)；孔尼茲域(Kunitz domain)(《藥理學與實驗療法雜誌(
J. Pharmacol. Exp. Ther.)》(2006)318, 803-809)；阿非林蛋白(affilin)(《生物技術趨勢(
Trends. Biotechnol)》.(2005), 23, 514-522)；親和體(Avacta Life Sciences, Wetherby, UK)。
熟習此項技術者應進一步瞭解，無論目前存在或在未來存在，本發明亦涵蓋抗體及其抗原結合片段之修飾版本，例如藉由聚乙二醇或另一適合聚合物之共價連接(參見下文)及/或共價或非共價連接(例如藉由呈現為融合蛋白)至其他多肽序列來修飾。
產生抗體及抗體片段之方法為此項技術中所熟知。舉例而言，抗體可經由若干種方法中之任一者產生，該等方法採用誘導活體內產生抗體分子、篩選免疫球蛋白庫(Orlandi等人, 1989; Winter等人, 1991)或藉由培養中之細胞株產生單株抗體分子。此等包括但不限於融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術及艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)融合瘤技術(Kohler等人, 1975.《自然》
256:4950497; Kozbor等人, 1985.《免疫學方法雜誌(
J. Immund.Methods)》
81:31-42; Cote等人, 1983.《美國國家科學院院刊》
80:2026-2030; Cole等人, 1984.《分子與細胞生物學(
Mol. Cell.Biol.)》
62:109-120)
用於產生單株抗體之適合方法亦揭示於「單株抗體：技術手冊(
Monoclonal Antibodies: A manual of techniques)」, H Zola (CRC出版社, 1988)中及「單株融合瘤抗體：技術與應用(
Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications)」, J G R Hurrell (CRC出版社, 1982)。
如本文所用之術語「單株抗體」包括自實質上均質之抗體群體獲得的抗體，亦即除可少量存在可能天然存在之突變之外，構成該群體之個別抗體為相同的。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，相比於通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除了其特異性之外，單株抗體為有利的，因為其係藉由融合瘤培養合成，未經其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得之特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。舉例而言，將根據本發明使用之單株抗體可由Kohler等人，《自然》, 256: 495(1975)首先描述之融合瘤方法製成或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)製成。亦可使用例如Clackson等人，《自然》, 352:624-628(1991)及Marks等人，《分子生物學雜誌》, 222:581-597(1991)中描述之技術自噬菌體抗體庫分離「單株抗體」。視情況，實質上均質之單株抗體群體為以重量計群體中大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或大於99.5% (諸如100%)之抗體一致或實質上一致的群體。實質上一致抗體與一致抗原決定基結合及/或包含一致CDR序列、一致VH及/或VL鏈、一致重鏈及/或輕鏈或其任何組合。視情況，群體內之單株抗體可視為一致，與例如歸因於常見修飾，諸如不完全二硫鍵形成、糖基化、N端焦麩醯胺酸環化、C端離胺酸加工、去醯胺化、異構化及氧化，及較不常見修飾，諸如藉由馬來酸一醯脲修飾N端胺基酸及C端胺基酸之醯胺化，可能出現在此類群體內之任何潛在酶及/或非酶異質性無關。此類修飾及其他此類形式之異質性在例如Liu等人, 藥物科學雜誌
( J Pharm Sci .) 2008年7月;97(7):2426-47中論述，其內容以引用的方式倂入本文中。
同樣地，可使用此項技術中熟知之方法獲得抗體片段(參見例如Harlow及Lane, 1988, 《抗體：實驗室手冊(Antibodies: A Laboratory Manual)》, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。舉例而言，根據本發明之抗體片段可藉由抗體之蛋白水解或藉由在大腸桿菌或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢[CHO]細胞培養物或其他蛋白質表現系統)中表現編碼片段之DNA來製備。替代地，抗體片段可藉由習知方法進行全抗體之胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶消化來獲得。
熟習此項技術者應瞭解，對於人類療法及/或診斷，較佳使用人類或人類化抗體。非人類(例如鼠類)抗體之人類化形式為較佳具有衍生自非人類抗體之最小部分的經基因工程改造之嵌合抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。人類化抗體包括其中人類抗體(受體抗體)之互補決定區(CDR)經來自具有所需功能之非人類物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠或兔)之互補決定區的殘基置換的抗體。在一些情況下，人類抗體之Fv構架殘基經相應非人類殘基置換。人類化抗體亦可包含既不存在於受體抗體中亦不存在於導入互補決定區或構架序列中的殘基。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上所有，其中所有或實質上所有互補決定區對應於相關供體抗體，諸如非人類抗體之互補決定區，且所有或實質上所有構架區對應於相關人類共有序列之構架區。人類化抗體最佳亦包括通常衍生自人類抗體之抗體恆定區(諸如Fc區)之至少一部分(參見例如Jones等人, 1986.《自然》
321:522-525; Riechmann等人, 1988, 《自然》
332:323-329; Presta, 1992, 《結構生物學新觀點(
Curr. Op. Struct. Biol.)》
2:593-596，其以引用之方式併入本文中)。
人類化非人類抗體之方法為此項技術中所熟知。一般而言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入至其中的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基，通常稱為所導入殘基，通常獲自所導入可變域。人類化可基本上如所描述進行(參見例如Jones等人, 1986; Reichmann等人, 1988; Verhoeyen等人, 1988, 《科學》
239:1534-1536I; US 4,816,567, 其係以引用的方式併入本文中)，藉由用對應嚙齒動物互補決定區取代人類互補決定區。因此，此類人類化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整之人類可變域已經來自非人類物種之對應序列取代。實際上，人類化抗體通常可為一些互補決定區殘基及可能一些構架殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代的人類抗體。
人類抗體亦可使用此項技術中已知之各種技術鑑別，包括噬菌體顯示庫(參見例如Hoogenboom及Winter, 1991, 《分子生物學雜誌》
227:381; Marks等人, 1991, 《分子生物學雜誌》
222:581; Cole等人, 1985, 見：《單株抗體與癌症治療(
Monoclonal antibodies and Cancer Therapy)》, Alan R. Liss, 第77頁; Boerner等人, 1991.《免疫學方法雜誌》
147:86-95, Soderlind等人, 2000, 《自然-生物技術(
Nat Biotechnol)》
18:852-6及WO 98/32845，其以引用之方式併入本文中)。
熟習此項技術者應瞭解，本發明之多肽，例如抗體，可具有任何適合之結構型式。
抗體亦可包含Fc區，對於該Fc區，存在Fc特異性受體。工程改造治療性單株抗體或Fc融合蛋白之Fc區可產生更適合於其所需之藥理學活性的分子(Strohl, 2009, 《生物技術新觀點(
Curr Opin Biotechnol)》
20(6):685-91，其揭示內容以引用的方式併入本文中)。
5. (a) 半衰期增加之經工程改造之 Fc 區 一種提高治療性抗體之功效之方法為增加其血清持久性，藉此允許較高循環程度、較低投與頻率及劑量減少。
IgG之半衰期視其與新生受體FcRn之pH依賴性結合而定。FcRn，表現於內皮細胞之表面上，以pH依賴性方式結合IgG且保護其免於降解。
一些在pH 6.0而非pH 7.4下選擇性結合FcRn之抗體在多種動物模型中呈現出較高半衰期。
位於CH2與CH3域之間的界面處的突變，諸如T250Q/M428L (Hinton等人, 2004, 《生物化學雜誌》
279(8):6213-6，其揭示內容以引用的方式併入本文中)及M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F (Vaccaro等人, 2005, 《自然-生物技術》
23(10):1283-8，其揭示內容以引用的方式併入本文中)已展示增加與FcRn之結合親和力及IgG1之活體內半衰期。
6. (b) 效應功能改變之經工程改造之 Fc 區 抗體Fc部分對FcγRI、FcγRII及FcγRIII之親和力可藉由流動式細胞測量術與野生型IgG1比較，以測定表現FcγR之細胞達成何種半最大結合濃度(Hezareh等人, 2001, 《病毒學雜誌》,
75(24): 12161-12168，以引用的方式併入本文中)。此可替代地藉由FcγR酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定(Shields等人, 2001, 《細胞發展與生物學分子基礎(
Mol. Basis Cell Dev.Biol.)》,
276(9): 6591-6604，以引用的方式併入本文中)。
四種人類IgG同型以不同親和力結合活化Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制FcγRIIb受體及補體第一組分(C1q)，產生極為不同之效應功能(Bruhns等人, 2009, 《血液(
Blood.)》
113(16):3716-25，其揭示內容以引用的方式併入本文中)。IgG1分子具有最高親和力及誘導效應功能之能力，而IgG2、IgG3及IgG4不太有效(Bruhns, 2012, 《血液》119(24):5640-9; Hogarth及Pietersz, 2012, 《自然綜述：藥物發現(Nature Reviews Drug Discovery)》 11, 311-331; Stewart等人 2014 《癌症免疫治療雜誌(Journal for ImmunoTherapy of Cancer)》 2:29; Wang等人 2015 《免疫學前沿(Front Immunol)》; 6: 368; Vidarsson等人 2014,《免疫學前沿(Front Immunol)》5:520，以引用的方式併入本文中)。另外，IgG1之Fc區中之某些突變顯著降低FcγR親和力及效應功能，同時保留新生FcR (FcRn)相互作用(Ju及Jung, 2014, 《生物技術新觀點》
30:128-39; Leabman等人 2013, mAbs, 5:6, 896-903; Oganesyan等人 2008 《晶體學報D生物晶體學(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.)》
64(Pt 6): 700-704; Oganesyan等人 2008 《分子免疫學(
Mol Immunol.)》
45(7):1872-82; Sazinsky等人, 2008 《美國國家科學院院刊》
105(51)20167-20172，其揭示內容以引用的方式併入本文中)。
最廣泛使用之IgG1突變體為單獨或與D265A組合之N297A，以及位置L234及L235處之突變，包括所謂的「LALA」雙重突變L234A/L235A。藉由突變進一步使IgG1沉默之另一位置為P329 (參見US 2012/0251531)。Fc區中之額外突變描述於WO 2021/234402中。因此，本發明之結合分子可併有如WO 2021/234402中所描述之Fc區中之任一者，其內容以引用之方式併入本文中。
在示例性實施例中，多肽係選自由以下組成之群組(其中任一者可為單特異性或雙特異性)：
(a) 二價抗體，諸如IgG-scFv抗體(例如，其中第一結合域係完整IgG，且第二結合域係scFv，該scFv在IgG之輕鏈之N端及/或在輕鏈之C端及/或在重鏈之N端及/或在重鏈之C端附接至第一結合域，或反之亦然)；
(b) 單價抗體，諸如
DuoBody ®(丹麥哥本哈根Genmab AS)或『臼包杵』雙特異性抗體(例如scFv-KIH、scFv-KIH
r、BiTE-KIH或BiTE-KIH
r)(參見Xu等人, 2015,
mAbs7(1):231-242)；
(c) scFv
2-Fc抗體(諸如來自新興生物科技公司(Emergent Biosolutions Inc)之
ADAPTIR™雙特異性抗體)；
(d) BiTE/scFv
2抗體；
(e) DVD-Ig抗體；
(f) 基於DART之抗體(例如DART
2-Fc或DART)；
(g) DNL-Fab
3抗體；及
(h) scFv-HSA-scFv抗體。
舉例而言，抗體可為IgG-scFv抗體。IgG-scFv抗體可呈VH-VL或VL-VH取向。在一個實施例中，scFv可藉由VH與VL之間的S-S橋鍵穩定化。
第一結合域及第二結合域可彼此直接融合。替代地，第一結合域及第二結合域可經由連接子(諸如多肽連接子)接合。舉例而言，多肽連接子可為約10至約25個胺基酸之間的短連接肽。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可使VH之N端與VL之C端連接，或反之亦然。
術語「結合活性」及「結合親和力」意欲指多肽分子結合或不結合至目標之傾向。結合親和力可藉由測定多肽及其目標之解離常數(Kd)來定量。較低Kd指示對目標之較高親和力。類似地，多肽與其目標之結合特異性可根據多肽對其目標與多肽及另一非目標分子之解離常數相比的比較解離常數(Kd)來定義。
此解離常數值可直接藉由熟知方法測定，且甚至複雜混合物之解離常數值可藉由諸如Caceci等人, 1984中所闡述之彼等方法的方法計算。舉例而言，Kd可使用諸如Wong及Lohman，1993所揭示之雙過濾器硝化纖維過濾器結合分析而確定。評估配位體(諸如針對目標之抗體)之結合能力的其他標準分析為此項技術中已知的，包括例如ELISA、西方墨點法、RIA及流動式細胞測量術分析。多肽之結合動力學(例如結合親和力)亦可藉由此項技術中已知之標準分析，諸如藉由Biacore
TM系統分析來評定。
可進行競爭結合分析，其中將多肽與目標之結合與該目標之另一配位體(諸如另一多肽)與目標之結合比較。出現50%抑制之濃度稱為Ki。在理想條件下，Ki等於Kd。因為Ki值應永不小於Kd，所以可宜由提供Kd之上限替代量測Ki。
結合親和力之替代量測包括EC50或IC50。在此情形下，EC50指示多肽達成其與固定量之目標之最大結合的50%的濃度。IC50指示多肽抑制固定量競爭者與固定量之目標之最大結合的50%的濃度。在兩種情況下，EC50或IC50之較低程度指示對目標之較高親和力。配位體關於其目標之EC50及IC50值可藉由熟知方法，例如ELISA測定。評定多肽之EC50及IC50的適合分析闡述於實例中。
如所提及，抗體可藉由標準技術，例如藉由用適當(糖基)多肽或其部分進行免疫接種，或藉由使用噬菌體顯示庫產生。
若需要多株抗體，則用攜有視情況半抗原化至另一多肽的所需抗原決定基的免疫原性多肽對所選哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)進行免疫接種。視宿主物種而定，可使用多種佐劑來增加免疫反應。此類佐劑包括但不限於弗氏佐劑(Freund's)、諸如氫氧化鋁之礦物凝膠以及表面活性物質，諸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇、多價陰離子、肽、油乳劑、匙孔螺血氰蛋白及二硝基苯酚。根據已知程序收集來自經免疫接種之動物的血清且處理。若含有針對所需抗原決定基之多株抗體之血清含有針對其他抗原之抗體，則多株抗體可藉由免疫親和層析純化。用於產生及加工多株抗血清之技術為此項技術中所熟知。
針對整個多肽或其特定抗原決定基(例如在本申請案之情況下，US28之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基，及/或視情況ECD3)的單株抗體亦可容易地由熟習此項技術者產生。藉由融合瘤製備單株抗體之一般方法為熟知的。產生永生抗體之細胞株可藉由細胞融合，且亦藉由其他技術產生，諸如直接轉型具有致癌DNA之B淋巴球或藉由艾伯斯坦-巴爾病毒轉染。針對上文所列之多肽產生的單株抗體組可針對多種特性進行篩選；亦即針對同型及抗原決定基特異性及/或親和力，以及病毒株未定性結合特性。單株抗體可使用熟知技術中之任一者製備，該等技術藉由在培養中之連續細胞株提供抗體分子之產生。
在一些實施例中，較佳抗體為單株抗體。在一些情況下，尤其在向人類患者重複投與抗體的情況下，單株抗體較佳為人類單株抗體或人類化單株抗體，其適於投與人類而不引起人類針對所投與之免疫球蛋白的免疫反應。適當製備之非人類抗體可以已知方式「人類化」，例如藉由將小鼠抗體之CDR區插入人類抗體之構架中。人類化抗體可使用Verhoeyen等人,(1988)《科學》, 239, 1534-1536及Kettleborough等人,(1991)《蛋白質工程改造(
Protein Engineering)》, l4(7), 773-783中所述之技術及方法製成。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基經相應的非人類殘基置換。一般而言，人類化抗體將含有可變域，其中所有或大部分CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且構架區實質上或完全為人類免疫球蛋白共有序列之構架區。
可使用重組技術產生完全人類抗體。通常，使用包含數十億種不同抗體之大型庫。與使用例如嵌合或人類化鼠類抗體之先前技術相比，此技術不依賴於動物免疫接種產生特異性抗體。而重組庫包含大量預製抗體變體，其中很可能庫將具有至少一種對任何抗原具有特異性之抗體。因此，使用此類庫，可鑑別具有所需結合特徵之現有抗體。為了以有效方式找到庫中之良好結合子，已設計出其中表型(亦即抗體或其片段)連接至其基因型(亦即編碼基因)的各種系統。最常用的此類系統為所謂噬菌體顯示系統，其中抗體片段表現、顯示為與絲狀噬菌體粒子表面上之噬菌體外殼蛋白融合，同時攜載編碼所顯示分子之遺傳資訊(McCafferty等人, 1990, 《自然》 348: 552-554)。顯示對特定抗原具有特異性之抗體片段的噬菌體可經由結合於相關抗原來選擇。接著可擴增經分離之噬菌體，且編碼所選抗體可變域之基因可視情況轉變至其他抗體型式，諸如全長免疫球蛋白，且使用此項技術中熟知之適當載體及宿主細胞以高量表現。替代地，「人類」抗體可藉由對本質上含有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠進行免疫接種來製成(Vaughan等人,(1998)《自然-生物技術》 16, 535-539)。
應瞭解，當抗體係用於向非人類個體投與時，抗體可針對所欲接受物種進行特定地設計/生產。
噬菌體粒子上所顯示之抗體特異性之型式可不同。最常用型式為Fab (Griffiths等人, 1994.《歐洲分子生物學學會會刊(
EMBO J.)》13: 3245-3260)及scFv (Hoogenboom等人, 1992, 《分子生物學雜誌(
J Mol Biol.)》 227: 381-388)，均包含抗體之可變抗原結合域。單鏈型式由經由可撓性連接子連接至可變輕鏈域(V
L)之可變重鏈域(V
H)構成(US 4,946,778)。在用作治療劑之前，抗體可轉變成可溶性型式(例如Fab或scFv)且按原樣分析。在後續步驟中，經鑑別具有所需特徵之抗體片段可轉變成其他型式，諸如全長抗體。
WO 98/32845及Soderlind等人
,(2000)《自然－生物技術》18: 852-856描述在抗體庫中產生變化性之技術。源自此庫之抗體片段均具有相同構架區且僅在其CDR方面不同。因為構架區具有生殖系序列，所以來源於該庫或使用相同技術產生之類似庫之抗體的免疫原性預期會尤其低(Soderlind等人, 2000, 同上)。此特性對於治療性抗體具有較大價值，降低患者形成所投與抗體之抗體的風險，由此降低過敏性反應、出現阻斷抗體的風險及允許抗體具有較長血漿半衰期。因此，當研發用於人類之治療性抗體時，現使用現代重組庫技術(Soderlind等人, 2001, 《組合化學和高通量篩選(
Chem.& High Throughput Screen. )》4: 409-416)優先於早期融合瘤技術。
藉由抗體，吾等亦包括在結構上衍生自駱駝科抗體，諸如Nanobodies
®(Ablynx)之重鏈抗體。此等為含有天然存在之重鏈抗體之結構及功能特性的抗體衍生之治療蛋白。在發現駱駝科動物(駱駝及駱馬)具有缺乏輕鏈之全功能性抗體之後，研發出Nanobody
®技術。此等重鏈抗體含有單一可變域(VHH)及兩個恆定域(C
H2及C
H3)。選殖及分離之VHH域為具有原始重鏈抗體之完整抗原結合能力的完全穩定多肽。具有獨特結構及功能特性之此等VHH域形成Nanobodies
®之基礎。其將習知抗體之優點(高目標特異性、高目標親和力及低固有毒性)與小分子藥物之重要特徵(抑制酶及接近鉗形受體(receptor cleft)之能力)組合。此外，其為穩定的，具有藉由除注射以外之手段投與的潛力，更易於製造且可人類化。(參見例如US 5,840,526；US 5,874,541；US 6,005,079；US 6,765,087；EP 1 589 107；WO 97/34103；WO97/49805；US 5,800,988；US 5,874, 541及US 6,015,695)。
較佳地，選擇性地結合至US28之ECD3的抗體或其他結合分子不結合相關多肽，諸如CCR5，或抗體以比針對相關多肽，諸如CCR5更大的親和力結合US28。較佳地，抗體以比相關多肽大至少5倍、或至少10倍或至少50倍之親和力結合US28。更佳地，抗體分子以比相關多肽大至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍的親和力結合US28。此類結合可藉由此項技術中熟知之方法測定，諸如Biacore®系統之一。
雙特異性抗體及其他雙特異性結合分子
在備受關注之一個實施例中，本發明之第一態樣之結合分子為或包含雙特異性結合分子。
舉例而言，根據本發明之第一態樣的雙特異性結合分子可包含能夠藉由特異性結合至位於效應細胞上之效應抗原來募集效應細胞之活性的第一域；及能夠特異性結合至經HCMV編碼之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基作為目標抗原的第二域(及視情況能夠特異性結合至經HCMV編碼之US28蛋白之ECD3的第三域)，其中該目標抗原可位於除效應細胞以外的目標細胞上。第二域為或包含根據本發明之第一態樣之結合分子。第三域為或包含與第二域不同的根據本發明之第一態樣之結合分子。
第一、第二及/或第三域之全部或部分可視情況藉由一或多個連接序列連接。第一域可包含多個功能域且彼等功能域中之每一者可直接或經由連接序列連接至相鄰域及/或可由超過一個單獨多肽序列形成。第二域可包含多個功能域且彼等功能域中之每一者可直接或經由連接序列連接至相鄰域及/或可由超過一個單獨多肽序列形成。第三域可包含多個功能域且彼等功能域中之每一者可直接或經由連接序列連接至相鄰域及/或可由超過一個單獨多肽序列形成。
在一或多個連接序列存在於本發明之多特異性(例如雙特異性或三特異性)結合分子中的情況下，則各連接序列可獨立地選自任何適合之連接序列。舉例而言，各連接序列長度可為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多個胺基酸殘基。各連接序列可包含任何天然存在之胺基酸。在一些實施例中，各連接序列可包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸或由其組成。在另一實施例中，該或各連接序列可包含甘胺酸及絲胺酸重複序列之集合或由其組成，諸如(Gly
4Ser)
n，其中n為等於或大於1之正整數，諸如2、3、4、5、6或更多。在一個實施例中，連接子為(Gly
4Ser)
3。連接子長度之變化可保持或提高活性，在活性研究中產生優良功效。
在一個實施例中，雙特異性結合分子為雙特異性抗體(bsAb)型式，諸如Suurs等人, 2019, 《藥理學及治療(Pharmacology & Therapeutics)》, 201: 103-119 (其內容以引用之方式併入本文中)中所述之彼等型式，且特定言之為Suurs等人, 2019 (同上)之圖1C中說明之型式中之一或多者，諸如TriMab、IgG樣BsAb、CrossMab、2:1 CrossMab、2:2 CrossMab、DuoBody、DVD-Ig BsAb、scFv-IgG及IgG-IgG、Fab-scFv-Fc、TF、ADAPTIR、BiTE、BiTE-Fc、DART、DART-Fc、四價DART、TandAb、ImmTAC、TriKE及scFv-scFv-scFv或三特異性奈米抗體型式。
在一個實施例中，第一及/或第二域可包含至少一個可變輕鏈及/或至少一個可變重鏈。在一個實施例中，第一及/或第二域可包含至少一個可變輕鏈及至少一個可變重鏈以形成scFv。在一個實施例中，第一域及/或第二域包含藉由連接子(例如小肽連接子)連接之scFv之非共價二聚體以形成雙功能抗體。在一個實施例中，第一域及/或第二域可包含多個雙功能抗體以形成串聯雙功能抗體(TandAb)。視情況，在一些實施例中，前述任一者可進一步包含例如對US28之ECD3具有結合特異性的第三域。
在一個實施例中，第一及/或第二域可進一步包含至少一個恆定輕鏈及/或至少一個恆定重鏈。舉例而言，第一及/或第二域可包含scFv，其進一步包含恆定輕鏈及恆定重鏈以形成Fab。在一個實施例中，第一及/或第二域包含多個Fab (例如兩個Fab)。視情況，在一些實施例中，前述任一者可進一步包含例如對US28之ECD3具有結合特異性的第三域。
在一個實施例中，第一及/或第二域可進一步包含至少一個Fc。舉例而言，第一及/或第二域可包含scFv，其進一步包含Fc以形成scFV-IgG。另外或替代地，第一及/或第二域可包含兩個Fab域，其進一步包含Fc以形成IgG。視情況，在一些實施例中，前述任一者可進一步包含例如對US28之ECD3具有結合特異性的第三域。
在一個實施例中，第一域可為視情況經由連接子連接至係scFv之第二域之scFv，以形成BiTE，視情況其中BiTE進一步包含Fc以形成BiTE-Fc。視情況，在一些實施例中，前述任一者可進一步包含例如對US28之ECD3具有結合特異性的視情況經由連接子連接的第三域。
在一個實施例中，第一域之VH或VL可分別與第二域之VH或VL交換，以形成包含第一域及第二域之DART，視情況其中DART進一步包含Fc以形成DART-Fc。另外或替代地，多種DART可連接至單一Fc以形成四價DART。
在一個實施例中，第一域及/或第二域呈T細胞受體形式，其可與呈scFv形式之第一域及/或第二域組合以形成ImmTAC。舉例而言，第一域可為scFv且第二域可為T細胞受體，較佳地其中該scFv對CD3之抗原決定基(亦即，CD3結合域)具有特異性，由此產生ImmTAC。視情況，在一些實施例中，前述任一者可進一步包含例如對US28之ECD3具有結合特異性的第三域。
在一個實施例中，第一域之效應細胞為免疫效應細胞，例如選自由以下組成之群組的免疫效應細胞：T細胞(例如CD4
+T細胞及/或CD8
+T細胞)、NK T細胞、NK細胞、巨噬細胞或其任何重組細胞(例如表現CAR之細胞，諸如CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR-M細胞)。在此類實施例中，雙特異性結合分子可以稱為『雙特異性免疫細胞接合子抗體』，其中「免疫細胞」可以取代效應細胞類型。舉例而言，若第一域之效應細胞係T細胞，則此類實施例可稱為『雙特異性T細胞接合子抗體』(BiTE，其可具有但不一定具有Suurs等人，2019，同上的圖1C中所示之BiTE或BiTE-Fc分子型式)，且若第一域之效應細胞係NK細胞，則此類實施例可以稱為『雙特異性NK細胞接合子抗體』等。
在一個實施例中，雙特異性結合分子的第一域對CD3的抗原決定基具有特異性，其可稱為CD3結合域。
在一個實施例中，CD3結合域可包含例如如本申請案之SEQ ID NO: 48序列所定義的OKT3重鏈可變區序列，或其實質上保留SEQ ID NO: 48序列之CD3結合特異性及/或親和力的功能變體或片段。其功能變體或片段可視情況包含對應於如由SEQ ID NO: 48所定義之OKT3重鏈可變區之CDR序列中之任一者、兩者或全部三者的一個、兩個或三個CDR。OKT3重鏈可變區之CDR序列分別如由SEQ ID NO: 49、50及51所定義，及/或抗體OKT3之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體。
在另一實施例中，CD3結合域可包含例如如本申請案之SEQ ID NO: 52序列所定義的OKT3輕鏈可變區序列，或其實質上保留SEQ ID NO: 52序列之CD3結合特異性及/或親和力的功能變體或片段。其功能變體或片段可視情況包含對應於如由SEQ ID NO: 52所定義之OKT3輕鏈可變區之CDR序列中之任一者、兩者或全部三者的一個、兩個或三個CDR。OKT3重鏈可變區之CDR序列分別如由SEQ ID NO: 53、54及55所定義，及/或抗體OKT3之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體。
在另一實施例中，CD3結合域可包含例如分別如藉由本申請案之SEQ ID NO: 48及52之序列所定義的OKT3重鏈可變區及OKT3輕鏈可變區之序列兩者，或任一者或兩者之功能變體或片段，諸如如上文所描述之功能變體或片段。
在一較佳實施例中，CD3結合域可包含例如如藉由本申請案之SEQ ID NO: 48及52之序列所定義的OKT3重鏈可變區及OKT3輕鏈可變區之序列兩者，其視情況藉由連接子，諸如具有序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56)之連接子接合。視情況藉由連接子接合的OKT3重鏈可變區及OKT3輕鏈可變區之此組合可形成OKT3之scFv。
因此，CD3結合域可為包含SEQ ID No: 48、56及52之序列的OKT3之scFv，該等序列按如下次序接合在一起，其中SEQ ID NO: 48之OKT3重鏈可變區在其C端處接合至SEQ ID NO: 56之連接序列的N端，該連接序列又在其C端處接合至SEQ ID NO: 52之輕鏈可變區OKT3的N端。替代地，可調換輕鏈區及重鏈區之次序，使得CD3結合域包含以彼次序接合在一起的SEQ ID NO: 52、56及48之序列。應瞭解，可使用其他連接序列代替SEQ ID NO: 56之示例性序列；其他連接序列可視情況包含序列GGGGS (SEQ ID NO: 57)之多個重複序列，且因此可具有序列[GGGGS]
n，其中n為2、3、4、5、6、7、8、9 10或更大之整數；或可含有任何其他適合之連接序列。
視情況，CD3結合域包含至少一個(較佳兩個) OKT3之scFv。舉例而言，雙特異性結合分子可包含含有兩個OKT3 scFv之第一域，視情況其中兩個scFv彼此直接連接或經由第二域間接連接。
視情況，本發明之結合分子在置於OKT3雙特異性型式中時可使腫瘤尺寸相對於對照減小(例如相對於不包括OKT3結合域之單特異性抗體)。此類腫瘤尺寸減小可例如使用實例10中所述之技術評估。
在一個實施例中，包含根據本發明之第一態樣之結合分子且對HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的雙特異性結合分子之第二域對作為表現US28之細胞及/或感染HCMV之細胞(其可例如經潛伏感染或裂解感染)之目標細胞具有結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性結合分子之第二域包含對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，該等CDR對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者：
(a) 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義；
(b) 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義；及/或
(c) 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義；
及/或抗體4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體(諸如本文所述之4H3C3或7B1F3人類化變體)。
視情況，根據此實施例之US28結合域可包含：
(a) 以下抗體之可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 196；197、293或294；及198所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
ii. 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 219；220、296或297；及221或298所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
iii. 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 242、243及244所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
及/或
(b) 抗體之可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 199或295；200或222；及201所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
ii. 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 199或295；222及223所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
iii. 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 199、245及246所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)。
較佳地，根據此實施例之US28結合域包含至少4種不同CDR序列，例如至少5或6種不同CDR序列。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第二域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 196、197及198之序列的CDR 1、2及3序列(或其人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成(或其人類化變體)；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 199、200及201之序列的CDR 1、2及3序列(或其人類化變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成(或其人類化變體)。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第二域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 219、220及221之序列的CDR 1、2及3序列(或其人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成(或其人類化變體)；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 199、222及223之序列的CDR 1、2及3序列(或其人類化變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成(或其人類化變體)。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第二域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 242、243及244之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 199、245及246之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成。
在一個實施例中，包含根據本發明之第一態樣之結合分子且對HCMV之US28蛋白之ECD3具有結合特異性的雙特異性結合分子之第三域對作為表現US28之細胞及/或感染HCMV之細胞(其可例如經潛伏感染或裂解感染)之目標細胞具有結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性結合分子之第三域包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，其對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者：
(a) 1D3，分別如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義；
(b) 1C10，分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義；
(c) 1A10，分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義；
(d) 1G9，分別如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義；及/或
(e) 1E8，分別如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義；
及/或抗體1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體。
視情況，根據此實施例之US28結合域可包含：
(a) 以下抗體之可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 1D3，分別如由SEQ ID NO: 8、9及10所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
ii. 1C10，分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
iii. 1A10，分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
iv. 1G9，分別如由SEQ ID NO: 76、77及78所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
v. 1E8，分別如由SEQ ID NO: 76、95及96所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
及/或
(b) 抗體之可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 1D3，分別如由SEQ ID NO: 14、15及16所定義；
ii. 1C10，分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
iii. 1A10，分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；
iv. 1G9，分別如由SEQ ID NO: 82、83及84所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)；及/或
v. 1E8，分別如由SEQ ID NO: 82、99及100所定義(及/或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者之功能變體)。
較佳地，根據此實施例之US28結合域包含至少4種不同CDR序列，例如至少5或6種不同CDR序列。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第三域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 8、9及10之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO:12之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 14、15及16之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO:18之序列、基本上由其組成或由其組成。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第三域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 76、77及78之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 68之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 82、83及84之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 72之序列、基本上由其組成或由其組成。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第三域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 76、95及96之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 88之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 82、99及100之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 92之序列、基本上由其組成或由其組成。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第三域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 112、113及114之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 104之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 117、83及118之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 108之序列、基本上由其組成或由其組成。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第三域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 112、113及114之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 122之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 117、83及118之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成。
另外或替代地，在另一選項中，根據此實施例之雙特異性結合分子之第三域可包含：(a)至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 138、139及140之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 130之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(b)至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含分別具有SEQ ID NO: 144、145及146之序列的CDR 1、2及3序列，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 134之序列、基本上由其組成或由其組成。
在一個實施例中，雙特異性結合分子之第一域為包含OKT3之全部六個CDR序列之scFv (較佳其中第一域為OKT3之scFv)，且雙特異性結合分子之第二域為包含4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之全部六個CDR序列之scFv (較佳其中第二域為4H3C3、7B1F3及/或2F5B11之scFv)，視情況其中第一及第二域經由連接子連接。視情況，存在第三域，其為包含1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之全部六個CDR序列之scFv (較佳其中第二域為1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之scFv)，視情況其中第三域經由連接子連接至第一及第二域中之任一者或兩者。
在一個實施例中，雙特異性結合分子之第一域包含兩個各自包含OKT3之全部六個CDR序列之scFv (較佳其中第一域包含OKT3之兩個scFv)；且雙特異性結合分子之第二域包含兩個Fab，其各自包含對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR (或如本文所述之其人類化變體)：
(a) 4H3C3，如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義(較佳其中第一域包含4H3C3之兩個Fab)；
(b) 7B1F3，如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義(較佳其中第一域包含7B1F3之兩個Fab)；及/或
(c) 2F5B11，如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義(較佳其中第一域包含2F5B11之兩個Fab)；
視情況其中存在第三域，其中雙特異性結合分子之第三域包含兩個Fab，其各自包含對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者的一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR：
(a) 1D3，如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義(較佳其中第一域包含1D3之兩個Fab)；
(b) 1C10，如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義(較佳其中第一域包含1C10之兩個Fab)；
(c) 1A10，如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義(較佳其中第一域包含1A10之兩個Fab)；
(d) 1G9，如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義(較佳其中第一域包含1G9之兩個Fab)；及/或
(e) 1E8，如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義(較佳其中第一域包含1E8之兩個Fab)；
且進一步包含Fc，視情況其中Fc對應於人類IgG之Fc。
在一些實施例中，第二及/或第三域之兩個Fab相同。在一些實施例中，第二域之兩個Fab對應於選自由4H3C3、7B1F3及2F5B11組成之群組的不同抗體。在一些實施例中，第三域之兩個Fab對應於選自由1D3、1C10、1A10、1G9及1E8組成之群組的不同抗體。
在一個特定實施例中，雙特異性結合分子為具有CD3結合OKT3 scFv域結合區之BiTE，且包含具有1D3抗體序列之US28 ECD3結合區，且更特定言之，較佳包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：
(i)第一多肽序列，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：包括1D3之V
H區的重鏈序列；視情況，一或多個C
H序列(諸如C
H1、C
H2及/或C
H3序列)；視情況存在之連接序列；及OKT3 scFv序列，例如具有SEQ ID NO: 58之序列的重鏈序列；及
(ii)第二多肽序列，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：包括4H3C3之V
L區的輕鏈序列，及視情況存在之C
L序列，例如具有SEQ ID NO: 59之序列的輕鏈序列。
在另一實施例中，4H3C3抗體之序列可在BiTE中經選自由7B1F3及2F5B11組成之群組的抗體之對應序列置換。
CAR/CAR T細胞及其他重組表現CAR之細胞
基於免疫療法之治療可基於嵌合抗原受體(CAR)。CAR為抗原之重組受體，其在單一分子中重導引T淋巴球及其他免疫細胞之特異性及功能(Sadelain等人 2013 《癌症發現(
Cancer Discov)》
3(4): 388)。
其用於癌症免疫療法中之一般前提為快速產生腫瘤靶向T細胞，繞過主動免疫之障礙及遞增動力學。一旦表現於T細胞中，經CAR修飾之T細胞獲得超生理學特性且充當可發揮即刻及長期作用之「活藥物」。將CAR工程改造至T細胞中需要培養T細胞以允許轉導及擴增。轉導可利用多種方法，但需要穩定的基因轉移以在純系擴展及持久T細胞中實現持續CAR表現。
原則上，任何細胞表面分子可經由CAR靶向，因此在限制T細胞反應性範圍的生理學T細胞譜系中超越對自體抗原及抗原識別差異之耐受性。
各種T細胞亞群以及T細胞前驅細胞及其他免疫細胞(諸如自然殺手細胞)可用CAR靶向。
使用諸如T細胞之經CAR工程改造之細胞的過繼性免疫療法為有前景的癌症治療方法(Han等人 2013 《兒科血液學和腫瘤學雜誌(
J Hematol Oncol)》
6: 47)。在過去幾十年中取得之顯著進展已促成研發更有效抗腫瘤免疫療法。舉例而言，併入腫瘤抗原特異性抗體之單鏈可變片段(scFv)及T細胞受體之信號傳導域呈現具有抗體特異性及細胞毒性T淋巴球之細胞毒性的CAR。CAR以MHC非依賴性方式賦予T細胞抗原特異性識別、活化及增殖。此外，CAR繞過許多癌細胞藉此逃逸免疫識別之機制。此等機制包括下調MHC、降低共刺激分子表現、誘導遏制細胞介素及募集調節性T細胞。除此等有益作用以外，CAR之技術可行性使其在過繼性免疫療法之研發中甚至更具吸引力。臨床前及臨床研究之觀測結果已揭露經CAR介導之免疫療法在多種癌症，包括淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病、黑素瘤及神經母細胞瘤中的極令人鼓舞的治療功效。
在一個實施例中，本發明之第一態樣之結合分子可為CAR，例如包含以下：
(i) 胞外域，其中該胞外域包含如上文所定義之結合分子(諸如抗體)或該結合分子之功能片段或由其組成；
(ii) 跨膜域；及
(iii) 胞內域；
其中該CAR之胞外域對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內的抗原決定基具有結合特異性，且
其中該US28蛋白之ECD1及ECD3包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白的位置1至37及167至183。
視情況：
(a)該CAR之胞外域對完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內的抗原決定基具有結合特異性；
(b)該CAR之胞外域對US28蛋白之ECD1及/或ECD3內的線性抗原決定基具有結合特異性；
(c)該CAR之胞外域對HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內的抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性，例如對HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內的抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性對選自由以下組成之群組的HCMV病毒株中之兩者或更多者(諸如全部)係未定性：DB、Towne、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR、VHL/E 及VR1814 (FIX)；及/或
(d)該CAR之胞外域對HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內的抗原決定基具有特異性，無論US28蛋白之ECD3是否包含以下序列：
- 如在由大部分HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)，或
- 如在由少數HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)。
在一個較佳實施例中，CAR之胞外域可包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，其對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者(或如本文所述之其人類化變體)：
(a) 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 196、197、198、199、200及201所定義，及/或抗體4H3C3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 219、220、221、199、222及223所定義，及/或抗體7B1F3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；及/或
(c) 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 242、243、244、199、245及246所定義，及/或抗體2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
且視情況進一步包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，其對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者：
(d) 1D3，分別如由SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及16所定義，及/或抗體1D3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(e) 1C10，分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義，及/或抗體1C10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(f) 1A10，分別如由SEQ ID NO: 112、113、114、117、83及118所定義，及/或抗體1A10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(g) 1G9，分別如由SEQ ID NO: 76、77、78、82、83及84所定義，及/或抗體1G9之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；及/或
(h) 1E8，分別如由SEQ ID NO: 76、95、96、82、99及100所定義，及/或抗體1E8之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體。
另外或替代地，CAR之胞外域可包含：
(a) 以下抗體之可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 196、197及198所定義(或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；
ii. 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 219、220及221所定義(或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；及/或
iii. 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 242、243及244所定義(或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體)；
且視情況進一步包含：
iv. 1D3，分別如由SEQ ID NO: 8、9及10所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
v. 1C10，分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
vi. 1A10，分別如由SEQ ID NO: 112、113及114所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
vii. 1G9，分別如由SEQ ID NO: 76、77及78所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；及/或
viii. 1E8，分別如由SEQ ID NO: 76、95及96所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
及/或
(b) 抗體之可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
i. 4H3C3，分別如由SEQ ID NO: 199、200及201所定義(或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；
ii. 7B1F3，分別如由SEQ ID NO: 199、222及223所定義(或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；及/或
iii. 2F5B11，分別如由SEQ ID NO: 199、245及246所定義(或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體)；
且視情況進一步包含：
iv. 1D3，分別如由SEQ ID NO: 14、15及16所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
v. 1C10，分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
vi. 1A10，分別如由SEQ ID NO: 117、83及118所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
vii. 1G9，分別如由SEQ ID NO: 82、83及84所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)；
viii. 1E8，分別如由SEQ ID NO: 82、99及100所定義(或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)。
另外或替代地，CAR之胞外域可包含：
(a) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含具有以下序列之CDR 1、2及3序列：
i. 分別SEQ ID NO: 196、197及198 (或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；
ii. 分別SEQ ID NO: 219、220及221 (或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；及/或
iii. 分別SEQ ID NO: 242、243及244 (或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
及視情況：
iv. 分別SEQ ID NO: 8、9及10 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 12之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
v. 分別SEQ ID NO: 112、113及114 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 104之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
vi. 分別SEQ ID NO: 112、113及114 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 122之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
vii. 分別SEQ ID NO: 76、77及78 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 68之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；及/或
viii. 分別SEQ ID NO: 76、95及96 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 88之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
及/或
(b) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含具有以下序列之CDR 1、2及3序列：
i. 分別SEQ ID NO: 199、200及201 (或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
L)多肽序列包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；
ii. 分別SEQ ID NO: 199、222及223 (或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
L)多肽序列包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體，諸如如本文所述之其人類化變體)；及/或
iii. 分別SEQ ID NO: 199、245及246 (或該等CDR序列中之任一者、兩者或三者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
L)多肽序列包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
及視情況：
iv. 分別SEQ ID NO: 14、15及16 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 18之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
v. 分別SEQ ID NO: 117、83及118 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 108之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
vi. 分別SEQ ID NO: 117、83及118 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；
vii. 分別SEQ ID NO: 82、83及84 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 72之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)；及/或
viii. 分別SEQ ID NO: 82、99及100 (或該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體)，且視情況其中至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 92之序列、基本上由其組成或由其組成(或其功能變體)。
選自SEQ ID NO: 187、189、211、213、233、235、12、18、68、72、88、92、104、108、122或126之參考序列之功能變體可視情況與所定義參考物具有至少70%序列一致性，例如與所定義之胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且更一般而言95-99%序列一致性(例如96%、97%、98%或99%序列一致性)。變異可僅在可變重鏈或輕鏈之功能變體之序列之非CDR區內，僅在序列之CDR區內，或在序列之非CDR區及CDR區內。應瞭解，若變異包括於功能變體之CDR區中，則變異可分別在重鏈可變區或輕鏈可變區之一個CDR、兩個CDR或三個CDR內。通常，變異係在CDR區之外。功能變體可選自SEQ ID NO: 256-271
在某些實施例中，CAR之胞外域為以下或包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：抗體、視情況人類化抗體、例如單鏈可變片段(scFv)或其功能變體之序列，其中該抗體及其功能變體為根據本發明之第一態樣之結合分子。
scFv可在其VL區與VH區之間包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個或更多個胺基酸殘基之連接子。連接子可包含任何天然存在之胺基酸。在一些實施例中，連接序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，連接序列包含甘胺酸及絲胺酸重複序列之集合，諸如(Gly
4Ser)
n，其中n為等於或大於1之正整數，諸如2、3、4、5、6或更大。在一個實施例中，連接子為(Gly
4Ser)
3。連接子長度之變化可保持或提高活性，在活性研究中產生優良功效。
scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下取向中之任一者：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
如本文所描述之CAR包含跨膜域。藉由跨膜域，吾等包括任何部分能夠嵌入於脂膜中的意義。藉由嵌入於脂膜中，吾等包括跨膜域有利地與構成脂膜之脂質的疏水性部分相互作用之意義。插入脂膜中可使用此項技術中已知之任何適合方法分析，包括用螢光顯微法進行螢光標記。因此，應瞭解，跨膜域為一種使CAR分子定位於脂膜內之跨膜域。
視情況，跨膜域包含蛋白質(例如跨膜蛋白)之跨膜域，例如跨膜受體蛋白之跨膜域。在一實施例中，跨膜域為與CAR之其他域中之一者相關聯的跨膜域。在一實施例中，跨膜域包含構成胞內信號傳導域之至少部分之胞內信號傳導蛋白質的跨膜部分。在一些情況下，跨膜域可藉由胺基酸取代選擇或修飾以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，例如將與受體複合物之其他成員的相互作用減至最少。在一些情況下，跨膜域能夠與細胞表面上之另一CAR均二聚。
跨膜域可來源於天然或重組來源。該域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個實施例中，每當CAR已結合至目標時，跨膜域能夠向胞內域傳導信號。適用於本發明之跨膜域可以包括T細胞受體之α鏈、β鏈或ζ鏈之跨膜區CD28、CD3ε、CD8、CD45及CD4。
跨膜域可包括一或多個與跨膜區相鄰之額外胺基酸，諸如一或多個與跨膜域所源自之蛋白質之胞外區有關的胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15個胞外區胺基酸)及/或一或多個與跨膜蛋白所源自之蛋白質的胞內區有關之額外胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15個胞內區胺基酸)。
在某些實施例中，CAR之胞外域藉由鉸鏈區連接至跨膜域。鉸鏈區可包含一或多個免疫球蛋白域。特定實例包括IgG1之Fc區及CD4及CD8之免疫球蛋白樣胞外區。應瞭解，當選擇性結合US28之抗體為scFv分子時，鉸鏈區可用於延伸scFv之範圍以允許其連接至跨膜域而不影響其結合至US28。鉸鏈可來自人類蛋白質，諸如人類免疫球蛋白。鉸鏈區可例如為CD8α鉸鏈區(例如，如An等人, 2016, 《腫瘤標靶(
Oncotarget)》,
7:10638-10649中所描述，其內容以引用之方式併入本文中)。
通常，跨膜域主要包含疏水性胺基酸殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。
在實施例中，短寡肽或多肽連接子(諸如長度在2與10個胺基酸之間)可在CAR之跨膜域與胞內信號傳導域之間形成連接。連接子可例如包含甘胺酸及/或絲胺酸殘基。適合連接子之一個實例為甘胺酸絲胺酸二聯體。
藉由胞內信號傳導域，吾等包括以下意義：域能夠活化其中引入CAR之細胞之正常功能中之至少一者，諸如免疫細胞(例如T細胞)之正常效應功能中之至少一者。效應功能係指細胞之專門功能。T細胞之效應功能例如可為細胞溶解功能或輔助活性，包括細胞介素之分泌。因此，胞內信號傳導域可為轉導效應功能信號及導引細胞(例如T細胞)執行專門功能之蛋白質的一部分。
一般而言，可使用整個胞內信號傳導域；然而，應瞭解，不必使用整個域，條件為所使用之信號傳導域之任何部分仍能夠轉導效應功能信號。亦應瞭解，亦可使用具有實質上相同或更大功能性能力之此類胞內信號傳導域的變體。藉此，吾等包括如下意義：變體應具有效應功能信號之實質上相同或更大的轉導。通常，實質上相同或更大的信號轉導包括未經修飾之胞內信號傳導域之至少80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%或120%或更大的信號轉導，其中未經修飾之胞內信號傳導域之信號轉導對應於100%。
用於評定效應功能信號之轉導的方法為熟習此項技術者所熟知且包括例如評定指示轉導信號之分子(例如蛋白質，諸如細胞介素)之量及/或活性。因此，當信號為T細胞之溶胞功能時，方法可涉及量測由T細胞分泌之一或多種細胞介素，已知該等細胞介素具有溶胞活性(例如IFNγ)且在量測目標細胞溶解之後。
用於本發明之CAR的胞內信號傳導域之實例包括共同作用以在抗原受體接合後起始信號轉導的T細胞受體(TCR)及輔助受體之細胞質序列，以及此等序列及具有相同功能性能力之任何重組序列的任何衍生物或變體。
已知單獨TCR產生之信號不足以完全活化T細胞且亦可需要二級及/或共刺激信號。因此，T細胞活化可稱為由兩種不同類別之胞內信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性主要活化者(主要胞內信號傳導域)及以抗原非依賴性方式起作用以提供次要或共刺激信號者(次要胞內信號傳導域，諸如共刺激域)。共刺激域促進效應功能之活化且亦可促進細胞之效應功能及/或存活之持久性。
主要胞內信號傳導域以刺激方式或抑制方式調節TCR複合物之主要活化。以刺激方式起作用之主要胞內信號傳導域可含有信號傳導模體，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體或ITAM (例如2、3、4、5或更多個ITAM)。因此，胞內信號傳導域可包含一或多個ITAM。特定用於本發明之含有ITAM之主要胞內信號傳導域的實例包括CD3ζ、Fc受體γ、Fc受體β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之彼等主要胞內信號傳導域。
在一個實施例中，本發明之CAR包含CD3-ζ之胞內信號傳導域。
應瞭解，胞內信號傳導域之一或多個ITAM可例如藉由突變修飾。與原生ITAM域相比，修飾可用於提高或降低ITAM之信號傳導功能。
如上文所提及，胞內信號傳導域本身可包含主要胞內信號傳導域，或其可包含主要胞內信號傳導域以及一或多個次級胞內信號傳導域，諸如一或多個共刺激信號傳導域。因此，CAR之胞內信號傳導域本身可包含CD3ζ信號傳導域或與一或多個其他胞內信號傳導域(諸如一或多個共刺激信號傳導域)組合。
共刺激信號傳導域係指CAR中包含共刺激分子之胞內域的一部分。共刺激分子可為除免疫細胞(例如淋巴球)對抗原之有效反應所需的抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子。此類分子之實例包括CD28、4-1BB (CD137)、OX40、ICOS、DAP10、CD27、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴球功能相關之抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特異性結合CD83之配位體及其類似物。舉例而言，CD27共刺激已證明可增強活體外人類CAR T細胞之擴增、效應功能及存活且增強活體內人類T細胞之持久性及抗腫瘤活性(Song等人, 《血液》2012,
119(3):696-706)。
本發明之CAR的胞內部分中之胞內信號傳導序列可以隨機或指定次序彼此連接。視情況，例如長度在2個與10個胺基酸之間(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)之短寡肽或多肽連接子可在胞內信號傳導序列之間形成連接。在一個實施例中，甘胺酸-絲胺酸二聯體可用作適合連接子。在另一實施例中，單一胺基酸，諸如丙胺酸或甘胺酸可用作適合的連接子。
在一個實施例中，胞內信號傳導域經設計以包含兩個或兩個以上，例如3、4、5個或更多個共刺激信號傳導域。在一實施例中，兩個或兩個以上(例如2、3、4、5個或更多個)共刺激信號傳導域藉由連接分子(諸如本文中所描述之連接分子)分離。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含兩個共刺激信號傳導域。在一些實施例中，連接子分子為甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接子為丙胺酸殘基。
在一較佳實施例中，CAR之胞內部分包含CD3ζ之信號傳導域及CD28之信號傳導域。
在另一實施例中，CAR之胞內部分包含CD3-ζ之信號傳導域及4-1BB之信號傳導域。
在另一實施例中，CAR之胞內部分包含CD3-ζ之信號傳導域及OX40之信號傳導域。
在另一實施例中，CAR之胞內部分包含CD3-ζ之信號傳導域及ICOS之信號傳導域。
在另一實施例中，CAR之胞內部分包含CD3-ζ之信號傳導域及DAP10之信號傳導域。
在另一實施例中，CAR之胞內部分包含CD3-ζ之信號傳導域、4-1BB之信號傳導域及OX40之信號傳導域。
CAR之其他視情況選用之組分
在實施例中，CAR可進一步包含前導序列。藉由「前導序列」，吾等包括肽序列可將CAR引導至細胞膜的意義。因此，當CAR為嵌合融合蛋白時，其可在胺基端(N端)含有前導序列。視情況，前導序列在CAR細胞加工及定位至細胞膜期間自CAR裂解。
在另一實施例中，CAR可包含誘導性自殺部分。藉由誘導性自殺部分，吾等包括以下意義：分子具有引起細胞死亡之誘導性能力，在該細胞細胞膜中CAR駐存(例如T細胞)。以此方式，可經由選擇性缺失包含CAR之細胞來嚴格控制CAR對個體之影響。方便地，自殺部分包含具有直接或間接細胞毒性之抗體之抗原決定基。具有直接細胞毒性之抗體包括結合於CD20之裂解抗體，諸如利妥昔單抗(Rituximab)。因此，在一個實施例中，CAR可包含CD20抗原決定基。抗體亦可藉由結合至一或多個細胞毒性部分而間接地具有細胞毒性。
在一個較佳實施例中，CAR包含：(i)胞外域，其中胞外域包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：根據本發明之第一態樣的選擇性結合至US28多肽之ECD3的抗體(例如，scFv片段)；(ii)跨膜域；及(iii)胞內信號傳導域(例如，包含諸如CD3ζ之主要信號傳導域的胞內信號傳導域，及視情況，諸如CD28、4-1BB、OX40、ICOS及DAP10之一或多個共刺激域)。
融合多肽：
在另一選項中，如由本發明之第一態樣所定義之結合分子可包含融合多肽序列，其中融合多肽序列包含融合第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，且其中第一胺基酸序列包含結合分子之多肽鏈或其功能片段之多肽鏈中的至少一者或由其組成，且第二胺基酸序列為融合搭配物。
可選擇任何相關融合搭配物。熟習此項技術者熟知此項技術中已知之融合搭配物序列，且可選擇任何序列。融合搭配物可例如提供額外或替代的結合特性；其可提供效應部分，該效應部分在結合分子之結合位點處產生作用(實例包括能夠擴增免疫反應或誘導對由結合分子結合之任何細胞的直接破壞的序列，例如細胞毒性序列)；其可提供結合分子之循環半衰期之調節(諸如增加或減少)；其可提供促進該結合分子之捕獲、回收或純化的序列；及/或其可提供促進該結合分子之偵測的序列。
結合物：
根據本發明之第一態樣之結合分子可包括及/或連接至至少一種藥劑以形成結合物，諸如抗體結合物。該藥劑可視情況為非蛋白質，諸如小分子藥物或其他藥劑，其可為例如低分子量(＜900道爾頓)有機化合物。
為了增加抗體分子及其他結合劑作為診斷劑或治療劑之功效，習知地連接或共價結合或複合至少一個所需分子或部分。此類分子或部分可為(但不限於)至少一個效應子或報導分子。效應分子可包含具有所需活性之分子，例如藥物、細胞毒素劑、免疫抑制劑、消炎劑等。此類分子可視情況經由可裂解連接子連接至抗體分子或其他結合劑，該可裂解連接子經設計以允許分子在目標位點處或附近釋放。
該所需分子或部分可視情況在細胞外環境中選擇性地具有活性或在細胞內環境中選擇性地具有活性。如上文所論述，US28為GCPR，其向質膜遷移允許其經結合分子直接靶向且其由於其胞吞作用而用作有效負載之轉運蛋白，該胞吞作用為組成性的或由於配位體結合而發生。GCPR一般構成由經批准藥物靶向之最大蛋白質家族(Sriram及Insel, 《分子藥理學(
Mol Pharmacol)》, 2018,
93(4): 251-258)。因此，與US28之ECD1 (及視情況ECD3)具有結合特異性的本發明之結合分子可用於藉由表現US28之細胞(特定言之，HCMV感染細胞)實現一或多種所需分子或部分(諸如在細胞內環境中選擇性地具有活性的所需分子或部分)的內化，該內化係藉由使該一或多種所需分子或部分與本發明之結合分子結合來達成。
相比之下，報導分子定義為可使用分析法偵測的任何部分。已與抗體及其他結合劑結合之報導分子之非限制性實例包括酶、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、光親和分子、著色粒子或配位體，諸如生物素。
此類結合物通常用作診斷劑。此等診斷劑一般屬於兩類：用於活體外診斷，諸如多種免疫分析及/或免疫組織化學(IHC)中之診斷劑；及用於活體內診斷方案之診斷劑，一般稱為「抗體針對性成像」。此項技術中已知許多適當成像劑，以及用於其附著至抗體及其他此類結合分子的方法(參見例如，美國專利5,021,236、4,938,948及4,472,509)。所用成像部分可為順磁性離子、放射性同位素、螢光染料、NMR可偵測之物質及X射線成像劑。
在順磁性離子之情況下，可例如提及諸如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、鈣(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)及/或鉺(III)之離子，其中釓尤佳。可用於其他情形，諸如X射線成像之離子包括但不限於鑭(III)、金(III)、鉛(II)且尤其是鉍(III)。
在用於治療及/或診斷應用之放射性同位素之情況下，可提及砹
211、
14碳、
51鉻、
36氯、
57鈷、
58鈷、銅
67、
152Eu、鎵
67、
3氫、碘
123、碘
125、碘
131、銦
111、
59鐵、
32磷、錸
186、錸
188、
75硒、
35硫、鎝
99m及/或釔
90。
125I通常較佳用於某些實施例中，且鎝
99m及/或銦
111亦由於其能量低及適用於遠程偵測而通常較佳。放射性標記之單株抗體可根據此項技術中熟知之方法產生。舉例而言，單株抗體及其他結合劑可藉由與碘化鈉及/或碘化鉀及化學氧化劑(諸如次氯酸鈉)或酶氧化劑(諸如乳過氧化酶)接觸而碘化。單株抗體及其他結合劑可藉由配位體交換法，例如藉由用亞錫溶液還原高鎝酸鹽，將經還原之鎝螯合至葡聚糖凝膠管柱上且將該抗體施加至此管柱來用鎝
99m標記。替代地，可以使用直接標記技術，例如藉由溫育高鎝酸鹽、還原劑(諸如SNCl
2)、緩衝溶液(諸如鄰苯二甲酸鈉-鉀溶液)及該抗體。中間官能基通常用於將放射性同位素結合至抗體或其他結合劑，且以金屬離子形式存在，為二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或伸乙基二胺四乙酸(EDTA)。
在涵蓋用作結合物之螢光標記中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、異硫氰酸螢光素、HEX、6-JOE、俄勒岡綠(Oregon Green) 488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(Pacific Blue)、REG、若丹明綠(Rhodamine Green)、若丹明紅、腎造影劑(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明及/或德克薩斯紅(Texas Red)。
所涵蓋之另一類結合物為主要意欲用於活體外之結合物，其中抗體或其他結合分子連接至將在與發色基質接觸時產生有色產物的二級結合配位體及/或酶(酶標籤)。適合酶之實例包括尿素酶、鹼性磷酸酶、(辣根)氫過氧化酶或葡萄糖氧化酶。較佳之二級結合配位體為生物素及抗生素蛋白及卵白素化合物。此類標記之使用為熟習此項技術者熟知的且描述於例如美國專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149及4,366,241中。
此項技術中已知用於抗體或其他結合分子與其結合部分之連接或結合的若干方法。一些連接方法涉及使用金屬螯合劑複合物，採用例如有機螯合劑，諸如二伸乙三胺五乙酸之酸酐(DTPA)；伸乙基三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺醯胺；及/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3連接至抗體(美國專利4,472,509及4,938,948)。單株抗體或其他結合分子亦可在諸如戊二醛或過碘酸鹽之偶合劑存在下與酶反應。帶有螢光素標記之結合物係在該等偶合劑存在下或藉由與異硫氰酸鹽反應來製備。在美國專利4,938,948中，乳房腫瘤之成像係使用單株抗體實現且可偵測成像部分使用諸如甲基-對羥基苯甲亞胺酸酯或N-琥珀醯亞胺基-3-(4-羥苯基)丙酸酯之連接子結合至抗體。
在其他實施例中，涵蓋藉由使用不改變抗體組合位點之反應條件，在免疫球蛋白之Fc區中選擇性引入硫氫基進行免疫球蛋白或其他結合分子之衍生作用。揭示的根據此方法產生之抗體結合物展現改善之耐久性、特異性及敏感性(美國專利5,196,066，以引用的方式併入本文中)。文獻中亦已揭示效應分子或報導分子之位點特異性連接，其中報導分子或效應分子係結合至Fc區中之碳水化合物殘基。
前藥：
應瞭解，本發明之第一態樣之結合分子可以「前藥」形式投與。舉例而言，在前藥形式中，分別選擇性地結合至US28之ECD1或ECD3之結合分子之ECD1及/或ECD3結合部分可以僅在目標細胞(例如表現US28及/或潛伏及/或裂解感染HCMV之彼等細胞)之地點中選擇性地揭露之方式經遮蔽。
如本申請案中所用之術語「前藥」係指生物或醫藥活性物質之前驅體或衍生物形式，其活性低於親本生物或醫藥活性物質且能夠以酶方式活化或轉化為活性較大的親本形式(參見例如D. E. V. Wilman 《癌症化療中的前藥(Prodrugs in Cancer Chemotherapy)》 《生物化學學會學報(Biochemical Society Transactions)》 14, 375-382 (第615次會議, Belfast 1986)及V. J. Stella等人, 「前藥：靶向藥遞送的化學方法(Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery)」 Directed Drug Delivery R. Borchardt等人,(編)第247-267頁(胡馬納出版社(Humana Press)1985))。
B. 核酸分子 本發明之第二態樣提供一種核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中核酸分子包含或多個不同核酸分子之組合共同地包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合方式編碼藉由本發明之第一態樣之結合分子提供之一或多條多肽鏈。
根據本發明之第二態樣之核酸分子或各核酸分子可例如為DNA (例如基因體DNA或互補DNA)或RNA (例如mRNA分子、活體外轉錄RNA或合成RNA)。在一個實施例中，核酸分子或各核酸分子為cDNA分子。其可包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何基質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在修飾，則可在聚合物組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。編碼本發明抗體之核酸分子的一些特定實例描述於本文中。其他適合序列可基於抗體結構及遺傳密碼之知識容易地確定。
藉由術語「活體外轉錄RNA」，吾等包括以下意義：已在活體外合成之RNA，包括mRNA。一般而言，活體外轉錄RNA係由活體外轉錄載體或PCR產生之聚核苷酸模板產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄之RNA的模板。用於產生供轉染用之mRNA的方法可以包括用專門設計之引子活體外轉錄模板，隨後添加聚腺苷酸，以產生構築體，該構築體含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、待表現之核酸及聚腺苷酸尾(長度通常為50-2000個鹼基)。此類RNA可用於有效轉染不同種類之細胞，如下文進一步描述。
根據本發明之第二態樣，核酸分子或多個不同核酸分子之組合可經分離。藉由「分離」，吾等包括以下視情況存在之意義：核酸分子不位於細胞內或以其他方式提供於細胞內。
根據本發明之第二態樣之核酸分子或各核酸分子可為單股的。替代地，根據本發明之第二態樣之核酸分子或各核酸分子可為雙股的。
在本發明之第一態樣之結合分子由單一連續胺基酸序列形成的情況下，則其可由根據本發明之單一核酸分子編碼序列編碼。
在本發明之第一態樣之結合分子由兩個或更多個單獨多肽序列形成的情況下，則各單獨多肽序列可由單獨核酸分子編碼，使得結合分子之全部由多個不同核酸分子之組合編碼；替代地，結合分子之兩個或兩個以上單獨多肽序列可由包含多個不同編碼序列之單一核酸分子編碼，其中彼等多個不同編碼序列分別編碼結合分子之不同兩個或兩個以上單獨多肽序列中之每一者。
在一個實施例中，根據本發明之第二態樣之核酸分子編碼本發明之結合分子或第一態樣或其部分，其包含抗體重鏈或其可變區。
在一個實施例中，根據本發明之第二態樣之核酸分子編碼本發明之結合分子或第一態樣或其部分，其包含抗體輕鏈或其可變區。
在一個實施例中，根據本發明之第二態樣之核酸分子或根據本發明之第二態樣之多個不同核酸分子的組合共同地編碼本發明之結合分子或第一態樣或其部分，其包含抗體重鏈或其可變區及抗體輕鏈或其可變區兩者。
因此，應瞭解，核酸分子或多個不同核酸分子之組合可編碼本發明之第一態樣之結合分子中之任一者(諸如抗體、其片段、融合蛋白、CAR等)，包括如上文所定義之特定胺基酸序列之變體，或其部分。
在一個實施例中，根據本發明之第二態樣之核酸分子包含(或根據本發明之第二態樣之多個不同核酸分子之組合共同地包含)：
a) 編碼可變重鏈序列之核苷酸序列，該可變重鏈序列包含以下序列：
i. 分別編碼4H3C3之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 190、191及192；
ii. 分別編碼7B1F3之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 214、215及216；
iii. 分別編碼2F5B11之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 236、237及238；
及視情況：
iv. 分別編碼1D3之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 22、23及24；
v. 分別編碼1C10之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 109、110及111；
vi. 分別編碼1A10之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 109、110及111；
vii. 分別編碼1G9之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 73、74及75；及/或
viii. 分別編碼1E8之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 73、93及94；
及
b) 編碼可變輕鏈序列之核苷酸序列，該可變輕鏈序列包含以下序列：
i. 分別編碼4H3C3之V
L-CDR1、V
L-CDR2及V
L-CDR3序列的SEQ ID NO: 193、194及195；
ii. 分別編碼7B1F3之V
L-CDR1、V
L-CDR2及V
L-CDR3序列的SEQ ID NO: 251、217及218；
iii. 分別編碼2F5B11之V
L-CDR1、V
L-CDR2及V
L-CDR3序列的SEQ ID NO: 239、240及241；
及視情況：
iv. 分別編碼1D3之V
L-CDR1、V
L-CDR2及V
L-CDR3序列的SEQ ID NO: 28、29及30；
v. 分別編碼1C10之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 115、80及116；
vi. 分別編碼1A10之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 115、80及116；
vii. 分別編碼1G9之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 79、80及81；及/或
viii. 分別編碼1E8之V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列的SEQ ID NO: 79、97及98；
或此等序列中之任一者之功能變體，例如在該等SEQ ID NO中之任一者或多者內包含1、2、3、4或5個核苷酸取代之變體，及/或與該等SEQ ID No具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%序列一致性之變體。舉例而言，該變異核酸或各變異核酸變化可為沉默突變，且因此不改變其編碼之胺基酸序列。
在另一實施例中，根據本發明之第二態樣之核酸分子包含(或根據本發明之第二態樣之多個不同核酸分子之組合共同地包含)：
a) 包含選自由SEQ ID NO: 183、207、229、26、102、120、66及86組成之群組之序列的核苷酸序列，其分別編碼4H3C3、7B1F3、2F5B11、1D3、1C10、1A10、1G9及1E8之可變重鏈序列，及
b) 包含選自由SEQ ID NO: 185、209、231、32、106、124、70及90組成之群組之序列的核苷酸序列，其分別編碼4H3C3、7B1F3、2F5B11、1D3、1C10、1A10、1G9及1E8之可變輕鏈序列，
或此等序列中之任一者之功能變體，例如與該等SEQ ID No具有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%序列一致性之變體。
在另一實施例中，根據本發明之第二態樣之核酸分子包含(或根據本發明之第二態樣之多個不同核酸分子之組合共同地包含)：
a) 包含以下序列之核苷酸序列：
i. SEQ ID NO: 178 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 180所定義之4H3C3之重鏈之完全成熟序列；
ii. SEQ ID NO: 202 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 204所定義之7B1F3之重鏈之完全成熟序列；
iii. SEQ ID NO: 224 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 226所定義之2F5B11之重鏈之完全成熟序列；
及視情況：
iv. SEQ ID NO: 34 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 20所定義之1D3之重鏈之完全成熟序列；
v. SEQ ID NO: 155 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 157所定義之1C10之重鏈之完全成熟序列；
vi. SEQ ID NO: 159 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 161所定義之重鏈1A10之之完全成熟序列；
vii. SEQ ID NO: 147 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 149所定義之1G9之重鏈之完全成熟序列；及/或
viii. SEQ ID NO: 151 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 153所定義之1E8之重鏈之完全成熟序列；
及
b) 包含以下序列之核苷酸序列：
i. SEQ ID NO: 179 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 181所定義之4H3C3之重鏈之完全成熟序列；
ii. SEQ ID NO: 203 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 205所定義之7B1F3之重鏈之完全成熟序列；
iii. SEQ ID NO: 225 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 227所定義之2F5B11之重鏈之完全成熟序列；
及視情況：
iv. SEQ ID NO: 35 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，如由SEQ ID NO: 21所定義之1D3之輕鏈之完全成熟序列；
v. SEQ ID NO: 156 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 158所定義之1C10之輕鏈之完全成熟序列；
vi. SEQ ID NO: 160 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 162所定義之1A10之輕鏈之完全成熟序列；
vii. SEQ ID NO: 148 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 150所定義之1G9之輕鏈之完全成熟序列；及/或
viii. SEQ ID NO: 152 (具有或不具有如所指示之前導序列編碼區，且若不具有，則視情況包含編碼替代前導序列之序列)，其編碼如由SEQ ID NO: 154所定義之1E8之輕鏈之完全成熟序列；
或此等序列中之任一者之功能變體，例如與該等SEQ ID No具有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%序列一致性之變體(視情況，其中序列一致性係相對於不具有如所指示之前導序列編碼區之該等序列測定)。
根據前述實施例，該等所定義核酸序列之功能變體可例如為以上核酸序列中之任一者之取代、缺失及/或添加變體。變異聚核苷酸可包含序列表中所給定之序列之1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多75或更多種核酸取代及/或缺失。
在一些實施例中，變體可與本文中所揭示之核酸序列中之任一者之聚核苷酸至少70%同源、較佳與其至少80%或90%且更佳至少95%、97%或99%同源。較佳地，此等程度下之同源性及一致性至少相對於聚核苷酸之編碼區存在。量測同源性之方法為此項技術中熟知，且熟習此項技術者應理解，在本發明情形下，基於核酸一致性計算同源性。此類同源性可存在於至少15個、較佳至少30個、例如至少40、60、100、200個或更多個連續核苷酸之區內。如此同源性可遍及未經修飾之聚核苷酸序列之全部長度存在。
視情況，在本文所述之一些變異核酸序列中，編碼可變重鏈及可變輕鏈內存在之六個CDR序列中之任一者或多者的區之序列可為保守性的，且在別處存在任何序列變異；或在另一選項中，編碼可變重鏈及可變輕鏈內存在之六個CDR序列中之任一者或多者的區中之變異的程度及/或性質與其餘之核酸分子或各核酸分子相比可經最小化。舉例而言，可變重鏈及可變輕鏈內存在之六個CDR序列中之任一者或多者的區內或各區內之變化程度可限於1、2、3、4或5個核苷酸取代及/或展現與對應非變異CDR編碼區具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%序列一致性之CDR編碼區。該變異核酸或各變異核酸之變化形式可例如為沉默突變，且因此不改變其編碼之胺基酸序列之序列；此在編碼V
H-CDR1、V
H-CDR2及V
H-CDR3序列及/或V
L-CDR1、V
L-CDR2及V
L-CDR3序列中之任一者或多者的區中可為(儘管不必需)尤其較佳的。
量測聚核苷酸同源性或一致性之方法在此項技術中已知。舉例而言，UWGCG程序包提供BESTFIT程式，其可用於計算同源性(例如在其默認設定下使用)(Devereux等人, 1984, 《核酸研究(
Nucleic Acids Research)》
12: 387-395，其揭示內容以引用的方式併入本文中)。
PILEUP及BLAST演算法亦可用於計算同源性或對齊序列(通常在其預設設定下)，例如，如Altschul, 1993, 《分子進化雜誌(
J Mol Evol)》
36:290-300; Altschul等人, 1990, 《分子生物學雜誌(J Mol Biol)》 215:403-10中所描述，其揭示內容以引用之方式併入本文中)。
進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法涉及藉由鑑別查詢序列中之長度W之短字來首先鑑別得高分序列對(high scoring sequence pair，HSP)，該等短字在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足某些正值臨限值分數T。T稱作鄰域字分數臨限值(Altschul等人，同上)。此等初始鄰域字命中充當用於啟動搜尋之種子以發現含有其之較長HSP。字命中沿各序列以兩個方向延伸，只要累積比對分數可增加即可。在以下情況中字命中在各個方向上之延伸中止：由於一或多個得負分殘基比對之積累，累積比對得分達至零或低於零；或達到任一序列之末端。BLAST算法參數W、T及X決定比對之靈敏度及速度。BLAST程式使用字長(W) 11，BLOSUM62分數矩陣(參見Henikoff及Henikoff, 1992)比對(B) 50，(E) 10，M=5，N=4及兩股之比較作為預設。
BLAST演算法對兩個序列之間的相似性執行統計分析；參見例如Karlin及Altschul, 1993。藉由BLAST演算法提供之一種相似性度量為最小總和機率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然出現匹配之機率的指示。舉例而言，若第一序列與第二序列之比較中的最小和概率小於約1，較佳小於約0.1，更佳小於約0.01且最佳小於約0.001，則認為序列與另一序列相似。
同源物可與相關聚核苷酸中之序列在小於3、5、10、15、20或更多種突變上存在不同(其中各者可為取代、缺失或插入)。此等突變可遍及同源物之至少30，例如至少40、60或100或更多個連續核苷酸之區量測。
在一個實施例中，變體序列可借助基因密碼中之冗餘由序列表中所給定之特定序列而變化。DNA密碼具有4種主要核酸殘基(A、T、C及G)且使用此等來「拼寫」表示編碼在生物體之基因中之蛋白之胺基酸的三字母密碼子。沿DNA分子之密碼子之線性序列經轉譯成由彼等基因編碼之蛋白中之胺基酸之線性序列。密碼高度簡併，61個密碼子編碼20種天然胺基酸且3個密碼子表示「終止」信號。因此，大多數胺基酸係由多於一個密碼子編碼，事實上有幾種係由四個或更多個不同密碼子編碼。本發明之變異聚核苷酸可因此編碼與本發明之另一聚核苷酸相同之多肽序列，但由於使用不同密碼子編碼相同胺基酸而可能具有不同核酸序列。
存在於本發明之第一態樣之結合分子內的一或多種多肽因此可由一或多種聚核苷酸產生或以其形式遞送，該一或多種聚核苷酸對其編碼且能夠表現該或該等多肽。
本發明之聚核苷酸可根據此項技術中熟知之方法來合成，如例如在Green及Sambrook (2012, 《分子選殖-實驗室手冊(Molecular Cloning - a laboratory manual)》，第4版；Cold Spring Harbor Press)中所描述的。
熟習此項技術者應瞭解，核酸分子可經密碼子最佳化以表現特定宿主細胞中之抗體多肽，例如表現於人類細胞中(例如參見Angov, 2011)。
為避免疑問，當提及編碼特定CDR序列之核酸之變體時，應瞭解，編碼如所定義之CDR之核苷酸序列中之一或多者可變化。因此，當核酸定義為編碼各自由特定核酸序列編碼之重鏈或輕鏈CDR (例如CDR 1-3)時，彼等特定序列中之至多一個、兩個或三個可變化等。類似地，當核酸定義為編碼各自由特定核苷酸序列編碼之輕鏈及重鏈CDR (例如六個CDR)時，彼等特定序列中之至多一個、兩個、三個、四個、五個或全部六個可變化。變體通常為引起如上文所描述之保守性胺基酸取代之變體。
當核酸定義為編碼輕鏈可變區及重鏈可變區時，應瞭解，彼等序列中之至多一者或兩者可經定義而變化。變異可僅在編碼非CDR區之序列之一部分內，僅在編碼CDR區之序列之一部分內，或在編碼CDR區及編碼非CDR區之部分之兩個部分內。通常，變異係在CDR區外部，且因此核酸可包含編碼本文所定義之特定CDR之核酸中之任一者(例如1D3之SEQ ID NO: 8、9、10、14、15及/或16，或4H3C3、7B1F3、2F5B11、1C10、1A10、1G9及/或1E8中之對應SEQ ID NO中之任一者)。
應瞭解，本文所述之特定核酸序列之任何變體不應顯著影響所需結合特性中之一或多者，例如對US28之ECD1及/或ECD3的選擇性結合特異性、特異性但以病毒株未定性之方式結合US28之ECD1及/或ECD3的能力及/或對US28之ECD1及/或ECD3的結合親和力。上文關於本發明之第一態樣描述測試此等所需活性之方法。
在一尤其較佳實施例中，核酸編碼(或多個不同核酸分子之組合共同編碼)作為選擇性結合至US28之ECD1及/或ECD3之scFv的本發明之第一態樣之結合分子。因此，核酸(或多個不同核酸分子之組合)可包含如下序列區，其分別編碼通常呈單一連續核酸編碼區形式之可變重(V
H)鏈序列及可變輕(V
L)鏈序列，例如其中編碼V
H及V
L序列之序列區的單一連續核酸編碼區由編碼連接序列之序列連接，使得scFv可表現為由單一核酸編碼之單一多肽。
在另一尤其較佳實施例中，該核酸編碼(或多個不同核酸分子之組合共同編碼)本發明之第一態樣之結合分子，該結合分子係雙特異性免疫細胞接合子抗體，例如雙特異性T細胞接合子(BiTE)。舉例而言，核酸(或多個不同核酸分子之組合中之一或多者)可編碼作為細胞接合區之區，諸如T細胞接合區，例如CD3結合域。
在另一尤其較佳實施例中，該核酸編碼(或多個不同核酸分子之組合共同編碼)作為嵌合抗原受體(CAR)之本發明之第一態樣之結合分子。因此，根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合可包括一或多個編碼CAR之核酸序列，該CAR包含：
(i) 胞外域(例如抗體，諸如scFv)，其中該胞外域包含如本文所定義之本發明之第一態樣的結合分子或如本文所定義之該結合分子的功能片段或由其組成；
(ii) 跨膜域(例如跨膜受體蛋白之跨膜域，且視情況其中跨膜域包含選自由以下組成之群組的蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD8、CD45及CD4)；及
(iii) 胞內域(例如胞內信號傳導域，例如其中：(a)胞內信號傳導域包含一或多個基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)；及/或(b)胞內信號傳導域包含CD3ζ、Fc受體γ、Fc受體β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之信號傳導域)；
其中該CAR之該胞外域對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內的第一抗原決定基(及視情況ECD3內之第二抗原決定基)具有結合特異性，及
其中該US28蛋白之ECD1及ECD3包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之US28蛋白的位置1至37及167至183。
視情況，由本發明之第二態樣之核酸分子編碼之CAR的胞外域可例如藉由鉸鏈區連接至跨膜域。因此，本發明之第二態樣之核酸分子可包括編碼該鉸鏈區之核酸序列之區。
由本發明之第二態樣之核酸分子編碼的CAR之胞內域可例如藉由鉸鏈區連接至跨膜域，例如包含一或多個共刺激域，例如：(a)其中一或多個共刺激域包括一或多個選自由CD28、41BB、OX40、ICOS、CD27及DAP10組成之群組的蛋白質的功能性信號傳導域；(b)其中胞內域併有接近胞內信號傳導域之共刺激域，(c)其中胞內域包含兩個或更多個共刺激域，例如兩個串聯共刺激域，及/或(d)其中胞內域併有單獨細胞介素信號。因此，本發明之第二態樣之核酸分子可包括編碼該一或多個共刺激域之核酸序列的一或多個區。
根據本發明之第二態樣之核酸分子或各核酸分子亦可編碼前導序列、跨膜域、胞內信號傳導域及鉸鏈區，諸如如上文所描述之任一或多個此類序列。因此，根據本發明之第二態樣之核酸分子或各核酸分子可包含前導序列(亦成為信號肽) (例如SEQ ID No: 253、13或19之前導序列)。
視情況，根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合可以表現卡匣形式(共同地或單獨地呈獨立形式)提供，該表現卡匣包括可操作地連接至插入序列之控制序列，由此允許活體內表現本發明之多肽。該表現卡匣可向宿主個體直接投與。此等表現卡匣又通常提供於載體(例如質體或重組病毒載體)內，例如如下文進一步論述。
C. 載體 本發明之第三態樣進一步提供一種載體，其包含根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
術語「載體」係指併有一或多個經分離核酸序列之序列且可用於將該經分離核酸或各經分離核酸遞送至細胞內部的核酸。此項技術中已知多種載體，包括線性聚核苷酸、與離子或兩親媒性化合物相關之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語載體包括自主複製質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。
在本文所用之情形下，術語「載體」包括單個及/或多個載體。舉例而言，在本發明之第一態樣之結合分子由根據本發明之第二態樣之多個不同核酸分子之組合編碼的情形下，其可包括多個載體，其中存在於該多個不同核酸分子之組合中之一或多個核酸可呈現於第一載體上，且存在於該多個不同核酸分子之組合中之其他核酸中之一或多者可呈現於第二不同載體上，及/或該多個不同核酸分子之組合中之其他核酸可呈現於第三、第四、第五等不同其他載體上。
因此，舉例而言，若本發明之第一態樣之結合分子為包含超過一條不同多肽鏈之抗體或CAR，則視情況根據本發明之第三態樣之單一形式之載體可包含所有必需核酸序列以編碼超過一條形成結合分子之不同多肽鏈。替代地，本發明之第三態樣亦提供多個不同載體(例如兩個載體或更多個)之組合，其中多個不同載體之組合共同地包含根據本發明之第二態樣之多個不同核酸分子的組合。因此，舉例而言，若本發明之第一態樣之結合分子為包含超過一條不同多肽鏈之抗體或CAR，則多個不同載體可各自包含各自編碼共同形成結合分子之不同及不同多肽鏈的一或多個核酸序列，使得結合分子包含一或多條由第一載體編碼之不同多肽鏈及一或多條由一或多個後續不同載體編碼之其他不同多肽鏈。
出於簡潔起見，一般而言，本申請案係指呈單數形式之「載體(vector)」，但應理解，此亦可視情況涵蓋呈複數形式之「載體(vectors)」，包括如上文所描述的多個不同形式之載體。
視情況，該(或各)載體可選自由以下組成之群組：反轉錄病毒載體、質體、慢病毒載體及腺病毒載體。
根據本發明之第三態樣的包含根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合的該(或各)載體可向宿主個體投與。較佳地，聚核苷酸使用遺傳載體來製備及/或投與。適合載體可為能夠攜載足量遺傳資訊且允許表現一或多個由載體或各載體編碼之多肽序列，諸如允許表現根據本發明之第一態樣之結合分子的任何載體。
編碼本發明之第一態樣之結合分子(諸如抗體或其片段，包括scFv、BiTE及其類似物，以及CAR)的天然或合成核酸之表現通常藉由將一或多種各自獨立地編碼一或多種多肽(或其部分)之核酸可操作地連接至啟動子且將該或各構築體併入至一或多種表現載體中來達成。因此，該(或各)載體可為表現載體。
因此，本發明之第三態樣包括包含此類聚核苷酸序列之表現載體。藉由「表現載體」，吾等包括包含重組聚核苷酸之載體的意義，該重組聚核苷酸包含可操作地連接於待表現之核苷酸序列的表現控制序列。此類表現載體通常在分子生物學技術中構築且可例如涉及使用質體DNA及適當引發劑、啟動子、強化子及其他元件，諸如聚腺苷酸化信號，該等元件可為必需的，且以適當取向定位，以便允許表現一或多個由載體或各載體編碼之多肽序列，諸如允許表現根據本發明之第一態樣的結合分子。其他適合之載體將對熟習此項技術者顯而易見(參見Green及Sambrook, 同上)。
表現載體可包含足夠順式作用元件以用於表現；用於表現之其他元件可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之全部，包括併入重組聚核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或含於脂質體中)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調節所需核酸序列之表現的啟動子。
此外，表現載體可以病毒載體形式提供。病毒載體技術為此項技術中所熟知且描述於例如Sambrook等人, 2012, 《分子選殖：實驗室手冊(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL)》, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)中。適用作載體之病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。
已開發出用於將基因轉移至哺乳動物細胞中的多種基於病毒之系統。舉例而言，反轉錄病毒為基因遞送系統提供方便的平台。一或多個所選編碼一或多種相關多肽序列之核酸序列可插入載體中且使用此項技術中已知之技術封裝於反轉錄病毒粒子中。接著可分離重組型病毒且活體內或離體遞送至細胞中。此項技術中已知許多反轉錄病毒系統。
術語「慢病毒」係指反轉錄病毒科家族之屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的，因為其能夠感染未分化細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體之最有效方法中之一者。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。慢病毒載體為達成長期基因轉移之尤其適合工具，因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之複製。
術語「慢病毒載體」係指來源於慢病毒基因體之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人, 《分子治療(Mol. Ther.)》17(8): 1453-1464 (2009)中所提供之自身失活慢病毒載體。臨床中可使用之慢病毒載體之其他實例包括但不限於例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及其類似物。非臨床型慢病毒載體亦為可獲得的且將為熟習此項技術者所已知。
亦可使用腺病毒載體，且多種腺病毒載體為此項技術中已知的。
亦可使用混合載體，且多個混合載體為此項技術中已知的。混合載體通常包括經基因工程改造以具有超過一個載體之品質的載體病毒。改變病毒以避免典型病毒載體之缺點，該等典型病毒載體可具有有限負載容量、免疫原性、遺傳毒性且無法支持長期充足轉殖基因表現。
編碼根據本發明之第一態樣之結合分子的核酸之表現亦可使用轉位子(諸如睡美人、CRISPR、CAS9及鋅指核酸酶)實現。
載體可適合於真核生物中之複製及整合，及/或其可適合於原核生物中，諸如細菌物種中之表現。較佳地，該或各載體能夠在生產細胞(例如CHO細胞、大腸桿菌細胞等)或個體細胞，例如哺乳動物細胞(例如人類細胞)，諸如哺乳動物(例如人類)免疫細胞(例如T細胞、NK細胞、巨噬細胞等)中表現根據本發明之第一態樣之結合分子。
根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合亦可選殖入許多類型之載體中，包括質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。
一般而言，適合載體將視情況含有在至少一個生物體中起作用之複製起點、可操作地連接至該或各編碼核酸序列之啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及/或一或多個可選標記(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
應瞭解，根據本發明之第三態樣之載體可包含調節轉錄起始頻率之額外啟動子元件，例如強化子。通常，此等定位於起始位點上游30-110 bp區中，儘管許多啟動子已顯示含有亦在起始位點下游之功能性元件。啟動子元件之間的間距通常為靈活的，使得當元件倒置或相對於彼此移動時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始減退之前可增加至相隔50 bp。視啟動子而定，個別元件可協作地或獨立地發揮活化轉錄功能。
能夠表現哺乳動物T細胞中相關轉殖基因之啟動子的實例為EFla啟動子。原生EFla啟動子驅使伸長因子-1複合物之α次單元的表現，所述複合物負責將胺基醯基tRNA酶促遞送至核糖體。EFla啟動子已廣泛用於哺乳動物表現質體且已顯示有效驅使表現選殖至豆狀病毒載體中之轉殖基因(例如CAR編碼序列)。參見，例如Milone等人, 《分子治療》 17(8): 1453-1464(2009)。
啟動子之另一實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為強組成性啟動子序列，其能夠驅動與其可操作地連接之任何聚核苷酸序列之高表現量。
替代地或另外，可使用其他組成性啟動子序列，包括但不限於猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、伸長因子-la啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。
此外，本發明不限於組成性啟動子之使用。亦涵蓋誘導性啟動子作為本發明之一部分。誘導性啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要其可操作地連接之聚核苷酸序列之表現時打開此類表現或在不需要表現時關閉表現。誘導性啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。因此，應瞭解，在本文所述之本發明方法或用途中之任一者中，藉由本發明之第二態樣之核酸或根據本發明之第三態樣之載體編碼的根據本發明之第一態樣之結合分子的表現可為條件性或誘導性的，例如經由環境刺激物或經由第二分子之作用。以此方式，有可能限制或最小化不良脫靶影響(例如，在並不表現或表現低含量US28之組織中)。
為了評定相關多肽在細胞(例如根據本發明之第一態樣之結合分子)中之表現，載體宜含有可選標記基因或報導基因或兩者，以便於鑑別及選擇表現細胞。在其他實施例中，可選標記可攜載於單獨一片DNA上且用於共轉染程序。可選標記基因及報導基因皆可側接適當調節序列以使得能夠在宿主細胞中表現。適用可選標記包括例如耐抗生素基因，諸如neo及其類似物。
報導基因用於鑑別潛在經轉染細胞及評估調節序列功能。一般而言，報導基因為不存在於接受者生物體或組織中或由接受者生物體或組織表現的基因，且該基因編碼表現藉由一些容易偵測之特性(例如酶促活性)顯現之多肽。在DNA已引入受體細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌型鹼性磷酸酯酶之基因或綠色螢光蛋白質基因(GFP)(例如Ui-Tei等人, 2000 《歐洲生化學會聯合會快報(FEBS Letters)》 479: 79-82)。適合的表現系統已熟知且可使用已知技術製備或市售購買。一般而言，展示報導基因表現量最高的具有最小5'側接區之構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區可連接至報導基因且用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
本發明之表現構築體亦可用於使用標準基因遞送方案之核酸免疫及基因療法(參見例如US 5,399,346)。因此，載體可為基因療法載體。在此情況下，可能需要使核酸及/或載體連接至適合之靶向部分以使得其可導引至適當細胞、組織或器官以用於表現。因此，應瞭解，在某些實施例中，本發明之核酸分子及/或載體可經由基因療法方法，使用下文描述且此項技術中已知之調配物及方法用於本發明之治療態樣中。
D. 經轉型細胞 本發明之第四態樣提供一種細胞或細胞群(視情況，均質或異質細胞群)，其包含根據本發明之第二態樣的核酸分子或多個不同核酸分子之組合，及/或根據本發明之第三態樣的載體，視情況其中細胞表現根據本發明之第一態樣之一或多個結合分子(諸如一或多個抗體，例如單株抗體及/或一或多個CAR)，該一或多個結合分子及/或CAR由根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據本發明之第三態樣之載體編碼。該等細胞可視情況選自經分離之細胞、離體細胞及活體外細胞。
該等細胞包括短暫或較佳地穩定高等真核細胞株(諸如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)、低等真核細胞(諸如酵母)或原核細胞(諸如細菌細胞)。可藉由插入編碼根據本發明之第一態樣之結合分子的載體或表現卡匣修飾的細胞之特定實例包括哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、NS0及COS細胞。較佳地，所選細胞株將為不僅穩定且亦允許多肽之成熟糖基化及/或細胞表面表現的細胞株。
本發明之此類細胞株可使用常規方法培養以產生根據本發明之第一態樣之結合分子，或可治療性或預防性地用於向個體遞送根據本發明之第一態樣之結合分子。
替代地，本發明之聚核苷酸、表現卡匣或載體可以離體投與來自個體之細胞，且該細胞隨後返回個體身體中。
如下文進一步描述，在該(等)細胞治療性或預防性用於個體的實施例中，則細胞可視情況為「自體的」或相對於個體為「同種異體的」。
根據本發明之第四態樣之細胞可例如包含：(a)根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中所編碼之結合分子為根據本發明之第一態樣之抗體、該抗體之功能片段、或包含融合多肽序列之抗體或其功能片段；及/或(b)根據本發明之第三態樣之載體，其中該載體包含如根據此段落之選項(a)所定義的核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
根據本發明之第四態樣之細胞可例如包含：(a)根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中所編碼之結合分子為根據本發明之第一態樣之CAR；及/或(b)根據本發明之第三態樣之載體，其中該載體包含如由此段落之部分(a)所定義的核酸分子或多個不同核酸分子之組合。在無限制下，該細胞可例如選自由以下組成之群組：T細胞、自然殺手(NK)細胞及巨噬細胞。因此，細胞可視情況為CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR巨噬細胞，且視情況，當細胞為CAR-T細胞時，則例如T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
本發明之第四態樣亦提供一種細胞，其包含根據本發明之第一態樣之結合分子及/或編碼該結合分子之核酸，視情況其中該核酸為分別如由本發明之第二或第三態樣所定義之核酸或載體。舉例而言，結合分子可為根據本發明之第一態樣之抗體、根據本發明之第一態樣之該抗體的功能片段或根據本發明之第一態樣之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段，且視情況其中該抗體為單株抗體，且進一步例如其中該細胞為重組表現單株抗體之哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。
本發明之第四態樣亦提供一種細胞，其包含根據本發明之第一態樣之CAR及/或編碼該CAR之核酸，視情況其中該核酸為分別如由本發明之第二或第三態樣所定義之核酸或載體。在無限制下，該細胞可例如選自由以下組成之群組：T細胞、自然殺手(NK)細胞及巨噬細胞(M)。因此，細胞可視情況為CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR-M巨噬細胞，且視情況，當細胞為CAR-T細胞時，則例如T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
本發明之第五態樣提供一種產生細胞，更尤其重組細胞或此類細胞之群體(視情況均質或異質細胞群)之方法，該方法包含將根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第三態樣之載體引入至細胞中。
向細胞中引入及表現基因之方法在此項技術中已知。在表現載體之情況下，載體易於藉由此項技術中之任何方法引入宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。舉例而言，表現載體可藉由物理、化學或生物方式轉移至宿主細胞中。
用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及類似方法。用於產生包含載體及/或外源性核酸之細胞的方法為此項技術中熟知的。參見例如Sambrook等人, 2012, 《分子選殖：實驗室手冊》, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)。將聚核苷酸引入宿主細胞中之較佳方法為磷酸鈣轉染。
用於將相關聚核苷酸引入至宿主細胞的生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入至哺乳動物細胞，例如人類細胞中之方法。其他病毒載體可來源於慢病毒、痘病毒、I型單純疱疹病毒病毒、腺病毒及腺相關病毒及其類似病毒。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。相關聚核苷酸可經由病毒轉導遞送至細胞。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米囊劑、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。通常，脂質體(例如人工膜囊泡)可用作活體外及活體內遞送媒劑。可以利用當前技術中靶向遞送核酸之其他方法，諸如用靶向奈米顆粒或其他適合的亞微米尺寸化遞送系統遞送聚核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情況下，遞送媒劑可為脂質體。涵蓋使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。與脂質相關聯之核酸可囊封於脂質體之水性內部中，穿插於脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸相關聯之連接分子附接至脂質體、包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質相關聯。與脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合的組合物不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可存在於雙層結構中，呈微胞形式或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地穿插於溶液中，可能形成尺寸或形狀上不均勻的聚集物。脂質為可天然存在之脂肪物質或合成脂質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。
適用之脂質可獲自市售來源。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可獲自Sigma, St. Louis, MO；磷酸三十二烷基酯(「DCP」)可獲自K & K Laboratories(Plainview, NY)；膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids公司(Birmingham, AL.)。
「脂質體」為通用術語，其涵蓋藉由產生經圍封之脂質雙層或聚集物而形成的多種單層及多層脂質媒劑。脂質體之特徵可為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有由水性介質分隔開之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水性溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前進行自身重排且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶解物(Ghosh等人, 1991 《醣生物學(Glycobiology)》5: 505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同之結構的組合物。舉例而言，脂質可採用膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋脂染胺-核酸複合物。
可使用短暫轉染形式將編碼本發明之第一態樣之結合分子的一或多個RNA分子引入細胞。將編碼RNA(a)引入細胞之其他方法包括但不限於例如電致孔(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)或Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、使用脂質體轉染的陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或基因槍粒子遞送系統，諸如「基因槍(gene gun)」(參見例如Nishikawa等人, 《人類基因療法(Hum Gene Ther.)》, 12(8):861-70(2001)。
不管用於將外源性核酸引入宿主細胞中或以其他方式使細胞暴露於本發明之核酸或載體的方法，為了確認核酸在宿主細胞中之存在，可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知的「分子生物學」分析，諸如南方(Southern)墨點法及北方墨點法(Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如偵測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELlSA及西方墨點法(Western blots))或藉由本文所描述的用於鑑別在本發明範圍內之藥劑的分析進行偵測。
該方法視情況進一步包含選擇根據本發明之第五態樣之細胞的步驟；例如自異質細胞群中選擇該等細胞，由此產生富集及/或均質細胞群。該選擇步驟可包括選擇根據本發明之第二態樣的核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第三態樣之載體中存在之一或多個可選標記的存在。
該方法視情況包含培養該等細胞。該等經培養細胞可因此產生根據本發明之第一態樣之一或多個結合分子，且該方法可包括自該等經培養細胞分離及/或純化該一或多種結合分子。視情況，經分離及/或純化之一或多種結合分子可例如以醫藥學上可接受之調配物形式調配及/或向有需要之個體投與。
E. 表現CAR之細胞： 如上文所論述，在一較佳實施例中，根據本發明之第四態樣之細胞可包含：
(a)根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中所編碼之結合分子為根據本發明之第一態樣之CAR；及/或
(b)根據本發明之第三態樣之載體，其中該載體包含如由此段之部分(a)所定義的核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
在無限制下，該細胞可例如選自由以下組成之群組：T細胞、自然殺手(NK)細胞及巨噬細胞(M)。因此，細胞可視情況為CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR-M細胞。
當細胞為CAR-T細胞時，則T細胞可為α-β T細胞、γ-δ T細胞、記憶T細胞(例如具有幹細胞樣特性之記憶T細胞)中之任一者。舉例而言，T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。在一尤其較佳實施例中，免疫細胞可為具有幹細胞樣特性之記憶T細胞。
當細胞為CAR-NK細胞時，則NK細胞可視情況為不變NK細胞。
當細胞為CAR巨噬細胞(CAR-M)細胞時，則巨噬細胞可視情況為M1型巨噬細胞。如Mukhopadhyay (《自然-方法(Nature Methods)》, 2020, 17: 559-565)中所論述，儘管T細胞上之CAR表現已在惡性腫瘤治療中展示巨大前景，但CAR-T細胞療法可能受阻於T細胞無法穿透實體腫瘤以及抑制腫瘤微環境(TME)，而已展示CAR引入巨噬細胞(CAR-M)可有效地促成抗腫瘤反應。
然而，更一般而言，應瞭解，表現CAR之細胞可為任何類型之來源於個體(例如人類個體)之細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)或任何細胞株。此類細胞可經修飾以包含根據本發明之核酸或載體且由此表現本發明之CAR。因此，本發明包括一種產生表現本發明CAR之細胞的方法，該方法包含獲得衍生自個體之細胞或提供衍生自個體之細胞或提供細胞株，及將根據本發明之第二態樣的一或多個聚核苷酸分子或根據本發明之第三態樣的載體引入至該細胞或細胞株中。
個體之實例包括哺乳動物、人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。
細胞可為「自體的」或「同種異體的」，如下文進一步描述。
藉由「自體的」，吾等包括以下意義：表現CAR之細胞來源於其表現CAR之細胞待根據本申請案之各種態樣使用之個體的細胞。
藉由「同種異體的」，吾等包括以下意義：表現CAR之細胞不來源於其表現CAR之細胞待根據本申請案之各種態樣使用之個體的細胞。通常，細胞來源於與待對其進行該等方法或用途之個體相同的物種之細胞。
諸如T細胞之免疫細胞可獲自許多來源：周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸膜積液、脾組織及腫瘤。亦可使用此項技術中可獲得之任何數目之細胞株(例如免疫細胞株，諸如T細胞株)。
在一個實施例中，免疫細胞(例如T細胞)係使用此項技術中已知之任何適合技術(諸如Ficoll™分離)獲自個體之血液單元。在另一實施例中，藉由血球分離術獲得來自個體之循環血液的細胞。血球分離術產物通常含有淋巴球，包含T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。應瞭解，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。舉例而言，細胞可用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。替代地，洗滌溶液缺乏鈣且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若並非全部)二價陽離子。缺乏鈣的初始活化步驟能引起活化擴增。洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知之方法，諸如藉由使用半自動「流過式」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)，根據製造商說明書實現。洗滌後，可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液中，諸如不含Ca不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有生理食鹽水溶液之緩衝液。替代地，可移除血球分離術樣本之非所需組分，且將細胞直接再懸浮於培養基中。
在一個實施例中，藉由溶解紅血球及例如藉由經由PERCOLL
TM梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核球，而自周邊血液淋巴球分離T細胞。T細胞之特定亞群，諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+T細胞，可進一步藉由此項技術中已知之陽性或陰性選擇技術分離。舉例而言，T細胞可藉由與諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T之抗CD3/抗CD28 (例如3×28)結合珠粒一起培育達足以陽性選擇所需T細胞之時間段來分離。另外地或替代地，T細胞群可藉由陰性選擇，例如藉由針對陰性選擇之細胞所特有之表面標記的抗體之組合來富集。可使用經由負磁性免疫黏附或流動式細胞測量術之細胞分選及/或選擇。
應理解，來源於經修飾以表現本發明之CAR (及/或其他結合分子)之個體的細胞可在其使用之前儲存一段時間(參見例如下文治療方法)。舉例而言，細胞可視情況在其已洗滌之後冷凍，或其可在適合條件下培育以便其保持存活直至需要(例如在旋轉器上在2-10℃下或在室溫下)。以此方式，可儲存細胞直至可能需要其之時候。其可以未修飾之狀態(亦即其中其不表現本發明之CAR)或以修飾之狀態(亦即其中其已經修飾以表現本發明之CAR)儲存。
在用於下文進一步描述之治療應用中之前，細胞可一般使用此項技術中已知之方法活化及擴增。舉例而言，T細胞可藉由與表面接觸而擴增，該表面連接有刺激CD3/TCR複合物相關信號之藥劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配位體。特定言之，T細胞群可如本文所描述刺激，諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段、或固定於表面上之抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化因子(例如，苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸。為了共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配位體。舉例而言，可使T細胞群與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)，可按此項技術中通常已知之其他方法使用(Berg等人, 《移植程序(Transplant Proc.)》 30(8):3975-3977, 1998; Haanen等人, 《實驗醫學雜誌(J. Exp. Med.)》 190(9): 13191328, 1999; Garland等人, 《免疫方法雜誌(J. Immunol Meth.)》 227(1-2):53-63, 1999)。
在一實施例中，表現本發明之CAR (及/或其他結合劑)之細胞進一步經修飾以包含或表現增強細胞(例如T細胞)活性之一或多種其他藥劑。
舉例而言，另一藥劑可為抑制已知減少表現CAR之細胞建立有效免疫反應之能力的抑制性分子之藥劑。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGF-β受體。抑制抑制性分子之藥劑可包含與向細胞(例如本文所描述之胞內信號傳導域)提供陽性信號之第二多肽相關的第一多肽，例如抑制性分子。
另外或替代地，其他藥劑可為促炎性或促增殖性細胞介素。此類細胞介素之目的可為提供自分泌支持以增強表現CAR之細胞之功能、增殖及/或持久性，及/或有利地改變腫瘤微環境且募集內源性先天及同源免疫效應。
應瞭解，本發明提供一種細胞群，其包含根據本發明之第二態樣的一或多個聚核苷酸及/或根據本發明之第四態樣的一或多種載體。因此，本發明提供表現本發明之CAR (及/或其他結合分子)之細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)群。在一些實施例中，表現CAR之細胞群包含表現不同CAR之細胞之混合物。舉例而言，細胞群可包含：第一細胞，其表現具有針對如本文所述之US28之ECD1及/或ECD3具有特異性的結合域的CAR；及第二細胞，其表現具有不同結合域，諸如抗US28結合域的CAR，例如對如本文所述之US28之ECD1及/或ECD3具有特異性的不同CAR (例如，其中各細胞靶向ECD1或ECD3之不同抗原決定基，或其中一種細胞靶向ECD1之抗原決定基且另一細胞靶向ECD3之抗原決定基)。作為另一實例，表現CAR之細胞群可包括：第一細胞，其表現包括針對如本文所述之US28之ECD1具有特異性之結合域的CAR；及第二細胞，其表現包括針對不同於US28的目標之抗原結合域的CAR；視情況具有第三細胞，其表現包括針對如本文所述之US28之ECD3具有特異性之結合域的CAR。作為另一實例，表現CAR之細胞群可包括：第一細胞，其表現包括對如本文所述之US28之ECD1具有特異性之結合域的CAR；及第二細胞，其表現增強表現CAR之細胞(例如T細胞)活性之一或多種藥劑；視情況具有第三細胞，其表現包括針對如本文所述之US28之ECD3具有特異性之結合域的CAR。
分析 CAR 活性
本發明亦包括製成本發明之CAR之方法。舉例而言，本發明包含在適合之宿主細胞中表現編碼CAR之重組載體，及回收CAR。用於表現及純化多肽(例如抗體)之方法為此項技術中所熟知。
一旦已構築本發明之CAR，則可使用各種分析來評定其活性，包括分析抗原刺激之後擴增T細胞、在無再刺激存在下維持T細胞擴增之能力及適當活體外及活體內(例如動物)模型中之抗癌活性。
可藉由流動式細胞測量術在抗原刺激之後量測表現CAR之細胞(例如T細胞)之活體外擴增。舉例而言，細胞可表現CAR以及螢光報導子，且在US28存在及不存在下及/或在根據本發明之第十三及/或第十四態樣之一或多種肽存在或不存在下量測螢光。適合的方法描述於Milone等人，《分子療法(Molecular Therapy)》 17(8): 1453-1464 (2009)中。
動物模型亦可用於量測表現CAR之細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)的活性。舉例而言，使用US28特異性表現CAR之T細胞之異種移植模型可用於處理免疫缺乏小鼠之原發性表現人類US28之癌症，如已在處理免疫缺乏小鼠之前B ALL中針對CD19特異性表現CAR之T細胞進行(參見例如Milone等人，《分子療法》17(8): 1453-1464(2009))。
此外，CAR之活性可藉由評定細胞增殖及細胞介素產生來測定(參見例如Milone等人，《分子療法》17(8): 1453-1464 (2009))。
成像技術亦可用於評估具有腫瘤之動物模型中CAR之特定運輸及增殖。此類分析法已描述於例如Barrett等人, 《人類基因療法(Human Gene Therapy)》 22: 1575-1586 (2011)中。
其他分析，包括此項技術中已知的分析，亦可用於評估本發明之CAR構築體。
適用於與表現 CAR 之細胞療法組合之藥劑：
本發明亦涵蓋表現CAR之細胞與增加該表現CAR之細胞之功效及/或增殖及/或持久性之藥劑的組合之用途。較佳地，增加表現CAR之細胞之功效及/或增殖及/或持久性之藥劑為細胞介素。
另一治療劑可為增強表現CAR之細胞(例如T細胞)之功效/持久性/擴增之細胞介素。
另一治療劑可為改善與投與表現CAR之細胞相關之一或多種副作用的藥劑。舉例而言，另一治療劑可用於治療「細胞介素風暴」(例如抗IL6抗體)。藉由「細胞介素風暴」(亦稱為細胞介素級聯及高細胞介素血症)，吾等意謂響應於病原體及免疫損傷對T細胞及巨噬細胞之刺激的發炎性介體(細胞介素)之潛在致命的超釋放。
另一治療劑可為阻斷CTLA-4 (例如伊派利單抗(ipilimumab)及曲美單抗(tremelimumab))、PD-1 (例如納武單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)及皮立珠單抗(pidilizumab))及/或PD-L1 (例如MDX-1105及MPDL3280A)之抗體或抗體組合。
已確認可經由趨化介素受體(CXCR2或CCR4)之共表現或經由與趨化介素組合而將CAR-T細胞療法導引至腫瘤組織(Di Stasi等人, 2009, 《血液》,
113:6392-6402; Kershaw等人, 2002, 《人類基因療法》,
13:1971-1980)。因為US28亦結合於多種CC趨化介素以及CX3CR1，所以此可為一項選擇。
Xia等人, 2016, 《癌症研究》
76:6747-6759表明組合溶瘤病毒與CAR-T細胞療法可在干擾素基因刺激蛋白失活及I型IFN破壞腫瘤方面尤其有效。相比之下，Ajina及Maher (《免疫療法與癌症雜誌(
J Immunother Cancer. )》, 2017;
5:90)、Kim (《自然-通訊》2017;
8:344)及Scott等人(《大分子生物科學(Macromol Biosci.)》, 2018年1月;
18)指示溶瘤病毒感染可能增加CAR-T細胞之進入及移動，且減輕或逆轉局部免疫抑制且增強CAR-T細胞效應子之功能及持久性。
F. 結合分子之產生及純化 本發明之第六態樣提供一種產生根據本發明之第一態樣之結合分子，例如根據本發明之第一態樣之抗體或CAR的方法，該方法包含：在細胞，更特定言之，重組細胞或此類細胞之群體(視情況，均質或異質細胞群)中表現根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，及/或根據本發明之第三態樣之載體。該一或多個細胞可為根據本發明之第五態樣，例如如上文所描述之細胞。
視情況，本發明之第六態樣之方法亦可包含自細胞分離或純化如此產生之結合分子之步驟；舉例而言，其中結合分子為根據本發明之第一態樣之抗體、該抗體之功能片段或根據本發明之第一態樣之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段。
因此，在某些實施例中，本揭示案之結合分子可經純化。如本文所用之術語「純化」意欲指可與其他組分分離之組合物，其中結合分子相對於其可在初始生產之後獲得的狀態，例如其在細胞或細胞培養物中產生的狀態，經純化至任何程度。當使用術語「實質上經純化」時，此名稱將指以下組合物，其中結合分子形成組合物之主要組分，諸如構成組合物中之蛋白質含量之約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或更高(以重量計)。
蛋白質純化技術係熟習此項技術者熟知的。該等技術一方面涉及細胞環境粗品部分分離成多肽及非多肽部分。在已將相關多肽(例如，本發明之結合分子)與其他蛋白質分離之後，可使用層析及電泳技術進一步純化相關多肽以達成部分或完全純化(或純化至均質)。特別適合於製備純肽之分析方法為離子交換層析法、排阻層析法、聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電聚焦。用於蛋白質純化之其他方法包括用硫酸銨、PEG、抗體及其類似物沈澱，或藉由熱變性，隨後離心；凝膠過濾、逆相層析、羥磷灰石層析及親和層析；及此類及其他技術之組合。
在純化本發明之抗體或其他結合分子中，可能需要在原核或真核表現系統中表現多肽且使用變性條件提取蛋白質。可使用結合至多肽之標記部分的親和管柱自其他細胞組分純化多肽。如此項技術中一般所知，咸信執行多個純化步驟之次序可改變，或可省略某些步驟，且仍為適用於製備實質上純化之蛋白質或肽的方法。
通常，利用結合抗體Fc部分之試劑(亦即，蛋白A)分級分離完整抗體。替代地，可以使用抗原同時純化及選擇適當抗體。舉例而言，在對US28之ECD1及/或ECD3具有結合特異性的根據本發明之結合分子之情形下，則適合的抗原可包括以下中之一或多者：選自本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白，及/或根據本發明之第十七態樣之至少兩種(例如三種)不同融合蛋白的組合、根據本發明之第十八態樣之結合物及/或根據本發明之第十九態樣之至少兩種(例如三種)不同結合物的組合。
此類方法通常利用結合至支撐物，諸如管柱、過濾器或珠粒之選擇劑。抗體或其他結合分子可結合至支撐物、移除(例如洗掉)之污染物及藉由施加條件(鹽、熱等)釋放之抗體(或其他結合分子)。
熟習此項技術者根據本揭示案將獲知用於定量蛋白質或肽之純化程度的多種方法。此等包括例如測定活性部分之比活性，或藉由SDS/PAGE分析評估一部分內之多肽的量。用於評估一部分之純度的另一方法係計算該部分之比活性，將其與初始提取物之比活性相比較，且由此計算純度。用於表示活性之量的實際單位當然取決於選擇用於跟蹤純化之特定分析技術及表現之蛋白質或肽是否展現可偵測之活性。
本發明之第七態樣提供藉由本發明之第六態樣之方法獲得或可藉由其獲得的經分離及/或純化之結合分子，視情況其中該經分離之結合分子進一步調配用於向個體投與。
在一個實施例中，本發明之結合分子可調配為醫藥組合物；該組合物包含醫藥學上有效量之一或多種如本文所定義之本發明之結合分子。在一個較佳實施例中，醫藥組合物進一步包含醫藥學上或獸醫學上可接受之佐劑、稀釋劑或載劑，其通常將根據預期投與途徑及標準醫藥實踐選擇。組合物可呈立即釋放、延遲釋放或控制釋放施加之形式。較佳地，調配物為單位劑量之活性成分，其含有每日劑量或單位劑量、每日次劑量或其適當部分。
片語「醫藥或獸醫學上可接受」包括提及當視需要向動物或人類投與時不會產生有害、過敏或其他不良反應的組合物。根據本揭示案，此類醫藥或獸醫學組合物之製備為熟習此項技術者已知的，如由《雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)》, 第18版 Mack Printing公司, 1990所示例，其以引用方式併入本文中。此外，對於動物或人類投與，應理解，製劑應滿足如FDA生物標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)所要求之無菌性、發熱性、一般安全性及純度標準。
如本文所用，「醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩定劑、賦形劑、崩解劑、類似的材料及其組合，如一般熟習藥物技術者已知。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則考慮將其用於治療或醫藥組合物中。
在一個實施例中，醫藥組合物進一步包含另一藥物及/或其他治療劑、預防劑或診斷劑。
在一個實施例中，如本文所述之本發明之結合分子、本文所述之組合物或本文所述之醫藥組合物經調配用於經口、非經腸、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、眼內、顱腦內、腦內、骨內、腦室內、鞘內或皮下投與。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之本發明之結合分子與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，視需要隨後滅菌來製備。醫藥組合物可最佳以無菌水溶液形式使用，該無菌水溶液可含有其他物質，例如足夠鹽或葡萄糖以使溶液與血液等張。必要時，可適當地緩衝水溶液(較佳達pH 3至9)。在無菌條件下製備適合醫藥調配物易於藉由熟習醫藥技術者熟知之標準醫藥技術實現。
根據本發明之醫藥或獸醫學組合物可替代地以粉末形式調配，諸如無菌粉末，其可為凍乾粉末。
G. 對抗HCMV及/或與HCMV相關之疾病或病況 本發明之第十一態樣提供一種對抗HCMV或與HCMV相關之疾病或病況的方法。
在此情形下，術語「對抗」可視情況包括以下中之任一者或多者：預防HCMV感染或與HCMV感染相關之疾病或病況、針對其接種疫苗、降低其風險、預防、治療、改善、減緩該感染或相關疾病或病況或阻止其發展、逆轉及/或固化該感染或相關疾病或病況。
在一個選項中，術語「對抗」可指治療性治療。此類治療性治療可引起疾病症狀之嚴重程度降低，及/或無症候期之頻率或持續時間增加。足以實現此之量定義為「治療有效量」。
在預防性應用中，該方法之個體可能尚未呈現出HCMV感染或與HCMV感染相關之疾病或病況之症狀，且該方法可用於預防或延遲症狀之發展。足以實現此之量定義為「預防有效量」。個體可藉由任何適合手段鑑別為處於罹患疾病或病況之風險下。
本發明之第十一態樣之方法包含向個體或向離體或活體外細胞物質投與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑：
i. 根據本發明之第一態樣之結合分子，
ii. 根據本發明之第一態樣之該結合分子的功能片段，
iii. 根據本發明之第七態樣之經分離之結合分子，
iv. 根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據本發明之第三態樣之載體，
vi. 根據本發明之第四態樣的細胞，
vii. 根據本發明之第八態樣之結合物，及
viii. 根據本發明之第十態樣之經分離之結合物。
換言之，本發明之第十一態樣提供該等藥劑中之一或多者以用於對抗個體或離體或活體外細胞物質中與HCMV相關之疾病或病況。
此外，本發明之第十一態樣提供該等藥劑中之一或多者之用途，其用於製造供對抗個體或離體或活體外細胞物質中與HCMV相關之疾病或病況用之藥物。
個體較佳地為人類。然而，亦應理解，個體可為非人類哺乳動物，諸如任何非人類哺乳動物，例如馬、犬、豬、牛、綿羊、大鼠、小鼠、天竺鼠或靈長類動物，例如其中非人類動物為人類化動物模型，具有可為HCMV載體之經移植人類細胞。
個體可視情況為雄性，諸如人類男性。
個體可視情況為雌性，諸如人類女性。
個體可例如為成年體、青年體、少年體、幼年體、嬰兒體、新出生體、胎兒體或胚胎；諸如人類成人、人類少年、人類青少年、人類兒童、人類嬰兒、人類新生兒、人類胎兒或人類胚胎。
個體可例如為年齡小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月的人類嬰兒。
個體可為例如年齡為至少或超過1歲，例如至少或超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20歲；及視情況小於100、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40歲之人類(例如人類男性及/或人類女性)。
個體可例如為年齡至少或超過20歲、例如至少或超過25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80歲；及視情況小於100、90或85歲之人類(例如人類男性及/或人類女性)。
該個體可為患有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之個體。因此，個體可藉由直接偵測獲自該個體之生物樣本(例如血液、唾液及/或尿液)中之HCMV病毒確定為具有實際HCMV感染。
該個體可視情況為已接受、繼續接受或將隨後接受任一或多種針對HCMV感染及/或與其相關之任何病況或症狀之其他治療的個體。可用於抑制HCMV感染之進展的此項技術中已知之兩種藥物為更昔洛韋(ganciclovir)及膦甲酸。通常，此等經靜脈內遞送，且通常，治療持續長時間段。經批准用於眼睛之CMV感染的錠劑形式之更昔洛韋已變得可用。此外，以玻璃體內植入物(例如活體外植入物)形式遞送之更昔洛韋可用作提供藥物至眼部之長期遞送的手段。此遞送系統通常需要對眼睛進行微小操作以植入遞送系統。此遞送形式通常在其必須重複之前持續3至6個月。對於在出生時具有先天性CMV感染徵象之嬰兒，抗病毒藥劑，主要為纈更昔洛韋(valganciclovir)，可改善聽覺及發育結果。纈更昔洛韋可具有嚴重副作用且僅已在患有先天性CMV感染徵象之嬰兒中研究。亦已使用靜脈內HCMV免疫球蛋白(人類)(CMV IGIV)。CMV IGIV為富集於針對巨細胞病毒(CMV)之抗體中的靜脈內免疫球蛋白；其經美國FDA批准作為針對與移植腎臟、肺、肝、胰臟及心臟相關之CMV疾病的預防性措施(防治)。
具有疑似HCMV感染之個體可能未必已直接針對攜有HCMV病毒進行測試，但可展示HCMV感染之一或多種症狀。舉例而言，在其他健康成年人中與HCMV感染(特定言之，裂解HMCV感染)相關之症狀可包括與感染性單核白血球增多症類似之症狀，包括例如以下中之任一者、兩者、三者或所有四者：疲乏；發熱；喉嚨痛；及/或肌肉疼痛。尤其在免疫力減弱之個人及/或免疫功能不全之個體中之額外症狀可在以下中之任一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者上存在問題：眼、肺、肝、食道、胃、腸及/或大腦。在患有先天性HCMV感染之嬰兒中與HCMV相關之症狀(特定言之，裂解HMCV感染)可為例如以下特徵中之任一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或全部九者：過早出生；低出生重量；黃皮膚及眼睛(黃疸)；增大及功能不良之肝臟；紫色膚斑或皮疹或兩者；頭部異常小(腦過小)；增大之脾臟；肺炎；及/或癲癇。
HCMV可經由許多途徑自感染個人擴散至未感染個人，包括經由體液，諸如血液、唾液、尿液、精液及母乳。舉例而言，傳播可由個體在與感染者之體液接觸之後觸摸其眼睛或其鼻內或口內；藉由與感染者性接觸；藉由與來自感染母體之母乳接觸(包括攝取)；藉由與感染者之生物材料(器官、組織、骨髓或幹細胞移植)或自感染者輸血接觸(例如植入或移植)；或在懷孕及/或出生期間，其中感染母體可在嬰兒出生之前或出生期間將病毒傳給該嬰兒。具有潛在HCMV感染之個體可能尚未直接針對攜有HCMV病毒進行測試及/或可能不展示HCMV感染之一或多種症狀，但儘管如此可諸如藉由上文所定義之途徑中之任一者或多者，具有使其處於自一或多個感染個體感染HCMV之風險下的歷史(例如，在之前70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1年，之前12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個月內、或新近歷史，諸如在之前4、3、2或1週內，或在之前7、6、5、4、3、2或1天)，且可因此表徵為具有根據本發明之潛在HCMV感染之個體。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為HCMV感染或與HCMV感染相關。如以下進一步論述，HMCV感染癌症為本發明之特殊關注點，但在任何情形下之HCMV感染，及與HCMV感染相關之任何疾病或病況為根據本發明進行對抗的關注點。
視情況，根據本發明第十一態樣對抗之疾病、病症或病況可與US28之表現相關，尤其包括US28之表面表現及US28之ECD1 (及視情況ECD3)在細胞表面處之暴露。此可包括例如與表現US28之細胞相關之任何疾病或病況。舉例而言，細胞可為非所要細胞。非所要細胞可為其在宿主中之存在為非所需的任何細胞。因此，與US28表現相關之疾病或病況可為特徵在於存在表現US28且為非所要之細胞的任何病況，例如其中至少一部分病理係藉由存在此類表現US28之非所要細胞來介導的任何生物學或醫學病況或病症。病況可由非所要細胞之存在引起，或者非所要細胞之存在可影響病況。
藉由US28之表現，吾等包括以下意義：US28蛋白能夠在細胞上或細胞中或在由細胞製備之提取物中偵測到，或多肽表現可藉由偵測編碼US28之mRNA來推斷。為了確認US28在細胞上或在細胞中之表現，可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知之生物化學分析，諸如藉由免疫手段(ELISA及西方墨點法)偵測特定蛋白質(亦即US28)之存在，或熟習此項技術者熟知之分子生物分析，諸如北方墨點法、RT-PCR及PCR，用於偵測US28 mRNA之存在。然而，如本文中進一步描述，US28之偵測可因不同HCMV病毒株之間的胺基酸程度變化及/或藉由基因程度下之多態性而複雜化，且某些方法可對來自有限數目之HCMV病毒株之US28蛋白表現敏感及/或允許偵測來自有限數目之HCMV病毒株之US28蛋白表現。此會引起未能偵測來自其他病毒株之HCMV感染。可能較佳的是，使用病毒株未定性方法來確定US28表現。本發明之結合分子可提供對US28之ECD1及/或ECD3之病毒株未定性結合性，且可為評定個體之一或多個細胞上或一或多個細胞中或由細胞製備之提取物中US28表現的尤其較佳方法。
視情況，HCMV感染可為無症狀的，及/或其可為未確診的。視情況，HCMV感染可為潛伏感染，例如其特徵可為低程度或不存在的病毒複製，其中病毒基因體主要駐存於CD34
+造血前驅細胞群中，該造血前驅細胞群駐存於骨髓中。
其中與HCMV相關之疾病或病況待對抗之個體可為免疫功能不全患者，例如原發性HCMV感染、再感染或再活化可引起影響一或多個器官的疾病，諸如危及生命之疾病的患者。免疫功能不全個人的特徵可例如在於具有一或多個影響以下中之任一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者之嚴重問題：眼睛、肺、肝臟、食道、胃、腸及/或大腦。免疫功能不全個體可例如為具有、已具有生物材料(諸如，器官、幹細胞或骨髓移植)移植或意欲成為生物材料移植的接受者的個人；另外或替代地，在一個選項中，待移植之生物材料可為根據本發明之第十一態樣的待處理之離體或活體外細胞物質。
HCMV為最常見之先天性病毒感染之一且為出生缺陷之最重要病因。嬰兒亦可在出生期間或不久之後(圍產期HCMV)被感染；此群組包括經由母乳感染之嬰兒。因此，與HCMV相關聯之病況可為先天性HCMV感染或先天性HCMV相關之出生缺陷或可為圍產期HCMV感染或圍產期HCMV相關之疾病或病況。嬰兒中之先天性HCMV感染可例如藉由病況表徵，該等病況顯示以下特徵中之任一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或全部九者：過早出生；低出生重量；黃皮膚及眼睛(黃疸)；經擴大且功能不佳之肝臟；紫色膚板或皮疹或兩者；異常小頭(微頭部)；脾擴大；肺炎；及/或癲癇；在任何情況下，直接偵測該等嬰兒中之HCMV感染可用以確認先天性感染。
個體可例如為嬰兒。該嬰兒可為由具有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之母體出生之新生兒。該嬰兒可為親本(尤其母體)具有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之嬰兒。該嬰兒可為由具有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之母體哺乳之嬰兒。個體可為由具有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之母親攜帶的胎兒或胚胎。個體可為具有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之母體、懷孕雌性或預期母體。個體可為具有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之哺乳母親。個體可為懷孕之前具有實際(包括陽性診斷)、疑似或潛在HCMV感染之雌性。
與HCMV相關之病況可為例如心血管疾病，諸如動脈粥樣硬化或自體免疫疾病。
HCMV感染狀態可另外影響燒傷、創傷、敗血症及感染病原體(諸如細菌及/或除HCMV以外之病毒)的臨床病程；且其中與HCMV相關之疾病或病況待對抗的個體可為罹患燒傷、創傷、敗血症及/或病原性感染(例如細菌感染或除HCMV以外之病毒感染)之個體及/或與HCMV相關之該疾病或病況可包括燒傷、創傷、敗血症及/或病原性感染(例如細菌感染或除HCMV以外之感染)中之任一者或多者。尤其在免疫力減弱之個體及/或免疫功能不全個體中的與HCMV相關之病況可為例如以下中之任一者或多者：歸因於眼睛(視網膜炎)之感光層發炎之視覺喪失；消化系統問題，包括結腸(結腸炎)、食道(食道炎)及/或肝臟(肝炎)之發炎；神經系統問題，包括腦發炎(腦炎)；及/或肺炎。
與具有先天性HCMV感染之嬰兒中之HCMV相關的病況可為例如以下中之任一者或多者：聽覺喪失、智能障礙、視覺問題、癲癇、缺乏協調、無力及/或使用肌肉問題。
在一個實施例中，HCMV感染可為單株感染。
在一替代實施例中，HCMV感染包含多株HCMV感染，其中多株HCMV感染包含一個以上不同HCMV病毒株，例如兩個或兩個以上不同HCMV病毒株之感染。此類多株感染為常見的，且應瞭解，能夠在多株感染中僅靶向一些而非所有HCMV病毒株之藥劑可處於產生選擇性壓力之風險下，該選擇性壓力可藉由抑制或移除一或多個由該藥劑靶向之競爭性HCMV病毒株來促進多株HCMV感染中之非靶向病毒株。因此，在選擇對抗實際、疑似或潛在多株HCMV感染之方法的情況下，尤其較佳使用提供病毒株未定性作用之治療模式。根據本發明，病毒株未定性藥劑之使用可由此用於預防在經治療之個體中產生選擇性地促進由存在於多株HCMV感染中之一或多個HCMV病毒株產生感染的病況，因為多株HCMV感染中之所有HCMV病毒株均由病毒株未定性藥劑靶向。
視情況，多株感染之兩個或更多個不同HCMV病毒株編碼不同US28蛋白編碼序列。該兩個或更多個病毒株可編碼在胞外區，諸如N端(ECD1)區、第一胞外環(ECD2)區、第二胞外環(ECD3)區及/或第三胞外環(ECD4)區中之一或多者上不同的US28蛋白。在一個相關實施例中，多株HCMV感染中之兩個或更多個HCMV病毒株各自編碼至少在N端(ECD1)區之一或多個位置上彼此不同的US28蛋白；例如其在N端(ECD1)區中之1、2、3、4、5、6、8、9、10或更多個胺基酸位置處可不同。N端(ECD1)區之一或多個位置之差異可在位置26-37外；例如不同之一或多個位置可在位置1-25 (諸如位置8、15、16、18、19、24、25中之任一者或多者，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異中之任一者或多者)內，例如在位置1-10、16、18及/或19中之任一者或多者內，其中位置係關於SEQ ID NO: 5中位置之編號。另外或替代地，在另一相關實施例中，多株HCMV感染中之兩個或更多個HCMV病毒株各自編碼在第二胞外(ECD3)區之一或多個位置處彼此不同的US28蛋白，例如，多株HCMV感染中HCMV病毒株中之一或多者可編碼如下US28蛋白，該蛋白質編碼ECD3之4N變體，且多株HCMV感染中其他HCMV病毒株中之一或多者可編碼如下US28蛋白，該蛋白質編碼ECD3之4D變體。舉例而言，編碼不同US28蛋白編碼序列之HCMV病毒株可選自以下之任兩者或更多者：HCMV病毒株DB (寄存編號KT959235)、HCMV病毒株Toledo (寄存編號GU937742)、HCMV病毒株Towne (寄存編號FJ616285)、HCMV病毒株VR1814 (寄存編號GU179289)、HCMV病毒株TB40/E (寄存編號KF297339)、HCMV病毒株Merlin (寄存編號AY446894)、HCMV病毒株JP (寄存編號GQ221975)、HCMV病毒株Ad169 (寄存編號X17403.1)、HCMV病毒株AF1 (寄存編號GU179291.1)、HCMV病毒株VHL/E (寄存編號L20501.1)、HCMV病毒株BL (寄存編號MW980585)、HCMV病毒株DAVIS (寄存編號JX512198.1)、HCMV病毒株TR (寄存編號KF021605.1)。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為潛伏HCMV感染(例如，單株或多株潛伏HCMV感染)或與潛伏HCMV感染(視情況，多株潛伏HCMV感染)相關。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)或與裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)相關。
根據本發明第十一態樣的待對抗之與HCMV相關聯之疾病或病況可為先天性HCMV感染(例如，單株或多株感染)，諸如潛伏先天性單株或多株HCMV感染或裂解先天性單株或多株HCMV感染。
根據本發明之第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為癌症，例如HCMV感染癌症(視情況單株或多株HCMV感染癌症)，諸如潛伏HCMV感染癌症(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
癌症可視情況位於個體體內之原發性、繼發性或任何其他腫瘤之部位。
腫瘤通常分配級別及階段。實體腫瘤之階段係指其尺寸或程度及是否其已擴散至其他器官及組織。腫瘤級別-癌症級別，為其有可能生長及擴散的速度指示。
舉例而言，癌症可為0期、I期、II期、III期或IV期，或其任一者或多者之細分。此等不同階段及其細分之特徵為此項技術中所熟知。然而，一般而言，0期指示癌症在何處開始(原位)且尚未擴散。I期指示癌症較小且尚未在任何地方擴散。II期指示癌症已生長，但尚未擴散。III期指示癌症較大且可已擴散至周圍組織及/或淋巴結(淋巴系統之一部分)。IV期指示癌症自開始擴散至至少一個其他身體器官之位置；亦稱為「繼發性」癌症或「轉移性」癌症。
在一個實施例中，癌症可為由TNM分期系統分類之癌症階段。此為由AJCC及國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control，UICC)開發及維持之系統。其係世界各地醫療專業人士最常用之分期系統。TNM分類系統基於某些標準化準則開發將不同類型之癌症分期的醫生用具。TNM分期系統係基於腫瘤(T)之程度、擴散至淋巴結(N)之程度及癌轉移(M)之存在。
- T類別描述原始(原發性)腫瘤。TX係指不可評估之原發性腫瘤。T0係指無原發性腫瘤之跡象。Tis係指原位癌(尚未擴散至相鄰組織之早期癌症)。T1、T2、T3及T4係關於原發性腫瘤之尺寸及/或程度。
- N類別描述癌症是否已到達附近淋巴結。NX指示無法評估局部淋巴結。N0指示無局部淋巴結涉及(淋巴結中未發現癌症)。N1、N2及N3指示涉及局部淋巴結(擴散之數目及/或程度)。
- M類別告知是否存在遠端癌轉移(癌症擴散至身體其他部分)。M0指示無遠端癌轉移(癌症尚未擴散至身體之其他部分)。M1指示遠端癌轉移(癌症已擴散至身體之遠端部分)。
因為各癌症類型具有其自身分類系統，所以字母及數字對於每種癌症不始終意謂相同事物。一旦測定T、N及M，則將其組合，且可指定0、I、II、III、IV之總體階段。有時，此等階段亦使用字母細分。進一步指導可見於https://cancerstaging.org。
在一些癌症類型中，可考慮非解剖學因素來指定解剖階段/預後群組。此等明顯定義於AJCC癌症分期手冊之每一章節(例如前列腺格里森分數(Gleason Score in Prostate))中。與T、N及M分開收集此等因素，其保持純粹解剖的且用以指定階段群組。在非解剖學因素用於分組的情況下，存在針對非解剖學因素不可用(X)的情況或在需要指定忽略非解剖學因素之群組的情況提供的分組定義。
I期癌症遠非晚期且通常具有較佳預後。較高階段的癌症通常為較晚期的，但在許多情況下，仍可成功地治療。
在額外及/或替代選項中，癌症可具有指定級別。分級通常基於細胞之分化(與正常細胞類似之程度)。癌症之指定級別可例如為I級、II級、III級或IV級癌症或兩個或三個類別之組合。此等不同等級之特徵為此項技術中所熟知。然而，一般而言：I級癌症為其中細胞類似於正常細胞且不快速生長之類型的癌症；II級癌症為其中癌細胞看起來不像正常細胞且生長得比正常細胞快之類型的癌症；且III級及IV級為其中癌細胞看起來異常且可更積極生長或擴散之類型的癌症。生長特徵可例如在一些癌症中基於分裂細胞之頻率來評定。
癌症可例如為一種類型的癌症，其係選自由以下組成之群組：癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤及混合型癌症。
癌瘤係指上皮源惡性贅瘤或身體內部或外部內襯之癌症。癌瘤，上皮組織惡性病，佔所有癌症病例之80%至90%。在整個身體中發現上皮組織。如上文進一步論述，其存在於皮膚中，以及器官及內部通道(諸如胃腸道)之覆蓋物及內襯中。
癌瘤可分成兩種主要亞型：腺癌，其在腺器官中產生；及鱗狀細胞癌，其發源於鱗狀上皮細胞中。
腺癌一般出現在黏膜中且首先被發現為增厚斑樣白色黏膜。其通常在其出現時易於擴散至軟組織。鱗狀細胞癌出現在身體之許多區域中。
大部分癌瘤影響能夠分泌之器官或腺體，諸如產生乳汁之乳房，或分泌黏液之肺部，或結腸或前列腺或膀胱。
在一個實施例中，癌瘤可為由上皮細胞引起之癌症，該等癌症係選自乳癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口腔癌、食道癌、小腸道癌及胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰臟癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌及皮膚癌，諸如鱗狀細胞癌及基底細胞癌、前列腺癌、腎細胞癌及影響全身上皮細胞之其他已知癌症。
肉瘤係指起源於諸如骨骼、肌腱、軟骨、肌肉及脂肪之支援及結締組織中的癌症。一般出現在年輕人中，最常見肉瘤常常產生為骨骼上疼痛塊狀物。肉瘤通常與其生長之組織類似。
肉瘤之實例為：骨肉瘤或骨原性肉瘤(骨)、軟骨肉瘤(軟骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、橫紋肌肉瘤(骨胳肌肉)、間皮肉瘤或間皮瘤(體腔之膜性內襯)、纖維肉瘤(纖維組織)、血管肉瘤或血管內皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪組織)、神經膠質瘤或星形細胞瘤(大腦中發現之神經結締組織)、黏液肉瘤(原始胚胎結締組織)、間質瘤或混合型中胚層腫瘤(混合結締組織型)。
骨髓瘤為骨髓漿細胞中所起源之癌症。漿細胞產生一些在血液中發現之蛋白質。
癌症可為實體癌症或液體癌症。
舉例而言，白血病(「液體癌症」或「血癌」)為骨髓(血細胞產生部位)癌症。該疾病通常與不成熟白血球之過度生產相關。此等不成熟白血球之表現不如其應表現的，因此患者常常易於感染。白血病亦影響紅血球且可引起因貧血所致之不良血液凝固及疲勞。白血病之實例包括：
- 骨髓或顆粒球性白血病(骨髓及顆粒球性白血球系列之惡性病)
- 淋巴性、淋巴球性或淋巴母細胞性白血病(淋巴及淋巴球性血細胞系列之惡性病)
- 真性紅細胞增多症或紅細胞增多症(各種血細胞產物之惡性病，但紅細胞佔主導)
淋巴瘤在純化體液且產生感染對抗性白血球或淋巴球的淋巴系統之腺體或結節、血管網絡、結節及器官(尤其脾臟、扁桃體及胸腺)中產生。不同於有時稱為「液體癌症」之白血病，「淋巴瘤」為「實體癌症」。淋巴瘤亦可發生在特定器官，諸如胃、乳房或大腦中。此等淋巴瘤稱為外結節淋巴瘤。淋巴瘤歸類為兩個類別：霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。霍奇金氏淋巴瘤中里德-斯德伯格氏細胞(Reed-Sternberg cell)之存在在診斷上將霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤區分開。
混合型癌症可包括類型組分位於一個類別或不同類別之癌症內的癌症。一些實例為：腺鱗癌；混合型中胚層腫瘤；癌肉瘤；及畸胎癌。
視情況，癌症可為原發性癌症或轉移性癌症。原發性癌症係指原發性腫瘤中之癌細胞，其為出現在個體內之第一位點處的腫瘤且可區別於在遠離原發性腫瘤之遠端部位處出現在個體體內的轉移性腫瘤。轉移性癌症係由癌轉移產生，癌轉移係指癌症自起源器官擴散至患者中之其他遠端部位的病況。
舉例而言，癌症類型可視情況選自以下清單中之任一者或多者：
● 急性淋巴母細胞白血病(ALL)，
● 急性骨髓性白血病(AML)，
● 青少年癌症(例如在12至18歲之年齡之間的青年)，
● 腎上腺皮質癌，亦包括例如：
○ 兒童腎上腺皮質癌
● AIDS相關癌症，亦包括例如：
○ 卡堡氏肉瘤(Kaposi Sarcoma)(軟組織肉瘤)
○ AIDS相關淋巴瘤(淋巴瘤)
○ 原發性CNS淋巴瘤(淋巴瘤)
● 肛門癌
● 闌尾癌
● 兒童星形細胞瘤(腦癌)
● 兒童中樞神經系統典型畸胎樣/棒狀腫瘤(腦癌)
● 皮膚基底細胞癌
● 膽道癌
● 膀胱癌，亦包括例如：
○ 兒童膀胱癌
● 骨癌(例如尤文氏肉瘤(Ewing Sarcoma)、骨肉瘤或惡性纖維組織細胞瘤)
● 腦腫瘤(包括例如神經膠質瘤或神經膠母細胞瘤)
● 乳癌，亦包括例如：
○ 兒童乳癌
● 兒童支氣管腫瘤
● 伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)
● 類癌(腸胃道)，亦包括例如：
○ 兒童類癌腫瘤
● 原發灶不明癌，亦包括例如：
○ 兒童原發灶不明癌
● 兒童心臟(心)腫瘤
● 中樞神經系統，亦包括例如：
○ 兒童非典型畸胎樣/桿狀腫瘤(腦癌)
○ 兒童胚胎瘤(腦癌)
○ 兒童生殖細胞瘤(腦癌)
○ 原發性CNS淋巴瘤
● 子宮頸癌，亦包括例如：
○ 兒童宮頸癌
● 兒童癌症(例如年齡在18歲以下、較佳年齡在16歲、14歲或12歲以下，諸如在1歲至12歲之範圍內的兒童)，
● 不常見兒童癌症，
● 膽管癌
● 兒童脊索瘤，
● 慢性淋巴球性白血病(CLL)
● 慢性骨髓性白血病(CML)
● 慢性骨髓增生性贅瘤
● 結腸直腸癌，亦包括例如：
○ 兒童結腸直腸癌
● 兒童顱咽管瘤(腦癌)
● 皮膚T細胞淋巴瘤
● 乳管原位癌(DCIS)
● 兒童中樞神經系統胚胎瘤(腦癌)
● 子宮內膜癌(子宮癌)
● 兒童室管膜瘤(腦癌)
● 食道癌，亦包括例如：
○ 兒童食道癌
● 敏感性神經胚細胞瘤(頭頸癌)
● 尤文氏肉瘤(骨癌)
● 兒童顱外生殖細胞瘤，
● 性腺外生殖細胞瘤
● 眼癌，亦包括例如：
○ 兒童眼內黑素瘤
○ 眼內黑素瘤
○ 視網膜母細胞瘤
● 輸卵管癌
● 惡性骨纖維性組織細胞瘤及骨肉瘤
● 膀胱癌
● 胃(Gastric/Stomach)癌，亦包括例如：
○ 兒童胃(Gastric/Stomach)癌
● 胃腸道類癌
● 胃腸道基質腫瘤(GIST)(軟組織肉瘤)，亦包括例如：
○ 兒童胃腸道基質腫瘤
● 生殖細胞瘤，亦包括例如：
○ 兒童中樞神經系統生殖細胞瘤(腦癌)
○ 兒童顱外生殖細胞瘤
○ 性腺外生殖細胞瘤
○ 卵巢生殖細胞腫瘤
○ 睾丸癌
● 妊娠滋養細胞疾病
● 毛細胞白血病
● 頭頸癌
● 兒童心臟腫瘤
● 肝細胞(肝)癌
● 蘭格漢氏細胞(Langerhans Cell)組織細胞增生症
● 霍奇金氏淋巴瘤
● 下咽癌(頭頸癌)
● 眼內黑素瘤，亦包括例如：
○ 兒童眼內黑素瘤
● 胰島細胞腫瘤、胰臟神經內分泌腫瘤
● 卡堡氏肉瘤(軟組織肉瘤)
● 腎(腎細胞)癌
● 蘭格漢氏細胞組織細胞增生症
● 喉癌(頭頸癌)
● 白血病
● 唇及口腔癌(頭頸癌)
● 肝癌
● 肺癌(非小細胞及小細胞)，亦包括例如：
○ 兒童肺癌
● 淋巴瘤
● 男性乳癌
● 骨惡性纖維組織細胞瘤及骨肉瘤
● 黑素瘤，亦包括例如：
○ 兒童黑素瘤
● 眼內(眼)黑素瘤，亦包括例如：
○ 兒童眼內黑素瘤
● 梅克爾細胞癌(皮膚癌)
● 惡性間皮瘤，亦包括例如：
○ 兒童間皮瘤
● 轉移性癌症
● 隱性原發性轉移性鱗狀頸癌(頭頸癌)
● 具有
NUT基因變化之中線道癌
● 口腔癌(頭頸癌)
● 多發性內分泌瘤症候群
● 多發性骨髓瘤/漿細胞贅瘤
● 蕈樣黴菌病(淋巴瘤)
● 骨髓發育不良症候群、骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤
● 慢性骨髓性白血病(CML)
● 急性骨髓性白血病(AML)
● 慢性骨髓增生性贅瘤
● 鼻腔及鼻竇癌(頭頸癌)
● 鼻咽癌(頭頸癌)
● 神經母細胞瘤
● 非霍奇金氏淋巴瘤
● 非小細胞肺癌
● 口腔癌、唇及口腔癌及口咽癌(頭頸癌)
● 骨肉瘤及骨惡性纖維組織細胞瘤
● 卵巢癌，亦包括例如：
○ 兒童卵巢癌
● 胰臟癌，亦包括例如：
○ 兒童胰臟癌
● 胰臟神經內分泌腫瘤(胰島細胞腫瘤)
● 乳頭狀瘤症(兒童喉部)
● 副神經節瘤，亦包括例如：
○ 兒童副神經節瘤
● 副鼻竇癌及鼻腔癌(頭頸癌)
● 副甲狀腺癌
● 陰莖癌
● 咽癌(頭頸癌)
● 嗜鉻細胞瘤，亦包括例如：
o 兒童嗜鉻細胞瘤
● 垂體瘤
● 漿細胞贅瘤/多發性骨髓瘤
● 胸膜肺母細胞瘤
● 妊娠及乳癌(亦即懷孕女性之乳癌)
● 原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤
● 原發性腹膜癌
● 前列腺癌
● 直腸癌
● 復發性癌症
● 腎細胞(腎)癌
● 視網膜母細胞瘤
● 兒童橫紋肌肉瘤(軟組織肉瘤)
● 唾液腺癌(頭頸癌)
● 肉瘤，亦包括例如：
○ 兒童橫紋肌肉瘤(軟組織肉瘤)
○ 兒童血管瘤(軟質組織肉瘤)
○ 尤文氏肉瘤(骨癌)
○ 卡堡氏肉瘤(軟組織肉瘤)
○ 骨肉瘤(骨癌)
○ 軟組織肉瘤
○ 子宮肉瘤
● 塞紮里症候群(Sézary Syndrome)(淋巴瘤)
● 皮膚癌，亦包括例如：
○ 兒童皮膚癌
● 小細胞肺癌
● 小腸癌
● 軟組織肉瘤
● 皮膚鱗狀細胞癌
● 隱性原發性轉移性鱗狀頸癌(頭頸癌)
● 胃(Gastric/Stomach)癌，亦包括例如：
○ 兒童胃(Gastric/Stomach)癌
● 皮膚T細胞淋巴瘤
● 睪丸癌，亦包括例如：
○ 兒童睪丸癌
● 咽喉癌(頭頸癌)，亦包括例如：
○ 鼻咽癌
○ 口咽癌
○ 下咽癌
● 胸腺瘤及胸腺癌
● 甲狀腺癌
● 腎盂及尿管移行細胞癌(腎臟(腎細胞)癌)
● 原發灶不明癌，亦包括例如：
○ 兒童不明原發灶癌症
● 兒童不常見癌症
● 尿管及腎盂移行細胞癌(腎臟(腎細胞)癌
● 尿道癌
● 子宮內膜癌
● 子宮肉瘤
● 陰道癌，亦包括例如：
○ 兒童陰道癌
● 血管腫瘤(軟組織肉瘤)
● 外陰癌
● 威爾姆氏瘤(Wilms Tumour)及其他兒童腎臟腫瘤
● 年輕人(例如在年齡為16-30歲，諸如18-30歲；視情況小於28、26、24、22或20歲之年輕人)癌症
更特定言之，癌症類型可視情況選自以下清單中之任一者或多者：
皮膚癌：存在三種原發性皮膚癌類型：基底細胞、鱗狀細胞及黑素瘤。此等癌症衍生自具有相同名稱之表皮層。黑素瘤來源於表皮之最深層之黑色素細胞或色素細胞。基底細胞及鱗狀細胞癌通常發生在暴露於日光之身體部分，諸如面部、耳朵及四肢。
肺癌：肺癌極難在早期偵測到，因為通常直至疾病晚期才出現症狀。症狀包括持續性咳嗽、痰有血線、胸痛及肺炎或支氣管炎反覆發作。
女性或男性乳癌：據估算，在美國約1/8女性在其一生中終會罹患乳癌。大部分乳癌為導管癌。最可能罹患該疾病之女性為50歲以上之女性；在一隻乳房中已有癌症之女性；其母親或姊妹患有乳癌之女性；從未有孩子之女性；及在30歲之後有其第一個孩子之女性。其他風險因素包括肥胖、高脂飲食、初潮早(月經開始)及停經遲(月經停止)。
前列腺癌：前列腺癌主要見於老年男性中。隨著男性年齡增長，前列腺可能增大且阻塞尿道或膀胱。此可造成排尿困難或干擾性功能。此病況稱為良性前列腺肥大(BPH)。儘管BPH不為癌性，但可能需要手術來對其校正。BPH之症狀或前列腺中之其他問題可類似於前列腺癌之症狀。
結腸癌及 / 或直腸癌：結腸直腸癌(CRC)係通常源自為胃腸道之結腸或直腸加襯的上皮細胞的疾病。在影響結腸之癌症中，約70%發生在結腸中且約30%發生在直腸中。此等癌症總體上為第三大最常見癌症。症狀包括便血，其可藉由簡單糞便潛血測試或腸道習性變化(諸如嚴重便秘或腹瀉)來測試。
子宮頸 ( 子宮體 ) 癌：子宮為女性骨盆中之囊，其可使嬰兒自受精的卵子發育且保護其直至出生。子宮癌為最常見的婦科惡性病。此癌症不常在40歲以下的女性中發生。其最頻繁地出現在60歲之後。呈遞症狀通常為異常子宮出血。通常進行子宮內膜活體組織切片或D&C來確認診斷。
除上文所論述以主要部位命名的癌症類型之外，存在許多其他實例，諸如腦癌、睪丸癌、膀胱癌等。
特定言之，根據本發明第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為上皮癌；視情況其中該上皮癌為乳癌；例如，其中該乳癌為三陰性乳癌(TNBC)或HER2陽性乳癌(如本文所描述)。該等形式之上皮癌可視情況為單株或多株形式之HCMV感染上皮癌，例如潛伏HCMV感染形式之上皮癌(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
根據本發明第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為轉移及/或侵襲形式之癌症。該等形式之轉移及/或侵襲癌症可視情況為單株或多株形式之HCMV感染之轉移及/或侵襲癌症，例如潛伏HCMV感染形式之轉移及/或侵襲癌症(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待對抗之與HCMV相關之疾病或病況可為神經膠母細胞瘤。在本文所述之其他實施例中，該疾病或病況不為神經膠母細胞瘤及/或該待處理之個體不患有及/或尚未診斷患有神經膠母細胞瘤。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之個體(或離體或活體外細胞物質)可能具有及/或已經診斷有或具有HCMV感染癌細胞，諸如潛伏HCMV感染癌細胞。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之個體可為或意欲為細胞物質，諸如細胞產物供給之受體。該細胞產物可例如包含離體活細胞物質、基本上由其組成或由其組成，該離體活細胞物質係選自包括以下之群組：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。視情況，細胞產物可直接或間接來源於活的供體。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之個體可為或意欲為細胞物質之供體，諸如細胞產物之供體。該細胞產物可包含來自該供體之細胞、組織或器官中之任一者或多者、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，根據本發明第十一態樣的待處理之離體或活體外細胞物質可為離體細胞產物。該離體細胞產物可例如包含離體活細胞物質、基本上由其組成或由其組成，該離體活細胞物質係選自包括以下之群組：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。視情況，細胞產物可直接或間接來源於活的供體。
在一個實施例中，根據本發明第十一態樣的待使用之一或多種藥劑可例如選自由以下組成之群組(或包括選自由以下組成之群組的一或多種藥劑)：
i. 如由本發明之第一態樣所定義的治療性抗體，
ii. 如由本發明之第一態樣所定義之該治療性抗體的功能片段，
iii. 如由本發明之第一態樣所定義之包含融合多肽序列之治療性抗體；及
iv. 如由本發明之第一態樣所定義之包含融合多肽序列之該治療性抗體之功能片段。
舉例而言，根據本發明第十一態樣使用之一或多種藥劑可為(或包括選自以下之一或多種藥劑)如由本發明之第一態樣所定義之雙特異性抗體。在無限制下，此可以為雙特異性免疫細胞接合子抗體。其示例性實施例為雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體，視情況其中除包含對US28蛋白之ECD1區具有結合特異性的本發明之第一態樣之結合分子的區以外，BiTE抗體進一步包含T細胞接合域，諸如CD3結合域。
在另一實施例中，根據本發明第十一態樣的待使用之一或多種藥劑可例如為(或包括)根據本發明第八態樣及/或本發明第十態樣之結合物，諸如作為抗體-藥物結合物(「ADC」)之結合物，或包含放射性部分之結合物，諸如適用於放射免疫療法(「RIT」)之結合物。
在另一實施例中，根據本發明第十一態樣的待使用之一或多種藥劑可例如為(或包括)細胞(或細胞群，例如均質細胞群)，其中該細胞或各細胞包含根據本發明第四態樣之CAR。該細胞或細胞群通常經分離及/或調配以用於向個體投與。
H. 組合治療： 視情況，根據本發明之第十一態樣，可向個體投與另一物質，諸如另一治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性物質，且視情況其中該另一物質可分開、依序投與或與一或多種藥劑中之每一者同時投與。
因此，本發明之第十一態樣亦提供一種治療有需要之個體的方法，其係藉由向個體投與治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性物質執行，其中亦分開、依序(例如之前或之後)或同時用一或多種藥劑中之任一者治療個體。
在同時治療之實施例中，接著根據本發明第十一態樣使用的一或多種藥劑可與治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性物質組合調配及/或投與；或可分開調配但作為兩種單獨調配物同時投與。
舉例而言，在一個實施例中，待治療之疾病或病況可為一種形式之癌症(諸如一或多種形式如上文所揭示之癌症)，且可使其他治療性、預防性、診斷性、預後或治療診斷物質靶向癌症。
因此，在本揭示案之情形下，亦預期，本發明之結合分子及如本發明第十一態樣所定義之其他治療劑可類似地結合化學或放射性治療性干預或其他治療用於治療癌症。
該等不同形式之治療可以數分鐘至數週範圍內之間隔先於其他治療或在其他治療之後。舉例而言，在彼此的約12至24小時內，且更佳在彼此的約6至12小時內，其中僅約12小時的延遲時間為一個較佳選項。在某些情況下，可能需要延長時段以進行顯著治療，無論如何，在各別投與之間會流逝若干天(2、3、4、5、6或7天)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8週)。
考慮到治療之毒性(若存在)，向患者投與本發明之治療劑將遵循用於投與該特定二級療法之一般方案。預期治療週期將視需要重複進行。亦預期，各種標準療法以及手術干預可與所描述之癌症療法組合施加。
熟習此項技術者係根據《雷明頓氏醫藥科學》第15版，第33章，尤其第624-652頁。視所治療個體之病況而定，將必然出現一些劑量變化。在任何事件中，負責投與之人員將判定個別個體之適當劑量。對於人類投與而言，製劑應符合FDA生物製劑標準辦公室所要求之無菌性、發熱性、一般安全性及純度標準性。
在一些實施例中，組合療法包含投與對HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽具有特異性的本發明之第一結合分子或其他治療劑，及例如如上關於本發明之結合分子之ECD3結合所定義但不具有抗SEQ 177結合活性的對ECD3具有特異性之第二結合分子或其他治療劑。視情況，在此類組合治療之情況下，本發明之第一結合分子或其他治療劑不包含抗ECD3結合活性。因此，組合療法可視情況包含投與主要或僅針對SEQ ID NO: 177內之抗原決定基特異性結合至US28的本發明之第一結合分子或其他治療劑，及主要或僅針對US28之ECD3內的抗原決定基特異性結合至US28，諸如如本文所述之ECD3抗原決定基的第二結合分子或其他治療劑。本發明亦提供包含此類結合分子或其他治療劑之組合的調配物。
1. 化療化學治療抗癌劑可例如選自烷基化劑，包括氮芥，諸如甲基二(氯乙基)胺(HN
2)、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖(L-溶肉瘤素)及氯芥苯丁酸；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，諸如六甲蜜胺、塞替派(thiotepa)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulphan)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU)及鏈脲佐菌素(streptozocin)(鏈佐黴素)；及三氮烯，諸如達卡巴
(decarbazine)(DTIC；二甲基三氮烯基咪唑-甲醯胺)；抗代謝物，包括葉酸類似物，諸如胺甲喋呤(methotrexate/amethopterin)；嘧啶類似物，諸如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟去氧尿苷；FUdR)及阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；及嘌呤類似物及相關抑制劑，諸如巰基嘌呤(6-巰基嘌呤；6-MP)、硫鳥嘌呤(6-硫鳥嘌呤；TG)及噴司他汀(2'-去氧助間型黴素)；包括長春花生物鹼之天然產物，諸如長春鹼(VLB)及長春新鹼；表鬼臼毒素，諸如依託泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide)；抗生素，諸如放線菌素(放線菌素D)、道諾黴素(daunorubicin)(柔紅黴素(daunomycin)；紅比黴素(rubidomycin))、阿黴素、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)(光神黴素(mithramycin))及絲裂黴素(絲裂黴素C)；酶類，諸如L-天冬醯胺酶；及生物反應調節劑，諸如干擾素艾爾夫農(alphenome)；各種藥劑，包括鉑配位複合物，諸如順鉑(順-DDP)及卡鉑；蒽醌，諸如米托蒽醌(mitoxantrone)及蒽環黴素；經取代脲，諸如羥基脲；甲基肼衍生物，諸如丙卡巴肼(N-甲基肼，MIH)；及腎上腺皮質抑制劑，諸如米托坦(mitotane)(
o,p′-DDD)及胺麩精(aminoglutethimide)；紫杉醇及類似物/衍生物；細胞週期抑制劑；蛋白酶體抑制劑，諸如硼替佐米(Bortezomib)(Velcade
®)；信號轉導酶(transductase)(例如酪胺酸激酶)抑制劑，諸如伊馬替尼(Imatinib)(Glivec
®)、COX-2抑制劑及激素促效劑/拮抗劑，諸如氟他胺(flutamide)及他莫昔芬(tamoxifen)。
臨床上使用之抗癌劑通常藉由以下作用機制分組：烷基化劑、拓樸異構酶I抑制劑、拓樸異構酶II抑制劑、RNA/DNA抗代謝物、DNA抗代謝物及抗有絲分裂劑。美國NIH/國家癌症研究所網站列出122種化合物(http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/ _searches/standard_mechanism.html)，其皆可結合如藉由本發明之各種態樣所描述之US28目標方法來使用。其包括烷基化劑，包括Asaley、AZQ、BCNU、白消安(Busulfan)、羧基鄰苯二甲酸鉑、CBDCA、CCNU、CHIP、氯芥苯丁酸、氯脲菌素、順鉑、氯乙礬、氰基-N-嗎啉基-阿黴素、塞迪遜(cyclodisone)、衛康醇(dianhydrogalactitol)、氟多潘(fluorodopan)、海普法姆(hepsulfam)、羥胺硫蒽酮(hycanthone)、美法侖、甲基CCNU、絲裂黴素C、米托唑醯胺(mitozolamide)、氮芥、PCNU、哌
、哌
二酮、哌泊溴烷(pipobroman)、泊非羅黴素(porfiromycin)、螺乙內醯脲氮芥(spirohydantoin mustard)、替羅昔隆(teroxirone)、四鉑(tetraplatin)、吡鉑(picoplatin)(SP-4-3)(順-胺二氯(2-甲基吡啶)Pt(II))、塞替派、三伸乙基蜜胺、尿嘧啶氮芥、Yoshi-864；抗有絲分裂劑，包括別秋水仙鹼(allocolchicine)、軟海綿素B、秋水仙鹼、秋水仙鹼衍生物、海兔毒素10、美登素、根瘤菌素、紫杉醇、紫杉醇衍生物、硫代秋水仙鹼、三苯甲基半胱胺酸、長春鹼硫酸鹽、長春新鹼硫酸鹽；拓樸異構酶I抑制劑，包括喜樹鹼、喜樹鹼、Na鹽、胺基喜樹鹼、喜樹鹼衍生物、嗎啉基阿黴素；拓樸異構酶II抑制劑，包括阿黴素、胺萘非特(amonafide)、m-AMSA、蒽吡唑(anthrapyrazole)衍生物、派拉瑞丁(pyrazoloacridine)、比生群(bisantrene) HCL、道諾黴素、去氧阿黴素、米托蒽醌、美諾立爾(menogaril)、N,N-二苯甲基柔紅黴素、氧雜蒽唑(oxanthrazole)、柔紅黴素苯腙(rubidazone)、VM-26、VP-16；RNA/DNA抗代謝物，包括L-丙氨菌素、5-氮胞苷、5-氟尿嘧啶、阿西維辛(acivicin)、3胺基喋呤衍生物、抗葉酸劑、貝克氏可溶性抗葉酸劑(Baker's soluble antifol)、二氯烯丙基指甲花醌(dichlorallyl lawsone)、布喹那(brequinar)、替加氟(ftorafur)(前藥)、5,6-二氫-5-氮胞苷、甲胺喋呤、甲胺喋呤衍生物、N-(膦醯乙醯基)-L-天冬胺酸(PALA)、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)、曲美沙特(trimetrexate)；DNA抗代謝物，包括3-HP、2'-去氧-5-氟尿苷、5-HP、α-TGDR、甘胺酸阿非迪黴素(aphidicolin glycinate)、阿糖胞苷(ara-C)、5-氮雜-2'-去氧胞苷；β-TGDR、環胞苷、胍唑、羥基脲、肌苷乙醇醛(inosine glycodialdehyde)、麥克菌素(macbecin) II、吡唑并咪唑、硫鳥嘌呤及硫嘌呤。
然而，至少一種其他抗癌劑較佳選自順鉑；卡鉑；吡鉑；5-氟尿嘧啶；太平洋紫杉醇；絲裂黴素C；阿黴素；吉西他濱(gemcitabine)；雷替曲塞(tomudex)；培美曲塞(pemetrexed)；甲胺喋呤；伊立替康(irinotecan)、氟尿嘧啶及甲醯四氫葉酸；奧沙利鉑(oxaliplatin)、5-氟尿嘧啶、泛艾黴素(epirubin)、卡培他濱(cabecitabine)、多西他賽(doxotaxel)、太平洋紫杉醇及卡鉑。
較佳抗血管生成化合物包括貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin®)；伊曲康唑(itraconazole)；羧醯胺基三唑；TNP-470 (煙黴素類似物)；CM101；IFN-α；IL-12；血小板因子-4；蘇拉明(suramin)；SU5416；血小板反應蛋白；VEGFR拮抗劑；血管抑制性類固醇+肝素；軟骨源血管生成抑制因子；基質金屬蛋白酶抑制劑；血管抑素；內皮抑素(endostatin)；2-甲氧基雌二醇；替康蘭(tecogalan)；四硫鉬酸鹽；沙立度胺(thalidomide)；促乳素；α
Vβ
3抑制劑；利諾胺(linomide)；他喹莫德(tasquinimod)；蘭比珠單抗(ranibizumab)；索拉非尼(sorafenib)；(Nexavar®)；舒尼替尼(sunitinib)(Sutent®)；帕唑帕尼(pazopanib)(Votrient®)；及依維莫司(everolimus)(Afinitor®)。
另一治療劑可為次活化細胞毒性劑(例如替拉紮明(Tirapazamine))。
癌症療法亦包括具有基於化學及輻射治療的多種組合療法。組合化療包括例如順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環磷醯胺、喜樹鹼、異環磷醯胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝基脲、更生黴素、道諾黴素、阿黴素、博萊黴素、光輝黴素(plicomycin)、絲裂黴素、依託泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷諾昔酚(raloxifene)、雌激素受體結合劑、紫杉醇、吉西他濱、溫諾平(navelbine)、法呢基蛋白轉移酶抑制劑、反鉑、5-氟尿嘧啶、長春新鹼、長春鹼及甲胺喋呤、替莫唑胺(Temazolomide)(一種水性形式DTIC)或前述之任何類似物或衍生變體。
化療與生物療法之組合已知為生化療法。本發明涵蓋可採用或此項技術中已知用於治療或預防癌症之任何化學治療劑。
2. 放射線療法造成DNA損傷且已廣泛使用之其他因素包括通常稱為γ-射線、X射線及/或放射性同位素直接遞送至腫瘤細胞之因素。亦涵蓋其他形式之DNA損傷因素，諸如微波及UV輻照。最可能之情形為，所有此等因素對DNA、DNA之前驅物、DNA之複製及修復，及染色體之組裝及維持造成大範圍損害。X射線之劑量範圍在延長的時段(3至4週)期間50至200倫琴日劑量至2000至6000倫琴之單次劑量範圍內。放射性同位素之劑量範圍變化極大，且視同位素之半衰期、所發射輻射之強度及類型及贅生性細胞之攝取而定。
當應用於細胞時，術語「接觸」及「暴露」在本文中用於描述治療劑及化學治療劑或放射性治療劑藉以遞送至目標或與目標直接併接地安置之過程。為實現細胞殺死或停滯，兩種藥劑以有效殺死目標處之一或多種細胞或阻止該等細胞分裂之組合量遞送至細胞。
3. 免疫療法免疫治療劑通常依賴於使用免疫效應細胞及分子以靶向及摧毀癌細胞。免疫效應子可為例如對腫瘤細胞表面上之一些標記具有特異性之抗體。出於本發明之目的且在無限制下，標記可為如表現於HCMV感染腫瘤細胞之表面上的US28；在此情況下抗體可為或包含本發明之結合分子中之任一者。單獨的抗體可充當療法之效應子或其可募集其他細胞以實際上實現細胞殺死。抗體亦可與藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)結合且僅充當靶向劑。替代地，效應子可為攜載直接或間接與腫瘤細胞目標相互作用之表面分子的淋巴球。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。治療模式之組合，亦即直接細胞毒活性及Fortilin蛋白之抑制或減少將在癌症治療中提供治療益處。
免疫療法亦可用作組合療法之一部分。下文論述用於組合療法之通用方法。在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須帶有一些適合於靶向，亦即不存在於大部分其他細胞上之標記。存在許多腫瘤標記，且任何此等標記可適用於在本發明之情形下靶向。常見腫瘤標記包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、尿液腫瘤相關抗原、胚胎抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層黏連蛋白受體、
erbB及p155。免疫療法之替代態樣為組合抗癌作用與免疫刺激作用。亦存在免疫刺激分子，包括：細胞介素，諸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趨化介素，諸如MIP-1、MCP-1、IL-8及生長因子，諸如FLT3配位體。組合免疫刺激分子作為蛋白質或使用基因遞送與腫瘤抑制因子(諸如MDA-7)的組合已展示增強抗腫瘤作用(Ju等人, 2000)。
當前在研究中或在使用中之免疫療法之實例係免疫佐劑(例如牛分枝桿菌(
Mycobacterium bovis)、鐮狀瘧原蟲(
Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯及芳族化合物)(美國專利5,801,005；美國專利5,739,169; Hui及Hashimoto, 1998, 《感染與免疫(
Infect. Immun.)》,
66(11):5329-36; Christodoulides等人, 1998, 《微生物學(
Microbiology)》,
144(Pt ll):3027-37)、細胞介素治療(例如干擾素；及IL-1、GM-CSF及TNF)(Bukowski等人, 1998, 《臨床癌症研究》
4(10):2337-47; Davidson等人, 1998, 《免疫與療法雜誌(
J. Immunother.)》,
21(5):389-98; Hellstrand等人
,1998, 《腫瘤學(
Oncol)》,
37(4):347-353)、基因療法(例如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等人, 1998, 《美國國家科學院院刊》,
95(24): 1441 1-14416; Austin-Ward及Villaseca, 1998,
Rev. Med. Chil, 126(7):838-45; 美國專利5,830,880及美國專利5,846,945)及單株抗體(例如抗神經節苷脂GM2、抗HER-2、抗p185)(Pietras等人, 1998, 《致癌基因(
Oncogene)》,
17(17):2235-49; Hanibuchi等人, 1998, 《國際癌症期刊》,
78(4):480-5; 美國專利5,824,311)。赫賽汀(Herceptin)(曲妥珠單抗(trastuzumab))係阻斷HER2-neu受體之嵌合(小鼠-人類)單株抗體。其具有抗腫瘤活性且已批准用於治療惡性腫瘤(Dillman, 1999,
Cancer Biother.Radiopharm.,
14:5-10)。赫賽汀與化療之癌症組合療法已展示比單獨療法更有效。因此，預期一或多種抗癌療法可與如本文所描述之針對HCMV編碼US28之ECD3的本發明療法一起採用。
在過繼性免疫療法中，將患者循環淋巴球或腫瘤浸潤淋巴球活體外分離，藉由諸如IL-2之淋巴介質活化或用針對腫瘤壞死之基因轉導，且再投與(Rosenberg等人, 1988, 《新英格蘭醫學雜誌(
N. Engl J. Med)》,
319:1676; Rosenberg等人, 1989, 《外科學年鑑(
Ann. Surg.)》,
210:474)。為達成此目的，將向動物或人類患者投與免疫學上有效量之活化淋巴球與如本文所述之併入佐劑之抗原肽組合物的組合。活化淋巴球將最佳為患者自身細胞，其先前自血液或腫瘤樣本分離且活體外經活化(或「擴增」)。此形式之免疫療法已產生若干黑素瘤及腎癌消退情況，但反應者百分比相比於無反應者較少。
存在用於癌症之被動免疫療法之多種不同方法。其可廣泛地分成以下：單獨注射抗體；注射與毒素偶合之抗體或化學治療劑；注射與放射性同位素偶合之抗體；注射抗個體基因型抗體；及最後，清除骨髓中之腫瘤細胞。
人類單株抗體用於被動免疫療法中，因為其在患者中產生很少或沒有副作用。然而，其應用略微受限於其稀缺性且迄今為止僅在病灶內投與過。針對神經節苷脂抗原之人類單株抗體已向罹患皮膚復發性黑素瘤的患者病灶內投與(Irie及Morton, 1986, 《美國國家科學院院刊》
83:8694-8698)。在每日或每週進行病灶內注射後，在十名患者中之六名患者中觀測到消退。在另一研究中，由病灶內注射兩個人類單株抗體而實現適度成功(Irie等人, 「黑素瘤神經節苷脂及人類單株抗體(
Melanoma gangliosides and human monoclonal antibody)」見：《人類腫瘤抗原及特異性腫瘤療法(Human Tumor Antigens and Specific Tumor Therapy)》, Metzgar及Mitchell (編), Alan R. Liss公司, New York, 第115-126頁, 1989)。可能的治療性抗體包括抗TNF、抗CD25、抗CD3、抗CD20、CTLA-4-IG及抗CD28。
投與超過一種針對兩種不同抗原之單株抗體或甚至具有多種抗原特異性之抗體係可能有利的。治療方案亦可包括投與淋巴介質或其他免疫增強劑，如Bajorin等人, 1988,
Proc. Anu.Meet.Am. Soc. Clin.Oncol,
7:A967所描述。人類單株抗體之研發進一步詳細描述於本說明書中其他處。
4. 基因療法在又一實施例中，二級治療為一種基因療法，其中治療性聚核苷酸在本發明第十一態樣之療法之前、之後或同時投與。某種形式之基因療法可與本發明組合靶向的各種基因為一般熟習此項技術者所熟知且可包含涉及癌症之任何基因。
細胞增殖之誘導劑.誘導細胞增殖之蛋白質視功能而定進一步屬於各種類別。所有此等蛋白質之共同性為其調節細胞增殖之能力。舉例而言，PDGF (sis致癌基因)之一種形式為分泌生長因子。致癌基因很少由編碼生長因子之基因產生，且目前，sis係唯一已知的天然存在之致癌生長因子。在本發明之一個實施例中，預期針對細胞增殖之特定誘導劑的反義mRNA用於防止細胞增殖之誘導劑表現。
蛋白質FMS、ErbA、ErbB及neu為生長因子受體。此等受體之突變致使可調節功能喪失。舉例而言，影響Neu受體蛋白質之跨膜域之點突變產生neu致癌基因。erbA致癌基因來源於甲狀腺激素之細胞內受體。被修飾之致癌ErbA受體被認為與內源性甲狀腺激素受體競爭，引起不受控生長。
最大類別之致癌基因包括信號轉導蛋白質(例如，Src、Abl及Ras)。蛋白質Src為細胞質蛋白質酪胺酸激酶，且其自原致癌基因至致癌基因之轉型在一些情況下經由酪胺酸殘基527處之突變產生。相比之下，在一個實例中，GTP酶蛋白質ras自原致癌基因轉型為致癌基因係由序列中胺基酸12處之纈胺酸至甘胺酸突變產生，從而降低ras GTP酶活性。蛋白質Jun、Fos及Myc為直接發揮其對作為轉錄因子之核功能之作用的蛋白質。
細胞增殖抑制劑.腫瘤抑制致癌基因用於抑制過度細胞增殖。此等基因失活破壞其抑制活性，導致不受調控之增殖。最常見腫瘤抑制劑為Rb、p53、p21及p16。可根據本發明採用之其他基因包括APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、C-CAM、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合及p21/p27融合。
程式化細胞死亡之調節子。細胞凋亡或程式化細胞死亡為正常胚胎發育、維持成人組織內穩定及抑制癌發生之基本過程(Kerr等人, 1972)。在其他系統中，Bcl-2家族蛋白質及ICE樣蛋白酶已經證實為細胞凋亡之重要調節因子及效應子。發現與濾泡性淋巴瘤結合之Bcl-2蛋白質響應於不同細胞凋亡刺激在控制細胞凋亡及增強細胞存活方面起重要作用(Bakhshi等人, 1985, 《細胞》,
41(3):899-906; Cleary及Sklar, 1985, 《美國國家科學院院刊》,
82(21):7439-43; Cleary等人, 1986, 《實驗醫學雜誌》,
164(1):315-20; Tsujimoto等人, 1985, 《科學》,
228(4706):1440-3; Tsujimoto及Croce, 1986, 《美國國家科學院院刊》,
83(14):5214-8)。現將進化保守的Bcl-2蛋白質視為相關蛋白質家族之成員，其可歸類為死亡促效劑或死亡拮抗劑。
在發現其之後，Bcl-2展示用以遏制由多種刺激觸發之細胞死亡。此外，顯而易見地，存在共有共同結構及序列同源性之Bcl-2細胞死亡調節蛋白家族。此等不同家族成員已展示具有與Bcl-2 (例如Bcl
XL、Bcl
W、Bcl
S、Mcl-1、A1、Bfl-1)類似的功能，或抵消Bcl-2功能且促進細胞死亡(例如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
5. 手術大致60%患有癌症的人將經歷一些類型之手術，其包括預防性、診斷或分期、治癒性及姑息性手術。治癒性手術為可與其他療法結合使用之癌症治療，諸如本發明之治療、化學療法、放射線療法、荷爾蒙療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法。
治癒性手術包括切除，其中物理上移除、切除及/或破壞癌組織之全部或一部分。腫瘤切除係指物理移除腫瘤之至少部分。除腫瘤切除以外，手術治療亦包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制手術(莫氏手術(Mohs' surgery))。進一步預期，本發明可與移除表面皮癌、初癌或附帶量之正常組織結合使用。
在切除一部分或所有癌細胞、組織或腫瘤後，可在體內形成空腔。治療可藉由用額外抗癌療法對該區域灌注、直接注射或局部施用而實現。可例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或每1週、2週、3週、4週及5週，或每1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月重複此類治療。
I. ECD1及/或ECD3衍生肽序列及其用途
如上文所論述，當考慮到針對US28之結合分子設計時，本發明人指出，鑒於US28蛋白之N端部分(ECD1)在不同HCMV病毒株當中含有高程度突變，本發明人鑑別出ECD1之特定區域可為高度特異性及病毒株未定性抗體之適當目標。
此方法係基於使用具有序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之來源於ECD1之肽序列。
此肽序列在本申請案之實例中稱為肽-N，用於對小鼠進行免疫且篩選及鑑別對US28 ECD1之基因變體具有高度特異性且可能病毒株未定性結合特性以及展示與過度表現US28之US28-CHO-A1細胞及感染HCMV之人類肺組織高度特異性結合的抗體。
本發明人先前發現保守ECD2及ECD4蛋白質之保守部分並非小鼠之適當免疫原，且因此本申請人先前開發出一種鑑別針對HCMV US28之ECD3區的高度特異性、病毒株未定性結合分子。
此方法係基於使用來源於ECD3之兩個以下變異形式的肽序列，具有如由SEQ ID NO: 6所定義之序列TKKNNQCMTDYDYLEVS之4N變體；及具有如由SEQ ID NO: 7所定義之序列TKKDNQCMTDYDYLEVS之4D變體。
在本申請案之實例中分別稱為肽1及2之此等肽序列用於對小鼠進行免疫，且用於篩選及鑑別針對US28 ECD3肽之兩種基因變體具有高度特異性且病毒株未定性結合特性以及展示與以下的高度特異性結合的抗體：過度表現US28之US28-CHO-A1細胞、經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞、來自HCMV血清反應呈陽性之個體之初級PBMC、感染HCMV之人類肺組織及若干類型之侵襲性人類腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤。
進一步提供該等肽序列及其功能衍生物及變體以及其根據本發明之用途。
如先前所提及，本發明之第十三態樣提供一種肽或多肽，其包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)、基本上由其組成或由其組成。
該肽或多肽並非US28蛋白。舉例而言，當在整個其長度中考慮時，在由SEQ ID NO: 177或其免疫原性片段或變體定義之序列外，本發明之第十三態樣之肽或多肽的剩餘序列可與序列US28具有小於50%、40%、30%、20%、10%或5%序列一致性。較佳地，該肽或多肽中僅US28衍生之序列為序列SEQ ID NO: 177或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段或變體之序列。
此外，本發明之第十四態樣提供一種肽或多肽，其包含US28之ECD3之4N變體之序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)、基本上由其組成或由其組成，或包含SEQ ID NO: 6之免疫原性片段或變體之序列。
該肽或多肽並非US28蛋白。舉例而言，當在整個其長度中考慮時，在由SEQ ID NO: 6或其免疫原性片段或變體定義之序列外，本發明之第十三態樣之肽或多肽的剩餘序列可與US28之序列具有小於50%、40%、30%、20%、10%或5%序列一致性。較佳地，該肽或多肽中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 6之序列或SEQ ID NO: 6之免疫原性片段或變體之序列。
本發明之第十四態樣亦提供一種肽或多肽，其包含序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)、基本上由其組成或由其組成，或包含SEQ ID NO: 7之免疫原性片段或變體之序列。
該肽或多肽並非US28蛋白。舉例而言，當在其整個長度考慮時，在由SEQ ID NO: 7或其免疫原性片段或變體定義之序列外，本發明之第十四態樣之肽或多肽的剩餘序列可與US28之序列具有小於50%、40%、30%、20%、10%或5%序列一致性。較佳地，該肽或多肽中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 7之序列或SEQ ID NO: 7之免疫原性片段或變體之序列。
根據本發明之第十三態樣的參考序列SEQ ID NO: 177之免疫原性片段或變體可包含少於參考序列之全序列，且較佳包含參考序列之至少3、4、5、6、7、8、9、10或11個連續胺基酸。
SEQ ID NO: 177之該免疫原性片段可例如選自以下中之任一者或多者：
- 11-聚體，其選自：DVLNQSKPVTL；或TDVLNQSKPVT；
- 10-聚體，其選自：VLNQSKPVTL；DVLNQSKPVT或TDVLNQSKPV；
- 9-聚體，其選自：LNQSKPVTL；VLNQSKPVT；DVLNQSKPV；或TDVLNQSKP；
- 8-聚體，其選自：NQSKPVTL；LNQSKPVT；VLNQSKPV；DVLNQSKP；或TDVLNQSK；
- 7-聚體，其選自：QSKPVTL；NQSKPVT；LNQSKPV；VLNQSKP；DVLNQSK；或TDVLNQS；
- 6-聚體，其選自：SKPVTL；QSKPVT；NQSKPV；LNQSKP；VLNQSK；DVLNQS；或TDVLNQ；
- 5-聚體，其選自：KPVTL；SKPVT；QSKPV；NQSKP；LNQSK；VLNQS；DVLNQ；或TDVLN；
- 4-聚體，其選自：PVTL；KPVT；SKPV；QSKP；NQSK；LNQS；VLNQ；DVLN；或TDVL；或
- 3-聚體，其選自：VTL；PVT；KPV；SKP；QSK；NQS；LNQ；VLN；DVL；TDV。
分別根據本發明之第十四態樣的參考序列SEQ ID NO: 6或7之免疫原性片段或變體包含少於參考序列之全序列，且較佳包含參考序列之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續胺基酸。
SEQ ID NO: 6之該免疫原性片段可例如選自以下中之任一者或多者：
- 16-聚體，其選自：KKNNQCMTDYDYLEVS或TKKNNQCMTDYDYLEV；
- 15-聚體，其選自：KNNQCMTDYDYLEVS；KKNNQCMTDYDYLEV；或TKKNNQCMTDYDYLE；
- 14-聚體，其選自：NNQCMTDYDYLEVS；KNNQCMTDYDYLEV；KKNNQCMTDYDYLE；或TKKNNQCMTDYDYL；
- 13-聚體，其選自：NQCMTDYDYLEVS；NNQCMTDYDYLEV；KNNQCMTDYDYLE；KKNNQCMTDYDYL；或TKKNNQCMTDYDY；
- 12-聚體，其選自：QCMTDYDYLEVS；NQCMTDYDYLEV；NNQCMTDYDYLE；KNNQCMTDYDYL；KKNNQCMTDYDY；TKKNNQCMTDYD；
- 11-聚體，其選自：CMTDYDYLEVS；QCMTDYDYLEV；NQCMTDYDYLE；NNQCMTDYDYL；KNNQCMTDYDY；KKNNQCMTDYD；或TKKNNQCMTDY；
- 10-聚體，其選自：MTDYDYLEVS；CMTDYDYLEV；QCMTDYDYLE；NQCMTDYDYL；NNQCMTDYDY；KNNQCMTDYD；KKNNQCMTDY；或TKKNNQCMTD；
- 9-聚體，其選自：TDYDYLEVS；MTDYDYLEV；CMTDYDYLE；QCMTDYDYL；NQCMTDYDY；NNQCMTDYD；KNNQCMTDY；KKNNQCMTD；或TKKNNQCMT；
- 8-聚體，其選自：DYDYLEVS；TDYDYLEV；MTDYDYLE；CMTDYDYL；QCMTDYDY；NQCMTDYD；NNQCMTDY；KNNQCMTD；KKNNQCMT；或TKKNNQCM；
- 7-聚體，其選自：YDYLEVS；DYDYLEV；TDYDYLE；MTDYDYL；CMTDYDY；QCMTDYD；NQCMTDY；NNQCMTD；KNNQCMT；KKNNQCM；或TKKNNQC；
- 6-聚體，其選自：DYLEVS；YDYLEV；DYDYLE；TDYDYL；MTDYDY；CMTDYD；QCMTDY；NQCMTD；NNQCMT；KNNQCM；KKNNQC；或TKKNNQ；
- 5-聚體，其選自：YLEVS；DYLEV；YDYLE；DYDYL；TDYDY；MTDYD；CMTDY；QCMTD；NQCMT；NNQCM；KNNQC；KKNNQ；或TKKNN；
- 4-聚體，其選自：LEVS；YLEV；DYLE；YDYL；DYDY；TDYD；MTDY；CMTD；QCMT；NQCM；NNQC；KNNQ；KKNN；或TKKN；或
- 3-聚體，其選自：EVS；LEV；YLE；DYL；YDY；DYD；TDY；MTD；CMT；QCM；NQC；NNQ；KNN；KKN；TKK。
SEQ ID NO: 7之該免疫原性片段可例如選自以下中之任一者或多者：
- 16-聚體，其選自：KKDNQCMTDYDYLEVS或TKKDNQCMTDYDYLEV；
- 15-聚體，其選自：KDNQCMTDYDYLEVS；KKDNQCMTDYDYLEV；或TKKDNQCMTDYDYLE；
- 14-聚體，其選自：DNQCMTDYDYLEVS；KDNQCMTDYDYLEV；KKDNQCMTDYDYLE；或TKKDNQCMTDYDYL；
- 13-聚體，其選自：NQCMTDYDYLEVS；DNQCMTDYDYLEV；KDNQCMTDYDYLE；KKDNQCMTDYDYL；或TKKDNQCMTDYDY；
- 12-聚體，其選自：QCMTDYDYLEVS；NQCMTDYDYLEV；DNQCMTDYDYLE；KDNQCMTDYDYL；KKDNQCMTDYDY；TKKDNQCMTDYD；
- 11-聚體，其選自：CMTDYDYLEVS；QCMTDYDYLEV；NQCMTDYDYLE；DNQCMTDYDYL；KDNQCMTDYDY；KKDNQCMTDYD；或TKKDNQCMTDY；
- 10-聚體，其選自：MTDYDYLEVS；CMTDYDYLEV；QCMTDYDYLE；NQCMTDYDYL；DNQCMTDYDY；KDNQCMTDYD；KKDNQCMTDY；或TKKDNQCMTD；
- 9-聚體，其選自：TDYDYLEVS；MTDYDYLEV；CMTDYDYLE；QCMTDYDYL；NQCMTDYDY；DNQCMTDYD；KDNQCMTDY；KKDNQCMTD；或TKKDNQCMT；
- 8-聚體，其選自：DYDYLEVS；TDYDYLEV；MTDYDYLE；CMTDYDYL；QCMTDYDY；NQCMTDYD；DNQCMTDY；KDNQCMTD；KKDNQCMT；或TKKDNQCM；
- 7-聚體，其選自：YDYLEVS；DYDYLEV；TDYDYLE；MTDYDYL；CMTDYDY；QCMTDYD；NQCMTDY；DNQCMTD；KDNQCMT；KKDNQCM；或TKKDNQC；
- 6-聚體，其選自：DYLEVS；YDYLEV；DYDYLE；TDYDYL；MTDYDY；CMTDYD；QCMTDY；NQCMTD；DNQCMT；KDNQCM；KKDNQC；或TKKDNQ；
- 5-聚體，其選自：YLEVS；DYLEV；YDYLE；DYDYL；TDYDY；MTDYD；CMTDY；QCMTD；NQCMT；DNQCM；KDNQC；KKDNQ；或TKKDN；
- 4-聚體，其選自：LEVS；YLEV；DYLE；YDYL；DYDY；TDYD；MTDY；CMTD；QCMT；NQCM；DNQC；KDNQ；KKDN；或TKKD；或
- 3-聚體，其選自：EVS；LEV；YLE；DYL；YDY；DYD；TDY；MTD；CMT；QCM；NQC；DNQ；KDN；KKD；TKK。
較佳地，所選免疫原性片段或其中之每一者不包括存在於任何其他蛋白質，尤其任何蛋白質(諸如其他GPCR)之胞外區中之彼等序列；此可幫助獲得US28之ECD及/或ECD3所需特異性且使任何脫靶效應降至最低或較佳避免任何脫靶效應。因此，較長免疫原性片段可為較佳的，例如至少5-聚體、至少6-聚體、至少7-聚體、至少8-聚體、至少9-聚體、至少10-聚體、至少11-聚體、至少12-聚體、至少13-聚體、至少14-聚體、至少15-聚體或至少16-聚體。
分別根據本發明之第十三或第十四態樣之參考序列SEQ ID NO: 177、6或7之免疫原性片段或變體通常能夠引起免疫反應(例如人類或其他動物體內之免疫反應)，諸如引起體液及/或細胞介導之免疫反應。該免疫反應為分別對如存在於根據本發明之第十三或第十四態樣之肽或多肽內之參考序列(亦即SEQ ID NO: 177、6及/或7)具有特異性的免疫反應。
在一個實施例中，本發明之第十四態樣之肽或多肽之免疫原性片段或變體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7共有的且存在於該等序列內的序列。該共有序列可包含連續胺基酸序列或非連續胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在一個實施例中，可由本發明之第十四態樣之肽或多肽之免疫原性片段或變體引起的免疫反應可為對SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7共有的且存在於該等序列內的序列具有特異性的免疫反應。舉例而言，共有序列可以包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7共有的且存在於該等序列內的連續胺基酸序列或非連續胺基酸序列。
本發明之第十三及第十四態樣亦提供肽或多肽，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：分別選自TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)、TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)或TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)之參考序列之免疫原性片段或變體，其中該免疫原性片段或變體包含US28之ECD1及/或ECD3內由抗體4H3C3、7B1F3、2F5B11、1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8結合之抗原決定基之序列、基本上由其組成或由其組成(其中亦包括scFv，其包含具有分別如由SEQ ID No: 187、211、233、12、104、122、68及88所定義之4H3C3、7B1F3、2F5B11、4A11A11、1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
H序列的V
H多肽序列，以及具有分別如由SEQ ID No: 189、213、235、18、108、126、72及92所定義之4H3C3、7B1F3、2F5B11、1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8之V
L序列的V
L多肽序列)。較佳地，該等肽或多肽由4H3C3、7B1F3、2F5B11、1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8特異性結合。
在一個實施例中，本發明之第十三及/或第十四態樣之肽或多肽(或各肽或多肽)(及/或其免疫原性片段或變體)以經純化及/或分離形式提供。
如由本發明之第十三及/或第十四態樣所定義之肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)適用於廣泛多種作用及效用。在無限制下，其可分開或組合使用以引起針對HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3之特異性免疫反應(例如作為個體中之疫苗及/或產生具有針對US28之ECD1及/或ECD3之結合特異性的其他抗體)；且亦為了捕獲、鑑別及/或表徵已指定為US28之ECD1及/或ECD3的結合分子(包括例如藉由提供用以捕獲、鑑別及/或表徵此類結合分子的手段，該等結合分子對US28之ECD1及/或ECD3具有病毒株未定性結合特異性，使得該等病毒株未定性結合分子可經確認為基本上同等地結合於如由本發明之第十三及/或第十四態樣所定義的肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)中之每一者，而不管是否存在已知之ECD1突變(例如表3中所述之ECD1突變)，及/或該4N變體序列或該4D變體序列)。因此，在一些實施例中，分開使用(例如單獨分析中各類型中之一者，該等單獨分析待用於組合中)或彼此混合使用呈組合形式的如本發明之第十三及/或第十四態樣所定義的該等肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)可為適用的。
如先前所提及，本發明之第十五態樣提供至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合，其包含第一肽或多肽及第二肽或多肽(視情況第三多肽)，其中：
(a)第一肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段，諸如如由本發明之第十三態樣所定義之免疫原性片段；及
(b)第二肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)或其免疫原性片段或變體，諸如如由本發明之第十四態樣所定義之肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)，條件為該免疫原性片段包含至少SEQ ID NO: 6之4N胺基酸；或
(c)第二肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)或其免疫原性片段，諸如如由本發明之第十四態樣所定義之免疫原性片段，條件為該免疫原性片段包含至少SEQ ID NO: 7之4D胺基酸；及
視情況其中第三肽或多肽對應於選項(b)或(c)，且其中第三肽或多肽不同於第二肽或多肽。
如由本發明之第十三及/或第十四態樣所定義之肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)及如由本發明之第十五態樣所定義之至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合可以其效用之最適當方式展現。舉例而言，其可適合於產生融合蛋白或結合物(其(但不限於)可適用作用於將該等肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)呈遞至免疫系統之攜載體)及/或產生該等肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)之固定形式，或其融合蛋白或結合物，例如用於在用於捕獲、鑑別及/或表徵對US28之ECD1及/或ECD3具有特異性的結合分子之分析中使用該等固定分子。
因此，本發明之第十六態樣提供一種融合蛋白，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：直接或經由一或多個連接子胺基酸序列融合至第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，其中第一胺基酸序列為如由本發明之第十三或第十四態樣所定義之肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)之序列；且第二胺基酸序列為融合搭配物。較佳地，該融合蛋白並非US28蛋白。較佳地，該融合蛋白中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列及/或該融合蛋白不含與在US28蛋白中在除包含SEQ ID NO: 177之序列之區以外之位置發現的同等長度之相連胺基酸序列之序列一致的3、4、5、6、7、8、9、10個或超過10個相連胺基酸之任何序列。
可選擇任何相關融合搭配物。熟習此項技術者熟知此項技術中已知之融合搭配物序列，且可選擇任何序列。融合搭配物可例如為攜載蛋白質。另外或替代地，融合搭配物可向與其融合之第一胺基酸序列提供額外或替代的結合特性及/或抗原特性；其可提供在第一胺基酸序列之結合位點處產生效應之效應部分；其可提供結合分子循環半衰期之調節(諸如增加或減少)；其可提供有助於偵測結合分子之序列。
在一個較佳選項中，融合搭配物為攜載蛋白質，諸如經選擇以提供適合於針對第一胺基酸序列進行抗體之免疫及產生的融合蛋白之攜載蛋白質。舉例而言，攜載蛋白質可選自由以下組成之群組：匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、經遺傳修飾之白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)及流感嗜血桿菌蛋白質D (HiD)。
迄今為止，就申請人所知，已用於經授權結合物疫苗中之五種攜載蛋白質為：TT、DT、經遺傳修飾之白喉類毒素之CRM、腦膜炎球菌OMPC及HiD。臨床試驗已證實此等結合物疫苗在預防傳染病中之功效。所有五種攜載蛋白質均有效增加疫苗之免疫原性，但引起不同量之具有不同親和力的抗體。已經評估(儘管在臨床試驗中不太充分)之額外攜載蛋白質包括綠膿桿菌外毒素A (rEPA)、匙孔螺血氰蛋白(KLH)及鞭毛蛋白。
本發明之第十七態樣提供至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合，該等融合蛋白包含第一融合蛋白及第二融合蛋白(及視情況第三融合蛋白)，其中：
(a)根據本發明之第十六態樣之第一融合蛋白包含作為第一融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段或變體；及
(b)根據本發明之第十六態樣之第二融合蛋白包含作為第一融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)或其免疫原性片段或變體，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO:6之4N胺基酸；或
根據本發明之第十六態樣之第二融合蛋白序列包含作為第二融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)或其免疫原性片段或變體，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO: 7之4D胺基酸；及
視情況第三融合蛋白根據選項(b)或(c)，其中第三融合蛋白不同於第二融合蛋白。
該組合可例如尤其適用作疫苗組合物之免疫原性組分，該疫苗組合物可用於在個體中引起免疫反應，該免疫反應對具有變化ECD1序列之HCMV病毒之多種變異株中的ECD1及/或針對HCMV病毒之4N變異株與4D變異株具有反應性。該反應可以例如包括產生多株抗體反應，其包含包括以下之抗體群體：與US28之ECD3之4N變體具有結合特異性的抗體、與US28之ECD3之4D變體具有結合特異性的抗體及較佳與US28之ECD3之4N及4D變體兩者具有病毒株未定性結合特異性的抗體。本發明亦提供一種可由該多株抗體反應獲得之經分離多株抗體產物，其中該多株抗體產物可經選擇以包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：對ECD1及視情況對US28之ECD3之4N及4D變體中之任一者或較佳兩者具有結合特異性的抗體。
如上文所論述，作為產生融合蛋白之替代(或額外修改)，本發明亦提供結合物之產生。因此，本發明之第十八態樣提供一種結合物，其包含與如由本發明之第十三及第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽結合的部分，或與如由本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白結合的部分。
該結合物之部分可直接結合於如由本發明之第十三及第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)，或結合於如由本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白。替代地，該結合物之部分可諸如經由連接子而與如由本發明之第十三及第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽或與如由本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白間接結合。
視情況，該部分可為攜載體，例如攜載蛋白，諸如選自以下之攜載體：匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、經遺傳修飾之白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)及流感嗜血桿菌蛋白質D (HiD)。
本發明之第十九態樣提供至少兩種(例如三種)不同結合物之組合，其中該組合包含：
(a)根據本發明之第十八態樣之第一結合物，其中該第一結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成；及
(b)根據本發明之第十八態樣之第二結合物，其中該第一結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO: 6之4N胺基酸；或
根據本發明之第十八態樣之第二結合物，其中該第二結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)或其免疫原性片段或變體、基本上由其組成或由其組成，條件為該免疫原性片段或變體包括SEQ ID NO: 7之4D胺基酸；及
視情況第三結合物根據選項(b)或(c)，其中第三結合物不同於第二結合物。
該組合可例如尤其適用作疫苗組合物之免疫原性組分，該疫苗組合物可用於在個體中引起免疫反應，該免疫反應對具有變化ECD1序列之HCMV病毒之多種變異株及視情況針對HCMV病毒之4N變異株與4D變異株具有反應性。該反應可以例如包括產生多株抗體反應，其包含包括以下之抗體群體：與ECD1及視情況與US28之ECD3之4N變體具有結合特異性的抗體、與US28之ECD3之4D變體具有結合特異性的抗體及較佳與US28之ECD3之4N及4D變體兩者具有病毒株未定性結合特異性的抗體。本發明亦提供一種可由該多株抗體反應獲得之經分離多株抗體產物，其中該多株抗體產物可經選擇以包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：對ECD1及視情況對US28之ECD3之4N及4D變體中之任一者或較佳兩者具有結合特異性的抗體。
本發明之第二十態樣提供一種產生根據本發明之第十九態樣之結合物的方法，該方法包含以下步驟：(a) 提供如由本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者所定義之肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)、如本發明之第十五態樣所定義之其組合或如本發明之第十六態樣所定義之融合蛋白；及(b)將部分與其結合。
可使用使部分與肽或多肽(或其免疫原性片段或變體)結合之任何方式；熟習此項技術者熟知在所選肽/多肽與所選其他部分之間產生結合物之習知方式，且自由選擇最適當方法。
舉例而言(但不限於)，交聯多肽之一些習知方法包括通常描述於O'Sullivan等人, 《分析生物化學(
Anal. Biochem.)》, 1979,
100, 100-108中之方法。舉例而言，肽或多肽可經工程改造以富集一或多個硫醇基及所選適用於與能夠與彼等硫醇基反應之雙官能藥劑，例如碘乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯(NHIA)或N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(結合物種之間併有二硫橋鍵的異雙官能交聯劑)反應之部分。例如用間順丁烯二醯亞胺基-N-羥基丁二醯亞胺酯達成的醯胺及硫醚鍵在活體內一般比二硫鍵更穩定。
其他適用交聯劑包括但不限於作為一級胺之硫醇化試劑的S-乙醯硫代乙醇酸N-羥基丁二醯亞胺酯(SATA)，其允許在溫和條件下使硫氫基去保護(Julian等人, 《分析生物化學》1983,
132: 68)，辛二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽及N,N'-鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺。
本發明之第二十一態樣提供一種產生如由本發明之第十九態樣所定義之至少兩種(例如三種)不同結合物之組合的方法。兩種(視情況三種)不同結合物可分別產生，且接著組合，或替代地，兩種(視情況三種)不同肽或多肽(或任一者之免疫原性片段或變體)，且接著可組合各產生於同一反應中之結合物以便產生至少兩種(例如三種)不同結合物之組合。
本發明之第二十或第二十一態樣之方法視情況包含以下步驟：分離生產之結合物或結合物之組合；及本發明之第二十二態樣提供藉由本發明之第二十或第二十一態樣中之任一者之方法獲得或可獲得的分離之結合物或結合物之組合，視情況其中分離之結合物經進一步調配用於向個體投與。舉例而言，其可調配用於下游用途，例如以醫藥或獸醫學組合物形式向受體投與。
本發明之第二十三態樣提供核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中核酸分子包含，或多個不同核酸分子之組合共同地包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合形式編碼根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽及/或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合。
根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或各核酸分子可例如各自獨立地選自DNA或RNA分子。根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或各核酸分子可例如各自獨立地選自單股或雙股核酸分子。上文在本申請案之部分B中所論述的選項中之每一者，在編碼根據本發明之第一態樣之結合分子的核酸之情形下，揭示於本文中且可在細節上作必要修改後應用於根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或各核酸分子。
本發明之第二十四態樣提供一種載體，其包含根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。可使用任何載體，儘管(但不限於)該載體可視情況選自由以下組成之群組：反轉錄病毒載體、質體、慢病毒載體及腺病毒載體。上文在本申請案之部分C中所論述之選項中之每一者，在併入一或多種編碼根據本發明之第一態樣之結合分子的核酸的情形下，揭示於本文中且可在細節上作必要修改後應用於根據本發明之第二十四態樣之載體或各載體。
本發明之第二十五態樣提供一種細胞，其包含根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據本發明之第二十四態樣之載體。視情況，該細胞表現選自本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合。上文在本申請案之部分D中所論述的選項中之每一者，在併入一或多種編碼根據本發明之第一態樣之結合分子的核酸(或併入該一或多種核酸之載體)的細胞之情形下，揭示於本文中且可在細節上作必要修改後應用於根據本發明之第二十五態樣之細胞或各細胞。
本發明進一步提供經分離之分子群體，其用於分離及/或擴增對HCMV之US28蛋白之ECD3具有特異性(較佳具有病毒株未定性特異性)的細胞，且視情況其中細胞為T細胞及/或B細胞，其中經分離之分子群體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：選自本發明之第十三及/或第十四多肽中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣之至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣之一或多種融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣之至少兩種(例如三種)不同融合蛋白的組合、根據本發明之第十八態樣之一或多種結合物及/或根據本發明之第十九態樣之至少兩種(例如三種)不同結合物之組合。
本發明進一步提供一種分離及/或擴增能夠特異性靶向HCMV之US28蛋白之ECD1 (及視情況ECD3) (較佳具有病毒株未定性特異性)之細胞的方法，其中該方法包含提供細胞源，及在選擇對HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3具有特異性之細胞(且較佳針對病毒株未定性特異性進行選擇)的方法中，使用如前述段落中所定義之經分離分子群體，及擴增所選細胞，且視情況其中細胞源係選自由以下組成之群組：
i. 根據本發明之各種態樣中之任一者的待治療及/或待對抗HCMV感染或與其相關之疾病或病況之個體的細胞；
ii. 與根據本發明之各種態樣中之任一者的待治療及/或待對抗HCMV感染或與其相關之疾病或病況之個體HLA匹配的細胞；
iii. 周邊血液白血球或PBMC；及
iv. T細胞或B細胞。
該等所選細胞可視情況為：
(a) 具有T細胞受體(TcR)的T細胞，該T細胞受體對HCMV之US28蛋白之ECD1 (及視情況ECD3)具有特異性(較佳具有病毒株未定性特異性)；
(b) 具有表面結合抗體的B細胞，該表面結合抗體對HCMV之US28蛋白之ECD1 (及視情況ECD3)具有特異性(較佳具有病毒株未定性特異性)；及/或
(c) 分泌對HCMV之US28蛋白之ECD1 (及視情況ECD3)具有特異性(較佳具有病毒株未定性特異性)的抗體的B細胞。
本發明之第二十六態樣提供一種細胞，其暴露於及/或包含選自本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物、根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合、根據本發明之第二十三態樣的核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第二十四態樣的載體。
舉例而言，細胞(或細胞群)可為抗原呈遞細胞(APC)。視情況，APC係選自由以下組成之群組：樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)及B細胞。
視情況，細胞(或細胞群)可經或已經以下脈衝：選自本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣之至少兩種(例如三種)不同融合蛋白的組合、根據本發明之第十八態樣之結合物及/或根據本發明之第十九態樣之至少兩種(例如三種)不同結合物的組合。另外或替代地，細胞(或細胞群)可表現或已表現根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，及/或根據本發明之第二十四態樣之載體，且由此包含由該一或多個核酸編碼之肽或多肽序列。
視情況，細胞，諸如APC (例如DC)，可來自根據本發明之各種態樣中之任一者的待治療及/或待對抗HCMV感染或與其相關之疾病或病況之個體。
視情況，DC可為單核球衍生DC (MoDC)，且例如衍生DC之單核球可為來自根據本發明之各種態樣中之任一者的待治療及/或待對抗HCMV感染或與其相關之疾病或病況之個體的單核球。
視情況，DC來自與根據本發明之各種態樣中之任一者的待治療及/或待對抗HCMV感染或與其相關之疾病或病況之個體HLA匹配的供體。
視情況，DC為MoDC，且衍生DC之單核球為來自與根據本發明之各種態樣中之任一者的待治療及/或待對抗HCMV感染或與其相關之疾病或病況之個體HLA匹配的供體的單核球。
本發明之第二十七態樣提供一種分離及/或富集包含T細胞受體(TCR)之細胞的方法，該T細胞受體對US28之ECD1 (及視情況ECD3)中之抗原決定基具有特異性(例如天然存在之T細胞，或表現根據本發明之第一態樣之CAR之重組細胞，例如CAR T細胞、CAR NK細胞及/或CAR巨噬細胞)，其中該方法包含使用一或多種藥劑分離及/或富集對SEQ ID NO: 6、7及/或177之序列中之一者或全部具有結合特異性之細胞的步驟，
其中一或多種藥劑係或選自由以下組成之群組：根據本發明之第十三及/或第十四態樣中任一者或兩者之肽或多肽、根據本發明之第十五態樣之至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽的組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白及/或根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物及/或根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合。
在本發明之第二十七態樣之方法之一個實施例中，序列可以調配為MHC四聚體。
MHC四聚體已成為用於表徵T細胞免疫反應之特異性及表型且因此亦用於細胞重組表現T細胞受體(TCR)的重要工具，適用於多種疾病及疫苗研究。肽-MHC多聚體通常在MHC結合溝中顯示抗原肽，充當作為T細胞受體與抗原呈遞細胞相互作用之一部分出現之識別事件的替代物。現今，最普遍使用之多聚體形式由顯示於卵白素分子上之生物素標記pMHC組成，形成四價複合體；因此此偵測方法通常使用術語「四聚體」。自從第一描述以來，MHC四聚體已廣泛用於定量抗原特異性T細胞反應。當與預測肽同MHC分子結合的方法一起使用時，四聚體分析可極其適用於鑑別T細胞受體抗原決定基。特定言之，應用I類四聚體來研究自身抗原亦在腫瘤抗原之研究中廣泛發展。
在某些實施例中，根據本發明之第二十七態樣，該MHC四聚體可例如為用於抗原特異性CD8
+T細胞偵測之I類MHC四聚體、用於抗原特異性CD4
+T細胞偵測之II類MHC四聚體或用於流動式細胞測量術或螢光顯微術之螢光團標記四聚體。
視情況，T細胞可選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
本發明之第二十八態樣提供一種MHC四聚體，其包含根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合，視情況其中該或各肽包含或對應於SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7或任一者或每一者之免疫原性片段，例如其中該MHC四聚體為用於抗原特異性CD8
+T細胞偵測之I類MHC四聚體、用於抗原特異性CD4
+T細胞偵測之II類MHC四聚體、用於流動式細胞測量術或螢光顯微術之螢光團標記四聚體。MHC四聚體可進一步用於分離及/或富集包含對US28之ECD1及/或ECD3中之抗原決定基具有特異性的T細胞受體(TCR)之細胞，例如選自由以下組成之群組的T細胞：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型及/或表現根據本發明之第一態樣的CAR之重組細胞，例如CAR T細胞、CAR NK細胞及/或CAR巨噬細胞。
J. 調配物 可調配根據本發明之各種態樣之產物以供進一步使用。舉例而言，其可調配為醫藥學上或獸醫學上可接受之調配物。
醫藥學上或獸醫學上可接受之調配物可以此項技術中已知之充分儲存穩定且適用於向人類及動物投與之方式製備。在一個選項中，其可以溶液，諸如無菌溶液形式呈現。在另一選項中，尤其就非細胞產物之調配物而言，醫藥學上或獸醫學上可接受之調配物可例如經由冷凍乾燥、噴霧乾燥、噴灑冷卻或經由使用由超臨界顆粒形成的顆粒成型來凍乾。
此類非細胞產物可包括但不限於以下中之一或多者：本發明之第一或第七態樣之結合分子；根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合；根據本發明之第三態樣之載體或多個不同載體之組合；根據本發明之第八態樣之結合物；根據本發明第十態樣之經分離之結合物；根據本發明之第十二態樣提供之藥劑的各種非細胞選項的非細胞藥劑；選自本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽；根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白及/或至少兩種(例如三種)根據本發明之第十七態樣之不同融合蛋白的組合、根據本發明之第十八態樣之結合物、根據本發明之第十九態樣之至少兩種(例如三種)不同結合物的組合、根據本發明之第二十三態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第二十四態樣之載體；根據本發明之第二十八態樣之MHC四聚體；根據本發明之第二十九態樣提供之各種非細胞選項的非細胞疫苗組合物。
藉由「醫藥學上可接受」，吾等意謂不降低一或多種根據本發明之各種態樣之調配產物之有效性的無毒材料，包括一或多種醫藥學上可接受之緩衝液、載劑及/或賦形劑。此類醫藥學上可接受之緩衝液、載劑或賦形劑為此項技術中熟知的(參見《雷明頓氏醫藥科學》, 第18版, A.R Gennaro編, 馬克出版公司(Mack Publishing Company)(1990)及《藥物賦形劑(Pharmaceutical Excipients)》手冊, 第3版, A. Kibbe編, 英國醫藥出版社(Pharmaceutical Press)(2000))。
術語「緩衝液」欲意謂含有酸鹼混合物之水溶液，其目的為穩定pH。緩衝液的實例為Trizma、二甘胺酸、麥黃酮、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、羥乙酸鹽、乳酸鹽、硼酸鹽、ACES、ADA、酒石酸鹽、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲胂酸鹽、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘胺酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO及TES。
術語「稀釋劑」欲意謂水性或非水性溶液，其目的為稀釋醫藥製劑中之多肽。稀釋劑可例如為生理食鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(諸如紅花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中之一或多者。
視情況，醫藥學上或獸醫學上可接受之調配物可包含佐劑。術語「佐劑」欲意謂添加至調配物中以增加調配物內之一或多種本發明之產物的生物學作用的任何化合物。佐劑可為具有不同陰離子之鋅、銅或銀鹽中之一或多者，該等陰離子為例如但不限於氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、氰酸根、亞硫酸根、氫氧根、磷酸根、碳酸根、乳酸根、乙醇酸根、檸檬酸根、硼酸根、酒石酸根及不同醯基組合物之乙酸根。佐劑亦可為陽離子聚合物，諸如陽離子纖維素醚；陽離子纖維素酯；去乙醯化玻尿酸；聚葡萄胺糖；陽離子樹枝狀聚合物；陽離子合成聚合物，諸如聚(乙烯基咪唑)；及陽離子多肽，諸如聚組胺酸、聚離胺酸、聚精胺酸及含有此等胺基酸之肽。
賦形劑可為碳水化合物、聚合物、脂質及礦物質中之一或多者。碳水化合物之實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇及環糊精，其添加至組合物中例如用於促進凍乾。聚合物之實例為澱粉、纖維素醚、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、海藻酸鹽、卡拉膠、玻尿酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸鹽、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同水解程度之聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯及聚乙烯吡咯啶酮，其皆為不同分子量，均添加至調配物中，例如用於黏度控制，用於達成生物黏附或用於保護脂質免受化學及蛋白質降解。脂質之實例為脂肪酸、磷脂、單酸甘油酯、雙酸甘油酯以及三酸甘油酯、神經醯胺、鞘脂及糖脂，其皆具有不同醯基鏈長及飽和度；蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化蛋及大豆卵磷脂，出於與彼等聚合物類似之原因添加至該組合物中。礦物質之實例為滑石、氧化鎂、氧化鋅及氧化鈦，其添加至組合物中以獲得諸如減少液體積聚或有利色素特性之益處。
在本發明之醫療用途之一實施例中，調配物亦可包含至少一種其他治療劑(例如抗癌劑及/或抗血管生成化合物，其實例在本申請案之部分H中論述)。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合物可呈脂質體形式，其中根據本發明之各種態樣之一或多種產物(下文中稱為「活性劑」)可與除其他醫藥學上可接受之載劑之外的以聚集形式存在，呈微胞、不可溶單層及液晶形式之兩親媒性藥劑(諸如脂質)組合調配。脂質體調配物之合適脂質包括但不限於單酸甘油酯、二酸甘油酯、髓硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂素、膽酸及其類似物。適合之脂質亦包括極性頭基中藉由聚(乙二醇)修飾以用於延長血流循環時間的上述脂質。此類脂質體調配物之製備可見於例如US 4,235,871中。
本發明之醫藥組合物亦可呈可生物降解微球體形式。脂族聚酯，諸如聚(乳酸) (PLA)、聚(乙醇酸) (PGA)、PLA及PGA之共聚物(PLGA)或聚(己內酯)(PCL)及聚酸酐已廣泛用作微球體生產中之可生物降解聚合物。該等微球體之製備可見於US 5,851,451及EP 0 213 303中。
在另一實施例中，本發明之醫藥組合物以聚合物凝膠形式提供，其中聚合物，諸如澱粉、纖維素醚、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、海藻酸鹽、卡拉膠、玻尿酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯咪唑、聚磺酸鹽、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同水解程度之聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯及聚乙烯吡咯啶酮用於增稠含有該藥劑之溶液。聚合物亦可包含明膠或膠原蛋白。
替代地，活性劑可簡單地溶解於生理食鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(諸如紅花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黃蓍膠及/或各種緩衝液中。
應瞭解，本發明之醫藥組合物可包括用於強化活性多肽之作用的離子及界定pH。另外，組合物可經受習知醫藥操作，諸如滅菌及/或可含有習知佐劑，諸如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、緩衝液、填充劑等。
適於非經腸投與之調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性及非水性無菌注射溶液；及可包括懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。
在一替代性較佳實施例中，醫藥組合物適用於向患者局部投與。
較佳地，調配物為單位劑量之活性成分，其含有每日劑量或單位劑量、每日次劑量或其適當部分。
應瞭解，在以下所描述之投與途徑中，熟習此項技術者應知曉哪些活性劑適用於任何給定投與途徑。
活性劑可以醫藥學上可接受之劑型，以包含視情況呈無毒有機或無機酸或鹼加成鹽形式之活性成分的醫藥調配物形式經口或藉由任何非經腸途徑投與。視待治療之病症及患者以及投與途徑而定，組合物可以不同劑量投與。
在人類療法中，活性劑將一般與就預期投與途徑及標準醫藥實踐選擇之適合的醫藥賦形劑、稀釋劑或載劑混合投與。
舉例而言，活性劑可以錠劑、膠囊、卵形栓劑、酏劑、溶液或懸浮液形式經口、頰內或舌下投與，其可含有調味劑或著色劑，用於立即、延遲或控制釋放施加。活性劑亦可經由肝內注射投與。
適合的錠劑可含有賦形劑，諸如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鈣及甘胺酸；崩解劑，諸如澱粉(較佳玉米、馬鈴薯或木薯澱粉)、羥基乙酸澱粉鈉、交聯羧甲纖維素鈉及某些複合矽酸鹽；及粒化黏合劑，諸如聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠及阿拉伯膠。另外，可包括潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯及滑石。
類似類型之固體組合物亦可作為明膠膠囊中之填料使用。在此方面較佳賦形劑包括乳糖、澱粉、纖維素、奶糖或高分子量聚乙二醇。對於水性懸浮液及/或酏劑而言，本發明之化合物可與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料、與乳化劑及/或懸浮劑及與稀釋劑(諸如水、乙醇、丙二醇及甘油及其組合)組合。
活性劑亦可非經腸，例如經靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、腦室內、胸骨內、顱內、肌內或皮下投與，或其可藉由輸注技術投與。其最佳以無菌水溶液形式使用，該無菌水溶液可含有其他物質，例如含有足夠鹽或葡萄糖以使溶液與血液具有等張性。必要時，應適當地緩衝水溶液(較佳達pH 3至9)。在無菌條件下製備適合的非經腸調配物易於藉由熟習此項技術者所熟知的標準醫藥技術來實現。
調配物可呈單位劑量或多劑量容器，例如密封安瓿及小瓶呈現，且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)之條件下，僅需要在即將使用之前添加用於注射之無菌液體載劑，例如水。即用型注射溶液及懸浮液可由前述種類之無菌粉末、顆粒及錠劑製備。
對於向人類患者經口及非經腸投與，活性劑之日劑量通常將為以單次或分次劑量投與，每個成人1至1,000 mg (亦即約0.015至15 mg/kg)。
因此，舉例而言，具有活性劑之錠劑或膠囊可含有1 mg至1,000 mg活性劑，以按需要每次投與一份或兩份或更多份。在任何情況下，醫師會確定將最適於任何個別患者之實際劑量，且其將隨特定患者之年齡、體重及反應而變化。上述劑量為一般情況之示例。當然，可存在值得較高或較低劑量範圍之個別情況，且此類情況係在本發明之範疇內。
活性劑亦可經鼻內或藉由吸入投與，且宜以乾粉吸入器或氣溶膠噴霧呈遞形式使用適合的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷烴，諸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他適合的氣體，自加壓容器、泵、噴霧或噴霧器遞送。在加壓氣溶膠之情況下，劑量單位可藉由提供遞送計量之量的閥來確定。經加壓之容器、泵、噴霧或噴霧器可含有活性化合物之溶液或懸浮液，例如使用乙醇與推進劑之混合物作為溶劑，該溶劑可額外含有潤滑劑，例如脫水山梨糖醇三油酸酯。可調配含有活性劑與諸如乳糖或澱粉之適合粉末基質之粉末混合物的膠囊及藥筒(例如由明膠製成)用於吸入器或吹入器中。此類調配物可尤其適用於治療肺實體腫瘤，諸如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸膜肺母細胞瘤或類癌瘤。
較佳配置氣溶膠或乾粉調配物，使得各定量劑量或「一噴」含有有效量(例如至少1 mg)之活性劑以遞送至個體。應瞭解，氣溶膠之總體日劑量將因患者而不同，且可在一日中以單次劑量或更通常以分次劑量投與。
替代地，活性劑可以栓劑或子宮托形式投與，尤其用於治療或靶向結腸、直腸或前列腺腫瘤。
活性劑亦可藉由眼部途徑投與。對於經眼用途，活性劑可調配為例如含在等張、pH經調節之無菌生理鹽水中的微粉化懸浮液，或較佳調配為含在等張、pH經調節之無菌生理鹽水中的溶液，視情況與諸如苯紮氯銨之防腐劑組合。替代地，活性劑可調配在諸如石蠟脂之軟膏中。此類調配物可尤其適用於治療眼睛之實體腫瘤，諸如視網膜母細胞瘤、髓上皮瘤、葡萄膜黑素瘤、橫紋肌肉瘤、眼內淋巴瘤或眼眶淋巴瘤。
活性劑可以洗劑、溶液、乳膏、軟膏或粉劑形式局部施加，或可例如藉由使用皮膚貼片來經皮施加。對於局部施加於皮膚，活性劑可調配為含有懸浮或溶解於例如與以下中之一或多者之混合物中之活性化合物的適合軟膏：礦物油、液體石蠟脂、白石蠟脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟及水。替代地，其可調配成適合的洗劑或乳膏，其懸浮或溶解於例如以下中之一或多者的混合物中：礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨醇酯60、十六酯蠟、十六醇十八醇、2-辛基十二醇、苄醇及水。此類調配物可尤其適用於治療皮膚之實體腫瘤，諸如基底細胞癌、鱗狀細胞癌或黑素瘤。
對於皮膚癌，活性劑亦可藉由電併入(electroincorporation，EI)遞送。EI在皮膚表面上直徑至多30微米之小粒子經受與電穿孔中使用之彼等相同或類似的電氣脈衝時發生。在EI中，此等粒子經驅動穿過角質層且進入皮膚之更深層。顆粒可負載或塗佈有抑制劑，或可簡單地充當在皮膚中產生孔隙使藥劑、抗體或化合物可經由其進入的「子彈」。
適合於在口中局部投與之調配物包括在調味基劑(通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍膠)中包含活性成分的口含錠；在惰性基劑(諸如明膠及甘油、或蔗糖及阿拉伯膠)中包含活性成分之片劑；以及在適合液體載劑中包含活性成分的漱口劑。此類調配物可尤其適用於治療口腔及咽喉之實體腫瘤。
在一個實施例中，當活性劑包括多肽、基本上由其組成或由其組成時，則活性劑可使用可注射之持續釋放藥物遞送系統遞送。此等經特定設計以降低注射劑頻率。此類系統之實例為Nutropin Depot，其將重組人類生長激素(rhGH)囊封於可生物降解微球體中，在注射後，在一段持續時間內緩慢釋放rhGH。
活性劑可藉由以手術方式植入之裝置投與，該裝置直接將活性劑釋放至所需部位，例如釋放至眼睛中以治療眼部腫瘤。此類向疾病部位之直接施加實現有效療法而無顯著全身性副作用。
用於遞送活性劑(其包含諸如抗體及CAR之多肽、基本上由其組成或由其組成)之替代方法為熱敏性ReGel可注射系統。ReGel為低於體溫的可注射液體，而在體溫下其立即形成凝膠儲集器，緩慢腐蝕且溶解於已知的安全可生物降解之聚合物中。隨著生物聚合物溶解，隨時間推移遞送活性藥物。
多肽活性劑亦可經口遞送。該方法採用口服維生素B
12入體內以共遞送蛋白質及肽的自然過程。藉由利用維生素B
12吸收系統，蛋白質或肽活性劑可移動穿過腸壁。複合物由維生素B
12類似物與藥物合成，其保持複合物之維生素B
12部分的內因子(IF)之顯著親和力及複合物之藥物部分之顯著生物活性。
核酸活性劑可作為如本文所述之適合基因構築體投與並遞送至個體用於表現。通常，基因構築體中之核酸可操作地連接於啟動子，該啟動子可在細胞中表現化合物。本發明之基因構築體可使用此項技術中熟知之方法製備，例如Sambrook等人(2012)《分子選殖：實驗室手冊》, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY。
較佳地，基因構築體適用於遞送至人類細胞。將基因構築體引入細胞中之手段及方法為此項技術中已知，且包括使用免疫脂質體、脂質體、病毒載體(包括牛痘、經修飾牛痘、慢病毒、小病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒(AAV)載體)，及藉由DNA之直接遞送，例如使用基因槍及電穿孔。此外，將聚核苷酸遞送至患者之目標組織進行治療的方法亦為此項技術中熟知的。在替代方法中，採用使用受體介導之內吞作用將DNA大分子攜載至細胞中之高效率核酸遞送系統。此係藉由使鐵轉運蛋白(運鐵蛋白)與結合核酸之聚陽離子結合來實現。亦可使用本發明DNA構築體或其他基因構築體之高效受體介導之遞送，使用藉由Cotten等人(1992)《美國國家科學院院刊》 89, 6094-6098之方法產生之缺陷性或化學不活化之腺病毒粒子的胞內體破壞活性。應瞭解，「裸DNA」及與陽離子及中性脂質複合之DNA亦可適用於將本發明之DNA引入待處理之個體的細胞中。基因療法之非病毒方法描述於Ledley (1995，《人類基因療法(
Human Gene Therapy)》 6, 1129-1144)中。
儘管對於特定組織之癌症/腫瘤，在編碼本發明之核酸分子之載體中使用組織特異性啟動子可能有用，但此並非必需的，因為相較於對於罹患癌症/腫瘤之患者的治療益處，期望在體內除癌症/腫瘤以外之位置表現核酸序列之風險為可耐受的。
在一實施例中，本發明之醫藥組合物或調配物用於非經腸投與，更特定言之用於靜脈內投與。在一較佳實施例中，醫藥組合物適用於例如藉由注射向患者靜脈內投與。在其他實施例中，可使用盲腸內投與例如以靶向大腦及/或神經系統。
K. 疫苗 本發明之第二十九態樣提供適用於針對HCMV感染及/或與人類巨細胞病毒(HCMV)相關之疾病或病況進行接種疫苗、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況或對抗該疾病或病況的疫苗組合物。該HCMV感染及/或與人類巨細胞病毒(HCMV)相關之疾病或病況可如本申請案之部分G中所定義。
疫苗可包含主動疫苗及/或被動疫苗之組分。主動疫苗組分經設計以引起自動免疫；而被動疫苗組分經設計以提供被動免疫。
當投與個體時，根據本發明之第二十九態樣之主動疫苗可誘導個體之免疫系統產生針對存在於HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內之抗原決定基的免疫反應，較佳為病毒株未定性免疫反應。
根據本發明之第二十九態樣之被動疫苗可為如下組合物，其在投與個體時提供針對存在於HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內之抗原決定基的免疫系統能力，較佳為病毒株未定性免疫系統能力。
在一些實施例中，本發明之第二十九態樣之疫苗組合物針對以下觸發及/或提供免疫反應：
(a) 完全存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內之一或多個抗原決定基(例如，存在於SEQ ID No: 177之免疫原性片段中之一或多者中的抗原決定基，如根據本發明之第十三態樣所描述)；
(b) US28蛋白之ECD1內的一或多個線性抗原決定基；
(c) 完全存在於HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的一或多個抗原決定基(例如，存在於SEQ ID No: 6或7之免疫原性片段中之一或多者中的抗原決定基，如根據本發明之第十四態樣所描述)；
(d) US28蛋白之ECD3內的一或多個線性抗原決定基；
(e) HCMV之US28蛋白之ECD3內之一或多個抗原決定基，其為以相同形式存在於HCMV之該等4D變異株及該等4N變異株兩者中之一個抗原決定基或多個抗原決定基，其中HCMV之該4D變異株編碼包含具有TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)之序列之ECD3的US28蛋白，且其中HCMV之該4N變異株編碼包含具有TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:6)之序列之ECD3的US28蛋白；及/或
(f)其中由該疫苗觸發或提供之該免疫反應對HCMV之該等4D變異株及該等4N變異株係HCMV病毒株未定性，且觸發及/或提供針對選自Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、JP、Ad169、VHL/E、AF1、BL及DAVIS的該等4D變異HCMV病毒株中之一或多者且亦針對選自Toledo、TR及DB的該等4N變異HCMV病毒株中之一或多者的免疫反應。
該疫苗組合物可為被動疫苗，及/或視情況包含：(a)根據本發明之第一態樣之一或多個結合分子，(b)如由本發明之第一態樣所定義之該一或多個結合分子之功能片段，(c)根據本發明之第七態樣之一或多個經分離之結合分子，(d)根據本發明之第二態樣之一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合；(e)根據本發明之第三態樣之一或多種載體；(f)根據本發明之第四態樣之一或多種細胞；(g)根據本發明之第八態樣之一或多種結合物；及/或(h)根據本發明之第十態樣之一或多種經分離之結合物。
替代地，該疫苗組合物可為主動疫苗，及/或視情況包含：
(a)根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣的融合蛋白、根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物及/或根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合；
(b)根據本發明之第二十三態樣的一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第二十四態樣的載體；及/或
(c)細胞，諸如抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)，或該等細胞之均質或異質群體，其中該等細胞或該等細胞中之每一者負載有以下中之一或多者：根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白、根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物、根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合、根據本發明之第二十三態樣的一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據本發明之第二十四態樣的載體。
本發明之第三十態樣提供一種針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法，該方法包含向個體投與根據本發明之第二十九態樣之疫苗。
本發明之第三十態樣提供根據本發明之第二十九態樣之疫苗，其用於針對個體之與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況。
本發明之第三十態樣提供根據本發明之第二十九態樣之疫苗的用途，其用於製造供針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況用之藥物。
與HCMV相關之該疾病或病況可例如為如上文在本發明第十一態樣之情形下所揭示的與HCMV相關之疾病或病況。視情況，疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
在一些實施例中，針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法可包含僅向個體投與疫苗一次。
在其他實施例中，針對與HCMV有關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法可包含向個體投與疫苗兩次或多次。舉例而言，在其中疫苗為主動疫苗之實施例中，可適於向個體分開投與初始劑量及後續加強劑量。
L. 診斷及其他偵測及評定模式 如本申請案之發明內容部分中所論述，本發明之第三十一態樣提供一種評定個體及/或離體生物材料之一或多種生物病況及/或生物特徵的方法。
該方法利用根據本發明之結合分子或其結合物之結合特徵，以高度特異性結合至US28蛋白之ECD1及/或ECD3，且較佳以高度特異性結合但不區辨HCMV之不同病毒株。
該方法包含：(a)使個體及/或離體生物材料與如本發明之第一態樣所定義之結合分子或如本發明之第八或第十態樣所定義之結合物接觸；及(b)基於結合分子或結合物與個體及/或離體生物材料之結合的直接及/或間接量測來評定個體及/或離體生物材料。
任何適合之方法均可用於評定。舉例而言且在無限制下，方法可包含ELISA法，且視情況，該方法係對離體生物材料，諸如一或多種體液(例如，血液、唾液、尿液)進行。
在一替代實例中，該方法包含流動式細胞測量術方法，且視情況該方法係用於評定來自個體之離體血液樣本及/或離體骨髓樣本的方法。
在另一替代實施例中，方法包含使用如由本發明之第八或第十態樣定義之結合物，其中結合物包含可偵測部分，諸如放射性部分，且方法包含偵測個體及/或離體生物材料中之可偵測部分，例如其中方法為免疫正電子發射(PET)之方法。
在另一替代實施例中，該方法係免疫組織化學(IHC)方法，例如對離體生物材料樣本進行之IHC。該樣本可例如為來自獲自個體或其他相關生物學來源之生物材料的組織學樣本。熟習此項技術者十分瞭解用於自生物材料製備組織學樣本之此項技術中熟知的許多技術。在本發明之情形下，可使用用於製備組織學樣本之任何適合方式。
在一個實施例中，出於產生適合於對個體中之HCMV感染及/或與HCMV相關之疾病或病況進行診斷或預後評定之資料(諸如影像或其他可量測資料)的目的，對個體或對獲自個體之離體生物材料執行本發明之第三十一態樣之方法。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的該HCMV感染及/或與HCMV相關之疾病或病況可例如由本申請案之部分G中所定義。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的個體可例如為由本申請案之部分G中所述的任何個體。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為HCMV感染或與HCMV感染相關。
在一個實施例中，HCMV感染可為單株感染。
視情況，在一替代實施例中，HCMV感染包含多株HCMV感染，其中多株HCMV感染包含用一個以上不同HCMV病毒株，例如編碼不同US28蛋白編碼序列之兩個或更多個HCMV病毒株感染。該兩個或更多個病毒株可編碼US28蛋白，該等蛋白質在胞外區，諸如N端(ECD1)區、第一胞外環(ECD2)區、第二胞外環(ECD3)區及/或第三胞外環(ECD4)區中之一或多者上不同。在一個相關實施例中，多株HCMV感染中之兩個或更多個HCMV病毒株各自編碼至少在N端(ECD1)區之一或多個位置上彼此不同的US28蛋白；例如其在N端(ECD1)區中之1、2、3、4、5、6、8、9、10或更多個胺基酸位置處可不同。N端(ECD1)區之一或多個位置之差異可在位置26-37外；例如不同之一或多個位置可在位置1-25 (諸如位置8、15、16、18、19、24、25中之任一者或多者，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異中之任一者或多者)內，例如在位置1-10、16、18及/或19中之任一者或多者內，其中位置係關於SEQ ID NO: 5中位置之編號。另外或替代地，在另一相關實施例中，多株HCMV感染中之兩個或更多個HCMV病毒株各自編碼在第二胞外(ECD3)區之一或多個位置處彼此不同的US28蛋白，例如，多株HCMV感染中之HCMV病毒株中之一或多者可編碼如下US28蛋白，該蛋白質編碼ECD3之4N變體，且多株HCMV感染中之其他HCMV病毒株中之一或多者可編碼如下US28蛋白，該蛋白質編碼ECD3之4D變體。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為潛伏HCMV感染(例如單株或多株潛伏HCMV感染)或與潛伏HCMV感染(視情況多株潛伏HCMV感染)相關。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)或與裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)相關。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為先天性HCMV感染(例如，單株或多株感染)，諸如潛伏先天性單株或多株HCMV感染或裂解先天性單株或多株HCMV感染。因此，具有此類評定之個體可為疾病或病況尚待評定之個體，諸如嬰兒(諸如新生兒)、胎兒或胚胎，或母親(或個體之預期母親)，諸如個體之哺乳母親、懷有個體之女性或在懷有個體之前待評定之女性。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為癌症，例如感染HCMV之癌症(視情況單株或多株HCMV感染癌症)，諸如潛伏HCMV感染癌症(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為上皮癌；視情況其中該上皮癌為乳癌；例如其中該乳癌為三陰性乳癌(TNBC)或HER2陽性乳癌(如本文所描述)。該等形式之上皮癌可視情況為單株或多株形式之HCMV感染上皮癌，例如潛伏HCMV感染形式之上皮癌(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為轉移性及/或侵襲性形式之癌症。該等形式之轉移及/或侵襲癌症可視情況為單株或多株形式之HCMV感染之轉移及/或侵襲癌症，例如潛伏HCMV感染形式之轉移及/或侵襲癌症(視情況單株或多株潛伏HCMV感染癌症)。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為神經膠母細胞瘤。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可發生在個體或自個體獲得之離體生物材料中，其已經診斷患有或具有或疑似患有HCMV感染癌細胞，諸如潛伏HCMV感染癌細胞。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可為或意欲為細胞物質，諸如細胞產物供給之接受者。該細胞產物可例如包含離體活細胞物質、基本上由其組成或由其組成，該離體活細胞物質係選自包括以下之群組：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。視情況，細胞產物可直接或間接來源於活的供體。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可在為或意欲為細胞物質之供體，諸如細胞產物之供體之個體中評定；或在來自該供體之離體生物材料中評定。該細胞產物可包含來自該供體之細胞、組織或器官中之任一者或多者、基本上由其組成或由其組成。
藉由本發明之第三十一態樣之方法可進行診斷或預後評定(或可由此產生相關資料)的與HCMV相關之疾病或病況可對生物材料進行，諸如離體或活體外細胞物質，諸如適合於及/或待用於向接受個體投與之生物材料。該離體細胞產物可例如包含離體活細胞物質、基本上由其組成或由其組成，該離體活細胞物質係選自包括以下之群組：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。視情況，細胞產物可直接或間接來源於活的供體。
本文亦提供一種套組，諸如診斷套組，其包含一或多種上文在此部分中所論述之組分，例如該一或多種組分在存在於該套組內時，呈適用於(或能夠轉化為適用於使用之形式，例如藉由復原或對所儲存形式進行其他簡單處理)進行根據本發明之第三十一態樣評定個體及/或離體生物材料之一或多種生物病況及/或生物特徵之方法的形式。
M. 離體材料之處理 如上所述，HCMV傳輸至個體之一些途徑可經由與來自感染個人或來自任何其他感染源之離體生物材料接觸。實例包括向該個體中植入或移植離體生物材料(諸如器官、組織、骨髓或幹細胞移植)或輸血。
因此，本發明之第三十二態樣提供一種對抗離體活生物材料中之HCMV感染(諸如潛伏HCMV感染及/或裂解HCMV感染及/或多株HCMV感染)之方法，該方法包含使離體活生物材料與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑接觸：
i. 根據本發明之第一態樣之結合分子，
ii. 如本發明之第一態樣所定義之該結合分子的功能片段，
iii. 根據本發明之第七態樣之經分離之結合分子，
iv. 根據本發明之第二態樣之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據本發明之第三態樣之載體，
vi. 根據本發明之第五態樣之細胞，
vii. 根據本發明之第八態樣之結合物，及
viii. 根據本發明之第十態樣之經分離之結合物。
本發明之第三十二態樣亦提供藉由此態樣之方法獲得或可藉由其獲得的活的離體生物材料。
在本發明之第三十二態樣之方法及/或由此獲得或可由此獲得之活的離體生物材料的一個實施例中，該離體活生物材料包含選自包括以下之群組的活的離體生物材料、基本上由其組成或由其組成：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體胞器；一或多種類型之離體胞器培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。示例性實施例包括器官移植、組織移植、骨髓移植、幹細胞移植及/或輸血。
本發明之第三十三態樣提供一種治療有需要之個體(亦即，需要該離體活生物材料移植或植入之個體)的方法，其包含向個體投與如本發明之第三十二態樣所定義之離體活生物材料。
舉例而言，該方法可為移植離體活生物材料，諸如器官移植或組織移植之方法。該方法可用於預防移植接受者之HCMV傳播及感染，或與HCMV感染相關之疾病或病況，或降低其風險。
根據本發明之第三十三態樣的待處理之個體可例如為如本申請案之G部分中所述的任何個體。
根據本發明之第三十三態樣之與HCMV相關的疾病或病況可例如為如在本申請案之部分G中所描述之HCMV感染或與HCMV感染相關之疾病或病況的任何形式。
N. 篩選結合分子之方法 如本申請案之實例中所述，本申請人已研發一種藉由聚焦於產生與HCMV US28之ECD1及/或ECD3區內之抗原決定基結合的結合分子來鑑別針對HCMV US28蛋白之高度特異性、病毒株未定性結合分子的新穎方法。如本申請案之實例中所報導，由此方法產生之大量ECD1單株抗體展示良好且特異性結合於過度表現US28之US28-CHO-A1細胞及感染HCMV之人類肺組織上的表示ECD1內之保守抗原決定基之肽。此外，由此方法產生之大量ECD3單株抗體展示良好且特異性結合於US28 ECD1及/或ECD3肽之兩種基因變體上，由此證實特異性及病毒株未定性結合特性，且進一步證實在以下上的特異性結合：過度表現US28之US28-CHO-A1細胞、經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞、來自HCMV血清反應呈陽性之個體之初級PBMC、感染HCMV之人類肺組織及若干類型之侵襲性人類腫瘤，諸如食道癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、子宮頸癌、惡性嗜鉻細胞瘤及局部晚期結腸癌、乳癌及其癌轉移及4級神經膠母細胞瘤。
對於ECD3，本申請人之方法使用US28之ECD3中之胺基酸變化之經鑑別單一位點，利用經選擇以產生免疫反應的肽之組合，且產生並分離對US28之ECD3具有病毒株未定性結合特異性的抗體。此方法可用於產生及鑑別其他具有本發明之有利結合特性的此類結合分子。
因此，本發明之第三十四態樣提供一種篩選對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內之抗原決定基具有結合特異性及/或結合親和力之結合分子的方法，該方法包含：
(a) 提供一或多種肽，其對應於US28蛋白之ECD1及/或ECD3中存在的胺基酸序列，
(b) 提供一或多種候選結合分子；
(c) 測定一或多種候選結合分子對該一或多種肽之結合特異性及/或結合親和力。
視情況，步驟(a)中所提供之一或多種肽或每一種係以以下形式提供：根據本發明之第十三及/或第十四態樣中之任一者或兩者的一或多種肽或多肽、根據本發明之第十五態樣的至少兩種(例如三種)不同肽及/或多肽之組合、根據本發明之第十六態樣之融合蛋白、根據本發明之第十七態樣的至少兩種(例如三種)不同融合蛋白之組合、根據本發明之第十八態樣的結合物、根據本發明之第十九態樣的至少兩種(例如三種)不同結合物之組合。
視情況，該一或多種肽或其各自包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：多肽序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)、TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)及/或TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)及/或任一者或每一者之免疫原性片段。
視情況，一或多種候選結合分子可為抗體及/或CAR，諸如以下中之任一者或多者：
(a) 二價抗體，諸如IgG-scFv抗體(例如，其中第一結合域係完整IgG，且第二結合域係scFv，該scFv在IgG之輕鏈之N端及/或在輕鏈之C端及/或在重鏈之N端及/或在重鏈之C端處附接至該第一結合域，或反之亦然)；
(b) 單價抗體，諸如
DuoBody
® 或『臼包杵』雙特異性抗體(例如scFv-KIH、scFv-KIH
r、BiTE-KIH或BiTE-KIH
r)；
(c) scFv
2-Fc抗體；
(d) 雙特異性抗體，諸如雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體；
(e) 雙重可變域(DVD)-Ig抗體；
(f) 基於雙親和力再靶向(DART)之抗體(例如，DART
2-Fc或DART)；
(g) 三特異性抗體，諸如DNL-Fab
3抗體；
(h) scFv-HSA-scFv抗體；及
(i) 嵌合抗原受體(CAR)。
本發明之第三十四態樣之方法可包含基於對一或多種肽之結合特異性及/或結合親和力選擇候選結合分子的步驟。舉例而言，所選候選結合分子：
(a) 可對完全存在於HCMV之該US28蛋白之ECD1內之抗原決定基具有結合特異性；
(b) 可對該US28蛋白之ECD1內的線性抗原決定基具有結合特異性；
(c) 可對HCMV之US28蛋白之ECD1內的抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性，例如對HCMV之US28蛋白之ECD1內的抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性對選自由以下組成之群組的HCMV病毒株中之兩者或更多者(諸如全部)係未定性：DB、Towne、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、VHL/E、TR及VR1814 (FIX)；
(d) 可對完全存在於HCMV之US28蛋白的胞外域3 (ECD3)內的抗原決定基具有結合特異性；
(e) 可對US28蛋白之ECD3內的線性抗原決定基具有結合特異性；
(f) 可對HCMV之US28蛋白之ECD3內的抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性，例如對HCMV之US28蛋白之ECD3內的抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性對選自由以下組成之群組的HCMV病毒株中之兩者或更多者(諸如全部)係未定性：DB、Towne、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR、VHL/E及VR1814(FIX)；及/或
(g) 可對HCMV之該US28蛋白之ECD3內的抗原決定基具有特異性，無論該US28蛋白之該ECD3是否包含序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)或TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)。
所選候選結合分子與一或多種肽之結合特異性及/或結合親和力可效於如藉由包含由SEQ ID NO: 187、211、233、12、104、122、68或88之序列組成之可變重鏈(V
H)多肽及由SEQ ID NO: 189、213、235、18、108、126、72或92之序列組成之可變輕鏈(V
L)多肽的抗體所展現的與相同一或多種肽之結合特異性及/或結合親和力。該抗體可例如為如本文進一步描述之4H3C3、7B1F3、2F5B11、1D3、1C10、1A10、1G9或1E8抗體。
該所選候選結合分子中之一或多者之功能變體可藉由此項技術中熟知之各種方法中之任一者產生。舉例而言，所選候選結合分子(例如包含1、2、3、4、5或6個CDR之所選候選結合分子)之結合特性可藉由成熟方法開發。舉例而言，結合親和力可藉由成熟步驟修飾(增加或減少)；及/或結合特異性可藉由成熟步驟修飾(一般而言，增加)。應理解，對US28之較高或增加之結合親和力程度可能並非始終合乎需要，尤其是在以對諸如健康人類細胞之脫靶不可接受之高程度的結合親和力為代價時不合乎需要。結合分子，包括但不限於CAR及表現CAR之細胞，例如可受益於較低結合親和力程度，但一般將始終受益於最佳結合特異性程度。成熟方法之實例論述於上本申請案之部分A中。
本發明之第三十五態樣提供一種產生包含結合分子之多個複本之組合物的方法，該方法包含使已根據本發明之第三十四態樣之方法選擇之所選候選結合分子複製。
該方法可例如包含提供核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中核酸分子包含或多個不同核酸分子之組合共同包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合形式編碼所選候選結合分子。該方法可進一步包含例如在經該核酸分子或多個不同核酸分子之組合轉型之重組細胞或細胞群中表現該核酸分子或多個不同核酸分子之組合。此類表現可用於產生所選候選分子之其他複本。
視情況，該所選候選分子隨後經分離及/或純化及/或調配，例如呈醫藥學上可接受之組合物形式。
視情況，該所選候選分子例如根據本申請案之A部分中所論述之結合物之論述結合。
本發明之第三十六態樣提供一種評定所選候選結合分子的方法，該結合分子已根據本發明之第三十四態樣之方法經選擇及/或根據本發明之第三十五態樣之方法產生，該方法包含及鑑別所選候選結合分子內之結構，該結構提供該候選結合分子結合特徵(特定言之，與人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1 (及視情況ECD3)內之抗原決定基之結合特異性及/或結合親和力)。
舉例而言，鑑別所選候選結合分子內提供其結合特徵之結構的步驟可包括鑑別及/或定序作為抗體或CAR之所選候選結合分子中的可變輕鏈及/或可變重鏈區。
另外或替代地，鑑別所選候選結合分子內提供其結合特徵之結構的步驟可包括鑑別及/或定序作為抗體或CAR之所選候選結合分子中之各CDR區。
鑑別可變輕鏈及/或可變重鏈區及鑑別CDR序列之方法為此項技術中所熟知，且可由熟習此項技術者使用常規技術採用。
舉例而言，抗體之重鏈及輕鏈可變域序列(V
H及V
L)可由重鏈及輕鏈cDNA確定，其藉由此項技術中通常已知之技術由各別mRNA合成。CDR區接著可藉由此項技術中已知之技術確定。舉例而言，CDR區可使用Kabat方法確定(Wu及Kabat, J(1970)《實驗醫學雜誌(
J. Exp. Med.)》
132, 211)。CDR可藉由使用X射線結晶或分子建模技術之結構分析確定。複合CDR可定義為含有一個CDR中之所有殘基及對應高變區中之所有殘基。此等複合CDR以及來自構架區之某些選擇殘基較佳鑑別為可轉移「抗原結合位點」。鑑別CDR序列之其他熟知方法包括Chothia編碼制(例如，如Al-Lazikani等人,
JMB, 1997,
273: 927-948中所描述)或Martin (增強Chothia)編碼制。
本發明之結合分子及多肽之CDR係使用Kabat方法測定。因此，在一些實施例中，本發明之多肽或結合分子中之1、2、3、4、5或6個CDR已使用Kabat方法測定。此外，在CDR序列尚未表徵之情況下，熟習此項技術者的慣例為一旦提供有全長輕鏈及/或重可變鏈，使用慣例方法(諸如計算演算法或突變/結合分析)確定CDR中之一或多者。
本發明之第三十七態樣提供一種產生組合物之方法，該組合物包含具有與人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1 (及視情況ECD3)內之抗原決定基之結合特異性及/或結合親和力的結合分子之多個複本，其中該結合分子包含在所選候選結合分子內已鑑別為提供其結合特徵的結構(例如CDR序列)或每一個結構，根據本發明之第三十六態樣之方法，該方法包含引起該結合分子之複製。
本發明之第三十七態樣進一步提供藉由相同態樣獲得之結合分子之組合物，例如醫藥學上可接受之組合物。該等結合分子或其組合物可隨後在本發明之第一態樣之結合分子的情形下以本文中所論述之任何方式使用。
本文所揭示及主張之所有方法可在根據本揭示案不進行不當實驗的情況下進行且執行。雖然已就較佳實施例而言描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應顯而易知，在不脫離本發明之概念、精神及範疇之情況下可對該等方法施加變化及在本文所描述之方法之步驟或步驟順序中施加變化。更特定言之，咸了解，某些在化學上及生理上相關之藥劑可取代本文所描述之藥劑，同時將達成相同或類似結果。熟習此項技術者咸了解所有此類類似取代及修改均視為在由隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。
本申請案亦提供根據以下編號段落之態樣：
1. 一種結合分子，其包含一或多條多肽鏈，該結合分子對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之胞外域1 (ECD1)內由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且
視情況，其中該結合分子亦對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的第二抗原決定基具有結合特異性(及/或其中該結合分子為與對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的第二結合分子一起調配的第一結合分子)，
其中該US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3各自包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之該US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。
2. 段落1之結合分子，其中：
(a) 該結合分子係選自抗體及嵌合抗原受體(CAR)；及/或
(b) 該結合分子為多特異性(例如，雙特異性或三特異性)結合分子，其分別包含對由HCMV編碼之該US28蛋白之ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的一或多個區域且進一步包含對由HCMV編碼之該US28蛋白之ECD3內的第二抗原決定基具有結合特異性的一或多個區域。
3. 段落1或2之結合分子，其中該第一抗原決定基完全存在於HCMV之該US28蛋白之SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內(及/或視情況其中該第二抗原決定基完全存在於ECD3內)。
4. 任何前述段落之結合分子，其中該第一抗原決定基為HCMV之該US28蛋白之SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的線性抗原決定基(及/或視情況其中該第二抗原決定基為ECD3內之線性抗原決定基)。
5. 任何前述段落之結合分子，其對HCMV之US28蛋白之SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的該第一抗原決定基(及/或視情況對ECD3內之該第二抗原決定基)具有HCMV病毒株未定性結合特異性，
舉例而言，其中該結合分子：(a)對HCMV之US28蛋白內之該第一及/或第二抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性對兩種或更多種(諸如全部) HCMV病毒株係未定性，(b)具有對ECD3 4D變異株及ECD3 4N變異株未定性之結合特異性，及/或(c)具有對以下病毒株未定性之結合特異性：兩種或更多種(諸如全部)選自由DB、Towne、AF1、VHL/E、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR及VR1814 (FIX)組成之群組之HCMV病毒株。
6. 任何前述段落之結合分子，其中該結合分子對HCMV之該US28蛋白之該ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且亦對HCMV之該US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性，無論該US28蛋白之該ECD3是否包含4D變體或4N變體之序列：
- 其中該4D變體包含如在由諸如以下之第一組HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)：Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、JP、Ad169、AF1、VHL/E、BL及DAVIS；且
- 其中該4N變體包含如在由諸如以下之第二組HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)：Toledo、TR及DB病毒株。
7. 任何前述段落之結合分子，其包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者：
(a) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 196、197、198、199、200及201所定義，及/或抗體4H3C3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(b) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 219、220、221、199、222及223所定義，及/或抗體7B1F3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；及/或
(c) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 242、243、244、199、245及246所定義，及/或抗體2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
且視情況進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者：
(d) 1D3，分別如由SEQ ID No: 8、9、10、14、15及16所定義，及/或抗體1D3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(e) 1C10，分別如由SEQ ID No: 112、113、114、117、83及118所定義，及/或抗體1C10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(f) 1A10，分別如由SEQ ID No: 112、113、114、117、83及118所定義，及/或抗體1A10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(g) 1G9，分別如由SEQ ID No: 76、77、78、82、83及84所定義，及/或抗體1G9之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；及/或
(h) 1E8，分別如由SEQ ID No: 76、95、96、82、99及100所定義，及/或抗體1E8之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
且
視情況其中該結合分子係選自抗體及CAR。
8. 段落7之結合分子，其包含：
(a) 選自以下的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(i) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 196、197及198所定義；
(ii) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 219、220及221所定義；及/或
(iii) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 242、243及244所定義；
且視情況進一步包含選自以下的對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(iv) 1D3，分別如由SEQ ID No: 8、9及10所定義；
(v) 1C10，分別如由SEQ ID No: 112、113及114所定義；
(vi) 1A10，分別如由SEQ ID No: 112、113及114所定義；
(vii) 1G9，分別如由SEQ ID No: 76、77及78所定義；及/或
(viii) 1E8，分別如由SEQ ID No: 76、95及96所定義；
及/或
(b) 選自以下的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(i) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 199、200及201所定義；
(ii) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 199、222及223所定義；及/或
(iii) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 199、245及246所定義；
且視情況進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性的選自以下之抗體的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(iv) 1D3，分別如由SEQ ID No: 14、15及16所定義；
(v) 1C10，分別如由SEQ ID No: 117、83及118所定義；
(vi) 1A10，分別如由SEQ ID No: 117、83及118所定義；
(vii) 1G9，分別如由SEQ ID No: 82、83及84所定義；及/或
(viii) 1E8，分別如由SEQ ID No: 82、99及100所定義。
9. 段落7或8之結合分子，其包含：
(a) 至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含具有以下序列的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的CDR 1、2及3序列：
(i) 分別抗體4H3C3之SEQ ID No: 196、197及198，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成；
(ii) 分別抗體7B1F3之SEQ ID No: 219、220及221，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成；
(iii) 分別抗體2F5B11之SEQ ID No: 242、243及244，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(36) 至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含具有以下序列的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的CDR 1、2及3序列：
(iv) 分別抗體4H3C3之SEQ ID No: 199、200及201，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成；
(v) 分別抗體7B1F3之SEQ ID No: 199、222及223，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成；
(vi) 分別抗體2F5B11之SEQ ID No: 199、245及246，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成；且
視情況
其中該結合分子進一步包含至少一個可變重鏈(V
H)多肽，其包含具有以下序列的對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性之抗體的CDR 1、2及3序列：
(vii) 分別SEQ ID No: 8、9及10，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 12之序列、基本上由其組成或由其組成；
(viii) 分別SEQ ID No: 112、113及114，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 104之序列、基本上由其組成或由其組成；
(ix) 分別SEQ ID No: 112、113及114，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 122之序列、基本上由其組成或由其組成；
(x) 分別SEQ ID No: 76、77及78，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 68之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(xi) 分別SEQ ID No: 76、95及96，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 88之序列、基本上由其組成或由其組成；
及/或
其中該結合分子進一步包含至少一個可變輕鏈(V
L)多肽，其包含具有以下序列的對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性之抗體的CDR 1、2及3序列：
(xii) 分別SEQ ID No: 14、15及16，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 18之序列、基本上由其組成或由其組成；
(xiii) 分別SEQ ID No: 117、83及118，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 108之序列、基本上由其組成或由其組成；
(xiv) 分別SEQ ID No: 117、83及118，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成；
(xv) 分別SEQ ID No: 82、83及84，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 72之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(xvi) 分別SEQ ID No: 82、99及100，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 92之序列、基本上由其組成或由其組成。
10. 任何前述段落之結合分子，其中該結合分子係選自由以下組成之群組：
(a) 二價抗體，諸如IgG-scFv抗體(例如，其中第一結合域係完整IgG，且第二結合域係scFv，該scFv在該IgG之輕鏈之N端及/或在輕鏈之C端及/或在重鏈之N端及/或在重鏈之C端附接至該第一結合域，或反之亦然)，包括但不限於對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內之該第一抗原決定基具有結合特異性且對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內之該第二抗原決定基具有結合特異性的二價抗體，例如其中該第一及/或第二抗原決定基如藉由任何前述段落所定義；
(b) 單價抗體，諸如
DuoBody ®或『臼包杵』雙特異性抗體(例如，scFv-KIH、scFv-KIH
r、BiTE-KIH或BiTE-KIH
r；
(c) scFv
2-Fc抗體；
(d) 雙特異性抗體，諸如雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體；
(e) 雙重可變域(DVD)-Ig抗體；
(f) 基於雙親和力再靶向(DART)之抗體(例如，DART
2-Fc或DART)；
(g) 三特異性抗體，諸如DNL-Fab
3抗體或對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內之該第一抗原決定基具有結合特異性且對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內之該第二抗原決定基具有結合特異性且對第三抗原決定基，諸如免疫細胞呈現之抗原決定基具有結合特異性的三特異性抗體，例如其中該第一及/或第二抗原決定基如藉由任何前述段落所定義，視情況其中該三特異性抗體為三特異性免疫細胞接合子抗體，例如三特異性T細胞接合子(TiTE)，且視情況其中該TiTE抗體包含CD3結合域；
(h) scFv-HSA-scFv抗體；
(i) 單域抗體；
(j) 僅重鏈IgG (hcIgG)，諸如駱駝IgG (例如VHH抗體)及鯊魚免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)，及其單鏈抗體；及
(k) 嵌合抗原受體(CAR)，其包含根據段落1或依附於其之任何段落之胞外域，例如包含此段落之選項(a)至(h)中之任一者或其組合的胞外域。
11. 任何前述段落之結合分子，其中該結合分子為：
(i) 雙特異性免疫細胞接合子抗體，例如雙特異性T細胞接合子(BiTE)，且視情況其中該BiTE抗體包含CD3結合域；或
(ii) 單株抗體，視情況重組單株抗體，例如由CHO細胞重組產生之單株抗體。
12. 一種如前述段落中之任一者所定義之結合分子的功能片段，其中該功能片段：
(a) 包含如由前述段落中之任一者所定義之結合分子之抗原結合片段或其變體、融合體或衍生物或由其組成，該抗原結合片段或其變體、融合體或衍生物係選自由以下組成之群組：Fv片段(諸如單鏈Fv片段(scFv)或二硫鍵結合Fv片段)、Fab樣片段(諸如Fab片段、Fab'片段或F(ab)
2片段)及單域抗體(dAb，包括單一型式及雙重型式，諸如dAb-連接子-dAb及奈米抗體)；
(b) 提供如段落1-6中之任一者所定義之結合特徵；
(c) 包含如段落7-9中之任一者所定義之CDR序列；及/或
(d) 包含如段落9所定義之V
H及/或V
L序列。
13. 如段落1-11中任一者所定義之結合分子，或如段落12所定義之該結合分子之功能片段，其中該結合分子或其功能片段包含融合多肽序列，
該融合多肽序列包含融合至第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，其中
該第一胺基酸序列包含該結合分子或其功能片段之多肽鏈中的至少一者或由其組成，且
該第二胺基酸序列為融合搭配物。
14. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含：
(i) 胞外域，其中該胞外域包含以下或由以下組成：如段落1-11或13中任一者所定義之結合分子，或如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段；
(ii) 跨膜域；及
(iii) 胞內域；
其中該CAR之該胞外域對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白的ECD1內之由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性(且視情況亦對ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性)，且
其中該US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3各自包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之該US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。
15. 根據段落14之CAR，其中：
(a) 該CAR之該胞外域對完全存在於HCMV之該US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性(及/或對完全存在於ECD3內的第二抗原決定基具有結合特異性)；
(b) 該CAR之該胞外域對該US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一線性抗原決定基具有結合特異性(及/或對ECD3內之第二線性抗原決定基具有結合特異性)；
(c) 該CAR之該胞外域對HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基及/或ECD3內之第二抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性，例如，對HCMV之US28蛋白之ECD1及/或ECD3內的SEQ ID NO: 177內之抗原決定基的結合特異性，該結合特異性對選自由以下組成之群組的HCMV病毒株中之兩者或更多者(諸如全部)係未定性：DB、Towne、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR、VHL/E及VR1814 (FIX)；及/或
(d) 該CAR之該胞外域對HCMV之該US28蛋白之ECD3內的抗原決定基具有特異性，無論該US28蛋白之該ECD3是否包含以下序列：
- 如在由大部分HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)，或
- 如在由少數HCMV病毒株編碼之US28之ECD3中發現的TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)。
16. 根據段落14或15之CAR，其中：
(a) 該CAR之該胞外域包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者：
(i) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 196、197、198、199、200及201所定義，及/或抗體4H3C3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(ii) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 219、220、221、199、222及223所定義，及/或抗體7B1F3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；及/或
(iii) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 242、243、244、199、245及246所定義，及/或抗體2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
且視情況進一步包含對HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者：
(iv) 1D3，分別如由SEQ ID No: 8、9、10、14、15及16所定義，及/或抗體1D3之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(v) 1C10，分別如由SEQ ID No: 112、113、114、117、83及118所定義，及/或抗體1C10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(vi) 1A10，分別如由SEQ ID No: 112、113、114、117、83及118所定義，及/或抗體1A10之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(vii) 1G9，分別如由SEQ ID No: 76、77、78、82、83及84所定義，及/或抗體1G9之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；及/或
(viii) 1E8，分別如由SEQ ID No: 76、95、96、82、99及100所定義，及/或抗體1E8之該等CDR序列中之任一者或多者之功能變體；
(37) 該CAR之該胞外域包含：
選自以下的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(38) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 196、197及198所定義；
(ii) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 219、220及221所定義；及/或
(iii) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 242、243及244所定義；
且視情況進一步包含選自以下的對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變重鏈(V
H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(iv) 1D3，分別如由SEQ ID No: 8、9及10所定義；
(v) 1C10，分別如由SEQ ID No: 112、113及114所定義；
(vi) 1A10，分別如由SEQ ID No: 112、113及114所定義；
(vii) 1G9，分別如由SEQ ID No: 76、77及78所定義；及/或
(viii) 1E8，分別如由SEQ ID No: 76、95及96所定義；及/或
選自以下的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(ix) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 199、200及201所定義；
(x) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 199、222及223所定義；及/或
(xi) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 199、245及246所定義；
且視情況進一步包含選自以下的對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變輕鏈(V
L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者：
(xii) 1D3，分別如由SEQ ID No: 14、15及16所定義；
(xiii) 1C10，分別如由SEQ ID No: 117、83及118所定義；
(xiv) 1A10，分別如由SEQ ID No: 117、83及118所定義；
(xv) 1G9，分別如由SEQ ID No: 82、83及84所定義；及/或
(xvi) 1E8，分別如由SEQ ID No: 82、99及100所定義；及/或
該CAR之胞外域包含：
至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含選自以下的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體之CDR 1、2及3序列：
(i) 分別抗體4H3C3之SEQ ID No: 196、197及198，且視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成；
(ii) 分別抗體7B1F3之SEQ ID No: 219、220及221，且視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成；
(iii) 分別抗體2F5B11之SEQ ID No: 242、243及244，且視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
至少一個可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含選自以下的對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性之抗體之CDR 1、2及3序列：
(iv) 分別抗體4H3C3之SEQ ID No: 199、200及201，且視情況其中該至少一個可變重鏈(V
L)多肽序列包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成；
(v) 分別抗體7B1F3之SEQ ID No: 199、222及223，且視情況其中該至少一個可變重鏈(V
L)多肽序列包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成；
(vi) 分別抗體2F5B11之SEQ ID No: 199、245及246，且視情況其中該至少一個可變重鏈(V
L)多肽序列包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成；且
視情況其中該CAR之該胞外域進一步包含至少一個其他可變重鏈(V
H)多肽序列，其包含選自以下的對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性之抗體之CDR 1、2及3序列：
(vii) 分別SEQ ID No: 8、9及10，且視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽序列包含SEQ ID NO: 12之序列、基本上由其組成或由其組成；
(viii) 分別SEQ ID No: 112、113及114，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 104之序列、基本上由其組成或由其組成；
(ix) 分別SEQ ID No: 112、113及114，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 122之序列、基本上由其組成或由其組成；
(x) 分別SEQ ID No: 76、77及78，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 68之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(xi) 分別SEQ ID No: 76、95及96，且
視情況其中該至少一個可變重鏈(V
H)多肽包含SEQ ID NO: 88之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
其中該CAR之該胞外域進一步包含至少一個其他可變輕鏈(V
L)多肽序列，其包含選自以下的對HCMV之US28蛋白之ECD3內的該第二抗原決定基具有結合特異性之抗體之CDR 1、2及3序列：
(xii) 分別SEQ ID No: 14、15及16，且視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 18之序列、基本上由其組成或由其組成；
(xiii) 分別SEQ ID No: 117、83及118，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 108之序列、基本上由其組成或由其組成；
(xiv) 分別SEQ ID No: 117、83及118，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成；
(xv) 分別SEQ ID No: 82、83及84，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 72之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或
(xvi) 分別SEQ ID No: 82、99及100，且
視情況其中該可變輕鏈(V
L)多肽包含SEQ ID NO: 92之序列、基本上由其組成或由其組成。
17. 根據段落14-16中任一者之CAR，其中該胞外域為抗體，例如單鏈可變片段(scFv)。
18. 根據段落14-17中任一者之CAR，其中該跨膜域包含蛋白質跨膜域，例如跨膜受體蛋白之跨膜域，且
視情況其中該跨膜域包含選自由以下組成之群組的蛋白質的跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD8、CD45及CD4。
19. 根據段落14-18中任一者之CAR，其中該胞外域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域。
20. 根據段落14-19中任一者之CAR，其中該胞內域包含胞內信號傳導域，例如其中：
(a)該胞內信號傳導域包含一或多種基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)；及/或
(b)該胞內信號傳導域包含CD3ζ、Fc受體γ、Fc受體β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之信號傳導域。
21. 根據段落20之CAR，其中該胞內域包含一或多個共刺激域，例如：
(a) 其中該一或多個共刺激域包括一或多個自選自由CD28、41BB、OX40、ICOS、CD27及DAP10組成之群組的蛋白質獲得的功能性信號傳導域；
(b) 其中該胞內域併有接近該胞內信號傳導域之共刺激域，
其中該胞內域包含兩個或更多個共刺激域，例如例如兩個串聯共刺激域，及/或
(d) 其中該胞內域併有單獨細胞介素信號。
22. 根據段落14-21中任一者之CAR，其中該CAR進一步包含前導序列。
23. 一種核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
其中該核酸分子包含，或多個不同核酸分子之該組合共同包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合形式編碼段落1-13中任一者之結合分子或段落14-22中任一者之CAR。
24. 一種載體，其包含根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
25. 根據段落24之載體，其中該載體係選自由以下組成之群組：反轉錄病毒載體、質體、慢病毒載體及腺病毒載體。
26. 一種細胞，其包含根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據段落24或25之載體，
視情況其中該細胞表現根據段落1-13中任一者之一或多個結合分子，及/或根據段落14-22中任一者之一或多個CAR，該一或多個結合分子及/或CAR由根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據段落24或25之載體編碼。
27. 根據段落26之細胞，其中該細胞包含：
(a) 根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中所編碼之結合分子為根據段落1-11中任一者之抗體、根據段落12之抗體之功能片段或根據段落13之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段；及/或
(b) 根據段落25或26之載體，其中該載體包含如此段落之部分(a)所定義之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
28. 根據段落26之細胞，其中該細胞包含：
(a) 根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中所編碼之結合分子為根據段落14-22中任一者之CAR；及/或
(b) 根據段落25或26之載體，其中該載體包含如此段落之部分(a)所定義之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
29. 一種細胞，其包含根據段落1-13中任一者之結合分子及/或編碼該結合分子之核酸，視情況其中該核酸為如段落23至25中任一者所定義之核酸或載體。
30. 段落29之細胞，其中
該結合分子為根據段落1-11中任一者之抗體、根據段落12之抗體之功能片段或根據段落13之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段，且
視情況其中該抗體為單株抗體，且進一步例如其中該細胞為重組表現該單株抗體之CHO細胞。
31. 一種細胞，其包含根據段落14-22中任一者之CAR及/或編碼該CAR之核酸，視情況其中該核酸為如段落23至25中任一者所定義之核酸或載體。
32. 根據段落26、28、29或31之細胞或根據段落32之方法，其中該細胞為T細胞、自然殺手(NK)細胞或巨噬細胞。
33. 根據段落31或32之細胞，其中該細胞為CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR-巨噬細胞，且
視情況，當該細胞為CAR-T細胞時，則該T細胞係選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4
+T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
34. 一種產生細胞之方法，該方法包含將根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據段落24或25之載體引入細胞中。
35. 一種產生根據段落1至13中任一者之結合分子或根據段落14至22中任一者之CAR之方法，該方法包含：
在細胞中表現根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據段落24或25之載體。
36. 段落35之方法，其包含將該如此產生之結合分子自該細胞分離的步驟；且
視情況，其中該結合分子為根據段落1-11中任一者之抗體、根據段落12之抗體之功能片段或根據段落13之包含融合多肽序列之抗體之其功能片段。
37. 一種經分離之結合分子，其係藉由段落36之方法獲得或可藉由該方法獲得，
視情況，其中該經分離之結合分子經進一步調配以用於向個體投與。
38. 一種結合物，該結合物包含與如段落1-11或13中任一者所定義之結合分子或與如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段結合的部分。
39. 段落38之結合物，其中該部分為治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性部分。
40. 段落38或39之結合物，其中該部分為藥物(例如，其中該結合物為抗體-藥物結合物(「ADC」))及/或放射性部分(例如，其中該結合物適用於放射免疫療法(「RIT」))。
41. 一種產生根據段落38至40中任一者之結合物之方法，該方法包含以下步驟：
(a) 提供如段落1-11或13中任一者所定義之結合分子或如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段；及
(b) 使部分與如段落1-11或13中任一者所定義之結合分子或如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段結合。
42. 段落41之方法，其包含分離該如此產生之結合物的步驟。
43. 段落38至40中任一者之結合物或段落41或42之方法，其中該結合分子為根據段落1-11中任一者之抗體、根據段落12之抗體之功能片段或根據段落13之包含融合多肽序列之抗體或其功能片段。
44. 一種經分離之結合物，其係藉由段落42或43之方法獲得或可藉由該方法獲得，
視情況，其中該經分離之結合物經進一步調配以用於向個體投與。
45. 一種對抗HCMV或與HCMV有關之疾病或病況的方法，該方法包含向個體或離體或活體外細胞物質投與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑：
i. 根據段落1-11或13中任一者之結合分子，
ii. 如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段，
iii. 根據段落37之經分離之結合分子，
iv. 根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據段落24或25之載體，
vi. 根據段落26至33中任一者之細胞，
vii. 根據段落38至40中任一者之結合物，及
viii. 根據段落44之經分離之結合物。
46. 一或多種供使用之藥劑，其用於在個體或離體細胞物質或活體外細胞物質中對抗與HCMV相關之疾病或病況，其中該一或多種藥劑係各自單獨地選自由以下組成之群組：
i. 根據段落1-11或13中任一者之結合分子，
ii. 如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段，
iii. 根據段落37之經分離之結合分子，
iv. 根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據段落24或25之載體，
vi. 根據段落26至33中任一者之細胞，
vii. 根據段落38至40中任一者之結合物，及
viii. 根據段落44之經分離之結合物。
47. 一種一或多種藥劑之用途，其用於製造供在個體或離體細胞物質或活體外細胞物質中對抗與HCMV相關之疾病或病況用的藥物，其中該一或多種藥劑係各自單獨地選自由以下組成之群組：
i. 根據段落1-11或13中任一者之結合分子，
ii. 如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段，
iii. 根據段落37之經分離之結合分子，
iv. 根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據段落24或25之載體，
vi. 根據段落26至33中任一者之細胞，
vii. 根據段落38至40中任一者之結合物，及
viii. 根據段落44之經分離之結合物。
48. 根據段落45之方法、根據段落46之一或多種供使用之藥劑或根據段落47之用途，其中：
i. 該疾病或病況為HCMV感染或與HCMV感染相關，且視情況該HCMV感染包含多株HCMV感染；
ii. 該疾病或病況為潛伏HCMV感染(視情況為多株潛伏HCMV感染)或與潛伏HCMV感染(視情況為多株潛伏HCMV感染)相關；
iii. 該疾病或病況為裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)或與裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)相關；
iv. 該疾病或病況為先天性單株或多株HCMV感染，諸如潛伏先天性單株或多株HCMV感染或裂解先天性單株或多株HCMV感染；
v. 該疾病或病況為癌症；
vi. 該疾病或病況為HCMV感染癌症(視情況為多株HCMV感染癌症)，諸如潛伏HCMV感染癌症(視情況為多株潛伏HCMV感染癌症)；
vii. 該疾病或病況係上皮癌；視情況其中該上皮癌為乳癌；例如其中該乳癌為三陰性乳癌(TNBC)或HER2陽性乳癌(諸如三陽性乳癌「TPBC」)；
viii. 該疾病為轉移及/或侵襲形式之癌症，諸如轉移及/或侵襲形式之HCMV感染癌症(例如具有潛伏HCMV感染及/或多株HCMV感染之癌症)；
ix. 該疾病或病況不為神經膠母細胞瘤；
x. 該有需要之個體已診斷具有HCMV感染癌細胞，諸如潛伏HCMV感染癌細胞；及/或
xi. 該有需要之個體為或意欲為器官捐獻接受者或器官捐獻者；且
其中如本文所述之該多株HCMV感染包含感染有一種以上不同HCMV病毒株，例如：
a) 展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)的多種HCMV病毒株，及/或
b) 一或多種編碼US28之ECD3之該4N變體的HCMV病毒株及一或多種編碼US28之ECD3之該4D變體的HCMV病毒株。
49. 根據段落45或48之方法、根據段落46或48之一或多種供使用之藥劑或根據段落47或48之用途，
其中該藥劑係選自由以下組成之群組：
i. 如段落1至11中任一者所定義之治療性抗體，
ii. 如段落12所定義之治療性抗體之功能片段，
iii. 如段落13所定義之包含融合多肽序列之治療性抗體；及
iv. 如段落13所定義之包含融合多肽序列之治療性抗體之功能片段。
50. 根據段落45或48之方法、根據段落46或48之一或多種供使用之藥劑或根據段落47或48之用途，
其中該藥劑為雙特異性抗體，例如雙特異性免疫細胞接合子抗體，諸如雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體，視情況其中該BiTE抗體包含CD3結合域。
51. 根據段落45或48之方法、根據段落46或48之一或多種供使用之藥劑或根據段落47或48之用途，
其中該藥劑為段落38至40中任一者之結合物，諸如作為抗體-藥物結合物(「ADC」)之結合物，或包含放射性部分之結合物，諸如適用於放射免疫療法(「RIT」)之結合物。
52. 根據段落45或48之方法、根據段落46或48之一或多種供使用之藥劑或根據段落47或48之用途，
其中該藥劑為根據段落31至33中任一者之包含CAR之細胞，例如CAR-T細胞、CAR-NK細胞或CAR-巨噬細胞。
53. 根據段落45或段落48至52中任一者之方法、根據段落46或段落48至52中任一者之一或多種供使用之藥劑或根據段落47至52中任一者之用途，
其中該個體為被投與另一物質，諸如另一治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性物質之個體，且
視情況其中該另一物質係與該一或多種藥劑或其中之每一者分開、依序或同時投與。
54. 一種用於醫藥之藥劑，其中該藥劑係選自由以下組成之群組：
i. 根據段落1-11或13中任一者之結合分子，
ii. 如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段，
iii. 根據段落37之經分離之結合分子，
iv. 根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據段落24或25之載體，
vi. 根據段落26至33中任一者之細胞，
vii. 根據段落38至40中任一者之結合物，及
viii. 根據段落44之經分離之結合物。
55. 一種疫苗組合物，其適用於針對與人類巨細胞病毒(HCMV)相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況或對抗該疾病或病況，
其中該疫苗為主動或被動疫苗，
其中該疫苗觸發及/或提供針對存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基的免疫反應(且視情況，其中該疫苗亦觸發及/或提供針對存在於HCMV之US28蛋白之ECD3內之第二抗原決定基的免疫反應)，且
其中該US28蛋白之ECD1、SEQ ID NO: 177及ECD3包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO:5中所闡述之由HCMV編碼之該US28蛋白的位置1至37、26至37及167至183。
56. 段落55之疫苗組合物，其中該疫苗觸發及/或提供針對以下之免疫反應：
(a) 完全存在於HCMV之該US28蛋白之ECD1內由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的一或多個抗原決定基及/或完全存在於HCMV之該US28蛋白之ECD3內之一或多個抗原決定基；
(b) HCMV之該US28蛋白之ECD1內由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的一或多個線性抗原決定基及/或HCMV之該US28蛋白之ECD3內之一或多個線性抗原決定基；
(c) HCMV之US28蛋白之ECD3內之一或多個抗原決定基，其為以相同形式存在於HCMV之4D變異株及4N變異株兩者中之一個抗原決定基或多個抗原決定基，其中HCMV之該4D變異株編碼包含具有TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)之序列之ECD3的US28蛋白，且其中HCMV之該4N變異株編碼包含具有TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:6)之序列之ECD3的US28蛋白；
(d)其中由該疫苗觸發或提供之該免疫反應對多種HCMV病毒株係HCMV病毒株未定性，該多種HCMV病毒株展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)，例如其中該多種病毒株為兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種選自由DB、Toledo、Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、AD169、VHL/E、Davis及BL組成之群組之不同病毒株；及/或
(e)其中由該疫苗觸發或提供之該免疫反應對HCMV之該等4D變異株及該等4N變異株係HCMV病毒株未定性，且觸發及/或提供針對選自Towne、VR1814、TB40/E、Merlin、JP、Ad169、VHL/E、AF1、BL及DAVIS的該等4D變異HCMV病毒株中之一或多者且亦針對選自Toledo、TR及DB的該等4N變異HCMV病毒株中之一或多者的免疫反應。
57. 段落55或56之疫苗組合物，其中：
(i) 該疫苗為被動疫苗，及/或視情況包含：
● 根據段落1-11或13中任一者之一或多個結合分子，
● 如段落12或13所定義之一或多個結合分子之一或多個功能片段,
● 根據段落37之一或多個經分離之結合分子，
● 根據段落23之一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
● 根據段落24或25之一或多種載體，
● 根據段落26至33中任一者之一或多個細胞，
● 根據段落38至40中任一者之一或多種結合物，及/或
● 根據段落44之一或多種經分離之結合物；及/或
(ii) 該疫苗為主動疫苗，及/或視情況包含：
(a) 根據段落84至88中任一者之一或多種肽或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合、根據段落90之融合蛋白、根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合、根據段落92至94中任一者之結合物及/或根據段落95之至少兩種不同結合物之組合；及/或
(b) 根據段落101或102之一或多個核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據段落103或104之載體；及/或
(c) 樹突狀細胞或其均質或異質群體，其中該等樹突狀細胞或各樹突狀細胞負載有以下中之一或多者：根據段落84至88中任一者之肽或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合、根據段落90之融合蛋白、根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合、根據段落92至94中任一者之結合物、根據段落95之至少兩種不同結合物之組合、根據段落101或102之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或根據段落103或104之一或多種載體。
58. 一種針對與HCMV相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法，該方法包含向個體投與根據段落55至57中任一者之疫苗，
視情況其中該疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
59. 根據段落55至57中任一者之疫苗，其用於針對個體之與HCMV相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況，
視情況其中該疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
60. 一種根據段落55至57中任一者之疫苗的用途，其用於製造供針對個體之與HCMV相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況用的藥物，
視情況其中該疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
61. 段落55至57中任一者之疫苗組合物、段落58之方法、根據段落59之供使用之疫苗組合物或根據段落60之用途，其中：
i. 該疾病或病況為HCMV感染或與HCMV感染相關，且視情況該HCMV感染包含多株HCMV感染；
ii. 該疾病或病況為潛伏HCMV感染(視情況為多株潛伏HCMV感染)或與潛伏HCMV感染(視情況為多株潛伏HCMV感染)相關；
iii. 該疾病或病況為裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)或與裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)相關；
iv. 該疾病或病況為先天性單株或多株HCMV感染，諸如潛伏先天性單株或多株HCMV感染或裂解先天性單株或多株HCMV感染；
v. 該疾病或病況為癌症；
vi. 該疾病或病況為HCMV感染癌症(視情況為多株HCMV感染癌症)，諸如潛伏HCMV感染癌症(視情況為多株潛伏HCMV感染癌症)；
vii. 該疾病或病況係上皮癌；視情況其中該上皮癌為乳癌；例如其中該乳癌為三陰性乳癌(TNBC)或HER2陽性乳癌(諸如三陽性乳癌「TPBC」)；
viii. 該疾病或病況為轉移及/或侵襲形式之癌症，諸如轉移及/或侵襲形式之HCMV感染癌症(例如具有潛伏HCMV感染及/或多株HCMV感染之癌症)；
ix. 該疾病或病況不為神經膠母細胞瘤；
x. 該有需要之個體已診斷具有HCMV感染癌細胞，諸如潛伏HCMV感染癌細胞；及/或
xi. 該有需要之個體為或意欲為器官捐獻接受者或器官捐獻者；
其中如本文所述之該多株HCMV感染包含感染有一種以上不同HCMV病毒株，例如：
a) 展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)的多種HCMV病毒株，及/或
b) 一或多種編碼US28之ECD3之該4N變體的HCMV病毒株及一或多種編碼US28之ECD3之該4D變體的HCMV病毒株。
62. 一種評定個體及/或離體生物材料之一或多種生物病況及/或生物特徵的方法，其中該方法包含：
(a) 使該個體及/或該離體生物材料與如段落1至13中任一者所定義之結合分子或如段落38至40、43或44中任一者所定義之結合物接觸；及
(b) 基於對該結合分子或結合物與該個體及/或該離體生物材料之結合的直接及/或間接量測來評定該個體及/或該離體生物材料。
63. 段落62之方法，其中該方法包含ELISA方法，且視情況對離體生物材料，諸如一或多種體液執行該方法。
64. 段落62之方法，其中該方法包含流動式細胞測量方法，且視情況該方法係用於評定來自個體之離體血液樣本及/或離體骨髓樣本的方法。
65. 段落62之方法，其中該方法包含使用如段落38至40、43或44中任一者所定義之結合物，
其中該結合物包含可偵測部分，諸如放射性部分，且該方法包含偵測該個體及/或該離體生物材料中之該放射性部分，
例如，其中該方法為免疫正電子發射(PET)成像方法。
66. 段落62之方法，其中該方法為對離體生物材料之樣本執行之免疫組織化學方法。
67. 段落62至66中任一者之方法，其中出於對個體之與HCMV相關之疾病或病況進行診斷或預後評定之目的，對該個體或對自該個體獲得之離體生物材料執行該方法。
68. 段落67之方法，其中：
i. 該疾病或病況為HCMV感染或與HCMV感染相關，且視情況該HCMV感染包含多株HCMV感染；
ii. 該疾病或病況為潛伏HCMV感染(視情況為多株潛伏HCMV感染)或與潛伏HCMV感染(視情況為多株潛伏HCMV感染)相關；
iii. 該疾病或病況為裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)或與裂解HCMV感染(視情況為多株裂解HCMV感染)相關；
iv. 該疾病或病況為先天性單株或多株HCMV感染，諸如潛伏先天性單株或多株HCMV感染或裂解先天性單株或多株HCMV感染；
v. 該疾病或病況為癌症；
vi. 該疾病或病況為HCMV感染癌症(視情況為多株HCMV感染癌症)，諸如潛伏HCMV感染癌症(視情況為多株潛伏HCMV感染癌症)；
vii. 該疾病或病況係上皮癌；視情況其中該上皮癌為乳癌；例如其中該乳癌為三陰性乳癌(TNBC)或HER2陽性乳癌(諸如三陽性乳癌「TPBC」)；
viii. 該疾病或病況為轉移及/或侵襲形式之癌症，諸如轉移及/或侵襲形式之HCMV感染癌症(例如具有潛伏HCMV感染及/或多株HCMV感染之癌症)；
ix. 該疾病或病況不為神經膠母細胞瘤；及/或
x. 該有需要之個體已診斷具有HCMV感染癌細胞，諸如潛伏HCMV感染癌細胞或具有生產性HCMV感染之癌細胞(包括但不限於具有生產性HCMV感染之腫瘤相關巨噬細胞)及/或多株HCMV感染癌細胞；
xi. 該個體為或意欲為器官捐獻接受者或器官捐獻者；
其中如本文所述之該多株HCMV感染包含感染有一種以上不同HCMV病毒株，例如：
a) 展示在ECD1之位置1至25之區域中的一或多個位置中的病毒株間序列變異(諸如位置8、15、18、19、24、25中之任一個或多個，包括但不限於本申請案之表3中所列出的序列變異)的多種HCMV病毒株，及/或
b) 一或多種編碼US28之ECD3之該4N變體的HCMV病毒株及一或多種編碼US28之ECD3之該4D變體的HCMV病毒株。
69. 一種對抗活的離體生物材料之HCMV感染(諸如潛伏HCMV感染及/或裂解HCMV感染及/或多株HCMV感染)之方法，該方法包含使該活的離體生物材料與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑接觸：
i. 根據段落1-11或13中任一者之結合分子，
ii. 如段落12或13所定義之該結合分子之功能片段，
iii. 根據段落37之經分離之結合分子，
iv. 根據段落23之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
v. 根據段落24或25之載體，
vi. 根據段落26至33中任一者之細胞，
vii. 根據段落38至40中任一者之結合物，及
viii. 根據段落44之經分離之結合物。
70. 一種活的離體生物材料，其係藉由段落69之方法獲得或可藉由該方法獲得。
71. 段落69之方法或根據段落70之活的離體生物材料，其中該離體活生物材料包含選自包括以下之群組的活的離體生物材料、基本上由其組成或由其組成：一或多種類型之離體細胞；一或多種類型之離體細胞培養物；一或多種類型之離體組織；一或多種類型之離體組織培養物；一或多種類型之離體胞器；一或多種類型之離體胞器培養物；一或多種類型之離體器官；及/或一或多種類型之離體器官培養物。
72. 一種治療有需要之個體的方法，其包含向該個體投與如段落60或61所定義之離體活生物材料。
73. 段落72之方法，其中該方法為移植該離體活生物材料，諸如器官移植或組織移植之方法。
74. 一種篩選結合分子之方法，該結合分子對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，
其中該US28蛋白之ECD1及SEQ ID NO: 177包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO:5中所闡述之由HCMV編碼之US28蛋白的位置1至37及26至27，
該方法包含：
(a) 提供一或多種肽或多肽，該一或多種肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段，
視情況其中該一或多種肽或多肽以如下形式提供：
- 根據段落84至88中任一者之一或多種肽或多肽，
- 根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合，
- 根據段落90之一或多種融合蛋白，
- 根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合、根據段落92至94中任一者之結合物，
- 或根據段落95之至少兩種不同結合物之組合，且
較佳其中存在於該一或多種肽或多肽內之僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 177之序列或其免疫原性片段，諸如由抗體4H3C3、7B1F3及/或2F5B11結合之片段；
(b) 提供一或多種候選結合分子；
(c) 測定一或多種候選結合分子對該一或多種肽之結合特異性及/或結合親和力，藉此選擇對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性的一或多種結合分子；且
視情況，其中該方法進一步涉及藉由額外方法步驟針對對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內的抗原決定基之結合特異性篩選該等結合分子(可在步驟(a)-(c)之前或之後進行)，該等額外方法步驟包含：
● 提供一或多種與該US28蛋白之ECD3中存在之胺基酸序列對應的肽或多肽，
視情況其中該一或多種肽或多肽係以以下形式提供：
- 根據段落85至88中任一者之一或多種肽或多肽，
- 根據段落89之選項(b)及(c)之至少兩種不同肽及/或多肽之組合，
- 根據段落90之一或多種融合蛋白，其包含根據段落85至88中任一者之具有SEQ ID NO: 6及/或7之序列的至少一種肽或多肽之序列或任一者之免疫原性片段，
- 根據段落91之選項(b)及(c)的至少兩種不同融合蛋白之組合，
- 根據段落92至94中任一者之結合物，其包含根據段落85至88中任一者之具有SEQ ID NO: 6及/或7之序列的至少一種肽或多肽之序列或任一者之免疫原性片段，或
- 根據段落95之選項(b)及(c)的至少兩種不同結合物之組合；
較佳其中存在於該一或多種肽內之僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 6及/或7之序列，或任一者之免疫原性片段，諸如由抗體1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8結合之片段；
(ii) 提供一或多種候選結合分子，視情況其中步驟(a)-(c)在步驟(i)-(iii)之前進行且其中步驟(ii)之該等候選結合分子為此段落之步驟(c)的產物；及
(iii) 測定一或多種候選結合分子對該一或多種與該US28蛋白之ECD3中存在之胺基酸序列對應的肽或多肽的結合特異性及/或結合親和力，視情況其中步驟(a)-(c)在步驟(i)-(iii)之後進行且其中步驟(b)之該等候選結合分子為此段落之步驟(iii)之產物。
75. 段落74之方法，其中該一或多種肽或其中之每一者包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：多肽序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)、TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)及/或TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)及/或任一者或每一者之免疫原性片段；
視情況其中該一或多種肽係以以下形式提供：根據段落84至88中任一者之一或多種肽或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合、根據段落90之一或多種融合蛋白、根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合、根據段落92至94中任一者之結合物或根據段落95之至少兩種不同結合物之組合。
76. 段落74或75之方法，其中該一或多種候選結合分子為抗體及/或CAR，諸如以下中之任一者或多者：
(a) 二價抗體，諸如IgG-scFv抗體(例如，其中第一結合域係完整IgG，且第二結合域係scFv，該scFv在該IgG之輕鏈之N端及/或在輕鏈之C端及/或在重鏈之N端及/或在重鏈之C端處附接至該第一結合域，或反之亦然)，包括但不限於對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內之該第一抗原決定基具有結合特異性且對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內之該第二抗原決定基具有結合特異性的二價抗體，例如其中該第一及/或第二抗原決定基如段落1至9中任一者所定義；
(b) 單價抗體，諸如
DuoBody ®或『臼包杵』雙特異性抗體(例如scFv-KIH、scFv-KIH
r、BiTE-KIH或BiTE-KIH
r)；
(c) scFv
2-Fc抗體；
(d) 雙特異性抗體，諸如雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體；
(e) 雙重可變域(DVD)-Ig抗體；
(f) 基於雙親和力再靶向(DART)之抗體(例如，DART
2-Fc或DART)；
(g) 三特異性抗體，諸如DNL-Fab
3抗體或對由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內之該第一抗原決定基具有結合特異性且對HCMV之US28蛋白之胞外域3 (ECD3)內之該第二抗原決定基具有結合特異性且對第三抗原決定基，諸如免疫細胞呈現之抗原決定基具有結合特異性的三特異性抗體，例如其中該第一及/或第二抗原決定基如段落1至9中任一者所定義，視情況其中該三特異性抗體為三特異性免疫細胞接合子抗體，例如三特異性T細胞接合子(TiTE)，且視情況其中該TiTE抗體包含CD3結合域；
(h) scFv-HSA-scFv抗體；及
(i) 嵌合抗原受體(CAR)。
77. 段落74至76中任一者之方法，其進一步包含基於對該一或多種肽之結合特異性及/或結合親和力選擇候選結合分子的步驟。
78. 段落77之方法，其中所選候選結合分子：
(a) 對完全存在於HCMV之該US28蛋白之ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基(及視情況完全存在於ECD3內之第二抗原決定基)具有結合特異性；
(b) 對該US28蛋白之ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一線性抗原決定基具有結合特異性(且視情況對ECD3內之第二線性抗原決定基具有結合特異性)；
(c) 對HCMV之US28蛋白之ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基及/或ECD3內之第二抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性，例如對HCMV之US28蛋白之ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽及/或ECD3內的抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性對選自由以下組成之群組的HCMV病毒株中之兩者或更多者(諸如全部)係未定性：DB、Towne、AD169、DAVIS、BL、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、VHL/E、TR及VR1814 (FIX)；
(d) 對HCMV之該US28蛋白之ECD3內的抗原決定基具有特異性，無論該US28蛋白之該ECD3是否包含序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)或TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)；及/或
(e) 對完全存在於以下內之不連續抗原決定基具有特異性：
- 在ECD1內由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的US28之第一區；及
- 在US28之ECD3內的US28之第二區，較佳為在SEQ ID No: 6及7中之每一者中一致的胺基酸。
79. 段落77或78之方法，其中所選候選結合分子對包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段、基本上由其組成或由其組成之該一或多種肽或多肽具有的結合特異性及/或結合親和力等效於如由包含以下之抗體所展現的對相同一或多種肽或多肽之結合特異性及/或結合親和力：
(a) 由SEQ ID NO:187之序列組成之可變重鏈(V
H)多肽及由SEQ ID NO:189之序列組成之可變輕鏈(V
L)多肽；
(b) 由SEQ ID NO:211之序列組成之可變重鏈(V
H)多肽及由SEQ ID NO:213之序列組成之可變輕鏈(V
L)多肽；或
(c) 由SEQ ID NO:233之序列組成之可變重鏈(V
H)多肽及由SEQ ID NO:235之序列組成之可變輕鏈(V
L)多肽。
80. 一種產生包含結合分子之多個複本的組合物之方法，該方法包含使所選候選結合分子複製，該候選結合分子已根據段落77、78或79中任一者之方法經選擇。
81. 一種評定所選候選結合分子之方法，該候選結合分子已根據段落77、78或79中任一者之方法經選擇，該方法包含及鑑別所選候選結合分子內之一或多種結構，該一或多種結構提供該候選結合分子之結合特徵，
例如，鑑別作為抗體或CAR之所選候選結合分子中的該CDR序列或各CDR序列。
82. 一種產生包含結合分子之多個複本的組合物之方法，其中該結合分子包含已根據段落81之方法在所選候選結合分子內經鑑別為提供該候選結合分子之結合特徵之一或多種結構或其中之每一者，
該方法包含使該結合分子複製。
83. 一種結合分子之組合物，其藉由段落80或82之方法獲得。
84. 一種肽或多肽，其包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)、基本上由其組成或由其組成，或包含SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列，其中該肽或多肽並非US28蛋白，且
較佳其中該肽或多肽中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列。
85. 一種肽或多肽，其包含序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)及/或TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)、基本上由其組成或由其組成，或包含SEQ ID NO: 6及/或7之免疫原性片段之序列，其中該肽或多肽並非US28蛋白，視情況其中該肽或多肽亦包含SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列，其中該肽或多肽並非US28蛋白，且
較佳其中該肽或多肽中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 6及/或7之序列或SEQ ID NO: 6及/或7之免疫原性片段之序列，且視情況亦為SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列。
86. 段落84或85之肽或多肽，其中：
(a) SEQ ID NO: 177之免疫原性片段包含少於SEQ ID NO: 177之全序列，且包含SEQ ID NO: 177之至少3、4、5、6、7、8、9、10或11個連續胺基酸；
(b) SEQ ID NO: 6之免疫原性片段包含少於SEQ ID NO: 6之全序列，且包含SEQ ID NO: 6之至少3、4、5、6、7、8、9、10或11個連續胺基酸；及/或
(c) SEQ ID NO: 7之免疫原性片段包含少於SEQ ID NO: 7之全序列，且包含SEQ ID NO: 7之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續胺基酸。
87. 段落85或86之肽或多肽，其中SEQ ID NO: 6及/或7之免疫原性片段包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7共有的且存在於該等序列內的序列。
88. 一種肽或多肽，其包含TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之免疫原性片段或變體的序列、由其組成或基本上由其組成，其中該免疫原性片段或變體包含由抗體4H3C3、7B1F3及/或2F5B11所結合的US28之ECD1內的抗原決定基之序列；且
視情況進一步包含TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)或TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)之免疫原性片段或變體的序列、由其組成或基本上由其組成，其中該免疫原性片段或變體包含由抗體1D3、1C10、1A10、1G9及/或1E8所結合的US28之ECD3內的抗原決定基之序列。
89. 一種至少兩種不同肽及/或多肽之組合，其包含第一肽或多肽及第二肽或多肽(及視情況至少第三肽或多肽)，其中：
(a) 該第一肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：根據段落84之序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)，或其免疫原性片段，諸如如段落86或88所定義之免疫原性片段；及
(b) 該第二肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：如段落85所定義之序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)，或其免疫原性片段，諸如如段落86、87或88所定義之免疫原性片段，視情況，條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO: 6之4N胺基酸；或
(c) 該第二肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：如段落85所定義之序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)，或其免疫原性片段，諸如如段落86、87或88所定義之免疫原性片段，視情況條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO: 7之4D胺基酸；及
視情況其中該組合包含該第三多肽，且若該第二肽或多肽如由選項(b)所定義，則該第三肽或多肽對應於選項(c)，或其中若該第二肽或多肽如由選項(c)所定義，則該第三肽或多肽對應於選項(b)。
90. 一種融合蛋白，其包含直接或經由一或多個連接子胺基酸序列融合至第二胺基酸序列之第一胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，其中
該第一胺基酸序列為如段落84-88中任一者所定義之肽或多肽之序列；及
該第二胺基酸序列為融合搭配物，視情況其中該融合搭配物為攜載蛋白，諸如經選擇以提供適用於針對該第一胺基酸序列進行免疫接種及產生抗體的融合蛋白之攜載蛋白，
視情況其中該攜載蛋白係選自由以下組成之群組：匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、經遺傳修飾之白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)及流感嗜血桿菌蛋白質D (HiD)。
91. 一種至少兩種不同融合蛋白之組合，其包含第一融合蛋白及第二融合蛋白(及視情況至少第三融合蛋白)，其中：
(a) 根據段落90之第一融合蛋白包含作為該第一融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：如段落84所定義之序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)，或其免疫原性片段，諸如如段落86或88所定義之免疫原性片段；及
(b) 根據段落90之第二融合蛋白包含作為該第一融合蛋白之第二胺基酸序列的序列，該序列包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：如段落85所定義之序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)，或其免疫原性片段，諸如如段落86、87或88所定義之免疫原性片段，視情況條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO:6之4N胺基酸；或
(c) 根據段落90之第二融合蛋白包含作為該第二融合蛋白之第一胺基酸序列的序列，該序列包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：如段落85所定義之序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)，或其免疫原性片段，諸如如段落86、87或88所定義之免疫原性片段，視情況條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO:7之4D胺基酸；及
視情況其中該組合包含第三不同融合蛋白，且若該第二融合蛋白如由選項(b)所定義，則該第三融合蛋白對應於選項(c)，或其中若該第二融合蛋白如由選項(c)所定義，則該第三融合蛋白對應於選項(b)。
92. 一種結合物，其包含與如段落84-88中任一者所定義之肽或多肽或與如段落90所定義之融合蛋白結合的部分。
93. 段落92之結合物，其中：
(i) 該部分直接與如段落84-88中任一者所定義之肽或多肽或與如段落90所定義之融合蛋白結合；或
(ii) 該部分諸如經由連接子間接地與如段落84-88中任一者所定義之肽或多肽或與如段落90所定義之融合蛋白結合。
94. 段落92或93之結合物，其中該部分為攜載體，例如攜載蛋白質，例如選自以下之攜載體：匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、經遺傳修飾之白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)及流感嗜血桿菌蛋白質D (HiD)。
95. 一種至少兩種不同結合物之組合，其中該組合包含：
(a) 根據段落92-94中任一者之第一結合物，其中該第一結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)，或其免疫原性片段，諸如如段落86或88所定義之免疫原性片段；及
(b) 根據段落92-94中任一者之第二結合物，其中該第二結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)，或其免疫原性片段，諸如如段落86、87或88所定義之免疫原性片段，條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO:6之4N胺基酸；或
(c) 根據段落92-94中任一者之第二結合物，其中該第二結合物包含與肽或多肽結合之部分、基本上由其組成或由其組成，其中該肽或多肽包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO:7)，或其免疫原性片段，諸如如段落86或88所定義之免疫原性片段，條件為該免疫原性片段至少包含SEQ ID NO:7之4D胺基酸；及
視情況其中該組合包含第三不同結合物，且若該第二結合物如由選項(b)所定義，則該第三結合物對應於選項(c)，或其中若該第二結合物如由選項(c)所定義，則該第三結合物對應於選項(b)。
96. 一種產生根據段落92-94中任一者之結合物之方法，該方法包含以下步驟：
(a) 提供如段落84-88中任一者所定義之肽或多肽或如段落90所定義之融合蛋白；及
(b) 使部分與如段落84-88中任一者所定義之肽或多肽或與如段落90所定義之融合蛋白結合。
97. 一種產生如段落95所定義之至少兩種不同結合物之組合的方法，該方法包含以下步驟：
(a) 藉由根據段落95之方法產生如段落90所定義之第一結合物；
(b) 藉由根據段落95之方法產生如段落90所定義之第二結合物；
(c) 視情況藉由根據段落95之方法產生如段落90所定義之第三結合物；及
(d) 組合該第一結合物及該第二(及視情況第三)結合物，由此形成根據段落95之組合。
98. 一種產生如段落95所定義之至少兩種不同結合物之組合的方法，該方法包含以下步驟：
(a) 提供根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合或根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合；及
(b) 使部分與根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合或與根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合結合，由此形成根據段落95之組合。
99. 段落96、97或98之方法，其包含分離如此產生之結合物或結合物之組合的步驟。
100. 一種經分離之結合物或結合物之組合，其係藉由段落97-99中任一者之方法獲得或可藉由其獲得，
視情況，其中該經分離之結合物經進一步調配以用於向個體投與。
101. 一種核酸分子或多個不同核酸分子之組合，
其中該核酸分子包含，或該多個不同核酸分子之組合共同包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合形式編碼根據段落84至88中任一者之一或多種肽及/或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合、根據段落90之融合蛋白及/或根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合。
102. 根據段落101之核酸分子或多個不同核酸分子之組合，其中該核酸分子或各核酸分子係獨立地選自DNA或RNA分子。
103. 一種載體，其包含根據段落101或102之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
104. 根據段落103之載體，其中該載體係選自由以下組成之群組：反轉錄病毒載體、質體、慢病毒載體及腺病毒載體。
105. 一種細胞，其包含根據段落101或102之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據段落103或104之載體，
視情況其中該細胞表現根據段落84至88中任一者之一或多種肽或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合、根據段落90之融合蛋白或根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合。
106. 一種細胞，其暴露於及/或包含根據段落84至88中任一者之一或多種肽或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合、根據段落90之融合蛋白、根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合、根據段落92-94中任一者之結合物、根據段落95之至少兩種不同結合物之組合、根據段落101或102之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或根據段落103或104之載體。
107. 一種分離及/或富集包含對US28之ECD1中由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基(及視情況ECD3中之第二抗原決定基)具有特異性的T細胞受體(TCR)之細胞(例如天然存在之T細胞，或表現根據段落14-22中任一者之CAR之重組細胞，例如CAR T細胞、CAR NK細胞及/或CAR巨噬細胞)的方法，其中該方法包含使用藥劑之步驟，
其中該藥劑係選自由以下組成之群組：根據段落84至88中任一者之肽或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合、根據段落90之融合蛋白、根據段落91之至少兩種不同融合蛋白之組合、根據段落92至94中任一者之結合物及/或根據段落95之至少兩種不同結合物之組合，
以分離及/或富集對SEQ ID No: 177之序列或其免疫原性片段具有結合特異性，且視情況亦對SEQ ID NO: 6及/或7之序列中之一或兩者或任一者之免疫原性片段具有結合特異性的細胞。
108. 段落107之方法，其中該等序列經調配為MHC四聚體，
例如用於抗原特異性CD8
+T細胞偵測之I類MHC四聚體、用於抗原特異性CD4
+T細胞偵測之II類MHC四聚體、用於流動式細胞測量術或螢光顯微術之螢光團標記四聚體。
109. 段落107或108之方法，其中該T細胞係選自由以下組成之群組：CD8
+T細胞、CD4+ T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型。
110. 一種MHC四聚體，其包含根據段落84至88中任一者之肽或多肽、根據段落89之至少兩種不同肽及/或多肽之組合，視情況其中該肽包含或對應於SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7或任一者或兩者之免疫原性片段，
例如其中該MHC四聚體為用於抗原特異性CD8
+T細胞偵測之I類MHC四聚體、用於抗原特異性CD4
+T細胞偵測之II類MHC四聚體、用於流動式細胞測量術或螢光顯微術之螢光團標記四聚體。
111. 段落110之MHC四聚體，其用於分離及/或富集包含對US28之ECD1中由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基(及視情況ECD3中之第二抗原決定基)具有特異性的T細胞受體(TCR)之細胞，例如選自由以下組成之群組的T細胞：CD8
+T細胞、CD4
+T細胞、效應T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、EBV特異性T細胞受體(TCR)或γδ-T細胞亞型；及/或表現根據段落14-22中任一者之CAR之重組細胞，例如CAR T細胞、CAR NK細胞及/或CAR巨噬細胞。
現將藉助於以下非限制性實施例描述本發明。
實例 實例 1方法： 人類材料及倫理標準：
所有組織材料均在最高倫理標準，包括當地倫理委員會之方案批准下收集，且供體會被告知並就知情同意書進行簽名。活體組織切片已在標準醫學護理期間收集且無法追溯到個體捐獻者。所有人類組織均在HIPPA批准之方案下收集。所有人類樣本已對HIV及B型肝炎測試為陰性的且批准用於市售產品研發。
動物：
在Creative Biolabs公司(Shirley, NY 11967, USA)之指導原則下，將BABL/c小鼠維持於動物設施中。所有動物實驗均根據美國農業部(U.S. Department of Agriculture，USDA)之動物的照護及科學使用準則進行。
免疫接種： ECD1
對於HCMV US28 ECD1 (亦即N端)，肽-N經由化學合成製備：TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)。為增強免疫原性，匙孔螺血氰蛋白(KHL)連接於母肽之N端處。KLH結合肽命名為KLH-肽-N，且用於免疫接種。另外，製備生物素標記肽，其隨後用於抗體篩選。簡言之，將生物素添加至親本肽之N端，該親本肽重新命名為生物肽-N。
藉由肽-N對五隻小鼠(#1-5)進行免疫接種。每14天重複免疫接種。各小鼠接受60 μg KLH-肽-N與弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant)組合之免疫接種作為初始免疫接種。自第2次加打，各小鼠接受60 μg KLH-肽-N與弗氏不完全佐劑組合之免疫接種。在第3次加打劑量之後，收集抗血清，且藉由展示針對肽-N之陽性信號的酶聯免疫吸附分析(ELISA)檢驗免疫反應。效價在小鼠4#中達到超過64,000。
ECD3
對於HCMV US28 ECD3，兩種肽經由化學合成製備：肽1：TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6)；肽2：TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7)。為增強免疫原性，匙孔螺血氰蛋白(KHL)連接於母肽之N端處。KLH結合肽分別命名為KLH-肽-1及KLH-肽-2，且用於免疫接種。質譜法(MS)及高效能液相層析(HPLC)分析證實兩個KLH連接肽非常適合免疫接種。另外，製備生物素標記肽，其隨後用於抗體篩選。簡言之，將生物素添加至親本肽之N端，其分別稱為生物肽-1及生物肽-2。
用肽1和肽2對五隻小鼠(#10-15)進行免疫接種。每14天重複免疫接種。各小鼠接受30 μg KLH-肽-1及30 μg KLH-肽-2與弗氏完全佐劑組合之共免疫接種作為初始免疫接種。自第2次加打，各小鼠接受30 μg KLH-肽-1及30 μg KLH-肽-2與弗氏不完全佐劑組合之共免疫接種。在第3次加打劑量之後，收集抗血清，且藉由展示分別針對肽-1及肽-2之陽性信號的酶聯免疫吸附分析(ELISA)檢驗免疫反應。在第4次加強劑量之後，收集抗血清，且抗血清分別展示針對肽-1及肽-2之增加之陽性信號。效價在小鼠11#、13#、14#及15#中達到超過40,000且在小鼠12#中超過10,000。
ECD2 及 ECD4
相比於ECD1使用肽-N及ECD3使用肽-1及肽-2，用KHL連接之HCMV US28 ECD2及ECD4肽：QYLLDHNSLAS及DTLKLLKWISSSCE免疫接種四隻小鼠(16#、17#、18#及19#)產生比如上文所描述之類似加打方案低的抗體效價(若存在)。MS及HPLC分析另外確認此等肽進行免疫接種之低免疫原性。此等資料表明，即使在胞外域之序列內，鑑別HCMV US28蛋白之適合免疫原性部分仍可為具有挑戰性的。相比於ECD2衍生肽及ECD4衍生肽之失效，ECD1及ECD3衍生肽的成功並非先驗可預測的。
融合瘤培養物：
ECD1
考慮到抗血清ELISA結果，選擇小鼠4#用於細胞融合。使用聚(乙二醇)(PEG)1500 (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, 64293 Darmstadt, Germany)使脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合。接著將融合細胞接種至96孔盤中且在氫原子轉移(HAT)試劑(目錄號21060017, Thermofisher, Waltham, MA 02451, USA)存在下在半固體培養基中培養。針對BSA-肽-N測試958個單一純系(十個96孔盤)，且鑑別137個陽性純系。第2輪篩選證實107個陽性純系與BSA-肽-N結合，其中鑑別63個強陽性純系及44個弱陽性純系。選擇前30個純系進行次選殖，其中29個純系成功次純系。自各親本純系，選擇1次次純系用於第2輪ELISA測試，其中全部29個次純系特異性結合目標肽。
選擇10個次純系用於進一步分析，表示為2F5B11、2G2B3、4A11A11、4H3C3、5D6H11、5E1E4、5E8F7、6G3D6、7B1F3及9G3B9，且藉由FACS驗證(參見下文)。
ECD3
考慮到抗血清ELISA結果，選擇小鼠13#及14#用於細胞融合。在藉由分別靜脈內注射100 μg KLH-肽-1及100 μg KLH-肽-2的第5次加打之後5天收集小鼠13#及14#之脾臟。使用聚(乙二醇)(PEG)1500 (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, 64293 Darmstadt, Germany)使脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合。接著將融合細胞接種至96孔盤中且在氫原子轉移(HAT)試劑(目錄號21060017, Thermofisher, Waltham, MA 02451, USA)存在下在半固體培養基中培養。針對生物肽-1及生物肽-2進行QC-ELISA驗證。在針對肽-1 (包衣生物肽-1)之第1次篩選中測試960個單一純系，且鑑別26個陽性純系。在第2次篩選中進一步研究32個純系(包括以上26個陽性純系)以鑑別特異性識別肽-1與肽-2之純系。在第2篩選中鑑別18個陽性純系。
藉由限制稀釋法對10個純系進行次選殖。在細胞融合篩選步驟中，基於ELISA效價選擇5個各來自小鼠13#及14#之純系：小鼠13#：1C10、3H9、4C10、4F1及5G6；小鼠14#：1F12、2C2、3D11、4F11及5H11。針對生物肽-1進行QC-ELISA驗證。鑑別8個結合至肽1之陽性純系，其中6個純系為單株。為鑑別更特定純系，對來自小鼠14#之其餘8個純系進行次選殖：1D2、1B9、1H3、2E3、2G8、2G12、3A1及4E4。針對生物肽-1進行QC-ELISA驗證。鑑別7個結合至肽1之陽性純系，其中4個純系為單株。在此等10個單株純系中，額外驗證展示US28-13-5G6-1D3純系之優良結合特性，選擇該等純系用於進一步研究。然而，亦進一步研究純系13-1C10-1C10、13-1C10-1G9、14-1H3-IA10、14-2C2-1G4及14-4E4-1E8。
US28-13-5G6-1D3純系之定序：
Creative Biolabs (Shirley, NY 11967, USA)的融合瘤定序服務用於獲得US28-13-5G6-1D3、13-1C10-1C10、13-1C10-1G9、14-IH3-1A10及14-4E4-1E8抗體的序列資訊。融合瘤定序係指獲得關於編碼特異性抗體之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)域之cDNA之序列資訊的方法。在定序之前，藉由RNA分離株提取所選融合瘤細胞之總mRNA (Cat. R401-01, Vazyme Biotech, Cellagen Technology LLC, San Diego, CA 92121, USA)。5'RACE方法，如Georgious等人所述[1]，用於擴增、選殖及定序完整特異性抗體可變區(VH及VL)以及非可變側接恆定區序列，其隨後選殖至兩個選殖載體中以用於下游序列操縱及表現載體構築。載體構築體接著使用桑格定序方法(Sanger sequencing method)定序且用於在HEK293-F細胞中表現重組抗體(rAb)。藉由蛋白G層析純化抗體且在瓊脂糖凝膠上用SDS-PAGE檢查結果。
其他抗體：
抗HIS HRP抗體自GenScrip, Piscataway, NJ 08854 (目錄號A00612)訂購。抗HIS FITC抗體自Thermofisher, Waltham, MA 02451, USA (Cat.MA1-81891)訂購。在兔中製成之市售多株抗US28抗體製劑自Mybiosource, San Diego, CA 92195 (目錄號MBS9606669)訂購。CMV即刻早期抗原Alexa488 Ab自Merck Life Sciences, Oslo, Norway (目錄號MAB810X)及MilliporeSigma, Burlington, MA 01803, USA (目錄號MAB810R)訂購。所使用之二級及IgG同型對照抗體自Thermofisher, Oslo, Norway訂購；山羊抗小鼠lgG-Alexa 488 (目錄號A11001)；山羊抗兔lgG Alexa 488 (目錄號A11008)；山羊抗小鼠lgG之同型對照(目錄號14−4714−82)；及山羊抗兔lgG (目錄號MA516384)。由Creative Biolabs自HEK293-F細胞用重組技術製造單價及二價VUN100 scFv。VUN100 ScFvs含有MYC標籤且用PE標記之抗Myc標籤二級抗體[9E10] (ab72468, Abcam)偵測。
實驗室細胞：
除重組抗體合成之外，使用中國倉鼠卵巢(CHO-K1)細胞(Creative Biolabs, Shirley, NY 11967, USA)過度表現US28蛋白以研究US28抗體之表面結合。HEK-293細胞亦用於過度表現US28且用於抗體結合研究。人類胚胎腎臟293-F (HEK293-F)細胞株用於表現US28-13-5G6-1D3重組抗體(rAb)(Creative Biolabs, Shirley, NY 11967, USA)及其他重組抗體(BioIntron公司, Shanghai, China)，不過大部分抗體使用CHO細胞重組製造。醫學研究委員會細胞株-5 (MRC-5)，其來源於人類胚胎肺纖維母細胞(目錄號CCL-171, RRID: CVCL_0440, 美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC), Manassas, VA 20110 USA)，用於研究與HCMV感染細胞之表面結合的抗體。市售周邊血液單核細胞(PBMC)係獲自三個血清反應呈陽性的健康供體(供體#509、# 526、# 230；Cellero, Bothell, WA 98021 USA)。
初級細胞：
來自不同組織來源的初級細胞在塗佈有3 mL基於明膠之塗佈溶液(Cellbiologeics, 6950)的T25燒瓶中培養且在37℃下放置1小時。在細胞接種之前抽吸過量溶液。用6 mL經預加熱之完全培養基製備15 mL離心管。將儲存於液氮中之初級細胞在37℃水浴中快速解凍＜1分鐘，且轉移至15 mL離心管中。細胞在1000 rpm下離心5分鐘，隨後抽吸上清液且將細胞集結粒再懸浮於6 mL完整培養基中。將再懸浮細胞添加至預塗佈T25燒瓶中，且在37℃下具有5% CO
2之含濕氣培育箱中培育。第二天更換培養基以移除非黏附細胞且每日重複補充營養物。當細胞匯合＞85%時，移除細胞培養基且自燒瓶丟棄。用無菌PBS (1×)洗滌黏附層2次。將細胞與2 mL溫熱(37℃) 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液一起培育3分鐘。細胞一經分離，即添加8 mL完全培養基以中和胰蛋白酶，隨後在37℃下，將其塗鋪於在潮濕的5% CO
2培育箱中的用基於明膠之塗佈溶液預塗佈的新鮮燒瓶中。第二天更換培養基以移除非黏附細胞，且每天在顯微鏡下檢查細胞以驗證適當細胞形態。如本文所述進行FACS分析。
US28表現構築體：
進行質體構築以產生過度表現US28之細胞株。US28序列等同於HCMV DB病毒株(寄存編號：KT959235；本申請案之SEQ ID No. 5)，在其C端部分融合至6His標籤，插入至pCDH-EF1a-MCS載體(Creative Biolabs, Shirley, NY 11967, USA)中。質體構築體經轉染至CHO-K1細胞株。轉染48小時後收集細胞。細胞株稱為CHO-US28-A1-6His且其蛋白質序列(SEQ ID NO: 47)如下：
亦以類似方式製造攜載TB40/E、VHL/E及Merlin構築體及突變US28病毒株之DNA的質體(分別為SEQ ID No: 254、272、273及255)。
SEQ ID NO: 254：
SEQ ID NO: 272：
SEQ ID NO: 273：
SEQ ID NO: 255：
MRC-5細胞之HCMV感染：
使MRC-5人類胚胎肺纖維母細胞第21至30繼代胰蛋白酶化，且將每個T75燒瓶1×10
6個細胞於達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)中塗鋪，該培養基補充有10%胎牛血清(FBS)、2 mM L-麩醯胺酸、0.1 mM非必需胺基酸、10 mM HEPES及各100 U/ml的青黴素及鏈黴素。使細胞保持未感染(模擬)或用HCMV病毒株Ad169感染(ATCC® VR538™, ATCC, VA 20110 USA)，感染倍率(multiplicity of infection，m.o.i.)為5。在添加病毒至各別細胞之後，細胞在37℃及5% CO
2下培育，直至細胞在感染後(p.i.)第4天(96小時pi)收集。藉由顯微法確認感染。
酶聯免疫吸附分析(ELISA)：
使微量滴定盤孔塗佈有100 µl溶液，該溶液含有(i)生物肽-N；或(ii)生物肽-1及生物肽-2；在塗佈緩衝液中呈在1-10 µg/ml之間之濃度，該緩衝液由1.5 g Na
2CO
3及2.93 g NaHCO
3於1 L pH 9.6蒸餾水中組成，且隨後將微量滴定盤孔在室溫下培育1-2小時。在由含有0.05% v/v Tween-20之PBS組成之洗滌緩衝液中洗滌培養盤3次，且隨後用紙巾吸取。將150 µl含有包含1% w/v BSA之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的阻斷溶液添加至各孔中且在37℃下培育該盤2小時。在洗滌緩衝液中洗滌孔4次，且在最後一次洗滌之後在紙巾上吸乾。將100 µl之抗體稀釋液添加至各孔中，且將盤在37℃下培育1小時，且隨後在洗滌緩衝液中洗滌3次。將100 µl酶結合之二級抗體(經洗滌緩衝液適當稀釋)添加至各孔中且在37℃下培育培養盤1小時。隨後再次在洗滌緩衝液中洗滌孔3次，且在最後一次洗滌之後用紙巾吸乾。將100 µl適當的基質溶液添加至各孔且在室溫下培育30分鐘，或直至達到所需顏色變化。在適當波長下立即讀取吸光度值且藉由CMax Plus, Molecular Devices, San Jose, CA 95134, USA分析資料。
西方墨點法：
西方墨點法用於驗證US28蛋白在CHO-US28-A1-6His細胞中之表現。收集之細胞及US28陰性對照CHO細胞用PBS洗滌兩次且添加具有1% PMSF之冰冷RIPA溶解緩衝液。使用塑膠細胞刮刀將黏附細胞平緩地自培養皿刮下，且將細胞懸浮液轉移至預冷卻之微量離心管中，在4℃下攪拌30分鐘。隨後將試管離心，且將上清液抽吸至新試管中。藉由BCA方法測定試管之蛋白質濃度。以相同體積添加由4% SDS、10% 2-巰基乙醇、20%甘油、0.004%溴酚藍及0.125 M Tris HCl組成之2X Laemmli緩衝液。藉由使樣本緩衝液中之裂解物沸騰來使樣本還原且變性。製備聚丙烯醯胺凝膠(12%)且將30-120 μg各樣本之蛋白質裝載至SDS-PAGE孔中。將蛋白質標記裝載於第一泳道中。用由25 mM Tris鹼、250 mM甘胺酸、0.1% SDS組成、調節至pH 8.3的1×操作緩衝液進行電泳，在30分鐘內在80 V電壓下且在1.5小時100電壓下進行。藉由將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜於甲醇中浸濕30秒且隨後將其短暫浸泡於蒸餾水中，隨後1×轉移緩衝液中來製備，該緩衝液含有25 mM Tris鹼、192 mM甘胺酸、20%甲醇，調節至pH 8.3。蛋白質隨後藉由夾心濕法在轉移卡匣中轉移至PVDF膜。將膜用1×Tris緩衝生理鹽水及Tween 20 (TBST)溶液洗滌且在含有1×TBST及10%脫脂奶粉之阻斷溶液中培育。接著用含5%脫脂奶粉之1×TBST將初級抗體稀釋至工作濃度且在室溫下培育1.5小時。用1×TBST洗滌膜三次，且添加二級抗體，進行與如上所述相同的培育及洗滌程序。將預混合化學發光基質溶液(Thermofisher, Waltham, MA 02451, USA, 目錄號34075)添加至膜上，其後用化學發光成像系統(BIO-RAD ChemiDocXRS+, Bio-Rad, Hercules, CA 94547, USA)成像1-90秒。
流動式細胞測量術(FACS)分析：
使用流動式細胞測量術分析US28抗體之細胞表面結合。在細胞收集後，用細胞染色緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS (Amresco, Cleveland, OH 44139, USA)，添加0.5% BSA及0.05%疊氮化鈉(NaN
3))洗滌黏著未感染及過度表現US28或HCMV感染細胞三次。使細胞胰蛋白酶化且隨後再懸浮於具有10% FBS之DMEM中以抑制胰蛋白酶作用。接著以400×g使細胞集結10分鐘，且在細胞染色緩衝液中洗滌三次。細胞存活率及細胞濃度藉由台盼藍(tryphan blue)存活率分析及細胞計數器(Countess, Invitrogen, Carlsbad, CA 92008, USA)量測。用冰冷細胞染色緩衝液將細胞懸浮液調節至1×10
6個細胞/毫升。細胞在每1×10
6個細胞1 ml含
10% FBS 或 1% BSA之PBS中阻斷，短暫渦旋且培育10至30分鐘以消除非特異性染色。細胞接著用各別抗體及適當陰性對照染色。
ECD1
所用初級抗體為I) 13-5G6-1D3 (50 μg/ml)作為陽性對照；及II)單價及二價VUN100 ScFvs 1:1 (50 μg/ml)，III)指定次純系之測試抗體(1:5)。
ECD3
所用初級抗體為I) 13-5G6-1D3 1:50至50 μg/ml；及II)市售US28多株抗體(50 μg/ml)、III)單價及二價VUN100 ScFv (50 μg/ml)，且對於某些實驗，包括適當同型對照。
在兩種情況下(ECD1及ECD3)，將抗體添加至細胞中，渦旋且在冰上培育15至30分鐘直至隔夜且用細胞染色緩衝液洗滌兩次以移除任何未結合之抗體。另外，在一個實驗中包括CMV即刻早期抗原(IE) Alexa488 Ab，MAB810X，1:50來驗證HCMV感染細胞。由於其結合至胞內HCMV編碼之蛋白質，因此其係在用70%乙醇滲透細胞30分鐘之後在冰上添加。
添加細胞染色緩衝液中1:500-1:5000的適當螢光結合之適當二級抗體且在冰上於暗處培育15-20分鐘。洗滌細胞三次以移除任何未結合抗體。隨後將細胞用0.5%多聚甲醛(PFA)在冰上固定30分鐘，且再懸浮在200-500 µL細胞染色緩衝液中用於使用Accuri C6流動式細胞測量術系統(BD Biosciences, San Jose, CA 95131, USA)進行最終流動式細胞測量分析。使用FlowJo軟體v8.8 (Treestar公司 Ashland, OR 97520, USA)進行資料分析。
人類石蠟包埋組織陣列：
含有CMV陽性肺組織及CMV陰性子宮肌層的巨細胞病毒(CMV)對照載片(產品編號#3240A)係獲自Newcomer Supply公司, Middleton, WI 53562-2579, USA。組織微陣列(TMA)係獲自US Biomax公司, Derwood, MD 20855, USA，且包括腫瘤組織# BR1008b、# BS17016c、# BCN721b及正常組織# FDA662a及心臟組織# HEN241a。
免疫組織化學(IHC)分析：
將石蠟切片依序浸入至a.100%二甲苯三次(各5分鐘)；b.100%乙醇兩次(各2分鐘)；c.95%乙醇兩次(各2分鐘)。載片於水中沖洗兩次歷時5分鐘以移除乙醇。為了抗原檢索，將載片浸沒在3% H
2O
2中5分鐘且其後用蒸餾水洗滌兩次(2×)。隨後將載片浸沒於工作檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中且用蓋子蓋上。在微波中加熱緩衝液直至其已沸騰，且隨後保持於蒸鍋中15分鐘。
將切片在室溫下冷卻30分鐘且用PBS洗滌。隨後將5% BSA阻斷溶液添加至經HIER處理之樣本中且將其在37℃下培育30分鐘。根據由稀釋梯度測試得到之最佳結果稀釋初級抗體且將其添加至樣本中用於在4℃或37℃下培育隔夜持續1小時。接著在PBS中在震盪器上洗滌載片三次。二級抗體以1:200稀釋度使用，添加至樣本中且在37℃下培育30分鐘。在PBS中在震盪器上洗滌載片三次(每次5分鐘)。添加卵白素生物素複合物(SABC) HRP或AP結合試劑，且將樣本在黑暗中在室溫下培育。隨後將樣本在蒸餾水中洗滌，藉由蘇木精對比染色，且隨後經由梯度乙醇自70%至100%脫水，且在二甲苯中清除3次，各5分鐘。載片由ACRYMOUNT (StatLab, MicKinney, TX 75069, USA)固定且滑動蓋玻片。數位化圖片由Olympus VS120掃描儀取得且藉由資深病理學家使用OlyVia 3.2軟體(Olympus Corporation, 20101 Tokyo, Japan)分析。
原位雜交 (ISH)
CMV ISH探針(目錄號：ISHP-031，Creative Bioarray)經設計用於藉由顯色原位雜交(CISH)偵測福馬林固定、石蠟包埋之組織或細胞中的巨細胞病毒(CMV) DNA。CMV探針使用NICK方法，利用CMV IE1基因載體用地高辛(Digoxin)標記。
載片首先藉由在85℃下烘烤載片15分鐘來預處理，其後在室溫下將載片浸沒於新鮮二甲苯中兩次，持續5分鐘。載片接著在室溫下在100%、85%、75%乙醇中脫水，各3分鐘且浸沒於PBS中2分鐘。
隨後藉由使載片浸沒於0.2 M HCl中12分鐘來用蛋白酶預處理載片。在PBS中添加0.5% Triton X100且培育載片12分鐘。載片用1×PBS洗滌2分鐘，接著浸沒於20 µg/ml蛋白酶K中15分鐘，隨後再次用1×PBS洗滌兩次2分鐘。此後，將載片浸沒在3% H
2O
2中15分鐘，用1×PBS洗滌兩次，歷時2分鐘且風乾。
為了製備含有探針之雜交緩衝液，將1 µl探針儲備溶液添加至50 µl的雜交緩衝液中，且接著渦旋且離心。ISH探針在85℃下變性10分鐘且保持在37℃下30分鐘。在載片乾燥90+分鐘之後，將200 µl含有探針之雜交緩衝液分配至載片之組織切片上。將乾淨的24×60 mm矩形玻璃蓋玻片小心地置放於雜交溶液上以完全覆蓋組織切片且使雜交溶液分佈均勻。將載片置於潮濕腔室中，用組織培養蓋覆蓋，且用封口膜密封腔室。載片在黑暗中在37℃下培育20-36小時。
在自切片移除蓋玻片之後，藉由在2×SSC中浸沒載片5分鐘進行原位洗滌。在37℃下，使載片與3% BSA溶液一起培育30分鐘，且隨後在37℃下與抗DIG-HRP溶液(於1% BSA中1:100稀釋)一起培育30分鐘。隨後載片首先用2×SSC洗滌兩次，持續2分鐘，且隨後用1×PBS洗滌兩次，持續5分鐘。此後，將載片與DAB溶液一起培育2-10分鐘且在流動自來水中洗滌。將載片浸沒在蘇木精中以對比染色3-5分鐘且再次在流動自來水中洗滌。載片最後在室溫下在100%乙醇中脫水1分鐘且風乾，且接著在室溫下浸沒於二甲苯中10分鐘。使用含水固定溶液來固定該等部分。
使用配備有40×物鏡之Nikon 80I顯微鏡獲取亮場影像。
結果 抗體設計：
HCMV編碼之US28蛋白具有4個胞外域(ECD)，其中第2及第3 ECD及第4 ECD之部分在不同HCMV病毒株之間高度保守。雖然HCMV US28之N端部分(ECD1)含有頻繁突變(例如，各種經鑑別之N端區突變展示於本申請案之表3中)，但在本申請案中用於產生針對ECD1之結合分子的肽代表尤其保守之潛在新抗原決定基，且因此顯示有望成為用於開發針對HCMV編碼之US28蛋白、對US28具有高度特異性、亦有潛力提供病毒株未定性結合性的抗體的適當免疫原。
用5次加打KHL連接之HCMV US28 ECD2及ECD4肽重複免疫接種小鼠出乎意料地產生較低(若存在)抗體力價。此等肽之免疫接種的低品質藉由MS及HPLC分析確認。
對於用於免疫接種之ECD1衍生肽之設計，吾等考慮不同HCMV病毒株之間的基因變化。使用BLAST搜索，且吾等鑑別出在多個HCMV臨床病毒株中尤其很好保守之N端的一部分。HCMV US28 ECD1肽-N (SEQ ID NO: 177)經選擇作為用於進一步開發可識別一系列HCMV病毒株的病毒株未定性抗體的免疫原，藉此產生表示為2F5B11、2G2B3、4A11A11、4H3C3、5D6H11、5E1E4、5E8F7、6G3D6、7B1F3及9G3B9之10個次純系，經鑑別結合至生物肽-N。
對於用於免疫接種之ECD3衍生肽之設計，吾等考慮不同HCMV病毒株之間的基因變化。使用BLAST搜索，且吾等鑑別出US28 ECD3之第4胺基酸存在單一D至N變化。90%隨機選擇之100個HCMV臨床病毒株含有US28 ECD3 4D變體，而10%具有US28 ECD3 4N變體。在展示US28 ECD3 4N變體之病毒株中，HCMV DB (寄存編號：KT959235)、TR (寄存編號：KF021605.1)臨床病毒株及Toledo (寄存編號：GU93774)實驗室病毒株(表1)，其均基於其US28序列，攜載HCMV A1病毒株基因型[2]。
含有兩種基因變體之HCMV US28 ECD3肽-1及肽-2 (分別為SEQ ID NO: 6及7)選定為用於進一步發展可識別免疫小鼠中之4N及4D基因型的病毒株未定性抗體的免疫原。在自五隻免疫小鼠鑑別之總共＞1000個融合瘤純系中，獲得32個陽性純系，其中鑑別出18個陽性純系特異性識別肽-1及肽-2。此等之次選殖產生15個陽性純系，其經鑑別結合至生物肽1，其中10個純系為單株。
抗US28純系之結合特性：
為測試所得十個單株HCMV US28抗體純系，藉由將編碼來自HCMV病毒株DB之US28的DNA序列與C端6His標籤(胺基酸序列SEQ ID NO: 47)一起插入至pCDH-EF1a-MCS載體中且接著將載體構築體轉染至CHO-K1細胞中來產生過度表現US28蛋白之細胞株。之後，過度表現US28之細胞稱為CHO-US28-A1細胞。
經由西方墨點分析，藉由使用結合在添加至US28-A1蛋白質構築體之C端部分的6HIS標籤上之抗HIS抗體來驗證US28蛋白在經轉化之CHO-US28-A1細胞中之成功表現。抗HIS抗體以約41 kDa標記出特定條帶，其與HCMV US28之先前報導之蛋白質尺寸等效，且其不存在於對照CHO細胞上，由此指示US28蛋白在經轉染之CHO-US28-A1細胞中但不在對照CHO細胞中之表現(圖1)。
ECD1
對所獲得之十個單株ECD1結合抗體純系(以1:5 w/v Ab稀釋度)進行FACS分析以量測此等純系與CHO-US28-A1細胞表面上之HCMV US28跨膜蛋白之表面結合。所有純系展示與CHO-US28之特異性結合。不具有任何抗體及僅具有小鼠二級抗體之陰性對照視為陰性。1D3-mFc (50 mg/ml)及1:1比率之單價及二價VUN100 (50 μg/ml)用作陽性對照。
ECD3
對所獲得之十個單株抗體純系(以1:50 w/v Ab稀釋度)進行FACS分析以量測此等純系與CHO-US28-A1細胞表面上之HCMV US28跨膜蛋白之表面結合。純系US28-13-5G6-1D3展示最佳結合結果，其比任何其他9個純系(資料未示出)優異(結合性比CHO-US28-A1細胞高約8-10倍)。不具有任何抗體及僅具有小鼠二級抗體之陰性對照視為陰性(圖2)。
CHO-US28-A1細胞上之純系US28-13-5G6-1D3之陽性表面結合進一步藉由梯度稀釋(1:20、1:50、1:200，以w/v表示)來驗證，展示抗體結合之直接相關性(圖3)。在若干實驗中確認與CHO對照細胞之表面結合較低(結合性降低超過15倍)，指示純系US28-13-5G6-1D3 Ab與表現US28之CHO細胞之表面的結合具有高度特異性(圖4)。
原始ELISA分析展示US28-13-5G6抗體純系針對肽1 (US28 ECD3基因型4N)及肽2 (US28 ECD3基因型4D)之相等定性結合親和力(圖5)。此等結果指示所產生US28-13-5G6-1D3抗體純系可良好且特異性地結合於過度表現HCMV US28蛋白之CHO細胞之表面上，且US28-13-5G6-1D3抗體與其目標之結合為HCMV病毒株未定性。
US28-13-5G6-1D3 rAb之產生及驗證
為了能夠重組產生US28-13-5G6-1D3抗體，對編碼US28-13-5G6-1D3之融合瘤純系進行定序。參考下文所描述之序列鑑別編號(「SEQ ID NO」)，鑑別US28-13-5G6-1D3抗體之以下序列：
| DNA序列 | 蛋白質序列 | ||
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 34 | SEQ ID NO: 20 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 35 | SEQ ID NO: 21 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 25 | SEQ ID NO: 11 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 26 | SEQ ID NO: 12 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 31 | SEQ ID NO:17 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 32 | SEQ ID NO: 18 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 22 | SEQ ID NO: 8 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 23 | SEQ ID NO: 9 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 24 | SEQ ID NO: 10 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 28 | SEQ ID NO: 14 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 29 | SEQ ID NO: 15 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 30 | SEQ ID NO: 16 |
對應於上述SEQ ID NO之序列在本申請案之標題為「序列」之部分中給出，其在此等實例之後。
定序分析證實，US28-13-5G6-1D3之亞型最可能為IgG1κ。US28-13-5G6-1D3 DNA序列插入兩個選殖載體中且轉染至HEK293-F細胞株中用於重組生產。藉由定性ELISA針對生物肽-1及生物肽-2測試所得重組抗體產物US28-13-5G6-1D3 rAb之結合，展示與US28 ECD3基因變體再次相等、較強及較高的結合親和力，確認重組抗體亦展示HCMV病毒株未定性特性(圖6)。
此後驗證13-5G6-1D3 rAb與CHO-US28-A1細胞之表面結合且針對來自其他候選融合瘤純系(13-5C6-1B5、13-5G6-1D3培養物、13-4C10-1D8、14-1H3-1A6、14-2C2-1A7、14-2E3-1A12、14-4E4-1B3)(資料未示出)之抗體比較。與來自13-5G6-1D3純系之抗體的早期測試結果類似，結果展示13-5G6-1D3 rAb與CHO-US28-A1細胞之最高結合。
對13-5G6-1D3 rAb與CHO-US28-A1細胞及各別對照CHO細胞以1:10、1:50及1:100稀釋度(w/v)之表面結合的進一步FACS驗證展示13-5G6-1D rAb結合於16.55%的表現US28之細胞的表面上，且吾等針對13-5G6-1D3 rAb進行測試的最佳染色稀釋度為：1:50 (w/v)。在1:10稀釋度(w/v)下量測13-5G6-1D rAb與對照CHO細胞之表面結合，此為應增強對任何非特異性結合之偵測的高濃度，且在移除與空白及抗小鼠lgG-Alexa 488二級Ab對照物之結合之後，亦展示僅結合至0.77%對照CHO細胞(圖7)。當與對照CHO細胞相比時，此等結果展示的高＞21倍之表面結合與其他吾等在表現US28之CHO細胞上藉由13-5G6-1D3 Ab純系獲得的特異性結果完全一致(圖4)。吾等針對US28之ECD3產生的若干其他抗體純系亦展示對表現US28之細胞的較大特異性(與針對US28陰性對照CHO細胞觀測到的結合程度相比，表現US28之CHO細胞的結合特異性因數大大約11倍至26倍)，因此確認ECD3肽為US28結合抗體的特異性目標(表2)。
ECD1 結合分子之產生及驗證為了能夠重組產生4H3C3、7B1F3及2F5B11抗體(經選擇為示例性ECD1結合分子)，對相應編碼之融合瘤純系進行定序。
參考下文所描述之SEQ ID No，鑑別4H3C3抗體之以下序列：
參考下文所描述之SEQ ID No，鑑別7B1F3抗體之以下序列：
參考下文所描述之SEQ ID No，鑑別2F5B11抗體之以下序列：
對應於上述SEQ ID No之序列在本申請案之標題為「序列」之部分中給出，其在此等實例之後。亦用經定序之次純系進一步分析額外次純系2G2B3。
定序分析證實，4H3C3、7B1F3及2F5B11之亞型最可能為IgG1κ。4H3C3、7B1F3及2F5B11 DNA序列分別插入兩個選殖載體中且轉染至HEK293-F細胞株中用於重組生產。藉由定性ELISA針對測試純系抗體產物4H3C3、7B1F3及2F5B11 rAb之結合，展示與US28之再次相等、較強及較高的結合親和力。
| 4H3C3 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 178 | SEQ ID NO: 180 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 179 | SEQ ID NO: 181 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 182 | SEQ ID NO: 186 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 183 | SEQ ID NO: 187 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 184 | SEQ ID NO: 188 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 185 | SEQ ID NO: 189 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 190 | SEQ ID NO: 196 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 191 | SEQ ID NO: 197 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 192 | SEQ ID NO: 198 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 193 | SEQ ID NO: 199 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 194 | SEQ ID NO: 200 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 195 | SEQ ID NO: 201 |
| 7B1F3 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 202 | SEQ ID NO: 204 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 203 | SEQ ID NO: 205 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 206 | SEQ ID NO: 210 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 207 | SEQ ID NO: 211 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 208 | SEQ ID NO: 212 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 209 | SEQ ID NO: 213 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 214 | SEQ ID NO: 219 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 215 | SEQ ID NO: 220 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 216 | SEQ ID NO: 221 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 251 | SEQ ID NO: 199 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 217 | SEQ ID NO: 222 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 218 | SEQ ID NO: 223 |
| 2F5B11 | DNA序列 | 蛋白質序列 | |
| 完整重鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 224 | SEQ ID NO: 226 | |
| 完整輕鏈(包括前導序列) | SEQ ID NO: 225 | SEQ ID NO: 227 | |
| V H鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 228 | SEQ ID NO: 232 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 229 | SEQ ID NO: 233 | |
| V L鏈 | 不成熟 | SEQ ID NO: 230 | SEQ ID NO: 234 |
| 成熟 | SEQ ID NO: 231 | SEQ ID NO: 235 | |
| V H-CDR1 | SEQ ID NO: 236 | SEQ ID NO: 242 | |
| V H-CDR2 | SEQ ID NO: 237 | SEQ ID NO: 243 | |
| V H-CDR3 | SEQ ID NO: 238 | SEQ ID NO: 244 | |
| V L-CDR1 | SEQ ID NO: 239 | SEQ ID NO: 199 | |
| V L-CDR2 | SEQ ID NO: 240 | SEQ ID NO: 245 | |
| V L-CDR3 | SEQ ID NO: 241 | SEQ ID NO: 246 |
此後驗證4H3C3、7B1F3及2F5B11純系Ab與CHO-US28-A1細胞之表面結合。與來自4H3C3、7B1F3及2F5B11次純系之抗體的早期測試結果類似，結果展示4H3C3、7B1F3及2F5B11 rAb與CHO-US28-A1細胞之最高結合。
US28-13-5G6-1D3 rAb與經HCMV感染之MRC-5細胞的結合
吾等隨後研究US28-13-5G6-1D3 rAb是否能夠特異性結合至HCMV感染細胞之表面。已知HCMV進入、複製且在人類纖維母細胞中引起裂解感染[3]。吾等因此用HCMV Ad169實驗室病毒株在5 m.o.i.下感染人類MRC-5細胞，且在第4天p.i. (96 hpi)收集細胞。如藉由顯微鏡所觀察，在大部分細胞中，細胞展示裂解HCMV感染之典型徵象(以平坦、腫脹細胞為特徵之巨細胞)。
藉由使用流式細胞儀分析將US28-13-5G6-1D rAb與HCMV Ad169感染細胞之表面結合與用適當IgG同型對照染色之經感染細胞以及未感染之經培養MRC-5細胞(模擬)相比較。結果展示US28-13-5G6-1D rAb在HCMV Ad169感染之MRC-5細胞之表面上的特異性結合，但不在模擬細胞上(圖8-9)。
為了驗證13-5G6-1D rAb結合於HCMV感染細胞群之表面，另一組HCMV Ad169感染之細胞及模擬細胞用針對HCMV主要即刻早期(IE)抗原之市售抗體MAB810X滲透且染色，該抗原為已知在裂解HCMV感染期間較早表現之胞內蛋白[3]。在FACS分析中，MAB810X抗體染色與US28-13-5G6-1D3 rAb相同的經HCMV感染之MRC-5細胞群，未觀測到任一抗體對未感染細胞之染色，確認了US28-13-5G6-1D3 rAb所展現的表面結合對HCMV感染細胞具有特異性(圖8A及B)。
在與山羊抗小鼠lgG-Alexa 488一起培育之前，藉由使用在小鼠(IgG同型對照)中製備之非免疫血清代替初級抗體來測試US28-13-5G6-1D3 rAb之非特異性結合。結果展示與同型對照相比，經HCMV感染之MRC-5細胞藉由US28-13-5G6-1D3 rAb之染色偏移，而未感染細胞之染色(模擬)類似於IgG同型對照。綜合而言，此等結果展示，與未感染細胞相比，US28-13-5G6-1D3 rAb特異性結合(高約16倍的特異性)至HCMV感染細胞之表面(圖9)。
應注意，HCMV Ad169實驗室病毒株編碼US28之4D變體(SEQ ID NO: 42)，因為其在ECD3序列之第4胺基酸處展現D；與由DB病毒株編碼之4N變體相反，DB病毒株為先前實驗中所論述之用於產生CHO-US28-A1細胞之序列。US28-13-5G6-1D3與US28之4D及4N變體的結合，如本發明實例中所證實，為所提供之病毒株未定性結合特性的明確指示。
人類PBMC上的US28-13-5G6-1D3結合
CD34+前驅細胞及其衍生物，包括顆粒球巨噬細胞前驅細胞及CD14+單核球中之長期潛伏HCMV攜載物提供可在血清反應呈陽性的個體中再活化之HCMV儲集器[4]。隨後藉由使用與吾等先前研究相同之流動式細胞測量術方案研究US28-13-5G6-1D3 rAb是否可結合至來自三個HCMV血清反應呈陽性的個體(供體1-3)之初級PBMC。結果展示來自三個供體之PBMC細胞的US28-13-5G6-1D3 rAb之表面結合分別為18.37%、3.57%及5.25% (圖10)。在所研究PBMC中，僅CD11+、CD14+及CD16+陽性細胞可為HCMV之攜載體，且此等細胞標記可在不同單核細胞中部分重疊。取決於個人及情形，潛伏感染之細胞群添加至約15%但可變化。因此，分別在供體1、2及3中觀測到的US28-13-5G6-1D3 rAb在18.37%、3.57%及5.25%之總PBMC上之表面結合證實與實質性比例之HCMV攜帶者之PBMC的結合。此等結果與PBMC亞型無關，但指示US28-13-5G6-1D3 rAb可與潛伏HCMV感染細胞之表面結合。
市售US28抗體
購買市售多株US28 Ab以比較其結合特性與US28-13-5G6-1D3 Ab。
測試市售US28多株Ab與CHO-US28-A1細胞之結合且同US28-13-5G6-1D3 rAb與相同細胞之結合進行比較。US28-13-5G6-1D3抗體結合至超過50%之CHO-US28-A1細胞，而市售US28 Ab僅在同一實驗中染色10%細胞(圖11A)。吾等隨後在經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞上測試市售US28 Ab，其中其展示對HCMV感染群體之特異性結合。然而，此抗體亦染色未感染模擬細胞，與IgG同型對照物相比約兩倍，指示未感染MRC-5細胞之表面上的非特異性結合(圖11B)。另外，當潛伏感染細胞添加至約15%時，市售US28抗體在人類初級PBMC上之結合在所有三種測試樣本中＞80%，指示與此細胞群之非特異性結合(資料未展示)。因此，在HCMV Ad169感染之MRC-5細胞上觀測到的市售US28抗體之特異性結合作用的一部分可由此非特異性表面結合組分產生。
單價與二價VUN100之比較
WO 2019/151865，如亦在等效期刊文章De Groof等人, 2019 [5]中所報導，描述由稱為VUN100之特定VHH示例的針對US28之單重鏈可變域抗體(VHH)。VUN100 (其序列提供為本申請案之SEQ ID NO: 60)展示結合於不連續抗原決定基，該不連續抗原決定基在US28之N端胞外區(位置1-37，在本文中亦稱為ECD1)中包含多個結合位置，且進一步受US28之第三細胞外環(ECL3，位置250-273，亦在本文中稱為ECD4)之存在影響，如WO 2019/151865之實例3 (第36頁，第11-32行)及De Groof等人, 2019 [5]之圖2之圖例中所論述。De Groof等人, 2019 [5]在其支持資訊，其圖S1.A (且概述在本申請案之表2中)中報導VUN100 Ab與HEK293-F模擬細胞之表面結合(約20%)，特異性分數為4。相比於使用針對US28的ECD3產生的抗體(包含抗體13-5G6-1D3、13-5C6-1B5及14-1H3-1A6)獲得的持續較高程度的特異性分數(其始終展現在11-26之範圍內的特異性分數(表2))，顯著區分表現US28之細胞及US28陰性細胞的能力(僅約4的特異性分數)為次佳的，即使在選擇高抗體濃度以使任何非特異性結合最大化時，且甚至使用更市售化相關(較低)抗體濃度展現更高特異性分數(圖7)。
VUN100報導之低特異性分數引發關於其對HCMV感染細胞提供特異性靶向作用，同時避免健康細胞中之脫靶副作用的能力之擔憂。提供針對US28之ECD3的高度特異性結合分子，在將具有高度特異性之細胞毒性活性引導至HCMV感染細胞之情形下，諸如藉由使用包含本文所提供之結合分子之US28結合活性的BiTE及/或CAR-T細胞，該等結合分子實質上避免健康細胞中不可接受之脫靶結合程度，為本發明的一個特別關注點。VUN100報導之特性指示其缺乏引導具有高度特異性之細胞毒性活性至HCMV感染細胞的適合性。其亦引發與本發明之高度特異性結合分子對比，關於VUN100在分析(包括診斷分析，諸如用於免疫組織化學(IHC))中可靠地鑑別表現US28之細胞(特定言之，HCMV感染細胞)之情況下適用的能力的問題。
在WO 2019/151865及等效期刊文章De Groof等人, 2019, 《分子藥物學》,
16: 3145-3156中，作者參考VUN100且指示特異性偵測GBM組織中之US28且抑制配位體依賴性及組成性US28活性的能力，且因此削弱原位異種移植模型中活體外及活體內US28依賴性GBM生長。
然而，為了利用US28作為治療目標，尤其出於將細胞毒活性引導至展示US28之表面表現之細胞的目的，重要的係克服如先前所描述之最重要障礙，不僅包括已針對此項技術中已知之VUN100分子報導之相對較高程度之非特異性結合活性，而且提供US28結合分子解決病毒株多樣性、病毒突變、突變漂移及病毒在病毒潛伏期間自免疫系統隱藏之能力的問題。
因此，已在結合於US28之ECD3的本發明之結合分子(諸如13-5G6-1D3)與已報導與存在於US28之N端及ECD4內的不連續抗原決定基結合的WO 2019/151865及De Groof等人, 2019 (同上)之VUN100 Ab及/或De Groof等人, 2020(同上)之VUN100b二價分子之間比較。
在來自HCMV病毒株DB (作為代表性4N變體)或HCMV病毒株TB40/E (作為代表性4D變體)的重組表現US28序列之CHO細胞中進行比較，且使用非重組CHO細胞作為對照。如上文所指出，本申請人已鑑別，HCMV病毒株可參考其ECD3序列進行分類，且一般屬於作為4N-或4D變體之範疇(分別為大約10%/90%分裂)，且因此所示例之DB及TB40/E病毒株代表在此等兩個分組內之許多其他病毒株。因此，展示4N變體及4D變體之交叉反應性指示對於廣泛範圍之HCMV病毒株之病毒株未定性結合性。
用以下初級抗體對感染細胞株中之每一者進行FACS分析(如上所述)：(i) 13-5G6-1D3；(ii)單價(縮寫為「Mv」) VUN100；及(iii)二價VUN100 (縮寫為「BvVUN100」且亦稱作VUN100b)。細胞結合表示為群體中與抗體結合之細胞的百分比。
對於CHO陰性對照觀測到低結合百分比，單價VUN100展示2.25%背景結合，二價VUN100展示1.06%背景結合，且13-5G6-1D3 (圖中縮寫為「1D3」)展示0.88%之最低背景結合(圖21A)。此等資料表明與VUN100抗體相比，示例性ECD3結合抗體13-5G6-1D3對未感染CHO細胞具有較低背景結合。
在表現由HCMV之DB病毒株編碼之US28的CHO細胞(示例性4N變體)中，觀測到所有測試抗體之結合增加，其中單價VUN100與6.91%之群體結合，二價VUN100與9.24%之群體結合，且13-5G6-1D3與16.65%之群體結合(圖21A)。此展示，除具有比單價或二價VUN100低的背景結合以外，13-5G6-1D3亦實質上具有較高的與表現US28之DB形式之CHO細胞的結合。當表示為CHO對照細胞與表現US28之DB形式之CHO細胞之間的結合增加%時，此為13-5G6-1D3之顯著改良之特異性的指示(圖21B)。此等資料表明示例性ECD3結合抗體13-5G6-1D3與感染有HCMV之4N變異株之CHO細胞的特異性結合提高。
類似地，當比較表現US28之TB40/E形式(示例性4D變體)之CHO細胞中的結合與結合至CHO對照細胞時，資料明確展示示例性ECD3結合抗體13-5G6-1D3與表現US28之TB40/E形式(圖21A)之CHO細胞之較高結合及比單價及二價VUN100兩者極大改良之特異性(圖21B)。
此等資料亦提供病毒株未定性結合活性之相對含量的指示。
可比較組中不同抗體對表現US28之DB形式(ECD3中之示例性4N變體)與US28之TB40/E形式(ECD3中之示例性4D變體)之CHO細胞中之結合程度。如圖21A中所示，與單價VUN100之4N變體相比觀測到與4D變體之結合減少，自6.91%降至4.33%之群體。同樣地，二價VUN100展示減少之結合，自9.24%降至5.2%之群體。此等結果與WO 2019/151865中之發現一致。然而，有趣地，示例性ECD3結合抗體13-5G6-1D3相比於4N變異株具有進一步改良之特異性結合，自16.65%稍微增加至18.25%之群體。
圖21C展示測試組中之不同抗體與細胞群之結合之絕對含量，在與表現US28之DB及TB40/E形式之CHO細胞之結合之間的變化%。自此等數據顯而易見，視衍生出US28序列之HCMV之病毒株而定，單價及二價VUN100兩者之結合能力存在相當大的差異(分別大於35%及大於40%)。相比之下，獲得US28蛋白之HCMV病毒株一致性在小得多的程度上影響示例性ECD3結合抗體13-5G6-1D3之結合，差異小於10%。
當比較來源於HCMV之此等不同病毒株之US28時，亦可分析此等資料以確定對於US28之結合活性之保留率。圖21D展示示例性ECD3結合抗體13-5G6-1D3在此等病毒株之間保持基本上100%之結合活性，而取決於獲得US28蛋白之HCMV病毒株一致性，VUN100單價及二價形式僅保持約或低於60% (亦即，損失約或超過40%)。
圖21E中亦明顯地說明視獲得US28之HCMV之病毒株而定的結合能力之此等差異，其中基於針對13-5G6-1D3分別與US28之同一形式之結合標準化的值，計算單價及二價VUN100中之每一者分別與來自每一所測試HCMV病毒株之US28結合的能力。當以此方式標準化時，單價及二價VUN100各自與針對13-5G6-1D3所觀察到的結合的相互依賴性變化清楚地可見。
此等資料表明，儘管單價及二價VUN100抗US28抗體對於US28具有很大程度上受編碼US28之HCMV病毒株影響之結合活性，相比之下，本發明之示例性ECD3結合抗體13-5G6-1D3為有效地病毒株未定性，其中對於HCMV之4N-及4D變體兩者具有高結合程度。
此等資料進一步展示，病毒株未定性抗原決定基序列(「SAES」)存在於US28內，本發明之ECD3結合分子可利用以保持對多種不同HCMV病毒株之高結合特異性。因此，本發明之結合分子靶向先前尚未靶向之有利抗原決定基，亦即US28之ECD3內之SAES。相比之下，與N端區及ECD4內之不連續抗原決定基結合的此項技術之VUN100分子具有相對較高的背景(脫靶)結合、實質上較低的特異性，且顯示HMCV病毒株依賴型結合特性。
此等比較結果證實，如US28-13-5G6-1D3 rAb所示例，結合至US28之ECD3內之SAES的本發明抗體在所測試之所有細胞株及細胞上顯示高度US28特異性表面結合特性，而兩種參考抗體：市售多株US28 Ab及VUN100 Ab單株抗體在US28陰性對照細胞之表面上顯示高度非特異性結合。因此，已根據本文所描述之方案針對US28之ECD3產生的抗體，如特定地藉由US28-13-5G6-1D3 rAb所示例，且藉由本申請案中所描述之方法獲得的其他抗ECD3抗體係根據吾等知識，能夠以高度特異性且又未定性方式結合於US28表現宿主HCMV病毒株之表面上的唯一當前現有抗體。
與人工產生之US28突變病毒株結合
US28在其序列內具有可突變之許多已知點(參見表3)。此外，已知諸如HCMV之病毒突變以適應療法。舉例而言，纈更昔洛韋對病毒經由突變產生抗性敏感(Boivin等人, 2012；Göhring等人, 2015；及Jung等人, 2019)。因此，製備US28之突變型式，其包括其序列內所有已知點處之突變(在本文中稱為「突變」形式)，以模擬HCMV病毒株內可能未來基因偏移之極端形式。序列在本文中提供為SEQ ID NO: 173，且相較於由HCMV病毒株DB (SEQ ID NO: 5)編碼之US28序列具有以下突變：P3Q、T7del (亦即缺失)、A8T、E18L、A19G、T21A、P22L、V24T、F25L、V35I、N170D、V250L、F265S、R267K。
在示例性ECD3結合分子1D3與不結合至ECD3之VUN100分子之間比較與經工程改造以表現突變形式之CHO細胞(「CHO突變病毒株」)之結合(參見圖21A)。
有趣地，藉由單價VUN100觀測到，未偵測到突變病毒株高於CHO陰性對照之結合(與此等實驗中對照CHO細胞之2.25%結合相比，1.41%結合於突變病毒株)，表明單價VUN100與表現US28之細胞相比實際上更強地結合於脫靶細胞。此進一步說明於圖21B中，其展示單價VUN100對CHO突變病毒株之特異性小於1 (亦即，其結合於突變表現US28之細胞比對照細胞少)。
二價VUN100呈現2.58%與表現US28之突變形式之細胞的極低結合，其僅為相比於對照CHO細胞提高1.52% (圖21A)，此對應於與表現US28之突變病毒株形式之細胞的結合僅2.43倍(圖21B)。
相比之下，與0.88%對照細胞相比，本發明之示例性ECD3結合分子13-5G6-1D3 (「1D3」)與表現突變US28形式之細胞保持高度結合，為12.93% (圖21A)，與對照細胞相比，與表現US28突變形式之細胞的結合程度幾乎為15倍(圖21B)。
此等資料證實，雖然先前技術之VUN100分子(其結合於US28之N端區及ECD4內之不連續抗原決定基)可能對結合特性及特異性之變化高度敏感，視病毒突變而定(例如發展產生抗性時)，本發明之ECD3結合分子(諸如1D3)具有針對所鑑別之病毒株未定性抗原決定基序列(「SAES」)的結合，且此允許本發明之抗ECD3結合分子維持高程度之特異性結合至US28之其他突變病毒株。因此，基於此等資料，與將例如如WO 2019/151865、De Groof等人，2019，同上及De Groof等人，2020，同上中所描述之VUN100抗體相比，HCMV較不可能經由突變對ECD3結合分子產生抗性。此係本發明之ECD3結合分子優於諸如纈更昔洛韋之其他HCMV療法的另一優勢。
實例 2 ：其他ECD3抗體與HCMV之4N及4D變體結合
鑒於實例1中之發現，吾等假設使用4N及4D生物肽，以以上方式產生及選擇針對US28之ECD3的抗體及其他結合分子之過程提供有益結合特性，包括由於在ECD3內使用經鑑別之病毒株未定性抗原決定基序列(「SAES」)而引起的病毒株未定性結合性。
為了確認此假設，使用與先前所述相同之方法產生其他次純系，且隨後藉由ELISA測試與兩種肽變體之結合(如上文所描述，參見
分析 1)。如前所述，此ELISA分析中所用之肽序列為生物肽1，其具有序列TKKNNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 6，對應於ECD3之4N變體)，及肽2，其具有序列TKKDNQCMTDYDYLEVS (SEQ ID NO: 7，對應於ECD3之4D變體)。
總共測試28個次純系，其針對US28的ECD3產生特異性。得到次純系之純系之細節可見於表4中。如先前所描述，「13」及「14」指示小鼠13及小鼠14。次純系可因此藉由將次純系標識標記於相應純系標識之末端且不包括「US28」而充分表徵為例如13-1C10-1A2，此僅表示產生針對US28具有特異性之純系。
表 4：ECD3結合分子之純系及次純系.
| 純系標識 | 次純系標識 |
| US28-13-1C10 | 1A2、1A8、1B9、1B11、1C10、1D3、1G8、1G9 |
| US28-14-1H3 | 1A10、1C10、1C11、1C12、1D2、1E1 |
| US28-14-2C2 | 1A2、1A3、1G4、1G9、1G11 |
| US28-14-4E4 | 1A1、1A4、1E6、1E8 |
| US28-14-4F11 | 1A1、1A2、1A3、1A4 |
| US28-14-5H11 | 1H6 |
全部ECD3次純系標識列於表5A中，其中各次純系之吸光度值在數值上表示於對應表5B中。此等表格均代表實驗之96孔盤佈局，且因此表5A之表示抗體次純系之細胞(代表96孔盤中之孔)可與表5B之對應細胞匹配。空白孔塗佈有對應肽且在無初級抗體存在下用二級抗體處理。
觀測到所有28個抗體次純系對生物肽-1與生物肽-2之高吸光度值，其證實許多不同序列之抗體可針對ECD3產生，將共有與HCMV之4N及4D變體之病毒株未定性結合性之有益特性。
全部ECD1次純系標識列於表5C中，其中各次純系之吸光度值在數值上表示。空白孔塗佈有對應肽且在無初級抗體存在下用二級抗體處理。
觀測到所有29個抗體次純系對生物肽-N之高吸光度值，其證實許多不同序列之抗體可針對ECD1之高度保守抗原決定基產生，將共有與HCMV之變體之病毒株未定性結合性之有益特性。
表 5C ：針對與HCMV之保守N端抗原決定基之結合測試之額外29個純系的ECD1抗體純系及吸光度值.
表 5A ：針對與HCMV之4N及4D變體之結合測試之額外28個純系的ECD3抗體純系關鍵點.
表 5B：針對與HCMV之4N及4D變體之結合測試之額外28個純系之吸光度值.
額外純系與表現US28之細胞的結合
| 純系 ID | 塗佈：肽 -N-BSA | 塗佈： BSA | 純系 ID | 塗佈：肽 -N-BSA | 塗佈： BSA |
| 1E10F4 | 2.5076 | 0.0414 | 6B2B5 | 2.5635 | 0.0279 |
| 2E10B7 | 2.686 | 0.079 | 6B3C10 | 2.6402 | 0.0255 |
| 2F5B11 | 2.8039 | 0.0508 | 6D5G3 | 2.8039 | 0.0211 |
| 2G2B3 | 2.8319 | 0.0015 | 6G3D6 | 2.819 | 0.0291 |
| 3E1D7 | 2.7848 | 0.066 | 7A2C10 | 2.9445 | 0.0319 |
| 4A11A11 | 2.7409 | 0.0132 | 7B1F3 | 2.7989 | 0.0474 |
| 4B7E1 | 2.6664 | 0.0481 | 7B11D6 | 2.4905 | 0.0162 |
| 4D10B6 | 2.6751 | 0.0194 | 7D12D11 | 2.6529 | 0.0012 |
| 4E1B10 | 2.5898 | 0.0652 | 7E11F7 | 2.5726 | 0.0197 |
| 4H3C3 | 2.7481 | 0.0164 | 9G3B9 | 2.674 | 0.0008 |
| 4H9B5 | 2.739 | 0.0326 | 10F9B1 | 2.6189 | 0.0977 |
| 5D6H11 | 2.8319 | 0.0479 | 10G1D5 | 2.6867 | 0.0484 |
| 5E1E4 | 2.7131 | 0.0051 | 10G6C9 | 2.6987 | 0.0626 |
| 5E8F7 | 2.7989 | 0.0634 | 空白(陰性細胞) | 0.056 | 0.0356 |
| 5F10H11 | 2.7027 | 0.0424 | 陽性血清 | 2.4711 | 0.0774 |
| 6A1B4 | 2.7113 | 0.0425 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| 肽-1 | 13-1C10-1A8 | 14-2C2-1G4 | 14-2C2-1G9 | 13-1C10-1B9 | 14-5H11-1H6 | 13-1C10-1G8 | 14-4E4-1E6 | 14-4F11-1A1 | 14-4E4-1A1 | 14-1H3-1C10 | 14-1H3-1E1 | 14-4E4-1A4 |
| 肽2 | ||||||||||||
| 肽-1 | 14-4F11-1A2 | 14-1H3-1C12 | 13-1C10-1A2 | 14-2C2-1A2 | 14-1H3-1D2 | 14-4E4-1E8 | 13-1C10-1D3 | 14-2C2-1G11 | 14-2C2-1A3 | 14-1H3-1A10 | 14-1H3-1C11 | 14-4F11-1A3 |
| 肽2 | ||||||||||||
| 肽-1 | 13-1C10-1C10 | 14-4F11-1A4 | 13-1C10-1G9 | 13-1C10-1B11 | 空白 | |||||||
| 肽2 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| 肽-1 | 2.921 | 2.951 | 2.830 | 3.097 | 2.921 | 2.880 | 2.880 | 2.717 | 2.921 | 2.983 | 2.907 | 2.454 |
| 肽2 | 2.951 | 2.811 | 2.747 | 2.823 | 2.944 | 2.993 | 3.090 | 2.944 | 2.976 | 3.187 | 2.914 | 2.374 |
| 肽-1 | 2.971 | 2.752 | 2.841 | 2.794 | 3.005 | 2.988 | 3.005 | 2.742 | 3.005 | 3.005 | 3.005 | 2.645 |
| 肽2 | 2.902 | 2.871 | 2.789 | 2.488 | 2.765 | 2.871 | 2.661 | 2.534 | 2.765 | 2.842 | 2.765 | 2.482 |
| 肽-1 | 3.106 | 2.987 | 3.106 | 3.154 | 0.033 | |||||||
| 肽2 | 3.029 | 2.922 | 3.065 | 2.330 | 0.032 |
認為，大部分HCMV發病機制與病毒潛伏相關，其與病毒經由多個機制避開體液及細胞宿主免疫反應之能力密切有關(Manandhar等人,
《國際分子科學雜誌》, 2019.
20(15))。此類機制中最重要的一點包括HCMV之此高度的、不斷變化的遺傳多樣性。許多CMV基因已鑑別為高度可變的，包括已報導許多N端多態性之G蛋白偶合受體US28 (Goffard等人,
Virus Genes, 2006;
33(2):175-81; Arav-Boger等人,
J Infect Dis.,2002;
186(8):1057-64)。
吾等研究已鑑別出HCMV病毒株可參考其ECD3序列分類，且屬於分別為4N或4D變體(此為約10%/90%分裂)之範疇。以上表5B中提供之結合資料展示，與結合至US28分子之其他區的抗US28抗體(諸如VUN100 (據報導結合至US28之N端及ECD4區中之不連續抗原決定基)之特徵相比，針對ECD3內之病毒株未定性抗原決定基序列(「SAES」)產生的結合分子始終顯示病毒株未定性結合，如藉由本申請案的圖21中之資料(如上文實例1中所論述)。
因此，本發明之結合分子之特徵可在於對表現US28之細胞具有病毒株未定性結合性，其中結合程度及/或結合特異性實質上不受表現US28之HCMV之病毒株影響。不僅鑒於不同個體可感染不同HCMV病毒株之事實，且亦由於個體可同時感染有多種不同HCMV病毒株，故此情況可為重要的(Gorzer等人,
J Virol, 2010,
84(14): 7195-7203; Renzette等人,
PLoS Pathog, 2011,
7(5): e1001344; Renzette等人,
Curr Opin Virol, 2014.
8: 109-15; Renzette等人,
Proc Natl Acad Sci USA, 2015,
112(30): E4120-8; Renzette等人,
J Virol, 2017,
91(5))。在用HCMV之不同病毒株感染之情形下，提供能夠發揮其結合特性而與HCMV病毒株存在無關且因此避免在開始治療之前對HCMV感染之病毒株進行分類之需要的結合劑為非常有益的。在個體同時感染多個不同HCMV病毒株之情形下，非常有益的係能夠在個體中同時處理所有病毒株；特定言之，此可幫助避免產生施加選擇性壓力以促進任何非結合病毒株之感染之產生的環境。
亦已知，新的宿主感染使各經感染個體產生獨特病毒株，且產生選擇事件，其中由於免疫反應之選擇性壓力，新穎基因型可變得顯性(Renzette等人, 2011，同上)，且病毒及宿主因子有可能在HCMV感染期間促進病毒基因漂移(Vabret等人,
Trends Immunol, 2017, 38(1): 53-65; Christensen及Paludan,
Cell Mol Immunol, 2017, 14(1): 4-13)。此為提供具有病毒株未定性結合性之抗US28結合分子為重要的另一情形。
至少出於此等原因，病毒株未定性結合性(或至少使本發明之抗US28結合分子之結合特性如在HCMV之不同病毒株之間之變化程度降至最低)為高度較佳的。
本發明之結合分子可另外或替代地進一步特徵在於與US28陰性細胞之結合相比優先結合於表現US28之細胞。因此，特異性為另一重要特徵，以及以病毒株未定性方式保留該特異性之能力。
至少在一些情形下(例如在其中本發明之結合分子用於遞送針對所結合細胞之細胞毒活性的治療情形下)，脫靶結合程度在絕對意義上較低的亦為重要的。在此類情況下，僅與表現US28之細胞之特異性結合可能係不夠的。換言之，儘管在某些情況下極高程度之與表現US28之細胞的結合可為有幫助的，但若高程度之與表現US28之細胞的結合亦伴隨相對高程度之脫靶結合，則此在治療背景下可能為不可接受的，即使結合特異性之相對程度(比較結合與靶細胞相對於脫靶細胞之絕對程度)可產生有利比率。實際上，在此情形下，避免結合至脫靶細胞(亦即，不感染HCMV之細胞)可具有高重要性之額外特徵，從而允許提供避免脫靶活性之治療適用分子。換言之，具有低絕對程度之結合至US28陰性細胞之本發明之結合分子在一些情況下可提供更治療相關活性，因為高背景結合將有對結合分子之脫靶作用的風險。舉例而言，在CAR T細胞或BiTE選擇性殺死所結合之任何細胞之情況下，對於目標，CAR T細胞或BiTE具有低程度之背景結合至陰性細胞為關鍵的。否則，CAR T細胞或BiTE可殺滅除預期目標以外之細胞。
如上文所指出，在本申請案之實例1中(如圖21中進一步所示)，與抗US28 VUN100先前技術抗體(據報導其與US28之N端及ECD4區中之不連續抗原決定基結合)相比，本發明之示例性ECD3結合分子(13-5G6-1D3)提供實質上較低的脫靶結合活性，提供顯著改良之病毒株未定性結合性，且亦提供更高特異性以及改良之對不同HCMV病毒株的特異性的保持。
因此，與VUN100及1D3相比，進一步分析所選其他抗ECD3結合分子的結合特性。
為了測定脫靶結合程度及針對表現US28之細胞的結合特異性程度，使用與上述
分析 2相同的流動式細胞測量術分析用於選自以下之多種候選次純系：(i)上述28種病毒株未定性ECD3結合分子(所選候選物可見於表6A中)及(ii)上述29種ECD1結合分子(所選候選物可見於表6B中)，且與以下相比：1D3-mFc，一種含有鼠類Fc受體之示例性13-5G6-1D3形式，作為陽性對照；及Mv及Bv VUN100分子之混合物相比，該等分子為此項技術已知之針對US28之結合分子，呈50 μg/ml比率1:1，作為另一比較對照。
表 6A ：選擇用於針對表現US28之細胞之結合分析的ECD3次純系.
表 6B ：選擇用於針對表現US28之細胞之結合分析的ECD1次純系.
| 純系標識 | 次純系標識 |
| US28-13-1C10 | 1B9、1C10、1G9 |
| US28-14-1H3 | 1A10、1C10 |
| US28-14-2C2 | 1G4 |
| US28-14-4E4 | 1A1、1E8 |
| 純系標識 | 次純系標識 |
| US28-4-2F5 | B11 |
| US28-4-2G2 | B3 |
| US28-4-4A11 | A11 |
| US28-4-4H3 | C3 |
| US28-4-5D6 | H11 |
| US28-4-5E1 | E4 |
| US28-4-5E8 | F7 |
| US28-4-6G3 | D6 |
| US28-4-7B1 | F3 |
| US28-4-9G3 | B9 |
藉由流動式細胞測量術，相較於不過度表現US28之CHO細胞(「CHO」細胞)，測試所選擇之次純系與經工程改造以過度表現DB-US28之CHO細胞(「CHO-US28」細胞)的結合，作為量測各種結合分子之非特異性結合的方式。使用各別二級抗體(次純系之抗mFc-FITC，或VUN100分子之抗myc-PE)以及CHO細胞及CHO-US28細胞測定背景含量。鑒於US28表現於細胞表面上，細胞對於此等實驗為非滲透的。
表7A及圖22A概述對照CHO細胞(亦即不表現US28)中流動式細胞測量術中對ECD3結合分子之結合百分比，其表明脫靶結合之風險，其中移除二級抗體之背景含量。因此，藉由各條件指示之結合百分比為測試結合分子之脫靶結合。
表 7A ：ECD3結合分子與對US28呈陰性之CHO細胞之結合百分比.
| 條件 | 與 CHO 細胞之結合百分比 |
| 1D3-mFc (1:4) 250 µg/ml | 0.66% |
| VUN100 Mv+Bv Ab混合物50 µg/ml | 2.47% |
| 13-1C10-1B9 (1:5) (200 µg/ml) | 0.71% |
| 13-1C10-1C10 (1:5) (200 µg/ml) | 0.62% |
| 13-1C10-1G9 (1:5) (200 µg/ml) | 0.44% |
| 14-1H3-1A10 (1:5) (200 µg/ml) | 0.58% |
| 14-1H3-1C10 (1:5) (200 µg/ml) | 0.31% |
| 14-2C2-1G4 (1:20) (50 µg/ml) | 0.35% |
| 14-4E4-1A1 (1:5) (200 µg/ml) | 1.63% |
| 14-4E4-1E8 (1:5) (200 µg/ml) | 0.03% |
表7A及圖22A中之資料展示與針對ECD3內之病毒株未定性抗原決定基序列-1 (「SAES1」)產生之抗體相比，VUN100分子具有一致較高程度之針對US28陰性CHO細胞的背景結合。應注意，VUN100在比大多數其他抗體高的將幫助降低VUN100樣本之偵測到之脫靶結合的稀釋/較低濃度下進行測試(因為較高抗體濃度往往會導致較高背景結合)。儘管如此，資料展示與VUN100樣本相比，本發明之ECD3結合分子一致地顯示降低的背景結合。
通常，VUN100分子以至少3倍或4倍或更高之增加的程度結合脫靶細胞。
相比較地，如先前所描述之1D3結合分子之其他ECD3結合分子表明與US28-陰性CHO細胞之背景結合低得多。
因此，針對ECD3內之病毒株未定性抗原決定基序列-1 (「SAES1」)產生的本發明之ECD3結合分子與VUN100分子相比一致地顯示具有較低的脫靶結合風險的更治療相關活性。
在結合於經本發明人鑑別存在於US28之ECD1內由位置26至37所定義之區域內的保守病毒株未定性抗原決定基序列-2 (「SAES2」)之本發明之結合分子(諸如4H3C3、7B1F3及2F5B11)與據報導結合於存在於US28 N端及US28之ECD4內的不連續抗原決定基的WO 2019/151865及De Groof等人, 2019 (
同上)之VUN100 Ab及/或De Groof等人, 2020 (
同上)之VUN100b二價分子之間進行進一步比較，其中N端區內之結合發生在位置1至22內，包括至少位置16，且最可能亦在位置8、18及/或19中之一或多者，且可能位置1-10及16-22內之其他胺基酸(參見本申請案之背景部分中關於由VUN100分子結合之不連續抗原決定基之表徵的進一步細節所論述)。根據先前與VUN100結合分子之比較資料，本發明之示例性ECD3結合分子13-5G6-1D3用作陽性對照。
表7B及圖22B概述對照CHO細胞(亦即不表現US28)中流動式細胞測量術中對ECD1結合分子之結合百分比，其表明脫靶結合之風險，其中移除二級抗體之背景含量。因此，藉由各條件指示之結合百分比為測試結合分子之脫靶結合。
表 7B ：ECD1結合分子與對US28呈陰性之CHO細胞之結合百分比.
| 條件 | 與 CHO 細胞之結合百分比 |
| 1D3-mFc (1:4) 50 µg/ml | 0.57% |
| VUN100 Mv+Bv Ab混合物50 µg/ml | 2.87% |
| 2F5B11 (1:5) | 0.39% |
| 2G2B3 (1:5) | 0.95% |
| 4A11A11 (1:5) | 0.76% |
| 4H3C3 (1:5) | 0.31% |
| 5D6H11 (1:5) | 0.64% |
| 5E1E4 (1:5) | 1.64% |
| 5E8F7 (1:5) | 0.96% |
| 6G3D6 (1:5) | 1.24% |
| 7B1F3 (1:5) | 0.67% |
| 9G3B9 (1:5) | 1.17% |
表7B及圖22B中之資料展示可產生與VUN100相比，具有降低程度之背景結合的針對ECD1內之病毒株未定性抗原決定基序列-2 (「SAES2」)之抗體。在所有情況下，資料展示與VUN100樣本相比，本發明之ECD1結合分子均顯示降低的背景結合。
因此，資料顯示，能夠可靠地開發針對本發明人鑑別之ECD1內之病毒株未定性抗原決定基序列-2 (「SAES2」)產生的本發明之ECD1結合分子，其與VUN100分子相比具有更治療相關活性及較低的脫靶結合風險。
雖然與基於VUN100之分子相比，改良之病毒株未定性結合性及/或低背景程度為ECD3及ECD1結合分子之足夠有利特性，但本申請人進一步研究是否可容易地獲得具有比VUN100分子改良之結合特異性的ECD3及ECD1結合分子。因此，將五個示例性ECD3結合分子及七個示例性ECD1結合分子與已示例的有前景的1D3候選物及作為對照之VUN100相比。五個示例性ECD3結合分子及ECD1結合分子分別如表8A及8B中所列出。
為了計算針對表現US28之CHO細胞之結合特異性，相比於對照細胞，如下計算示例性ECD3及ECD1結合分子之特異性程度：如上文所描述減去背景程度，各測試抗體樣本之CHO-US28結合程度除以其各別對照CHO結合程度(亦即，陽性結合與陰性結合之比率)，且計算差異(相對於針對VUN100樣本確定之結合特異性)，其中值＞1表示相較於VUN100改良之特異性。
此等實驗之ECD3結果表示於表8A及圖23中。此等實驗之ECD1結果表示於表8B及圖24中。
表 8A ：5個示例性ECD3結合次純系之結合特異性.
表 8B ：7個示例性ECD1結合次純系之結合特異性.
| 條件 | 與 VUN100 顯示之特異性相比較的結合特異性 |
| VUN100 Mv+Bv Ab混合物 | 1.00 |
| 14-2C2-1G4 (1:20) | 5.37 |
| 14-4E4-1E8 (1:5) | 4.60 |
| 14-1H3-1A10 (1:5) | 2.29 |
| 13-1C10-1C10 (1:5) | 1.74 |
| 1D3-mFc (1:4) 50 µg/ml | 1.65 |
| 條件 | 與 VUN100 顯示之特異性相比較的結合特異性 |
| VUN100 Mv+Bv Ab混合物 | 1.00 |
| 1D3-mFc (1:4) 50 µg/ml | 1.65 |
| 2F5B11 (1:5) | 4.21 |
| 2G2B3 (1:5) | 1.24 |
| 4A11A11 (1:5) | 3.20 |
| 4H3C3 (1:5) | 3.35 |
| 5D6H11 (1:5) | 1.18 |
| 7B1F3 (1:5) | 1.67 |
| 9G3B9 (1:5) | 1.10 |
結合特異性資料證實，許多其他ECD3次純系提供，且甚至增加了針對ECD3產生的1D3-Fc結合分子的改良的特異性，且亦證實與VUN100分子相比的改良的結合特異性。
此證實針對ECD3內之病毒株未定性抗原決定基序列-1 (「SAES1」)產生的多個ECD3結合分子可根據本文所述之方案容易地鑑別，其與1D3相比具有改良之結合特異性，及/或與VUN100分子相比至少具有改良之結合特異性。
總體而言，此等資料證實，如根據本文所描述之方案產生之針對ECD3內之病毒株未定性抗原決定基序列-1 (「SAES1」)的具有ECD3結合特異性之結合分子可提供為呈現以下特徵中之一者、兩者或全部三者：
1. 相較於VUN100分子，一致改良的與由不同HCMV病毒株編碼之US28的病毒株未定性結合性；
2. 與VUN100分子相比，實質上一致較低的與US28陰性細胞之背景結合；及視情況
3. 與VUN100及/或1D3分子相比維持或較佳改良之結合特異性。
類似地，此等資料證實針對ECD1內之病毒株未定性抗原決定基序列-2 (「SAES2」)產生的多個ECD1結合分子可根據本文所述之方案容易地鑑別，其與VUN100分子相比具有改良之結合特異性，且甚至一些與本發明之示例性抗ECD3抗體1D3相比具有改良之結合特異性。
實例 3 ：在HCMV感染人類組織上之結合
感染HCMV之人類肺組織用於藉由使用免疫組織化學分析(IHC)驗證本發明之示例性ECD3結合分子US28-13-5G6-1D3 rAb在HCMV感染人類組織上之結合。
US28-13-5G6-1D3 rAb展示1:400-1:1600稀釋度(w/v)之間的染色，且選擇1:400稀釋度(w/v)用於進一步篩選研究(圖12A)。如製造商手冊所建議，HCMV抗IE市售抗體MAB810R用作陽性對照且以1:200 (w/v)稀釋度展示HCMV感染肺組織的最佳染色(圖12D)。lgG用作陰性對照抗體(圖12F)。用US28-13-5G6-1D3 rAb對HCMV感染肺組織的染色證明對感染HCMV之肺泡細胞的特異性，因為正常肺組織(圖12B)或HCMV陰性子宮肌層(資料未示出)中無肺泡細胞及纖維母細胞染色。US28-13-5G6-1D3 rAb將典型HCMV感染細胞染色，在HCMV陽性對照載片中具有特徵性細胞腫大作用(圖12A)。13-5G6-1D3 rAb在此等細胞中展示強細胞質染色，因為US28蛋白已知位於細胞質及細胞膜中，而抗IE對照抗體MAB810R展示核染色，如所預期，因為已知IE蛋白質在生產性HCMV感染期間位於細胞核中(圖12D)。陽性染色藉由使用原位雜交(ISH)方法檢驗為HCMV特異性，其中探針靶向相同樣本中之HCMV DNA。有趣地，在正常肺組織中，對於已知為潛伏或再活化HCMV之載體的一些組織巨噬細胞，13-5G6-1D3 rAb經陽性染色(圖12B)。相同巨噬細胞展示如藉由陽性ISH信號所表明之HCMVDNA之存在(圖12C)。相同巨噬細胞未展示IE蛋白質之陽性染色(圖12E)。針對肺組織，用陰性抗體對照抗IgG Ab染色保持陰性(圖12F)。此等結果與來自展示US28-13-5G6-1D3 rAb與HCMV感染人類組織之特異性結合之細胞研究的本文中展現之吾等其他結果一致。圖20展示在形態上正常之相鄰腫瘤(NAT)胰臟組織中之生產性HCMV感染之額外實例的特異性染色結果。
根據1D3之陽性資料，感染HCMV之人類肺組織用於藉由使用免疫組織化學分析(IHC)驗證本發明之三種示例性ECD1結合分子US28-4-4F3C3、US28-4-7B1F3及US28-4-2F5B11在HCMV感染人類組織上之結合。
US28-4-4F3C3 rAb (1:800稀釋度(w/v))、US28-4-7B1F3 rAb (1:6400稀釋度(w/v))及US28-4-2F5B11 rAb (1:1600稀釋度(w/v))均顯示陽性染色(圖25 B-D)。先前示例之US28-13-5G6-1D3 rAb用作陽性對照且以1:3200 (w/v)稀釋度展示HCMV感染肺組織的最佳染色(圖25 A)。IgG用作陰性對照抗體。用示例之ECD1結合分子對HCMV感染肺組織的染色證明對感染HCMV之肺泡細胞的特異性，因為相應HCMV陰性子宮肌層對照中無子宮肌層細胞及纖維母細胞染色。與US28-13-5G6-1D3 rAb一樣，ECD1結合分子將典型HCMV感染細胞染色，具有特徵性細胞腫大作用，在此等細胞中展示強細胞質或膜染色，因為US28蛋白已知位於細胞質及細胞膜中，且對於已知為潛伏或再活化HCMV之載體的一些組織巨噬細胞進行陽性染色。
在HCMV感染人類癌症上之結合
吾等隨後藉由使用IHC及驗證ISH分析研究US28-13-5G6-1D3 rAb與人類癌症組織之結合。由資深病理學家評估結果。吾等發現US28-13-5G6-1D3 rAb對若干癌症類型之特異性染色。其中有神經膠母細胞瘤(例如神經膠母細胞瘤4級)、結腸癌、直腸癌、乳癌(例如局部晚期乳癌及其轉移)、食道癌、胃癌(gastric/stomach)、胰臟癌、肝癌(諸如肝細胞癌)、肺癌、惡性嗜鉻細胞瘤及子宮頸癌，首次顯示US28在癌症病理學中之潛在通用作用。不同癌細胞之染色強度分類為陰性=0，弱陽性=1+，中等陽性=2+或強陽性=3+。US28染色僅在腫瘤細胞具有不同於相鄰正常組織之陽性染色的情況下分類為陽性。在陽性US28-13-5G6-1D3 rAb染色之大多數腫瘤中，染色一般在大部分腫瘤細胞中為陽性。藉由使用ISH陽性發現腫瘤細胞核中之HCMV DNA來確認腫瘤陽性。在許多情況下，腫瘤樣本展示血管內皮及平滑肌細胞之陽性染色，其亦見於相鄰正常組織中且不視為腫瘤陽性之跡象。IgG對照Ab染色用作陰性對照且在所有經研究癌性及正常組織中為陰性。
三個經研究之食道及胃腺癌樣本中之一者中存在陽性US28-13-5G6-1D3 rAb染色強度以及細胞核HCMV DNA之發現。HCMV陽性胃腫瘤展示彌漫性類型胃癌之形態徵象，其通常在小細胞組中生長且影響大區域，而非僅影響某一區域。陽性腫瘤樣本來自56歲男性，其腫瘤為3級且TNM歸類為T3N1M0。此外，US28陽性食道癌展示侵襲性類型，IIIa期，T3N1M0。對於上皮細胞染色，相鄰食道組織之全部(3/3)均為陰性且對於HCMV DNA，2/3胃腫瘤相鄰樣本亦為陰性。
除1/3測試結腸腺癌中之陽性HCMV DNA分析以外，US28-13-5G6-1D3 rAb之染色強度為陽性(1+)，而3/3對照對於相鄰上皮細胞中之US28-13-5G6-1D3染色皆為陰性。HCMV DNA仍可在2/3相鄰樣本中追蹤。陽性腫瘤為3級，其中TNM分類為T4N1M0。值得注意地，T4分級意謂癌症已滲透結腸壁，且可已附著或生長至其他鄰近組織或器官中，且因此根據定義歸類為局部晚期結腸癌。
所有3個經研究之直腸腺癌樣本具有陽性US28-13-5G6-1D3染色及陽性HCMV ISH。其為T3N0M0，2級；T4N0M0，2級；及T3N1M0，3級。對於HCMV，相鄰樣本2/3為陰性且1/3具有陽性US28-13-5G6-1D3染色及陽性ISH。
2/3之經研究肝細胞癌對於US28-13-5G6-1D3染色及HCMV ISH為陽性。引人注目地，相鄰肝組織展示生產性HCMV感染之徵象，具有中度US28-13-5G6-1D3染色及庫弗細胞(Kupffer cell)中之大及頻繁細胞質HCMV DNA聚集物。此在腫瘤相鄰肝組織及各別相鄰樣本中均可見。
吾等亦發現2/3肺癌樣本、2/3宮頸癌樣本及1/3胰臟癌樣本中的US28-13-5G6-1D3染色與陽性ISH。
吾等隨後藉由使用IHC及ISH更詳細地研究乳癌群組中之HCMV US28表現。41個經研究之原發性乳房腫瘤樣本中之約74%展示US28-13-5G6-1D3 rAb之陽性及特異性細胞質染色及癌細胞中之陽性核HCMV DNA (圖13及圖15)。出人意料地，為HER2陽性或三陰性乳癌(TNBC)之腫瘤形式(諸如具有低激素受體表現之彼等腫瘤形式)侵襲性愈大，可見US28-13-5G6-1D3 rAb對腫瘤細胞染色趨勢愈強(圖13及圖16A)。US28-13-5G6-1D3 rAb染色限於腫瘤細胞，但許多腫瘤血管亦展示強陽性染色。有趣地，經研究之30個轉移性淋巴結約94%展示轉移性細胞之特異性US28-13-5G6-1D3 rAb染色。TNBC及HER2陽性癌轉移中看到最密集染色(圖14及圖16B)。所有TNBC (n=8)及HER2陽性(n=11)轉移均具有陽性US28-13-5G6-1D3染色(圖16B)。HCMV ISH對於98%之所研究乳癌樣本(n=41)及100%之所研究腺乳癌轉移(n=30)為陽性。有趣地，僅HCMV DNA陰性乳癌樣本為神經內分泌腫瘤，其亦展示陰性US28-13-5G6-1D3染色。ISH發現亦與上列IHC結果一致，展示僅12%原發性腫瘤中每個腫瘤細胞許多核HCMV DNA信號，然而在39%癌轉移中每個腫瘤細胞存在許多核ISH信號。三陰性腫瘤及HER2陽性腫瘤中，排他性地發現在原發性腫瘤與癌轉移中每個腫瘤細胞有許多ISH信號，僅一個或兩個例外情況。正常乳房上皮細胞及10/10相鄰對照乳房組織中不存在U28-13-5G6-1D3之細胞質染色(圖15)。正常淋巴組織未展示任何陽性US28染色(2/2樣本皆為陰性)。然而，許多相鄰組織對於血管內皮細胞及平滑肌細胞(在70%相鄰乳房組織中)展示陽性染色，其類似於腫瘤樣本。一致地，亦在3/10正常鄰近乳房組織中發現少量HCMV DNA。13-5G6-1D3染色評估為對乳癌及相鄰正常組織中之HCMV感染細胞具有特異性。
若干早期研究記錄HCMV感染及US28在神經膠母細胞瘤組織中之表現[5, 6]。吾等用US28-13-5G6-1D3 rAb及MAB810R抗體對人類星形細胞瘤1-3級及神經膠母細胞瘤4級組織染色。對於US28-13-5G6-1D3 rAb染色，所有星形細胞瘤1級(n=4)均為陰性。在2-3級星形膠質細胞瘤中，6個為陰性，37個為陽性(1+)，且2個對於US28-13-5G6-1D3 rAb染色為中度陽性(2+)。所有4級神經膠母細胞瘤(n=19)均為陽性，其中3級對於US28-13-5G6-1D3 rAb染色為中度陽性(2+)(圖17及圖18)。抗IE抗體MAB810R展示17/19神經膠母細胞瘤4級樣本之陽性染色，而2個樣本視為陰性。HCMV ISH在所有腫瘤樣本中陽性，指示100%樣本中存在HCMV DNA。相鄰正常腦組織對照未展示US28-13-5G6-1D3 rAb之任何一般染色(圖17C)。對於HCMV DNA，五個NAT為完全陰性的。HCMV DNA發現於靜止五個NAT樣本中之星形膠質細胞及神經膠質細胞核中。腫瘤組織中之陰性IgG對照染色為陰性(圖17C)，指示腦組織中藉由13-5G6-1D3 rAb之HCMV US28特異性染色。
僅6/41個經研究乳癌樣本，但大部分4級神經膠母細胞瘤樣本(17/19)展示抗IE MAB810R抗體之陽性細胞質染色。陽性乳癌樣本通常僅含有具有陽性細胞塑膠染色之稀有陽性細胞，但陽性樣本中之5/6為HER2陽性(n=4)或TNBC (n=1)。另外，一種HER2陽性樣本在腫瘤巨噬細胞中針對MAB810R Ab陽性染色。僅1/37癌轉移針對MAB810R Ab陽性染色，但此樣本亦為HER2陽性。MAB810R Ab之染色始終與乳癌樣本中US28-13-5G6-1D3 rAb之陽性染色組合。極有趣地，具有陰性MAB810R染色之若干腫瘤樣本展示陽性血管內皮及平滑肌細胞染色，其對於US28-13-5G6-1D3 rAb及MAB810R抗體皆為陽性的。
HCMV IE蛋白質之細胞質染色先前已描述於若干癌症類型中[7, 8]。MAB810R單株抗體在吾等實驗中用作HCMV陽性對照以靶向細胞內、HCMV編碼之IE1及IE2蛋白。此等蛋白共用外顯子1-3且另外包括外顯子4 (IE1)或5 (IE2)。全長IE蛋白為HCMV複製及自潛伏再活化以引起生產性HCMV感染所需[4]。其不在HCMV實驗潛伏期期間表現[9]。然而，IE1蛋白之外顯子4之RNA及蛋白質表現(IE1x4)(約60 kDa尺寸)此前已展示於潛伏HCMV感染之CD34+造血前驅細胞中但不展示於天然及實驗潛伏系統中之CD14單核球中[10]。因此，除US28蛋白之外，潛伏期期間之HCMV基因表現可包括IE1x4之表現，但不包括全長IE1及IE2蛋白[10]。根據製造商之資訊(MerckMillipore.com)，MAB810R抗體結合於約68-72 kDa全長IE1及IE2蛋白上，指示MAB810R Ab靶向具有裂解或複製CMV感染之細胞。因此，其不應結合於潛伏HCMV感染細胞。吾等之結果展示，陽性乳房腫瘤樣本中之大部分癌細胞表現US28蛋白，但不表現IE蛋白。
在吾等研究中，當用ISH研究時，100%乳癌轉移及100%腦瘤均為HCMV DNA陽性。吾等觀測到，在惡性腫瘤中，HCMV DNA僅僅位於腫瘤細胞核中。核HCMV DNA信號之數目在不同腫瘤樣本之間變化。吾等亦觀測到，侵襲性癌症類型，諸如TNBC及HER2陽性乳癌中每腫瘤細胞核ISH信號之數目增加。在其中病毒DNA主要位於細胞質中之正常組織中，在多個大聚集物中觀測到ISH信號之核定位(圖20)。在生產性HCMV感染期間，病毒粒子在自細胞排出之前填裝於內質網中。此解釋在生產性HCMV感染期間大部分DNA之細胞質位置。吾等觀測到僅正常組織(及NAT)，諸如胰臟(圖20)、乳房、肝臟及肺組織中之此類生產性HCMV感染(圖12)。
當綜合而言時，此等資料表明癌細胞且尤其乳癌細胞攜載潛伏HCMV感染。此發現不僅由IE蛋白質表現之缺乏及細胞質病毒聚集物之缺乏而且由腫瘤細胞中存在核HCMV信號支持於吾等之研究中。吾等結果及結論由早期資料支持，指示缺乏細胞病變效應且缺乏腫瘤細胞中複製病毒之跡象[11, 12]。
潛伏HCMV感染之單核球經程式化以用於長期細胞存活[13]，且合理地，腫瘤細胞中之潛伏HCMV感染可促進增加之腫瘤細胞存活。潛伏HCMV感染單核球展示在其微環境中發揮較寬免疫抑制功能以保護自身免受免疫系統消除[13]。此亦類似於癌細胞，且逃避免疫破壞已確認為癌症之十大標誌中之一者[14]。
有趣地，如亦由早期其他[7, 8]所描述，吾等發現在少數侵襲性乳癌樣本及大部分神經膠母細胞瘤4樣本中之細胞質全長IE蛋白表現。癌症特異性表成機制(諸如組蛋白修飾、DNA低甲基化或某些病毒或宿主突變)可抑制病毒複製，但仍允許某些侵襲性癌症中之一些IE表現[15]。吾等發現一些陽性乳房腫瘤樣本中之僅少數細胞之細胞質中存在IE蛋白表現，指示非均質癌細胞群可含有更容許複製病毒之極少細胞/細胞類型。已提出癌症幹細胞尤其允許HCMV感染且神經膠母細胞瘤細胞中之IE蛋白質表現經突變誘發細胞存活、腫瘤生長及上皮間質(EMT)表型[16]。潛伏HCMV感染之US28陽性癌細胞可進一步產生強免疫抑制微環境，其可允許IE蛋白質之表現，已知該等IE蛋白質在少數腫瘤細胞中為高度免疫原性CD4+ T細胞抗原及CD8+ T細胞抗原[17]。吾等結果另外展示腫瘤含有其他HCMV感染細胞，其針對IE蛋白質，諸如內皮及平滑肌細胞及有時巨噬細胞陽性染色。已知此等細胞類型比腫瘤細胞更容易複製病毒感染[16]，且可另外促進腫瘤內之病毒維持及排出。然而，神經膠母細胞瘤腫瘤中參與HCMV相關感染之機制可能由於此等癌症之不同細胞來源而不同於乳癌。
綜合而言，上文所列之結果在本文中展示特異性結合於US28之ECD3之結合劑，如藉由US28-13-5G6-1D3 rAb所示例，特異性結合於HCMV感染細胞之表面上，如US28-13-5G6-1D3在過度表現US28之細胞模型、HCMV感染細胞及組織、來自HCMV陽性腫瘤之PBMC及HCMV陽性癌細胞上之結合所展示。相比之下，如本文中藉由US28-13-5G6-1D3 rAb所示例，特異性結合至US28之ECD3的結合劑通常不結合於HCMV陰性對照細胞或組織上(如圖12、15、17、19及20中所示)。此等發現與US28蛋白之作用相干，其展示為在裂解及潛伏HCMV感染兩者期間存在[18]。吾等在此首次展示人類乳癌、直腸癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、肺癌及子宮頸癌之陽性US28染色且確認在神經膠母細胞瘤4級[5, 6]及結腸癌[19]中之HCMV US28表現的一些早期結果。最重要地，吾等展示US28-13-5G6-1D3 rAb特異性結合於局部晚期結腸癌、轉移性乳癌組織(約94%)及神經膠母細胞瘤IV級腫瘤(約100%)，證實吾等在侵襲性、局部晚期及轉移人類癌症中高HCMV US28表現之假設，且為特異性結合於US28之ECD3的結合劑提供另一作用。
此等發現支持HCMV US28作為針對HCMV感染(尤其關注潛伏HCMV感染)及針對HCMV陽性癌症(尤其關注侵襲性、局部晚期及轉移、HCMV陽性癌症)之重要治療目標之作用，且指向針對US28之ECD3之抗體及其他結合劑，尤其針對US28具有高度特異性及/或病毒株未定性結合性之彼等結合劑，諸如抗體US28-13-5G6-1D3，作為一種高效的治療性、預防性和診斷性結合分子。此包括提供針對HCMV感染(尤其關注潛伏HCMV感染)及針對HCMV陽性癌症之細胞毒活性的高度特異性靶向的能力。
在未感染 HCMV 之初級組織上的結合
當考慮治療分子時，評估結合分子之脫靶結合之風險為重要的。此對於US28而言尤其重要，該蛋白具有與可存在於個體中的CCR5之序列同源性程度。因此，高結合特異性及低脫靶結合為具有低脫靶效應風險的有前景的治療結合分子的指標。
因此，吾等研究本發明之示例性結合分子與多種人類初級組織之結合以評估脫靶結合之程度。此等資料係使用以與先前所述相同之方式製備之US28-13-5G6-1D3抗體在流動式細胞測量術(FACS)中產生。
對各種人類初級細胞進行利用13-5G6-1D3抗體之流動式細胞測量術分析以排除一般脫靶結合。研究以下細胞株：人類初級腎上腺皮質細胞、人類初級腎臟上皮細胞、人類初級心臟微血管內皮細胞、人類初級肝臟上皮細胞及人類初級靜脈平滑肌細胞。US28靶向抗體13-5G6-1D3在所有此等細胞類型上展示極低表面結合，遠低於＜1%，表明13-5G6-1D3對此等細胞類型不存在脫靶結合(圖19A)。此等結果支持吾等對實驗室細胞(亦即非初級細胞株)之觀測結果，展示正常US28陰性細胞之低結合。人類胰臟組織之US28-13-5G6-1D3 Ab之IHC染色展示感染HCMV之胰臟組織之特異性染色及感染HCMV之胰臟組織之陰性染色(圖20)。
人類心臟組織 之 IHC
藉由免疫組織化學研究人類心臟組織樣本之13-5G6-1D3染色。免疫組織化學未展示13-5G6-1D3對人類心臟肌肉組織之任何一般脫靶結合(圖19B)。HCMV DNA之相同肌肉組織亦為陰性(資料未示出)。用13-5G6-1D3進行之染色類似於用陰性IgG抗體對照進行之染色。人類惡性嗜鉻細胞瘤腫瘤在分析中用作HCMV感染之陽性對照。其與心臟樣本位於相同TMA盤上且展示13-5G6-1D3抗體之陽性染色(圖19B)。ISH對照亦展示在相同活體組織切片中腫瘤細胞之細胞核中之典型HCMV DNA染色，確認此陽性對照中存在潛伏HCMV感染(圖19B)。
此等資料表明，抗體US28-13-5G6-1D3特異性地結合於生產性及潛伏HCMV感染細胞及人類組織兩者上且其不結合於健康人類細胞及組織之表面上。陽性及陰性結果已由HCMV感染之其他獨立替代標記確認，諸如藉由ISH分析用MAB810抗體及HCMV DNA對照染色，及用人類IgG抗體之陰性對照染色。
實例 4 ： ECD1 結合分子之結合特異性前言：
大規模蛋白質陣列為用於抗體特異性評估、篩選生物標記、蛋白質-蛋白質、蛋白質-小分子、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA及蛋白質-脂質相互作用的通用及靈敏平台。其對於評估廣泛用於研究及臨床應用中之蛋白質結合或親和試劑極其有用。
HuProt™人類蛋白質體微陣列在單一顯微鏡載片上提供最大數目之獨特全長、經個別純化之人類蛋白質。其提供＞21,000個獨特人類蛋白質、同功異型物變體及蛋白質片段，覆蓋16,794個獨特基因。此包括人類蛋白質圖譜中所述之19,613個典型人類蛋白質中的15,889個，廣泛覆蓋蛋白質。此允許以高通量方式剖析數千個相互作用。全長重組蛋白在酵母釀酒酵母(
S. cerevisiae)中表現，純化且連同一組對照蛋白(GST、BSA、組蛋白、IgG等)一起一式兩份印刷於玻璃載片上。如此實例中使用之HuProt™人類蛋白質體微陣列中包括的不同蛋白質之完整清單在研究揭示公開案(ISSN 0374-4353，Questel Ireland Ltd)中提供為「清單B」，資料庫編號為707018、707019及707020，各自之標題為「大規模蛋白質排列目標蛋白標識」，且各自在2023年1月27日數位公開，各者之內容以全文引用之方式倂入本文中，以達成揭示由「清單B」定義之蛋白質的目的。「清單B」開始於研究揭示公開案707018，在研究揭示公開案707019中繼續，且結束於研究揭示公開案707020，且因此三個公開案連續地作為「清單B」蛋白質之單一揭示內容讀取。HuProt™微陣列不限於特定類型之表面塗佈，不過預設為玻璃用超薄硝化纖維素膜塗佈以非共價、但不可逆地將活性蛋白質捕獲至表面。
實驗概述 ：
在HuProt
TM人類蛋白質體陣列上分析人類化7B1F3及小鼠7B1F3抗體之樣品的結合特異性。將具有序列TDVLNQSKPVTL之肽(「肽3」)以0.1 mg/ml添加至陣列中，作為對照。
在阻斷之後，在室溫下用抗體樣品(0.1 µg/ml)探測陣列1小時。隨後用TBST洗滌陣列，10分鐘×3，且在藉由CDI Labs針對信號偵測最佳化之條件下用Alexa647-抗人類IgG Fc或Alexa647-抗小鼠IgG二級抗體探測。
資料分析：
● 自樣品分析消除直接結合於二級抗體之非特異性命中。
● 使用CDI軟體，基於Z分數定量各個別樣品對陣列上之特定蛋白質的特異性。
● Z分數為既定蛋白質之重複點之平均Z分數(各蛋白質一式兩份地列印在HuProt
TM陣列上)。根據以下演算法計算既定陣列上每一光點之Z分數：
Z= [F635 – F635(avg)] / F635(std) F635(avg) 及 F635(std) 分別為陣列上之所有光點之 F635 值的平均值及標準偏差。● S分數為既定蛋白質之Z分數與排名緊鄰其之Z分數的差異。若最高命中之S分數＞3，則認為抗體對最高命中具有高度特異性。
● F635係既定蛋白質之2個重複光點在偵測通道中的平均前景信號強度(635 nm)。
● B635係既定蛋白質之2個重複光點在偵測通道中的平均背景信號強度(635 nm)。
結果：
樣本hum7B1F3及小鼠7B1F3均識別肽3，對應於如HCMV蛋白質US28之ECD1中所提供的SEQ ID NO: 177之序列，作為具有極高特異性之最高命中，參見表9。
表9：人類化7B1F3相對於小鼠7B1F3之信號讀數.
* 65535為飽和信號強度。
| 樣本 | 最高命中 | Z 分數 | S 分數 | 信號 | 肽 3 信號 |
| hum7B1F3 | 肽3 | 147.646 | 123.346 | 65535* | 65535 |
| 小鼠7B1F3 | 肽3 | 145.092 | 116.095 | 49972 | 49972 |
肽3鑑別為對hum7B1F3 (參見圖26及表10)及小鼠7B1F3 (參見圖27及表11)具有極高特異性之最高命中。在兩種情況下，肽3以極高特異性結合，而各種其他脫靶候選物展示極低或基本上無結合(參見圖28及29)。
表10：來自圖26之前10個命中之結果的定量.
表11：來自圖27之前10個命中之結果的定量.
| 排名 | 蛋白質 | F635 | Z 分數 | S 分數 |
| 1 | 肽_3 | 65535 | 147.464 | 123.346 |
| 2 | AGAP2 | 10822.5 | 24.3 | 15.039 |
| 3 | EXD2 | 4151.5 | 9.261 | 1.977 |
| 4 | CCDC97 | 3274.5 | 7.284 | 0.170 |
| 5 | BYSL | 3199 | 7.114 | 0.085 |
| 6 | LASP1 | 3161.5 | 7.029 | 0.619 |
| 7 | DNAJB2 | 2887 | 6.41 | 0.100 |
| 8 | TRIM33 | 2842.5 | 6.31 | 1.300 |
| 9 | BYSL | 2266 | 5.01 | 0.012 |
| 10 | SYNCRIP | 2260.5 | 4.998 | 0.063 |
| 排名 | 蛋白質 | F635 | Z 分數 | S 分數 |
| 1 | 肽_3 | 49972 | 145.092 | 116.095 |
| 2 | AGAP2 | 10020.5 | 28.997 | 15.511 |
| 3 | FBXO2 | 4683 | 13.486 | 2.911 |
| 4 | LASP1 | 3681 | 10.575 | 1.073 |
| 5 | DNAJB2 | 3312 | 9.502 | 0.235 |
| 6 | TRIM33 | 3231 | 9.267 | 1.539 |
| 7 | EXD2 | 2701.5 | 7.728 | 1.271 |
| 8 | SYNCRIP | 2264 | 6.457 | 0.157 |
| 9 | BYSL | 2210 | 6.3 | 0.378 |
| 10 | CCDC97 | 2080 | 5.922 | 0.353 |
如下為來自hum7B1F3之HuProt分析的前100個命中，排除肽3 (在本文中稱為「清單A」)(HuProt ID在括號內)：AGAP2 (JHU12842.B11C24R24)；EXD2 (JHU08666.B7C25R48)；CCDC97 (JHU04911.B4C30R76)；BYSL (JHU15392.B11C14R64)；LASP1 (JHU14849.B10C30R54)；DNAJB2 (JHU05676.B1C10R90)；TRIM33 (JHU19543.B15C32R26)；BYSL (JHU05768.B8C20R2)；SYNCRIP (JHU08142.B6C12R42)；SHFM1 (JHU03919.B2C5R64)；ABCF3 (JHU00673.B4C28R12)；NOL4L (JHU09419.B5C16R60)；PPIP5K1 (JHU07043.B5C22R20)；GMPPB (JHU01291.B12C13R84)；Glis2 (JHU19734.B15C19R6)；SP8 (JHU16771.B13C25R40)；GET4 (JHU11625.B11C17R4)；ZYX (JHU08351.B8C25R40)；CITED1 (JHU02424.B4C9R38)；IL27RA (JHU18193.B13C12R46)；KANSL2_frag (JHU09033.B7C11R50)；PRR16 (JHU16025.B12C28R70)；KIAA0430_frag (JHU11326.B5C14R90)；JO-1自體抗原.B20C24R40)；Glis2 (JHU19734.B15C15R8)；RCAN1 (JHU11634.B10C27R4)；SYNCRIP (JHU13100.B12C5R26)；RRAGD (JHU11116.B8C10R80)；PRKG1_frag (JHU09569.B7C10R56)；PDXDC1 (JHU10332.B8C18R68)；NOVA2 (JHU18112.B16C28R64)；CCNY (JHU11339.B7C19R90)；UBXN1 (JHU00329.B13C6R78)；PALD1 (JHU14658.B10C8R50)；TEX33 (JHU07207.B10C14R90)；POGZ (JHU12321.B9C26R14)；GAS2L1 (JHU11642.B10C27R2)；NOVA1 (JHU11477.B6C7R88)；KJ904402 (JHU16482.B10C26R80)；KANSL2_frag (JHU06156.B6C12R10)；TRAF3IP2 (JHU08439.B5C13R38)；PCMTD1 (JHU09086.B5C6R52)；CCDC91 (JHU05488.B3C22R86)；TEX33 (JHU20055.B17C9R4)；ZMYM3 (JHU00766.B1C18R12)；BC018766_frag (JHU01404.B3C4R20)；CNKSR1 (JHU08559.B6C8R48)；COL9A3 (JHU08659.B8C4R44)；ZUFSP (JHU08078.B6C20R42)；NDE1 (JHU00337.B14C6R84)；ANKRD17 (JHU12257.B12C2R18)；GNAS (JHU28981.B17C22R6)；TTLL12 (JHU30284.B17C29R40)；WRAP73 (JHU15189.B9C11R60)；HSF2 (JHU19738.B14C4R2)；CH25H (JHU04335.B4C32R72)；TCAP (JHU01718.B4C9R26)；STK24 (JHU16471.B10C20R80)；EDIL3 (JHU06744.B6C6R14)；CCDC155 (JHU09052.B5C16R52)；SLC2A14 (JHU06795.B5C11R14)；FCHO1 (JHU12286.B12C23R16)；GAS2L1 (JHU12862.B15C32R86)；HSF2 (JHU19738.B17C24R10)；CCNI (JHU04718.B4C32R74)；FANCE (JHU10008.B8C26R70)；ATP8B5P_frag (JHU15426.B11C27R66)；TNFRSF1A (JHU18512.B15C18R46)；DAXX (JHU11066.B7C31R84)；SLC27A3 (JHU08714.B8C16R46)；CLPTM1 (JHU08558.B6C17R48)；HSF2 (JHU26287.B19C23R6)；CD74 (JHU01357.B3C1R22)；CPEB1 (JHU06736.B6C11R14)；APBA1 (JHU18056.B15C31R62)；REST (JHU16767.B16C4R40)；MPRIP (JHU19494.B13C14R30)；TCAP (JHU01625.B4C32R42)；OSBPL6 (JHU06594.B5C15R18)；PTGS2自體抗原.B20C24R38)；TAGLN2 (JHU06128.B8C13R6)；BC089418 (JHU16002.B10C10R72)；OGFOD3 (JHU15317.B11C20R64)；NAF1 (JHU03983.B13C20R80)；EOGT (JHU10282.B6C10R68)；HARS (JHU05318.B4C30R84)；DCDC2 (JHU13615.B9C19R32)；BCL2L13 (JHU01262.B4C27R24)；CORO6 (JHU09909.B13C26R90)；CRTAC1 (JHU03192.B4C32R50)；BAFF (JHU29136.B20C1R38)；DEFB132 (JHU13092.B12C4R90)；KCNAB2 (JHU07150.B6C16R20)；MMD2 (JHU15539.B12C25R62)；ABTB1 (JHU08641.B8C16R48)；PDCD2 (JHU13853.B11C20R38)；HAT1_frag (JHU01484.B3C7R22)；CPEB3 (JHU12849.B13C23R74)；THEMIS2_frag (JHU15201.B12C7R56)；及GPBP1L1 (JHU04644.B3C23R74)。
結論 ：
人類化7B1F3及小鼠7B1F3之樣本均識別具有序列TDVLNQSKPVTL 之肽(「肽3」)作為具有極高特異性之最高命中。
具體言之，圖28及29展示兩種測試抗體與HSPD1 (亦稱為HSP60)及ITGA6 (整合素α6，亦稱為CD49f)之基本上不可偵測之交叉反應性。實際上，當以Z分數對超過23,000個蛋白質目標之清單進行排序時，HSPD1 (JHU02056.B15C21R82)為第1,417個蛋白質；且ITGA6 (JHU11750.B10C1R6)為第13,749個蛋白質。
此等資料展示，即使有與ECD1抗原決定基之交叉反應性之潛在風險的脫靶亦未被7B1F3純系結合。
實例 5 ： RETROGENIX 細胞微陣列 目標：
此研究之目的為使用Retrogenix細胞微陣列技術平台之『刪減』版本來針對特異性脫靶結合篩選示例性結合分子。
所測試之示例性結合分子為雙特異性T細胞接合(BiTE)分子之兩種替代型式，各具有如本文所描述之7B1F3之VH及VL鏈，因此結合於如由SEQ ID NO: 177進一步定義之HCMV編碼之US28之ECD1區內的抗原決定基，及結合T細胞受體CD3之OKT3 VH及VL結構域。此實例中所用之示例性BiTE在本文中稱為Thbi44.7_bis (分子量173 kDa)及Thbi44.8_bis (分子量150 kDa)，且其結構展示於圖38中。此等均呈雙特異性IgG1、Fc沉默型式。IgG及Fc之物種為人類。所用篩選濃度為0.1 µg/mL。
背景
Retrogenix細胞微陣列技術適合於篩選蛋白質配位體及抗體與人類質膜及分泌蛋白質之相互作用，該等蛋白質中之各者個別地表現於人類細胞中。其利用編碼人類質膜蛋白、繫栓人類分泌蛋白及雜二聚體質膜蛋白複合物之大量表現載體。
該技術可a)鑑別受體未知之蛋白質配位體及抗體的受體/目標，及b)鑑別此類分子之任何不合需要之脫靶活性。該技術對於兩種應用均已證實極其強大。
在此研究中，示例性結合分子Thbi44.7_bis及Thbi44.8_bis針對Discovery UK的人類質膜蛋白、繫栓人類分泌蛋白及雜二聚體質膜蛋白複合物之最新文庫進行篩選，以鑑別任何潛在的脫靶結合活性。
方法：i. 預篩選
在固定、未經轉染之HEK293細胞之載片上篩選示例性結合分子以確定最佳濃度，用於評估背景結合程度(例如，因為HEK293細胞中之高內源性一級目標表現)。使用適當及經過充分驗證之AlexaFluor647標記之偵測試劑評估結合，接著螢光成像。預篩選資料包括背景之定量評估(相比於『未經結合分子』處理之載片的增加倍數)。確定最佳濃度為0.1 µg/ml。
b. 文庫篩選
對於文庫篩選，使用Retrogenix細胞微陣列之刪減版本，對於針對在人類HEK293細胞中表現之6052種人類質膜蛋白(在本文中稱為「清單C」)、分泌及細胞表面繫栓之人類分泌蛋白+397種人類雜二聚體(在本文中稱為「清單D」)之結合，篩選測試抗體。如此實例中使用之清單C及清單D之不同蛋白質的完整清單在研究揭示公開案(ISSN 0374-4353，Questel Ireland Ltd)中分別提供為「清單C」及「清單D」，資料庫編號為707020，標題為「大規模蛋白質排列目標蛋白標識」，在2023年1月27日數位公開，其內容以全文引用之方式倂入本文中，以達成揭示由「清單C」及「清單D」定義之蛋白質的目的。
表現載體文庫分別在微陣列載片(「載片組」)上一式兩份地排列。在每個載片上一式四份點樣表現載體(pIRES-hEGFR-IRES-ZsGreen1)且用於確保在每個載片上達成或超出最小轉染效率臨限值。先前已定義此最小臨限值(相比於背景，來自pIRES-EGFR-ZsGreen1載體之平均ZsGreen1信號)。使用人類HEK293細胞進行反向轉染/表現。示例性結合分子各自以0.1 µg/ml個別地施加於所有固定載片組（n=1載片/載片組）。根據預篩選進行結合之偵測。使用ImageQuant軟體(GE)分析螢光影像且定量(對於轉染效率)。
蛋白質『命中』定義為展示相較於背景程度升高之信號的重複光點。此藉由使用ImageQuant軟體上柵格化之影像進行目視檢查來達成。視重複光點之強度而定，將命中分類為『強、中等、弱或極弱』。
結果：
對於針對表現重複6052種人類質膜蛋白、分泌及細胞表面繫栓之人類分泌蛋白+397種人類雜二聚體之固定HEK293細胞/載片之結合，篩選Thbi44.7_bis及Thbi44.8_bis (18載片組，n=1載片/載片組/抗體)。
所有轉染效率均超過最小臨限值。
使用Retrogenix細胞微陣列之刪減版本，對於針對在人類HEK293細胞中表現之清單C 6052種人類質膜蛋白、分泌及細胞表面繫栓之人類分泌蛋白+清單D 397種人類雜二聚體之結合，篩選測試抗體Thbi44.7_bis及Thbi44.8_bis。
排除非特異性及低可信度(極弱強度)相互作用，未鑑別出Thbi44.7_bis或Thbi44.8_bis之顯著特異性相互作用。
實例 6 ： ECD1 人類化及非糖基化分析 人類化方法之概述：
將抗體4H3C3及7B1F3之親本VH及VL序列與一組人類生殖系序列比對。選擇兩個緊密比對之生殖系序列，且CDR及某些構架胺基酸自供體親本序列移植至人類受體生殖系序列上。總計產生四個VH及四個VL序列，得到16種抗體之可能組合。使用IMGT域間隙比對工具計算與人類之一致性百分比。
結合分析： ii. 材料： 細胞：HEK Phoenix Ampho (ATCC-CRL-3213)，p 21。
染色緩衝液：具有1% BSA、2 mM EDTA之PBS。
質體：編碼來自以下不同HCMV病毒株之US28蛋白：DB；TB40/E；Merlin；及VHL/E。
阻斷：人類TruStain FcX™ (參考422302)。
Live Dead: Invitrogen™ eBioscience™可固定活力染料eFluor™ 780 (參考13539140)。
初級抗體：7B1F3 (6.76 nM = 1 µg/ml)；hum7B1F3 (6.76 nM = 1 µg/ml)
結合之二級抗體 ：● APC抗人類IgG Fc抗體(參考410712)：1:200。
● APC抗小鼠IgG Fc (參考405308)：2.5 µg/mL。
對照：● 活力染料。
● FMO.
● 二級Ab：
APC抗人類IgG Fc抗體(參考410712)：1:200。
APC抗小鼠IgG Fc (參考405308)：2.5 µg/mL。
接種：
轉染前一天，在1×6孔盤中以1×10
6個活細胞/孔、2毫升/孔接種HEK Ampho細胞。HEKPhoenix_質體接種4個孔。HEKPhoenix_模擬轉染接種2個孔。在37℃培育箱中培育細胞，相對濕度＞80%且CO
25%。
細胞轉染：
1天後，細胞已黏附且達到＞60%匯合。在轉染之前自各孔移除700 μL培養基。使X-tremeGENE™ HP DNA轉染試劑、DNA及稀Opti-MEM®I還原血清培養基溫熱至+15℃至+25℃，且輕緩渦旋。針對各條件將100 μL稀釋劑置放於無菌管中。添加1 μg質體DNA。輕緩地抽吸以混合(對於模擬條件，不添加DNA)：
● DB (683.3 ng/μL)：1.46 μL
● TB40/E (742.05 ng/μL)：1.35 μL
● Merlin (70.78 ng/μL)：14.13 μL
● VHL/E (51.87 ng/μL)：19.28 μL
將3 μL X-tremeGENE™ HP DNA轉染試劑添加至稀DNA。(3:1試劑與DNA比率)。輕緩地抽吸以混合，隨後：
1. 在15℃至25℃下培育20分鐘。
2. 以逐滴方式添加約100 μL轉染複合物至細胞中。
3. 輕緩地震盪或旋動該等孔或燒瓶以確保整個盤上之均勻分佈。
4. 在量測蛋白質表現之前培育細胞48小時。
更詳情請見：https://www.sigmaaldrich.com/NO/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/xtg-cell-protocols#EK-293T。
抗體結合及製備 ：
抗體結合及製備分別概述於表12及表13中。
表 12 ：抗體結合
表 13 ：抗體製備
方法：
| 抗體 | HEKPhoenix_ 模擬 | HEKPhoenix_BD | HEKPhoenix_TB40/E | HEKPhoenix_Merlin | HEKPhoenix_VHL/E |
| FMO (無APC) | 1 | ||||
| Sec Ab小鼠 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 7B1F3 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| Sec Ab人類 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| hum7B1F3 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 |
| 濃度 | Ab | 活力 | SB | |
| 阻斷 | 37.5 | 3000 | ||
| 活力染料 | 1:1000 | 2 | 1998 | |
| Sec抗小鼠 | 2.5 ug/mL | 7.5 | 592.5 | |
| Sec抗人類 | 1:200 | 3 | 597 | |
| 7B1F3 | 1 ug/ml = 6.76nM | 1 | 1000 | |
| hum7B1F3 | 1 ug/ml = 6.76nM | 1 | 1000 |
每孔使用0.25×10
6個總細胞，用versene分離。
1. 若細胞位於培養基中，則在200 μL SB中洗滌細胞一次
2. 在300-400×g (1200 rpm)下離心細胞3分鐘。
3. 若使用盤，則將上清液倒至槽中，或使用移液管抽吸。
4. 阻斷：Fc阻斷，50 μl緩衝液+0.625 μl Trustain FcX/孔以阻斷Fc受體。在Ab之前添加。
5. 在室溫下培育10分鐘。
6. 製備抗體，在SB中進行所需稀釋。
7. 用100 μL SB洗滌1次。
8. 每孔添加50 μl Ab-SB溶液(僅sec或FMO並非如此)。
9. 在冰上培育30分鐘。
10. 在工作稀釋度下製備二級Ab之溶液。
11. 添加100 μl染色緩衝液以洗滌細胞，在4℃下以300-400×g離心3分鐘，且丟棄上清液。再次用150 μL SB洗滌。
12. 每孔二級添加50 μl SB或無染色不添加。在冰上培育15分鐘。
13. 添加100 μl染色緩衝液以洗滌細胞，在4℃下以300-400×g離心3分鐘，且丟棄上清液。
14. 使細胞再懸浮於200 μl SB中且將細胞轉移至流動管中以用於獲取樣本。
4H3C3 之人類化：
抗體序列含有去醯胺及異構化模體係常見的。然而，4H3C3序列不含特定關注之任何模體。4H3C3之人類化序列展示於表14中。
表 14 ： 4H3C3 之人類化序列 .
7B1F3 之人類化：
| 類型 | 名稱 | 生殖系 | 序列 | 人類 % |
| 親本 | VH | - | QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 187) | 73.5% |
| 人類化 | VH1 | IGHV1-46*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKFQGRATLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 256) | 85.7% |
| 人類化 | VH2 | IGHV1-46*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYAEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 257) | 89.8% |
| 人類化 | VH3 | IGHV1-18*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKLQGRATLTADKSSSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 258) | 83.7% |
| 人類化 | VH4 | IGHV1-18*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYAEYNQKLQGRVTMTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 259) | 87.8% |
| 親本 | VL | - | QIVLTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTWESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 189) | 84.0% |
| 人類化 | VL1 | IGKV4-1*01 | QIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTWESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 260) | 95.0% |
| 人類化 | VL2 | IGKV4-1*01 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 261) | 96.0% |
| 人類化 | VL3 | IGKV2-28*01 | QIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTWESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 262) | 84.0% |
| 人類化 | VL4 | IGKV2-28*01 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 263) | 85.1% |
序列可靠性分析揭露7B1F3在CDRH3中含有N連接之糖基化位點。此位點已在表15內之序列中加粗。此具有潛在傾向，因為其可引起產物異質性以及糖基化變化之風險增加，從而在聚糖直接涉及結合時可能影響活性。
表 15 ： 7B1F3 之人類化序列 .
結構分析：
| 類型 | 名稱 | 生殖系 | 序列 | 人類 % |
| 親本 | VH | - | EVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSRTAYMQLSSLTSEDSAVYSCARIL NGTGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 211) | 68.4% |
| 人類化 | VH1 | IGHV1-46*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFQGRATLTADKSSRTAYMELSSLRSEDTAVYSCARIL NGTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 264) | 81.6% |
| 人類化 | VH2 | IGHV1-46*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIL NGTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 265) | 87.8% |
| 人類化 | VH3 | IGHV1-18*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQQLQGRATLTADKSSRTAYMELRSLRSDDTAVYSCARIL NGTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 266) | 78.6% |
| 人類化 | VH4 | IGHV1-18*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQQLQGRVTMTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARIL NGTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 267) | 84.7% |
| 親本 | VL | - | DIVLTQSPSSLTVSVGEKFTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLAISSVKPEDLAIYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 213) | 81.2% |
| 人類化 | VL1 | IGKV4-1*01 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 268) | 95.0% |
| 人類化 | VL2 | IGKV4-1*01 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 261) | 96.0% |
| 人類化 | VL3 | IGKV2-28*01 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 269) | 84.2% |
| 人類化 | VL4 | IGKV2-28*01 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 263) | 85.1% |
對7B1F3純系進行結構分析以觀測N97之取向(亦即，NGT中之N，其為N-糖基化之序列傾向)。7B1F3之結構展示於圖30中。
僅基於結構分析，不可能知曉N94之位置對於結合是否至關重要。然而，基於該取向，可認識到可能使N-糖基化位點突變，藉此降低與此類序列傾向相關之風險。
去糖基化人類化序列 ：
已設計兩個其他人類化VH序列，其中天冬醯胺(N)突變成麩醯胺酸(Q)以移除糖基化位點(表16)。此突變以粗體字體突出顯示於下表中。由於此突變可能影響目標結合，隨後評估此突變。
表 16 ： 7B1F3 之去糖基化人類化序列 .
結果：
| 類型 | 名稱 | 生殖系 | 序列 | 人類 % |
| 人類化 | VH5 | IGHV1-46*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFQGRATLTADKSSRTAYMELSSLRSEDTAVYSCARIL QGTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 270) | 81.6% |
| 人類化 | VH6 | IGHV1-46*0-1 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIL QGTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 271) | 87.8% |
藉由減去背景結合程度(如藉由模擬陰性對照所測定，其未經轉染以表現US28)將結合至目標之程度標準化。接著比較親本7B1F3及人類化7B1F3與經各種載體轉染之細胞的結合。
親本細胞為根據流式細胞測量術觀測到的總群體中偵測之活細胞。因此，親本讀數%反映對於7B1F3抗體之結合呈陽性之活細胞的百分比(參見圖31)。
出乎意料地，與DB、Merlin及VHL/E病毒株之親本形式相比，人類化抗體之結合百分比增加，同時維持與TB40/E病毒株等效之結合。
結論：
此等資料表明示例性ECD1結合分子之人類化可積極地影響許多US28病毒株之目標結合。
實例 7 ： 小鼠 7B1F3 之非糖基化突變體與親本小鼠 7B1F3 的比較 概述：
此實例報導如上文所描述之親本小鼠7B1F3序列與非糖基化突變體之比較測試，在該非糖基化突變體中VH鏈之CDR3發生突變，用麩醯胺酸(Q)置換天冬醯胺(N) (在對應於以上表16中所示之位置的位置)以移除糖基化位點。針對由不同HCMV病毒株編碼之US28形式評估結合。
材料製備 ：染色緩衝液：具有0.5% BSA、2 mM EDTA之PBS。
阻斷溶液(細胞數目依賴性)：對於0.25×10
6個細胞：
人類阻斷：50 µl染色緩衝液/孔中0.625 µl Trustain FcX。
活力染料溶液：在染色緩衝液中1:1000稀釋之活力染料。
初級Ab溶液：相應地在染色緩衝液中稀釋Ab。
二級Ab溶液：在染色緩衝液中1:200稀釋Ab。
| 濃度 | Ab | 活力染料 | 染色緩衝液 | ||||
| 阻斷 | 50 | 4000 | |||||
| 活力染料 | 1:1000 | 6 | 6000 | ||||
| 二級抗小鼠 | 1:200 | 20 | 4000 | ||||
| Ab | A 50 µg/ml | 17.5 | 332.5 | ||||
| B 20 µg/ml | 7 | 343 | |||||
| C 10 µg/ml | 3.5 | 346.5 | |||||
| D 5 µg/ml | A 35 | 315 | |||||
| E 2 µg/ml | B 35 | 315 | |||||
| F 1 µg/ml | C 35 | 315 | |||||
| G 0.5 µg/ml | A 3.5 | 346.5 | |||||
| H 0.2 µg/ml | B 3.5 | 346.5 | |||||
| I 0.1 µg/ml | C 3.5 | 346.5 | |||||
染色：1. 在96孔盤每孔接種0.2×10
6個細胞(最大體積200 μl)。
2. 在4℃下在300×g下離心細胞3分鐘。
3. 將上清液倒至槽中。
4. 藉由添加150 μl染色緩衝液洗滌細胞。
5. 在4℃下在300×g下離心細胞3分鐘。
6.
阻斷：o 添加50 μl阻斷溶液。
o 在室溫下培育10分鐘。
7. 在培育之後，每孔添加100 μl染色緩衝液以洗滌細胞。
8. 在4℃下在300×g下離心3分鐘，且丟棄上清液。
9.
初級 Ab/ 活力染色：o 每孔添加50 μl初級Ab/活力染料溶液。
o 僅未用初級Ab染色之每孔添加50 μl活力染料溶液。
o 在冰上培育30分鐘。
10. 添加100 μl染色緩衝液以洗滌細胞。
11. 在4℃下在300×g下離心3分鐘，且丟棄上清液。
12. 第二次洗滌
13.
二級 Ab 染色：o 每孔添加50 μl二級Ab溶液。
o 在冰上培育15分鐘。
14. 添加100 μl染色緩衝液以洗滌細胞。
15. 在4℃下在300×g下離心3分鐘，且丟棄上清液。
16. 藉由添加100 μl染色緩衝液重複洗滌步驟，旋轉且丟棄上清液。
17. 使細胞再懸浮於200 µl染色緩衝液中。
18. 將細胞轉移至流動管中以用於獲取樣本。
比較：細胞未染色：經阻斷但未染色之細胞(所有其他步驟中僅染色緩衝液)。
細胞+活力染料：藉由將細胞在95℃下培育2分鐘且隨後將其直接置於冰中來殺死細胞。阻斷細胞且接著僅用活力染料染色(其他步驟中僅染色緩衝液)。
珠粒+二級Ab：珠粒遵循製造商給出之方案染色。
結果：
此分析中評定結合差異之最佳濃度確定為0.5 µg/ml。使用在此濃度下獲得之結果，自各種條件之結合百分比值減去模擬陰性對照中觀測到之背景結合。親本鼠類7B1F3抗體與各US28病毒株之所得結合標準化為100%，且針對此評估去糖基化7B1F3之相對結合程度。
如圖32中可見，觀測到與親本鼠類7B1F3 (縮寫為「m7B1F3」)相比，去糖基化7B1F3對US28之全部HCMV變異株的結合百分比增加。
結論：
此等資料表明，點突變可解決序列傾向，諸如CDRH3-中之N-糖基化位點。在此情況下，天冬醯胺突變成麩醯胺酸(其具有與胺基酸類似之特性)以作為降低風險之手段，且突變之去糖基化形式出人意料地維持或改良與US28之目標結合，與目標蛋白之變異株無關。
實例 8 ： 病毒株未定性結合性 概述：
此實例評估本發明之一些示例性結合分子，抗體2F5B11、4H3C3及7B1F3，以基於由HCMV病毒株TB40/E、DB、Merlin及VHL/E編碼之US28之序列變體，確定在US28之序列改變時維持結合於US28之程度。藉助於比較，在同一分析中評估先前技術抗體VUN100 (使用由De Groof等人, 2020,
同上所述之二價形式)。
材料： 細胞：HEK Phoenix Ampho (ATCC-CRL-3213)。
染色緩衝液：具有0.5% BSA、2 mM EDTA之PBS。
質體：編碼來自以下不同HCMV病毒株之US28蛋白：DB；TB40/E；Merlin；及VHL/E。
阻斷：人類TruStain FcX™ (參考422302)。
Live Dead: Invitrogen™ eBioscience™可固定活力染料eFluor™ 780 (參考13539140)。
初級抗體：● 初級抗體7B1F3、2F5B11、4H3C3及二價VUN100 (SEQ ID NO: 63)中之每一者用Myc標籤標記以藉由二次抗體偵測。所測試濃度包括67.6 nM = 10 ug/ml；6.76 nM = 1 ug/ml；0.676 nM = 0.1 ug/ml
結合之二級抗體：● Alexa Fluor 647抗-Myc抗體(參考626810)：1:200
對照：● 活力染料
● FMO
二級Ab：Alexa Fluor 647抗c-Myc抗體(參考626810)：1:200
接種：
轉染前一天，在1×6孔盤中以1×10
6個活細胞/孔、2毫升/孔接種HEK Ampho。HEKPhoenix_質體接種8個孔且HEKPhoenix_模擬轉染接種2個孔。在37℃培育箱中培育細胞，相對濕度＞80%且CO
25%。
細胞轉染：1天後，細胞已黏附且達到＞60%匯合。在轉染之前自各孔移除700 μL培養基。
● 使X-tremeGENE™ HP DNA轉染試劑、DNA及稀Opti-MEM®I還原血清培養基溫熱至+15℃至+25℃，且輕緩渦旋。
● 針對各條件將100 μL稀釋劑置放於無菌管中。
● 添加1 μg 質體DNA。輕緩地抽吸以混合。(模擬條件不添加DNA)：
b. DB (683.3 ng/μL)：1.46 μL
c. TB40/E (742.05 ng/μL)：1.35 μL
d. Merlin (70.78 ng/μL)：14.13 μL
e. VHL/E (51.87 ng/μL)：19.28 μL
● 將3 μL X-tremeGENE™ HP DNA轉染試劑添加至稀DNA。(3:1試劑與DNA比率)。輕緩地抽吸以混合。
1. 在15℃至25℃下培育20分鐘。
2. 以逐滴方式添加約100 μL轉染複合物至細胞中。
3. 輕緩地震盪或旋動該等孔或燒瓶以確保整個盤上之均勻分佈。
4. 在量測蛋白質表現之前培育細胞48小時。
https://www.sigmaaldrich.com/NO/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/xtg-cell-protocols#EK-293T.
方法：每孔使用0.25×10
6個總細胞，用胰蛋白酶分離。
1. 若細胞位於培養基中，則在200 μL SB中洗滌細胞一次
2. 在300-400×g (1200 rpm)下離心細胞3分鐘。
3. 若使用盤，則將上清液倒至槽中，或使用移液管抽吸。
4. 阻斷：Fc阻斷，50 μl緩衝液+0.625 μl Trustain FcX/孔以阻斷Fc受體。應在Ab之前添加。
5. 在室溫下培育10分鐘。
6. 製備抗體，在SB中進行所需稀釋。
7. 用100 μL SB洗滌1次。
8. 每孔添加50 μL Ab-SB溶液(僅sec或FMO並非如此)。
9. 在冰上培育30分鐘。
10. 在工作稀釋度下製備二級Ab之溶液。
11. 添加100 μL染色緩衝液以洗滌細胞，在4℃下以300-400×g離心3分鐘，且丟棄上清液。再次用150 μL SB洗滌。
12. 每孔二級添加50 μL SB或無染色不添加。在冰上培育15分鐘。
13. 添加100 μL染色緩衝液以洗滌細胞，在4℃下以300-400×g離心3分鐘，且丟棄上清液。
14. 使細胞再懸浮於200 μL SB中且將細胞轉移至流動管中以用於獲取樣本。
結果：
流動式細胞量測術結果指示6.76 nM之抗體濃度對於此分析為最佳的。圖33展示使用與由HCMV病毒株VHL/E編碼之US28變體之結合程度作為參考點，每一抗體之結合相對變化。因此：
● 變化零指示在由HCMV病毒株VHL/E編碼之US28變體與由不同HCMV病毒株編碼之US28變體之間既定抗體之結合無差異；
● 變化大於零指示相對於與VHL/E編碼之US28之結合程度結合增加；及
● 變化小於零指示相對於與VHL/E編碼之US28之結合程度結合減少。
二價VUN100抗體證實與VHL/E編碼之US28變體序列之結合程度相比，與所有其他測試US28變體(由DB、TB40/E及Merlin病毒株編碼)之結合實質性減少。相比之下，與VHL/E編碼之US28變體序列之結合程度相比，本發明之示例性抗體(2F5B11、4H3C3及7B1F3)顯示與所有其他測試US28變體(由DB、TB40/E及Merlin病毒株編碼)之結合程度僅微小變化，藉此表明其與VUN100抗體相比提供大大改良之病毒株未定性結合性特徵。
圖33中之曲線圖之基礎資料提供於以下表17A及B中。
表 17A ：初步結合資料。
| 抗體 | 模擬 | VHL/E | DB | TB40/E | Merlin |
| 2F5B11-Myc | 0.015 | 1.08 | 1.04 | 0.57 | 1.09 |
| 4H3C3-Myc | 0.015 | 0.16 | 0.37 | 0.14 | 0.12 |
| 7B1F3-Myc | 0.06 | 0.37 | 0.91 | 0.42 | 0.45 |
| VUN100bv-Myc | 0.031 | 2.29 | 0.62 | 0.16 | 0.71 |
基於表17A中之初步資料，可自針對來自VHL/E、DB、TB40/E及病毒株中之每一者的US28變體之結合值減去各抗體針對「模擬」(亦即，陰性對照)樣品之結合值以計算各抗體針對各病毒株之US28特異性結合之程度。出於此分析之目的，且為了允許交叉比較，接著將該等值相對於US28變體中之一者之所觀測結合標準化；在此，將該等值相對於由VHL/E病毒株編碼之US28蛋白標準化。接著計算倍數差異(其中倍數差異1為無變化且大於1為變化)，且減去值1 (以使得變化0為無變化，且不同於0的變化為變化)。最終，為了圖33中之清晰視覺表示，正值及負值經指派以指示相對於由VHL/E病毒株編碼之US28蛋白觀測到之結合程度，結合增加或減少。在根據前述方法處理之後，圖33中所繪製之資料展示於表17B中。
表 17B ： 經處理之結合資料 .
結論：
| 抗體 | 相對於與如由 VHL/E 編碼之 US28 之確定結合的結合變化 | |||
| VHL/E | DB | TB40/E | Merlin | |
| 2F5B11-Myc | 0 | -0.04 | -0.92 | +0.01 |
| 4H3C3-Myc | 0 | +0.59 | -0.16 | -0.38 |
| 7B1F3-Myc | 0 | +0.64 | +0.14 | +0.21 |
| VUN100bv-Myc | 0 | -2.92 | -14.83 | -2.41 |
如圖33中所示，本發明之分析表明，當本發明之示例性結合分子(7B1F3、2F5B11、4H3C3)的結合與由HCMV病毒株VHL/E、DB、TB40/E及Merlin編碼之不同變異US28蛋白相比時，針對其所觀測到之結合僅存在低變化程度。
此等結果與當二價VUN100與相同組之由HCMV病毒株VHL/E、DB、TB40/E及Merlin編碼之變異US28蛋白之結合進行比較時，針對其所觀測到之大得多的變化程度形成對比。此與VUN100與不同HCMV病毒株之結合的先前報導一致。舉例而言，WO 2019/151865之圖8D展示HCMV之VHL/E、Merlin與TB40/E病毒株之間的結合差異，其中在病毒株TB40/E(B1類型)中結合尤其減少，在本發明結果中其亦為二價VUN100之最低結合變體。
本發明之示例性結合分子(7B1F3、2F5B11、4H3C3)與先前技術之二價VUN100抗體之間的關鍵差異為在所結合之US28蛋白內的抗原決定基之位置。
如上文所論述，VUN100已顯示結合於不連續抗原決定基，該不連續抗原決定基包含US28之N端胞外區內之多個結合位置。De Groof (2019，同上)確定移除N端胺基酸位置1-22導致無結合，且進一步確定VUN100不與胺基酸位置11-15結合，但需要胺基酸位置16。
然而，本申請人確定，在US28之由VUN100結合之區域中存在高序列發散度(參見本申請案之表3)，且進一步出人意料地確定，不同於HCMV蛋白之US28之N端區(ECD1)的許多區域，TDVLNQSKPVTL之胺基酸序列(SEQ ID NO: 177；如由本發明之結合分子所結合)在所有已知HCMV病毒株之間高度保守，且此外適宜為免疫原性的。因而，SEQ ID NO: 177序列(及其免疫原性片段)適合於用作產生抗US28抗體之抗原，該等抗體具有以下中之一或多者(諸如全部)：例如與如上文所論述之先前技術之VUN100抗體相比，改良之病毒株未定性結合特性、改良(亦即相對較高)之結合特異性及/或改良(亦即相對較低)之脫靶結合活性。
圖33中之資料驗證本申請人的如下假設：針對由TDVLNQSKPVTL之胺基酸序列(SEQ ID NO: 177)組成之多肽內的抗原決定基的本發明之結合分子例如與如上文所論述之先前技術之VUN100抗體相比，具有改良的病毒株未定性結合特性。
實例 9 ： 細胞殺死分析 目標：
此研究之目標為測試雙特異性T細胞接合(BiTE)，其包括本發明之示例性ECD1結合分子之結合區。所用BiTE為如上文實例5中所描述且圖38中所示之Thbi44.7_bis及Thbi44.8_bis。
實例使用Cypre 3D免疫-腫瘤學活體外分析，使用癌細胞株模型(一個細胞株表現US28且稱為「MAXF401」，且另一細胞株不表現US28且稱為「MDA-MB-231」)，與人類真皮纖維母細胞(HDF)及PBMC (獲自供體)共培養以便評估所測試BiTE之治療效果，如由腫瘤尺寸所測定。
所用方法之額外詳情可見於Hribar等人, 2019 (「簡單三維水凝膠平台使得患者及PDX腫瘤之離體細胞培養物能夠用於分析患者及PDX腫瘤對臨床相關療法之反應(A Simple Three-dimensional Hydrogel Platform Enables Ex Vivo Cell Culture of Patient and PDX Tumors for Assaying Their Response to Clinically Relevant Therapies)」, 《分子癌症治療學(
Mol Cancer Ther)》, 18(3)，其揭示內容均以引用的方式併入本文中}。
研究概述 ：
在此分析中，對標準96孔盤使用Symphony® 3D凝膠圖案化技術，將一個PDX及一個細胞株模型(分別為MAXFTN 401及MDA-MB-231)之腫瘤細胞包埋於Cypre's VersaGel® (生物相容且化學成分確定之細胞外基質水凝膠)之層中。纖維母細胞另外與腫瘤細胞共培養以模擬腫瘤微環境之基質區域。
Cypre 3D 分析法：在建立3D腫瘤之後，其用測試結合分子處理，且另外用未活化的PBMC處理用於免疫腫瘤學(IO)分析。最初將PBMC添加至3D凝膠上方之細胞培養基中；隨時間推移，其逐漸浸潤且回應於免疫調節劑，靶向凝膠內部之腫瘤球體。
該分析法有效再現在腫瘤殺死之前在生理TME中可見之免疫浸潤基質，從而遞送轉譯相關結果。PBMC未經活化使用。
針對測試結合分子選擇以下分析讀數選項：
腫瘤生長延遲：使用高含量共焦成像來分析腫瘤尺寸減小。
典型的分析時刻表可見於圖34中。
分析設置：
一式兩份地以6點濃度反應曲線測試所有化合物。化合物1:4連續稀釋。對照藥物為一種濃度之星形孢菌素。收集上清液且研究結束時儲存用於進一步分析。終點通常為化合物處理後4天。
腫瘤模型資訊 / 細胞株資訊 ：
化合物資訊：
1媒劑之組分由供應源及物品編號指示
參考化合物之清單：
結果：
| 腫瘤名稱 | 腫瘤編號 | 癌症類型 | 植入前化學 / 放射 線 療法 | 植入階段 | 組織學 |
| MAXFTN | MDA-MB-231 | 乳癌(三陰性) | 未知 | 不可得 | 乳腺，乳房 |
| MAXFTN | 401 | 乳癌(三陰性) | 放射性 | M1肺 | 腺癌 |
| 原發性 / 癌轉移 / 循環 | 原發部位 | 分化 | 患者在手術時之年齡 | 性別 | 種族 / 血統 |
| 癌轉移 | 肋膜積液 | 差 | 51 | 女性 | 白種人 |
| 癌轉移 | 肺 | 好 | 51 | 女性 | 白種人 |
| 化合物 1 | 化合物 2 | ||
| 化合物名稱 | Thbi44.7 | Thbi44.8 | |
| 態樣(粉末或溶液) | 溶液 | 溶液 | |
| 濃度[mg/ml]，若呈溶液遞送 | 1mg/mL | 1mg/mL | |
| 運送溫度[℃] | -80℃ | -80℃ | |
| 儲存溫度，儲備液[℃] | -20℃ | -20℃ | |
| 光保護(儲備液) Y/N | N | N | |
| 媒劑，精確調配說明 1 | 1X PBS (ThermoFisher cat: 10010056)中50%甘油(ThermoFisher cat: 11433297) | 1X PBS (ThermoFisher cat: 10010056)中50%甘油(ThermoFisher cat: 11433297) | |
| 儲存溫度，調配化合物[℃] | -20℃ | -20℃ | |
| 避光(調配物) Y/N | N | N | |
| 經調配化合物穩定時間段 | 1年 | 1年 |
| 模型 | 所需免疫細胞 | 所需免疫細胞 | |||
| 結腸癌 | 奧沙利鉑(Oxaliplatin) | 西妥昔單抗(Cetuximab) | 5-FU | 貝伐單抗(Bevacizumab) | 帕博利珠單抗(Pembrolizumab) |
| NSCLC | 多西他賽(Docetaxel) | 順鉑(Cisplatin) | 阿法替尼(Afatinib) (或其他EGFR TKl) | 奧克珠單抗(Atezollizumab) | 帕博利珠單抗 |
| 腎癌 | 舒尼替尼(Sunitinb) | 帕唑帕尼(Pazopanib) | 坦羅莫司(Temsirolimus) | 貝伐單抗 | 帕博利珠單抗 |
腫瘤尺寸之熱度圖可見於圖35中。
MDA-MB-231細胞株不表現目標蛋白US28。因此，其在此等實驗中用作對照以確定任何抗腫瘤作用是否對癌細胞無特異性，無論所測試BiTE之HCMV編碼之US28目標之表現如何。MAXF401細胞株表現US28，且因此具有所測試BiTE之目標。
如圖36及37中可見，與表現US28之MAXF401細胞株中之陰性對照相比，示例性ECD1結合BiTE分子均以劑量依賴性方式引起供體中之腫瘤尺寸減小。
相比之下，MDA-MB-231細胞株之腫瘤尺寸增加，其驗證以下假設：所測試之BiTE能夠基於與HCMV編碼之US28目標之結合特異性引導抗癌活性。因此，MDA-MB-231細胞株之持續生長並非出人意料的，因為腫瘤將在所測試BiTE之目標表現不存在下持續生長。
因此，此等資料展示腫瘤尺寸之減小視ECD1結合分子之US28目標蛋白之表現而定，且進一步表明BiTE能夠成功地接合T細胞以介導靶向抗癌作用。
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序列
表 1 ：根據Blast搜索，90%之HCMV病毒株展示ECD 4D變體。展示4N變體之病毒株列於下文：
表 2 ：潛在US28結合抗體之表面結合特異性之比較
該比率係基於抗體與*CHO-US28-A1細胞相比於US28陰性對照CHO細胞之表面結合；**表現US28之HEK-293相對於模擬HEK-293膜如由De Groof等人 2019(同上)所報導；***經HCMVAd169感染之MRC-5細胞相對於模擬MRC-5細胞。值＞1意謂表現US28之細胞上之結合高於陰性對照細胞。
表3：由HCMV病毒株DB編碼之US28蛋白結構(SEQ ID No: 5/寄存編號KT959235；突變以粗體文字指示)，及由不同HCMV病毒株編碼之US28蛋白中之突變：
| SEQ ID NO: | 序列 | 描述 |
| SEQ ID NO:1 | MTPTTTTAELTTEFDYDEAATPCVFTDVLNQSKPVTL | US28之N端胞外域1 (ECD1)，如由HCMV病毒株DB (寄存編號KT959235)編碼，對應於SEQ ID NO: 5之位置1-37 |
| SEQ ID NO:2 | QYLLDHNSLAS | US28之胞外域2 (ECD2)，如由HCMV病毒株DB (寄存編號KT959235)編碼，對應於SEQ ID NO: 5之位置91-101 |
| SEQ ID NO:3 | TKKNNQCMTDYDYLEVS | US28之胞外域3 (ECD3)，如由HCMV病毒株DB (寄存編號KT959235)編碼，對應於SEQ ID NO: 5之位置167-183 |
| SEQ ID NO:4 | VDTLKLLKWISSSCEFERSLKRAL | US28之胞外域4 (ECD4)，如由HCMV病毒株DB (寄存編號KT959235)編碼，對應於SEQ ID NO: 5之位置250-273 |
| SEQ ID NO:5 | MTPTTTTAELTTEFDYDEAATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVVTKKNNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株DB編碼之US28之全序列(寄存編號KT959235) |
| SEQ ID NO:6 | TKKNNQCMTDYDYLEVS | US28蛋白之ECD3，如由HCMV病毒株之ECD3 4N變體群組(例如病毒株DB，寄存編號KT959235)編碼 |
| SEQ ID NO:7 | TKKDNQCMTDYDYLEVS | US28蛋白之ECD3，如由HCMV病毒株之ECD3 4D變體群組(例如病毒株AF1，寄存編號GU179291.1)編碼 |
| SEQ ID NO:8 | GFTFTDYY | 1D3之V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 9 | IRSKANGYTT | 1D3之V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 10 | ARDERRTAWLAY | 1D3之V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 11 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLACATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRSKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRSEDSATYYCARDERRTAWLAYWGQGTLVTVSA | 1D3之重組表現之V H序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 12 | EVKLVESGGGLVQPGGSLRLACATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRSKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRSEDSATYYCARDERRTAWLAYWGQGTLVTVSA | 1D3之V H序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 13 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQC | 1D3之重組表現之V H序列的前導序列 |
| SEQ ID NO: 14 | QSIVHSNGNTY | 1D3之V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 15 | KVS | 1D3之V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 16 | FQGSHVPTWT | 1D3之V L-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 17 | MKLPVRLLVLMVWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPTWTFGGGTKLEIK | 1D3之重組表現之V L序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 18 | DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPTWTFGGGTKLEIK | 1D3之V L序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 19 | MKLPVRLLVLMVWIPASSS | 1D3之重組表現之V L序列的前導序列 |
| SEQ ID NO: 20 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQC EVKLVESGGGLVQPGGSLRLACATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRSKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRSEDSATYYCARDERRTAWLAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 1D3之重鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V H序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 21 | MKLPVRLLVLMVWIPASSS DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPTWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 1D3之輕鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V L序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 22 | GGGTTCACCTTCACTGATTACTAT | 編碼如由SEQ ID NO：8所定義之1D3之V H-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 23 | ATTAGAAGCAAAGCTAATGGTTACACAACA | 編碼如由SEQ ID NO: 9所定義之1D3之V H-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 24 | GCAAGAGATGAGCGCCGTACTGCCTGGCTTGCTTAC | 編碼如由SEQ ID NO: 10所定義之1D3之V H-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 25 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGTTCTCTGAGACTCGCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTATATGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCACTTGAGTGGCTGGGTTTTATTAGAAGCAAAGCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTTAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGATCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAGAGATGAGCGCCGTACTGCCTGGCTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGC | 編碼如由SEQ ID NO: 11所定義的1D3之重組表現之V H序列之不成熟形式的核酸序列。編碼前導序列的核酸序列帶下劃線 |
| SEQ ID NO: 26 | GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGTTCTCTGAGACTCGCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTATATGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCACTTGAGTGGCTGGGTTTTATTAGAAGCAAAGCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTTAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGATCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAGAGATGAGCGCCGTACTGCCTGGCTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGC | 編碼無前導序列的如由SEQ ID NO: 12所定義之1D3之V H序列之成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 27 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGT | 編碼如由SEQ ID NO: 13所定義的1D3之重組表現之V H序列的前導序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 28 | CAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTAT | 編碼如由SEQ ID NO：14所定義的1D3之V L-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 29 | AAAGTTTCC | 編碼如由SEQ ID NO: 15所定義的1D3之V L-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 30 | TTTCAAGGTTCACATGTTCCCACGTGGACG | 編碼如由SEQ ID NO: 16所定義的1D3之V L-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 31 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGACTGGTACCTTCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCCACGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 17所定義的1D3之重組表現之V L序列之不成熟形式的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼對應於前導序列之SEQ ID NO: 17之胺基酸序列之位置1-19。 |
| SEQ ID NO: 32 | GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGACTGGTACCTTCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCCACGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA | 編碼無前導序列的如由SEQ ID NO: 18所定義之1D3之V L序列之成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 33 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGT | 編碼如由SEQ ID NO: 19所定義的1D3之重組表現之V L序列的前導序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 34 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGTTCTCTGAGACTCGCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTATATGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCACTTGAGTGGCTGGGTTTTATTAGAAGCAAAGCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTTAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGATCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAGAGATGAGCGCCGTACTGCCTGGCTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA | 編碼如由SEQ ID NO: 20所定義的1D3之重鏈完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 35 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGACTGGTACCTTCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCCACGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG | 編碼如由SEQ ID NO: 21所定義的1D3輕鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 36 | MTPTTTTAELTTEFDYDEAATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKNNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株Toledo (寄存編號GU937742)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 37 | MTPTTTTAELTTEFDYDEDATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株Towne (寄存編號FJ616285)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 38 | MTPTTTTAELTTEFDYDEDATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRGSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株VR1814 (寄存編號GU179289)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 39 | MTPTTTTTELTTEFEYDLGATPCTFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSVGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株TB40/E (寄存編號KF297339)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 40 | MTPTTTTAELTTEFDYDEDATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRGSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株Merlin (寄存編號AY446894)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 41 | MTPTTTTAELTTEFDYDEAATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株JP (寄存編號GQ221975)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 42 | MTPTTTTAELTTEFDYDEDATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株Ad169 (寄存編號X17403.1)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 43 | MTPPTTTAELTTEFDYDEAATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株AF1 (寄存編號GU179291.1)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 44 | MTPTTTTAELTTEFDYDDEATPCVLTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFEKSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEACRVSQIIP | 由HCMV病毒株VHL/E (寄存編號L20501.1)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 45 | MTPTTTTAELTTEFDYDEDATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNIELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFEKSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEACRVSQIIP | 由HCMV病毒株DAVIS (寄存編號JX512198.1)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 46 | MTPTTTTAELTTEFDYDEAATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFIFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKNNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFEKSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | 由HCMV病毒株TR (寄存編號KF021605.1)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 47 | MTPTTTTAELTTEFDYDEAATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVVTKKNNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIPAAALEGSHHHHHH | US28融合蛋白，包含來自HCMV DB病毒株(寄存編號：KT959235)之US28序列，在其C端部分融合至6His標籤 |
| SEQ ID NO: 48 | QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS | 小鼠OKT3 (mOKT3)重鏈可變區 |
| SEQ ID NO: 49 | RYTMH | OKT3 V H-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 50 | YINPSRGYTNYNQKFK | OKT3 V H-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 51 | YCARYYDD | OKT3 V H-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 52 | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN | mOKT3輕鏈可變區 |
| SEQ ID NO: 53 | SASSSVSYMNW | OKT3 V L-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 54 | TSKLASG | OKT3 V L-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 55 | QWSSNPFTF | OKT3 V L-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 56 | GGGGSGGGGSGGGGS | 連接序列 |
| SEQ ID NO: 57 | GGGGS | 部分連接序列 |
| SEQ ID NO: 58 | [EVKLVESGGGLVQPGGSLRLACATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRSKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRSEDSATYYCARDERRTAWLAYWGQGTLVTVSA][ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP][SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT][KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK][GGGGSGGGGS][QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS][GGGGSGGGGSGGGGS][QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN] | 較佳BiTE分子之第一多肽序列，該分子包含包括1D3之VH區的重鏈序列、連接序列及mOKT3 scFv之序列 對於額外資訊，序列之獨立功能區塊之起始及結束分別由「[」及「]」指示，儘管應理解，第一多肽以所展現之次序在單一連續多肽鏈中含有所有此等序列。 |
| SEQ ID NO: 59 | [DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPTWTFGGGTKLEIK][RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] | 較佳BiTE分子之第二多肽序列，該分子包含包括1D3之VL區的輕鏈序列或具有SQE ID NO: 59之序列之實例 對於額外資訊，序列之獨立功能區塊之起始及結束分別由「[」及「]」指示，儘管應理解，第一多肽在單一連續多肽鏈中含有所有此等序列。 |
| SEQ ID NO: 60 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAVSGPGLIFKFTGVAWYRRQVPGAKRGLVALITGDGATRYGDSVKGRFTVSRDIAAKRVYLEMNDLRSEDTAVYYCKTGEYWGQGTQVTVSS | VUN100之核心序列，如WO 2019/151865之第24頁所展示 |
| SEQ ID NO: 61 | MHSSALLCCLVLLTGVRAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAVSGPGLIFKFTGVAWYRRQVPGAKRGLVALITGDGATRYGDSVKGRFTVSRDIAAKRVYLEMNDLRSEDTAVYYCKTGEYWGQGTQVTVSS EQKLISEEDLHHHHHH | SEQ ID NO: 60之VUN100序列，具有額外N端信號肽(帶下劃線)及C端Myc-6His標籤序列(帶雙下劃線) |
| SEQ ID NO: 62 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAVSGPGLIFKFTGVAWYRRQVPGAKRGLVALITGDGATRYGDSVKGRFTVSRDIAAKRVYLEMNDLRSEDTAVYYCKTGEYWGQGTQVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAVSGPGLIFKFTGVAWYRRQVPGAKRGLVALITGDGATRYGDSVKGRFTVSRDIAAKRVYLEMNDLRSEDTAVYYCKTGEYWGQGTQVTVSS | VUN100b為二價VUN100分子，由VUN100之兩個藉由連接序列接合之複本組成(連接序列帶下劃線) |
| SEQ ID NO: 63 | MHSSALLCCLVLLTGVRAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAVSGPGLIFKFTGVAWYRRQVPGAKRGLVALITGDGATRYGDSVKGRFTVSRDIAAKRVYLEMNDLRSEDTAVYYCKTGEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAVSGPGLIFKFTGVAWYRRQVPGAKRGLVALITGDGATRYGDSVKGRFTVSRDIAAKRVYLEMNDLRSEDTAVYYCKTGEYWGQGTQVTVSS EQKLISEEDLHHHHHH | SEQ ID NO: 62之VUN100b序列，具有額外N端信號肽(帶下劃線)及C端Myc-6His標籤序列(帶雙下劃線) |
| SEQ ID NO: 65 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGGCGGGTCTACTATGATTACGACGGGGCTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA | 編碼如由SEQ ID NO: 67所定義的1G9之重組表現之VH序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 66 | GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGGCGGGTCTACTATGATTACGACGGGGCTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA | 編碼如由SEQ ID NO: 68所定義的1G9之VH序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 67 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGGSTMITTGLGFAYWGQGTLVTVSA | 1G9之重組表現之V H序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 68 | EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGGSTMITTGLGFAYWGQGTLVTVSA | 1G9之VH序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 69 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 71所定義的1G9之重組表現之VL序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 70 | CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 72所定義的1G9之VL序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 71 | MKLPVRLLVLMVWIPASSSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPLTFGAGTKLELK | 1G9之重組表現之VL序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 72 | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPLTFGAGTKLELK | 1G9之VL序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 73 | AGCTATGCCATGTCT | 編碼如由SEQ ID NO: 76所定義之1G9、1E8之VH-CDR1序列之核酸 |
| SEQ ID NO: 74 | TCCATTAGTAGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGC | 編碼如由SEQ ID NO: 77所定義的1G9之VH-CDR2序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 75 | GGCGGGTCTACTATGATTACGACGGGGCTGGGGTTTGCTTAC | 編碼如由SEQ ID NO: 78所定義的1G9之VH-CDR3序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 76 | SYAMS | 1G9、1E8之VH-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 77 | SISSGGSTYYPDSVKG | 1G9之VH-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 78 | GGSTMITTGLGFAY | 1G9之VH-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 79 | AGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCAC | 編碼如由SEQ ID NO: 82所定義之1G9、1E8之VL-CDR1序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 80 | GACACATCCAAACTGGCTTCT | 編碼如由SEQ ID NO: 83所定義之1G9、1C10、1A10之VL-CDR2序列之核酸 |
| SEQ ID NO: 81 | CAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCCTCACG | 編碼如由SEQ ID NO: 84所定義之1G9之VL-CDR3序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 82 | SASSSVSYMH | 1G9、1E8之VL-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 83 | DTSKLAS | 1G9、1C10、1A10之VL-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 84 | QQWSSNPPLT | 1G9之VL-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 85 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGAACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATCTATTACTGTGCACGAGGCGGGACTCGTCATTCCTACGGCAACGGGTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | 編碼如由SEQ ID NO: 87所定義的1E8之重組表現之VH序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 86 | GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGAACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATCTATTACTGTGCACGAGGCGGGACTCGTCATTCCTACGGCAACGGGTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | 編碼如由SEQ ID NO: 88所定義的1E8之VH序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 87 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGRTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAIYYCARGGTRHSYGNGFDYWGQGTTLTVSS | 1E8之重組表現之V H序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 88 | EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGRTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAIYYCARGGTRHSYGNGFDYWGQGTTLTVSS | 1E8之VH序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 89 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACTCATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 91所定義的1E8之重組表現之VL序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 90 | CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACTCATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 92所定義的1E8之VL序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 91 | MKLPVRLLVLMVWIPASSSQIVLSQSPTIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTSNPPITFGAGTKLELK | 1E8之重組表現之VL序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 92 | QIVLSQSPTIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTSNPPITFGAGTKLELK | 1E8之VL序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 93 | TCCATTAGTAGTGGTGGTAGAACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGC | 編碼如由SEQ ID NO: 95所定義之1E8之VH-CDR2序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 94 | GGCGGGACTCGTCATTCCTACGGCAACGGGTTTGACTAC | 編碼如由SEQ ID NO: 96所定義的1E8之VH-CDR3序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 95 | SISSGGRTYYPDSVKG | 1E8之VH-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 96 | GGTRHSYGNGFDY | 1E8之VH-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 97 | GACTCATCCAAACTGGCTTCT | 編碼如由SEQ ID NO: 99所定義的1E8之VL-CDR2序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 98 | CAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCATCACG | 編碼如由SEQ ID NO: 100所定義的1E8之VL-CDR3序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 99 | DSSKLAS | 1E8之VL-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 100 | QQWTSNPPIT | 1E8之VL-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 101 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAACTGGTTGAGTCTGGGGGAGTCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCCATGCCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTCGTGGTCGAACCTACTATCCAGACAGTGTAAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGAGGCGGGACTCATTATTCCTACGGCAACGGTTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | 編碼如由SEQ ID NO: 103所定義的1C10之重組表現之VH序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 102 | GAAGTGAAACTGGTTGAGTCTGGGGGAGTCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCCATGCCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTCGTGGTCGAACCTACTATCCAGACAGTGTAAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGAGGCGGGACTCATTATTCCTACGGCAACGGTTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | 編碼如由SEQ ID NO: 104所定義的1C10之VH序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 103 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGVLVKPGGSLKFSCAASGFTFSSHALSWVRQTPEKRLEWVASISSRGRTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILYLQVSSLRSEDTAMYYCTRGGTHYSYGNGFDFWGQGTTLTVSS | 1C10之重組表現之V H序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 104 | EVKLVESGGVLVKPGGSLKFSCAASGFTFSSHALSWVRQTPEKRLEWVASISSRGRTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILYLQVSSLRSEDTAMYYCTRGGTHYSYGNGFDFWGQGTTLTVSS | 1C10之VH序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 105 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAATAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 107所定義的1C10之重組表現之VL序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 106 | CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAATAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 108所定義的1C10之VL序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 107 | MKLPVRLLVLMVWIPASSSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSNNPPITFGAGTKLELK | 1C10之重組表現之VL序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 108 | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSNNPPITFGAGTKLELK | 1C10之VL序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 109 | AGCCATGCCTTGTCT | 編碼如由SEQ ID NO: 112所定義之1C10、1A10之VH-CDR1序列之核酸 |
| SEQ ID NO: 110 | TCCATTAGTAGTCGTGGTCGAACCTACTATCCAGACAGTGTAAAGGGC | 編碼如由SEQ ID NO: 113所定義之1C10、1A10之VH-CDR2序列之核酸 |
| SEQ ID NO: 111 | GGCGGGACTCATTATTCCTACGGCAACGGTTTTGACTTC | 編碼如由SEQ ID NO: 114所定義之1C10、1A10之VH-CDR3序列之核酸 |
| SEQ ID NO: 112 | SHALS | 1C10、1A10之VH-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 113 | SISSRGRTYYPDSVKG | 1C10、1A10之VH-CDR2序列 |
| SEQ ID NO: 114 | GGTHYSYGNGFDF | 1C10、1A10之VH-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 115 | AGTGTCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCAC | 編碼如由SEQ ID NO: 117所定義之1C10、1A10之VL-CDR1序列之核酸 |
| SEQ ID NO: 116 | CAGCAGTGGAGTAATAACCCACCCATCACG | 編碼如由SEQ ID NO: 118所定義之1C10、1A10之VL-CDR3序列的核酸 |
| SEQ ID NO: 117 | SVSSSVSYMH | 1C10、1A10之VL-CDR1序列 |
| SEQ ID NO: 118 | QQWSNNPPIT | 1C10、1A10之VL-CDR3序列 |
| SEQ ID NO: 119 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAACTGGTTGAGTCTGGGGGAGTCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTCTCAGTAGCCATGCCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTCGTGGTCGAACCTACTATCCAGACAGTGTAAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGAGGCGGGACTCATTATTCCTACGGCAACGGTTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | 編碼如由SEQ ID NO: 121所定義的1A10之重組表現之VH序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 120 | GAAGTGAAACTGGTTGAGTCTGGGGGAGTCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTCTCAGTAGCCATGCCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTCGTGGTCGAACCTACTATCCAGACAGTGTAAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGAGGCGGGACTCATTATTCCTACGGCAACGGTTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | 編碼如由SEQ ID NO: 122所定義的1A10之VH序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 121 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGVLVKPGGSLKFSCAASGFTLSSHALSWVRQTPEKRLEWVASISSRGRTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILYLQVSSLRSEDTAMYYCTRGGTHYSYGNGFDFWGQGTTLTVSS | 1A10之重組表現之V H序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 122 | EVKLVESGGVLVKPGGSLKFSCAASGFTLSSHALSWVRQTPEKRLEWVASISSRGRTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILYLQVSSLRSEDTAMYYCTRGGTHYSYGNGFDFWGQGTTLTVSS | 1A10之成熟形式之VH序列，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 123 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAATAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO：125所定義的1A10之重組表現之VL序列之不成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 124 | CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAATAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA | 編碼如由SEQ ID NO: 126所定義的1A10之VL序列之成熟形式的核酸 |
| SEQ ID NO: 125 | MKLPVRLLVLMVWIPASSSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSNNPPITFGAGTKLELK | 1A10之重組表現之VL序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 126 | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSNNPPITFGAGTKLELK | 1A10之VL序列的成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 127 | MTPTTTTAELTTEFDYDEDAAPCVLTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFLDTLKLLKWISSSCEFEKSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEACRVSQIIP | 由HCMV病毒株BL (寄存編號MW980585.1)編碼之US28之全序列。ECD3的序列帶下劃線。 |
| SEQ ID NO: 147 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGGCGGGTCTACTATGATTACGACGGGGCTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCACAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA | 編碼如SEQ ID NO: 149所定義之1G9之重鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 148 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG | 編碼如由SEQ ID NO: 150所定義的1G9輕鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 149 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQC EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGGSTMITTGLGFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 1G9重鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V H序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 150 | MKLPVRLLVLMVWIPASSS QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 1G9輕鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V L序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 151 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGAACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATCTATTACTGTGCACGAGGCGGGACTCGTCATTCCTACGGCAACGGGTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCACAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA | 編碼如SEQ ID NO: 153所定義之1E8之重鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 152 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACTCATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG | 編碼如由SEQ ID NO: 154所定義的1E8輕鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 153 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQC EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGRTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAIYYCARGGTRHSYGNGFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 1E8重鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V H序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 154 | MKLPVRLLVLMVWIPASSS QIVLSQSPTIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTSNPPITFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 1E8輕鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V L序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 155 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAACTGGTTGAGTCTGGGGGAGTCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCCATGCCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTCGTGGTCGAACCTACTATCCAGACAGTGTAAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGAGGCGGGACTCATTATTCCTACGGCAACGGTTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCACAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA | 編碼如SEQ ID NO: 157所定義之1C10之重鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 156 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAATAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG | 編碼如由SEQ ID NO: 158所定義的1C10輕鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 157 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQC EVKLVESGGVLVKPGGSLKFSCAASGFTFSSHALSWVRQTPEKRLEWVASISSRGRTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILYLQVSSLRSEDTAMYYCTRGGTHYSYGNGFDFWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 1C10重鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V H序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 158 | MKLPVRLLVLMVWIPASSS QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSNNPPITFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 1C10輕鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V L序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 159 | ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTGAAACTGGTTGAGTCTGGGGGAGTCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTCTCAGTAGCCATGCCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTCGTGGTCGAACCTACTATCCAGACAGTGTAAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGAGGCGGGACTCATTATTCCTACGGCAACGGTTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCACAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA | 編碼如SEQ ID NO: 161所定義之1A10之重鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 160 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGGTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAATAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG | 編碼如由SEQ ID NO: 162所定義的1A10輕鏈之完整序列的核酸序列。帶下劃線的核酸序列編碼前導序列，該前導序列在成熟表現之蛋白質中經移除。 |
| SEQ ID NO: 161 | MKLWLNWIFLVTLLNGIQC EVKLVESGGVLVKPGGSLKFSCAASGFTLSSHALSWVRQTPEKRLEWVASISSRGRTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILYLQVSSLRSEDTAMYYCTRGGTHYSYGNGFDFWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 1A10重鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V H序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 162 | MKLPVRLLVLMVWIPASSS QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSNNPPITFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 1A10輕鏈之完整序列。前導序列帶下劃線；其在成熟序列中經移除。成熟V L序列以粗體顯示。 |
| SEQ ID NO: 167 | S(Y/H)A(M/L)S | ECD3 V H-CDR1共有序列 |
| SEQ ID NO: 168 | SISS(G/R)G(S/R)TYYPDSVKG | ECD3 V H-CDR2共有序列，變體1 |
| SEQ ID NO: 169 | GG(S/T)(T/R/H)(M/H/Y)(I/S)(T/Y)(T/G)(G/N)(L/*)GF(A/D)(Y/F) | ECD3 V H-CDR3共有序列，變體1 |
| SEQ ID NO: 170 | S(A/V)SSSVSYMH | ECD3 V L-CDR1共有序列 |
| SEQ ID NO: 171 | D(T/S)SKLAS | ECD3 V L-CDR2共有序列 |
| SEQ ID NO: 172 | QQW(S/T/*)SN(*/N)PP(I/L)T | ECD3 V L-CDR3共有序列，變體1 |
| SEQ ID NO: 173 | MT Q TTT _T ELTTEF D YD LG A AL C TL TDVLNQSKP I TLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWM QYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVV TKK D NQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLF L DTLKLLKWISSSCE S E K SLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIP | US28突變病毒株(人工產生)。應注意，該空間指示關於突變序列(其不存在於序列表中之此序列之型式中)的缺失。帶下劃線的部分依序分別對應於N端(亦即ECD1)、ECD2、ECD3及ECD4。帶有粗體下劃線和加粗文本的胺基酸指示已發生突變的位置。 |
| SEQ ID NO: 174 | SISS(G/R)GRTYYPDSVKG | ECD3 V H-CDR2共有序列，變體2 |
| SEQ ID NO: 175 | GG(S/T)(T/R/H)(M/H/Y)(I/S)(T/Y)(T/G)(G/N)GF(A/D)(Y/F) | ECD3 V H-CDR3共有序列，變體2 |
| SEQ ID NO: 176 | QQW(T/*)SN(*/N)PPIT | V L-CDR3共有序列，變體2 |
| SEQ ID NO: 177 | TDVLNQSKPVTL | US28蛋白之ECD1之保守抗原決定基 |
| SEQ ID NO: 178 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGCTAAACCCGGCGCTTCTGTGAAAATGTCTTGTAAAGCCTCAGGCTATACCTTCACATCCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGACCCGGCCAGGGACTGGAATGGATTGGATACATCAACCCCTCAACCGGCTACGCCGAGTATAACCAGAAATTCAAGGACAAGGCTACCCTGACCGCCGACAAAAGCAGCTCAACCGCTTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGATTCTGCTGTGTACTACTGCGCCAGACTGAGATTCGGCAGCAGCGGATTCGCCTACTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCCGCTAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCGCAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGATTCTAGA | 編碼4H3C3之重鏈之完整序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 179 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCCAGATCGTGCTGACCCAGTCACCAAGCAGCCTGGCTGTGTCTGTGGGAGAAAAGGTGACCATGAGCTGCAAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGTCACCCAAACTGCTGATCTATTGGGCCAGCACCTGGGAGAGCGGAGTGCCTGATAGATTCACCGGGTCCGGAAGCGGAACAGACTTCACACTGACCATTAGCAGCGTGAAAGCTGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTTCCCCTGACCTTTGGAGCCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGAGAGCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTGATTCTAGA | 編碼4H3C3之輕鏈之完整序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 180 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAQVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 4H3C3之重鏈之完整胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 181 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAQIVLTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTWESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 4H3C3之輕鏈之完整胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 182 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGCTAAACCCGGCGCTTCTGTGAAAATGTCTTGTAAAGCCTCAGGCTATACCTTCACATCCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGACCCGGCCAGGGACTGGAATGGATTGGATACATCAACCCCTCAACCGGCTACGCCGAGTATAACCAGAAATTCAAGGACAAGGCTACCCTGACCGCCGACAAAAGCAGCTCAACCGCTTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGATTCTGCTGTGTACTACTGCGCCAGACTGAGATTCGGCAGCAGCGGATTCGCCTACTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCC | 編碼4H3C3之重組表現之VH序列的不成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 183 | CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGCTAAACCCGGCGCTTCTGTGAAAATGTCTTGTAAAGCCTCAGGCTATACCTTCACATCCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGACCCGGCCAGGGACTGGAATGGATTGGATACATCAACCCCTCAACCGGCTACGCCGAGTATAACCAGAAATTCAAGGACAAGGCTACCCTGACCGCCGACAAAAGCAGCTCAACCGCTTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGATTCTGCTGTGTACTACTGCGCCAGACTGAGATTCGGCAGCAGCGGATTCGCCTACTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCC | 編碼4H3C3之VH序列之成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 184 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCCAGATCGTGCTGACCCAGTCACCAAGCAGCCTGGCTGTGTCTGTGGGAGAAAAGGTGACCATGAGCTGCAAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGTCACCCAAACTGCTGATCTATTGGGCCAGCACCTGGGAGAGCGGAGTGCCTGATAGATTCACCGGGTCCGGAAGCGGAACAGACTTCACACTGACCATTAGCAGCGTGAAAGCTGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTTCCCCTGACCTTTGGAGCCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG | 編碼4H3C3之重組表現之VL序列的不成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 185 | CAGATCGTGCTGACCCAGTCACCAAGCAGCCTGGCTGTGTCTGTGGGAGAAAAGGTGACCATGAGCTGCAAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGTCACCCAAACTGCTGATCTATTGGGCCAGCACCTGGGAGAGCGGAGTGCCTGATAGATTCACCGGGTCCGGAAGCGGAACAGACTTCACACTGACCATTAGCAGCGTGAAAGCTGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTTCCCCTGACCTTTGGAGCCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG | 編碼4H3C3之VL序列之成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 186 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAQVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 4H3C3之重組表現之VH序列的不成熟形式，其中位置1-19 對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 187 | QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 4H3C3之VH序列之成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 188 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAQIVLTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTWESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK | 4H3C3之重組表現之VL序列的不成熟形式，其中位置1-19 對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 189 | QIVLTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTWESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK | 4H3C3之VL序列之成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 190 | TCCTACTGGATGCAC | 編碼4H3C3之VH-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 191 | TACATCAACCCCTCAACCGGCTACGCCGAGTATAACCAGAAATTCAAGGAC | 編碼4H3C3之VH-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 192 | CTGAGATTCGGCAGCAGCGGATTCGCCTAC | 編碼4H3C3之VH-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 193 | AAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCC | 編碼4H3C3之VL-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 194 | TGGGCCAGCACCTGGGAGAGC | 編碼4H3C3之VL-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 195 | CAGCAGTACTACAGCTTTCCCCTGACC | 編碼4H3C3之VL-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 196 | SYWMH | 4H3C3之VH-CDR1胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 197 | YINPSTGYAEYNQKFKD | 4H3C3之VH-CDR2胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 198 | LRFGSSGFAY | 4H3C3之VH-CDR3胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 199 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 4H3C3、7B1F3及2F5B11之VL-CDR1胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 200 | WASTWES | 4H3C3之VL-CDR2胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 201 | QQYYSFPLT | 4H3C3之VL-CDR3胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 202 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGTGGAGCTGAGCTGGCTAAGCCTGGAGCTAGTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACATTTACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGACAGGGACTGGAATGGATTGGATACGTGAACCCCAGAACAGGATACACCGAGTACAACCAGAAGTTCAAAGACAAAGCCACCCTGACCGCCGACAAAAGCAGCAGAACCGCTTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGATTCTGCTGTGTACAGTTGCGCCAGAATCCTGAACGGCACCGGATTTGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTGCTGCTAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCGCAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGATTCTAGA | 編碼7B1F3之重鏈之完整序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 203 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGATATTGTGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGACAGTGTCTGTGGGAGAAAAGTTTACCATGAGCTGTAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGTCACCCAAGCTGCTGATTTACTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGAGTGCCTGATAGATTCACCGGCAGCGGAAGCGGAACCGATTTCACACTGGCTATCAGCAGCGTGAAGCCCGAGGATCTGGCTATCTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTCCCACTGACCTTCGGCGCCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGAGAGCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTGATTCTAGA | 編碼7B1F3之輕鏈之完整序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 204 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAEVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSRTAYMQLSSLTSEDSAVYSCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 7B1F3之重鏈之完整胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 205 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRADIVLTQSPSSLTVSVGEKFTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLAISSVKPEDLAIYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 7B1F3之輕鏈之完整胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 206 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGTGGAGCTGAGCTGGCTAAGCCTGGAGCTAGTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACATTTACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGACAGGGACTGGAATGGATTGGATACGTGAACCCCAGAACAGGATACACCGAGTACAACCAGAAGTTCAAAGACAAAGCCACCCTGACCGCCGACAAAAGCAGCAGAACCGCTTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGATTCTGCTGTGTACAGTTGCGCCAGAATCCTGAACGGCACCGGATTTGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTGCT | 編碼7B1F3之重組表現之VH序列的不成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 207 | GAAGTGCAGCTGCAGCAGAGTGGAGCTGAGCTGGCTAAGCCTGGAGCTAGTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACATTTACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGACAGGGACTGGAATGGATTGGATACGTGAACCCCAGAACAGGATACACCGAGTACAACCAGAAGTTCAAAGACAAAGCCACCCTGACCGCCGACAAAAGCAGCAGAACCGCTTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGATTCTGCTGTGTACAGTTGCGCCAGAATCCTGAACGGCACCGGATTTGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTGCT | 編碼7B1F3之VH序列之成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 208 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGATATTGTGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGACAGTGTCTGTGGGAGAAAAGTTTACCATGAGCTGTAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGTCACCCAAGCTGCTGATTTACTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGAGTGCCTGATAGATTCACCGGCAGCGGAAGCGGAACCGATTTCACACTGGCTATCAGCAGCGTGAAGCCCGAGGATCTGGCTATCTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTCCCACTGACCTTCGGCGCCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG | 編碼7B1F3之重組表現之VL序列的不成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 209 | GATATTGTGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGACAGTGTCTGTGGGAGAAAAGTTTACCATGAGCTGTAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGTCACCCAAGCTGCTGATTTACTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGAGTGCCTGATAGATTCACCGGCAGCGGAAGCGGAACCGATTTCACACTGGCTATCAGCAGCGTGAAGCCCGAGGATCTGGCTATCTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTCCCACTGACCTTCGGCGCCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG | 編碼7B1F3之VL序列之成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 210 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAEVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSRTAYMQLSSLTSEDSAVYSCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSA | 7B1F3之重組表現之VH序列的不成熟形式，其中位置1-19 對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 211 | EVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSRTAYMQLSSLTSEDSAVYSCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSA | 7B1F3之VH序列之成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 212 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRADIVLTQSPSSLTVSVGEKFTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLAISSVKPEDLAIYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK | 7B1F3之重組表現之VL序列的不成熟形式，其中位置1-19 對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 213 | DIVLTQSPSSLTVSVGEKFTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLAISSVKPEDLAIYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK | 7B1F3之VL序列之成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 214 | AACTACTGGATGCAC | 編碼7B1F3之VH-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 215 | TACGTGAACCCCAGAACAGGATACACCGAGTACAACCAGAAGTTCAAAGAC | 編碼7B1F3之VH-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 216 | ATCCTGAACGGCACCGGATTTGCCTAC | 編碼7B1F3之VH-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 217 | TGGGCCAGCACCCGGGAAAGC | 編碼7B1F3之VL-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 218 | CAGCAGTACTACAGCTTCCCACTGACC | 編碼7B1F3之VL-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 219 | NYWMH | 7B1F3之VH-CDR1胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 220 | YVNPRTGYTEYNQKFKD | 7B1F3之VH-CDR2胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 221 | ILNGTGFAY | 7B1F3之VH-CDR3胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 222 | WASTRES | 7B1F3之VL-CDR2胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 223 | QQYYSFPLT | 7B1F3之VL-CDR3胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 224 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGAAGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGAGCTGAGCTGGCTAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGATGAGCTGTAAGGCCAGCGGATACACATTTAGTAGCTATTGGATTCATTGGATCAAGCAGAGACCTGGCCAGGGACTGGAATGGATTGGATACATCAACCCCAACACCGCCTATACCGAGTTCAACCAGAAATTCATGGACAAGGCCACCCTGACCGCCGATAAAAGCAGCTCAACCGCCTACATGCAGCTGACCAGCCTGACAAGCGAAGACAGCGCTGTGTACTATTGCGCCAGGCTGAGAAGCGACAGAACCGGATTCGCCTACTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGAGTGCCGCTAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCGCAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCATCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGATTCTAGA | 編碼2F5B11之重鏈之VL完整序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 225 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCCAGATCGTGCTGACCCAGTCACCAAGCAGCCTGGCTGTGTCTGTGGGAGAAAAGGTGACCATGAGCTGCAAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGTCACCCAAAGTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATACGGCGTGCCTGATAGATTCACCGGCAGCGGAAGCGGAACCGATTTCACACTGACTATTAGCAGCGTGAAGGCTGAAGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTCCCCCTGACCTTTGGAGCCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGAGAGCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTGATTCTAGA | 編碼2F5B11之輕鏈之VL完整序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 226 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAEVQLQESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFSSYWIHWIKQRPGQGLEWIGYINPNTAYTEFNQKFMDKATLTADKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARLRSDRTGFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK | 2F5B11之重鏈之完整序列 |
| SEQ ID NO: 227 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAQIVLTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKVLIYWASTREYGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC | 2F5B11之輕鏈之完整序列 |
| SEQ ID NO: 228 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGAAGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGAGCTGAGCTGGCTAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGATGAGCTGTAAGGCCAGCGGATACACATTTAGTAGCTATTGGATTCATTGGATCAAGCAGAGACCTGGCCAGGGACTGGAATGGATTGGATACATCAACCCCAACACCGCCTATACCGAGTTCAACCAGAAATTCATGGACAAGGCCACCCTGACCGCCGATAAAAGCAGCTCAACCGCCTACATGCAGCTGACCAGCCTGACAAGCGAAGACAGCGCTGTGTACTATTGCGCCAGGCTGAGAAGCGACAGAACCGGATTCGCCTACTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGAGTGCC | 編碼2F5B11之重組表現之VH序列之VL不成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 229 | GAAGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGAGCTGAGCTGGCTAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGATGAGCTGTAAGGCCAGCGGATACACATTTAGTAGCTATTGGATTCATTGGATCAAGCAGAGACCTGGCCAGGGACTGGAATGGATTGGATACATCAACCCCAACACCGCCTATACCGAGTTCAACCAGAAATTCATGGACAAGGCCACCCTGACCGCCGATAAAAGCAGCTCAACCGCCTACATGCAGCTGACCAGCCTGACAAGCGAAGACAGCGCTGTGTACTATTGCGCCAGGCTGAGAAGCGACAGAACCGGATTCGCCTACTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGAGTGCC | 編碼2F5B11之VH序列之VL成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 230 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCCAGATCGTGCTGACCCAGTCACCAAGCAGCCTGGCTGTGTCTGTGGGAGAAAAGGTGACCATGAGCTGCAAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGTCACCCAAAGTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATACGGCGTGCCTGATAGATTCACCGGCAGCGGAAGCGGAACCGATTTCACACTGACTATTAGCAGCGTGAAGGCTGAAGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTCCCCCTGACCTTTGGAGCCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG | 編碼2F5B11之重組表現之VL序列之VL不成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 231 | CAGATCGTGCTGACCCAGTCACCAAGCAGCCTGGCTGTGTCTGTGGGAGAAAAGGTGACCATGAGCTGCAAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGTCACCCAAAGTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATACGGCGTGCCTGATAGATTCACCGGCAGCGGAAGCGGAACCGATTTCACACTGACTATTAGCAGCGTGAAGGCTGAAGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTCCCCCTGACCTTTGGAGCCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG | 編碼2F5B11之VL序列之VL成熟形式的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 232 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAEVQLQESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFSSYWIHWIKQRPGQGLEWIGYINPNTAYTEFNQKFMDKATLTADKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARLRSDRTGFAYWGQGTLVTVSA | 2F5B11之重組表現之VH序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 233 | EVQLQESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFSSYWIHWIKQRPGQGLEWIGYINPNTAYTEFNQKFMDKATLTADKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARLRSDRTGFAYWGQGTLVTVSA | 2F5B11之VH序列之成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 234 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRAQIVLTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKVLIYWASTREYGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK | 2F5B11之重組表現之VL序列的不成熟形式，其中位置1-19對應於前導序列 |
| SEQ ID NO: 235 | QIVLTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKVLIYWASTREYGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSFPLTFGAGTKLEIK | 2F5B11之VL序列之成熟形式，無前導序列 |
| SEQ ID NO: 236 | AGCTATTGGATTCAT | 編碼2F5B11之VH-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 237 | TACATCAACCCCAACACCGCCTATACCGAGTTCAACCAGAAATTCATGGAC | 編碼2F5B11之VH-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 238 | CTGAGAAGCGACAGAACCGGATTCGCCTAC | 編碼2F5B11之VH-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 239 | AAAAGCTCACAGAGCCTGCTGTACAGCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCC | 編碼2F5B11之VL-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 240 | TGGGCCAGCACCAGAGAATAC | 編碼2F5B11之VL-CDR2序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 241 | CAGCAGTACTACAGCTTCCCCCTGACC | 編碼2F5B11之VL-CDR3序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 242 | SYWIH | 2F5B11之VH-CDR1胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 243 | YINPNTAYTEFNQKFMD | 2F5B11之VH-CDR2胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 244 | LRSDRTGFAY | 2F5B11之VH-CDR3胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 245 | WASTREY | 2F5B11之VL-CDR2胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 246 | QQYYSFPLT | 2F5B11之VL-CDR3胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 247 | (S/N)YW(M/I)H | ECD1 V H-CDR1共有序列 |
| SEQ ID NO: 248 | Y(I/V)NP(S/R/N)T(G/A)Y(A/T)E(Y/F)NQKF(K/M)D | ECD1 V H-CDR2共有序列 |
| SEQ ID NO: 249 | (L/I)(R/L)(F/N/S)(G/D)(S/*/R)(S/T)GFAY | ECD1 V H-CDR3共有序列 |
| SEQ ID NO: 250 | WAST(W/R)E(S/Y) | ECD1 V L-CDR2共有序列 |
| SEQ ID NO: 251 | AAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC | 編碼7B1F3之VL-CDR1序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 252 | GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCC | 編碼ECD1結合分子之重組表現之V H序列之前導序列的核酸序列 |
| SEQ ID NO: 253 | GRKLQDRLAKEGMHSSALLCCLVLLTGVRA | ECD1結合分子之重組表現之V H及V L序列的前導序列(亦稱為信號肽) |
| SEQ ID NO: 254 | MTPTTTTTELTTEFEYDLGATPCTFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSVGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVVTKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIPAAALEGSHHHHHH | US28融合蛋白，包含來自HCMV TB40/E病毒株之US28序列 |
| SEQ ID NO: 255 | MTQTTTTELTTEFDYDLGAALCTLTDVLNQSKPITLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVVTKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFLDTLKLLKWISSSCESEKSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIPAAALEGSHHHHHH | US28融合蛋白，包含來自HCMV突變病毒株之US28序列 |
| SEQ ID NO: 256 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKFQGRATLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 4H3C3 VH1. |
| SEQ ID NO: 257 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYAEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 4H3C3 VH2 |
| SEQ ID NO: 258 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSTGYAEYNQKLQGRATLTADKSSSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 4H3C3 VH3. |
| SEQ ID NO: 259 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYAEYNQKLQGRVTMTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARLRFGSSGFAYWGQGTLVTVSS | 4H3C3 VH4. |
| SEQ ID NO: 260 | QIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTWESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 4H3C3 VL1 |
| SEQ ID NO: 261 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 4H3C3 VL2及7B1F3 VL2 |
| SEQ ID NO: 262 | QIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTWESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 4H3C3 VL3 |
| SEQ ID NO: 263 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 4H3C3 VL4及7B1F3 VL4 |
| SEQ ID NO: 264 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFQGRATLTADKSSRTAYMELSSLRSEDTAVYSCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 7B1F3 VH1 |
| SEQ ID NO: 265 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 7B1F3 VH2 |
| SEQ ID NO: 266 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQQLQGRATLTADKSSRTAYMELRSLRSDDTAVYSCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 7B1F3 VH3 |
| SEQ ID NO: 267 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQQLQGRVTMTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARILNGTGFAYWGQGTLVTVSS | 7B1F3 VH4 |
| SEQ ID NO: 268 | DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 7B1F3 VL1 |
| SEQ ID NO: 269 | DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCQQYYSFPLTFGGGTKLEIK | 7B1F3 VL3 |
| SEQ ID NO: 270 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGYVNPRTGYTEYNQKFQGRATLTADKSSRTAYMELSSLRSEDTAVYSCARILQGTGFAYWGQGTLVTVSS | 7B1F3 VH5 |
| SEQ ID NO: 271 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGYVNPRTGYTEYNQKFQGRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARILQGTGFAYWGQGTLVTVSS | 7B1F3 VH6 |
| SEQ ID NO: 272 | MTPTTTTAELTTEFDYDDEATPCVLTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVVTKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFEKSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRSSPSRRETSSDTLSDEACRVSQIIPAAALEGSHHHHHH | US28融合蛋白，包含來自HCMV VHL/E病毒株之US28序列 |
| SEQ ID NO: 273 | MTPTTTTAELTTEFDYDEDATPCVFTDVLNQSKPVTLFLYGVVFLFGSIGNFLVIFTITWRRRIQCSGDVYFINLAAADLLFVCTLPLWMQYLLDHNSLASVPCTLLTACFYVAMFASLCFITEIALDRYYAIVYMRYRPVKQACLFSIFWWIFAVIIAIPHFMVVTKKDNQCMTDYDYLEVSYPIILNVELMLGAFVIPLSVISYCYYRISRIVAVSQSRHKGRIVRVLIAVVLVFIIFWLPYHLTLFVDTLKLLKWISSSCEFERSLKRALILTESLAFCHCCLNPLLYVFVGTKFRQELHCLLAEFRQRLFSRDVSWYHSMSFSRRGSPSRRETSSDTLSDEVCRVSQIIPAAALEGSHHHHHH | US28融合蛋白，包含來自HCMV Merlin病毒株之US28序列 |
| SEQ ID NO: 274-292 | (故意留空) | 無序列對應於此等Seq ID編號之 |
| SEQ ID NO: 293 | YINPSTGYAEYNQKFQG | 4H3C3之VH-CDR2序列，如4H3C3 VH1及4H3C3 VH2中所發現 |
| SEQ ID NO: 294 | YINPSTGYAEYNQKLQG | 4H3C3之VH-CDR2序列，如4H3C3 VH3及4H3C3 VH4中所發現 |
| SEQ ID NO: 295 | RSSQSLLYSSNQKNYLA | 4H3C3之VL-CDR1序列，如4H3C3 VL3、4H3C3 VL4、7B1F3 VL4及7B1F3 VL3中所發現 |
| SEQ ID NO: 296 | YVNPRTGYTEYNQKFQG | 7B1F3之VH-CDR2序列，如7B1F3 VH1、7B1F3 VH2、7B1F3 VH5及7B1F3 VH6中所發現 |
| SEQ ID NO: 297 | YVNPRTGYTEYNQQLQG | 7B1F3之VH-CDR2序列，如7B1F3 VH3、7B1F3 VH4中所發現 |
| SEQ ID NO: 298 | ILQGTGFAY | 7B1F3之VH-CDR3序列，如7B1F3 VH5及7B1F3 VH6中所發現 |
| SEQ ID NO: 299 | Y(I/V)NP(S/R/N)T(G/A)Y(A/T)E(Y/F)NQ(K/Q)(F/L)(K/M/Q)(D/G) | ECD1 V H-CDR2共有序列 |
| SEQ ID NO: 300 | (L/I)(R/L)(F/N/S/Q)(G/D)(S/*/R)(S/T)GFAY | ECD1 V H-CDR3共有序列 |
| SEQ ID NO: 301 | (K/R)SSQSLLYSSNQKNYLA | ECD1 V H-CDR1共有序列 |
| 寄存編號 | 病毒株名稱 | 來源 | 變異 US28 ECD3 | 年份 |
| MT044485.1 | SYD-SCT1 | 血漿 | 4N | 2020 |
| KF021605.1 | TR | HIV患者眼睛 | 4N | 2013 |
| AF073835 | N8 | ? | 4N | 2015 |
| KP745645.1 | BE/13/2010 | 尿液 | 4N | 2015 |
| KP745727.1 | BE/17/2010 | 尿液 | 4N | 2015 |
| AF073834.1 | L10 | ? | 4N | 2000 |
| KY490076.1 | HANRTR8 | 腎三聯症患者(kidn.trpl.pat.)血液 | 4N | 2017 |
| AF073833.1 | FS4 | ? | 4N | 2000 |
| MH836520.1 | P020 | ? | 4N | 2018 |
| MH836506.1 | P003 | ? | 4N | 2018 |
| GU93774 | Toledo | 先天性感染嬰兒的尿液 | 4N | 2003 |
| KT959235 | DB | 懷孕女性 | 4N | 2009 |
| 抗體 | 結合特異性 |
| 13-5G6-1D3純系 | 15.2* |
| 13-5G6-1D3 rAb | 21.5* |
| 13-5C6-1B5純系 | 11* |
| 14-1H3-1A6純系 | 26* |
| VUN100 | 4** |
| US28市售Ab | 1,70*** |
| HCMVDB (KT959235) 相對於 | US28 突變 |
| Toledo (GU937742) | 相同(A1基因型) |
| Towne (FJ616285) | A19D；N170D (A2基因型) |
| VR1814 (GU179289) | A19D；N170D；S330G (A2基因型) |
| TR (KF021605.1) | L45I；R267K (A1基因型) |
| TB40/E (KF297339) | A8T；D15E；E18L；A19G；V24T；N170D (B1基因型) |
| Merlin (AY446894) | A19D；N170D；S330G (A2基因型) |
| JP (GQ221975) | N170D (A1基因型) |
| AD169 (X17403.1) | A19D；N170D (A2基因型) |
| AF1 (GU179291.1) | N170D (A1基因型) |
| VHL/E (L20501.1) | E18D；A19E；F25L；N170D；R267K；V346A (D基因型) |
| Davis (JX512198.1) | A19D、N170D、V190I、R267K、V346A (A1基因型) |
| BL (MW980585) | A19D、T21A、F25L、N170D、V250L、R267K、V346A (C基因型) |
圖 1.使用西方墨點分析藉由使用抗HIS Ab驗證經轉型CHO-US28-A1細胞中之US28蛋白表現。自左側起，第一行：梯級，第二行：來自CHO對照細胞之蛋白質提取物，第三行：來自CHO-US28-A1細胞之蛋白質提取物，及第四行：6HIS陽性對照。經轉染至CHO-US28-A1細胞中的US28-A1構築體之C端部分含有6HIS標籤。當與階梯相比時，用結合於6HIS標籤上的抗HIS抗體之染色以~41 kDa標記出特定條帶，此與HCMV US28蛋白之先前報導之尺寸等效。在圖片中圈出之此條帶未出現於對照CHO細胞中，因此驗證了US28在經轉染之CHO-US28-A1細胞中但不在對照CHO細胞中表現。6HIS陽性對照為陽性的，指示6HIS Ab如所預期結合至其目標。
圖 2.流動式細胞測量術分析展示US28-13-5G6-1D3抗體純系在CHO-US28-A1細胞上之表面結合。自左側起，空白對照，第2抗體對照及純系US28-13-5G6-1D3 Ab結合於CHO-US28-A1細胞之表面上。US28-13-5G6-1D3 Ab結合至53.4%之CHO-US28-A1細胞，而空白及二級抗體對照展示弱結合：分別0.11%及1.63%。
圖 3.藉由FACS分析中之梯度稀釋進一步驗證純系US28-13-5G6-1D3在CHO-US28-A1細胞上之陽性表面結合。自左側起，純系US28-13-5G6-1D3 Ab以1:20、1:50、1:200 (w/v)稀釋度表面結合至CHO-US28-A1細胞。
圖 4.將純系US28-13-5G6-1D3在CHO-US28-A1細胞上之陽性表面結合與US28陰性CHO對照細胞進行比較。純系US28-13-5G6-1D3 Ab以1:50 (w/v)結合至US28陽性CHO-US28-A1細胞之表面係結合至US28陰性CHO細胞的15倍多。
圖 5.原始ELISA分析展示在生物肽(Bio-Peptide)-1 (US28 ECD3基因型4N)及生物肽-2 (US28 ECD3基因型4D)上US28-13-5G6-1D3抗體純系之相等定性結合。由於ECD3中未觀測到其他突變，因此此等結果表明US28-13-5G6-1D3 Ab與其目標之結合為HCMV病毒株未定性。
圖 6.定性ELISA分析展示重組抗體產物US28-13-5G6-1D3 rAb與生物肽1及2之結合。此等結果展示所產生之抗體與US28 ECD3之兩種基因變體之強力及相等結合，確認重組抗體與其目標良好地結合且維持HCMV病毒株未定性結合特性。
圖 7.藉由使用FACS分析驗證13-5G6-1D3 rAb在CHO-US28-A1細胞上及在各別對照CHO細胞上之表面結合。展示CHO細胞結果之條柱用深灰色著色，而展示CHO-US28-A1細胞結果之條柱用淺灰色著色。自左側起，第一個條柱展示不具有分別針對CHO-US28-A1及CHO細胞之抗體的空白對照之量測；自左側起之第二個條柱展示抗小鼠lgG-Alexa 488二級Ab單獨在兩種細胞類型上之表面結合；自左側起之第三個條柱展示13-5G6-1D3 rAb以1:10稀釋度(w/v)在兩種細胞類型上之表面結合；自左側起之第四個條柱展示13-5G6-1D3 rAb以1:50稀釋度(w/v)僅在CHO-US28-A1細胞上之表面結合；且自左側起之第五個條柱展示13-5G6-1D3 rAb以1:100稀釋度(w/v)僅在CHO-US28-A1細胞上之表面結合。y軸展示與細胞百分比之結合。基於此等結果，13-5G6-1D3 rAb之最佳染色稀釋度為1:50 w/v (自左側起之第三條柱)。僅在1:10稀釋(w/v)下量測13-5G6-1D3 rAb與CHO細胞之表面結合且在移除與空白及抗小鼠lgG-Alexa 488二級Ab對照之結合之後為0.77%。此等結果與先前藉由使用來自13-5G6-1D3純系之抗體獲得的結果一致，且展示13-5G6-1D3 rAb在CHO-US28-A1細胞上的高度比表面結合，其超過正常CHO細胞＞21倍。
圖 8.藉由FACS分析展示US28-13-5G6-1D3 rAb在經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞群之表面上但不在模擬細胞上的結合。
A.上列展示US28-13-5G6-1D3 rAb在模擬細胞相對於經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞上的表面結合，展示了在HCMV感染細胞上的高度特異性結合。
B.為了驗證13-5G6-1D3 rAb結合於HCMV感染細胞群之表面，另一組經HCMV Ad169感染之細胞及模擬細胞用針對HCMV主要即刻早期(IE)抗原之市售抗體MAB810X滲透且染色，該抗原為已知在裂解HCMV感染期間較早表現之胞內蛋白。MAB810X抗體染色與US28-13-5G6-1D3 rAb相同的經HCMV感染之MRC-5細胞群，未觀測到其未感染細胞之任一抗體，確認了US28-13-5G6-1D3 rAb所展現的表面結合對HCMV Ad169感染細胞具有特異性。
圖 9.藉由使用小鼠IgG同型對照代替初級抗體測試US28-13-5G6-1D3 rAb之非特異性結合，隨後與山羊抗小鼠lgG-Alexa 488一起培育。結果展示藉由US28-13-5G6-1D3 rAb，經HCMV感染之MRC-5細胞與同型對照相比的染色偏移，而未感染細胞(模擬)之染色類似於IgG同型對照。綜合而言，此等結果展示，與未感染細胞相比，US28-13-5G6-1D3 rAb特異性結合(約16倍多的結合)至裂解HCMV感染細胞之表面。
圖 10.藉由使用與先前研究中相同的流動式細胞測量術方案研究US28-13-5G6-1D3 rAb與來自三個HCMV血清反應呈陽性的個體之初級PBMC的結合。圖中之條柱展示US28-13-5G6-1D3 rAb在來自各別供體之PBMC上的相對表面結合。結果分別展示US28-13-5G6-1D3 rAb在18.37%、3.57%及5.25%之來自三個個體之總PBMC上的表面結合。來自相同個體之表現某些不同細胞表面標記之PBMC的相對比例列於條柱下方；總計超過100%，因為一些相同細胞表現此等細胞表面標記(然而，其在與US28-13-5G6-1D3 rAb結合相同的實驗期間未經量測)中之超過一者。在所研究PBMC中，僅CD11+、CD14+及CD16+陽性細胞可為HCMV攜帶者，且此等表面標記可在不同單核細胞中部分重疊。潛伏感染HCMV之單核細胞群通常總計達約15%之總PBMC (儘管個體之間可存在一些相當大的變化)。因此，分別在供體1、2及3中觀測到的US28-13-5G6-1D3 rAb在18.37%、3.57%及5.25%之總PBMC上之表面結合證實與實質性比例之PBMC的結合可為HCMV攜帶者。此等結果與PBMC亞型無關，但指示US28-13-5G6-1D3 rAb可在潛伏HCMV感染細胞之表面上結合。
圖 11.測試市售US28多株Ab與CHO-US28-A1細胞之結合且同US28-13-5G6-1D3 rAb與相同細胞之結合進行比較。
A.US28-13-5G6-1D3抗體結合至超過50%之CHO-US28-A1細胞之表面(自左側起之第一條柱)，而市售US28 Ab僅結合在10%之細胞上(自左側起之第二條柱)。
B.吾等隨後在經HCMV Ad169感染之MRC-5細胞上測試市售US28 Ab，其中其展示對HCMV感染群體之特異性結合。然而，市售US28多株Ab亦使未感染之模擬細胞與IgG同型對照相比染色約兩倍，指示未感染之MRC-5細胞之表面上的非特異性結合。當減去來自IgG同型之信號時，若與US28陰性模擬MRC-5細胞比較，市售US28 Ab與HCMV Ad169陽性MRC-5細胞之結合特異性僅為1.7。
圖 12.藉由使用免疫組織化學分析(IHC)研究在1:400稀釋(w/v)下的US28-13-5G5-1D3與HCMV感染人類組織之結合。
A.用US28-13-5G6-1D3 rAb染色HCMV感染肺組織證實對經HCMV感染之肺泡及內皮細胞的特異性。箭頭(在此圖之非彩色版本中)標記在HCMV陽性對照載片中在具有特徵性巨細胞效應之典型HCMV感染肺泡細胞上的US28-13-5G6-1D3 rAb細胞質染色。
B.13-5G6-1D3展示巨噬細胞之陽性US28染色，但正常肺組織中肺泡細胞為陰性染色。
C.相同巨噬細胞在相同肺活體組織切片中展示陽性HCMV DNA，而正常肺泡細胞中不存在HCMV DNA信號，其與相同樣本中之US28染色一致。
D.用MAB810R抗體染色HCMV感染肺組織證實對經HCMV感染之肺泡及內皮細胞的特異性。箭頭(在此圖之非彩色版本中)標記在HCMV陽性對照載片中在具有特徵性巨細胞效應之典型HCMV感染細胞上的MAB810R抗體核染色。
E.IE染色對於正常肺組織中之肺泡HCMV陽性巨噬細胞呈陰性。正常肺泡細胞亦展示陰性染色。
F.使用lgG作為陰性對照抗體且對於相同肺組織展示陰性染色。在該等非彩色版本旁邊亦提供圖12之彩色版本。
圖 13.在乳癌群組中藉由免疫組織化學(IHC)及原位雜交(ISH)研究HCMV US28表現。
A.在三陰性乳癌(TNBC)樣本中，US28-13-5G6-1D3 rAb展示癌細胞之強細胞質染色(3+)(在此圖之非彩色版本中以箭頭標記)。此樣本中大部分腫瘤細胞針對US28-13-5G6-1D3 rAb (棕色)呈陽性染色。
B.相同樣本展示在整個樣本內之少數細胞中針對抗IE MAB810R抗體之一些點樣陽性細胞質染色。
C.ISH分析展示相同腫瘤細胞之許多核中的多個HCMV DNA信號，其對於吾等之材料中之許多三陰性及HER2陽性腫瘤為典型的。箭頭指出圖中之一些陽性HCMV DNA信號。在細胞之細胞質中未看到HCMV DNA。
D.陰性對照IgG Ab展示陰性染色。圖13之彩色版本提供於頁面上非彩色版本之後。
圖 14. A.來自HER2陽性乳癌之腺癌轉移展示所有腫瘤細胞中針對US28-13-5G6-1D3 rAb (棕色)之陽性中間細胞質染色(2+)。
B.相同樣本中之大多數癌細胞針對MAB810R染色呈陰性。對於MAB810R Ab，整個樣本中僅有一個或兩個細胞具有點樣陽性細胞質染色(圖中未示)。
C.ISH分析展示相同腫瘤細胞中許多陽性核HCMV DNA信號。箭頭指出此類陽性HCMV DNA信號。HCMV DNA不可見於腫瘤細胞之細胞質中。
D.相同樣本之陰性對照抗IgG Ab染色呈陰性。亦提供圖14之彩色版本。
圖 15.US28染色及HCMV ISH在許多正常相鄰腫瘤(NAT)乳房組織中呈陰性，如樣本BR1008b_J6之圖中所示例。
A.US28-13-5G6-1D3 rAb展示正常乳房組織之陰性IHC染色。
B.MAB810R抗體亦展示相同樣本之陰性染色。
C.藉由ISH未發現同一樣本之核或細胞質HCMV DNA信號。
D.IgG染色亦呈陰性。此等結果指示，抗體針對不存在HCMV感染之徵象的正常腺乳房組織始終展示陰性染色。值得注意的是，HCMV陰性樣本BR1008b_J6置放於與樣本BR1008b_D5及BR1008b_H6相同的TMA載片上，其展示針對US28-13-5G6-1D3抗體之較強陽性染色及針對HCMV DNA ISH之陽性核信號。因此，使樣本暴露於完全相同的染色條件及抗體/DNA探針濃度。用US28-13-5G6-1D3 rAb所見之陽性染色經評估對乳癌及正常組織兩者中之HCMV感染細胞具有特異性。亦提供圖15之彩色版本。
圖 16. A.用US28-13-5G6-1D3 rAb之原發性乳癌樣本之IHC染色在41個所研究之原發性乳房腫瘤樣本的約73%中具有特異性及陽性。對US28染色呈陽性之100%腫瘤對於核HCMV DNA信號亦呈陽性，且在12/41腫瘤之核中存在多個信號。所有10個正常相鄰組織對照(n=10)對於乳房上皮細胞中之細胞質US28染色呈陰性(0)，且對於ISH信號，7/10亦呈陰性。
B.用US28-13-5G6-1D3 rAb之陽性染色可見於約94%之所研究的30個乳癌轉移中且對轉移性細胞具有特異性。所有TNBC (n=7)及HER2陽性(n=11)癌轉移均具有陽性US28-13-5G6-1D3染色，且唯一陰性樣本(n=2)為激素受體陽性癌症。ISH分析展示100%癌轉移中之陽性核HCMV DNA。43%轉移性組織在腫瘤細胞中展示多個核DNA信號。此等樣本僅僅為TNBC或HER2+亞型，且兩個例外狀況具有低HR+狀態。ISH結果未展示於圖中。
圖 17.藉由使用IHC及用針對HCMV DNA之ISH分析，用US28-13-5G6-1D3 rAb及MAB810R抗體研究人類神經膠母細胞瘤組織。
A.IV級神經膠母細胞瘤腦瘤展示US28在腫瘤細胞(棕色)中之中度染色。
B.MAB810R抗體染色在相同癌細胞中未展示IE表現。然而，MAB810R之陽性細胞質染色發現於約90%之神經膠母細胞瘤樣本中。在各陽性樣本中之若干細胞中出現染色，該等樣本不同於乳癌樣本。然而，神經膠質細胞之染色弱於US28-13-5G6-1D3 rAb。
C.腦組織NAT對13-5G6-1D3染色呈陰性。
D.ISH分析展示相同腫瘤細胞中之陽性核HCMV DNA信號。箭頭指示此等信號。
E.針對IgG抗體，相同IV級神經膠母細胞瘤樣本之染色呈陰性。
F.針對相同腦組織NAT樣本，ISH分析呈陰性。此等圖之非彩色版本中陽性神經膠質細胞藉由箭頭指示。圖17之彩色版本提供於頁面上非彩色版本之後。
圖 18.人類腦癌群組之US28-13-5G6-1D3染色，該群組含有1-3級人類星形細胞瘤及4級神經膠母細胞瘤及NAT組織。所有1級星形細胞瘤(n=4)均染色呈陰性(0)。在2-3級星形細胞瘤中，6個染色呈陰性(0)，37個具有陽性細胞質染色(1+)，且2個具有中度陽性細胞質染色(2+)。所有4級神經膠母細胞瘤(n=19)腫瘤針對US28-13-5G6-1D3 rAb展示陽性細胞質染色(1+)，其中3為中度陽性(2+)。ISH分析確認核HCMV DNA存在於所有腫瘤樣本之腫瘤細胞中。僅10個NAT樣本中之3個為HCMV DNA陽性。
圖 19. A.對各種人類初級細胞的28-13-5G6-1D3-PE抗體進行流動式細胞測量術分析以排除與此等細胞類型之表面的一般脫靶結合。研究以下細胞株：人類初級腎上腺皮質細胞、人類初級腎臟上皮細胞、人類初級心臟微血管內皮細胞、人類初級肝臟上皮細胞及人類初級靜脈平滑肌細胞。US28靶向抗體13-5G6-1D3展示極弱表面結合，遠弱於所有此等細胞類型之＜1%，指示不存在13-5G6-1D3對此等細胞類型之脫靶表面結合。此等結果支持吾等對實驗室細胞之觀測結果，展示與正常US28陰性細胞表面之弱結合。
B.原始人類初級心臟細胞不可用，且因此藉由免疫組織化學針對13-5G6-1D3之染色研究人類心臟組織樣本。圖中之實例展示心肌組織之陰性13-5G6-1D3染色，類似於陰性IgG抗體對照之染色。ISH分析未展示人類心肌中存在潛伏HCMV感染之任何跡象。若人類心臟中存在HCMV感染，則其始終為生產性感染類型。陽性對照位於具有心臟樣本之相同TMA盤上且為陽性：13-5G6-1D3展示惡性嗜鉻細胞瘤之陽性染色。ISH對照亦展示在相同活體組織切片中腫瘤細胞之核中之典型HCMV DNA染色，指示此腫瘤類型中存在潛伏HCMV感染。在圖中陽性13-5G6-1D3及HCMV ISH結果用箭頭標記。亦提供圖19之彩色版本。
圖 20.研究一些胰臟組織以排除28-13-5G6-1D3與此組織類型之一般脫靶結合。上列展示正常胰臟組織用13-5G6-1D3、MAB810R及IgG對照抗體進行陰性染色。HCMV ISH為陰性指示正常胰臟組織樣本中不存在病毒HCMV DNA。下列展示具有陽性13-5G6-1D3及MAB810R染色以及陰性IgG對照抗體染色(陰性對照)的另一患者之胰臟組織樣本。HCMV ISH分析亦展示陽性結果，指示同一樣本中存在細胞質HCMV DNA聚集物。因此，同一樣本對於HCMV蛋白US28及IE及HCMV DNA兩者呈陽性，但對於陰性對照IgG呈陰性，指示特異性抗體結合。正如預期，US28蛋白染色為細胞質的，正如預期，IE蛋白因為其為核蛋白而主要位於細胞核中。HCMV ISH展示大型細胞質病毒DNA聚集物，此係因為病毒封裝於細胞質中，指示生產性HCMV感染。此等結果指示，抗體US28-13-5G6-1D3不與胰臟組織脫靶結合，且形態正常之胰臟組織中存在之HCMV感染與似乎具有潛伏特徵之腫瘤對比具有生產性。亦提供圖20之彩色版本。
圖 21. A.一組抗體之絕對結合程度，比較此項技術所揭示之VUN100 (單價或二價)與US28-13-5G6-1D3相對於對照CHO細胞及表現由不同HCMV病毒株(DB及TB40/E)編碼之US28的CHO細胞以及表現含有所有已知US28突變(「突變病毒株」)之經修飾US28的CHO細胞之結合特性。
B.同一組抗體對表現不同形式之US28之CHO細胞與對照CHO細胞相比的結合特異性，結果表現為相比於對照CHO細胞，與表現US28之細胞之結合的倍數增加。
C.病毒株差異對同一組抗體之絕對結合程度的影響，展示為與表現由HCMV病毒株DB及TB40/E編碼之US28的CHO細胞之結合之間的絕對結合程度之變化百分比，其中較小變化百分比指示較大程度之病毒株未定性結合性。
D.同一組抗體在表現由HCMV病毒株DB及TB40/E編碼之US28之形式的CHO細胞之間的結合特異性保持率百分比，其中接近100%之結合特異性保持率指示病毒株未定性結合特異性，而更顯著之差異(如由兩個VUN100抗體樣本所展現)視編碼US28之病毒株而定，指示結合特異性之變化(亦即缺乏病毒株未定性結合特異性)。
E.當標準化至針對各US28形式之1D3所觀測到之結合程度時，抗體與表現不同形式之US28 (如由DB、TB40/E及突變形式所編碼)之CHO細胞之結合百分比，其中給定抗體在不同CHO形式中之結合變化%指示與1D3-mFc抗體相比，病毒株未定性結合活性降低，且展示結合更多取決於編碼US28之病毒株(亦即，與1D3-mFc抗體相比缺少病毒株未定性結合性)。
圖 22.與VUN100相比，如藉由結合至對照CHO細胞評定，本發明之各種ECD3結合分子(
A)或本發明之各種SEQ ID NO: 177結合分子(
B)之脫靶結合百分比。
圖 23.在同一分析中，相對於VUN100之特異性程度，示例性ECD3結合分子結合於US28表現CHO對比對照CHO細胞之結合特異性的倍數變化。
A.與VUN100 (n=3)相比，1D3的結合特異性有所提高。
B.與VUN100 (n=3)相比，1C10的結合特異性有所提高。
C.與VUN100 (n=3)相比，1A10的結合特異性有所提高。
D.與VUN100 (n=3)相比，1G4的結合特異性有所提高。
E.與VUN100 (n=1)相比，1E8的結合特異性有所提高。
圖 24.在同一分析中，相對於VUN100之特異性程度，示例性SEQ ID NO:177結合分子結合於US28表現CHO對比對照CHO細胞之結合特異性的倍數變化。
圖 25.藉由IHC研究N端抗體與HCMV感染之肺組織及HCMV陰性子宮肌層之結合。
A.先前例示之US28-13-5G6-1D3 rAb用作陽性對照且在此等研究中以1:3200 (w/v)稀釋顯示最佳IHC染色。
B.US28-4-2F5B11 rAb (1:1600 (w/v)稀釋)皆顯示HCMV感染細胞上之陽性染色及HCMV陰性子宮肌層之陰性染色。
C.US28-4-4F3C3 rAb (1:800 (w/v)稀釋)顯示對感染肺組織之HCMV特異性染色及對HCMV陰性子宮肌層之陰性染色。
D.US28-4-7B1F3 rAb (1:6400稀釋(w/v))顯示HCMV陽性肺組織中之陽性及HCMV特異性染色，但在子宮肌層中未顯示。
E.具有染色IgG之小鼠肺組織用作陰性對照抗體。用例示ECD1結合分子對HCMV感染肺組織之染色證明對HCMV感染肺泡細胞之特異性，因為對應HCMV陰性子宮肌層對照中無子宮肌層細胞及纖維母細胞染色。與US28-13-5G6-1D3 rAb一樣，ECD1結合分子染色具有特徵性巨細胞效應之典型HCMV感染細胞，在此等細胞中展示強細胞質或細胞膜染色，因為已知US28蛋白位於細胞質及細胞膜，且對一些已知為潛伏或再活化HCMV之攜帶者的組織巨噬細胞染色呈陽性。
圖 26.原生HuProt陣列上之樣本hum7B1F3 (0.1 µg/ml)之Z分數分佈，展示排名前50之命中。
圖 27.原生HuProt陣列上之樣本小鼠7B1F3 (0.1 µg/ml)之Z分數分佈，展示排名前50之命中。
圖 28.原生HuProt陣列上之樣本hum7B1F3 (0.1 µg/ml)之Z分數分佈，展示最高命中及自HuProt陣列選擇之額外命中。
圖 29.原生HuProt陣列上之樣本小鼠7B1F3 (0.1 µg/ml)之Z分數分佈，展示最高命中及自HuProt陣列選擇之額外命中。
圖 30.7B1F3之結構分析。VH位於左側，包含指定CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；且VL位於右側，包含指定CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。N-糖基化序列可靠性由蓋頂圓指示。
圖 31.親本鼠類7B1F3 (「7B1F3」)與人類化7B1F3 (「hum7B1F3」)之間的結合的比較。
圖 32.在0.5 µg/mL劑量下親本鼠類7B1F3 (「7B1F3」)與人類化、去糖基化7B1F3 (「hum7B1F3」)之間的結合的比較。
圖 33.本發明之三個示例性ECD1結合分子(抗體2F5B11、4H3C3及7B1F3)及先前技術抗體二價VUN100與來源於不同HCMV病毒株(VHL/E、DB、TB40/E及Merlin)之US28之相對結合的變化。如實例8中進一步論述，針對與如由HCMV之VHL/E病毒株編碼之US28蛋白之結合評估各抗體純系之資料。
圖 34.實例9之典型分析時間表。
圖 35.腫瘤細胞死亡之熱圖：在各3D PDX腫瘤模型中之E-max (IC50 max)/E-對照(IC50對照)。
圖 36.腫瘤尺寸結果(1 μM星形孢菌素為陽性對照)。
圖 37.腫瘤尺寸IC50曲線。
圖 38.使用7B1F3結合域之雙特異性抗體的示例性組態。
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Claims (36)
- 一種結合分子，其包含一或多個多肽鏈，該結合分子對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之胞外域1 (ECD1)內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且 其中該US28蛋白之ECD1及SEQ ID NO: 177各自包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之該US28蛋白的位置1至37及26至37，且 視情況，其中若該結合分子為抗體，則其為單株抗體。
- 如請求項1之結合分子，其中： (a) 該結合分子係選自抗體(諸如單株抗體)及嵌合抗原受體(CAR)；及/或 (b) 該結合分子為單特異性結合分子，或多特異性(例如，雙特異性或三特異性)結合分子，其包含對ECD1內的由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的一或多個區域。
- 如請求項1或2之結合分子，其中該第一抗原決定基完全存在於HCMV之該US28蛋白的SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內。
- 如前述請求項中任一項之結合分子，其中該第一抗原決定基為HCMV之該US28蛋白的SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的線性抗原決定基。
- 如前述請求項中任一項之結合分子，其對HCMV之US28蛋白的SEQ ID NO: 177之胺基酸序列內的該第一抗原決定基具有HCMV病毒株未定性結合特異性， 例如，其中該結合分子：(a)對HCMV之US28蛋白內之該第一及/或第二抗原決定基具有結合特異性，該結合特異性對兩種或更多種(諸如全部) HCMV病毒株係未定性；及/或(b)對選自由以下組成之群組的兩種或更多種(諸如全部)HCMV病毒株具有未定性結合特異性：DB、Towne、AF1、VHL/E、AD169、BL、DAVIS、JP、Merlin、PH、TB40/E、Toledo、TR及VR1814 (FIX)。
- 如前述請求項中任一項之結合分子，其包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR)，對應於以下抗體之CDR序列中之任一者、兩者、三者、四者、五者或全部六者： (a) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 196、197、198、199、200及201所定義，及/或抗體4H3C3之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體； (b) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 219、220、221、199、222及223所定義，及/或抗體7B1F3之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體；及/或 (c) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 242、243、244、199、245及246所定義，及/或抗體2F5B11之該等CDR序列中之任一者或多者的功能變體； 且 視情況其中該結合分子係選自抗體及CAR。
- 如請求項6之結合分子，其包含： (a) 對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變重鏈(V H)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者，其選自： (i) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 196、197及198所定義； (ii) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 219、220及221所定義；及/或 (iii) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 242、243及244所定義； 及/或 (b) 對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體的可變輕鏈(V L)之CDR 1、2及3序列中之一者、兩者或全部三者，其選自： (i) 4H3C3，分別如由SEQ ID No: 199、200及201所定義； (ii) 7B1F3，分別如由SEQ ID No: 199、222及223所定義；及/或 (iii) 2F5B11，分別如由SEQ ID No: 199、245及246所定義。
- 如請求項6或7之結合分子，其包含： (a) 至少一個可變重鏈(V H)多肽，其包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體之CDR 1、2及3序列，其具有以下序列： (i) 分別抗體4H3C3之SEQ ID No: 196、197及198，且 視情況其中該至少一個可變重鏈(V H)多肽包含SEQ ID NO: 187之序列、基本上由其組成或由其組成； (ii) 分別抗體7B1F3之SEQ ID No: 219、220及221，且 視情況其中該至少一個可變重鏈(V H)多肽包含SEQ ID NO: 211之序列、基本上由其組成或由其組成； (iii) 分別抗體2F5B11之SEQ ID No: 242、243及244，且 視情況其中該至少一個可變重鏈(V H)多肽包含SEQ ID NO: 233之序列、基本上由其組成或由其組成；及/或 i 至少一個可變輕鏈(V L)多肽，其包含對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性之抗體之CDR 1、2及3序列，其具有以下序列： (iv) 分別抗體4H3C3之SEQ ID No: 199、200及201，且 視情況其中該至少一個可變重鏈(V H)多肽包含SEQ ID NO: 189之序列、基本上由其組成或由其組成； (v) 分別抗體7B1F3之SEQ ID No: 199、222及223，且 視情況其中該至少一個可變重鏈(V H)多肽包含SEQ ID NO: 213之序列、基本上由其組成或由其組成； (vi) 分別抗體2F5B11之SEQ ID No: 199、245及246，且 視情況其中該至少一個可變重鏈(V H)多肽包含SEQ ID NO: 235之序列、基本上由其組成或由其組成。
- 如前述請求項中任一項之結合分子，其中該結合分子係選自由以下組成之群組： (a) 二價抗體，諸如IgG-scFv抗體(例如，其中第一結合域係完整IgG，且第二結合域係scFv，該scFv在該IgG之輕鏈之N端及/或在輕鏈之C端及/或在重鏈之N端及/或在重鏈之C端處附接至該第一結合域，或反之亦然)，包括但不限於對HCMV之US28蛋白的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的二價抗體，例如其中該第一抗原決定基如前述請求項中任一項所定義； (b) 單價抗體，諸如 DuoBody ®或『臼包杵』雙特異性抗體(例如scFv-KIH、scFv-KIH r、BiTE-KIH或BiTE-KIH r)； (c) scFv 2-Fc抗體； (d) 雙特異性抗體，諸如雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體； (e) 雙重可變域(DVD)-Ig抗體； (f) 基於雙親和力再靶向(DART)之抗體(例如，DART 2-Fc或DART)； (g) 三特異性抗體，諸如DNL-Fab 3抗體或對HCMV之US28蛋白的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的三特異性抗體，視情況其中該三特異性抗體為三特異性免疫細胞接合子抗體，例如三特異性T細胞接合子(TiTE)，且視情況其中該TiTE抗體包含CD3結合域； (h) scFv-HSA-scFv抗體； (i) 單域抗體； (j) 僅重鏈IgG (hcIgG)，諸如駱駝IgG (例如VHH抗體)及鯊魚免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)，及其單鏈抗體；及 (k) 嵌合抗原受體(CAR)，其包含如請求項1或其任何依附請求項之胞外域，例如包含此請求項之(a)至(h)中任一選項或其組合的胞外域。
- 如前述請求項中任一項之結合分子，其中該結合分子： (i) 為雙特異性免疫細胞接合子抗體，例如雙特異性T細胞接合子(BiTE)，且視情況其中該BiTE抗體包含CD3結合域；或 (ii) 為或包含抗體，其為單株抗體或其功能片段，視情況重組單株抗體或其功能片段，例如如由CHO細胞重組產生之單株抗體或其功能片段。
- 一種如前述請求項中任一項所定義之結合分子之功能片段，其中該功能片段： (a) 包含如前述請求項中任一項所定義之結合分子的抗原結合片段或其變體、融合體或衍生物或由其組成，其係選自由以下組成之群組：Fv片段(諸如單鏈Fv片段(scFv)或二硫鍵結合Fv片段)、Fab樣片段(諸如Fab片段、Fab'片段或F(ab)2片段)及單域抗體(dAb，包括單一型式及雙重型式，諸如dAb-連接子-dAb及奈米抗體)； (b) 提供如請求項1至5中任一項所定義之結合特徵； (c) 包含如請求項6至8中任一項所定義之CDR序列；及/或 (d) 包含如請求項8所定義之V H及/或V L序列。
- 如請求項1至10中任一項所定義之結合分子或如請求項11所定義之該結合分子之功能片段，其中該結合分子或其功能片段包含融合多肽序列， 該融合多肽序列包含融合至第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，其中 該第一胺基酸序列包含該結合分子或其功能片段之多肽鏈中之至少一者或由其組成，且 該第二胺基酸序列為融合搭配物。
- 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (i) 胞外域，其中該胞外域包含以下或由以下組成：如請求項1至10或12中任一項所定義之結合分子或如請求項11或12所定義之該結合分子之功能片段； (ii) 跨膜域；及 (iii) 胞內域； 其中該CAR之該胞外域對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性，且 其中該US28蛋白之ECD1及SEQ ID NO: 177各自包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO: 5中所闡述之由人類巨細胞病毒(HCMV)編碼之該US28蛋白的位置1至37及26至37。
- 一種核酸分子或多個不同核酸分子之組合， 其中該核酸分子包含，或該多個不同核酸分子之組合共同包含一或多個核酸序列，該一或多個核酸序列單獨地或以組合形式編碼如請求項1至12中任一項之結合分子或如請求項13之CAR。
- 一種載體，其包含如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合。
- 一種細胞，其包含如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或如請求項15之載體， 視情況其中該細胞表現一或多個如請求項1至12中任一項之結合分子，及/或一或多個如請求項13之CAR，該一或多個結合分子及/或CAR由如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合或如請求項15之載體編碼。
- 一種細胞，其包含如請求項1至12中任一項之結合分子及/或編碼該結合分子之核酸，視情況其中該核酸為如請求項14或15所定義之核酸或載體。
- 一種產生細胞之方法，該方法包含將如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或如請求項15之載體引入至細胞中。
- 一種產生如請求項1至12中任一項之結合分子或如請求項13之CAR之方法，該方法包含： 在細胞中表現如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合及/或如請求項15之載體，且 視情況其中該方法進一步包含自該細胞分離由此產生之結合分子的步驟。
- 一種結合物，該結合物包含與如請求項1至10或12中任一項所定義之結合分子或與如請求項11或12所定義之該結合分子之功能片段結合的部分， 視情況其中該部分為治療性、預防性、診斷性、預後性或治療診斷性部分，及/或其中該部分為藥物(例如，其中該結合物為抗體-藥物結合物(「ADC」))及/或放射性部分(例如，其中該結合物適用於放射免疫療法(「RIT」))。
- 一種對抗HCMV或與HCMV有關之疾病或病況的方法，該方法包含向個體或離體或活體外細胞物質投與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑： i. 如請求項1至10或12中任一項之結合分子， ii. 如請求項11或12所定義之該結合分子之功能片段， iii. 如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合， iv. 如請求項15之載體， v. 如請求項16或17之細胞，及 vi. 如請求項20之結合物。
- 一或多種藥劑，其用於在個體或離體細胞物質或活體外細胞物質中對抗與HCMV相關之疾病或病況，其中該一或多種藥劑係各自單獨地選自由以下組成之群組： i. 如請求項1至10或12中任一項之結合分子， ii. 如請求項11或12所定義之該結合分子之功能片段， iii. 如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合， iv. 如請求項15之載體， v. 如請求項16或17之細胞，及 vi. 如請求項20之結合物。
- 一種一或多種藥劑之用途，其用於製造藥物，供在個體或離體細胞物質或活體外細胞物質中對抗與HCMV相關之疾病或病況，其中該一或多種藥劑係各自單獨地選自由以下組成之群組： i. 如請求項1至10或12中任一項之結合分子， ii. 如請求項11或12所定義之該結合分子之功能片段， iii. 如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合， iv. 如請求項15之載體， v. 如請求項16或17之細胞，及 vi. 如請求項20之結合物。
- 一種用於醫藥之藥劑，其中該藥劑係選自由以下組成之群組： i. 如請求項1至10或12中任一項之結合分子， ii. 如請求項11或12所定義之該結合分子之功能片段， iii. 如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合， iv. 如請求項15之載體， v. 如請求項16或17之細胞，及 vi. 如請求項20之結合物。
- 一種疫苗組合物，其適用於針對與人類巨細胞病毒(HCMV)相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況或對抗該疾病或病況， 其中該疫苗為主動或被動疫苗， 其中該疫苗觸發及/或提供針對存在於HCMV之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基的免疫反應，且 其中該US28蛋白之ECD1及SEQ ID NO: 177包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO:5中所闡述之由HCMV編碼之該US28蛋白的位置1至37及26至37。
- 一種針對與HCMV相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況之方法，該方法包含向個體投與如請求項25之疫苗， 視情況其中該疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
- 如請求項25之疫苗，其用於針對個體之與HCMV相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況， 視情況其中該疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
- 一種如請求項25之疫苗的用途，其用於製造藥物供針對個體中與HCMV相關之疾病或病況進行疫苗接種、降低該疾病或病況之風險、預防該疾病或病況及/或對抗該疾病或病況， 視情況其中該疾病或病況為潛伏HCMV感染，或為與潛伏HCMV感染相關之疾病或病況。
- 一種評定個體及/或離體生物材料之一或多種生物病況及/或生物特徵的方法，其中該方法包含： (a) 使該個體及/或該離體生物材料與如請求項1至12中任一項所定義之結合分子或如請求項20所定義之結合物接觸；及 (b) 基於對該結合分子或結合物與該個體及/或該離體生物材料之結合的直接及/或間接量測來評定該個體及/或該離體生物材料。
- 一種在活的離體生物材料中對抗HCMV感染(諸如潛伏HCMV感染及/或裂解HCMV感染及/或多株HCMV感染)之方法，該方法包含使該活的離體生物材料與選自由以下組成之群組的任一或多種藥劑接觸： i. 如請求項1至10或12中任一項之結合分子， ii. 如請求項11或12所定義之該結合分子之功能片段， iii. 如請求項14之核酸分子或多個不同核酸分子之組合， iv. 如請求項15之載體， v. 如請求項16或17之細胞，及 vi. 如請求項20之結合物。
- 一種活的離體生物材料，其係藉由如請求項30之方法獲得或可藉由其獲得。
- 一種治療有需要之個體的方法，其包含向該個體投與如請求項31所定義之活的離體生物材料，視情況其中該方法為移植該活的離體生物材料，諸如器官移植或組織移植之方法。
- 一種篩選結合分子之方法，該結合分子對人類巨細胞病毒(HCMV)之US28蛋白之ECD1內的由TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列組成之多肽內的第一抗原決定基具有結合特異性， 其中該US28蛋白之ECD1及SEQ ID NO: 177包含存在於該US28蛋白中如下位置處的胺基酸序列，該等位置分別對應於如SEQ ID NO:5中所闡述之由HCMV編碼之該US28蛋白的位置1至37及26至27， 該方法包含： (a) 提供一或多種肽或多肽，該一或多種肽或多肽包含序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)或其免疫原性片段、基本上由其組成或由其組成； (b) 提供一或多種候選結合分子；及 (c) 測定一或多種候選結合分子對該一或多種肽之結合特異性及/或結合親和力，藉此選擇對由SEQ ID NO: 177之胺基酸序列組成之多肽內的該第一抗原決定基具有結合特異性的一或多個結合分子。
- 一種肽或多肽，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列TDVLNQSKPVTL (SEQ ID NO: 177)，或包含SEQ ID NO: 177之免疫原性片段之序列，其中該肽或多肽並非US28蛋白，且 較佳其中該肽或多肽中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之該免疫原性片段之序列。
- 一種融合蛋白，其包含直接或經由一或多個連接子胺基酸序列融合至第二胺基酸序列之第一胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，其中 該第一胺基酸序列為如請求項34所定義之肽或多肽之序列；及 該第二胺基酸序列為融合搭配物，視情況其中該融合搭配物為攜載蛋白，諸如經選擇以提供適用於針對該第一胺基酸序列進行免疫接種及產生抗體的融合蛋白之攜載蛋白， 較佳其中該融合蛋白中僅US28衍生之序列為SEQ ID NO: 177之序列或SEQ ID NO: 177之該免疫原性片段之序列；且 視情況其中該攜載蛋白係選自由以下組成之群組：匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、經遺傳修飾之白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)及流感嗜血桿菌( H. influenzae)蛋白質D (HiD)。
- 一種MHC四聚體，其包含如請求項34之肽或多肽，視情況其中該肽包含或對應於SEQ ID NO: 177或其免疫原性片段， 例如其中該MHC四聚體為用於偵測抗原特異性CD8 +T細胞之I類MHC四聚體、用於偵測抗原特異性CD4 +T細胞之II類MHC四聚體、用於流動式細胞測量術或螢光顯微術之螢光團標記四聚體。
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