CN116406375A - 抗SARS-CoV-2刺突蛋白的三聚体抗体 - Google Patents

抗SARS-CoV-2刺突蛋白的三聚体抗体 Download PDF

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Abstract

本公开提供了对SARS‑CoV‑2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)具有结合特异性的三聚体抗体及片段。三聚体抗体及片段对SARS‑CoV‑2病毒及各种突变形式均具有强亲和力和有效中和能力。特别是，这些三聚体抗体比它们相应的二聚体具有增强的中和能力，且可以更广泛地中和新的病毒变异株。因此，三聚体抗体和片段可用于预防或治疗SARS‑CoV‑2病毒感染。

Description

抗SARS-CoV-2刺突蛋白的三聚体抗体
背景技术
截至2021年8月12日，SARS-CoV-2(一种新型冠状病毒，也是2019冠状病毒病(COVID-19)的病因)的持续传播，已在全球范围内导致超过2.05亿的确诊病例和超过430万的死亡病例。尽管一些已经批准的疫苗和抗体药物在2020年底遏制了传染速度，但几种主要的新SARS-CoV-2谱系的快速传播和出现增加了对当前中和抗体(nAbs)和疫苗有效性的担忧。不受控制的传播促进了病毒的进化，产生了一些流行毒株，包括它们的变异株(VOC)B.1.1.7(alpha)、B.1.351(beta)、B.1.617.2(delta)和P.1(gamma)。
追踪病毒的进化，D614G是第一个被发现的显性突变，可在不增加疾病严重性和抗体免疫逃逸的情况下增加SARS-CoV-2的传染性，这在病毒进化和进一步变异的出现中起着至关重要的作用。N501Y独立出现在不同的变异株中，包括英国于2020年9月首次发现的B.1.1.7变异株(501Y.V1)，南非于2020年12月首次报道的B.1.351变异株(501Y.V2)，以及巴西发现的P1变异株(501Y.V3)。N501Y突变使RBD与hACE2之间的亲和力提高了约10倍，然而，与D614G突变不同的是，免疫血清和nAbs的中和效果受到N501Y变异株的影响。此外，B.1.351变异株导致更严重的疾病和住院死亡率。变异株B.1.617.1于2021年2月在印度引起关注，其刺突蛋白有三个关键突变：L452R、E484Q和P681R；另一种类似的VOC，B.1.617.2，在L452R，T478K和P681R突变，表现出明显的传播性增加，其在印度非常流行，目前在全球传播。此外，B.1.351和P.1血清表现出对B.1.617.2的中和作用的显著降低，表明先前感染这些变异株的个体可能更容易再次感染B.1.617.2。
在VOC的三个N501Y版本中，E484K是介导针对nAbs或免疫nAbs的免疫逃逸的关键突变。通过评估mRNA疫苗对10株全球流行的SARS-CoV-2毒株的影响，Wilfredo等人报道了5/10假病毒携带的K417N/T、E484K和N501Y对免疫nAbs的中和具有极高抗性。多个突变体(E484K+K417N+N501Y)完全消除了与巴尼韦单抗(Bamlanivimab)(LY-CoV555)的结合，后者已获得紧急使用授权(EUA)的批准。根据结合表位，et SARS-CoV-2nAbs被分为三类：第一类为ACE2竞争性nAbs，结合在刺突蛋白的受体结合基序(RBM)；第二类与SARS-CoV交叉反应并结合在RBD的碱基；第三类为N端结构域(NTD)识别nAbs。第一类和第三类中许多高效的中和mAbs表现出对含有E484K刺突蛋白突变的病毒的抑制活性降低或丧失。对于B.1.617.2变异株，大多数已获得批准的nAbs保持了较小的中和活性，最高可降低5倍，而LY-CoV555则严重降低。
针对病毒表面蛋白的单克隆抗体(mAbs)在以往SARS、MERS和埃博拉(Ebola)的治疗中表现出优异的中和效果，因此，对于抗击当前的流行病具有特别意义。自COVID-19暴发以来，刺突糖蛋白一直是研发治疗性mAbs的主要靶向抗原。大多数中和抗体与病毒刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)结合。一些与N端结构域(NTD)非RBD结合的抗体也表现出能够有效地中和SARS-CoV-2。
中和抗体已经从多种来源获得，包括来自SARS-CoV-2恢复期患者的记忆B细胞、以前的SARS中和抗体、免疫过的人源化H2L2小鼠、来自羊驼的纳米抗体和来自预建库的单域人抗体。预防和治疗SARS-CoV-2感染需要新的更好的抗体。特别是，迫切需要具有变异株抗性的中和抗体。
发明内容
本公开提供了能够与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的抗体、其片段、及其三聚体形式。在一些实施方案中，所提供的三聚体抗体包含三个融合多肽，每个融合多肽包含与三聚体化结构域融合的抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域与SARS-Cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)的受体结合基序(RBM)具有结合特异性。
在一些实施方案中，三聚体化结构域能够介导三聚体抗原结合分子的稳定结合。在一些实施方案中，三聚体化结构域包含选自SEQ ID NO:103、107和111的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO:103。
在一些实施方案中，三聚体抗体还包含在所述抗原结合结构域和所述三聚体化结构域之间的连接肽。在一些实施方案中，连接肽为一种柔性连接子，优选地，包含SEQ IDNO:122或123的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接肽为5至50个氨基酸残基的长度，优选5至20个氨基酸残基的长度。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与至少一个选自SEQ ID NO:126的第438、447-456、489-495和507-508位的氨基酸残基结合。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含本公开的片段。
本公开也提供在受试者中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的在此公开的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述受试者患有COVID-19症状。
附图说明
图1为靶向刺突蛋白scFv抗体的筛选。a.为针对S-RBD的淘选过程的工作流程。b.为三轮筛选中，抗原S-RBD-hFc的产出与淘选轮次。c.为22株具有阳性读数(OD405比率S-RBD-hFc/hFc>2)的特异性抗体的噬菌体ELISA结果。
图2为细胞表面表达的三聚体刺突蛋白的抗体结合分析。a为编码SARS-CoV-2全长刺突的表达质粒转染的HEK293T细胞，用纯化的IgG4抗体孵育，用PE标记的抗人IgG4 Fc二抗染色，然后用FACS分析。阳性结合细胞群被标记为阳性群(positive pop.)。b-g为抗体结合至SARS-CoV刺突、HCoV-229E刺突、HCoV-HKU1刺突、HCoV-NL63刺突、HCoV-OC43刺突、MERS刺突的FACS。h为抗体结合至未转染的HEK293T细胞的FACS。仅用二抗染色的细胞被用作阴性对照(NC)。i为SARS-CoV-2刺突结合抗体的平均荧光强度(MFI)。
图3为抗体与hACE2的竞争性ELISA以及对刺突蛋白的结合动力学。a为滴定三种抗体与hACE2-ECD竞争结合S-RBD，拟合曲线如图所示。b-d为通过生物膜干涉技术(BLI)测定的与野生型(WT)S-RBD的结合动力学。生物素化的S-RBD被装载到SA生物传感器上，用于检测与S-B8(b)和S-E6(d)的结合动力学，而偶联在AR2G传感器上的S-RBD胺被用于S-D4(c)，并在Octet上检测。所有曲线使用数据分析软件(Forte Bio)以1：1结合模型进行拟合。e-g为通过生物膜干涉技术(BLI)测定的与N501Y S-RBD的结合动力学。使用的方法与上述相同，S-B8(e)，S-D4(f)和S-E6(g)的结合曲线如图所示。h所示为三种竞争性抗体与WT S-RBD和N501Y S-RBD的结合率(kon)、解离率(koff)和解离常数(KD)。
图4为抗体对合胞体形成的抑制作用。a为与hACE2表达细胞共培养48小时后，SARS-CoV-2和SARS-CoV刺突介导的合胞体形成的代表性图像。b和d显示了用10nM的hACE2竞争性抗体处理时，合胞体的数量计算和抑制率。S-RBD被用作阳性对照。c和e显示了用不同浓度的抗体和S-RBD处理后的合胞体数量和抑制。f总结了10nM和1nM时的抑制率。比例尺＝400μm。误差棒表示为SD，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，由学生T检验确定。
图5为hACE2竞争抗体的中和试验。a为测试并拟合了三种hACE2竞争性抗体对WTSARS-CoV-2假病毒的中和能力。c为采用微量中和试验对三种抗体进行测试。b和d为真SARS-CoV-2上每种抗体的NT50和HillSlope的总结。e和f为测试并拟合了三种hACE2竞争性抗体对SARS-CoV-2N501Y+D614G突变假病毒的中和能力，NT50和HillSlope如图所示。g为三种抗体对真病毒株B.1.1.7的中和。每种抗体的NT50和HillSlope如h所示。
图6为S-B8和S-E6结合SARS-CoV-2S-RBD的结构表征。晶体结构以带状图示，重要残基以棒状形式显示。RBD上与抗体重链和轻链相互作用的表位表面分别以橙色和黄色显示。S-RBD以白色显示，S-B8显示为蓝色和浅蓝色显示重链和轻链，S-E6以橙色和粉色显示重链和轻链，hACE2以绿色显示。SHM残基显示为半透明的品红球体，并在c-h中以品红色标签突出显示。a为在相同的相对视图中，S-B8和S-E6与结合至RBD的hACE2的结构比较。b为S-RBD表位残基与S-B8和S-E6相互作用的表面展示。来自S-B8(蓝色)和COVA2-39(青色，PDB7JMP)的FRH1-CDRH1和CDRH2如图所示用于比较。c为S-B8的CDRH1和CDRH2与RBD的相互作用。d为S-B8与RBD脊之间的相互作用。e为S-E6与RBD脊之间的相互作用。f与IGHV3-53的结合模式A的比较。CC12.3(粉色为重链和浅粉色为轻链)与SARS-CoV-2S-RBD(PDB 6XC7)的复合物，显示了32NY33基序与S-RBD之间的氢键。g为S-E6与RBM中间区域的相互作用。h为S-E6与S-RBD脊另一侧的RBM之间的相互作用。
图7为抗体结合至细胞表面表达的突变刺突蛋白的FACS分析。编码SARS-CoV-2突变全长刺突的表达质粒转染HEK293T细胞与三种hACE2竞争性IgG4抗体孵育。然后用FITC标记的抗人IgG Fc二抗对细胞进行染色，并用FACS进行分析。仅用二抗染色的细胞被设为阴性对照(NC)。阳性结合细胞群被标记为阳性群(positive pop.)。a为Mut1：D215H，b为Mut2：S247R，c为Mut3：D614G，d为Mut4：N439K+D614G，e为B.1.1.7：英国变异株的刺突，f为Mut5：N501Y+D614G，g为Mut 6：N501Y+E484K+D614G，h为Mut 7：N501Y+E484K+K417N+D614G，i为Mut 8：N501Y+K417N+D614G。灰线：NC，红线：S-B8，绿线：S-D4，蓝线：S-E6。j列出了Abs对每个突变体的平均荧光强度。
图8为与N501Y S-RBD的结合动力学。A-C.通过生物膜干涉技术(BLI)测定N501YS-RBD的结合动力学。生物素化的N501Y S-RBD被装载到SA生物传感器上，用于检测与S-B8(A)和S-E6(C)的结合动力学，而偶联到AR2G传感器上的N501Y S-RBD胺用于S-D4(B)，并在Octet上进行检测。所有曲线使用数据分析软件(Forte Bio)以1:1结合模型进行拟合。D.显示了三种竞争性抗体与N501Y S-RBD的结合率(kon)、解离率(koff)和解离常数(KD)。
图9为三种hACE2竞争性抗体对N501Y假病毒的中和。测试并拟合了三种hACE2竞争性抗体对SARS-CoV-2N501Y+D614G突变假病毒的中和能力，NT50和HillSlope显示在下图。
图10为三种hACE2竞争性抗体对真病毒B.1.1.7的中和。测试并拟合了三种hACE2竞争性抗体对真病毒B.1.1.7毒株的中和能力，NT50和HillSlope显示在下图。
图11为S-D4抗体对K417N+E484K+N501Y假病毒的中和。测试并拟合了S-D4抗体对SARS-CoV-2K417N+E484K+N501Y+D614G突变假病毒的中和能力，NT50和HillSlope显示在下图。
图12为S-D4抗体对B.1.351真病毒的中和。测试并拟合了S-D4抗体对真病毒B.1.351毒株的中和能力，NT50和HillSlope显示在下图。
图13为三聚体抗体展现出增强的对野生型SARS-CoV-2假病毒的中和能力。A.为与刺突蛋白结合的单体、二聚体和三聚体抗体方案。B.为还原型单体、二聚体和三聚体S-E6的SDS-PAGE分析。C.为SEC-HPLC分析表明了单体(青色)、二聚体(紫色)和三聚体S-E6(橙色)的均一性。D.测试并拟合了不同价态的S-E6对WT SARS-CoV-2假病毒的中和能力，利用3(G4S)连接子将CH1融合至T4F标签以构建三聚体S-E6。E.测试并拟合了三种具有不同三聚体化标签的三聚体S-E6对WT SARS-CoV-2假病毒的中和能力，利用3(G4S)连接子将标签融合至CH1。F.测试并拟合了三种具有不同长度刚性连接子的三聚体S-E6对WT SARS-CoV-2假病毒的中和能力，连接子用于融合T4F标签。G.为单体、二聚体和三聚体抗体的构建。利用连接子(灰色)将三聚体标签(浅橙色)融合至CH1结构域(深蓝色)来构建重链质粒，并在C端添加His标签(深橙色)用于抗体纯化。
图14为三聚体S-E6显示出恢复的与B.1.351(Beta毒株)刺突RBD的结合亲和力。利用生物膜干涉法(BLI)测量二聚体S-E6(A)或三聚体S-E6(B)与野生型(WT)S-RBD的结合动力学。利用BLI测量二聚体S-E6(C)或三聚体S-E6(D)与B.1.351的刺突RBD的结合动力学。拟合曲线如灰色虚线所示。E.为抗体与WT S-RBD和B.1.351S-RBD的结合率(kon)、解离率(koff)和解离常数(KD)。所有曲线使用数据分析软件(Forte Bio)以1:1结合模型进行拟合。
图15为三聚体S-E6显示出恢复的对B.1.351(Beta毒株)PSV的中和能力。A.测试并拟合了不同价态的S-E6对SARS-CoV-2B.1.351假病毒的中和能力。B.测试并拟合了三种具有不同三聚体化标签的三聚体S-E6对SARS-CoV-2B.1.351假病毒的中和能力。C.测试并拟合了三种具有不同长度刚性连接子的三聚体S-E6对SARS-CoV-2B.1.351假病毒的中和能力。
图16为来自不同类别的nAbs的三聚体形式显示出对SARS-CoV-2B.1.351PSV不同程度的中和增强作用。测试并拟合了来自第一、第二和第三类的二聚体或三聚体抗体对B.1.351SARS-CoV-2假病毒的中和能力。S-B8(A)、S-D4(B)、S-B2(C)和S-D9(D)来自第一类。S309(E)来自第二类。CoV2-2489(F)来自第三类。G.为NT50值在三聚体化后成倍增加。
图17为来自第一类的nAbs的三聚体形式显示出对SARS-CoV-2B.1.617.2PSV不同程度的中和增强作用。测试并拟合了来自第一类的二聚体或三聚体抗体对SARS-CoV-2B.1.617.2假病毒的中和能力。S-B8(A)、S-D4(B)、S-E2(C)、S-B2(D)和S-D9(E)来自第一类。F.为NT50值在三聚体化后成倍增加。
图18显示了三聚体S-E6和S-B8的结合偏好性。使用含亚油酸(红色)或不含亚油酸(蓝色)的生物膜干涉法(BLI)测量了三聚体S-E6(A)或三聚体S-B8(B)与野生型(WT)S-RBD的结合动力学。亚油酸的添加显著降低了抗体与刺突蛋白的结合，表明抗体更倾向于结合向上构象。
详细描述
为了使本公开更容易理解，首先定义一些术语。更多的定义在详细描述中列出。
本文提及的术语“抗体”包括完整抗体以及任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。完整抗体为糖蛋白，包含至少两条通过二硫键连接的重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(此处缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域，CL组成。VH和VL区域可以进一步细分为超变区，被称为互补决定区(CDRs)，中间散布着更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”或者“片段”)是指保留与抗原(例如，LAG-3蛋白)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段、(ii)F(ab’)2片段，由两个Fab片段通过二硫桥在铰链区连接而成的二价片段、(iii)Fab’片段，其实质上为具有部分铰链区的Fab(参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY Paul ed.,3.sup.rd ed.I993)、(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段、(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)、(vii)分离的互补决定区(CDR)和(viii)纳米抗体，包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但它们可以利用重组方法，通过合成的连接子连接在一起，使它们成为单个的蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人，(1988)Science 242:423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体也被包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段是使用本领域技术人员所熟知的常规技术获得，且这些片段与完整抗体以相同的方式进行效用筛选。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指制备单分子组合物的抗体分子。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中，框架区和CDR区都来自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本公开的人抗体可包括非人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变，或体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不意为包括来自其他哺乳动物物种种系，例如小鼠，的CDR序列被移植到人框架序列上的抗体。
如本文所用，“特异性结合至SARS-CoV-2刺突蛋白”或“对SARS-CoV-2刺突蛋白具有特异性”的抗体意在指与SARS-CoV-2刺突蛋白结合但实质上不与非SARS-CoV-2刺突蛋白结合的抗体。优选地，该抗体以“高亲和力”与SARS-CoV-2刺突蛋白结合，即KD为1×10-7M或更少，更优选为5×10-8M或更少，更优选为3×10-8M或更少，更优选为1×10-8M或更少，更优选为3×10-9M或更少，或甚至更优选为1×10-9M或更少。
本文中，短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
本公开地各个方面在以下各小节进一步详细描述。
三聚体抗体
研究发现，抗刺突RBD抗体的三聚体形式比它们的二聚体形式展现出更高的中和活性。同样重要但出乎意料的是，三聚体形式在NT50为36pM时，有效中和免疫逃逸毒株B.1.351(beta)，且在NT50为7pM时，完全中和了另一免疫逃逸毒株B.1.617.2(delta)。
实施例3系统地比较了不同三聚体标签、抗体与三聚体标签之间的连接子对抗体中和的影响。研究发现，利用柔性连接子(例如，G4S)融合T4F标签，致使S-E6与刺突RBD的结合亲和力显著增加。同样令人惊讶的是，在NT50为0.036nM时，它超强地中和了免疫逃逸变异株(E484K、K417N、N501Y和D614G)假病毒(PSV)，并显示出抗B.1.617.2PSV的8.9倍的效力增长。通过将这种三聚体形式工程方法应用到其他RMB-参与的nAbs，类似的中和效果得到了增强。NT50值可以提高多达30倍。
根据相互作用的表位，nAbs被分为三类(Chen等人，Nature Medicine 2021,27)。第一类抗体阻断可溶性hACE2结合并结合到RBD的受体结合基序(RBM)中的多个近端位点。第二类nAbs结合至刺突蛋白RBD的碱基。第三类nAbs识别刺突蛋白的NTD。即时数据显示，第一类抗体通过三聚体重构实现最佳的增强。然而，第二类和第三类抗体显示出类似的阻碍抑制率的NT50。
刺突蛋白的序列已知(表A)。第11-304位氨基酸形成了N端结构域(NTD)，第319-541位氨基酸形成了受体结合结构域(RBD)。受体结合基序(RBM)中的氨基酸残基，包括第438、447-456、489-495、以及507-508位(如表A中方框所示)。
表A.SARS-CoV-2刺突蛋白的序列和结构域(SEQ ID NO:126)
Figure BDA0003972809200000081
因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种三聚体抗体，其包括融合至三聚体化结构域的抗体或片段。
如阐述，抗体或抗原结合片段对SARS-CoV-2刺突蛋白具有结合特异性，且优选地与受体结合结构域(RBD)(第一类中和抗体)的受体结合基序(RBM)结合。已知RBM包括SEQID NO:126的第438、447-456、489-495和507-508位氨基酸残基。因此，在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段对SARS-CoV-2刺突蛋白具有结合特异性，并与SEQ ID NO:126的第438、447-456、489-495和507-508位中的至少一个残基结合。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括如本申请中列举的VH和VL序列。例如，抗体或其片段包含重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含(a)SEQ ID NO:5-10；(b)SEQ ID NO:27-32；(c)SEQ ID NO:49-54；(d)SEQ ID NO:71-76；或(e)SEQ ID NO:89-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其片段不与SARS-CoV刺突蛋白结合。
三聚体抗体中的抗体或抗原结合片段可为本领域已知的任何形式，如Fab片段、scFv片段或纳米抗体。当使用Fab片段时，如本文所示，VH和VL进一步分别包括CH1和CL。在一些实施方案中，三聚体化结构域被融合至CH1。在一些实施方案中，三聚体化结构域被融合至CL。
三聚体化结构域是一种能够介导三聚体分子稳定结合的肽序列。三聚体化结构域为本领域已知，例如三聚体蛋白中负责介导三聚体蛋白结合的结构域。
三聚化结构域示例包括T4噬菌体纤维蛋白三聚体化基序(T4F)、GCN4三聚体亮氨酸拉链基序(GCN4)和人胶原蛋白XVIII衍生的同源三聚体化结构域(TIE)。示例序列在SEQID NO:103、107和111中提供。优选的三聚体化结构域为T4F(SEQ ID NO:103)。在一些实施方案中，三聚体化结构域不长于100个氨基酸，或不长于90、80、70、60或50个氨基酸。
在一些实施方案中，融合蛋白还包括抗体或抗原结合片段与三聚体化结构域之间的连接肽。在一些实施方案中，连接肽是柔性的，例如SEQ ID NO:122或123。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段与三聚体化结构域之间的距离不长于100个氨基酸，或不长于90、80、70、60、50、40、30、25、20、15或10个氨基酸。在一些实施方案中，连接肽为5到50个氨基酸残基的长度，优选5到20个氨基酸残基的长度。抗SARS-Cov-2刺突RBD的抗体
本公开也提供能够结合至SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体及其片段。如所附实验实施例所示，这些抗体具有优异的中和能力。
本公开提供了对SARS-CoV-2刺突蛋白具有特异性的抗体和片段，特别是受体结合结构域(RBD)。本公开的抗体具有抗体的特定功能特征或性质。
SARS-CoV-2为一种单链RNA包膜病毒。其整个基因组长度为29,881bp(GenBankno.MN908947)，编码9860个氨基酸。基因片段表达结构和非结构蛋白。S、E、M和N基因编码结构蛋白，而非结构蛋白，如3-糜蛋白酶样蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶，由ORF区编码。
糖基化的S(刺突)蛋白覆盖在SARS-CoV-2表面，并结合至宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，介导病毒进入细胞。当S蛋白结合至受体时，TM蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)，一种位于宿主细胞膜上的2型TM丝氨酸蛋白酶，通过激活S蛋白促进病毒进入细胞。一旦病毒进入细胞，病毒RNA被释放，多聚蛋白从RNA基因组被翻译，病毒RNA基因组的复制和转录通过蛋白质切割和复制酶-转录酶复合物的组装发生。病毒RNA被复制，结构蛋白在宿主细胞内合成、组装和包装，之后病毒颗粒被释放。
刺突蛋白的全长为1273aa，由位于N端的信号肽(氨基酸第1-13位)、S1亚基(14-685位残基)和S2亚基(686-1273位残基)组成；后两个区域分别负责受体结合和膜融合。在S1亚基中，存在N端结构域(14-305位残基)和受体结合结构域(RBD，319-541位残基)；S2亚基由融合肽(FP)(788-806位残基)、七肽重复序列1(HR1)(912-984位残基)、HR2(1163-1213位残基)、TM结构域(1213-1237位残基)和细胞质结构域(1237-1273位残基)组成。
在本实施例中发现了三种有效的中和抗体。有趣的是，它们不与SARS-CoV刺突蛋白(图2的b)发生交叉反应，这可能是由于这些抗体靶向的SARS-CoV和SAR-CoV-2之间的受体结合位点的表位存在差异(～70％差异)。此外，这三种抗体均不与其他五种HCoV结合(图2的c-g)。而且，HEp-2细胞的自身反应性实验排除了S-E6和S-D4来源于自身免疫反应，而S-B8表现出弱到中等的自身反应性，这在S-B8假定种系抗体中增加。
对S-E6和S-B8的结构研究揭示了这些组合抗体的一些显著特征。病毒感染的初次免疫应答后会有二次应答，其会产生功能更好的抗体，其中，结合能可以通过体细胞超突变来改进。二次免疫应答是为了之后遇到相同的抗原，也是疫苗的基础。在大流行的情况下，如SARS-CoV-2、禽流感或埃博拉病毒，如果感染在最初几天没有被免疫系统处理，患者有很高的死亡概率，因此，免疫系统将没有足够的时间来改进免疫反应。与之一致的是，从SARS-CoV-2恢复期患者体内分离的中和抗体仅含有少数氨基酸突变，这可能是由于病毒快速清除导致B细胞刺激较弱的结果。从感染不久的恢复期患者体内分离的中和抗体可能尚未完全改进(成熟)。相比之下，S-B8和S-E6展现出更高水平的SHM，其中许多SHM参与了与SARS-CoV-2RBD(S-RBD)的特异性相互作用。S-B8中13个SHM残基中的9个和S-E6中22个SHM残基中的8个位于抗体-抗原接触面。虽然这些SHM残基中的一些只使用它们的肽骨架，但其他残基则依赖于S-RBD结合的特定侧链与。有趣的是，S-E6的CDRH1中的SHM产生33NY34序列，该序列与IGHV3-53/3-66抗体中的32NY33基序相似，后者是靶向S-RBD的最常见的种系，这表明组合抗体库和成熟过程可以产生替代的抗体溶液。
本发明人利用SARS-CoV-2S RBD筛选了组合人抗体库，并鉴定了三种高效抗体，它们可以选择性地结合S蛋白并中和真SARS-CoV-2病毒。与来自COVID-19患者的中和抗体相比，这些抗体通常具有较低的体细胞超突变(SHM)，这些抗体包含超过13-22个SHM，其中许多与SARS-CoV-2刺突RBD的晶体结构中的特定相互作用有关。
三种抗体S-B8、S-D4和S-E6，都剂量依赖性地与人ACE2蛋白竞争结合S RDB(图3)。而且，它们对野生型SARS-CoV-2PSV感染显示出剂量依赖性的有效中和作用(图5)。同样重要的是，这些抗体能够结合刺突蛋白的某些天然突变体，例如D215H、S247R、D614G、N439K+D614G、N501Y+D614G、E484K+N501Y+D614G、K417N+E484K+N501Y+D614G和K417N+N501Y+D614G(图7)。这些数据表明，这些抗体可以为针对这些天然SARS-CoV-2变异株的合适的治疗剂。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种对SARS-CoV-2刺突蛋白具有特异性的抗体或其片段。所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3具有本文公开的那些抗体的CDR序列，例如表1A-1E提供的那些。
在一个实施方案中，参考抗体为S-B8，它具有SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ IDNO:2的VL序列。其CDR序列根据Kabat编号为SEQ ID NO:5-10，根据Chothia编号为SEQ ID NO:11-16。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5-10。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ IDNO:11-16。
在一个实施方案中，参考抗体为S-D4，其具有SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ IDNO:24的VL序列。其CDR序列根据Kabat编号为SEQ ID NO:27-32，根据Chothia编号为SEQ IDNO:33-38。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:27-32。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:33-38。
在一个实施方案中，参考抗体为S-E6，其具有SEQ ID NO:45的VH序列和SEQ IDNO:46的VL序列。其CDR序列根据Kabat编号为SEQ ID NO:49-54，根据Chothia编号为SEQ IDNO:55-60。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:49-54。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:55-60。
在一个实施方案中，参考抗体为S-B2，其具有SEQ ID NO:67的VH序列和SEQ IDNO:68的VL序列。其CDR序列根据Kabat编号为SEQ ID NO：71-76，根据Chothia编号为SEQ IDNO:77-82。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:71-76。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:77-82。
在一个实施方案中，参考抗体为S-D9，其具有SEQ ID NO:85的VH序列和SEQ IDNO:86的VL序列。其CDR序列根据Kabat编号为SEQ ID NO:89-94，根据Chothia编号为SEQ IDNO:95-100。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:89-94。在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段具有CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:95-100。
在一个实施方案中，还提供了一种抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段对SARS-CoV-2刺突蛋白具有特异性，并与本公开的抗体或其片段竞争结合SARS-CoV-2刺突蛋白，或与抗体或其片段结合相同表位。在一个实施方案中，抗体或其片段为封闭抗体或其片段。在一个实施方案中，抗体或其片段为非封闭抗体或其片段。
在各种实施方案中，抗体可以为，例如，人抗体。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可至少与上述序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。与上述序列的VH和VL区具有高(即，80％以上)同源性的具有VH和VL区的抗体，可以通过对VH和/或VL氨基酸序列的核酸进行突变(例如，定点突变或PCR介导的突变)获得，然后利用本文所述的功能测试对所编码的改变抗体进行保留功能(即上述的功能)的检测。
本公开列举的CDR区也可以改变为其自己的生物变异株。CDR序列的生物变异株是通过一个、两个或三个氨基酸的添加、删除和/或替换从原始序列衍生而来。在一些实施方案中，所述替换为保守的氨基酸替换。
“保守的氨基酸替换”是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、beta-支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替换。在另一实施方案中，氨基酸串可以用结构相似的，在侧链家族成员中顺序和/或组成上有所不同的串替换。
双功能分子
在一些实施方案中，本公开提供了双功能或双特异性分子，其包含抗刺突蛋白抗体/片段与至少一个其他功能分子连接，例如，另一个肽或蛋白(例如，受体的另一种抗体或配体)，以产生一个双功能或双特异性分子，该分子与至少两个不同的结合位点或靶分子结合。因此，如本文所用，“双特异性分子”包括具有三个或更多特异性的分子。在优选的实施方案中，双特异性分子包含对SARS-CoV-2刺突蛋白的第一结合特异性和对触发分子的第二结合特异性，该触发分子招募能够杀死SARS-CoV-2病毒的细胞毒性效应细胞。合适的触发分子的例子为CD64、CD89、CD16和CD3。参见Kufer等人，Trends in Biotech.22(5):238-44,2004。
在一些实施方案中，第二功能/特异性可用于抗增强因子(EF)，例如，与参与细胞毒性活动的表面蛋白结合的分子，从而增强针对目标病毒或受感染细胞的免疫反应。例如，抗增强因子可以结合细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CDS、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)、其他免疫调节分子(例如通过PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR、CD47或CD73)或其他免疫细胞，致使对病毒或受感染细胞的免疫反应增强。
双功能/双特异性分子还包括双表位分子，它们对目标抗原的一部分具有第一特异性，对同一抗原的另一部分具有第二特异性。另一部分可与或不与第一部分重叠。在一些实施方案中，对其他部分的结合本身可能不具有预期的阻断活性，而是增强了第一特异性的活性。这种增强不受任何特定理论的约束，可能是由于更紧密的结合或稳定的构象。在一些实施方案中，两种结合都可以独立地展现所期望的活性。
本公开还提供了不仅包括抗体或抗原结合片段的双功能分子。作为肿瘤抗原靶向分子，特异于刺突蛋白的抗体或抗原结合片段，如本文所述，可以任选地通过连接肽与免疫细胞因子或配体结合。连接的免疫细胞因子或配体包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT和GITRL。
双特异性分子可以有多种不同的形式和尺寸。在尺寸谱的一端，双特异性分子保留了传统的抗体形式，除此之外，代替两个具有相同特异性的结合臂，它有两个各自具有不同特异性的结合臂。另一端，双特异性分子由两个单链抗体片段(scFv’s)通过肽链连接而成，即所谓的Bs(scFv)2结构。中等尺寸的双特异性分子包括由肽基连接子连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因工程、体细胞杂交或化学方法制备。参见，例如，Kufer等人，见上文、Cao和Suresh,Bioconjugate Chem.9(6):635-44,1988和van Spriel等人，Immunol.Today 21(8):391-7,2000；以及其中引用的参考文献。
组合物和药物组合物
在一个实施方案中，治疗方法还可以包括施用有效量的另一制剂。在一些实施方案中，抗刺突蛋白抗体或片段和有效量的另一制剂共同给药。在一些实施方案中，第二种制剂也是抗刺突的抗体或其片段。在一些实施方案中，第二种制剂与抗体或其片段同时或按顺序共同给药。
在一些实施方案中，第二种制剂能有效减少或抑制细胞因子释放风暴。在一些实施方案中，第二种制剂为皮质类固醇。非限制性的例子包括甲基强的松龙(methylprednisolone)(特别是风湿性疾病患者)、地塞米松(dexamethasone)(特别是FHLH患者)。
在一些实施方案中，第二种制剂为细胞消融治疗。非限制性的例子包括环磷酰胺(cyclophosphamide)(特别是在JIA和MAS患者中)、依托泊苷(etoposide)(特别是在FHLH患者中)、利妥昔单抗(rituximab)(特别是爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)相关的HLH)、抗胸腺细胞球蛋白(antithymocyte globulin)(特别是处于FHLH治疗的骨髓移植期的患者)、阿仑单抗(alemtuzumab)(特别是FHLH或SLE相关的MAS患者)。
在一些实施方案中，第二种制剂为T细胞调节剂。非限制性的例子包括钙调磷酸酶(例如，环孢霉素)，其抑制IL-2的产生，和阿巴西普(abatacept)，其抑制T细胞的CD28信号传导。在一些实施方案中，第二种制剂为抗GM-CSF抑制剂或抗体。
在一些实施方案中，第二种制剂为细胞因子抑制剂，这些抑制剂靶向INFγ、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-6和/或TNF。
在一些实施方案中，第二种制剂针对潜在疾病或病症，如SARS-CoV-2感染。非限制性的例子包括洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、奥司他韦(oseltamivir)(特敏福，Tamifu)、法匹拉韦(favipiravir)、芬戈莫德(fingolimod)、甲基强的松龙、贝伐单抗(bevacizumab)、磷酸氯喹、氯喹、硫酸羟氯喹和瑞德西韦(remdesivir)。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本公开中的抗体与先前药学可接受的一起配制。它可以任选地包含一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本公开的药物组合物也可以与，例如，抗病毒剂或疫苗进行联合给药治疗。
药物组合物可以包含任意数量的辅料。可使用的辅料包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、涂料、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适的辅料的选择和使用在Gennaro,ed.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins2003)中进行了教导，其披露以引用的方式纳入本文。优选地，药物组合物适用于静脉、肌肉、皮下、肠外、脊柱或表皮给药(例如，通过注射或输液)。根据给药途径，活性化合物可以包被在材料中，以保护其免受酸和其他可能使其失活的自然条件的作用。本文所用的短语“肠外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常为注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和椎管内注射和输液。或者，本公开的抗体可以通过非注射途径给药，例如局部、表皮或黏膜给药途径，例如鼻腔、口服、阴道、直肠、舌下或局部。
药物组合物可以为无菌水溶液或分散体的形式。它们也可以在微乳、脂质体或其他适用于高药物浓度的有序结构中配制。
根据被治疗的受试者和特定的给药方式，可与载体材料结合产生单一剂型的活性成分的量会有所不同，通常为产生治疗效果的组合物的量。一般来说，在百分比中，这个量的范围将为从约0.01％至约99％的活性成分，优选地，从约0.1％至约70％，最优选地，从约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载体相结合。
调整给药方案以提供最佳的预期反应(例如，治疗性反应)。例如，可以单次推注，可以随着时间分剂量给药，或根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠外组合物，对于给药的方便性和剂量的均一性尤为有利。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单一剂量的物理上的离散单位；每个单位包含预定数量的活性化合物，以与所需的药物载体结合产生预期治疗效果来计算。或者，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况下需要较少的给药频率。
对于抗体的给药，剂量范围为宿主体重的约0.0001至100mg/kg，更通常地为0.01至5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案包括每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。本公开的抗体的优选给药方案包括通过静脉给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体使用以下给药方案之一：(i)每四周六次剂量，之后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后每三周1mg/kg体重一次。在一些方法中，剂量被调整以达到血浆抗体浓度为约1-1000μg/mL，在一些方法中为约25-300μg/mL。
本公开的抗体“治疗有效剂量”优选为能致使疾病症状严重程度降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防由于疾病的折磨而导致的损伤或残疾。例如，对于荷瘤受试者的治疗，“治疗有效剂量”优选抑制至少约20％的肿瘤生长，更优选抑制至少约40％的肿瘤生长，甚至更优选抑制至少约60％的肿瘤生长，而且相对于未治疗的受试者，还更优选抑制至少约80％的肿瘤生长。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤的大小，或以其他方式改善受试者的症状，受试者通常为人或可以是另一种哺乳动物。
使用和方法
本公开的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内实用性，例如涉及检测SARS-CoV-2刺突蛋白，或预防或治疗SARS-CoV-2病毒感染。在一个优选的实施方案中，本公开的抗体为人抗体。例如，这些分子可以在体外或离体培养中给予细胞或在体内给予人类受试者，以增强各种情况下的免疫力。因此，在一个方面，本公开提供了一种修改受试者免疫应答的方法，包括向受试者施用本公开的抗体或其抗原结合部分，从而修饰受试者的免疫应答。优选地，所述应答反应被增强、刺激或上调。
优选的受试者包括感染SARS-CoV-2病毒或有感染SARS-CoV-2风险的人类患者。
本公开还提供了检测样品中SARS-CoV-2病毒的存在，或测量SARS-CoV-2病毒数量的方法，包括在允许抗体或其部分与SARS-CoV-2刺突蛋白形成复合物的条件下，使本公开的抗体或其抗原结合接触样品和对照样品。然后检测复合物的形成，其中，样品与对照样品形成的复合物的差异表明样品中存在SARS-CoV-2病毒。此外，本公开的抗体可用于纯化SARS-CoV-2刺突蛋白。
实施例
下面的实施例用来说明本公开的优选实施方案。本领域的技术人员应当理解，下述实施例中所披露的技术代表了发明人在本公开的实践中发现的运作良好的技术，因此，可被视为构成其实践的优选方式。然而，那些本领域的技术人员应该根据本公开，理解具体的实施方案中可做出许多改变，并且在不偏离本公开的概念、精神和范围的情况下，仍然获得一个相似或类似的结果。更具体地说，显而易见的是，某些在化学和生理上都相关的制剂可以替代本文所描述的制剂，同时可获得相同或类似的结果。所有这些类似的替代物和修改，对本领域的技术人员来说是显而易见的，都被认为在由所附权利要求限定的本公开的精神、范围和概念内。
实施例1人抗体的鉴定
本实施例报道了从大流行前的人组合抗体库中筛选出三株有效的SARS-CoV-2抗体，S-E6、S-B8和S-D4。
这些抗体中的两种表现出高效的中和作用，对假病毒的明显中和，NT50低至0.025nM，和对真SARS-CoV-2病毒的明显中和，NT50低至0.25nM。抗体的种系分类表明，与迄今为止报道的最常见的IGHV3-53/3-66、IGHV1-2或IGHV3-30种系相比，最有效的抗体S-E6来源于一个较不常见的种系IGHV4-31。此外，尽管三种抗体来源于不同的种系基因，但都发现了高水平的体细胞超突变(每个分子最多15个氨基酸)。X射线结构研究发现，这些S-E6和S-B8抗体与受体结合位点结合，但接近RBD的角度不同，表位略有不同。
材料和方法：
细胞培养
Vero细胞系(
Figure BDA0003972809200000171
CCL-81TM)培养在含有10％(v/v)FBS(Gibco，1600074)的DMEM/F-12K培养基(Gibco，C11330500CP)中。FreeStyleTM293-F(HEK 293F，Thermo FisherScientific，R79007)细胞系培养在Freestyle 293表达培养基(Thermo FisherScientific，12338026)中。为了建立稳定的HEK293T/hACE2细胞系，用PiggyBac转位子系统(Transposon System)(System Biosciences，PB210PA-1)将编码融合有hACE2的BFP的PB510质粒瞬时转染HEK293T细胞(/>
Figure BDA0003972809200000181
ACS-4500TM)，转染后6h加入2μg/mL嘌呤霉素。所得细胞在含嘌呤霉素的培养基中再保存2天。通过流式细胞仪(BD FACS Aria III)分选表达BFP的阳性细胞。将过表达hACE2的分选细胞扩增，培养在添加了10％FBS(v/v)和10μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基(Gibco，10566016)中。
重组的SARS-CoV-2刺突RBD、人ACE2和抗体的表达与纯化
将密码子优化的SARS-CoV-2刺突受体结合结构域(S-RBD)和人ACE2胞外结构域(hACE2-ECD)的DNA序列克隆到pFuse-Fc表达载体(Invivogen)中。在RBD和Fc之间插入凝血酶切割序列，从而产生可切割的人Fc标签，用于后续的研究。通过瞬时转染将SARS-CoV-2S-RBD-hFc和hACE2-ECD-mFc蛋白在HEK293F细胞中异源表达，并培养4天，随后通过Mabselect柱(Cytiva，17-5199-01)纯化。简而言之，分泌的Fc标签过的重组蛋白S-RBD-hFc和hACE2-ECD-mFc的细胞培养基加载到预先清洗过且用PBS缓冲液(150mM氯化钠，20mM磷酸钠，pH7.2)平衡过的Mabselect柱上，并用pH 3.4的柠檬酸缓冲液洗脱。
将组合抗体可变区的DNA序列克隆到全长的人IgG4突变体(S228P)中，并在HEK293F细胞中表达4天，再通过Mabselect层析柱纯化。用离心浓缩仪将纯化的重组蛋白和抗体进行缓冲液交换至PBS缓冲液中。
功能导向的噬菌体淘选
经过两轮针对固定在链霉亲和素包被的磁珠(Pierce，21925)上的生物素化的S-RBD蛋白的亲和富集后，从组合的人单克隆scFv抗体噬菌体库(1011个成员)中筛选出SARS-CoV-2S-RBD特异性的scFv抗体，然后针对hACE2-ECD蛋白进行第三轮竞争淘选。简而言之，在前两轮筛选中，结合至抗原(S-RBD)的噬菌粒(展示抗体库)在每个循环中被富集，并用甘氨酸-HCl(pH 2.2)洗脱。XL1-Blue细胞被用于表达和扩增用于下一轮淘选的输出噬菌体。为了确定hACE2竞争性抗体，在第三轮淘选中采用了动力学竞争性淘选方法。用含有饱和浓度的hACE2-ECD蛋白(200nM；用于S-RBD和hACE2-ECD结合，EC80＝80nM)的洗脱缓冲液代替传统的pH 2.2的缓冲液洗脱噬菌体两次。三次迭代后，挑取96个阳性菌落进行噬菌体ELISA分析。所有阳性克隆都用Sanger测序法测序。CDR3结构域的DNA和蛋白质序列均通过国际免疫遗传学(ImMunoGeneTics，IMGT)信息平台(www.imgt.org)进行分析。
噬菌体ELISA
亲和素(Pierce，21121)在PBS缓冲液(Sigma，C3041)中稀释至终浓度为2ng/μL。所得亲和素溶液用于包被96孔板(25μL/孔)，4℃过夜。包被过的孔板用PBS缓冲液(150μL/孔)清洗一次，随后每孔加入25μL生物素化的SARS-CoV-2S-RBD-hFc溶液(2ng/μL)，室温孵育1h。单独的PBST(含0.05％ Tween-20的PBS)缓冲液和hFc溶液(2ng/μL)分别作为背景和阴性对照。移除孵育液后，所得孔板用PBST缓冲液冲洗一遍，用含5％牛奶(v/v)的PBST(150μL/孔)的封闭液在37℃孵育1小时。封闭和PBST清洗(一次)后，50μL含噬菌粒的XL1-Blue培养基上清液(通过3000g离心15分钟第三轮淘选输出XL1-Blue细胞)与10μL 5％牛奶(v/v)混合在PBST中，然后加入每孔并在37℃孵育1小时。所得孔板用PBST冲洗八次后进行辣根过氧化物酶(HRP)检测。将含有二抗，抗M13噬菌体抗体与HRP(稀释系数为1:5000；SinoBiological，11973-MM05T-H)偶联的溶液，加入上述孔板中(150μL/孔)并在37℃孵育1小时。用PBST清洗一次，随后在每孔中加入50μL ABTS溶液(Roche，11684302001)。室温孵育约10分钟后，在酶标仪(Enspire，PerkinElmer)上测量每孔在405nm处的吸光度变化。
竞争性ELISA
测量所选抗体与hACE2在结合SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的竞争性。将重组hACE2-ECD以2ng/μL包被于PBS缓冲液中，每孔100μL，4℃过夜，PBS清洗一次，然后用含3％ BSA的PBS封闭。将终浓度为50nM的生物素化S-RBD(通过凝血酶消化去除hFc标签)与2倍梯度稀释的S-B8、S-D4、S-E6抗体(1-133nM)在4℃孵育30分钟，以IgG4e1同种型抗体作为阴性对照。将S-RBD和抗体混合物加入hACE2-ECD包被的孔板中，室温孵育1小时，随后用PBST清洗4次。利用链霉亲和素-HRP偶联蛋白检测板中hACE2-ECD结合的S-RBD。
利用生物膜干涉技术(BLI)测定亲和力
使用AR2G生物传感器，在Octet RED96(Molecular Devices LLC，圣何塞，加州，美国)上通过BLI检测S-D4与SARS-CoV-2野生型或突变型S-RBD的结合亲和力。融合有hFc的SARS-CoV-2S-RBD先被凝血酶消化以去除Fc标签。所得的S-RBD稀释在含有0.02％ Tween-20和0.05％ BSA的PBS溶液(PBST-B)(10μg/mL)中，通过胺偶联加载到AR2G生物传感器上。将AR2G-S-RBD传感器浸入PBST-B中60秒以建立基线，然后与2倍梯度稀释的抗体溶液孵育，记录结合的渐进曲线。最后，将传感器在PBST-B缓冲液中孵育，记录解离的渐进曲线。对于S-B8和S-E6的检测，S-RBD被生物素化后，加载到链霉亲和素(SA)传感器，其余步骤与S-D4的步骤相同。传感器再生是通过将使用过的传感器浸入pH 3.4的柠檬酸缓冲液中，并在PBST-B缓冲液中平衡。用ForteBio Data Analysis软件分析结果。
FACS检测抗体与细胞表面表达的刺突的相互作用
在流式细胞术结合实验中，将全长的SARS-CoV-2或SARS的刺突蛋白与P2A-EGFP偶联后，瞬时转染到HEK293T细胞中。培养24小时后，收集细胞并重悬于冰冷的FACS缓冲液(PBS、0.05％ BSA和2mM EDTA)中。将表达刺突蛋白的细胞(每管50,000个细胞)与不同的抗S-RBD抗体在4℃孵育20分钟，然后用1mL冰冷的FACS缓冲液清洗，离心，并重悬于100μL冰冷的FACS缓冲液中，其中含有能识别人Fc(1:800v/v稀释，Life technology，A21433)的二抗偶联的Alexa555。4℃孵育15分钟后，清洗细胞两次并重悬于FACS缓冲液中，然后在流式细胞仪(Cyto FLEX S，Beckman Culter)上进行分类和分析，以确定抗体与过表达野生型刺突的细胞的相对结合水平。eGFP阳性细胞中Alexa555的平均荧光强度被记录与分析，以评估抗体结合。
尺寸排阻-高效液相色谱法(SEC-HPLC)
将20μL 0.5μg/μL纯化的S-RBD抗体应用于Agilent Bio SEC-5，500A HPLC系统。流动相为PBS缓冲液(pH 7.2)，流速为0.35mL/分钟。通过保留时间和曲线下面积(AUC)对吸光度进行分析和整合，以确定聚集物、单体组分和降解物组分的百分比。
细胞-细胞融合试验
细胞-细胞融合试验按以下建立。简而言之，hACE2阳性Vero细胞(通过FACS分选具有内源性hACE2的细胞)用作靶细胞。瞬时转染了SARS-CoV-2刺突-P2A-EGFP或SARS刺突-P2A-EGFP的HEK293F细胞设置为效应细胞。先将靶向Vero细胞以1×105/孔的密度接种于24孔板，37℃培养4小时后，按2:1的比例分别加入效应细胞、HEK293F/SARS刺突-EGFP或HEK293F/SARS-CoV-2刺突-EGFP。共培养的细胞培养在含10％ FBS的DMEM培养基中，并用或不用指定浓度的抗SARS-CoV-2刺突抗体处理。重组SARS-CoV-2S-RBD用作阳性对照。37℃培养6小时后，用荧光显微镜(EVOS M5000，Life Technologies)评估细胞-细胞融合率。在每个处理组随机挑选五个视野进行显微分析，计数融合和未融合EGFP阳性细胞的数量。
假病毒制备
根据制造商的说明书，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，L3000-015)将NL4-3mCherry荧光素酶质粒(addgene，44965)和pcDNA3.1野生型或突变型SARS-CoV-2突刺Δ19质粒(编码SARS-CoV-2突刺蛋白，C端截短19个AA)共转染HEK293T细胞。假型颗粒很容易释放到上清液中。转染后48小时收集含有SARS-CoV-2假病毒的上清液，过滤(0.45μm孔径，Sartorius，16533-K)，用Lenti-X浓缩仪(Takara，631231)混合，4℃过夜。然后在4℃1500g离心45分钟。收集细胞沉淀并重悬于DMEM培养基中，在-80℃保存备用。
基于假病毒的中和试验
为了检测所选抗体对冠状病毒假病毒(PSV)感染的中和能力，首先将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔的密度接种到96孔白色底板中，培养过夜。PSV与等体积不同浓度的所选抗体(稀释系数：3.16，S-B8和S-D4为200nM到200fM，S-E6为200nM到6.3fM)在DMEM中37℃预孵育30分钟。以不含抗体的DMEM加入或不加入PSV作为对照。孵育结束后，将PSV混合物转移至含有HEK293T/hACE2细胞的培养板中。处理16小时后，将含有PSV和抗体的DMEM培养基更换为新鲜培养基，继续孵育48小时。使用Bright-LumiTM萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(Beyotime，RG015M)通过荧光素酶活性评估PSV感染效果。每孔加入50μL的荧光素酶底物，然后在Envision酶标仪(PerkinElmer，Ensight)测量相对发光单位(RLU)值。
真SARS-CoV-2病毒中和试验
根据商定的实践规范、风险评估(根据ACDP)和标准操作程序，这项研究是在HSE许可下在牛津大学的CL3设施中进行的。简而言之，这种快速、高通量的试验确定了在Vero细胞中减少了50％不同的真SARS-CoV-2毒株感染聚焦形成单位的抗体浓度，如下所示。在与Vero细胞孵育前，将固定剂量的SARS-CoV-2(Victoria 01/2020分离株)与四倍稀释的0.5log10梯度稀释的抗体(从100nM到1pM分11档)预孵育。含1.5％羧甲基纤维素的覆盖层被用来防止卫星聚焦形成。感染后20小时，用4％多聚甲醛固定该单层，用2％ Triton X-100渗透化处理并用mAb EY 2A染色N抗原。过氧化物酶偶联的抗体和True Blue过氧化物酶底物培养后，用ELISPOT读取器计数感染灶。用四参数逻辑回归(Hill方程)在GraphPad Prism8.3中分析数据。
自身反应性试验
使用HEp-2抗核抗体(ANA)试剂盒(Medical&Biological Laboratories Co.,Ltd，4220-12CN)，按照制造商的说明进行自身反应性试验。简而言之，将35μL浓度为0.1mg/mL的抗体加载到预先接种了固定和渗透化过的HEp-2细胞的载玻片上的孔中，室温孵育20分钟。使用试剂盒提供的来自自身免疫性患者的阳性血清和来自健康供者的阴性血清作为对照。将FITC偶联的抗人二抗清洗两次(每次5分钟)后，与细胞在室温下孵育20分钟。然后清洗载玻片并安置盖玻片，用20×物镜在荧光显微镜(ZEISS，Axio Observer A1)上观察。
蛋白生产和结构测定
合成SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD；残基第319-541位)的编码序列，并将其克隆到定制的pFastBac载体中，设计将N端gp67信号肽和C端组氨酸(His6)标签融合至靶蛋白。为了表达RBD蛋白，使用Bac-to-Bac系统(Life Technologies)从测序确认的pFastBac构建体中生成重组杆状病毒质粒(bacmid)DNA。通过使用FuGENE HD(Promega)将纯化的杆状病毒DNA转染到Sf9细胞中生成杆状病毒，随后以5至10的感染复数(MOI)感染High Five细胞(Life Technologies)的悬浮培养物。感染的High Five细胞在28℃，110 rpm下振荡培养72小时进行蛋白表达。收集分泌到上清液中的RBD蛋白，然后用10kDa分子量(MW)截止Centramate盒(Pall Corporation)浓缩。使用Ni-NTA树脂(QIAGEN)通过亲和层析纯化RBD蛋白，然后在HiLoad Superdex200pg色谱柱(GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱，将缓冲液交换为20mM Tris-盐酸pH 7.4和150mM氯化钠。Fabs在ExpiCHO细胞中表达，并用CaptureSelect CH1-XL树脂(Thermo Fisher)纯化，然后进行尺寸排阻色谱。Fab/RBD复合物是通过将两种组分以等摩尔比混合并在4℃孵育过夜后形成的，然后进行晶体试验。
在斯克里普斯研究院(The Scripps Research Institute)的机器人CrystalMation系统(Rigaku)上使用JCSG Core Suite(QIAGEN)的384个条件筛选Fab/RBD复合物进行结晶。晶体在第一周出现，在第二周收获，然后在液氮中闪冻，用于X射线衍射实验。衍射数据在冷冻低温(100K)下采集于阿贡国家实验室(Argonne NationalLaboratory)先进光子源(APS)光束线23-ID-B处，光束波长为
Figure BDA0003972809200000221
并用HKL2000进行处理。衍射数据来自于晶体生长条件为：20％ PEG 3350，0.2M硫酸钠，pH 6.6的S-B8/RBD复合物；和20％异丙醇，20％ PEG 4000，0.1M柠檬酸pH 5.6的S-E6/RBD复合物。对于PDB 7JMW的RBD和Fab，使用PHASER和MR模型通过分子置换(MR)来解析X射线结构。分别在COOT和PHENIX中进行迭代模型构建和优化。利用PISA程序，以包埋表面积/>
Figure BDA0003972809200000222
为标准，鉴定表位和互补位残基及其相互作用。
数据分析和统计
结果以平均数±标准差(SD)表示，除非另有说明。数据分析采用Origin Pro 2019统计软件或Graph Pad Prism软件进行单因素方差分析(ANOVA)。假设P值<0.05时具有显著性。
结果
抗SARS-CoV-2刺突RBD的抗体筛选
该实施例构建并过表达了SARS-CoV-2刺突RBD(S-RBD)连接到带有凝血酶消化位点的人Fc(hFc)。亲和纯化后，重组SARS-CoV-2S-RBD被生物素化，固定在链霉亲和素包被的磁珠上，并在含有1011个成员的组合scFv抗体噬菌体库中淘选，该库由50名健康供体的外周血单核细胞(PBMC)生成。
在前两轮中，使用pH 2.2的甘氨酸-盐酸溶液洗脱与S-RBD结合的抗体展示噬菌体。为了富集与hACE2竞争的抗体，在第三轮种使用“功能导向富集”策略，其中重组hACE2-ECD蛋白用于洗脱S-RBD结合的噬菌体(图1的a)。经过三轮淘选，S-RBD特异性抗体被富集(图1的b)，筛选到22个与S-RBD-hFc特异性结合的特殊抗体(图1的c)。该文库的下一代测序显示，当与IMGT(国际免疫遗传学)数据库比对时，92％的人重链IGHV和89％的轻链(IGLV和IGKV)种系被覆盖，从而能够筛选由不同种系编码的抗体。值得注意的是，通过分析文库中(209,000个IGHV序列，93,000个IGKV序列和87,000个IGLV序列)的约400,000个序列，随机挑选的抗体显示出低SHM水平，正如对天然库所预期，IGHV、IGKV和IGLV分别有超过70％、61％和80％的序列具有不超过3个氨基酸的突变。
选定的抗S-RBD抗体保持与全长刺突的结合
scFv抗体通过克隆到人IgG4e1(S228P)载体中转化为全长单克隆抗体(mAb)。HEK293F细胞被用于表达分泌到培养上清液中的组合抗体。三种表现最好的抗体S-B8、S-D4和S-E6被纯化至均一，产量分别为8.1、9.6和17mg/L，而S-RBD-hFc(IgG1)的产量为58mg/L。为了表征抗S-RBD抗体与全长刺突之间的相互作用，HEK293T细胞被SARS-CoV-2刺突-P2A-EGFP或SARS刺突-P2A-EGFP瞬时转染。流式细胞术(FACS)显示，全部的三株全长IgG4型抗体均保留了它们与全长SARS-CoV-2刺突结合的能力，与其他HcoV刺突，包括SARS-CoV(图2的b)、HCoV-229E(图2的c)、HCoV-HKU1(图2的d)、HCoV-NL63(图2的e)、HCoV-OC43(图2的f)、MERS-CoV(图2的g)或与未转染细胞(图2的h)均无交叉反应。
相关的抗体序列如下表所示。
表1A.S-B8抗体
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表1E.S-D9抗体
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表1F.三聚体化结构域
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抗体与hACE2-ECD竞争结合SARS-CoV-2S-RBD
为了评估mAbs的中和潜力，本实施例通过ELISA考察了它们与ACE2-ECD竞争结合S-RBD的能力。S-B8、S-D4和S-E6均与hACE2-ECD呈剂量依赖性强竞争作用，IC50值分别为12.9±1.5nM、7.1±0.4nM和12.2±0.7nM(图3的a)。还观察到S-E6与S-B8或S-D4竞争结合S-RBD，表明三种抗体之间存在表位重叠。然后用生物膜干涉技术测定这些抗体的动力学参数，结合率(kon)、解离率(koff)和解离常数(KD)(图3的b-d和h)。
S-B8、S-D4和S-E6展示出的KD值分别为170pM、120pM和110pM，其中，S-D4展现出解离率大幅下降(图3的c和h)。与野生型刺突RBD相比，在英国变异株B.1.1.7中观察到的三种抗体与N501Y突变体S-RBD的结合亲和力与S-B8、S-D4和S-E6分别为130pM、97pM和210pM的KD值相似(图3的e-h)。然而，所有三种抗体的结合能力都受到RBD中E484K突变的极大影响，该突变最初出现在南非变异株B.1.351和巴西变异株P.1中，表现为显著降低与E484K+N501Y RBD的结合信号。对于S-B8，其与K417N+E484K+N501Y RBD的结合略强于与E484K+N501Y RBD的结合，而S-D4和S-E6展现出与K417N+E484K+N501Y RBD类似的弱结合。
本实施例然后测试了临床上与更严重的疾病和更长的住院时间相关的SARS-CoV-2刺突蛋白的天然突变体，也通过FACS试验测试了B.1.1.7和B.1.351等循环变异株中刺突蛋白的关键氨基酸突变。三个突变的刺突蛋白(图7的a-c)，即D215H(mut 1)、S247R(mut 2)和D614G(mut 3)，在需要在重症监护病房(ICU)治疗的患者中发现，刺突突变N439K+D614G(mut 4，图7的d)，其在水貂中发现，B.1.1.7刺突(图7的e)，关键突变N501Y+D614G(mut 5，图7的f)，其为快速传播的变异株中增强RBD与hACE2亲和力的关键突变，E484K+N501Y+D614G(mut 6，图7的g)在B.1.351和P.1毒株中发现，B.1.351毒株中的K417N+E484K+N501Y+D614G(mut7，图7的h)和K417N+N501Y+D614G(mut 8，图7的i)，均在FACS展示为阳性结合至S-B8、S-D4和S-E6。这些数据表明，抗体对这些从严重感染患者和被关注的循环变异株中分离出的天然SARS-CoV-2变异株具有治疗潜力。
通过分析每个抗体对所有突变体的平均荧光强度(MFI)(图7的j)，本实施例发现S-B8与mut 6(到mut 3的18％，图7的g)和mut7(到mut3的14.7％，图7的h)的结合显著降低。同样，检测到的S-D4与mut 6和mut 7结合分别下降到mut 3的33.2％和35.6％(图7的j)。然而，S-E6对mut 6和mut 7的MFI与mut 3(图7的j)相似，这与BLI数据不同，表明该抗体在细胞上表达的刺突与在S-RBD上的刺突存在一定差异。
SARS-CoV-2刺突和hACE2诱导的细胞-细胞融合抑制
SARS-CoV-2刺突的S2亚基介导hACE2表达细胞的膜融合，对病毒感染至关重要。hACE2与SARS-CoV-2的结合强于与SARS-CoV刺突的结合(KD分别为4.7nM和32nM)。为了检测这些抗体是否可以抑制刺突介导的细胞膜融合，本实施例建立细胞-细胞融合试验，以过表达hACE2的Vero细胞作为靶细胞，以SARS-CoV-2刺突-P2A-EGFP瞬时转染的HEK293F细胞作为效应细胞，并以SARS-CoV刺突-P2A-EGFP细胞作为阴性对照。
将表达刺突的HEK293F细胞与10nM或1nM S-B8、S-D4或S-E6混合后，加入Vero细胞，并于6小时后观察合胞体形成。SARS-CoV-2刺突诱导了明显的细胞-细胞融合，表现为形成更大的EGFP阳性细胞，而SARS-CoV刺突几乎不诱导合胞体的形成(图4的a)。所有三种抗体在10nM和1nM均能抑制SARS-CoV-2的细胞-细胞融合，其中，10nM的抑制更显著有效(图4的b、c和f)。在10nM时，S-D4和S-E6展现出超过80％的细胞-细胞融合抑制，略高于重组S-RBD；1nM和10nM的S-D4和S-E6也比S-B8更有效(图4的d和e)。
SARS-CoV-2假病毒和真病毒的抑制
为了测试对SARS-CoV-2病毒的中和作用，本实施例首先评估了假病毒(PSV)感染试验中的抗体。假病毒颗粒与S-B8、S-D4(200nM至200fM)和S-E6(200nM到6.3fM)预孵育后感染HEK293T/hACE2细胞。转染后60小时测定感染引起的荧光素酶活性。所有三种抗体均显示出对野生型SARS-CoV-2PSV感染的有效中和作用，且呈剂量依赖性。在HillSlopes接近1.0的1:1相互作用模型中，S-B8、S-D4和S-E6在假病毒中和测定中的NT50值分别为2.2±0.2nM、0.48±0.03nM和0.025±0.002nM(图5的b)。
本实施例接下来测试了真SARS-CoV-2病毒[BetaCoV/Australia/VIC01/2020；GenBank MT007544.1(Victoria/01/2020)，B VIC01]的抗体中和作用。感染后20小时，细胞内的病毒被可视化并定量为百分比感染率。所有三种抗体均能完全阻断真病毒BVIC01的感染(图5的c)，S-B8、S-D4和S-E6的NT50值分别为0.88±0.14nM、2.04±0.31nM和0.15±0.06nM(图5的d)。
由于B.1.1.7毒株(英国变异株)的RBD中N501Y突变的出现，本实施例也检测了这三种抗体对SARS-CoV-2刺突N501Y+D614G假病毒的中和能力。所有三种抗体看起来均显示出比对野生型PSV更好的中和效果。在HillSlope接近1.0的1:1相互作用模型中(图5的f)，测定S-B8、S-D4和S-E6对N501Y+D614G刺突假病毒中和的NT50值分别为0.53±0.09nM、0.042±0.008nM和0.021±0.003nM(图5的e)。对真SARS-CoV-2英国变异株(B.1.1.7)病毒的试验表明，所有三种抗体均保持中和能力(图5的g)，S-B8、S-D4和S-E6的NT50值分别为2.16±0.28nM、1.88±0.20nM和1.15±0.14nM(图5的h)。与它们中和野生型SARS-CoV-2真病毒的能力相比，S-B8和S-E6中和B.1.1.7变异株的能力分别下降了约2.4倍和7.6倍。然而，S-D4显示出稍好的效力。
从它们对E484K和E484K+K417N变异株的结合亲和力降低可以预期的是，在对E484K+K417N+N501Y刺突突变体假病毒测试时，所有三种抗体表现出显著下降的中和能力。200nM的抗体浓度仍不足以完全阻断PSV感染。在对真B.1.351变异株测试时，所有三种抗体都被观察到中和能力的类似下降。然而，S-D4在高浓度(>50nM)对B.1.351变异株表现出弱中和作用。
S-B8和S-E6结合RBD并在空间上阻断ACE2结合
为了阐明S-B8和S-E6对SARS-CoV-2S-RBD的分子识别，测定了Fab+RBD复合物的X-射线结构，分别为2.25和
Figure BDA0003972809200000382
(表2)。Fab S-B8和S-E6以不同的接近角度结合至受体结合位点(RBS)(图6的a)，在空间上与ACE2竞争结合RBD，与竞争实验一致(图3的a)。S-B8主要利用它的重链相互作用，其贡献了73％的包埋表面积(BSA，/>
Figure BDA0003972809200000383
的737)(图6的b)和16个极性接触中的12个(表3)。S-E6主要使用它的轻链，其贡献了63％的BSA(/>
Figure BDA0003972809200000384
的530)和19个极性接触中的16个(表3)。轻链主导的相互作用在抗体中较不常见。
表2.晶体数据收集与精修统计
Figure BDA0003972809200000381
Figure BDA0003972809200000391
a括号中的数字是指最高分辨率的外壳。
bRsym＝ΣhklΣi|Ihkl,i-<Ihkl>|/ΣhklΣiIhkl,iandRpim＝Σhkl(1/(n-1))1/2Σi|Ihkl,i-<Ihkl>|/ΣhklΣiIhkl,i，其中，Ihkl,i为h、k、l反射的第i次测量的缩放强度，<Ihkl>为该反射的平均强度，n为冗余度。
cCC1/2＝两个随机半数据集之间的Pearson相关系数。
dRcryst＝Σhkl|Fo-Fc|/Σhkl|Fo|x100，其中，Fo和Fc分别为观测和计算的结构系数。
eRfree的计算与Rcryst相同，但在包含5％排除在细化之外的数据的测试集上。
表3.在抗体-RBD接触面确定的氢键和盐桥*
Figure BDA0003972809200000392
/>
Figure BDA0003972809200000401
*体细胞超突变残基以黄色高亮显示。
IgBLAST分析表明S-B8来源于IGHV3-66，这是一种与IGHV3-53高度相似的种系。然而，在S-B8中，CDRH1中的32NY33突变为32SH33，CDRH2中的53SCGS56(COVA2-39中的53TGGT56)突变为53GDGN56。有趣的是，S-B8的CDRH1和CDRH2以及FRH1仍然结合至SARS-CoV-2S-RBD上与结合模式B相似的区域(图6的b)。S-B8中的32SH33为I型beta-转弯的一部分(图6的c)。VH S32侧链氢键与RBD Q493和VH T28羰基氧成键。VH H33咪唑与RBD E484形成盐桥，并与Y489形成π-π相互作用。CDRH2中的VH 53GD54骨架也与E484形成两个氢键，VH T28和L31与Q493和S494形成四个氢键(图6的c，表3)。S-RBD脊区的F486包埋在重链和轻链之间的疏水口袋(VHW47、VH I50、VL Y91、VL L94和VL L96)中，而RBD脊上的485GF486和476GS477通过π-π相互作用与VH Y52和VL Y27d相互作用(图6的d)。
S-E6与SARS-CoV-2S-RBD相互作用
S-E6为Ighv4-31抗体。有趣的是，SHM在与IGHV3-53/3-66抗体中CDRH1的32NY33基序相似的位置引入了33NY34序列，但相比于IGHV3-53结合模式A中的32NY33该序列与相同的RBD位点相互作用，但取向不同。然而，VH N33仍与RBD A475羰基形成氢键(图6的e)，与IGHV3-53的VH N32在结合模型A中一样(图6的f)。VH Y34和VH A97与S-RBD的N487形成两个氢键(图6的e)，不同于IGHV3-53抗体中的Y33(图6的f)。F486与N487一起与S-E6的VH Y34、A97、H101和I102形成的疏水口袋相互作用，并生成π-π和阳离子-π相互作用(图6的e)。然而，S-E6轻链贡献了大部分与RBD的包埋表面。CDRL2 50FDYR53通过多个极性(8个氢键和3个盐桥)与E484、F490、L492、Q493和S494(图6的g，表3)的相互作用与受体结合基序(RBM)相互作用。此外，VL F50与附近由L455、F456和Y489形成的疏水补丁相互作用(图6的g)，VL S27、G29、S67和G68在RBS脊的另一侧与R403、N501和Y505形成5个氢键(图6的h，表3)。然而，第501位残基位于S-E6表位位点的边缘，具有能容纳该位点酪氨酸突变的空间(图6的h)。N501Y+D614G假病毒的中和活性表明，第501位残基在S-E6的结合位点并不关键，因为在野生型病毒和突变病毒之间没有观察到中和效力的显著变化(图5的e和f)。
SHM残基与RBD形成特异性相互作用
从COVID-19患者中分离出的大多数RBD靶向的中和抗体具有最少的SHM，尽管一些在感染数月后从记忆B细胞表达的抗体具有增加的SHM。本研究中来源于组合抗体库的抗体是高度突变的。S-B8和S-E6分别包含13个和22个SHM残基，其中有一些位于抗体副表位(图6)，包括S-B8中的VH 31LSH33、VH 50IT51、VH 53GD54、VH N56、VH D58和VL L94，以及S-E6中的VHN33、VL V39、VL 50FDYR53和65TR66(图6的c-g)。综上，一些SHM残基似乎对与SARS-CoV-2RBD相互作用至关重要。与SHM残基的相互作用似乎主要与S-B8中的重链或S-E6中的轻链有关。
抗体自身反应性
为了研究三种抗体的来源，进行了HEp-2自身反应性试验。S-D4和S-E6在试验中均未显示阳性信号，表明它们并非来源于自身免疫应答，而S-B8展现出弱至中等的自身反应性。本实施例进一步通过将S-B8重链中的所有SHM突变回天然的IGHV3-66序列，产生了一个S-B8假定的种系抗体。突变的抗体显示出比S-B8更强的自身反应性，并且高达12.5nM都未与S-RBD结合。
三种抗体的抗体依赖性增强(ADE)活性评估
ADE在病毒感染过程中通过两种不同的机制发生，一种是通过表达在单核细胞和巨噬细胞上的FcγRIIa介导的增强感染，另一种是通过过度Fc介导的效应功能和免疫复合物形成引起的增强免疫激活。在这些抗体构建体中，本实施例采用了一种工程化的IgG4e1(S228P)形式来降低对Fcγ受体(FcγRs)的亲和力。三种抗体的ADE效应是在表达不同水平FcγR的三种细胞系中被评估。qPCR结果显示，THP-1、K562和Raji分别高表达FcγIA和IIA，高表达FcγIIA，以及低表达FcγIIB和IIIA。用不同浓度的S-B8、S-D4和S-E6与SARS-CoV-2假病毒混合物处理Raji、K562和THP-1细胞，均未显示明显的ADE效应。
本实施例发现了三种有效的中和抗体。有趣的是，它们不与SARS-CoV刺突蛋白发生交叉反应(图2的b)，这可能是由于这些抗体靶向的SARS-CoV和SAR-CoV-2之间的受体结合位点的表位存在差异(约70％差异)。此外，这三种抗体均未与其他五种HCoV结合(图2的c-g)。而且，HEp-2细胞的自身反应性试验排除了S-E6和S-D4来源于自身免疫应答，而S-B8表现出弱到中等的自身反应性，这在S-B8假定的种系抗体中有增加。
对S-E6和S-B8的结构研究揭示了这些组合抗体的一些显著特征。病毒感染的初次免疫应答后跟随的是产生功能更好的抗体的二次应答，其中，结合能可以通过体细胞超突变来改进。二次免疫应答是为了以后遇到相同的抗原，也是疫苗的基础。在大流行的情况下，如SARS-CoV-2、禽流感或埃博拉病毒，如果感染在最初几天没有被免疫系统处理，患者有很高的死亡概率，因此，免疫系统将没有足够的时间来完善免疫反应。与之一致的是，从SARS-CoV-2恢复期患者体内分离到的中和抗体仅含有少数氨基酸突变，这可能是由于病毒快速清除导致B细胞弱刺激的结果。从感染不久的恢复期患者体内分离的中和抗体可能尚未完全改进(成熟)。然而，最近的一项研究表明，在一些COVID-19患者感染后几个月，SHM水平较高。
相比之下，S-B8和S-E6表现出更高水平的SHM，其中许多SHM与SARS-CoV-2RBD(S-RBD)的特异性相互作用有关。S-B8中13个SHM残基中的9个和S-E6中22个SHM残基中的8个位于抗体-抗原界面。虽然这些SHM残基中的一些只使用它们的肽骨架，但其他残基依赖于特定的侧链与S-RBD结合(图6的c、d、e和g)。有趣的是，S-E6的CDRH1中的SHM产生一个33NY34序列，该序列与IGHV3-53/3-66抗体中的32NY33基序相似，后者是靶向S-RBD的最常见的种系，表明组合抗体库和成熟过程可以产生替代的抗体溶液。然而，尚不清楚这些SHM残基是如何被特异性地扩增到SARS-CoV-2S-RBD的，因为该文库是在SARS-CoV-2大流行之前产生的。
值得注意的是，在筛选实验中，重链和轻链是随机配对的。然而，S-E6是一种轻链优势抗体，重链中的大部分SHM残基不参与与SARS-CoV-2RBD的相互作用。因此，这些发现提出了关于引发S-B8和S-E6的原始抗原的有趣的问题，至少是引发与SARS-CoV-2RBD主要结合的重链或轻链的问题。
实施例2新突变体测试
进行了以下试验以测试新突变体的抗体。
生物膜干涉法(BLI)测定N501Y RBD的亲和力
使用AR2G生物传感器，在Octet RED96(Molecular Devices LLC，圣何塞，加州，美国)上通过BLI检测S-D4与SARS-CoV-2N501Y S-RBD的结合亲和力。N501Y S-RBD稀释在含有0.02％ Tween-20和0.05％ BSA的PBS溶液(PBST-B)(10μg/mL)中，通过胺偶联加载到AR2G生物传感器上。将AR2G-N501Y S-RBD传感器浸入PBST-B中60秒以建立基线，然后与2倍梯度稀释的S-D4抗体溶液孵育，记录结合的渐进曲线。最后，将传感器在PBST-B缓冲液中孵育，记录解离的渐进曲线。对于S-B8和S-E6的检测，S-RBD被生物素化后，加载到链霉亲和素(SA)传感器，其余步骤与S-D4的步骤相同。用ForteBio Data Analysis软件分析结果。
通过生物膜干涉法(BLI)测量N501Y S-RBD的结合动力学。将生物素化的N501YS-RBD加载到SA生物传感器上，用于检测与S-B8(图8的A)和S-E6(图8的C)的结合动力学，而偶联在AR2G传感器上的N501Y S-RBD胺被用于S-D4(图8的B)，在Octet上进行检测。所有曲线使用数据分析软件(Forte Bio)以1:1结合模型拟合。三种竞争性抗体与N501Y S-RBD的结合率(kon)、解离率(koff)和解离常数(KD)如图8的D所示。所有三种抗体均展现出与N501Y S-RBD有效的结合亲和力。
SARS-CoV-2N501Y假病毒的中和
首先制备SARS-CoV-2N501Y+D614G冠状病毒假病毒(PSV)，然后将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔的密度接种到96孔白色底板中，培养过夜。将PSV与等体积不同浓度的选定抗体(稀释倍数：3.16，S-D4和S-E6从200nM到20fM，S-B8从200nM到0.6pM)在DMEM中37℃预孵育30分钟。以不含抗体的DMEM加入或不加入PSV作为对照。孵育后，将PSV混合物转移至含有HEK293T/hACE2细胞的培养板中。处理16小时后，将含有PSV和抗体的DMEM培养基更换为新鲜培养基，继续孵育48小时。使用Bright-LumiTM萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(Beyotime，RG015M)通过荧光素酶活性评估PSV感染效果。每孔加入50μL荧光素酶底物，在Envision酶标仪(PerkinElmer，Ensight)上测量相对发光单位(RLU)值。
测定并拟合三种hACE2竞争性抗体对SARS-CoV-2N501Y+D614G突变假病毒的中和能力，NT50和HillSlope显示在图9的下图。所有三种抗体均表现出优异的中和能力。真B.1.1.7SARS-CoV-2病毒中和试验
根据商定的实践规范、风险评估(根据ACDP)和标准操作程序，这项研究是在HSE许可下在牛津大学的CL3设施中进行的。简而言之，这种快速、高通量的试验确定了在Vero细胞中减少了50％不同的真SARS-CoV-2毒株感染聚焦形成单位的抗体浓度，如下所示。在与Vero细胞孵育前，将固定剂量的SARS-CoV-2(B.1.1.7变异株)与四倍稀释的0.5log10梯度稀释的抗体(从316nM到31pM分9档)预孵育。含1.5％羧甲基纤维素的覆盖层被用来防止卫星聚焦形成。感染后20小时，用4％多聚甲醛固定该单层，用2％Triton X-100渗透化处理并用mAb EY 2A染色N抗原。过氧化物酶偶联的抗体和True Blue过氧化物酶底物培养后，用ELISPOT读取器计数感染灶。用四参数逻辑回归(Hill方程)在GraphPad Prism 8.3中分析数据。
测定并拟合了三种hACE2竞争性抗体对B.1.1.7毒株的真病毒的中和能力，NT50和HillSlope显示在图10的下图。所有三种抗体均表现出优异的中和能力。
S-D4抗体对SARS-CoV-2K417N+E484K+N501Y假病毒的中和
首先制备SARS-CoV-2K417N+E484K+N501Y+D614G冠状病毒假病毒(PSV)，然后将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔的密度接种到96孔白色底板中，培养过夜。将PSV与等体积不同浓度的S-D4(稀释倍数：3.16，从200nM到0.6fM)在DMEM中37℃预孵育30分钟。以不含抗体的DMEM加入或不加入PSV作为对照。孵育后，将PSV混合物转移至含有HEK293T/hACE2细胞的培养板中。处理16小时后，将含有PSV和抗体的DMEM培养基更换为新鲜培养基，继续孵育48小时。使用Bright-LumiTM萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(Beyotime，RG015M)通过荧光素酶活性评估PSV感染效果。每孔加入55μL荧光素酶底物，在Envision酶标仪(PerkinElmer，Ensight)上测量相对发光单位(RLU)值。
测定并拟合了S-D4抗体对SARS-CoV-2K417N+E484K+N501Y+D614G突变假病毒的中和能力，NT50和HillSlope显示在图11的下图。S-D4表现出优异的中和能力。真B.1.351SARS-CoV-2病毒中和试验
根据商定的实践规范、风险评估(根据ACDP)和标准操作程序，这项研究是在HSE许可下在牛津大学的CL3设施中进行的。简而言之，这种快速、高通量的试验确定了在Vero细胞中减少了50％ B.1.351真SARS-CoV-2毒株感染聚焦形成单位的抗体浓度，如下所示。在与Vero细胞孵育前，将固定剂量的SARS-CoV-2(B.1.351变异株)与四倍稀释的0.5log10梯度稀释的抗体(从316nM到31pM分9档)预孵育。含1.5％羧甲基纤维素的覆盖层被用来防止卫星聚焦形成。感染后20小时，用4％多聚甲醛固定该单层，用2％Triton X-100渗透化处理并用mAb EY 2A染色N抗原。过氧化物酶偶联的抗体和True Blue过氧化物酶底物培养后，用ELISPOT读取器计数感染灶。用四参数逻辑回归(Hill方程)在GraphPad Prism 8.3中分析数据。
测定并拟合了S-D4抗体对B.1.351毒株的真病毒的中和能力，NT50和HillSlope显示在图12的下图，表明了S-D4出色的中和能力。
实施例3.SARS-CoV-2RBD靶向抗体的三聚体形式恢复了对免疫逃逸突变体的超强中和能力
本实施例开发了一种三聚体形式的抗刺突RBD抗体。与单体和二聚体形式相比，三聚体形式显著增加了与刺突RBD的结合亲和力，令人惊讶的是，NT50为36pM时，它有效中和了免疫逃逸毒株B.1.351(beta)，NT50为7pM时，完全中和了B.1.617.2(delta)毒株。通过将这种三聚体形式的工程方法应用于其他RMB靶向抗体，它们也获得了显著的中和效果。NT50值提高了30倍。
材料与方法
细胞培养
FreeStyleTM 293F(HEK293F，Thermo Fisher Scientific)细胞系在Freestyle293表达培养基(ThermoFisher Scientific)中培养。HEK293T/hACE2稳定细胞系在含10％(v/v)胎牛血清(FBS)(Gemini)的高葡萄糖Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)(Gibco)中培养，并加入10μg/mL嘌呤霉素。
重组多价抗体的生产与纯化
对于多价抗体工程，以S-E6为例，我们通过将T4噬菌体纤维蛋白三聚体基序(T4F)、GCN4三聚体螺旋或TSE标签分别融合到S-E6 Fab重链的C端来构建S-E6的三聚体抗体。为了将三聚体化标签与抗体融合，尝试了不同的连接子，包括不同长度的刚性连接子(EAAAK，SEQ ID NO:105)。
针对单体和三聚体抗体，将S-E6重链的Fab结构域的编码序列克隆到C端带有6×His标签的表达载体中。将过表达各重组蛋白的HEK293F培养4天。从上清液中收获重组蛋白。离心后使用HisTrap Excel HP柱(GE Healthcare)和HiTrap Protein A HP柱(GEHealthcare)分别纯化His标签(单体和三聚体抗体)和hFc-tag蛋白(二聚体抗体)。操作步骤按照制造商的说明。简而言之，对于His标签蛋白，将上清液加载到HisTrap柱后，用结合缓冲液(500mM氯化钠，20mM磷酸钠，20mM咪唑，pH 7.4)清洗柱子，并用含500mM咪唑的PBS缓冲液洗脱。对于hFc-tag抗体，洗脱后，使用截断分子量为30kDa的Ultracel膜(MerckMillipore)将重组抗体缓冲液交换并浓缩到PBS缓冲液(150mM氯化钠，20mM磷酸钠，pH7.2)中，-80℃保存备用。
尺寸排阻-高效液相色谱法(SEC-HPLC)
20μL 0.5μg/μL纯化的抗体被应用到Agilent Bio SEC-5，500AHPCL系统。流动相为PBS缓冲液(pH 7.2)，流速为0.35mL/分钟。通过保留时间和曲线下面积(AUC)对吸光度进行分析和整合，以确定聚集物、单体和降解物组分的百分比。信号是通过监控A280。使用GraphPad Prism软件进行数据处理。
生物膜干涉法(BLI)测定亲和力
在Octet RED96系统(Molecular Devices LLC，圣何塞，加州，美国)上通过BLI检测多价抗体与SARS-CoV-2野生型或突变S-RBD的结合亲和力。简而言之，生物素偶联的S-RBD或突变S-RBD稀释到含有0.02％ Tween-20和0.05％ BSA的PBS溶液(PBST-B)(10μg/mL)，被SA包被的生物传感器(ForteBio)捕获。基线在运行缓冲液(PBST-B)中记录60秒，然后传感器在含有2倍梯度稀释的抗体溶液的孔中，记录300秒的结合阶段的渐进曲线。在解离步骤，传感器在PBST-B缓冲液中孵育600秒以记录解离的渐进曲线。基于1:1Langmuir结合模型的拟合，从所有结合曲线计算kon、koff和kD的平均值。
SARS-CoV-2野生型和突变型假病毒的生产
使用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen)将WT或突变型刺突Δ19质粒和NL4-3mcherry荧光素酶质粒(addgene)共转染HEK293T细胞产生假病毒。转染后48小时收获包含病毒的上清液，经0.45μm滤膜过滤后，与Lenti-X浓缩剂(Takara)混合，4℃过夜，然后1500g离心45分钟去除上清液。收集沉淀并储存在-80℃备用。
基于假病毒的中和试验
在96孔白色底板中每孔接种1×104个HEK293T/hACE2细胞。次日，抗体进行3.16倍梯度稀释。将等体积的不同浓度的抗体与野生型或突变型PSV混合。37℃孵育30分钟后，将混合物加入96孔板。37℃培养16小时后，用新鲜培养基更换接种物，细胞继续孵育48小时。使用Bright-LumiTM萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(beyotime，RG015M)通过荧光素酶活性评估PSV感染效果。采用GraphPad Prism软件中的“log(抑制剂)vs.响应(response)”方程计算NT50值。
结果
三聚体S-E6表现出比完整IgG形式更强的中和能力
研究表明，RBS靶向抗体对包含刺突突变体的E484K的结合和中和显著降低。我们的计算模拟表明，一个三聚体抗体可以同时与刺突中的三个单体结合，即一个三聚体蛋白(图1的A)。因此，三聚体抗体被认为对免疫逃逸突变体具有更高的结合亲和力和更好的中和效力。
在此，我们使用S-E6作为优化系统的示例。为了证明这个概念，S-E6首先被工程化为三聚体形式，通过将CH1结构域与带有(G4S)3连接子的三聚体化标签T4F融合(图13的G)。SDS-PAGE分析和SEC-HPLC结果均表明，三聚体S-E6被良好地组装，且显示均匀分布(图13的B和C)。结果显示，三聚体S-E6(NT50＝0.0016±0.001nM)比二聚体(NT50＝0.036±0.004nM)和单体(NT50＝1.3±0.4nM)S-E6能更有效地的中和SARS-CoV-2野生型假病毒(WT-SPV)(图13的D)。这些结果表明，三聚体-Fab形式抗体确实比常规的IgG形式具有更好的中和效力。
为了优化三聚体形式，我们首先比较了三个三聚体结构域的三聚体化效率，包括T4噬菌体纤维蛋白三聚体基序(T4F)、GCN4三聚体亮氨酸拉链基序(GCN4)和人胶原蛋白XVIII来源的同源三聚体结构域(TIE)。所有的三聚体蛋白在SDS-PAGE显示均得到纯蛋白，但GCN4标签的抗体在HPLC-SEC分离中出现了两个峰，表明组成不均匀。
表4.相关序列
Figure BDA0003972809200000471
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Figure BDA0003972809200000481
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Figure BDA0003972809200000491
/>
Figure BDA0003972809200000501
我们进一步分析了这些三聚体的中和能力。T4F融合抗体显示出最佳的中和效力(T4F，NT50＝0.0016±0.001nM；TSE，NT50＝0.0066±0.001nM；GCN4，NT50＝0.0073±0.001nM)(图13的E)。为了比较不同连接子的效果，将柔性GS连接子替换为不同长度的刚性连接子(EAAAK的1-5重复；SEQ ID NO:105)。3-和5-重复的刚性连接子介导的三聚体(3刚性，NT50＝0.038±0.002nM；5刚性，NT50＝0.20±0.035nM)显示出相似或降低的中和能力，而三聚体-1刚性S-E6表现出适度的改善(NT50＝0.026±0.002nM)(图13的F)。因此，我们在后续实验中将CH1结构域与带有3(G4S)连接子的T4F融合(表5)。
表5.nAbs的中和参数
Figure BDA0003972809200000502
Figure BDA0003972809200000511
三聚体S-E6通过增强与S-RBD的结合亲和力恢复了对B.1.351(Beta毒株)PSV的中和效力
结合是中和作用的基本物理力，因此，我们测定了抗体-RBD的结合参数。通过生物膜干涉技术测定二聚体/三聚体S-E6与野生型S-RBD和B.1.351S-RBD的结合率(kon)、解离率(koff)和解离常数(KD)的动力学参数(图14的A和B)。二聚体和三聚体S-E6对WT S-RBD的KD值分别为83.6pM和10.1pM，三聚体S-E6显示出提高的结合率(图14的E)。同样，三聚体S-E6与B.1.351S-RBD的结合亲和力也高于二聚体S-E6，对WT S-RBD和B.1.351S-RBD的KD值分别为1.58nM和0.58nM(图14的C、D和E)。结合亲和力的提高表明三聚体S-E6对中和B.1.351变异株更具有活性。
为了测试nAbs的三聚体形式能否恢复对免疫逃逸变异株的中和效力，我们首先测试了三聚体S-E6对B.1.351PSV的中和作用。实验设计与图13中的WT SARS-CoV-2PSV相似，测试了编码S-E6的不同价/三聚体化标签/连接子用于中和B.1.351PSV。如图15所示，三聚体S-E6确实显示出比二聚体和单体抗体显著增强的效力，而最佳的修饰也是具有3(G4S)连接子的T4F标签的构建体(表5)。三聚体S-E6表现出NT50为0.036±0.022nM，与天然形式的S-E6(IgG)对WT SARS-CoV-2PSV(NT50＝0.036±0.004nM，图13的D，表5)的效力相当。这表明，将IgG形式nAb工程化为三聚体-Fab形式，恢复了其对免疫逃逸变异株B.1.351的中和效力。
第一类三聚体nAbs恢复了对B.1.351(Beta毒株)PSV的中和效力
由于成功恢复了S-E6对B.1.351的中和作用，我们进一步研究了三聚体重构是否适用于其他靶向nAbs的S-RBD。第一类nAbs为ACE2竞争性抗体，其结合在刺突的RBM，且其中一些表现出对B.1.351的结合效力下降。我们使用融合有三重(G4S)连接子的T4F标签作为三聚体形式，这是通过S-E6确认的最有效的三聚体形式。我们选取了一些属于顶端富集的IGHV种系的第一类nAbs进行三聚体修饰，包括S-B2(IGHV3-30)、S-D9(IGHV5-51)、S-D4(IGHV3-33)和S-B8(IGHV3-66)(图16的A-D)。此外，一个第二类nAb，S309也被工程化(图16的E)。靶向AbCoV2-2489的NTD被挑选作为第三类nAb的实例(图16的F)。
三聚体形式的第一类抗体比它们相应的IgG4形式展现出提高的中和效力，如S-B8、S-D4分别将NT50提高了3.5倍和6.5倍。作为保守位点靶向的抗体，第二类抗体S309-IgG4和第三类抗体CoV2-2489-IgG4可中和B.1.351PSV，NT50分别为0.36±0.08nM和0.35±0.04nM。所有的NT50值在三聚体化后倍数增长，来自第一类的抗体增加了30.5倍(图16的G)。对于S-B2抗体，即使在100nM，其二聚体形式也没有显示出对B.1.351PSV的中和作用，但其三聚体形式抑制了PSV感染，对B.1.351PSV的NT50为0.1nM。
有趣的是，虽然在二聚体和三聚体之间观察到了相似的NT50，但对第二类和第三类抗体的三聚化工程削弱了中和效果，表现为最大浓度(200nM)下的抑制率下降。S309在200nM时抑制率从76％下降至55％，抑制能力降低了28％，而CoV2-2489在200nM时抑制率从95％下降至64％，抑制能力降低了32％(表6和图16的G)。但三聚体第一类抗体在200nM时的抑制率与二聚体抗体相比有提高。
表6.nAbs的中和参数
NT50(B.1.351)(nM) NT50(B.1.617.2)(nM)
S-E6二聚体 0.32±0.22 0.065±0.003
S-E6三聚体 0.036±0.02 0.007±0.003
S-B8二聚体 1.2±0.2 0.37±0.06
S-B8三聚体 0.35±0.07 0.15±0.01
S-D4二聚体 0.66±0.13 0.24±0.03
S-D4三聚体 0.10±0.02 0.14±0.02
S-B2二聚体 >100 0.23±0.02
S-B2三聚体 0.10±0.02 0.067±0.004
S-D9二聚体 ～1.5±3.6 0.24±0.05
S-D9三聚体 0.05±0.01 0.067±0.014
S309二聚体 0.36±0.08 N.A
S309三聚体 0.28±0.13 N.A
CoV2-2489二聚体 0.35±0.04 N.A
CoV2-2489三聚体 0.20±0.07 N.A
三聚体第一类nAbs恢复了对B.1.617.2(Delta毒株)PSV的中和效力
由于B.1.617.2的高传染效率和更多的突破性案例，我们在它的PSV上测试了三聚体抗体的效力。以S-E6为例，三聚体S-E6的中和能力明显高于其IgG形式，NT50值仅高于野生型SARS-CoV-2PSV 4.6倍(图17的A)。在其他第一类抗体上也观察到三聚体形式的中和作用增强(图17的B-E)。对于S-B2、S-B8、S-D4、S-E6和S-D9，提高的中和能力分别为2.5倍、1.5倍、8.5倍、3.5倍和3.5倍(图17的F和表6)。同时，四种抗体对B.1.671.2的中和作用接近完全。
变异株传播更快，导致严重疾病的风险更高。例如，B.1.1.7(alpha)毒株比野生型病毒引发严重疾病的风险高48％，B.1.351(beta)毒株引发严重疾病的风险高24％，危重疾病的风险高49％，以及COVID-19死亡风险高57％。B.1.351(beta)毒株可以逃逸靶向病毒刺突糖蛋白(S)的单克隆抗体。B.1.617完全抵抗巴尼韦单抗(bamlanivimab)的中和作用，部分抵抗Comirnaty/BNT162b2疫苗感染和接种引起的抗体的中和作用。总的来说，该病毒已经发展出一系列的变异株来逃逸nAb的中和作用。因此，研发抗变异株抗体对于变异株感染的治疗和预防至关重要。本实施例中，我们提出了一种将nAbs工程化为三聚体形式的策略。通过将带有3(G4S)的T4F融合到CH1结构域的C端，我们发现了一种高效的三聚体形式。三聚体抗体显著增加了对刺突蛋白的亲和力。最后，三聚体形式成功地恢复了对免疫逃逸毒株，包括B.1.351和B.1.617.2，的中和能力。
实施例4.SE6蛋白的构象选择
亚油酸可以将SARS-CoV-2刺突蛋白锁定在向下构象。我们使用Octet研究了构象偏好性。
纯化的刺突三聚体蛋白被固定在SA传感器上。将亚油酸(Cat.L8134，Sigma)溶于运行缓冲液中。基线在运行缓冲液(PBST-B)种记录60秒，然后传感器在含有2倍梯度稀释抗体溶液的孔中记录300秒结合阶段的渐进曲线。在解离步骤中，传感器在PBST-B缓冲液中孵育600秒，以记录解离的渐进曲线。与有或没有亚油酸的传感器图进行比较，以获得结合偏好。根据1：1Langmuir结合模型拟合，从所有结合曲线来计算平均kon、koff和kD值。
如图18所示，三聚体S-E6和S-B8优先与向上构象结合。通过含亚油酸(红色)或不含亚油酸(蓝色)的生物膜干涉技术(BLI)，测量三聚体S-E6(图18的A)或三聚体S-B8(图18的B)与野生型(WT)S-RBD的结合动力学，。亚油酸的添加显著降低了抗体与刺突蛋白的结合，表明抗体更倾向于结合向上构象。
本公开的范围不受所描述的具体实施例的限制，这些具体实施例意在作为本公开的各个方面的单独说明，任何在功能上等效的组合或方法都属于本公开的范围。对于本领域技术人员来说是显而易见的，在不偏离本公开的精神或范围的情况下，可以在本公开的方法和组合物中进行各种修改和变化。因此，本公开意在涵盖本公开的修改和变化，只要它们属于所附权利要求及其等效的范围。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入的程度相同。
序列表
<110> 上海科技大学
<120> 抗SARS-CoV-2刺突蛋白的三聚体抗体
<130> 49BD-343780-CN
<160> 126
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Leu Ser
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 3
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 3
caggttcagc tggtacagtc tggaggaggc ttgatccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt ctctcccaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtctcaatt acttatggcg atggtaactc agactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaatactac 300
tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348
<210> 4
<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 4
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaata ttatagtctt 300
cctctcactt tcggcggagg gaccaagctg gagatcaaac gt 342
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 5
Leu Ser His Met Asn
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 6
Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 7
Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 9
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 10
Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 11
Gly Phe Thr Val Ser Leu Ser His
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 12
Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 13
Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 14
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is any amino acid or not present
<400> 15
Trp Ala Ser Xaa
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 16
Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 17
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser
20 25 30
Leu Ser His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
130 135 140
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
180 185 190
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 18
<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 18
atggcacagg ttcagctggt acagtctgga ggaggcttga tccagccggg ggggtccctg 60
agactctcct gtgcagcctc tgggttcacc gtcagtctct cccacatgaa ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggact ggagtgggtc tcaattactt atggcgatgg taactcagac 180
tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 240
tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag gacacggctg tgtattactg tgcgagagaa 300
tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggcggc 360
ggcggctctg gcggaggtgg cagcggcggt ggcggatccg acatcgtgat gacccagtct 420
ccagactccc tggctgtgtc tctgggcgag agggccacca tcaactgcaa gtccagccag 480
agtgttttat acagctccaa caataagaac tacttagctt ggtaccagca gaaaccagga 540
cagcctccta agctgctcat ttactgggca tctacccggg aatccggggt ccctgaccga 600
ttcagtggca gcgggtctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcaggctgaa 660
gatgtggcag tttattactg tcaacaatat tatagtcttc ctctcacttt cggcggaggg 720
accaagctgg agatcaaacg t 741
<210> 19
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Leu Ser
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His
245 250 255
His His His His His
260
<210> 20
<211> 783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 20
caggttcagc tggtacagtc tggaggaggc ttgatccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt ctctcccaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtctcaatt acttatggcg atggtaactc agactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaatactac 300
tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgactgt gccctctagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagccccc gaaatctggc 660
ggtggcggat ccccaggatc aggttatatt cctgaagctc caagagatgg gcaagcttac 720
gttcgtaaag atggcgaatg ggtattactt tctacctttt taggacatca tcatcatcat 780
cac 783
<210> 21
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Leu Ser
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile
225 230 235 240
Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu
245 250 255
Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His His His His His
260 265 270
<210> 22
<211> 813
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 22
caggttcagc tggtacagtc tggaggaggc ttgatccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt ctctcccaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtctcaatt acttatggcg atggtaactc agactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaatactac 300
tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgactgt gccctctagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagccccc gaaatctggt 660
ggaggaggtt ctggaggcgg tggaagtggt ggcggaggta gcccaggatc aggttatatt 720
cctgaagctc caagagatgg gcaagcttac gttcgtaaag atggcgaatg ggtattactt 780
tctacctttt taggacatca tcatcatcat cac 813
<210> 23
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Thr Asp Arg Ser Pro Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Ala Arg Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 24
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Ser Arg Arg Pro Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Val Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 25
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 25
caggtgcagc tgcaggagtc cgggggaggc gtagtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag tgtctggatt cactttcagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtctg aaggaagtac tgaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tctagagaca attccaagga cacgctttat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagaccaggt 300
tatccaacat caaccgaccg ttcaccagca gcagctggtg caaggcaata ctactactac 360
ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 405
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 26
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac cgttaccatc 60
tcctgcaccc gcagcggtgg cagcggggcc gccaactatg tacagtggta ccaacagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tctgatctat gaagatagtc gaagaccccc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccgt cgacacgtcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgcagactg aagacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagtag taatcacgtg 300
gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 27
Asp Tyr Gly Met His
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 28
Val Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 29
Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Thr Asp Arg Ser Pro Ala Ala Ala Gly Ala
1 5 10 15
Arg Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20 25
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 30
Thr Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 31
Glu Asp Ser Arg Arg Pro Pro
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 32
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn His Val Val
1 5 10
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 34
Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Glu
1 5
<210> 35
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 35
Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Thr Asp Arg Ser Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Gly Ala Arg Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20 25
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 36
Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asn Tyr
1 5
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is any amino acid or not present
<400> 37
Glu Asp Ser Xaa
1
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 38
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn His Val Val
1 5 10
<210> 39
<211> 262
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Thr Asp Arg Ser Pro Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Ala Arg Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val
145 150 155 160
Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Ala Ala Asn Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
180 185 190
Ser Ser Pro Thr Thr Leu Ile Tyr Glu Asp Ser Arg Arg Pro Pro Gly
195 200 205
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Val Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala
210 215 220
Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
245 250 255
Lys Leu Thr Val Leu Gly
260
<210> 40
<211> 786
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 40
caggtgcagc tgcaggagtc cgggggaggc gtagtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag tgtctggatt cactttcagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtctg aaggaagtac tgaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tctagagaca attccaagga cacgctttat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagaccaggt 300
tatccaacat caaccgaccg ttcaccagca gcagctggtg caaggcaata ctactactac 360
ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcaggcgg cggcggctct 420
ggcggaggtg gcagcggcgg tggcggatcc aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg 480
tcggagtctc cggggaagac cgttaccatc tcctgcaccc gcagcggtgg cagcggggcc 540
gccaactatg tacagtggta ccaacagcgc ccgggcagtt cccccaccac tctgatctat 600
gaagatagtc gaagaccccc tggggtccct gatcggttct ctggctccgt cgacacgtcc 660
tccaactctg cctccctcac catctctgga ctgcagactg aagacgaggc tgactactac 720
tgtcagtctt atgatagtag taatcacgtg gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc 780
ctaggt 786
<210> 41
<211> 280
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Thr Asp Arg Ser Pro Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Ala Arg Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly
245 250 255
Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe
260 265 270
Leu Gly His His His His His His
275 280
<210> 42
<211> 840
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 42
caggtgcagc tgcaggagtc cgggggaggc gtagtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag tgtctggatt cactttcagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtctg aaggaagtac tgaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tctagagaca attccaagga cacgctttat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagaccaggt 300
tatccaacat caaccgaccg ttcaccagca gcagctggtg caaggcaata ctactactac 360
ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgactgtgcc ctctagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccccgaa atctggcggt 720
ggcggatccc caggatcagg ttatattcct gaagctccaa gagatgggca agcttacgtt 780
cgtaaagatg gcgaatgggt attactttct acctttttag gacatcatca tcatcatcac 840
<210> 43
<211> 290
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Thr Asp Arg Ser Pro Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Ala Arg Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser
245 250 255
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
260 265 270
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His His His
275 280 285
His His
290
<210> 44
<211> 870
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 44
caggtgcagc tgcaggagtc cgggggaggc gtagtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag tgtctggatt cactttcagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtctg aaggaagtac tgaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tctagagaca attccaagga cacgctttat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagaccaggt 300
tatccaacat caaccgaccg ttcaccagca gcagctggtg caaggcaata ctactactac 360
ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgactgtgcc ctctagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccccgaa atctggtgga 720
ggaggttctg gaggcggtgg aagtggtggc ggaggtagcc caggatcagg ttatattcct 780
gaagctccaa gagatgggca agcttacgtt cgtaaagatg gcgaatgggt attactttct 840
acctttttag gacatcatca tcatcatcac 870
<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 45
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 46
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Phe Asp Tyr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Thr Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Trp Val Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 47
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 47
caggtcacct tgagggagtc tggtccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctctctcagc agtgttaatt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtaccaac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtcactgg acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaaac tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgcgaccccc 300
ggagctatta tgggtgctct tcatatctgg ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 48
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 48
caggctgtgc tcactcagcc gtcctcggcg tcctcgaccc ccgggcagag ggtcatcatc 60
tcttgttctg ggagcagctc caatatcggg agtaacactg tcagctggta ccagcaggtc 120
ccaggagcgg cccccaaact cctcatctac tttgattatc gacgtccctc aggggtccct 180
gaccgcttct ctggcaccag gtctggcacc tctgcctccc tgggcatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgcc gcatgggatg acagcctgag tgcttgggtg 300
ttcggcagag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 49
Ser Val Asn Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 50
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 51
Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile
1 5 10
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 52
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 53
Phe Asp Tyr Arg Arg Pro Ser
1 5
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 54
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Trp Val
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 55
Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Asn Tyr Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 56
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 57
Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile
1 5 10
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 58
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr
1 5
<210> 59
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is any amino acid or not present
<400> 59
Phe Asp Tyr Xaa
1
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 60
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Trp Val
1 5 10
<210> 61
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 61
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gln Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro
165 170 175
Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Asp Tyr Arg Arg Pro Ser
180 185 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser
195 200 205
Leu Gly Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Trp Val Phe Gly Arg Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Leu Gly
245
<210> 62
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 62
caggtcacct tgagggagtc tggtccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctctctcagc agtgttaatt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtaccaac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtcactgg acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaaac tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgcgaccccc 300
ggagctatta tgggtgctct tcatatctgg ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca 360
ggcggcggcg gctctggcgg aggtggcagc ggcggtggcg gatcccaggc tgtgctcact 420
cagccgtcct cggcgtcctc gacccccggg cagagggtca tcatctcttg ttctgggagc 480
agctccaata tcgggagtaa cactgtcagc tggtaccagc aggtcccagg agcggccccc 540
aaactcctca tctactttga ttatcgacgt ccctcagggg tccctgaccg cttctctggc 600
accaggtctg gcacctctgc ctccctgggc atcagtgggc tccagtctga ggatgaggct 660
gattattact gtgccgcatg ggatgacagc ctgagtgctt gggtgttcgg cagagggacc 720
aagctgaccg tcctaggt 738
<210> 63
<211> 265
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 63
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp
225 230 235 240
Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr
245 250 255
Phe Leu Gly His His His His His His
260 265
<210> 64
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 64
caggtcacct tgagggagtc tggtccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctctctcagc agtgttaatt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtaccaac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtcactgg acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaaac tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgcgaccccc 300
ggagctatta tgggtgctct tcatatctgg ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgact gtgccctcta gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
ccgaaatctg gcggtggcgg atccccagga tcaggttata ttcctgaagc tccaagagat 720
gggcaagctt acgttcgtaa agatggcgaa tgggtattac tttctacctt tttaggacat 780
catcatcatc atcac 795
<210> 65
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 65
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly
225 230 235 240
Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg
245 250 255
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His His
260 265 270
His His His
275
<210> 66
<211> 825
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 66
caggtcacct tgagggagtc tggtccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctctctcagc agtgttaatt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtaccaac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtcactgg acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaaac tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgcgaccccc 300
ggagctatta tgggtgctct tcatatctgg ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgact gtgccctcta gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
ccgaaatctg gtggaggagg ttctggaggc ggtggaagtg gtggcggagg tagcccagga 720
tcaggttata ttcctgaagc tccaagagat gggcaagctt acgttcgtaa agatggcgaa 780
tgggtattac tttctacctt tttaggacat catcatcatc atcac 825
<210> 67
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 68
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 68
Leu Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ser Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Gly Thr
85 90 95
Leu Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 69
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 69
caggtgcagc tgcaggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagactac 300
ggtgactacc tccttgacta ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 70
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 70
ctgtctgccc tgactcagcc tgcctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggatataact atgcctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggta aagcccccaa actcctgatt tatgaggtca caaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctagctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caggcacttt gctacttttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctt 327
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 71
Ser Tyr Ala Met His
1 5
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 72
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 73
Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Tyr
1 5
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 74
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 75
Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 76
Ser Ser Tyr Thr Gly Thr Leu Leu Leu
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 77
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 78
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 79
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 80
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 81
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is any amino acid or not present
<400> 81
Glu Val Thr Xaa
1
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 82
Ser Ser Tyr Thr Gly Thr Leu Leu Leu
1 5
<210> 83
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 83
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Ala
115 120 125
Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr
130 135 140
Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
165 170 175
Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser
180 185 190
Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu
195 200 205
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Gly Thr Leu Leu Leu
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230
<210> 84
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 84
caggtgcagc tgcaggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagactac 300
ggtgactacc tccttgacta ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ctcaggcagc 360
ggcggtggcg gatccctgtc tgccctgact cagcctgcct ccgcgtccgg gtctcctgga 420
cagtcagtca ccatctcctg cactggaacc agcagtgacg ttggtggata taactatgcc 480
tcctggtacc aacaacaccc aggtaaagcc cccaaactcc tgatttatga ggtcacaaag 540
cggccctcag gggtccctga tcgcttctct agctccaagt ctggcaacac ggcctccctg 600
accgtctctg ggctccaggc tgaggacgag gctgattatt actgcagctc atatacaggc 660
actttgctac ttttcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc tt 702
<210> 85
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Val Asn Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Arg Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gln Asp His Asn Ser Gly Trp Tyr Thr Tyr Phe His
100 105 110
Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 86
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 86
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Phe Gly Val Asn Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Arg Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 87
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 87
caggtgcagc tggtgcaatc tggagcagaa ctgaaaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60
tcttgtacgg cttctggata tagttttacc aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggaatc gtcaatcctg ctgactctga taccagatac 180
agcccggcct tccaaggcca ggtcaccatg tccgccgaca agtccttcaa taccgcctac 240
ctgcagtgga gtcgcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacttggg 300
caagatcata atagtggctg gtatacctac ttccacccta tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc a 381
<210> 88
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 88
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagaag tgacgttggt ggttataatt atgtctcttg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcttaatt tttggggtca atgatcggcc ctcaggggtt 180
tctgatcgct tctctgggtc caggactggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caacctgagg acgaggctga ttattattgc agttcgttta cacgaggcac cactctcctg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 89
Asn Tyr Trp Ile Ala
1 5
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 90
Ile Val Asn Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ala Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 91
Leu Gly Gln Asp His Asn Ser Gly Trp Tyr Thr Tyr Phe His Pro Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 92
Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 93
Gly Val Asn Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 94
Ser Ser Phe Thr Arg Gly Thr Thr Leu Leu Val
1 5 10
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 95
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 96
Val Asn Pro Ala Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 97
Ala Arg Leu Gly Gln Asp His Asn Ser Gly Trp Tyr Thr Tyr Phe His
1 5 10 15
Pro Met Asp Val
20
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 98
Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 99
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is any amino acid or not present
<400> 99
Gly Val Asn Xaa
1
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 100
Ser Ser Phe Thr Arg Gly Thr Thr Leu Leu Val
1 5 10
<210> 101
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Val Asn Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Arg Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gln Asp His Asn Ser Gly Trp Tyr Thr Tyr Phe His
100 105 110
Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Phe Gly Val Asn Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Arg Thr Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Arg Gly Thr Thr
225 230 235 240
Leu Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
245 250
<210> 102
<211> 762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 102
caggtgcagc tggtgcaatc tggagcagaa ctgaaaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60
tcttgtacgg cttctggata tagttttacc aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggaatc gtcaatcctg ctgactctga taccagatac 180
agcccggcct tccaaggcca ggtcaccatg tccgccgaca agtccttcaa taccgcctac 240
ctgcagtgga gtcgcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacttggg 300
caagatcata atagtggctg gtatacctac ttccacccta tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc aggcggcggc ggctctggcg gaggtggcag cggcggtggc 420
ggatcccagt ctgccctgac tcagcctgcc tccgtgtctg ggtctcctgg acagtcgatc 480
accatctcct gcactggaac cagaagtgac gttggtggtt ataattatgt ctcttggtac 540
caacagcacc caggcaaagc ccccaaactc ttaatttttg gggtcaatga tcggccctca 600
ggggtttctg atcgcttctc tgggtccagg actggcaaca cggcctccct gaccatctct 660
gggctccaac ctgaggacga ggctgattat tattgcagtt cgtttacacg aggcaccact 720
ctcctggtgt tcggcggagg gaccaagctg accgtcctag gt 762
<210> 103
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 103
Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr
1 5 10 15
Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly
20 25 30
<210> 104
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 104
ccaggatcag gttatattcc tgaagctcca agagatgggc aagcttacgt tcgtaaagat 60
ggcgaatggg tattactttc taccttttta gga 93
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 105
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 106
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 106
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly
225 230 235 240
Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu
245 250 255
Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr
260 265 270
Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg Thr
275 280 285
Pro Leu Pro Arg Gly Thr Asp Asn Glu
290 295
<210> 107
<211> 59
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 107
Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
1 5 10 15
His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu
20 25 30
Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala
35 40 45
Arg Thr Pro Leu Pro Arg Gly Thr Asp Asn Glu
50 55
<210> 108
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 108
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Phe Asp Tyr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Thr Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Trp Val Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Gly Leu Val Asp Tyr Lys Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala
130 135 140
Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val
145 150 155 160
Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr
165 170 175
Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu
180 185 190
Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln
195 200 205
Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu
210 215 220
Cys Ser
225
<210> 109
<211> 269
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 109
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly
225 230 235 240
Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg
245 250 255
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly
260 265
<210> 110
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 110
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Pro Gly Ala Ile Met Gly Ala Leu His Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys
225 230 235 240
Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile
245 250 255
Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val
260 265 270
<210> 111
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 111
Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr
1 5 10 15
His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val
20 25 30
<210> 112
<211> 265
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Leu Ser
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile
225 230 235 240
Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu
245 250 255
Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly
260 265
<210> 113
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 113
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
145 150 155 160
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
165 170 175
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
180 185 190
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
195 200 205
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 114
<211> 267
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 114
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp
245 250 255
Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly
260 265
<210> 115
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 115
Leu Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ser Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Gly Thr
85 90 95
Leu Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 116
<211> 276
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Val Asn Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Arg Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gln Asp His Asn Ser Gly Trp Tyr Thr Tyr Phe His
100 105 110
Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
210 215 220
Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg
245 250 255
Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser
260 265 270
Thr Phe Leu Gly
275
<210> 117
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 117
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Phe Gly Val Asn Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Arg Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 118
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 118
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gln Trp Lys Trp Phe Gly Glu Ala Trp Tyr Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro
210 215 220
Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala
245 250 255
Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly
260 265 270
<210> 119
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 119
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 120
<211> 276
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Thr Arg Gly Ala Trp Phe Gly Glu Ser Leu Ile Gly
100 105 110
Gly Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
210 215 220
Val Glu Pro Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg
245 250 255
Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser
260 265 270
Thr Phe Leu Gly
275
<210> 121
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 121
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Thr
20 25 30
Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Thr Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 123
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 124
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 125
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 125
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
20 25
<210> 126
<211> 1273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Synthetic（合成的）
<400> 126
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (14)

1.一种三聚体抗体，其包含三个融合多肽，每个融合多肽包含与三聚体化结构域融合的抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域与SARS-Cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)的受体结合基序(RBM)具有结合特异性。
2.如权利要求1所述的三聚体抗体，其中，所述三聚体化结构域能够介导三聚体抗原结合分子的稳定结合。
3.如权利要求1所述的三聚体抗体，其中，所述三聚体化结构域包含选自SEQ IDNO:103、107和111的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO:103。
4.如权利要求1-3中任一项所述的三聚体抗体，其还包含在所述抗原结合结构域和所述三聚体化结构域之间的连接肽。
5.如权利要求4所述的三聚体抗体，其中，所述连接肽为一种柔性连接子，优选地，包含SEQ ID NO:122或123的氨基酸序列。
6.如权利要求4或5所述的三聚体抗体，其中，所述连接肽为5至50个氨基酸残基的长度，优选5至20个氨基酸残基的长度。
7.如权利要求1-6中任一项所述的三聚体抗体，其中，所述抗原结合结构域与至少一个选自SEQ ID NO:126的第438、447-456、489-495和507-508位的氨基酸残基结合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的三聚体抗体，其中，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含(a)SEQ ID NO:5-10、(b)SEQ ID NO:27-32、(c)SEQ ID NO:49-54、(d)SEQ ID NO:71-76或(e)SEQ ID NO:89-94的氨基酸序列。
9.如权利要求1-7中任一项所述的三聚体抗体，其中，所述抗原结合结构域为Fab片段、scFv片段或纳米抗体。
10.一种或多种编码如权利要求1-9中任一项所述的三聚体抗体的多核苷酸。
11.一种细胞，其包含如权利要求10所述的一种或多种多核苷酸。
12.一种组合物，其包含如权利要求1-9中任一项所述的三聚体抗体和药学上可接受的载体。
13.一种在受试者中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的如权利要求1-9中任一项所述的三聚体抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述受试者患有COVID-19症状。
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