KR101364172B1

KR101364172B1 - 원숭이 ｃｄ４３에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주

Info

Publication number: KR101364172B1
Application number: KR1020110002997A
Authority: KR
Inventors: 박정규; 김정식; 김상준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2011-01-12
Publication date: 2014-02-17
Also published as: KR20120081723A

Abstract

본 발명은 원숭이 CD43 항원에 특이적으로 결합하는 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD43 항체 (anti-monkey CD43 antibody), 이를 생산하는 융합 세포주 (hybridoma)에 관한 것이다. 본 발명은 면역증강 작용이 있는 항 원숭이 CD43 항체 및 항체 변형물에 관한 것으로 이를 이용하여 암 치료 및 바이러스 감염치료에 응용할 수 있다.

Description

원숭이 ＣＤ４３에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주 {Monoclonal antibody to specific monkey CD43 and a hybridoma producing the same}

본 발명은 원숭이의 혈액으로부터 직접 분리한 PBMC (peripheral blood mononuclear cell) 세포를 이용하여 얻은 고친화성 단일클론 항 원숭이 CD4 항체 및 이를 생산하는 융합 세포주에 관한 것이다.

원숭이류 (Non-human primates)에는 유인원 (Apes)과 원숭이 (Monkey)로 대별된다. 원숭이 중 실험용 동물로서 이용되고 있는 것은 약 30종 정도이며, 세계적으로 널리 이용되고 있는 원숭이류는 Rhesus 원숭이, Cynomolgus 원숭이 등의Macaca 원숭이와 Baboon 원숭이 및 Common marmoset 등이 있다. 그 중 수많은 연구들이 Rhesus 원숭이를 중심으로 보고되고 있다. 현재 원숭이를 이용한 AIDS, 뇌질환, 유전자치료 등의 질환연구, 이종간 장기이식 등의 인공장기개발 연구 등 영장류를 이용하는 연구의 붐이 일어나고 있는 상황이다 (생명공학 정책 연구센터,27-62009-09-01,Biozine, 2004-06-17). 하지만 이를 성공시키기 위해서는 우선 원숭이 면역체계의이해와 분석방법의 확립이 무엇보다도 중요하다. 이를 위해서는 각 면역세포의 변화 및 기능 분석을 위해 필수적인 원숭이 특이항체의 생산이 선행되어야 한다. CD43+T 세포의 검출법으로는 일반적으로 유세포 분석(FACS analysis), 면역조직염색법 (Immunohistochemistry), 면역형광법 (Immunofluoresce) 등의 방법이 시행되고 있으며, 이들은 모두 CD43 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 개발을 요구하고 있다. 하지만 Rhesus 원숭이 CD43 항원을 인식하며 현재 상용화되고 있는 항체는 모두 전무한 상태이다. 원숭이 CD43 항체와 교차반응이 있는 항사람 CD43 항체 (anti-human CD43 antibody)또한 전무한 상태이므로 원숭이 CD43항원에만 특이적으로 인식하는 항체의 개발이 절실하다.

본 발명자들은 상기의 문제점 및 필요성을 인식하고, 원숭이 CD43 항원에 친화력이 높은 항 원숭이 CD43 항체를 개발하고자, Rhesus 원숭이의 PBMC 세포를 직접분리하고, 이를 생쥐에 면역 (immunization)함으로서 원숭이 CD43항원을 인지하는 항체를 생산할 수 있는 융합 세포주를 선별해내고, 상기 항체가 CD43T 세포를 검출하거나 암세포 치료를 위한 면역증강제로 활용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체를 생산하는 융합세포주를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD43⁺ T세포와 관련된 질병의 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 원숭이로부터 분리된 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체를 제공한다.

상기 항체에서, 항체의 중사슬의 가변부위는 서열번호 1로 표시되고, 경사슬의 가변부위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하다.

또한 상기 단일클론항체는 수탁번호가 KCLRF-BP-00231인 융합세포주에 의하여 생산될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 생산하는 융합세포주를 제공한다.

상기 융합세포주는 수탁번호가 KCLRF-BP-00231인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 변형물을 포함하는, CD43⁺ T세포에 의해 매개되거나, CD43⁺ T세포와 관련된 질환의 치료용 조성물을 제공한다.

상기 질병은 암 또는 바이러스 감염에 의해 발생된 질환을 포함한다.

본 발명에 따른 항 원숭이 CD43항체는 원숭이 특이 CD43 항원을 높은 친화성을 가지고 인지할 수 있으며, T 세포의 활성을 증강시킴으로써 암이나 바이러스에 의해 유발되는 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 원숭이 면역세포 CD43 항원에 특이성을 갖는 단일클론 항체의 제작 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 원숭이 CD43항체의 특징을 파악하기 위해, 상업적으로 판매되고 있는 aCD43 항체(clone : YG-5, DFT-1)와 본 발명의 단일클론 항 원숭이 CD43 항체를 이용하여 immunoprecipitation(IP)법과 western blot(WB)법을 교차로 실시한 결과를 나타낸 것이다 ( 1) 본 발명항체 IP/YG5 WB 2) CEM7 lysate/본 발명항체 WB 3) YG5 IP/본 발명 항체 WB 4) DFT1 IP / 본 발명 항체 WB).
-CEM7 : human T cell, lysate 를 이용함
-YG5 IP : anti-CD43 antibody
-DFT1 : anti-CD43 antibody
도 3은 본 발명을 통해서 얻은 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD43항체의 cDNA염기서열 중 친화력을 결정하는 CDRs지역에 대한 유전자 정보를 중사슬과 경사슬의 가변 부위(variable region)으로 나누어서 나타낸 것이다. 각 아미노산 서열상에서 CDR 부분은 붉은 글씨로 표시하였다. VH는 중사슬 가변부위, VL는 경사슬 가변부위를 뜻한다.
도 4는 생쥐 Igg (1ug/well), CTLA4-Ig (0.5ug/well) 및 본 발명의 항 원숭이 CD43 항체를 처리하여, T 세포의 활성 증가 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 agonistic 항체로서 CD43항체를 보여주는 그래프로서, mIgg (1ug/well), aCD43 hybridoma 배양액 30ul, 정제된 aCD43 항체(0.5ug/well)를 넣고 beta-counter를 이용하여 방사능 양을 측정한 결과이다.

본 발명은 원숭이로부터 분리된 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 수탁번호 KCLRF-BP-00231의 융합세포주에 의해 분비되는 원숭이 CD43 항원을 특이적으로 인식하는 단일클론항체에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "단일클론항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위 (에피토프 (epitope))에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 (hybridoma)의 배양 또는 파지디스플레이 (phage display) 방법에 의해 생산될 수 있기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다.

본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 필요에 의해 정제하여 사용될 수 있다. 이러한 정제 방법의 예로는 투석, 염 침전, 이온교환크로마토그래피,크기배제크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 항체 정제 방법이 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 단일클론 항체는 항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체의 결합특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경사슬 및 2개의 전체 길이의중사슬을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다.

항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 단일클론 항체를 얻기 위해서 Rheus 원숭이의 혈액으로부터 PBMC를 분리하고, 생쥐 복강에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 쥐의 골수종 세포 (myeloma cell)와 융합하여 얻어진 융합 세포주에서 단일클론 항 원숭이 CD43항체를 분리 정제할 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 경쇄 가변부위 및 중쇄 가변부위를 모두 포함하는 단일클론항체일 수 있다. 본 발명 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 부위는, "상보성 결정 영역 (complementarity-determining resion, CDR)"라고 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 "구조 영역 (framework region, FR)"을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3으로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 한편, 본 발명의 단일클론항체는 상보성 결정 영역 (CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역 (FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 본 발명에서는 상기 단일클론항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 부위에 대한 CDRs의 염기서열을 제공한다.

항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위인 중사슬과 경사슬의 가변 부위, 특히 CDR (complementarity determining region) 이 복합체의 친화력을 결정하므로 기 단일클론항체 유전자를 클로닝하여 항체 중사슬과 경사슬의 가변부위에 대한 유전자 염기서열을 분석할 수 있다. 염기서열을 분석하기 위해 융합 세포주로부터 RNA 을 추출하여 Mouse Ig-Primer set (Novagen, CA, USA)을 이용하여 RT-PCR을 수행할 수 있다.

상기의 "PCR" 은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다. 상기의 "RTPCR"은 역전사 효소 중합 연쇄반응 (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)으로, 특정 부위의 RNA을 주형으로 하여 이에 상응하는 cDNA (complementary DNA) 을 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 역전사 효소를 이용하여 RNA로부터 cDNA 을 제조하는 과정과 cDNA 을 이용하여 특정부위를 증폭하는 과정으로 나누어진다. cDNA을 이용한 증폭과정은 상기의 PCR의 증폭과정과 동일하다. 상기 단일클론항체의 염기서열은 항체의 중사슬 (heavy chain) 및 경사슬 (light chain)의 가변부위가 각각 서열번호 1,2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태로는 상기의 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주에 관한 것이다. 본 발명에서 용어‘하이브리도마’란, 항체를 생산하는 B 림프구와 골수종 암세포를 융합하여 얻은 세포를 의미하는데, 골수종세포는 형질전환된 세포로, 배양접시에서 오랜 기간 배양할 수 있는 장점이 있어, 한 가지 항체만을 만들어 내는 골수종 하이브리도마를 분리해 내면 손쉽게 단일클론항체를 대량으로 획득하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 한 실시예로, Rheus 원숭이의 혈액으로부터 CD43T 세포를 순수 분리하고, 이를 생쥐 복강에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 쥐의 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하여 단일클론 항 원숭이 CD43항체를 생산하는 융합 세포주를 얻었다. 이를 한계희석 배양법 (limit dilution culture)을 통해 CD43⁺T 세포에 친화력이 높은 항체를 생산하는 융합 세포주를 최종 선별하였다.

상기의 특징을 가지는 단일클론항체를 분비하는 융합 세포주는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2010년 4월 5일자로 한국 세포주 은행 (KCLB, Korean Cell Line Bank)에 수탁번호 제 KCLRF-BP-00231호로서 기탁하였다.

또한 본 발명은 상기의 융합 세포주에서 얻은 항 원숭이 CD43 단일클론항체의 원숭이 CD43T 세포에 대한 높은 친화력을 이용하여 CD43+T 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 원숭이 CD43항원에 높은 친화력을 보이므로, 유세포 분석, 형광면역, 면역조직 염색 등을 통해 CD43⁺T 세포의 분석에 탁월하고, 높은 효율로 CD43⁺T 세포를 분리해낼 수 있다.

상기 유세포 분석법은 수많은 세포를 플루이드 컬럼 (fluid column) 안에서 single flow로 형성하여 레이저 빔 (laser beam)을 통과하면서 각 세포의 크기, 구조 및 과립도 등을 측정하므로 다양한 세포의 특징을 분석할 수 있는 방법이다. 극히 미량의 형광 물질도 인지할 수 있어 정확도와 민감도가 높고 다양한 혼합 세포군에서 소수의 아형군을 측정 혹은 분리할 수 있다. 상기 유세포 분석법은 단클론항체를 이용한 백혈병 마커 검사 등 세포 표지자 검사, 세포의 DNA량 측정에 따른성장 주기 분석, 망상 적혈구수 측정, 호중구 기능검사, 항-혈소판 항체 검사 및 망상 혈소판수 검사, 종양 단백 검출과 기타 연구목적의 검사 등에 사용되는 것을포함한다. 기존의 항체보다 항원과의 친화력이 우수한 본 발명의 항체를 사용하면 CD43⁺T 세포를 보다 정확하고 효율적으로 분리해 낼 수가 있다.

상기의 형광 면역법은 항체와 항원이 선택적으로 결합하는 특성을 이용하여 특정한 생물분자의 정량과 분자량의 측정 및 그 분자가 세포나 조직 내에서 존재하는 위치 등을 알아내는 방법을 말한다.

또한 본 발명은 상기 항-원숭이 CD43 단일클론항체 또는 이의 변형물을 포함하는 CD43⁺ T세포에 의해 매개되거나, CD43⁺ T세포와 관련된 질병의 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기의 항체 또는 이의 변형물은 CD43T 세포 매개 질병의 진단에 응용하는 모든 방법에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 원숭이 CD43항원의 분석, CD43T 세포의 정량 및 정성 분석 등이 포함될 수 있다.

상기의 변형물은 항 CD43항체를 이용하여 생체 내 CD43 +T 세포의 제거(depletion) 및 무력화(inactivation)에 응용되는 모든 변형체의 제조에 해당되는것을 포함한다. 보다 구체적으로 CD43 항체에 화학적 결합(conjugation)에 의한 변형체나, 상기 단일클론항체의 cDNA염기서열 정보를 이용하여 항체의 유전학적 변형및 그로 인해 생산된 모든 변형물을 의미한다.

상기 화학적 결합에 의한 변형체의 생산을 위한 화학적 방법 및 화학적 첨가물의 한계는 없으나, 구체적으로는 단일사슬 박테리아 톡신 (Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin), 식물 홀로톡신 (plant holotoxins: class II ribosome 불활성화 단백질인 리신 (ricin), 아브린 (abrin), 미슬토 (mistletoe), 렉틴 (lectin), moceccin) 이나 헤미톡신 (hemitoxins: class I ribosome 불활성화단백질인 gelonin, saporin, pokeweed antiviral 단백질) 과 같은 세포 독소의 부착을 통한 변형물을 포함한다. 즉, 항 원숭이 CD43 항체의 Fc부분에 독소 (toxin)인 박테리아 유래 내독소 및 외독소를 화학적 방법 및 유전학적 방법을 이용하여 결합시킨 독소 융합 항체의 생산이 포함될 수 있다.

상기의 유전학적 방법에 의한 변형체 생산은 cDNA 정보 및 재조합 기술을 이용하여 만들어지는 모든 형태의 단일사슬, 이중사슬 재조합 단백질을 포함한다.

상기 조성물에서 CD43⁺ T세포에 의해 매개되거나, CD43⁺ T세포와 관련된 질병은 암 또는 바이러스 감염에 의해 발생된 질환을 포함한다. 본 발명에서 생산된 항 원숭이 CD43 항체 또는 이의 변형물은 면역증강제로 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에서 생산된 항 원숭이 CD43 항체가 다른 항체보다 많은 양의 T 세포 활성을 증가시켰음을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어, "암 (cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라 부르며, 바람직하게 본 발명에서는 면역증강제로서 단일클론항체를 사용하면 암을 치료할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 항 원숭이 CD43 항체를 분비하는 융합 세포주의 제작

원숭이 CD43항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위해, 융합세포주를 도면 1로 표시되는 과정으로 제작하였다.

1-1. 원숭이의 혈액으로부터 CD43 +T 세포의 분리

Rhesus Macaqu로부터 전혈을 채혈하여 PBMC (peripheral blood mononuclear

cell)을 분리하였다. PBMC은 Ficoll-gradient centrifugation으로 분리했다. 분리한 세포들은 유세포 분석을 통해 검증했다.

1-2. 항원면역( Immunization )

분리된 6X10 PBMC 세포를 다음과 같은 조건으로 면역하였다.

항원면역 (Immunization)	기간	면역경로	양	마리수	면역증강제
항원면역 (Immunization)	2 달-1 달-1 달-총 3번	복강	6X 10⁵세포/생쥐	5 마리/각 그룹	ODN

1-3. 융합( fusion )

융합 세포주를 생성하기 위해 면역이 유도된 생쥐에서 얻은 비장세포를 P3X63Ag8.653 mouse myeloma 세포와 융합하였다. 골수종 (myeloma) 세포는 10%의 FBS를 함유한 RPMI 배지에서 성장시켜, 세포융합 전 우태아혈청 (FBS :Fetal bovine serum) 이 들어가지 않은 RPMI 배지로 3회 세척하여 부유시키고 세포수를 확인하였다. 비장 세포는 비장을 적출한 뒤 잘게 절제 후 유리시키며 튜브에 옮겨2분 정도 정치시키고 3회 세척한 후 세포를 계수했다. 골수종 세포 (myeloma)와 비장세포를 1:5 의 비율로 혼합하고 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하였다. 미리 37 ℃로 데운 50% PEG-1500 1ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 튜브(tube)를 1분 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 이 후 RPMI 배지를 1ml, 1ml, 3ml을 각각 1분 동안 떨어뜨리고, 14ml를 2분 동안 떨어뜨리면서 천천히 단계적으로 희석하였다. 이를 1200 rpm 으로 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 융합된 세포의 펠렛(pellet)을 서서히 풀어준 뒤 1x HAT이 포함된 RPMI 배지 (20% FBS, 히포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린 (aminopterin), 티미딘 (thymidine))에 부유시키고,96 웰 배양판에 200ul 씩 분주한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양했다. 융합 후 7일째에 배지를 HT로 교환했다. 4~5일 이후 군락이 형성한 웰에서 상층액을 150~200ul 취하여 유세포 분석법으로 원숭이 PBMC에 특이하게 반응하는 융합 세포주를 선별하였다.

1-4. 항체생성 융합세포의 클로닝

마우스의 복강에서 분리한 복강 마크로 파지 (macrophage)를 이용한 공급자세포 배양 또는 융합세포용 배지를 제조하여, 특히 항체를 생성하는 것으로 확인된융합 세포주를 24 웰에 옮겨 배양했다. 세포 군락이 50~70% 정도로 자랐을 때 배양상층액을 취하여 원숭이 PBMC에 활성도를 보이는지 확인하고 활성도가 높은 융합세포주는 HT 배지에 희석하여 한계희석 배양법 (limit dilution culture)으로 2회또는 3회의 단일세포 배양을 실시하였다.

1-5. CD43 항원 트랜스펙턴트 확립

CD43 항원들에 대해선 cDNA를 CHO 세포에서 유전자 전달감염(트랜스펙션, transfection) 함으로써 특정 CD 항원이 발현되는 유전자 전달 감염체 (트랜스펙턴트, transfectant)를 확립하였다.

실시예 2: Immunoprecipitation 법을 통한 항 원숭이 CD43 항체를 생산하는 친화력 높은 단일 클론 융합 세포주 선별

원숭이 CD43 특이적인 항체를 생성하는 융합세포주를 선별하기 위해서 얻어진 hybridoma를 3일 배양하여 배양액을 얻었다. CD43-발현 T세포 유래 백혈병 세포인 CEM7 세포를 NP-40 lysis buffer (50mM Tris-Cl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40)에 넣어 lysate를 얻고 여기에 hybridoma로부터 얻은 항체와 protein G bead (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, Ca, USA)를 넣은후 4도에서 overnight 배양한다. 이후 14,000g, 4도에서 3초간 원심분리한 후 얻어진 Pellet을 20 ul SDS sample buffer에 넣어 단백질 전기 영동을 실시한다. 도 2에서 보여지는 결과는 아래 그림과 같다.

우선 선별한 CD43 특이적인 항체 4-29 로 western blot을 한 샘플의 단백질 밴드 크기(위 그림, 2번 레인)와 4-29 항체로 면역침전(Immunoprecipitation)한 후, 알려진 CD43 항체인 YG5로 western blot 한 단백질 밴드 크기(위 그림, 1번 레인)가 약 100 kDa 로 같음을 확인하였다. 이는 알려진 CD43 항원의 단백질 크기와 유사하다. 이와 같은 결과는 면역침전과 western blot 실험 순서를 반대로 수행한 실험인, 즉 알려진 CD43 항체인 YG5 또는 DFT-1으로 각각 면역침전(Immunoprecipitation) 한 후, 4-29 항체로 western blot 한 샘플에서도 역시 같은 크기의 단백질을 확인 (위 그림, 3번, 4번 레인)함으로써, 4-29가 CD43에 대한 항체임을 확인하였다.

실시예 3: 친화력이 높은 항체의 CDRs 에 대한 cDNA 염기서열 분석

항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요부위는 중사슬과 경사슬의 가변 부위, 특히 CDR (complementarity determining region)이 복합체의 친화력을 결정하므로 상기 실시예를 통해 얻어진 항체 유전자를 클로닝하여 항체 중사슬과 경사슬에 대한 가변부위에 대한 유전자 염기서열을 분석하였다. 융합세포주로부터 RNA를 추출하여 Mouse Ig-Primer set (Novagen,CA, USA)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자를 셔틀 벡터 (shuttlevector)에 클로닝 하여 해당 유전자의 염기서열을 분석하였다. 중사슬의 가변 영역인 VH (variable region of heavy chain) 및 경사슬의 가변 영역인 VL (variableregion of light chain) 유전자 염기서열은 아미노산으로 치환하여 서열화하였다 (도 3 참고).

실시예 4: CD43 항체의 T 세포 활성 증가 유도확인

2마리의 원숭이로부터 Monkey PBMC를 분리하고 96 well plate에 각각 3X10⁵양의 세포를 넣어 배양하여 Mixed lymphocyte reaction(MLR)을 실시하였다. 이때 생쥐 Igg(1ug/well)를 음성대조군으로 CTLA4-Ig (0.5ug/well)를 양성대조군으로 넣어 배양하고, 실험군으로 항 CD43 항체를 0.5ug/well, 1ug/well 의 농도로 넣어 24시간, 48 시간, 72시간 배양하였다. 각각의 배양시간에 맞추어 배양한 후 thymidine 을 well 에 넣어주어 18시간을 더 배양하고 beta-counter를 이용하여 방사능양을 측정하였다. 도 4의 결과에서처럼 Mixed lymphocyte reaction으로 인해 PBMC의 증식이 이루어졌고, 특히 anti-CD43 항체를 넣은 Mixed lymphocyte reaction에서는 세포의 증식이 48시간의 경우 3.37배 이상 증가하였다. 반대로 음성대조군으로 CTLA4-Ig를 넣은 Mixed lymphocyte reaction 에서는 세포 증식이 오히려 약 8배 정도의 감소하였다. 이를 통해 항원숭이 CD43 항체는 면역세포의 활성을 3.37배 이상 증강시킬 수 있다는점을 알수 있다. 축약어 설명) R+S :원숭이 두 마리에서 얻은 PBMC를 각각 3X10^5씩 96 well plate의 한 well 에 넣은 Mixed lymphocyte reaction임. 이때 다른 항체는 넣지 않음. mIgg: R+S 에 isotype Igg를 넣은 대조군; CTLA4-Ig: R+S 에 CTLA4-Ig를 넣은 대조군; aCD43(0.5ug/well): R+S 에 antiCD43 항체를 0.5ug/well의 농도로 넣은 샘플; aCD43(1ug/well): R+S 에 antiCD43 항체를 1ug/well의 농도로 넣은 샘플.

실시예 5: agionistic CD43 항체의 확인

CD43 항체가 agonistic 항체임을 확인하기위해 원숭이의 PBMC (3 X 10⁵/well)를 넣고 anti-CD3 항체 (0.25ug/ml), anti-CD28 항체 (0.25 ug/ml)를 첨가하여 48 시간, 72 시간 배양하였다. 이때 음성대조군으로 mIgg (1ug/well), 실험군으로 aCD43 hybridoma 배양액 30ul, 정제된 aCD43 항체(0.5ug/well)를 넣고 배양하였다. 각각의 배양시간 후 thymidine을 넣고 18 시간을 배양한 후 beta-counter를 이용하여 방사능양을 측정였다. 그 결과 antiCD43 항체를 넣은 그룹에서는 넣지 않은 그룹 (PBMC, mIgg)에 비해 2배이상 증식이 증가하였다. 이를 통해 antiCD43 항체는 agonistic 형태로 T 세포의 증식을 활성화 시킴을 알수 있다. 축약어 설명) PBMC :원숭이 한 마리에서 얻은 PBMC를 각각 3X10^5씩 96 well plate의 한 well 에 넣고 antiCD3, antiCD28 항체로 T 세포 증식을 유도함. 이때 다른 항체는 넣지 않음. mIgg: 위의 PBMC 그룹에 isotype Igg를 넣은 대조군; aCD43 soup: antiCD43 항체를 분비하는 hybridoma 로부터 배양상등액을 얻은후 이 배양액 50ul를 PBMC 그룹에 첨가한 그룹; aCD43(0.5ug/well): PBMC 그룹에 antiCD43 항체를 0.5ug/well의 농도로 넣은 샘플.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00231

20100331

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어지는, 원숭이 CD43 항원에 특이적으로 반응하는 항-원숭이 CD43 항체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 항체는 수탁번호가 KCLRF-BP-00231인 융합세포주에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 항-원숭이 CD43 항체.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어지는, 원숭이 CD43 항원에 특이적으로 반응하는 항-원숭이 CD43 항체를 생산하는 융합세포주 (수탁번호 KCLRF-BP-00231).
삭제
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 항-원숭이 CD43 항체를 포함하는 면역 증강제.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 항체를 포함하는, 원숭이 CD43+T 세포 탐지용 조성물.