CN116179609A - 一种提高透膜多肽基因转染效率的方法 - Google Patents

一种提高透膜多肽基因转染效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高透膜多肽基因转染效率的方法，是在透膜多肽固相合成过程中，在其肽链上引入(VGVAPG)n肽段，得到(VGVAPG)n改性的透膜多肽。本发明提供的在透膜多肽上引入(VGVAPG)n肽段的方法，可以通过多肽的空间构象特异性地与细胞膜表面弹性蛋白结合蛋白结合，从而增强透膜多肽/核酸复合物与细胞膜的相互作用，从而增强细胞转染效率。

Description

一种提高透膜多肽基因转染效率的方法
技术领域
本发明属于基因领域，具体涉及一种提高透膜多肽基因转染效率的方法。
背景技术
基因治疗是一种非常有前途的预防和治疗多种疾病的策略，包括癌症、传染病、心血管等疾病的预防治疗。但基因治疗的有效应用还需要克服一些障碍，如低细胞毒性和高转染效率的基因递送载体的开发，递送的基因在细胞中的摄取、内体逃逸和核转运。目前的基因传递系统主要由病毒和非病毒载体组成。病毒载体效率较高所以在基因传递中占主导地位，占临床试验所用载体的70％以上。但病毒载体存在安全性问题，如免疫原性、无法快速清除；另外病毒载体制造成本较高。而非病毒载体则有安全性高、易于生产和使用方便等优点。常见的非病毒载体包括无机纳米粒子、脂质体、高分子、多肽及复合体系等。
透膜多肽(cell-penetrating peptide,CPP)是一类非病毒载体，由大约5-30个氨基酸组成。透膜多肽可降解，易于合成和修饰，并且能够方便地与核酸形成非共价复合物用于细胞的基因转染。透膜多肽可以穿透细胞膜并通过能量依赖性或非能量依赖性机制将各种活性物质输送到细胞中。最常见的透膜多肽是HIV-1Tat肽，它已被应用于药物、蛋白质和DNA的细胞递送。虽然透膜多肽研究取得一定进展，可以成功递送基因进入并转染细胞，但目前透膜多肽的转染效率与病毒载体、高分子载体或脂质体类载体相比还是偏低。
为了提升透膜多肽的转染效率，通常的方法是优化主链序列，提升多肽与核酸的结合能力及进入细胞后的内膜逃逸能力。如RALA是由近年开发的一种基因递送透膜多肽(N-WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA-C)，它来源于融合肽，包括富含谷氨酸的GALA(N-WEAALAEALA EALAEHLAEA LAEALEALAA-C)和富含赖氨酸的KALA(N-WEAKLAKALA KALAKHLAKALAKALKACEA-C)。它已被开发用于宫颈癌DNA疫苗载体，以及RNAi递送的载体。为提高透膜多肽的内膜逃逸能力，有研究人员将RALA中的精氨酸替换为组氨酸，设计了一系列多肽命名为HALA，如HALA2(N-WEARLARALA RALARHLARA LAHALHACEA-C)。但这些改性方法在提升透膜多肽的细胞转染效率方面取得的效果依然有限。
针对透膜多肽转染效率不高的问题，有研究(Proc Natl Acad Sci U S A 2016,113,E291-299；Biomaterials 2019,216,119277)通过在透膜多肽上引入能与细胞膜表面糖胺多糖位点结合的多肽序列，可以增强透膜多肽与细胞的相互作用，从而提升透膜多肽的基因递送效率。如研究(Proc Natl Acad Sci U S A 2016,113,E291-299)采用21个氨基酸的肽段靶向糖胺多糖；但是，该研究是利用基因重组的大肠杆菌合成多肽，步骤繁琐、耗时长、成本高。如研究(Biomaterials 2019,216,119277)利用固相合成法合成多肽，采用长度为16个氨基酸的肽段靶向糖胺多糖；但是，由于固相合成多肽的长度不能过长，否则合成难度和提纯难度越高，产率越低，因此，靶向细胞表面受体的肽段越长，要保持原透膜多肽原有序列，势必增加合成难度和提纯的难度；如果缩短原透膜多肽的序列，降低合成及提纯的难度，那么就会削弱透膜多肽结合核酸的能力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、安全、高效的提高透膜多肽基因转染效率的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高透膜多肽基因转染效率的方法，是在透膜多肽固相合成过程中，在其肽链上引入(VGVAPG)n肽段，得到(VGVAPG)n改性的透膜多肽。
具体的，所述提高透膜多肽基因转染效率的方法，包括下述步骤：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入透膜多肽固相合成的树脂，清洗树脂并溶胀，沥干；然后在反应器中加入脱保护试剂，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将带保护基的氨基酸、多肽缩合剂溶解，然后加入反应器中，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入脱保护试剂，然后震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽从树脂上切除下来，然后纯化、冷冻干燥，得到干态的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽。
优选的，所述(VGVAPG)n肽段的氨基酸数量在6～108个之间。
优选的，步骤(2)和步骤(3)中，反应温度在15～30℃之间，压力为常压。
优选的，步骤(1)中，透膜多肽包括但不限于RALA (WEARLARALA RALARHLARALARALRACEA)，GALA(WEAALAEALA EALAEHLAEA LAEALEALAA)，KALA(WEAKLAKALA KALAKHLAKALAKALKACEA)，HALA系列多肽(如HALA2:WEARLARALA RALARHLARA-LAHALHACEA)，聚赖氨酸Ln(n在1-40之间)，聚精氨酸Rn(n在1-40之间)，Rn1Hn2Rn3(n1，n2，n3在0-8之间)，Rn1Wn2Rn3(n1，n2，n3在0-8之间)，Kn1Hn2Kn3(n1，n2，n3在0-8之间)，Mu peptide(MRRAHHRRRR ASHRRMRGG)，Protamine sulfate(RSSSRPVRRR RRPRVSRRRR RRGGRRRR)，Tat多肽(GRKKRRQRRR PPQ)，Rn(n在3-40之间)，Penetratin(RQIKIWFQNR RMKWKK)，PenArg(RQIKIWFQNR RMKWRR)，PenLys(KQIKIWFQNK KMKWKK)，Pep-1(KETWWETWWT EWSQPKKKRK V)，TP10(AGYLLGKINL KALAALAKKIL)，C6(RLLRLLLRLW RRLLRLLR),RWmix(RWRRWRRWRR WR)，RWR(RRRRWWWWRR RR),INF7(GLFEAIEGFI ENGWEGMIDG WYG),H5WYG(GLFHAIAHFI HGGWHGLIHG WYG),SV40衍生肽(GYGPKKKRKV GGC)，hnRNP M9(GNYNNQSSNF GPMKGGNFGG RSSGPYGGGG QYFAKPRNQG GY)，HA2(GLFGAIAGFI ENGWEGMIDG)，MPG(GALFLGFLGA AGSTMGAWSQ PKKKRKV)，SAP(VRLPPP)3，SAP(E)[Ac-CGGW(VELPPP)3]，CyLoP-1(CRWRWKCCKK),gH 625(HGLASTLTRW AHYNALIRAF)，CADY(Ac-GLWRALWRLL RSLWRLLWRA cysteamide)，L17E(IWLTALKFLG KHAAKHEAKQ QLSKL)，K10(QW)6(KKKKKKKKKK QWQWQWQWQW QW),H5-S413-PV(CVKRKKKPAK LVKKLLTKWL AHHHHH)。
优选的，步骤(2)中采用的氨基酸包括左旋和/或右旋氨基酸。
优选的，步骤(1)中，所述透膜多肽固相合成包括固相Fmoc合成法和固相Boc合成法；更优选的，所述多肽合成方法为固相Fmoc合成法。
优选的，所述(VGVAPG)n的n为1或任意大于1的自然数。
优选的，在肽链上引入(VGVAPG)n肽段的位置包括多肽N端、C端、主链上任意位置、任意支链上，及上述位置的任意组合。
优选的，在肽链上引入的(VGVAPG)n肽段包括正序或反序排列，如(VGVAPG)n或(GPAVGV)n。
优选的，步骤(1)中，所述透膜多肽固相合成树脂，包括但不限于2-Cl树脂、AM树脂、Wang树脂和氨基树脂(如Rink Amide MBHA树脂，Rink Amide AM树脂)。
优选的，步骤(1)中，所述清洗并溶胀树脂所用的溶剂包括但不限于N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)，四氢呋喃(THF)，二氯甲烷(DCM)。
步骤(1)中，脱保护试剂包括但不限于哌啶(对Fmoc保护基团)和三氟乙酸TFA(对Boc保护基团)。
步骤(2)中，所述氨基酸的保护基包括Fmoc基团或Boc基团；优选的，所述氨基酸的保护基为Fmoc基团。
步骤(2)中，所述多肽缩合剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中的一种或一种以上混合物。
优选的，步骤(2)中，所述带保护基的氨基酸与树脂上用于偶联氨基酸的基团的摩尔比在1～10之间。
优选的，步骤(2)中，所述震荡的时间在30～120分钟之间。
优选的，步骤(2)中，所述带保护基的氨基酸与多肽缩合剂的摩尔比在0.1～1之间。
步骤(2)中，所述带保护基的氨基酸与缩合剂的溶解试剂包括但不限于DMF，THF，DCM。
步骤(1)、(2)、(3)中，清洗树脂所用的溶剂包括但不限于N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)，四氢呋喃(THF)，二氯甲烷(DCM)。
步骤(3)中，所述脱保护试剂包括强酸(如三氟乙酸)或强碱(如哌啶)；其中强酸用于裂解Boc保护基，强碱用于去除Fmoc保护基。
步骤(5)中，所述多肽的切除，对Boc法合成的多肽采用强酸(如氢氟酸或三氟甲磺酸)将合成的目标多肽从树脂上解离，对Fmoc法合成的多肽采用三氟乙酸TFA从树脂上解离。
进一步，为了验证本发明VGVAPG改性的透膜多肽的基因转染效率，将所述(VGVAPG)n改性的透膜多肽溶液与核酸溶液混合，得到改性的透膜多肽/核酸复合物；再将改性多肽/核酸复合物用于细胞转染，检测被转染细胞的基因转染效率等参数。
所述将VGVAPG改性的透膜多肽溶液与核酸溶液混合中，透膜多肽的正电荷与核酸的负电荷比例为3～12。
本发明的原理是：本发明采用的缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(VGVAPG)n是一种源自细胞外基质弹性蛋白的多肽肽段。在体内，弹性蛋白可以通过其蛋白网络上的(VGVAPG)n肽段特异性结合细胞膜表面的弹性蛋白结合蛋白，从而发挥细胞外基质对细胞的调控作用。这种特异性结合可能是通过(VGVAPG)n肽段在溶液中的Type VIIIβ-转角构象实现的(Peptide Science,2004,76:266-280)。所以本发明中带有(VGVAPG)n肽段的透膜多肽，然后带有(VGVAPG)n肽段透膜多肽与核酸的复合物，会特异性地结合到细胞表面，从而提升基因转染效率。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
(1)本发明提供的在透膜多肽上引入(VGVAPG)n肽段的方法，可以通过多肽的空间构象特异性地与细胞膜表面弹性蛋白结合蛋白结合，从而增强透膜多肽/核酸复合物与细胞膜的相互作用。
(2)本发明在透膜多肽上引入(VGVAPG)n肽段的方法，采用固相合成法，合成方法简单高效，产品易于纯化和大批量生成。
(3)本发明提供的在透膜多肽上引入(VGVAPG)n肽段的方法，可以增强透膜多肽/核酸复合物对细胞的基因转染效率。
(4)本发明提供的(VGVAPG)n肽段在n＝1时(6个氨基酸)就能够靶向细胞膜上弹性蛋白结合蛋白，靶向肽段越短，对透膜多肽的合成、提纯及其结合核酸能力越有利。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但是，不以任何形式限制本发明。应该指出的是，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，本发明还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种在透膜多肽RALA上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.25mmol)Rink Amide MBHA树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Fmoc保护基团的氨基酸，1mmol HBTU，1mmolHOBt，2mmol DIEA溶解在10mL DMF，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DMF清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入10mL 20wt/v％哌啶的DMF溶液，震荡30分钟，沥干；然后DMF清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽(N-WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA VGVAPG-C)的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用三氟乙酸TFA从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物(N-WEARLARALARALARHLARA LARALRACEA VGVAPG-C)。
实施例2
本实施例提供一种在透膜多肽RALA上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.3mmol)Rink Amide AM树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Fmoc保护基团的氨基酸，1mmol DIC，1mmolHOBt，2mmol DIEA溶解在10mL DMF，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DMF清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入15mL 15wt/v％哌啶的DMF溶液，震荡30分钟，沥干；然后DMF清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[N-WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA (GPAVGV)2-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用TFA从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[N-WEARLARALA RALARHLARALARALRACEA(GPAVGV)2-C]。
实施例3
本实施例提供一种在透膜多肽RALA上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.25mmol)Rink Amide MBHA树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Boc保护基团的第一个氨基酸，2mmol HBTU，2mmol DIEA溶解在10mL DMF，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DMF清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入20mL TFA，震荡30分钟，沥干；然后DMF清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[(VGVAPG)3WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEAVGVAPG-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用氢氟酸HF从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[(VGVAPG)3WEARLARALARALARHLARALARALRACEAVGVAPG-C]。
实施例4
本实施例提供一种在透膜多肽GALA上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.3mmol)Rink Amide AM树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Fmoc保护基团的第一个氨基酸，1mmol HBTU，1mmol HOBt,1.5mmol DIEA溶解在15mL DCM，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DCM清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入20mL 19wt/v％哌啶的DCM溶液，震荡30分钟，沥干；然后DCM清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[N-(GPAVGV)2WEAALAEALA EALAEHLAEALAEALEALAA(VGVAPG)2-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用TFA从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[N-(GPAVGV)2WEAALAEALAEALAEHLAEA LAEALEALAA (VGVAPG)2-C]。
实施例5
本实施例提供一种在透膜多肽KALA上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.25mmol)Rink Amide MBHA树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Fmoc保护基团的第一个氨基酸，1mmol HBTU，1mmol HOBt,2mmol DIEA溶解在20mL DCM，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DCM清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入15mL 20wt/v％哌啶的DCM溶液，震荡30分钟，沥干；然后DCM清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[N-VGVAPG WEAKLAKALA KALAKHLAKA(VGVAPG)2LAKALKACEA-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用TFA从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[N-VGVAPG WEAKLAKALAKALAKHLAKA(VGVAPG)2LAKALKACEA-C]。
实施例6
本实施例提供一种在透膜多肽HALA2上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.25mmol)Rink Amide MBHA树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Boc保护基团的第一个氨基酸，2mmol HBTU，2mmol DIEA溶解在10mL DMF，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DMF清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入20mL TFA，震荡30分钟，沥干；然后DMF清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[(VGVAPG)3WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEAVGVAPG-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用氢氟酸HF从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[(VGVAPG)3WEARLARALARALARHLARA LARALRACEAVGVAPG-C]。
实施例7
本实施例提供一种在透膜多肽HALA2上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入2-氯三苯甲基氯树脂，将树脂用DCM清洗4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Fmoc保护基团的第一个氨基酸，1.5mmol DIC，1mmol HOBt,1.5mmol DIEA溶解在20mL DCM，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DCM清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入10mL 19wt/v％哌啶的DCM溶液，震荡30分钟，沥干；然后DCM清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[N-VGVAPG WEARLARALA RALARHLARALAHALHACEAGPAVGV-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用0.5％TFA从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[N-VGVAPG WEARLARALARALARHLARALAHALHACEA GPAVGV-C]。
实施例8
本实施例提供一种在透膜多肽H5WYG上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.25mmol)Rink Amide AM树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Fmoc保护基团的第一个氨基酸，1.5mmol DIC，1mmol HOBt,1.5mmol DIEA溶解在20mL DMF，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DMF清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入10mL 19wt/v％哌啶的DMF溶液，震荡30分钟，沥干；然后DMF清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[N-VGVAPG GLFHAIAHFI HGGWHGLIHG WYG VGVAPG-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用TFA从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[N-VGVAPG GLFHAIAHFIHGGWHGLIHG WYG VGVAPG-C]。
实施例9
本实施例提供一种在透膜多肽H5-S413-PV上引入(VGVAPG)n肽段的改性方法，按以下步骤制备：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入0.5g(0.4mmol)Rink Amide MBHA树脂，将树脂用DMF清洗4次，沥干；对树脂采用20wt/v％哌啶的DMF溶液进行脱保护，然后用DMF清洗树脂4次，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将1mmol带Fmoc保护基团的第一个氨基酸，1.5mmol HOAt，1mmol HOBt,1.5mmol DIEA溶解在20mL DMF，然后加入反应器，震荡30-120分钟，沥干；用DMF清洗树脂4次，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入10mL 20wt/v％哌啶的DMF溶液，震荡30分钟，沥干；然后DMF清洗树脂4次，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽[N-GPAVGV CVKRKKKPAK LVKKLLTKWL AHHHHH-C]的合成；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽用TFA从树脂上切除下来，然后利用高效液相色谱进行纯化，冷冻干燥后，得到干态的终产物[N-GPAVGV CVKRKKKPAKLVKKLLTKWL AHHHHH-C]。
测试例1
以实施例1中制备的(VGVAPG)n肽段改性RALA多肽得到的改性透膜多肽(N-WEARLARALARALARHLARALARALRACEA VGVAPG-C)复合pCMV-C-EGFP pDNA，然后转染HeLa细胞，测试细胞转染效率。实验分组：RALA多肽组(N-WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA-C)，(VGVAPG)n肽段改性RALA多肽组(N-WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA VGVAPG-C)。实验处理方式：将两组多肽分别溶解于去离子水配成1mg/mL溶液。无菌条件下经0.22μm无菌过滤器中过滤灭菌。然后按一定比例将多肽溶液与1mg/mL的pCMV-C-EGFP pDNA去离子水溶液混合，使得多肽上的带正电荷基团(如赖氨酸和精氨酸)总量与pDNA上磷酸根基团总量的摩尔比为9。混合溶液经吹打或震荡形成透膜多肽/pDNA复合物。复合物静置15分钟后，经Zetasizer检测粒径，两组多肽制备的复合物尺寸均在100-15nm之间。
在24孔细胞培养板上每孔加入5万个HeLa细胞，培养48小时后，高糖DMEM培养液换成OptiMEM减血清培养液。每孔加入上述制备的透膜多肽/pDNA复合物，使得每孔加入的pDNA的量为1μg。细胞转染6小时后，换成普通培养液。转染的细胞培养48小时后，胰酶消化，然后每组取10万个细胞，用流式细胞仪进行定量测定表达绿色荧光蛋白的细胞的比例。结果显示，RALA多肽组的转染效率为24.7％，(VGVAPG)n肽段改性RALA多肽组的转染效率为44.9％。两组多肽组转染的细胞活力均在94％以上，组间没有显著差异，表明改性多肽和未改性多肽的细胞相容性良好。因此，本发明提供了一种有效提高透膜多肽基因转染效率的方法。
测试例2
以实施例9中制备的(VGVAPG)n肽段改性H5-S413-PV多肽得到的透膜多肽(N-GPAVGV CVKRKKKPAK LVKKLLTKWL AHHHHH-C)复合pCMV-C-EGFP pDNA，然后转染HEK-293T细胞，测试细胞转染效率。实验分组：H5-S413-PV多肽组(N-CVKRKKKPAK LVKKLLTKWL AHHHHH-C)，(VGVAPG)n肽段改性H5-S413-PV多肽组(N-GPAVGV CVKRKKKPAK LVKKLLTKWL AHHHHH-C)。实验处理方式：将两组多肽分别溶解于去离子水配成1mg/mL溶液。无菌条件下经0.22μm无菌过滤器中过滤灭菌。然后按一定比例将多肽溶液与1mg/mL的pCMV-C-EGFP pDNA去离子水溶液混合，使得多肽上的带正电荷基团(如赖氨酸和精氨酸)总量与pDNA上磷酸根基团总量的摩尔比为9。混合溶液经吹打或震荡形成透膜多肽/pDNA复合物。复合物静置15分钟后，经Zetasizer检测粒径，两组多肽制备的复合物尺寸均在100-15nm之间。
在24孔细胞培养板上每孔加入5万个HEK-293T细胞，培养48小时后，高糖DMEM培养液换成OptiMEM减血清培养液。每孔加入上述制备的透膜多肽/pDNA复合物，使得每孔加入的pDNA的量为1μg。细胞转染4小时后，换成普通培养液。转染的细胞培养48小时后，胰酶消化，然后每组取10万个细胞，用流式细胞仪进行定量测定表达绿色荧光蛋白的细胞的比例。结果显示，H5-S413-PV多肽组的转染效率为5.2％，(VGVAPG)n肽段改性H5-S413-PV多肽组的转染效率为8.1％。不同多肽转染的细胞活力均在93％以上，组间没有显著差异，表明改性多肽和未改性多肽的细胞相容性良好。因此，本发明提供了一种有效提高透膜多肽基因转染效率的方法。
以上所述仅为本发明的实施例，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：是在透膜多肽固相合成过程中，在其肽链上引入(VGVAPG)n肽段，得到(VGVAPG)n改性的透膜多肽。
2.根据权利要求1所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)溶胀树脂：在反应器中加入透膜多肽固相合成的树脂，清洗树脂并溶胀，沥干；然后在反应器中加入脱保护试剂，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
(2)氨基酸的偶联反应：将带保护基的氨基酸、多肽缩合剂溶解，然后加入反应器中，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
(3)脱保护反应：在反应器中加入脱保护试剂，脱除保护基团，然后震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到合成含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽；
(5)将合成的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽从树脂上切除下来，然后纯化、冷冻干燥，得到干态的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽。
3.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：所述(VGVAPG)n肽段的氨基酸数量在6～108个之间。
4.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：步骤(1)中，透膜多肽包括：RALA(WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA)，GALA(WEAALAEALAEALAEHLAEA LAEALEALAA)，KALA (WEAKLAKALA KALAKHLAKA LAKALKACEA)，HALA系列多肽，聚赖氨酸Ln(n在1-40之间)，聚精氨酸Rn(n在1-40之间)，Rn1Hn2Rn3(n1，n2，n3在0-8之间)，Rn1Wn2Rn3(n1，n2，n3在0-8之间)，Kn1Hn2Kn3(n1，n2，n3在0-8之间)，Mu peptide(MRRAHHRRRRASHRRMRGG)，Protamine sulfate(RSSSRPVRRR RRPRVSRRRR RRGGRRRR)，Tat多肽(GRKKRRQRRR PPQ)，Rn(n在3-40之间)，Penetratin(RQIKIWFQNR RMKWKK)，PenArg(RQIKIWFQNR RMKWRR)，PenLys(KQIKIWFQNK KMKWKK)，Pep-1(KETWWETWWT EWSQPKKKRK V)，TP10(AGYLLGKINL KALAALAKKI L)，C6(RLLRLLLRLW RRLLRLLR),RWmix(RWRRWRRWRR WR)，RWR(RRRRWWWWRR RR),INF7(GLFEAIEGFI ENGWEGMIDG WYG),H5WYG(GLFHAIAHFIHGGWHGLIHG WYG),SV40衍生肽(GYGPKKKRKV GGC)，hnRNP M9(GNYNNQSSNF GPMKGGNFGGRSSGPYGGGG QYFAKPRNQG GY)，HA2(GLFGAIAGFI ENGWEGMIDG)，MPG(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQ PKKKRKV)，SAP(VRLPPP)3，SAP(E)[Ac-CGGW(VELPPP)3]，CyLoP-1(CRWRWKCCKK),gH 625(HGLASTLTRW AHYNALIRAF)，CADY(Ac-GLWRALWRLL RSLWRLLWRA cysteamide)，L17E(IWLTALKFLG KHAAKHEAKQ QLSKL)，K10(QW)6(KKKKKKKKKK QWQWQWQWQW QW),H5-S413-PV(CVKRKKKPAK LVKKLLTKWL AHHHHH)。
5.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：在肽链上引入(VGVAPG)n肽段的位置包括多肽N端、C端、主链上任意位置、任意支链上，及上述位置的任意组合；引入的(VGVAPG)n肽段包括正序或反序排列，包括(VGVAPG)n或(GPAVGV)n。
6.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：步骤(1)中，脱保护试剂包括哌啶、三氟乙酸。
7.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述多肽缩合剂包括二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、N,N-二异丙基乙胺中的一种或一种以上混合物。
8.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述带保护基的氨基酸与树脂上用于偶联氨基酸的基团的摩尔比在1～10之间。
9.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述带保护基的氨基酸与多肽缩合剂的摩尔比在0.1～1之间。
10.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述脱保护试剂包括强酸或强碱。
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