HUT77263A

HUT77263A - Kémiai anyagok bejuttatása egy specifikus sejttípus sejtjeinek belsejébe

Info

Publication number: HUT77263A
Application number: HU9701746A
Authority: HU
Inventors: Ramesh K. Prakash
Original assignee: Theratech Inc.
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1995-09-12
Publication date: 1998-03-02
Also published as: BR9508951A; KR970705404A; WO1996008263A1; CA2198361A1; PL319100A1; AU697469B2; AU3550795A; CN1157570A; JPH10505835A; CZ74797A3; EP0781139A1; MX9701860A; ZA957688B

Description

A találmány tárgya kémiai anyagok sejtekbe való bejuttatása

Közelebbről találmányunk olyan készítményre és eljárásra vonatkozik, mely alkalmas kémiai anyagok egy specifikus sejttípusba

- a CR2-receptort kifejező sejtekbe - való bejuttatására.

• ·

- 2 A rák kezelése szempontjából komoly figyelmet keltettek az olyan toxinok, amelyek meg tudják célozni a sejtfelszíni receptorokat vagy a daganat sejteken elhelyezkedő antigéneket [például I. Pastan, D. Fitzgerald, Recombinant Toxins fór Cancer Treatment, 254 Science 1173 (1991); 5,169,933 számú és 5,135,736 számú USA-beli szabadalmi leírások (Anderson és munkatársai); 5,165,923 számú USA-beli szabadalmi leírás (Thorpe és munkatársai); 4,906,469 számú USA-beli szabadalmi leírás (Jansen és munkatársai); 4,962,188 számú USA-beli szabadalmi leírás (Frankéi); 4,792,447 számú USA-beli szabadalmi leírás (Uhr és munkatársai); 4,450,154 számú és 4,350,626 számú USA-beli szabadalmi leírások (Masuho és munkatársai)]. Ezek az anyagok egy a sejtet megtaláló molekularészt, úgymint egy növekedési faktort, vagy egy antigénkötő proteint tartalmaznak egy növényi vagy bakteriális toxinhoz kötve. A sejteket a szokásos kemoterápiától eltérő mechanizmussal pusztítják, így hatásosan csökkentik vagy kiküszöbölik a szokásos kemoterápiás szerekkel felléphető keresztrezisztenciát.

A membrán glukoprotein CR2, amit CD21-nek is neveznek az érett B limfocitákon (B sejtek) és bizonyos epitheliális sejteken - úgymint emberi, garati epitheliális sejteken, emberi follikuláris dendritikus sejteken és méhnyaki epitheliumban - fordul elő, és receptora mind az Epstein-Barr vírusnak (EBV), mind C3d/C3dg komplementer fragmentumainak [N. Miller és L.M. Hutt-Fletcher, 66 J. Virol. 3409 (1990)]. Ez a receptor egy 145 kD-os membrán glikoprotein, amely kötő funkcióján kívül részt vesz a B sejt aktiválás folyamatában is; lásd például [G.R. Nemerow és munkatársai]. B sejtek EBV-vel való megfertőződése úgy kezdődik, hogy a vírus gp350/220 burkoló glikoproteinje szelektíven a CR2·« ** * ·» ·»» · • » * · * V 9 9 » · » · · ·«»··· • «*«···· · · • t, a * · * * * · · ·

-receptorhoz kötődik, amit a CR2-receptornak a vírus belsejébe kerülése (internalizálódás) és a receptorhoz kötött virionok endocitozisa követ [Tedder és munkatársai (1986)] . A CR2-receptort tartalmazó epitheliális sejtek szintén kötik a EBV-t, de az ilyen sejtek nyilvánvalóan más mechanizmussal fertőződnek meg, mint a receptor közvetítette endocitózis.

Nemerow és munkatársai, [Identification of gp350 as the viral glycoprotein mediating attachment of Epstein-Barr vírus (EBV) to the EBV/C3d receptor of B cells: sequence homology of gp350 and C3 complement fragment C3d, 61 J. Virol. 1416 (1987)] közleményük szerint a C3dg és gp350/220 aminosav szekvenciáit összehasonlítva hasonló területeket találtak beleértve egy a pg350/220 N-terminusza közelében levő területet (Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu; szekvencia azonosítószám:1) amely megfelel egy szekvenciának a C3dg-ben (Glu-Asp-Pro-Gly-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Val-Glu; szekvencia azonosítószám:2). Nemerow és munkatársai, [Identification of an epitope in the major envelope protein of Epstein-Barr vírus that mediates viral binding to the B lymphocyte EBV receptor (CR2), 56 Cell 369 (1989)] azt is leírták, hogy egy szintetikus tetradekapeptid, amely tartalmazza az 1. szekvencia azonosítószámú aminosav szekvenciát, kötődik mind a tisztított CR2-receptorhoz, mind a CR2-kifejező B sejtekhez. Ez a szintetikus peptid tehát blokkolja a rekombináns gp350/220 vagy a C3dg kötődését a B sejtek CR2-receptorához és egy hasonló szintetikus peptid gátolja az in vitro EBV fertőzést. A csonkolással és helyettesítéssel nyert peptid analógok vizsgálata azt mutatta, hogy a CR2 kötésben résztvevő EBV epitóp a Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu szekvencián (szekvencia azonosítószám:!) belül van.

- 4 ·♦ »· 9 »·«·«· · • · I * · * • «««··· * • » 4* ·» · * ·*·

Rövidebb peptidekkel kisebb mértékű kötődést figyeltek meg bár a Glu-Asp-Pro-Gly (szekvencia azonosítószám:3) peptid jelentős CR2 kötő aktivitást tartott meg. Egy olyan peptid, amelyben glicin aminosavat prolinnal helyettesítettek ezen a területen belül, szintén jelentősen csökkent CR2 kötő hatást mutatott.

A fentiekből látható, hogy olyan készítmények kifejlesztése, amelyek kémiai anyagokat CR2-receptorokat hordozó B sejtek belsejébe szállítanak és az ilyen készítmények alkalmazása igen jelentős előrehaladást jelentene.

Találmányunk célkitűzése készítmények kifejlesztése bizonyos kiválasztott kémiai anyagok szállítására egy specifikus sejttípus, azaz a CR2-receptort kifejező sejtek belsejébe, mely receptorokhoz való kötődés kiváltja a receptor közvetítette endocitozist.

Találmányunk célkitűzése továbbá olyan készítmények előállítási eljárásának és alkalmazásának kidolgozása, melyek kiválasztott kémiai anyagokat szállítanak a CR2-receptort kifejező sejtek belsejébe.

Találmányunk célkitűzése továbbá készítmény és eljárások kifejlesztése kiválasztott kémiai anyagok - úgymint citotoxinok, transzformáló nukleinsavak, gél regulátorok, jelölőanyagok, antigének, gyógyszer hatóanyagok és más hasonlók - szállítására a CR2 -receptort kifejező sejtek belsejébe.

Találmányunk további célkitűzése olyan peptid ligandumok biztosítása, amelyek kiválasztott kémiai anyagokhoz kapcsolhatók, hogy azokat CR2-receptorokhoz kössük és a kémiai anyagok endocitozisát idézzük elő.

Ezeket a célkitűzéseket megvalósíthatjuk egy olyan készítmény segítségével, mely egy kémiai anyagnak specifikusan egy CR2-receptort hordozó sejtekbe való bejuttatására szolgál egy olyan sejtpopulációban, amely CR2-receptort nem hordozó sejteket is tartalmaz. A találmány szerinti készítményt az jellemzi, hogy tartalmaz egy ligandumot (CBEL), amely a CR2-receptorhoz tud kötődni és receptor közvetítette endocitózist vált ki és a ligandumhoz kötve tartalmaz egy kémiai anyagot, amely a CR2-receptort hordozó sejt belsejébe szállítva egy bizonyos kiválasztott hatást tud kifejteni. Az érett B limfociták olyan CR2-receptort hordozó sejtek, amelyek ezekkel a készítményekkel megcélozhatok. Az ilyen sejtekbe szállítható kémiai anyagok közé tartoznak a citotoxinok, transzformáló nukleinsavak, gél regulátorok, jelölő anyagok, antigének és gyógyszer hatóanyagok. A CBEL és a kémiai anyag kötődhetnek egymáshoz és/vagy más funkciós csoportokhoz egy áthidalón keresztül, amely lehet akár biológiailag lebontható úgymint bizonyos peptidek, akár biológiailag nem lebontható. A készítmény tartalmazhat továbbá egy hordozó típusú rendszert, mely egy vízoldható polimer, valamilyen liposzóma vagy valamilyen részecskékből álló anyag.

A készítményeket in vitro úgy alkalmazzuk, hogy sejt populációkat a készítmény hatásos mennyiségével érintkeztetünk olyan körülmények között, amelyek között a CR2-receptorhoz kötődő és endocitózist kiváltó ligandum (CBEL) megköti a CR2-receptort és endocitózist indít el a receptorhoz kötött készítményben. In vivő alkalmazásra a készítmény hatásos mennyiségét szisztémásán adjuk be úgy, hogy a CBEL érintkezzen és kötődjön az érett limfocitákon levő CR2-receptorokhoz, majd a készítmény endocitózisát indítsa • ·

- 6 el. Ha egyszer a sejt belsejébe jut, a kémiai anyag kifejti a kiválasztott hatást.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az IA. és 1B. ábrák a CBEL kémiai konjugációját mutatják egy olyan kémiai anyaggal, melynek egy szabad szulfhidril csoportja van és így egy találmány szerinti készítmény képződik.

A 2A-2D. ábrák egy plazmid létrehozásának lépéseit mutatják egy olyan fúziós protein kifejezésére, amely egy CBEL-t és egy kémiai anyag peptidet tartalmaz a találmány szerint.

A 3. ábra annak a hatásnak az összehasonlítását mutatja, amit a CR2⁺ B sejtekre (sötétebb oszlopok) és a CR2“ T sejtekre (világosabb oszlopok) fejt ki a sejtek in vitro kezelése egy CBEL-ricin A fúziós protein különböző koncentrációival a találmány értelmében.

Mielőtt részletesen ismertetnénk a találmányunk szerinti készítményeket és eljárásokat kémiai anyagok egy specifikus sejttípus belsejébe való szállítására, le szeretnénk szögezni, hogy találmányunk nem korlátozódik az ismertetett konkrét megvalósítási módokra, eljárási lépésekre és új anyagokra, minthogy ezek a megvalósítási módok, eljárási lépések és anyagok egy tartományon belül változhatnak. Azt is rögzíteni szeretnénk, hogy a leírásunkban használt terminológia az előnyös megvalósítási módok leírásának céljára szolgál és semmiképpen sem szándékunk ezzel találmányunk oltalmi körét az igénypontok által meghatározott körnél szűkebb tartományra korlátozni.

Meg kell jegyezni, hogy leírásunkban és igénypontjainkban az egyes számú határozatlan és határozott névelők, így az egy és a vagy az, az adott fogalom többesszámú megfelelőjére is vonatkoznak, hacsak a tartalmi értelmezés ezzel nem teljesen ellentétes. így például ha egy olyan készítményre hivatkozunk, amely egy ligandumot tartalmaz ebbe a hivatkozásba beleértjük a két vagy több ligandumot is; az egy kémiai anyag hivatkozás egy vagy több ilyen kémiai anyagra vonatkozik, amelyek lehetnek azonosak vagy különbözők; és amennyiben egy áthidaló-t említünk ebbe beleértendő két vagy több áthidaló is.

Az alábbiakban megadjuk a leírásunkban és igénypontjainkban alkalmazott terminológiát.

Leírásunkban peptid alatt bármilyen hosszúságú peptidet értünk és ebbe a kifejezésbe beletartoznak a proteinek is. A polipeptid és oligopeptid kifejezéseket mindenféle méretbeli korlátozás nélkül alkalmazzuk, hacsak egy konkrét méretet nem adunk meg.

Leírásunkban a CR2-receptorhoz kötődő és endocitózist kiváltó ligandum vagy CBEL kifejezés egy olyan készítményt jelent, amely képes a CR2 (CD21) receptorhoz kötődni és a sejt belsejébe kerülést (internalizálódást) kiváltani a receptor és a receptorhoz kötődött CBEL endocitőzisával. Találmányunk értelmében a CBEL-ek különböző funkcionális molekulákhoz kötődnek úgy, hogy a CBEL-ek endocitózisa során a hozzákapcsolódott különböző funkcionális molekulák szintén bekerülnek (internalizálódnak) a CR2-t hordozó sejtekbe.

Jelenlegi tudásunk szerint egy CBEL származhat a EBV gp350/ /220 glikoproteinjéből, beleértve az 1. szekvencia azonosítószámú szekvenciát és a határoló szekvenciákat; a C3dg peptidekből, beleértve a 2. azonosítószámú szekvenciát és határoló szekvenciáit vagy ezekkel lényegében homológ peptidekből. Leírásunkbán a lényegében homológ kifejezés olyan peptideket jelent, amelyek megtartják funkcionalitásukat a CR2-receptorokhoz való kötődés és a receptor közvetítette endocitózis kiváltása szempontjából, bár tartalmazhatnak határoló szekvenciákat vagy lehetnek az 1. vagy a 2. azonosítószámú szekvencia csonkolt formái, deliciós variánsai vagy szubsztituciós variánsai. Úgy tűnik, hogy a minimális követelmény a kötődés és a receptor közvetítette endocitózis kiváltásához a 3. azonosítószámú szekvencia jelenléte. A szubsztituciós variánsok egy vagy több aminosav csoport konzervatív szubsztitúcióját tartalmazzák. A konzervatív szubsztitúció egy aminosav gyök olyan helyettesítése egy másikkal, amelynek során a peptid funkcionalitása megmarad, ebben az esetben funkcionalitása a CR2-receptorhoz való kötődés és a receptorhoz kötött készítmény endocitózisának kiváltása szempontjából.

Egy bizonyos konzervatív szubsztituciós csoporthoz tartozó aminosav gyökök néha helyettesíthetnek egy másik aminosav gyököt, ugyanazon a csoporton belül. Egy ilyen csoportosítás a következő: Pro; Alá, Gly; Ser, Thr; Asn, Gin; Asp, Glu; His; Lys, Arg; Cys; Ile, Leu, Met, Val; és Phe, Trp, Tyr. [M. Jimezen-Montano és L. Zamora-Cortina, Evolutinary model fór the generation of amino acid sequences and its application to the study of mammal alfhahemoglobin chains, Proc. Vllth Int'1 Bio- physics Congress,

Mexico City (1981)]. Más variácok, amelyeket lényegében homológnak kell tekinteni például a D-aminosav szubsztitúciója a természetben előforduló L-aminosavakra, aminosav-származékok szubsztitúciója, mint például a további oldalláncokat tartalmazó aminosavak és nem-standard aminosavak szubsztitúciója, nevezetesen az o'-aminosavaké, amelyek proteinekben ritkák vagy nem fordul• ·

- 9 nak elő. A CBEL elsődleges szerkezetét csak funkcionalitási szempontok határozzák meg.

Leírásunkban kémiai anyag alatt bármilyen anyagot értünk, amelynek egy kiválasztott hatása van, hogyha egy B limfocita belsejébe kerül (internalizálódik) endocitózissal. Bizonyos kémiai anyagoknak fiziológiai hatásuk van, úgymint citotoxikus hatásuk vagy a gén regulációra hatnak, amennyiben B sejt belsejébe bekerülnek (internalizálódnak). Transzformáló nukleinsav (RNS vagy DNS) a sejtben internalizálódva replikálódhat és/vagy kifejeződhet a sejten belül. Más nukleinsavak kölcsönhatásba léphetnek szabályozó szekvenciákkal vagy szabályozó faktorokkal a sejten belül a gén kifejeződés egy megválasztott módon való befolyásolására. Egy a sejt belsejébe bevitt kimutatható jelölőanyag lehetővé teheti az olyan sejtek azonosítását a jelölőanyag kimutatásával, melyek internalizálták a találmányunk szerinti készítményeket. A sejt belső részébe szállított antigének az antigénre specifikus immunválaszt válthatnak ki. Gyógyszerhatóanyagok vagy farmakológiailag hatásos vegyületek alkalmazhatók patogén hatások vagy más típusú rendellenességek enyhítésére. Különösen hasznos kémiai anyagok a polipeptidek és bizonyos olyan kémiai anyagok, amelyek biológiailag aktív proteinek, aktív fragmentumai vagy antigén hatású proteinek specifikus antigén fragmentumai (például epitópjai). így a kémiai anyagok közé tartoznak citotoxinok, génregulátorok, transzformáló nukleinsavak, jelölőanyagok, antigének, gyógyszerhatóanyagok és más hasonlók .

Leírásunkban hordozó alatt vízoldható polimereket, részecskékből álló anyagokat vagy liposzómákat értünk. Az ilyen • ·

- 10 hordozók több olyan helyet is tartalmazhatnak, amelyekhez egy vagy több CBEL és/vagy kémiai anyag kapcsolódhat. Az ilyen hordozók növelik a készítmények molekuláris méretét és növelhetik a szelektivitást és/vagy a stabilitást. A szelektivitás azért nő, mert a hordozót tartalmazó készítmények túl nagyok ahhoz, hogy a sejtekbe passzív diffúzióval be tudjanak lépni és ezért a sejtekbe csak receptor közvetítette endocitózissal tudnak belépni.

A vízoldható polimerekből álló hordozókat alkalmazhatjuk peptid ligandumok, kémiai anyagok és más funkcionális molekulák kötésére. Az ilyen hordozók alkalmazhatósága célzott hatóanyag szállításra ismeretes; [Például J. Kopecek, 5 Biomaterials 19 (1984);

E. Schacht és munkatársai, Polysaccharides as Drug Carriers, in Controlled-Release Technology 188 (P.I. Lee & W.R. Good, eds.,

1987); F. Hudecz és munkatársai, Carrier design: cytotoxicity and immunogenicity of synthetic branched polypeptides with poly(L-lysine) backbone, 19 J. Controlled Release 231 (1992); Z. Brich és munkatársai, Preparation and characterization of a water soluble dextran immunoconjugate of doxorubicin and the monoclonal antibody (ABL364), 19 J. Controlled Release 245 (1992).] Az alkalmazható, vízoldható polimerek például a dextrán, inulin, poli(L-lizin), metakril-amid-tartalmú szintetikus polimerek és más hasonlók.

Leírásunkban gyógyszerhatóanyag vagy farmakológiailag hatásos anyag alatt bármilyen kémiai anyagot vagy vegyületet értünk, amely alkalmas egy CR2-t hordozó B sejtbe való bejuttatásra és kiváltja a kívánt biológiai hatást egy ilyen esetben.

Leírásunkban hatásos mennyiség alatt olyan mennyiséget értünk, amely kiváltja a kiválasztott hatást. így például egy • · • · · ·· · · kémiai anyagként egy citotoxint tartalmazó készítmény kiválasztott hatása lehet, hogy pusztítsa el az érett B sejtek egy kiválasztott arányát egy kiválasztott időtartamon belül. A készítmény hatásos mennyisége az a mennyiség, amely ezt a kiválasztott eredményt eléri és ez a mennyiség szakember számára rutin eljárásokkal meghatározható.

A találmányunk szerinti készítmények biztosítják egy kémiai anyag specifikus sejt belsejébe való szállítását egy CR2 receptort hordozó sejt esetében egy olyan sejtpopulációban, amely tartalmaz CR2-receptort nem hordozó sejteket is. A találmányunk szerinti készítmény tartalmaz egy CBEL-t, mely képes a CR2 receptorhoz kötődni és kiváltja a receptor közvetítette endocitozist és tartalmaz egy kémiai anyagot a CBEL-hez kapcsolva, mely kémiai anyag képes egy kiválasztott hatás kiváltására, ha a CR2 -receptort hordozó sejt belsejébe szállítjuk. Ezek a készítmények különösen jól alkalmazhatók érett B sejtek megcélzására. A kémiai anyag lehet citotoxin, transzformáló nukleinsav, gén regulátor, jelölőanyag, antigén, gyógyszerhatóanyag és más hasonlók. Egy CBEL egy kémiai anyaghoz kapcsolódhat kovelenskötéssel, elektrosztatikus kölcsönhatással, hidrofób kölcsönhatással, fizikai egymásba ágyazással és más hasonló módszerekkel; ez a felsorolás nem korlátozó. Egy CBEL egy kémiai anyaghoz kapcsolódhat közvetlenül vagy egy másik funkciós csoporton keresztül. így a készítmények tartalmazhatnak továbbá egy áthidalót, ami a CBEL és a kémiai anyag között helyezkedik el. Az ilyen áthidalók lehetnek biológiailag lebonthatók vagy biológiailag nem lebonthatók és előnyösen peptid áthidalókat alkalmazunk. A találmányunk szerinti készítmények tartalmazhatnak továbbá egy hordozót, amely egy víz• · · · · oldható polimer, egy liposzóma vagy egy részecskékből álló anyag. Ha a hordozó egy vízoldható polimer a készítmény összetétele a következő:

[L-S_aVC-[S_e-A]_f ahol L a ligandum (CBEL) , amely képes a CR2-receptorhoz kötődni és kiváltani annak endocitózisát; A a kémiai anyag; S az áthidaló; C a vízoldható polimer, melynek funkciós csoportjai kovalens kötéseket tudnak képezni a ligandummal, a kémiai anyaggal és az áthidalóval; a és e 0 vagy 1; és b és f legalább 1-et jelentő egész számok. Ilyen vízoldható polimerek lehetnek például a dextrán, inulin, poli(L-lizin), metakril-amid-tartalmú polimerek és más hasonlók.

így találmányunk értelmében a CBEL lehetőséget biztosít olyan készítmény kidolgozására, amely az érett B sejtek CR2 receptorához kötődik, így kiváltva a készítmény endocitózissal való internalizálódását. A kémiai anyag lehetővé teszi, hogy a B sejtekben egy kiválasztott hatást érjünk el. Ennek megfelelően a kémiai anyag lehet például citotoxin, beleértve a radionuklidokat, a CR2-receptort alkotó sejtek, szelektív elpusztítására vagy működésképtelenné tételére; antigén egy kiválasztott immunválasz létrehozására; nukleinsav a B sejtekben gén expresszió genetikai átalakítására vagy szabályozására; gyógyszerhatóanyag vagy más farmakológiailag aktív anyag egy kiválasztott gyógyászati hatás elérésére; jelölőanyag beleértve a fluoreszcens, radioaktív és mágneses jelölőanyagokat is, mely lehetővé teszi azoknak a sejteknek a kimutatását, melyek felvették a készítményt; és más hasonló anyagok.

A találmányunk szerinti készítmények előnyösen tartalmaznak egy vízoldható polimer hordozót is, így számos CBEL és/vagy kiválasztott funkcionalitású kémiai anyag kapcsolható össze egy komplex molekulában. Az ilyen hordozókhoz legalább egy kémiai anyag és legalább egy CBEL kapcsolódik, míg a kémiai anyagokhoz kapcsolódó CBEL-ek előnyös száma 1 és körülbelül 1000 körül van. Az ilyen hordozók növelik a készítmények molekuláris méretét és növelhetik a funkcionális csoportok szelektivitását és/vagy stabilitását a hordozó nélkül elértnél magasabb értékre. A CBEL-ek és/vagy kémiai anyagok összekapcsolását előnyösen biológiailag lebontható vagy biológiailag nem lebontható áthidalókkal végezzük. Az áthidalókat a B sejten belül a hidrolízissel és/vagy enzimatikus bontással szembeni viszonylagos érzékenységük vagy ellenálló képességük alapján választhatjuk. Ez a szelektivitás szakember számára lehetővé teszi, hogy az áthidalót aszerint válassza meg, hogy mi lenne legelőnyösebb; az hogy a kémiai anyag a sejten belül a hordozóhoz kapcsolva maradjon vagy a sejten belüli enzimaktivitás hasítsa le a hordozóról. A liposzómák és a részecskékből álló anyagok hordozóként való alkalmazása független a vízoldható polimer hordozó alkalmazásától.

Bizonyos megvalósítási módoknál a készítményeket úgy állítjuk elő, hogy egy CBEL-t kémiailag konjugálunk egy kémiai anyaggal. Kémiailag konjugáljuk alatt azt értjük, hogy a CBEL-t kovalensen kötjük a kémiai anyaghoz akár közvetlenül, akár egy kapcsoló csoport alkalmazásával. Azokban a megvalósítási módokban, amelyekben a kémiai anyag egy peptid, egy kapcsoló csoportot alkalmazhatunk, hogy összekösse a CBEL-en lévő funkcionális csoportokat és a kémiai anyagot. így például egy CBEL-t és egy ké• ·

- 14 miai anyagként peptidet tartalmazó készítményeket úgy hozhatunk létre, hogy egy a kémiai anyagon levő szulfhidrilcsoportot és egy a CBEL-en levő aminocsoportot egy heterobifunkcionális kötőanyagon keresztül összekapcsolunk. Az 1A. és 1B. ábrán bemutatunk egy példát egy CBEL és ricin A kémiai konjugálására egy maleimid kötőanyagon keresztül. CBEL-ek szulfhidrilcsoportokat tartalmazó kémiai anyagokhoz való kémiai konjugálására maleimid kötőanyagok mellett halogén-acetil-, alkil-halogenid-, alkil-szulfonát-, oí, β-telítetlen karbonil-, vagy a,β-telítetlen szulfoncsoportokat is alkalmazhatunk kötőanyagként. CBEL-ek és aminocsoportokat tartalmazó kémiai anyagok kémiai konjugálására aktív észtereket alkalmazhatunk kötőanyagként. Más kapcsoló csoportokat is alkalmazhatunk attól függően, hogy milyen funkciós csoportok vannak a CBEL-eken és a kémiai anyagon.

A találmányunk szerinti készítményeket előállíthatjuk egy genetikailag módosított szervezetben , úgymint E. coli-bán, mint egy fúziós protein-t. Azaz rekombináns DNS technológiával létrehozhatunk egy hibrid gént, amely tartalmaz egy CBEL-t kódoló nukleotid szekvenciát és egy peptid kémiai anyagot kódoló nukleotid szekvenciát. Ezt a hibrid gént inzertálni lehet egy szervezetbe úgy, hogy a hibrid gén által kódolt fúziós protein kifejeződjön. A fúziós proteint azután szokásos módszerekkel, például affinitás kromatográfiával tisztíthatjuk.

Fúziós proteineket, amelyek egy CBEL-t és egy kémiai anyag peptidet tartalmaznak a találmány értelmében, kémiai úton is előállíthatunk.

Ha a találmányunk szerinti készítményeket fúziós proteinek formájában készítjük el, akkor a CBEL és a kémiai anyag peptid • ···· közvetlenül szomszédos lehet egymással, azaz a CBEL karboxil vége közvetlenül kapcsolódhat a kémiai anyag aminovégéhez vagy megfordítva. A másik lehetőség, hogy a fúziós protein további aminosav gyököket is tartalmaz a CBEL és a kémiai anyag között úgy, hogy ezek a további aminosav gyökök áthidalóként szolgálnak a CBEL és a kémiai anyag peptid között. Általában előnyös a rövid peptid lígandumok alkalmazása részben azért, mert a rövid peptideket könnyebb módosítani és részben azért, mert a további aminosav gyökök jelenléte és főleg jelentős mennyiségű további aminosav gyök jelenléte megzavarhatja a peptid ligandumnak azt a funkcióját, hogy kiváltsa a kémiai anyag endocitózissal való internalizálódását.

A találmányunk szerinti készítmények tartalmazhatnak továbbá egy proteáz emésztési helyet, amely úgy helyezkedik el, hogy ha a készítmény bekerült a sejt belsejébe a kémiai anyag le tud válni a CBEL-ről, az emésztési hely proteolizisével. Az ilyen emésztési helyek természetesen előfordulnak a gp350/220 glikoproteinben az 1. szekvencia azonosítószámú szegmentum szomszédságában, így a készítmény CBEL része könnyen kiterjedhet annyira, hogy magában foglaljon ilyen helyeket. Egy ilyen protein érzékeny áthidalót beépíthetünk függetlenül attól, hogy a készítményt kémiailag vagy egy genetikailag módosított szervezetben expressziós peptidként állítjuk elő. Az utóbbi esetben a proteáz érzékeny áthidalót kódoló nukleotidokat inszertálhatunk a hibrid génbe a CBEL-t kódoló szegmentum és a kémiai anyag peptidet kódoló szegmentum közé a szakterületen jól ismert technikákkal.

Találmányunk további tárgya eljárás egy kívánt hatás specifikus elérésére CR2-t expresszáló sejtekben, amelyek egy CR2-t • · ··· ·· ·

- 16 nem expresszáló sejteket is tartalmazó populációban vannak jelen. Az eljárás értelmében a sejtpopulációkat egy olyan készítménnyel érintkeztetjük, amely egy CBEL-t tartalmaz egy kémiai anyaghoz kapcsolva, mely a kívánt hatást sejten belül kiváltja. A találmány szerinti készítmények kevert sejtpopulációban szelektíven kötődnek a CR2-t expresszáló sejtekhez, aminek révén megindul a készítmény endocitózisa a sejtekbe és a kémiai anyag kifejti hatását a CR2-t expresszáló sejtekben.

Találmányunk megvalósítása során a peptidek és a nukleinsavak peptidek expresszálására való manipulálása során szokásos technikákat alkalmazunk, hacsak kifejezetten mást nem adunk meg. Az oligopeptidek és az oligonukleotidek konjugálására szolgáló technikák a szakirodalomból ismeretesek és azokat leírják például a következő közleményekben [T. Zhu és munkatársai, 3 Antisense Rés. Dev. 265 (193); T. Zhu és munkatársai, 89 Proc.

Nat'1 Acad. Sci. USA 7934 (1992); P. Rigaudy és munkatársai, 49

Cancer Rés. 1836 (1989)].

Mint arra már kitértünk a találmányunk szerinti kompozíciókban alkalmazhatók peptidek CBEL-ekként és a készítmények kémiai anyagokat is tartalmaznak, amelyek szintén lehetnek peptidek vagy peptid tartalmúak. A találmány szerint alkalmazható peptideket bármilyen ismert technikával előállíthatjuk, beleértve a szerves szintézist és a rekombináns DNS módszereket. A peptidek kémiai előállítására szolgáló technikákat írnak le például a következő irodalmi helyeken [B. Merrifield és munkatársai, 21 Biochemistry 5020-31 (1982); Houghten, 82 Proc. Nat¹1 Acad. Sci. USA 5131-35 (1985)] . A peptidek más molekulákkal való kémiai konjugálására szolgáló technikák ismeretesek a szakirodalomban.

• · • · • · · • ····

Egy találmány szerinti fúziós proteint előállíthatunk egy olyan nukleinsav megfelelő gazdaszervezetben végzett expresszálásával, mely nukleinsav egy CBEL-t kódoló oligonukleotidot tartalmaz, amint azt fent leírtuk, és tartalmaz egy kémiai anyag peptidet kódoló oligonukleotidot is. A rekombináns fúziós proteinek előállítására szolgáló ilyen technikák jól ismertek a szakirodalomban és általánosságban leírják őket például a következő szakmunkában [J. Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., 1989)]. Az ilyen technikákban jól alkalmazható reagensek, úgymint restrikciós enzimek és más hasonlók, széles körben ismeretesek a szakterületen és a kereskedelemben számos gyártó bármelyikétől beszerezhetők.

Az alábbiakban ismertetjük az olyan készítmények létrehozását, amelyek egy CBEL-t és egy kémiai anyag peptidet tartalmaznak a találmány értelmében, hivatkozással azokra a példákra, amelyekben egy CBEL-t a ricin A citotoxikus kémiai anyag peptiddel konjugálunk. A ricin egy toxikus glikoprotein, amit a ricinusolaj termel (Ricinus communis) két alegyeségből áll, az A lánc ból és a B láncból, melyek mindegyike körülbelül 30 kD molekulatömegű és egy diszulfidkötés kapcsolja őket össze. A ricint, mint nagyméretű prekurzort szintetizálják, amelyet feldolgoznak és így érett ricin A láncot és B lánc alegységeket kapnak. Az A lánc egy enzim, amely hasít egy glikozidos kötést a 28S riboszomális RNS-ben, ezáltal rombolva a riboszomák proteinszintetizáló képességét. Az A lánc percenként körülbelül 1500 riboszómát tud inaktiválni, ami azt jelenti, hogy egyetlen internalizálódott ricin A molekula is halálos egy sejtre [S. Olsnes és munkatársai, Ribosome inactivation by the toxic lectins abrin and ricin, 60 Eur.

····

- 18 J. Biochem. 281 (1975)] . A B lánc egy sejt felszínén a galaktóz csoportokhoz kötődik, ami szükséges a ricin internalizálódásához. A B lánc eltávolítása megakadályozza, hogy az A lánc belépjen egy sejtbe, így ez az A láncot hatástalanná teszi. A ricin A láncot egy CBEL-hez kapcsolva lehetővé válik, hogy a ricin A lánc receptor által közvetített endocitózissal belépjen a sejtbe, így egy aktív citotoxint kapunk.

Az 1. példában a készítményt kémiai konjugálással hozzuk létre, a 2. példában a készítményt rekombináns fúziós proteinként állítjuk elő.

1. példa

Ecy CBEL és ricin A kémiai konjugálása

Szemléltetésül az 1A. és 1B. ábrákon bemutatott kétlépéses eljárással a Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (szekvencia azonosítószám:1) aminosav szekvenciájú CBEL-t kémiailag konjugáljuk a ricin A citotoxikus kémiai anyag peptiddel.

Az 1. lépésben a CBEL-t (gyártja a Peptide International, Kentucky, USA) aktiváljuk m-maleimido-benzoil-N-hidroxi-szulfoszukcinimid-észterrel (sulfo-MBS; gyártja a Pierce, Rockford, Illinois, USA) reagáltatva lényegében úgy, ahogy azt a gyártó utasításaiban le van írva. Röviden a CBEL-t összekeverjük sulfo-MBS-szel 1:10 molarányban PBS pufferben (20 mM nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, pH=7,0) 2 óra hosszat szobahőmérsékleten.

A kapott aktivált peptidet FPLC-vel tisztítjuk Superose 12-t (gyártja a Pharmacia) alkalmazva szokásos módszerekkel.

A 2. lépésben a maleimiddelaktivált peptidet deglikozilezett ricin A-val (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)

-19reagáltatjuk 1:5 molarányban összekeverve PBS pufferben 1 órát szobahőmérsékleten. A reagálatlan peptid molekulákat eltávolítjuk a CBEL-Ricin A konjugátumból egy éjszakán át 4 °C-on végzett dialízissel olyan membránon keresztül, melynek elválasztási értéke 6-8 kD.

A kapott kompozíció molekula tömegét elektroforézissel meghatározva körülbelül 32 kD-nek becsültük; az elektroforézist 10%-os SDS-PAGE gélen végezzük [U. Laemmli, 227 Natúré 680 (1970)]. így az eszerint a példa szerint előállított készítmény egy CBEL-t tartalmaz egy molekula ricin A-ra számítva. A három dimenziós kompjuteres modellezés azt mutatja, hogy a CBEL legvalószínűbben a ricin A molekula C-terminális végén levő Cys csoporthoz kapcsolódik, mivel az N-terminális Cys csoport hozzáférhetetlenül helyezkedik el az összehajtogatódott ricin A molekula belsejében.

2. példa

Egy CBEL-t és ricin A-t tartalmazó rekombináns protein

Rekombináns DNS technológiával egy fúziós proteint állítunk elő, mely tartalmaz egy CBEL-t, melynek aminosav szekvenciája Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (szekvencia azonosítószám:1) és tartalmazza a ricin A citotoxikus kémiai anyag peptidet. Röviden a példa szerinti fúziós proteint úgy állítjuk elő, hogy egy E. coli expressziós vektorban egy a ricin A-t kódoló polinukleotidtól lefelé egy a CBEL-t kódoló szintetikus oligonukleotidőt inszertálunk, a fúziós proteint nagy kitermeléssel expresszáljuk egy E. coli gazdaszervezetben, majd a fúziós proteint megtisztítjuk a sejt lízistermékeitől affinitás kromatográfiával.

• ·· ·

Amint az a 2A-2D. ábrákon látható a CBEL-t és ricin A-t tartalmazó fúziós proteint a következőképpen állítjuk elő rekombináns DNS technológiával. A 2A. ábra szerinti pTrcHis B (Invitrogen, San Diego, California) E. coli expressziós vektort, mely egy többszörös klónozó helyet (MCS) tartalmaz, egy transzlációs kezdőponttól (ATG) lefelé Ncol és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk és a kapott ragadós végeket tompa végekké alakítjuk T4 DNS polimerázzal és pTrc B képzésére újra ligáljuk (2B. ábra). A pAKG plazmidból (kaptuk Róbert Weaver-től, University of Kansas, Lawrence; ismertetése R. C. Halling és munkatársai közleményében, 13 Nucleic Acids Rés. 8019 (1985)) elkülönítünk egy 863 bázispárnyi BamHI-KpnI fragmentumot, mely a ricin A-t kódolja és BamHI-gyei és KpnI-gyei emésztetett pTrc B-be klónozzuk. Ezután BamHI-gyei emésztjük a ragadós végeket tompa végekké alakítjuk T4 DNS-polimerázzal és újra ligáljuk, így a klónozott gén transzlációjához megfelelő leolvasó keretet kapjuk (2C. ábra).

A kapott módosított pTrc B vektort, mely egy ricin A-t kódoló szekvenciát tartalmaz, ezután KpnI-gyei és EcoRI-gyel emésztjük és hozzáligáljuk a következő szintetikus oligonukleotidet, amely a CBEL-t kódoló nukleotid csoportokat és a KpnI és EcoRI helyeken való klónozással kompatibilis ragadós végeket tartalmaz .

(Szekvencia azonosítószám: 4) 5'- CA AAT TTT AAT GAA GAT CCT (Szekvencia azonosítószám: 5) 3'- CAT GGT TTA AAA TTA CTT CTA GGA (Szekvencia azonosítószám: 6)

Asn Phe Asn Glu Asp Pro “· ··· · • · · ·«· *·· • « • ··

(Szekvencia	azonosítószám:	4)	GGT	TTT	TTC	AAT	GTT	GAG	CAT	CAT
(Szekvencia	azonosítószám:	5)	CCA	AAA	AAG	TTA	CAA	CTC	GTA	GTA
(Szekvencia	azonosítószám:	6)	Gly	Phe	Phe	Asn	Val	Glu	His	His

Szekvencia	azonosítószám:	4)	CAT	CAT	CAT	CAT	TAA	G -3 '
Szekvencia	azonosítószám:	5)	GTA	GTA	GTA	GTA	ATT	CTT AA - 5
Szekvencia	azonosítószám:	6)	His	His	His	His

A kapott vektor (2D. ábra) egy hibrid gént tartalmaz, amely egy ricin A-proteáz hely-ligandum-His 6 fúziós proteint kódol, ahol proteáz hely jelentése egy proteáz emésztési hely vagy egy fent ismertetett proteázra érzékeny áthidaló, ligandum jelentése CBEL és His 6 6 egymást követő His csoportból álló szakaszt jelent, amelynek feladatát az alábbiakban ismertetjük. A kapott plazmidot ezután E. coli sejtek transzformálására használjuk és a transzformánsokat LB közegen kiválogatjuk és növesztjük [J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972)] . A sejteket ezután lízisnek vetjük alá és a rekombináns fúziós proteint affinitás kromatográfiával tisztítjuk egy nikkel töltetű gyantát tartalmazó oszlopon (PROBOND, Invitrogen, San Diego, California, USA). A fúziós protein C-terminuszánál levő His gyök elektrosztatikusán kötődik a PROBOND gyanta nikkel atomjaihoz. A megkötött fúziós proteint tartalmazó gyantát azután a szennyezők eltávolítására mossuk. Ezután az elektrosztatikus kötéseket megbontjuk és a fúziós proteint egy imidazoltartalmú eluáló pufferrel eluáljuk, amely kiszorítja a His csoportokat a nikkel töltetű gyantáról.

Ezt a tisztítást a gyártó kézikönyve szerint végeztük.

• * ···#

·. :··· • Ϊ w«<* . példa

A 2. példában leirt módon rekombináns DNS technológiával egy olyan fúziós proteint állítunk elő, amely egy Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (szekvencia azonosítószám:1) aminosav szekvenciájú CBEL-t és ricin A citotoxikus kémiai anyag peptidet tartalmaz; azzal az eltéréssel, hogy a hat egymást követő His csoportot kihagyjuk. így a módosított pTrc B vektor EcoRI-gyel és KpnI-gyel végzett emésztése után a következő szintetikus oligonukleotidot ligáljuk hozzá, mely oligonukleotid tartalmazza a CBEL-t kódoló nukleotid csoportokat és a KpnI és EcoRI helyeken való klónozással kompatibilis ragadós végeket.

(Szekvencia azonosítószám: 7) 5'- CA AAT TTT AAT ATC CAT CTC

(Szekvencia (Szekvencia	azonosítószám azonosítószám	: 8) 3 ' : 9)	- CAT	GGT	TTA Asn	AAA Phe	TTA Asn	TAG Ile	GTA His	GAG Leu
(Szekvencia	azonosítószám	: 7)	ACG	GGT	GAA	GAT	CCT	GGT	TTT	TTC
(Szekvencia	azonosítószám	: 8)	TGC	CCA	CTT	CTA	GGA	CCA	AAA	AAG
(Szekvencia	azonosítószám	: 9)	Thr	Glu	Glu	Asp	Pro	Gly	Phe	Phe
(Szekvencia	azonosítószám	: 7)	AAT	GTT	GAG	TAA	G	-3 ¹	1
(Szekvencia	azonosítószám	: 8)	TTA	CAA	CTC	ATT	CTT	AA	-5 '
(Szekvencia	azonosítószám	: 9)	Asn	Val	Glu
A kapott vektor egy hibrid	gént	tartalmaz, amely	egy	ricin

A-proteáz hely-CBEL fúziós proteint kódol, ahol proteáz hely jelentése egy proteáz emésztési hely vagy egy proteázra érzékeny áthidaló, amint azt fent leírtuk. A kapott plazmidot azután E.

coli sejtek transzformálására használjuk és a transzformánsokat

• · • * » • ».···

kiválogatjuk és LB közegben növesztjük. Az expresszált proteint elkülönítjük úgy, hogy a sejteket lízisnek vetjük alá 1 mg/ml lizozimmal, 20 mM nátrium-foszfáttal, pH=7,8 és háromszor 1 percig ultrahanggal kezeljük. Ilyen körülmények között a fúziós protein nem oldható, de a legtöbb E. coli protein oldható. A lizátumot 9000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk 30 percig és a kapott fúziós proteint tartalmazó pelletet újra centrifugálás előtt ismét szuszpendáljuk és 1 percig ultrahangos kezelésnek vetjük alá. Az újra szuszpendálási, ultrahangkezelési és centrifugálási lépéseket háromszor ismételjük. A végső pelletet, amely a fúziós protein egy viszonylag tiszta készítményét tartalmazza, feloldjuk egy 6 M karbamidot és 5 M ditio-treitolt tartalmazó oldatban. Ezt a feloldott fúziós proteint renaturáljuk úgy, hogy egymás után dializáljuk a következő anyagokkal szemben: 4 M karbamid; 2 M karbamid; és 20 mM nátrium-foszfát, 500 mM nátrium-klorid, pH=7,8.

4. példa

A 2. példában leírt módon rekombináns DNS technológiával egy olyan fúziós proteint állítunk elő, amely egy CBEL-t tartalmaz, melyben megtalálható a Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (szekvencia azonosítószám:!) aminosav szekvencia és tartalmazza a ricin A citotoxikus kémiai anyag peptidet; azzal az eltéréssel, hogy a fúziós proteinbe egy további cisztein csoportot viszünk be. Ez a szerkezet a kinyerhető fúziós protein nagyobb kitermelését biztosítja, mint a 2. példában, mert a szabad cisztein gyök a ricin A lánc C-terminális végén egy molekulák közötti diszulfid hidat tud képezni az új cisztein gyökkel a E. coli proteinek helyett. A pTrcHis A E. coli expressziós vektort (Invitrogen, San Diego, California, USA), mely hasonlít a 2A. ábra szerinti pTrcHis B vektorhoz, azzal az eltéréssel, hogy más leolvasási kerete van Ncol és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Ezután a vektorhoz egy szintetikus DNS-t ligálunk, amely hat egymást követő hisztidin gyököt kódol és Ncol és BamHI ragadós végei vannak. A pAKG plazmidot BamHI-gyei emésztjük és a keletkezett 893 bázispárnyi fragmentumot agaróz gélen végzett elektroforézis után elektro elucióval kinyerjük. Ezt a fragmentumot a BamHI-gyei és borjú vékonybél alkálikus foszfatázzal emésztett módosított pTrcHis A vektorba ligáijuk. A ligáló keveréket XL-1 E. coli törzs (Stratagene, La Jolla, California, USA) transzformálására alkalmazzuk. A transzformánsokat kiválogatjuk és a vektorban a BamHI fragmentum orientációját BglII-vel végzett emésztéssel meghatározzuk. Egy olyan transzformánsból származó DNS-t, amelyben a ricin A gén a transzláció szempontjából helyes orientációban van Sacl-gyel és EcoRI-gyel emésztünk és hozzáligáljuk a következő szintetikus oligonukleotidet, amely a CBEL-t kódoló nukleotid gyököket és a SacI és EcoRl helyeken való klónozással kompatibi-

lis ragadós (Szekvencia (Szekvencia (Szekvencia	végeket tartalmaz.	C 3AG	GAA CTT Glu	GAT CTA Asp	CCT GGA Pro	GGT CCA Gly	TTT AAA Phe
azonosítószám: azonosítószám: azonosítószám:	10) 11) 1)	5 ' - 3'- TC C
(Szekvencia	azonosítószám:	10)	TTC	AAT	GTT	GAG	TAA G	-3 '
(Szekvencia	azonosítószám:	11)	AAG	TTA	CAA	. CTC	ATT CTT AA -5
(Szekvencia	azonosítószám:	1)	Phe	Asn	Val	Glu

A ligáit DNS-t BLR E. coli törzsbe (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) transzformáljuk, mint expressziós gazdába; ez egy recA törzs, amelyből hiányoznak a ion és ompT proteázok.

A rekombináns proteint elkülönítjük a transzformált sejteket ampicillin jelenlétében növesztve 37 °C-on. Amikor a tenyészet eléri a 0,6-0,8 optikai sűrűséget (600 nm) az expresszió kiváltására izopropil-tio-galaktozidot (IPTG) adunk 1 mM végső koncentrációig. További 3 óra növekedés után a sejteket összegyűjtjük és egy olyan pufferben szuszpendáljuk, amelynek összetétele a következő: 10 mM Tris-HCL, pH=7,6, 100 mM KCl, 20 mM EDTA, 10 mM 2-merkapto-etanol, 0,05% Nonídet P-40, és 0,5 mg/ml, lizozim és 15 percig inkubáljuk jeges fürdőn. A kapott lizátumot ultrahangkezelésnek vetjük alá 0,5 nM fenil-metil-szulfonil-fluorid jelenlétében és 9000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk 30 percig, 4 °C-on. Az oldható proteinek kicsapására ammónium-szulfátot adagolunk 40%-os telítettségig és a kicsapódott pelletet feloldjuk és dializáljuk a következő összetételű eleggyel szemben: 10 mM Tris HC1, pH=7,4, 100 mM KCl. A dializátumot egy erős anioncserélő oszlopra visszük (Q Sepharose Fást Flow, Pharmacia), amelyet ugyanezzel a pufferrel ekvilibráltunk. Ilyen körülmények között a bakteriális protein szinte teljes egészében az oszlophoz kötődik és a meg nem kötődött frakció lényegében tisztított, rekombináns proteint tartalmaz. A rekombináns proteint tovább tisztítjuk a következő összetételű eleggyel szemben dializálva.- 4 M karbamid, 20 mM nátrium-foszfát, 500 mM nátrium-klorid, pH=7,8. A dializátumot átengedjük egy oszlopon, amely nikkel töltetű PROBOND gyantát tartalmaz és ötször mossuk a következő összetételű eleggyel: 4 M karbamid, 20 mM nátrium-foszfát, 500 mM nátrium26 • · · · · · » · · • · · · · · • · • · · ·

-klorid, 5 mM imidazol, pH=6,0. A rekombináns proteinben levő 6 hisztidin gyök azt eredményezi, hogy a rekombináns protein affinitási kölcsönhatással a gyantához kötődik. Az oszlopot még kétszer mossuk ugyanezzel a pufferrel, azzal az eltéréssel, hogy az imidazol koncentrációt 30 mM-re emeljük. A rekombináns proteint ugyanazzal a pufferrel eluáljuk, azzal az eltéréssel, hogy az imidazol koncentráció 300 mM. Az eluált proteint azután renaturáljuk és csavart szerkezetét helyreállítjuk úgy, hogy először 2 M karbamiddal, majd 20 mM nátrium-foszfáttal és 500 mM nátrium-kloriddal (pH=7,8) szemben dializáljuk.

5. példa

Egy citotoxin célzott bejuttatása B sejtekbe

Az alábbiakban egy kémiai anyag célzott bejuttatását szemléltetjük CR2-t kifejező B sejtekbe CBEL-t és a kémiai anyagot tartalmazó találmány szerinti készítmény alkalmazásával. Ennek során egy ricin A-t és egy CBEL-t tartalmazó készítményt juttatunk be in vitro Raji B limfoblasztoid sejtekbe, specifikus citotoxikus hatás elérésére a CR2-t kifejező B sejtekben.

Egy előzetes vizsgálat során 1 χ 10θ CR2⁺ Raji B limfoblasztoid sejtet inkubálunk 24 órát, 37 °C-on, 1 ml RPMI 1640 tenyésztő közegben (Hyclone, Logan, Utah, USA) minden egyéb kezelés nélkül; 1 ml tenyésztőközegben, amely az 1. példa szerinti ricin A-CBEL készítmény 20 μg-ját tartalmazza; vagy 1 ml csak ricin A-t tartalmazó tenyésztőkőzegben. Az inkubálást követően a sejtek pusztulási arányát tripán kékkel végzett festéssel és hemacitométerrel egy invert mikroszkóp alkalmazásával végzett sejtszámolással határozzuk meg. A tripán kéket az elpusztult • · · · • · · · · · · • · · ·· · ·· • · ··· ······ • · ····· · _ 27 - ...........

sejtek sejten belül felveszik és az kék színt kölcsönöz nekik. A sejtek egy alikvot részét kétszer hígítjuk 0,4%-os tripán kék festékben (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) és 5 percig inkubáljuk a számolás előtt. Az élő sejtek %-os arányát a következőképpen számítjuk ki: nem festődött sejtek mennyisége egységnyi térfogatban osztva a megfestődött és a nem festődött sejtek teljes számával és a hányadost szorozva 100-zal.

A csupán ricin A-val kezelt sejtek és a kontroll sejtek egészségesnek látszanak. A ricin A-CBEL készítménnyel kezelt sejtek körülbelül 99%-a elpusztult (1%-os túlélés). Mivel a ricin A csak akkor citotoxikus, ha a sejt belsejébe jut (internalizálódik) ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti ricin A-CBEL készítmény a citotoxikus kémiai anyag internalizálódását eredményezi.

6. példa

A 2. példa szerinti rekombináns CBEL-ricin A fúziós protein hatását CR2⁺ emberi B limfoblasztoid (Raji) sejtekre és CR2~ T (HSB2) sejtekre a következőképpen vizsgáljuk. 1 x 10® sejt szuszpenzióját alaposan összekeverjük a tisztított rekombináns fúziós protein változó koncentrációival 1 ml tenyésztőközegben és 24 órát inkubáljuk 37 °C-on. Azután a sejtek életképességét meghatározzuk tripán kékkel végzett festésükkel az 5. példában leírt módon. Amint a 3. ábra mutatja a CR2⁺ sejtek (sötétebb oszlop) a konjugátummal való kezelésre dózisfüggő módon reagáltak, míg a CR2” sejteket (világosabb oszlopok) a kezelés nem befolyásolta. 50 ^g/ml fúziós protein koncentrációnál a CR2^- B sejtek túlélése 10%-nál kisebb és a CR2~ sejtek túlélése 100%. Mindkét • · · · • · sejttípus esetében hatástalan volt az akár az önmagában CBEL-lel, akár az egymagában rekombináns ricin A-val végzett kezelés, ami alátámasztja azt a következtetést, hogy a rekombináns CBEL-ricin A fúziós protein a CR2 ⁺ sejtekre kifejtett toxikus hatása a rekombináns fúziós proteinnek a B sejteken elhelyezkedő CR2-receptorokon keresztül való internalizálódásának következménye.

7. példa

A 6. példában leírt eljárást követjük, azzal az eltéréssel, hogy az élő sejtek %-os arányát egy kolorimetriás módszerrel határozzuk meg a 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil)-5-(3-karboxi-metoxi-fenil)-2 -(4-szulfofenil)-2H-tetrazólium, belső só; MTS, tetrazólium vegyület alkalmazásával és egy elektrokapcsoló reagenssel (fenazin-metoszulfát; PMS). Az MTS a sejtekben biológiai úton egy formazánná redukálódik, ami oldható a szövet tenyésztési közegben. A formazán abszorbanciája 490 nm-nél közvetlenül mérhető 96 üregű vizsgálati lemezekről járulékos eljárás nélkül. A formazán termék mennyisége 490 nm-en mért abszorbanciája alapján közvetlenül arányos a tenyészetben levő élő sejtek számával. Az MTS vizsgálathoz szükséges reagenseket a Promega Corp.-tól (Madison, Wisconsin, USA) szereztük be. Az eredmények lényegében azonosak a 6. példában kapott eredményekkel.

8. példa

A 3. példa szerinti rekombináns CBEL-ricin A fúziós protein hatását vizsgáljuk CR2⁺ emberi B limfoblasztoid (Raji) sejteken és CR2 ^_ emberi T (HSB2) sejteken a 6. példa szerinti eljárással.

Az eredmények lényegében azonosak a 6. példában kapottakkal.

9. példa

A 4. példa szerinti rekombináns CBEL-ricin A fúziós protein hatását vizsgáljuk CR2⁺ emberi B limfoblasztoid (Raji) sejteken és CR2 emberi T (HSB2) sejteken a 6. példa szerinti eljárással. Az eredmények lényegében azonosak a 6. példában kapottakkal.

A találmány szerinti CBEL-kémiai anyag készítmény alkalmazható egy kémiai anyag célzott specifikus bejuttatására CR2-t kifejező sejtekbe, általában úgy, hogy a CR2-t kifejező sejteket olyan körülmények között érintkeztetjük a készítménnyel, amelyek között a CBEL kiváltja a készítmény endocitózisát a CR2-t kifejező sejtekbe. A kémiai anyag ezután a megcélzott sejten vagy sejten belül fejti ki hatását, amelybe a készítmény internalizálódott és a hatóanyag kívánt hatása azokra a sejtekre korlátozható, amelyek fenotípusa CR2⁺.

így például egy találmány szerinti CBEL-citotoxikus anyag készítmény alkalmazható hatásos bemenetellenes szerként in vivő CR2⁺ B sejtek szelektív elpusztításával. A készítményt előnyösen szisztémás beadással alkalmazzuk, általában szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás injekció alakjában vagy intraperitoneális beadással. Az ilyen alkalmazásra szolgáló injekciós készítményeket szokásos formában állíthatjuk elő, akár folyékony oldat vagy szuszpenzió alakjában vagy szilárd formában, amely alkalmas egy oldattá vagy szuszpenzióvá alakításra egy folyékony közegben befecskendezés előtt vagy emulzió alakjában. Alkalmazható segédanyagok például a víz, konyhasóoldat, dextróz, glicerin, etanol és más hasonlók; és kívánt esetben kis mennyiségben olyan segédanyagok is alkalmazhatók, mint nedvesítő- vagy emulgálószerek, pufferek és más hasonlók.

• · • · · · · · « • · · · • · ······

A készítményt a sejtekkel in vivő vagy in vitro hozhatjuk érintkezésbe. A CR2-t kifejező sejtek alkothatják (és a legtöbb esetben várható is, hogy alkotják) egy kevert típusú sejt populáció egy alpopulációját; a találmány szerinti peptid ligandum biztosíthatja a konjugátum CR2-specifikus endocitózisát a CR2-t kifejező sejtekbe.

A kémiai anyagnak számos kívánt hatása lehet a megcélzott sejtben. Amint azt már említettük, bizonyos különösen hasznos megvalósítási módok esetében a kémiai anyag csak akkor hat egy sejtre, hogyha az a sejtbe internalizálódik vagy lényegében ínternalizálódik.

10. példa

Egy CBEL-antigén hatású anyag célzott bejuttatása a B sejtekbe

Egy CBEL-t és egy antigént tartalmazó találmány szerinti készítményeket beadhatunk melegvérű állatoknak egy immunválasz célzott kiváltására CR2⁺ sejtekben. Közelebbről a CBEL biztosítja az antigén CR2-közvetítette internalizálódását a sejtekbe és egy antitesttől független reakcióút beindulását eredményezheti komplementer aktiválásra a megcélzott sejtekben. A találmány szerint tehát a megcélzott sejteket arra serkenthetjük, hogy immunválaszt adjanak egy olyan antigénnel szemben, amelyet nem ismernek.

Egy a 2. szekvencia azonosítószámú aminosav szekvenciát tartalmazó CBEL kémiai konjugációját aktiváljuk, majd csirke lizozimhoz kapcsoljuk (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) az 1. példában leírt módon. A CBEL-lizozim konjugátumot azután ·· · ·· ···

szisztémásán beadjuk egy egérnek. A C3dg CBEL (szekvencia azonosítószámú) az egér B sejtekhez való specifikus kötődést biztosít és elindítja a konjugátum CR2-receptor kiváltotta endocitozisát. A konjugátum ezután a megcélzott B sejtek immunválaszát váltja ki a konjugátumon hordozott epitópokkal szemben, beleértve olyan epitópokat is, amelyek egyediek a konjugátum lizozim részére. Ennek a példának az eredményeit lényegében lemásolhatjuk egy CBEL-lizozim fúziós protein létrehozásával.

11. példa

B sejt leukémia kezelésére emberben (a) készítünk egy találmány szerinti készítményt, amely tartalmaz egy CBEL-t úgymint a EBV CBEL-t (szekvencia azonosítószám:1) vagy egy ezzel lényegében homológ peptidet és egy citotoxint, úgymint ricin A-t és (b) a készítmény egy hatásos mennyiségét szisztémásán beadjuk egy betegnek. Az ilyen készítményt előállíthatjuk például a 3. példában leírt módon. Az EBV CBEL be tud jutni az érett emberi B sejtekbe és a ricin A citotoxikus bármilyen sejtre, amelybe bejuttatják. A készítmény egy hatásos mennyiségét szisztémásán adjuk be a betegnek úgy, hogy a készítmény belépjen a véráramba és érintkezésbe kerüljön a B sejtekkel. A CBEL hatására a készítmény hozzákötődik a B sejteken levő CR2-receptorhoz és kiváltja a készítmény internalizálódását andocitozissal. A ricin A citotoxin azután elpusztítja a sejtet a riboszomák tönkretételével. Ez az eljárás csökkenti a rosszindulatú B sejtek számát a beteg testében, ezáltal jó hatással van a betegség kezelésében.

12. példa

A 11. példa szerinti eljárással egy autoimmun betegséget például lupus erythematosus-t vagy rheumatoid arthritis-t kezelhetünk. Ha a B sejtekbe beszállítottuk a citotoxin megöli a sejteket, így csökkenti az autoantitesteket képző B sejtek számát és ezáltal jó hatású a betegség kezelésében.

SZEKVENCIA LISTA (1) Általános információ:

(i) Bejelentő: Ramesh K. Prakash (ii) A találmány címe: Kémiai anyagok bejuttatása egy specifikus sejttípus sejtjeinek belsejébe (iii) Szekvenciák száma: 11 (iv) Levelezési cím:

(A) Cím: Thrope, North & Western (B) Utca: 9035 South 700 East, Suite 200 (C) Város: Sandy (D) Állam: Utah (E) Ország: USA (F) Postai irányítószám: 84070 (v) Kompjuterrel olvasható forma:

(A) Médium típusa: Diskette, 3.5 inch,

720 Kb storage (B) Kompjuter: Toshiba Satellite T1800 (C) Operációs rendszer: DOS 6.0 (D) Program: Word Perfect 6.0 (vi) Jelen bejelentés adatai:

(A) Bejelentési szám:

(B) Bejelentés napja:

(C) NSZO osztályozás:

• · · (vii) Korábbi bejelentési adatok:

(A) Bejelentési szám:

(B) Bejelentési nap:

(viii) Szabadalmi ügyvivőre vonatkozó információ:

(A) Név: Alán J. Howarth (B) Regisztrálási szám: 36,553 (C) Aktaszám/hivatkozási szám: T2361 (ix) Telekommunikációs információ:

(A) Telefon: (801) 566-6633 (B) Telefax: (801) 566-0750 (2) Információ az 1. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 9 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) Szekvencia leírás: az 1. azonosítószámú szekvenciához

Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu

5 (2) Információ a 2. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 11 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) Szekvencia leírás: a 2. azonosítószámú szekvenciához Glu Asp Pro Gly Lys Asn Leu Tyr Asn Val Glu

5 10 (2) Információ a 3. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 4 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) Szekvencia leírás: a 3. azonosítószámú szekvenciához

Glu Asp Pro Gly (2) Információ a 4. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 60 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ix) Szekvencia leírás: a 4. azonosítószámú szekvenciához

CAAATTTTAA

TGAAGATCCT GGTTTTTTCA ATGTTGAGCA TCATCATCAT

CATCATTAAG • · · · (2) Információ az 5. azonosítószámú szekvenciához: (i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 68 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ix) Szekvencia leírás: az 5. azonosítószámú szekvenciához

AATTCTTAAT

GATGATGATG ATGATGCTCA ACATTGAAAA AACCAGGATC

TTCATTAAAA

TTTGGTAC (2)

Asn

Információ a 6. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 18 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) Szekvencia leírás: a 6. azonosítószámú szekvenciához Phe Asn Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu His His

His His His His (2) Információ a 7. azonosítószámú szekvenciához: (i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 57 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris • · (ix) Szekvencia leírás: a 7. azonosítószámú szekvenciához

CAAATTTTAA TATCCATCTC ACGGGTGAAG ATCCTGGTTT TTTCAATGTT GAGTAAG 57 (2) Információ a 8. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 65 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ix) Szekvencia leírás: a 8. azonosítószámú szekvenciához

AATTCTTACT CAACATTGAA AAAACCAGGA TCTTCACCCG TGAGATGGAT 50

ATTAAAATTT GGTAC 6 5 (2) Információ a 9. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) Szekvencia leírás: a 9. azonosítószámú szekvenciához Asn Phe Asn Ile His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe

10

Asn Val Glu ···

- 38 (2) Információ a 10. azonosítószámú szekvenciához:

(i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 32 (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ix) Szekvencia leírás: a 10. azonosítószámú szekvenciához

CGAAGATCCT GGTTTTTTCA ATGTTGAGTA AG 32 (2) Információ a 11. azonosítószámú szekvenciához: (i) Szekvencia jellemzők:

(A) Hosszúság: 40 (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ix) Szekvencia leírás: a 11. azonosítószámú szekvenciához

AATTCTTACT CAACATTGAA AAAACCAGGA TCTTCGAGCT

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Készítmény egy kémiai anyagnak egy CR2-receptort hordozó sejt belsejébe való specifikus bejuttatására olyan sejt populációban, amely CR2-receptort nem hordozó sejteket is tartalmaz, azzal jellemezve, hogy egy olyan ligandumot tartalmaz, amely képes a CR2-receptorhoz kötődni és receptor kiváltotta endocitozist kiváltani és tartalmaz a ligandumhoz kapcsolva egy kémiai anyagot, amely a CR2-receptort hordozó sejt belsejébe bejuttatva egy kiválasztott hatást tud kiváltani.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a CR2-receptort hordozó sejt egy B limfocita.
3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a ligandum egy olyan peptid, amely tartalmazza az 1., 2.,

3., 6. vagy 9. szekvencia azonosítószámú aminosav szekvenciát.
4. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kémiai anyag egy citotoxin, egy transzformáló nukleinsav, egy gén regulator, egy jelölőanyag, egy antigén vagy egy gyógyszerhatóanyag .
5. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a ligandum és a kémiai anyag közé beiktatva egy kovalensen kötött áthidalót is tartalmaz.

»« ··» • · · • 9 · · · 9 9 • 9 99
6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az áthidaló biológiailag lebontható.
7. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az áthidaló egy peptid.
8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a ligandum egy az 1. szekvencia azonosítószámú szekvenciát tartalmazó peptid és a kémiai anyag ricin A.
9. Az 5. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az áthidaló biológiailag nem lebontható.
10. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egy hordozóanyagot is tartalmaz, amely vízoldható polimer, liposzóma vagy részecskékből álló anyag.
11. A 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hordozóanyag egy vízoldható polimer és a készítmény képlete [L-S_a]_b-C-[S_e-A]_f ahol L jelentése a CR2-receptorhoz kötődni képes és annak endocitozisát kiváltó ligandum; A jelentése kémiai anyag; S jelentése áthidaló; C jelentése vízoldható polimer, melynek a ligandummal, a kémiai anyaggal és az áthidalóval kovalens kötéseket létesíteni képes funkciós csoportjai vannak; a és e értéke 0 vagy 1; b és f értéke legalább 1 értékű egész szám.

• · · · • · ·····« ···· · « • · ···
12. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy C jelentése dextrán, inulin, poli(L-lizin) vagy metakril-amid-tartalmú polimer.
13. Eljárás egy kémiai anyag in vitro specifikus bejuttatására egy CR2-receptort hordozó sejtbe, egy olyan sejtpopulációban, amely CR2-receptort nem hordozó sejteket is tartalmaz, azzal jellemezve, hogy (a) előállítunk egy készítményt egy kémiai anyag specifikus bejuttatására egy CR2-receptort hordozó sejt belsejébe egy olyan sejtpopulációban, amely CR2-receptort nem hordozó sejteket is tartalmaz, mely készítmény tartalmaz egy ligandumot, amely kötődni tud CR2-receptorhoz és kiváltja a receptor kiváltotta endocitozist és tartalmaz egy kémiai anyagot a lígandumhoz kapcsolva, mely kémiai anyag egy CR2-receptort hordozó sejt belsejébe juttatva egy kiválasztott hatást vált ki; és (b) a sejtpopulációt a készítmény hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe olyan körülmények között, melyek között a ligandum hozzákötődik a CR2-receptort hordozó sejtek CR2-receptorához és a készítmény endocitózisát váltja ki.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 'hogy a CR2-receptort hordozó sejt egy B limfocita.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandum egy olyan peptid, amely tartalmazza az 1., 2.,

3., 6. vagy 9. szekvencia azonosítószámú aminosav szekvenciát.

• · • · ··· ··· · »*·
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kémiai anyag egy citotoxin, egy transzformáló nukleinsav, egy gén regulátor, egy jelölőanyag, egy antigén vagy egy gyógyszerhatóanyag.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandum és a kémiai anyag közé beiktatva egy kovalensen kötött áthidalót is tartalmaz.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az áthidaló biológiailag lebontható.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az áthidaló egy peptid.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandum egy az 1. szekvencia azonosítószámú szekvenciát tartalmazó peptid és a kémiai anyag ricin A.
21. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az áthidaló biológiailag nem lebontható.
22. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy hordozóanyagot is tartalmaz, amely vízoldható polimer, liposzóma vagy részecskékből álló anyag.

• · • * · ·· · · · » · · · * ·»· «·· • ·····» · · _ _ ·*·· ·· « «· ··»
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozóanyag egy vízoldható polimer és a készítmény képlete [L-S_a]_b-C-[S_e-A]_f ahol L jelentése a CR2-receptorhoz kötődni képes és annak endocitozisát kiváltó ligandum; A jelentése kémiai anyag; S jelentése áthidaló; C jelentése vízoldható polimer, melynek a ligándummal, a kémiai anyaggal és az áthidalóval kovalens kötéseket létesíteni képes funkciós csoportjai vannak; a és e értéke 0 vagy 1; b és f értéke legalább 1 értékű egész szám.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy C jelentése dextrán, inulin, poli(L-lizin) vagy metakril-amid-tartalmú polimer.
25. Eljárás egy kémiai anyag specifikus bejuttatására, egy melegvérű állat CR2-receptort hordozó sejtjébe, azzal jellemezve, hogy (a) előállítunk egy készítményt egy kémiai anyag specifikus bejuttatására egy CR2-receptort hordozó sejt belsejébe egy olyan sejtpopulációban, amely CR2-receptort nem hordozó sejteket is tartalmaz, mely készítmény tartalmaz egy a CR2-receptorhoz kötődni képes és receptor kiváltotta endocitózist kiváltó ligandumot, és a ligandumhoz kapcsolva egy kémiai anyagot, mely a CR2-receptort hordozó sejt belsejébe bejuttatva egy kiválasztott hatást fejt ki; és * 9 9 » >

• · ··»· ··· (b) a melegvérű állatnak szisztémásán beadjuk a készítményhatásos mennyiségét olyan körülmények között, amelyek között a ligandum érintkezésbe kerül és hozzákötődik a CR2-receptort hordozó sejtek CR2-receptoraihoz és a készítmény endocitózisát váltja ki.
26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a CR2-receptort hordozó sejt egy B limfocita.
27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandum egy az 1., 2., 3., 6. vagy 9. szekvencia azonosítószámú aminosav szekvenciát tartalmazó peptid.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hogy a kémiai anyag egy citotoxin, egy transzformáló nukleinsav, egy gén regulator, egy jelölőanyag, egy antigén vagy egy gyógyszerhatóanyag .
29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandum és a kémiai anyag közé beiktatva egy kovalensen kötött áthidalót is tartalmaz.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az áthidaló biológiailag lebontható.
31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az áthidaló egy peptid.

»· ···· « · ·»· ··· γ· ...·
32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandum egy az 1. szekvencia azonosítószámú szekvenciát tartalmazó peptid és a kémiai anyag ricin A.
33. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az áthidaló biológiailag nem lebontható.
34. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy hordozóanyagot is tartalmaz, amely vízoldható polimer, liposzóma vagy részecskékből álló anyag.
35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozóanyag egy vízoldható polimer és a készítmény képlete [L-Sa]_b-C-[S_e-A]f ahol L jelentése a CR2-receptorhoz kötődni képes és annak endocitozisát kiváltó ligandum; A jelentése kémiai anyag; S jelentése áthidaló; C jelentése vízoldható polimer, melynek a ligandummal, a kémiai anyaggal és az áthidalóval kovalens kötéseket létesíteni képes funkciós csoportjai vannak; a és e értéke 0 vagy 1; b és f értéke legalább 1 értékű egész szám.
36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy C jelentése dextrán, inulin, poli(L-lizin) vagy metakril-amid-tartalmú polimer.