JPH10136981A - Ｐａｆ受容体を認識する抗体の可変領域を構成するポリペプチドおよび超可変領域を含むポリペプチド、それらをコードする遺伝子並びに該ポリペプチドを含む抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗
体の可変領域および超可変領域のアミノ酸配列を明らか
にし、さらに該アミノ酸配列を含み医薬として利用可能
なモノクローナル抗体を提供することを課題とする。 【解決手段】 マウス抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗
体の可変領域および超可変領域をコードする遺伝子の塩
基配列を決定し、さらに該遺伝子がコードするアミノ酸
配列を決定した。これにより、該アミノ酸配列からなる
抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体の可変領域を構成す
るポリペプチドおよび抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗
体の超可変領域を含むポリペプチドならびにそれらの遺
伝子、さらに該可変領域または該超可変領域を含むモノ
クローナル抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞表面に存在す
るＰＡＦ受容体を認識する抗体の可変領域を構成するポ
リペプチド、該抗体の超可変領域を含むポリペプチド、
それらをコードする遺伝子および該可変領域および該超
可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。該モノク
ローナル抗体は、医薬や分析試薬として利用可能であ
る。

【０００２】

【従来の技術】血小板活性化因子（Ｐｌａｔｌｅｔ−Ａ
ｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ：ＰＡＦ）は、血小
板の活性化、例えば、血小板の形態変化、血小板からの
ヒスタミン遊離、血小板同士の凝集を引き起こす白血球
由来の因子として発見されたリ配列表の配列番号３また
は５のアミノ酸配列からなるマウス抗ＰＡＦ受容体モノ
クローナル抗体の軽鎖可変領域である抗体フラグメン
ト。ン脂質で、１−ｏ−アルキル−２−アセチルグリセ
ロ−３−ホスホコリン（１−ｏ−ａｌｋｙｌ−ａｃｅｔ
ｙｌ−２−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ
ｃｈｏｌｉｎｅ）の構造をしている。この物質は、血小
板、白血球、肺、脾臓、腎臓、脳などで産生されるリン
脂質性オータコイドであり、微量で強力な起炎作用およ
び降圧作用をもち、気管支喘息、エンドトキシンショッ
ク、アナフィラキシーショック等に関与すると考えられ
ている。さらに具体的にいうと、ＰＡＦは、血小板活性
化作用、好中球活性化作用、マクロファージ活性化作
用、好酸球活性化作用、血圧降下作用、血管透過性亢進
作用、平滑筋収縮作用、肝臓でのグリコーゲン分解作用
などを有し、生体内でのアナフィラキシー、炎症、アレ
ルギーなどの進展に関わる因子といえる。

【０００３】ＰＡＦは細胞膜状の特異的な受容体（レセ
プター）を介して、血小板、好中球、好酸球、マクロフ
ァージなどの標的細胞を活性化する。細胞にはＰＡＦの
シグナルを特異的にキャッチする受容体（以下「ＰＡＦ
受容体」という）が存在するのではないかと１９７０年
代から言われていたが、１９９１年に清水らの手により
ようやくその受容体の遺伝子が単離され、その構造が明
らかとなった。本発明者は清水らと共同し、ＰＡＦ受容
体の生体内での機能を解明するために、ＰＡＦ受容体を
特異的に認識するモノクローナル抗体を作製した（特開
平７−１０１９９８号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，ｖ
ｏｌ．３０５，ｐｐ．８２９−８３５，１９９５）。こ
れらの文献には、ＰＡＦ受容体を認識するモノクローナ
ル抗体はモルモットとヒトのＰＡＦ受容体のいずれにも
特異的な結合力を有することが記載されている。また、
ヒトにおいては、好酸球、好中球を初めとし、Ｂ細胞株
のＲａｊｉや単球細胞株のＵ９３７等でＰＡＦ受容体が
その細胞表面に発現していることが述べられている。ま
た、特願平７−２５７０２３号明細書では、このＰＡＦ
受容体を認識するモノクローナル抗体（マウス抗ＰＡＦ
受容体モノクローナル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲ）が好酸球の
ＰＡＦを介した遊走活性を抑制すること、ＥＣＰの放出
を抑制することが示されている。また、上記出願には、
モルモットを用いた気管支喘息のモデル実験では、上記
モノクローナル抗体の前投与によりＰＡＦを介した気管
支喘息が抑制されることが示されている。したがって、
かかる抗体が抗アレルギー剤として利用できることが大
いに期待されている。

【０００４】しかし、上記マウス抗ＰＡＦ受容体モノク
ローナル抗体は、マウスの抗体（免疫グロブリン）であ
ることから、医薬（抗アレルギー剤）としてそのままヒ
トに投与すると、ヒトの抗体に比べてマウス抗体の半減
期は短くなり、臨床上有効な効果を上げるには、頻繁に
高濃度のマウス抗体を投与することが必要になる。ま
た、このようなマウス抗体を頻繁にヒトの生体内に投与
すれば、マウス抗体とヒト抗体のアミノ酸配列の違いか
ら、ヒトの生体内ではマウス抗体がヒトとは違う異種の
抗原として認識され、抗原を排除する免疫機構が惹起さ
れるおそれがある。その場合、ヒトの生体内に抗マウス
抗体（ＨＡＭＡ）が作られてしまい、その後に投与され
るマウス抗体が排除されるのみならず、アナフィラキシ
ー・ショックの様な免疫反応を引き起こすおそれがあ
る。

【０００５】一方、マウス抗体の有用性を損なわず、か
つ、ヒトには生体内への投与による免疫反応を惹起しな
い抗体として、抗原を認識する部位（可変領域）をマウ
スのアミノ酸配列とし、その他の定常領域をヒトのアミ
ノ酸配列とするキメラ抗体の作製が提唱されている（ヨ
ーロッパ特許０１２０６９４号、ヨーロッパ特許０１２
５０２３号、国際出願公開ＷＯ８６／０１１５３３号公
報）。

【０００６】さらに、キメラ抗体を改良したものとし
て、ヒト型化抗体の作製が提唱されている（ヨーロッパ
特許公開第０２３９４００号公報）。ヒト型化抗体は、
抗原と直接的に結合する領域（超可変領域（以下ＣＤＲ
または相補性決定領域ともいう））のみがマウス抗体由
来のアミノ酸配列からなり、抗体としての構造を保つた
めに必要な領域がヒト由来のアミノ酸配列からなる。し
たがって、含有される非ヒトアミノ酸配列の割合がさら
に低くなっている。その結果、ヒトの生体内においてこ
のヒト抗体と比べてほとんど同じ半減期を持つととも
に、抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の産生がほとんど起きな
くなっている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、上記マ
ウス抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体を医薬（抗アレ
ルギー剤）として使用するためには、該抗体をキメラ抗
体やヒト型化抗体に変換することが、投与量や抗マウス
抗体の産生の観点から、より好ましい。キメラ抗体やヒ
ト型化抗体への変換のためには、マウス抗ＰＡＦ受容体
モノクローナル抗体の可変領域もしくはＣＤＲのアミノ
酸配列または該抗体の可変領域もしくはＣＤＲの遺伝子
の塩基配列が必要となるが、それらはいまだ報告されて
いない。したがって、上記マウス抗ＰＡＦ受容体モノク
ローナル抗体をキメラ抗体やヒト型化抗体に変換するこ
とが出来ずにいた。

【０００８】本発明は、医薬として利用可能な抗ＰＡＦ
受容体モノクローナル抗体を得るために、ＰＡＦ受容体
を認識する抗体の可変領域およびＣＤＲのアミノ酸配列
ならびに該抗体の可変領域およびＣＤＲの遺伝子の塩基
配列を明らかにし、該アミノ酸配列からなるポリペプチ
ドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡを提供することを課題とする。さらに本発明は、上
記可変領域および超可変領域を含む抗ＰＡＦ受容体モノ
クローナル抗体を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、ＰＡＦ受容体を認識するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマから該ハイブリドーマ
が産生するモノクローナル抗体の可変領域（ＶＨ領域
（重鎖可変領域）およびＶＬ領域（軽鎖可変領域））の
ｃＤＮＡをクローニングした。そして、得られたＶＨ領
域およびＶＬ領域のｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を
決定した。そして、上記ＤＮＡがコードするマウス抗Ｐ
ＡＦ受容体モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配
列を決定した。さらに、本発明者は、上記可変領域のア
ミノ酸配列の情報をもとにしてコンピューター解析によ
りマウス抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体の超可変領
域のアミノ酸配列を決定した。

【００１０】より具体的には、上記課題を解決するため
にＰＡＦ受容体を認識するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマＹＭ−ＰＡＦＲ（工業技術院生命工学
工業技術研究所に１９９４年６月２８日に寄託されたハ
イブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２２）の
ｃＤＮＡからＰＣＲにより該ハイブリドーマが産生する
モノクローナル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲのＶＨ領域およびＶ
Ｌ領域のｃＤＮＡをクローニングし、得られたＶＨ領域
のｃＤＮＡフラグメントおよびＶＬ領域のｃＤＮＡフラ
グメントを導入した形質転換体をＴＡクローニングキッ
ト（インヴィトロジェン社製）により作製した。上記形
質転換体のプラスミドのＤＮＡの塩基配列をダイターミ
ネーター（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）法により決
定した。そして、上記ＤＮＡがコードするモノクローナ
ル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲの可変領域および超可変領域のア
ミノ酸配列を決定した。

【００１１】すなわち、本発明は、ＰＡＦ受容体を認識
する抗体の重鎖超可変領域を含むポリペプチドであっ
て、該重鎖超可変領域が、配列表の配列番号７に記載の
アミノ酸配列からなる超可変領域１、配列表の配列番号
８に記載のアミノ酸配列からなる超可変領域２、配列表
の配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる超可変領域
３から構成されることを特徴とするポリペプチドに関す
る。

【００１２】また、本発明は、ＰＡＦ受容体を認識する
抗体の軽鎖超可変領域を含むポリペプチドであって、該
軽鎖超可変領域が、配列表の配列番号１０に記載のアミ
ノ酸配列からなる超可変領域１、配列表の配列番号１１
に記載のアミノ酸配列からなる超可変領域２、配列表の
配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる超可変領域
３から構成されることを特徴とするポリペプチドに関す
る。

【００１３】また、本発明は、ＰＡＦ受容体を認識する
抗体の重鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、
該重鎖可変領域が配列表の配列番号１に記載のアミノ酸
配列からなることを特徴とするポリペプチドに関する。

【００１４】また、本発明は、ＰＡＦ受容体を認識する
抗体の軽鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、
該軽鎖可変領域が配列表の配列番号３または５に記載の
アミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドに
関する。

【００１５】また、本発明は、上記のいずれかのポリペ
プチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに関する。

【００１６】さらに、上記の可変領域または超可変領域
のアミノ酸配列、またはそれらの遺伝子の塩基配列を利
用することにより、該可変領域または該超可変領域を含
む抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体を作製することが
可能となる。

【００１７】すなわち、本発明は、上記の重鎖超可変領
域を含む、ＰＡＦ受容体を認識する抗ＰＡＦ受容体モノ
クローナル抗体に関する。

【００１８】また、本発明は、上記の軽鎖超可変領域を
含む、ＰＡＦ受容体を認識する抗ＰＡＦ受容体モノクロ
ーナル抗体に関する。

【００１９】さらに、本発明は、上記の重鎖超可変領域
と上記の軽鎖超可変領域とを含む、ＰＡＦ受容体を認識
する抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体に関する。

【００２０】また、本発明は、上記の重鎖可変領域を含
む、ＰＡＦ受容体を認識する抗ＰＡＦ受容体モノクロー
ナル抗体に関する。

【００２１】また、本発明は、上記の軽鎖可変領域を含
む、ＰＡＦ受容体を認識する抗ＰＡＦ受容体モノクロー
ナル抗体に関する。

【００２２】さらに、本発明は、上記の重鎖可変領域と
上記の軽鎖可変領域とを含む、ＰＡＦ受容体を認識する
抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体に関する。

【００２３】

【発明の実施の形態】モノクローナル抗体は、免疫グロ
ブリンの形態をとっていて、可変領域（以下Ｖ領域とい
うことがある）と定常領域に大別される。可変領域はさ
らに重鎖可変領域（以下ＶＨ領域ということがある）と
軽鎖可変領域（以下ＶＬ領域ということがある）に分け
られる。可変領域は、抗体が抗原を認識する部位であ
り、その領域には、抗体が各抗原と直接結合する部位で
ある超可変領域（以下ＣＤＲということがある）が含ま
れている。可変領域および超可変領域は抗体を産生する
細胞のクローンにより異なる。定常領域は、抗体を産生
する動物の種に由来する領域であり、同じ動物から産生
される同じサブクラスの抗体間では、抗体が認識する抗
原が異なっても、定常領域のアミノ酸配列は同じであ
る。

【００２４】本明細書において、可変領域、超可変領域
の「領域」とは完全なモノクローナル抗体の一部分（フ
ラグメント）を指す。

【００２５】本明細書において、「免疫グロブリン」と
は免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる
１以上のポリペプチドからなる蛋白質をいう。本明細書
において免疫グロブリンとモノクローナル抗体は、ほぼ
同義であるが、免疫グロブリンという場合はよりその分
子構造に着目した場合であり、モノクローナル抗体とい
うときはよりその抗原との反応性に着目した場合であ
る。本発明の免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラム
ダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー
定常領域遺伝子並びにミリアド（ｍｙｒｉａｄ）免疫グ
ロブリン可変領域遺伝子を含む。また、本発明において
は、免疫グロブリンは活性フラグメントをも包含するも
のである。活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を
有する抗体のフラグメントを意味し、具体的には、Ｆ
（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び組換えＦ
ｖ体などを挙げることができる。

【００２６】本明細書において、「遺伝子」とは、ゲノ
ム中のＤＮＡ、該ＤＮＡに由来するｍＲＮＡおよび該ｍ
ＲＮＡに対するｃＤＮＡ（センス鎖、アンチセンス鎖ま
たはそれらの二本鎖）をいう。また、「アミノ酸配列を
コードする遺伝子」は、遺伝暗号の縮重により取り得る
全ての塩基配列の遺伝子を指す。

【００２７】本発明のマウス抗ＰＡＦ受容体モノクロー
ナル抗体の超可変領域および可変領域のアミノ酸配列の
決定は、例えば実施例にしたがって行える。本発明の抗
ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体の重鎖可変領域は配列
表の配列番号１、軽鎖可変領域は配列表の配列番号３ま
たは５に記載のアミノ酸配列からなる。本明細書におい
て、可変領域を構成するポリペプチドとは当該ポリペプ
チドのアミノ酸配列が可変領域のアミノ酸配列と実質的
に同じであることを意味する。

【００２８】超可変領域は３つの部分から構成され、そ
れらの抗体上の位置によりＮ末端から順に超可変領域１
（ＣＤＲ１と呼ぶことがある。）、超可変領域２（ＣＤ
Ｒ２）、超可変領域３（ＣＤＲ３）と呼ぶ。重鎖超可変
領域１、２、３はそれぞれ配列表の配列番号７、８、９
に記載のアミノ酸配列からなり、軽鎖超可変領域１、
２、３はそれぞれ配列表の配列番号１０、１１、１２に
記載のアミノ酸配列からなる。

【００２９】本発明の抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗
体は、上記の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖超可変
領域または軽鎖超可変領域を含む免疫グロブリンであ
り、ＰＡＦ受容体と反応するものであれば、特に限定さ
れない。

【００３０】本発明の抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗
体は、例えば、特開平７−１０１９９８号公報に記載さ
れているハイブリドーマＹＭ−ＰＡＦＲ（工業技術院生
命工学工業技術研究所に１９９４年６月２８日に寄託さ
れ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２２である。）より
産生されるＹＭ−ＰＡＦＲ抗体を供与体抗体として作製
することができる。ＹＭ−ＰＡＦＲは、モルモットＰＡ
Ｆ受容体の細胞外第３ドメイン（１５８番目のＴｈｒか
ら１７３番目のＣｙｓまで）を免疫したＢａｌｂ／ｃマ
ウスの脾細胞と８−アザグアニン耐性株Ｐ３Ｕ１とを細
胞融合したハイブリドーマであり、これが産生するモノ
クローナル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲはモルモットＰＡＦ受容
体およびヒトＰＡＦ受容体と反応する。以下、便宜上、
好適な例として、ＹＭ−ＰＡＦＲ抗体を供与抗体とした
場合について概説する。

【００３１】ハイブリドーマＹＭ−ＰＡＦＲの染色体Ｄ
ＮＡからｃＤＮＡを合成しＶ領域遺伝子断片をクローニ
ングした。該Ｖ領域遺伝子をオートシーケンサーにかけ
ダイターミネーター方によりＤＮＡシーケンスを行って
その塩基配列を決定した。さらに、該塩基配列から該ｃ
ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定した。

【００３２】上記のようにクローニングにより得たＶ領
域遺伝子断片または人工的に合成したＶ領域遺伝子断片
を、ヒト免疫グロブリン定常領域の上流に連結させてキ
メラＹＭ−ＰＡＦＲ抗体遺伝子を作製することができ
る。

【００３３】Ｖ領域にあって抗原と直接的に結合する超
可変領域遺伝子を、ウインターらの方法（ウインター
ら、Ｎature,vol.３２１，ｐ．５２２−５２５，１９８
６）によりヒト免疫グロブリン可変領域のＣＤＲ遺伝子
に移植することによって、キメラ抗体よりもよりヒト免
疫グロブリンに近い、ヒト型化ＹＭ−ＰＡＦＲ抗体遺伝
子を作製し得る。

【００３４】本発明の、ＰＡＦ受容体を認識する抗体の
可変領域または超可変領域を含むモノクローナル抗体、
その活性フラグメントおよびその他の誘導体を含む免疫
グロブリンは種々の組換えＤＮＡ技術により容易に製造
されることができる。上記抗体、その活性フラグメント
およびその他の誘導体を含む免疫グロブリンは、トラン
スフェクションされた細胞、好ましくは不死化された真
核細胞、例えば、ミエローマまたはハイブリドーマ細胞
中で最終的に発現され得る。

【００３５】大腸菌は、本発明のＤＮＡ配列をクローニ
ングするために有用な一つの原核生物宿主である。他に
も、バチルス、例えば枯草菌および他の腸内細菌科、例
えばサルモネラ、セラチアおよび種々のシュードモナス
種等が微生物宿主として使用される。これらの原核生物
宿主において、また、発現ベクターを構築することもで
き、該ベクターは、典型的には、宿主細胞と適合した発
現制御配列を含む。さらに、任意の数の種々の公知のプ
ロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマー
ゼプロモーター系またはλファージからのプロモーター
系が存在してもよい。プロモーターは、場合によりオペ
レーター配列と共に、発現を調節し、そして、転写およ
び翻訳を開始し完成させるためのリボソーム結合部位配
列等を有する。

【００３６】他の微生物、例えば真核生物宿主として酵
母もまた発現のために用いられ得る。サッカロミセス
は、発現制御配列、例えば、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーターおよび複
製起点、末端配列および所望の類似のものを有する適当
なベクターを伴った好ましい宿主である。

【００３７】昆虫細胞培養物もまた、本発明の抗ＰＡＦ
受容体モノクローナル抗体等を製造するために用いられ
ることができ、代表的にはバキュロウイルスに基づいた
発現系が用いられる。

【００３８】上述の宿主に加えて、哺乳動物細胞培養物
もまた本発明の抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体等を
発現し、製造するために好適に用いられる。例えば、そ
の好ましい態様として、完全な免疫グロブリンを分泌で
きる多くの宿主セルラインが本技術分野で開発されてお
り、それらは、ＣＨＯセルライン、種々のＣＯＳセルラ
イン、Ｈｅｌａ細胞、好ましくはミエローマセルライン
等または形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマが
例示される。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御
配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー
および必要なプロセッシング情報部位例えばリボソーム
結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化
部位および転写ターミネーター配列を含む。好ましい発
現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデ
ノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウ
イルスまたはニワトリのβ−アクチン遺伝子由来のエン
ハンサーもしくはプロモーターである。

【００３９】所望の免疫グロブリンがいったん発現され
れば、本発明の完全な免疫グロブリン、それらのダイマ
ー、個々の軽鎖および重鎖、または免疫グロブリンの他
の形態は、本技術分野の標準方法に従って精製される。
該方法は、硫安沈澱、各種イオン交換クロマトグラフィ
ーおよびアフィニティーカラムクロマトグラフィー等を
含む。薬学的用途のためには、少なくとも約９０〜９５
％の均質性の実質純粋な免疫グロブリンが好ましく、９
８〜９９％あるいはそれ以上の均質性が好ましい。

【００４０】本発明の抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗
体は、免疫化学的な研究のみならず、免疫治療や診断な
どに有用である。このような目的を達成するには、必ず
しも免疫グロブリン分子全体を用いる必要はなく、活性
を有する限り、分子の一部を用いることができ、場合に
よってはその方が好ましいこともある。このことは、当
業者であれば容易に理解できることである。したがっ
て、本発明の抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体は、そ
の活性フラグメントをも包含するものである。抗体は、
特定の抗原物質を認識する均一な免疫グロブリンであ
る。活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を有する
免疫グロブリンのフラグメントを意味し、具体的には、
Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び組換え
Ｆｖ体などを挙げることができる。

【００４１】これらの活性フラグメントは、単独でも用
いられるが、必要に応じて、アルブミン、ポリエチレン
グリコール等の物質と結合させ、新たな複合物として用
いることができる。このような複合物は、一般に、生体
内では、長時間分解されずにその効果を最大限まで発揮
することが多い。活性フラグメントに、アルブミン、ポ
リエチレングリコール等の物質を付加する方法は、例え
ば、アンティボディーズ、ア・ラボラトリー・マニュア
ル（Ａntibodies, Ａ.Ｌaboratory Ｍanual），コール
ドスプリングハーバー・ラボラトリー、１９８８に記載
されている。一般的には、ＳＰＤＰ（ファルマシア製）
等の２価反応性試薬を用いれば、活性フラグメントをア
ルブミン等と容易に結合させることができる。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に
説明する。ハイブリドーマＹＭ−ＰＡＦＲを用いて、下
記のプロトコールによりＰＡＦ受容体に対するモノクロ
ーナル抗体の可変領域（Ｖ領域）の遺伝子シーケンスを
行った。

【００４３】１．ｃＤＮＡの調製 （１）ハイブリドーマＹＭ−ＰＡＦＲを２５ｃｍ³ フラ
スコ中で培養した。培養細胞を回収して、ＰＢＳで遠心
洗浄した後、１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、細胞数を数え
た。細胞１×１０⁶ 個を無菌のエッペンドルフチューブ
に入れ、遠心分離で上清を抜き取り、ペレットをタッピ
ングした。 （２）ＲＮＡｚｏｌＢ（コスモバイオ製）を上記ペレッ
トに２００μｌ加え、ピペットマンのチップでよく攪拌
して細胞を溶かした。クロロホルムを２０μｌ添加し、
振盪後、氷中に５分間放置した。４℃で１５，０００ｒ
ｐｍ、１５分間遠心した後、上層の無色透明の部分を回
収し、新しいチューブに移した。４℃で１５，０００ｒ
ｐｍ、１５分間遠心した後、上清を捨てて、ペレットに
７５％エタノールを８００μｌ加え、−２０℃で３０分
間放置した。４℃で１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心
した後、ペレットに蒸留水１１．５μｌ添加した。
（３）（２）の液にオリゴｄＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を
０．５μｌ添加して、７０℃で１０分間、氷上で５分間
放置した。下記の組成の液を加え、４２℃で５０分間、
９０℃で５分間、氷上で５分間放置した。 ５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ（ストラタジーン社製） １μｌ （４）ＲＮａｓｅＨを１μｌ添加し、３７℃で２０分間
放置した。このようにして、ｃＤＮＡ混合物を調製し
た。

【００４４】２．ＰＣＲ反応 （１）前記で得られたｃＤＮＡ混合物を用い、下記の組
成の液でＰＣＲ反応を行った。すなわち、ミネラルオイ
ル４０μｌを重層し、９４℃で５分間放置した後、「５
５℃で２分間、７２℃で３分間、９４℃で１分間」のサ
イクルを３０サイクル行い、次いで、５５℃で２分間、
７２℃で１０分間放置した。 ＶＨ ＶＬ ｃＤＮＡ ２．０μｌ ２．０μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ １．０μｌ １．０μｌ ｐｒｉｍｅｒ（ファルマシア社製） ２．０μｌ １．０μｌ １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ４．０μｌ ４．０μｌ ＤＤＷ ３０．５μｌ ３１．５μｌ Ａｍｐｌｉ−Ｔａｇ ０．５μｌ ０．５μｌ

【００４５】（２）反応液４μｌをミニゲル電気泳動
（１．５％アガロースゲル）でチェックした。結果を図
１に示す。ＰＣＲによりＤＮＡ断片が増幅したことが確
認された。

【００４６】３．ＶＨ及びＶＬフラグメントの回収 （１）上記で調製したＰＣＲ生成物をミニゲル電気泳動
（１．５％アガロースゲル）させて、ＶＨフラグメント
（重鎖可変領域をコードする遺伝子断片））及びＶＬフ
ラグメント（軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片）の
バンドをゲルから切り出した。 （２）Ｇｅｎｅ ＣｌｅａｎでＰＣＲ生成物を回収し、
ミニゲル電気泳動（１．５％アガロースゲル）でバンド
をチェックした。結果を図２に示す。

【００４７】４．ライゲーション 下記ＴＡクローニングキット（インヴィトロジェン社
製）を用い、ＤＮＡの連結反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）を
行った。すなわち、下記組成の液で１４℃で一晩反応を
行い、ライゲーション混合物を得た。 ＡＤＤＷ ５μｌ １０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ ＰＣＲベクター ２μｌ ＰＣＲ生成物 １μｌ Ｔ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １μｌ

【００４８】５．トランスフォーメイション ＴＡクローニングキットを用いて形質転換（Ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を行った。 （１）氷上で細胞５０μｌに、０．５Ｍのβメルカプト
エタノール２μｌ、及び前記で調製したライゲーション
混合物を添加し３０分間放置した後、４２℃の湯浴中に
３０秒間、次いで、氷上に２０分間放置した。４５０μ
ｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間（２２５ｒｐ
ｍ）インキュベートした。 （２）次いで、ＬＢ ａｇａｒプレート（＋Ａｍｐ，Ｘ
−Ｇａｌ，ＩＰＴＧ）に拡散した。各サンプルは、５０
μｌ、１００μｌ、２００μｌであった。３７℃で１８
時間インキュベートした後、４℃で２時間放置したとこ
ろ、白と青のコロニーが発現した。

【００４９】６．ミニ培養（Ｍｉｎｉ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ） （１）前記各サンプルのプレートから白いコロニーを４
個ずつ拾った。 （２）３ｍｌのＬＢ培地（＋Ａｍｐ）に１個のコロニー
を加え、３７℃で一晩振盪した。

【００５０】７．ミニ調製（Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ） （１）培養溶液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに
取った。４℃で６，０００ｒｐｍ、２分間遠心した。 （２）沈殿したペレットに対し１００μｌ溶液１（リゾ
チーム５ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で５分間放置した
後、２００μｌの溶液２（氷上で穏やかに５分間混合）
を添加し、１５０μｌの溶液３（氷上で１５分間混合）
を添加し、次いで、４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間
遠心した。溶液１、２、３はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８９年）１．２５−１．２６ページに記載のｓ
ｏｌｕｔｉｏｎＩ、ＩＩ、ＩＩＩに対応する。

【００５１】（３）新しいエッペンドルフチューブに上
清を取った。これに、等容量のフェノールを添加し、次
いで、室温で１２，０００ｒｐｍ、１分間遠心した。 （４）新しいエッペンドルフチューブに上清を取った。
これに、等容量のＣＨＣｌ₃ ：ｉＡＡ（９９：１）混合
物を加え、室温で１２，０００ｒｐｍ、１分間遠心し
た。 （５）新しいエッペンドルフチューブに上清を取った。
これに、１μｌのＭｕｓｓｅｌグリコーゲンと９００μ
ｌのエタノールを添加し、−８０℃で３０分間放置した
後、４℃で１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心した。 （６）沈殿物を乾燥した。２０μｌのＴＥ及び１μｌの
ＲＮａｓｅＡ（５ｍｇ／ｍｌ）を加え、６５℃で２０分
間放置した。 （７）このようにして、プラスミドＤＮＡを得た。 （８）得られたＤＮＡを下記の組成の液で３７℃で１時
間インキュベートした後、０．７５％アガロースゲルに
加えてミニゲル電気泳動を行を行い、バンドをチェック
した。ＶＨ領域ＤＮＡの電気泳動の結果を図３に示す。
図３で、右のレーンがプラスミドＤＮＡを電気泳動した
レーンであり、左のレーンがマーカーを電気泳動したレ
ーンである。マーカーの下から二つ目の広いバンドの横
（約３５０ｂｐの位置）に増幅されたＶＨ領域ＤＮＡの
バンドが見られる。 Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ ＥｃｏＲＩ １μｌ（１Ｕ） ＤＮＡ １μｌ ＡＤＤＷ ７μｌ

【００５２】８．ＤＮＡシーケンス （１）プラスミドＤＮＡを１μｌとり、９９μｌのＴＥ
にて希釈した。 （２）吸光光度計で（１）の液の２６０ｎｍの光の吸光
度（Ａ２６０）を測定し、ＤＮＡの濃度を計算した（Ａ
２６０が１．０のとき５０μｇ／ｍｌとした）。 （３）測定後、ＤＮＡ濃度が１μｇ／μｌとなるように
ＴＥにてＤＮＡ溶液を希釈した。 （４）ダイターミネーター（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｏｒ）法により、ＤＮＡシーケンス（オートシーケン
サ；ＡＢＩモデル３７３Ａを使用）を行った。モノクロ
ーナル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲのＶＨ領域のＤＮＡの塩基酸
配列を配列表の配列番号２に示す。また、モノクローナ
ル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲのＶＬ領域は、両端が若干違うこ
とが分かった。そのＤＮＡの塩基酸配列を配列表の配列
番号４とそのアライメントを配列番号６に示す。

【００５３】次に、上記ＤＮＡがコードするアミノ酸配
列を求めた。モノクローナル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲのＶＨ
領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ま
た、モノクローナル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲのＶＬ領域のア
ミノ酸配列とそのアライメントをそれぞれ配列表の配列
番号３および５に示す。

【００５４】９．Ｖ領域の解析 このようにして得られたＤＮＡシーケンスをもとに、Ｖ
領域の超可変領域のアミノ酸配列をコンピュータ解析に
より求めた。結果を図４（モノクローナル抗体ＹＭ−Ｐ
ＡＦＲのＶＨ領域のアミノ酸配列）並びに図５および図
６（モノクローナル抗体ＹＭ−ＰＡＦＲのＶＬ領域のア
ミノ酸配列およびそのアライメント）に示す。これらの
図において、四角の線で囲った箇所は、超可変領域（Ｃ
ＤＲ１ないし３）である。重鎖ＣＤＲ１ないし３のアミ
ノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号７ないし９に、軽
鎖ＣＤＲ１ないし３のアミノ酸配列を配列表の配列番号
１０ないし１２に示す。

【００５５】

【発明の効果】本発明のマウス抗ＰＡＦ受容体モノクロ
ーナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を利用すること
で、該可変領域を含む抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗
体、特にキメラ抗体の作製が可能となる。また、本発明
のマウス抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体の超可変領
域のアミノ酸配列を利用することで該超可変領域を含む
抗ＰＡＦ受容体モノクローナル抗体、特にヒト型化抗体
の作製が可能となる。

【００５６】既に述べたように、モノクローナル抗体Ｙ
Ｍ−ＰＡＦＲが好酸球のＰＡＦを介した遊走活性を抑制
すること、およびＥＣＰの放出を抑制すること、また、
モルモットを用いた気管支喘息のモデル実験では、該モ
ノクローナル抗体の前投与によりＰＡＦを介した気管支
喘息を抑制することが特願平７−２５７０２３号明細書
に示されている。したがって、該モノクローナル抗体を
供与抗体とする本発明の抗ＰＡＦ受容体モノクローナル
抗体は気管支喘息を初めとするアレルギーの研究試薬と
して使用できる。

【００５７】また、キメラ抗体およびヒト型化抗体は、
気管支喘息の治療薬として使用できることが期待され
る。さらに、抗アレルギー剤として使用できることが期
待される。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala 35 40 45 Ala Ile Asn Ser Asn Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ile Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Pro Gly Ser Ser Tyr Ala Trp Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：３５４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 AGG TGA AGC TGC AGG AGT CTG GGG GAG GCT TAG TGA AAC TTG GAG GGT 48 CCC TTA AAC TCT CCT GTG CAG CCT CTG GAT TCA CTT TCA GTA GCT ATT 96 ACA TGT CTT GGG TTC GCC AGA CTC CAG AGA AGA GGC TGG AAT TGG TCG 144 CAG CCA TTA ATA GTA ATG GTG ATA ACA CCT ACT ATC CAG ACA ATG TGA 192 AGG GCC GAT TCA CCA TCT CCA GAG ACA ATG CCA AGA ACA CCC TGT ACC 240 TGC AAA TGA GCA GTC TGA GGT CTG AGG ACA TTG CCT TGT ATT ATT GTG 288 CAA GAC CTG GTA GTA GTT ACG CCT GGT TTG ATC ACT GGG GCC AAG GGA 336 CCA CGG TCA CCG TCT CCT 354

【００６０】配列番号：３ 配列の長さ：１０７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Lys Ser Thr Ser Ile Gly 1 5 10 15 His Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

【００６１】配列番号：４ 配列の長さ：３２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA AAG TTC AAG TCC ACA TCA ATA GGA 48 CAC AGG GTC AGC GTC ACC TGC AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT 96 GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA TCA GGG CAG TCT CCT AAA ACA CTG ATT 144 TAC TCG ACA TCC TAC CGG TAC AGT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC 192 AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AAT GTG CAG TCT 240 GAA GAC TTG GCA GAC TAT TTC TGT CAG CAA TAT AAC ACC TAT CCG TTC 288 ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA 321

【００６２】配列番号：５ 配列の長さ：１０８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Lys Ser Thr Ser Ile Gly 1 5 10 15 His Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105

【００６３】配列番号：６ 配列の長さ：３２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA AAG TTC AAG TCC ACA TCA ATA GGA 48 CAC AGG GTC AGC GTC ACC TGC AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT 96 GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA TCA GGG CAG TCT CCT AAA ACA CTG ATT 144 TAC TCG ACA TCC TAC CGG TAC AGT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC 192 AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AAT GTG CAG TCT 240 GAA GAC TTG GCA GAC TAT TTC TGT CAG CAA TAT AAC ACC TAT CCG TTC 288 ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG 324

【００６４】配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5

【００６５】配列番号：８ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Ile Asn Ser Asn Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val 1 5 10 15

【００６６】配列番号：９ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質

【００６７】配列番号：１０ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質

【００６８】配列番号：１１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質

【００６９】配列番号：１２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質

【図面の簡単な説明】

【図１】ハイブリドーマＹＭ−ＰＡＦＲから取り出し、
ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡをミニゲル電気泳動した結果
を表す写真である。

【図２】ＰＣＲで増幅したＹＭ−ＰＡＦＲ抗体のｃＤＮ
Ａフラグメントのミニゲル電気泳動の結果を表す写真で
ある。

【図３】ＹＭ−ＰＡＦＲ抗体のＶＨフラグメントを導入
した形質転換体から取り出したプラスミドＤＮＡの電気
泳動の結果を表す写真である。

【図４】ＹＭ−ＰＡＦＲ抗体の重鎖可変領域および重鎖
超可変領域を示す図である。

【図５】ＹＭ−ＰＡＦＲ抗体の軽鎖可変領域および軽鎖
超可変領域を示す図である。

【図６】ＹＭ−ＰＡＦＲ抗体の軽鎖可変領域および軽鎖
超可変領域のアライメントを示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ Ｑ Ｙ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＰＡＦ受容体を認識する抗体の重鎖超可
   変領域を含むポリペプチドであって、該重鎖超可変領域
   が、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる
   超可変領域１、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配
   列からなる超可変領域２、配列表の配列番号９に記載の
   アミノ酸配列からなる超可変領域３から構成されること
   を特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項２】 ＰＡＦ受容体を認識する抗体の軽鎖超可
   変領域を含むポリペプチドであって、該軽鎖超可変領域
   が、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列からな
   る超可変領域１、配列表の配列番号１１に記載のアミノ
   酸配列からなる超可変領域２、配列表の配列番号１２に
   記載のアミノ酸配列からなる超可変領域３から構成され
   ることを特徴とするポリペプチド。
3. 【請求項３】 ＰＡＦ受容体を認識する抗体の重鎖可変
   領域を構成するポリペプチドであって、該重鎖可変領域
   が配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるこ
   とを特徴とするポリペプチド。
4. 【請求項４】 ＰＡＦ受容体を認識する抗体の軽鎖可変
   領域を構成するポリペプチドであって、該軽鎖可変領域
   が配列表の配列番号３または５に記載のアミノ酸配列か
   らなることを特徴とするポリペプチド。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか一項に記載
   のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリペプチドまたは請
   求項２に記載のポリペプチドを含む抗ＰＡＦ受容体モノ
   クローナル抗体。
7. 【請求項７】 請求項３に記載のポリペプチドまたは請
   求項４に記載のポリペプチドを含む抗ＰＡＦ受容体モノ
   クローナル抗体。