KR20090079912A - 노로바이러스 백신 제제 - Google Patents
노로바이러스 백신 제제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20090079912A KR20090079912A KR1020097008725A KR20097008725A KR20090079912A KR 20090079912 A KR20090079912 A KR 20090079912A KR 1020097008725 A KR1020097008725 A KR 1020097008725A KR 20097008725 A KR20097008725 A KR 20097008725A KR 20090079912 A KR20090079912 A KR 20090079912A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- norovirus
- vlps
- antigen
- vlp
- chitosan
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 196
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 title claims abstract description 150
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 74
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title claims description 94
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 153
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 152
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 150
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 41
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 38
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 38
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 32
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 32
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 32
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 29
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 29
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 29
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 20
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 14
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 13
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 13
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 13
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 12
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 7
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 claims description 6
- -1 capsid multimers Substances 0.000 claims description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 6
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 claims description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 6
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 claims description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 5
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 claims description 4
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 claims description 4
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 claims description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 4
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 3
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 claims description 3
- 241000532183 Norovirus GI Species 0.000 claims description 3
- 241000532184 Norovirus GII Species 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 3
- 229940123384 Toll-like receptor (TLR) agonist Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 3
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 3
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 claims description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 3
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940100656 nasal solution Drugs 0.000 claims description 3
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 3
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 claims description 3
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 3
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000277 virosome Substances 0.000 claims description 3
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 claims description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 claims description 2
- 229960000292 pectin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 claims 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 claims 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 46
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 39
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 36
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 35
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 33
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 25
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 23
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 23
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 23
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 23
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 22
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- 230000004044 response Effects 0.000 description 18
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 14
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 12
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 12
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 12
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 208000006339 Caliciviridae Infections Diseases 0.000 description 9
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 210000000776 antibody secreting cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 241000056533 Houston virus Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 5
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 4
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 4
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 3
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 3
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100282617 Bovine herpesvirus 1.1 (strain Cooper) gC gene Proteins 0.000 description 2
- 241000407176 Chiba virus Species 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000509413 Snow Mountain virus Species 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 2
- FPJHWYCPAOPVIV-VOZMEZHOSA-N (2R,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-(hydroxymethyl)-6-methoxy-3-sulfooxyoxan-4-yl]oxy-4,5-dihydroxy-3-methoxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H]([C@@H](OC)[C@H](O)[C@H]2O)C(O)=O)[C@H]1NC(C)=O FPJHWYCPAOPVIV-VOZMEZHOSA-N 0.000 description 1
- OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N (2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-acetamido-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methoxyoxan-4-yl]oxy-4,5-dihydroxy-3-methoxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OC)[C@H](C(O)=O)O1 OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N 0.000 description 1
- FHJATBIERQTCTN-UHFFFAOYSA-N 1-[4-amino-2-(ethylaminomethyl)imidazo[4,5-c]quinolin-1-yl]-2-methylpropan-2-ol Chemical compound C1=CC=CC2=C(N(C(CNCC)=N3)CC(C)(C)O)C3=C(N)N=C21 FHJATBIERQTCTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029062 15 gene Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 241001466947 Desert Shield virus Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- HEVGGTGPGPKZHF-UHFFFAOYSA-N Epilaurene Natural products CC1C(=C)CCC1(C)C1=CC=C(C)C=C1 HEVGGTGPGPKZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241001466963 Hawaii calicivirus Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 241000551546 Minerva Species 0.000 description 1
- 206010049565 Muscle fatigue Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 241001617329 Norovirus isolates Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000011363 dried mixture Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 150000002231 fructose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940124670 gardiquimod Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 1
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 208000030208 low-grade fever Diseases 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 229940037525 nasal preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- SYUHGPGVQRZVTB-UHFFFAOYSA-N radon atom Chemical compound [Rn] SYUHGPGVQRZVTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
본 발명은 노로바이러스 항원 및 항원보강제, 특히 단가 VLPs의 혼합물 및 다가 VLPs의 혼합물을 포함하는 항원, 및 백신 조성물 및 다가 및 다가 VLPs 모두를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 VLPs는 하나 이상의 노로바이러스 유전자군으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다.
노로바이러스 항원, 항원보강제
Description
본 발명은 백신 분야, 특히 노로바이러스에 대한 백신 분야이다. 또한, 본 발명은 백신 조성물의 제조 방법 및 면역유전반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
노로바이러스는 비박테리아성 위장염의 유행성 발생의 한 중요한 원인으로 출현한 배양할 수 없는 인간 칼리시바이러스이다(Glass et al, 2000; Hardy et at, 1999). 노로바이러스의 임상적 중요성은 민감한 분자 진단법의 개발 이전에는 저평가되었다. 유전자형 유전자군 I 놀워크 바이러스(NV) 게놈의 복제 및 재조합 바큘로바이러스 발현 시스템으로부터 바이러스-유사 입자들(VLPs)의 생산은 널리 퍼진 노로바이러스 감염을 밝혀낸 분석법의 개발을 유도하였다(Jiang et al 1990; 1992)
노로바이러스는 절단되지 않은 RNA 게놈을 함유하는 단일가닥의 양성 센스 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 3개의 오픈 리딩 프레임을 암호화하고, 이중 후자 둘은 각각 중요한 캡시드 단백질과 중요하지 않은 구조 단백질의 생산을 특징으로 한다(Glass et al 2000). 진핵세포 발현 시스템에서 높은 수준으로 발현될 때, NV의 캡시드 단백질 및 특정 다른 노로바이러스들은 천연 노로바이러스 비리온들과 구조적으로 유사한 VLPs 속에서 자가결합된다. 투과전자현미경으로 관찰할 때, VLPs는 인간 대변 샘플로부터 분리한 감염성 비리온들과 형태적으로 분간할 수 없다.
노로바이러스들에 대한 면역 반응은 복잡하고 보호의 상관관계의 한쪽은 이제 설명되고 있다. 천연 바이러스로 수행된 인간 지원자 연구들은 점막-유도 기억 면역 반응들이 감염으로부터 단기간의 보호를 제공한다는 것을 증명하고 백신-매개 보호가 실현 가능하다는 것을 나타내었다(Lindesmith et al. 2003; Parrino et al.1997; Wyatt et al., 1974))
비록 노로바이러스는, VLPs의 이용가능성과 대량으로 생산되는 이들의 능력 때문에 인비트로 배양될 수 없으나, 노로바이러스 캡시드의 항원 및 구조 정밀사진을 뚜렷이 보이게 하는데 상당한 진전이 이루어졌다. VLPs는 감염성 유전자 물질이 없으면서 바이러스 캡시드 단백질의 확실한 증거를 보유한다. 결과적으로, VLPs는 바이러스의 세포 수용체와의 기능적 상호작용을 모방하여, 감염을 재생하거나 일으키는 능력이 없으면서 적절한 숙주 면역반응을 유도한다. NIH와 공동으로, 베일러 의대는 학문적, 투자자-지원 I 단계 임상 시험에서 인간 지원자들에서 NV VLPs에 대한 체액, 점막 및 세포 면역 반응들을 연구하였다. 경구 투여된 VLPs는 건강한 어른들에서 안전하고 면역원성이 있다(Ball et al. 1999; Tacket et al. 2003). 다른 연구 센터에서, 동물 모델에서의 임상전 실험들은 박테리아 엑소토신 항원보강제로 비강으로 투여될 때 VLPs에 대한 면역반응의 증가를 증명하였다(Guerrero et al. 2001; Nicollier-Jamot et al. 2004; Periwal et al. 2003). 일괄해서, 이런 데이터는 적절하게 제조된 VLPs로 이루어진 백신은 노로바이러스 감염에 대해 면역성을 주는 실행가능한 전략을 나타낸다는 것을 주장한다.
본 발명은 노로바이러스 항원을 포함하는 항원 및 백신 제제를 제공한다. 한 실시예에서, 상기 제제는 적어도 하나의 항원보강제를 더 포함한다. 노로바이러스 항원은 유전자군 I 또는 유전자군 II 바이러스 서열 또는 일치 바이러스 서열로부터 유도될 수 있다. 노로바이러스 제제는 항원 펩타이드, 단백질 또는 바이러스-유사 입자들(VLPs)을 포함한다. 한 실시예에서, VLPs는 변형될 수 있다. 다른 실시예에서, 항원 펩타이드 및 단백질은 캡시드 모노머, 캡시드 멀티머, 단백질 응집체 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 노로바이러스 항원은 약 0.01중량% 내지 약 80중량%의 농도로 존재한다. 노로바이러스 항원의 복용량은 복용 당 약 1㎍ 내지 약 100mg의 양으로 존재한다.
다른 실시예에서, 노로바이러스 VLPs는 적어도 하나의 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 노로바이러스 핵산 서열을 사용하여 발현 시스템에서 생산된 재조합 VLPs이다. 캡시드 단백질은 VP1 및 VP2 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 발현 시스템은 효모, 박테리아, 곤충, 포유류 발현 시스템 또는 바큘로바이러스-감염 세포 발현 시스템과 같은 재조합 세포 발현 시스템일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 조성물은 전달 물질을 더 포함하고, 이 전달 물질은 저장소 효과를 제공함으로써 항원 흡수를 향상시키는 역할을 하고, 전달 부위에서 항원 잔류 시간을 증가시키고 또는 전달 부위에서 세포 밀착 결합의 완화를 통해 면역 반응을 향상시킨다. 전달 물질은 생체접착제일 수 있는데, 바람직하게는 글리코사미노글리칸(예를 들어, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 셀페이트 콘드로이틴, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 하이알우로난), 탄화수소 폴리머(예를 들어, 펙틴, 알지네이트, 글리코겐, 아밀라제, 아밀로펙틴, 셀룰로오스, 키틴, 스타키로스, 우눌린, 덱스트린, 덱스트란), 폴리(아크릴산)의 가교 유도체, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐 파이롤리돈, 폴리사카라이드(뮤신 및 다른 점막폴리사카라이드 포함) 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스), 단백질(예를 들어, 렉틴, 섬모 단백질) 및 데옥시리보핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 점막접착제일 수 있다. 바람직하게는, 점막접착제는 폴리사카라이드이다. 더욱 바람직하게는, 점막접착제는 키토산 또는 키토산 염 또는 키토산 염기와 같은 키토산을 함유하는 혼합물이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 항원보강제를 더 포함하는 조성물을 제공한다. 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A(MPL®), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트, 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 박테리아 내독소와 같은 내독소 및 리포솜으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제이다. 더욱 바람직하게는, 항원보강제는 MPL®이다.
본 발명의 조성물들은 액체 제제 또는 건조 분말 제제로 제공될 수 있다. 본 발명의 건조 분말 제제는 지름 약 10 내지 약 500 마이크로미터의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 한 실시예에서, 조성물은 항원 제제이다. 다른 실시예에서, 조성물은 백신으로 투여하기 위해 제제화된다. 투여의 적절한 경로는 점막, 근육내, 정맥, 피하(subcutaneous), 피내, 피하(subdermal) 또는 경피를 포함한다. 특히, 투여 경로는 근육내 또는 점막일 수 있고, 점막 투여의 바람직한 경로는 비강, 경구 또는 질 투여 경로를 포함한다. 다른 실시예에서, 조성물은 코 스프레이, 비액, 또는 건조 분말로 제제화되며, 제제는 비강에 밀접하게 고정되거나 삽입된 제제를 함유하는 장치로부터 비강 내에서 빠른 침적에 의해 투여된다. 다른 실시예에서, 제제는 하나 또는 두 콧구멍으로 투여된다.
본 발명은 피험자에게서 노로바이러스에 대한 면역반응을 일으키기 위한 방법을 제공하며, 피험자에게 노로바이러스 조성물을 포함하는 항원 제제 또는 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시예에서, 노로바이러스 조성물을 포함하는 항원 제제 및 백신은 하나 이상의 노로바이러스 항원들에 대해 항체들을 생성하는데 사용된다. 다른 실시예에서, 노로바이러스 백신 제제는 노로바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 노로바이러스 항원 및 백신 조성물 및 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 노로바이러스 항원 및 적어도 하나의 항원보강제를 포함하는 조성물을 제공한다. 부가적으로 또는 선택적으로, 조성물은 적어도 하나의 전달 물질을 더 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 면역반응을 일으키거나 노로바이러스 항원에 대한 항체들을 생산하기 위해 동물에 조성물을 투여하는 방법을 제공한다.
노로바이러스
항원
본 발명은 하나 이상의 노로바이러스 항원을 포함하는 조성물을 제공한다. "노로바이러스"는 칼리시바이러스과의 노로바이러스 속의 일원을 의미한다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간 또는 비인간 포유류 종들에 감염성인 관련된, 양성-센스 단일-가닥 RNA, 외피가 없는 바이러스의 그룹을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간에게 급성 위장염을 일으킬 수 있다. 또한 노로바이러스는 전자현미경으로 관찰할 때 경계가 정해진 구조 또는 가장자리를 가진 소형 원형 구조 바이러스(SRSVs)로 부를 수 있다. 노로바이러스 내에 포함되는 것은 핵산 및 아미노산 서열로 정의된 적어도 4개 유전자군이고, 15개 유전자 집단을 포함한다. 주요 유전자군은 GI 및 GII이다. GIII 및 GIV이 제안되었으나 일반적으로 허용된다. GIII의 대표적인 것은 소, 제나 균주(Jena strain)이다. GIV는 하나의 바이러스, 알파트론을 함유한다. 노로바이러스의 추가 설명을 위해서는 Vinje et al. J. Clin. Micro. 41:1423-1433 (2003) 참조. "노로바이러스"는 재조합 노로바이러스 바이러스-유사 입자들(rNOR VLPs)을 의미한다. 일부 실시예들에서, 재조합 노로바이러스 VLPs는 적어도 하나의 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 노로바이러스 핵산 서열을 사용하여 발현 시스템에서 생산된다. 다른 실시예들에서, 예를 들어, Sf9 세포들에서 바큘로바이러스 벡터로부터, 세포들의 ORF2에 의해 암호화된 노로바이러스 캡시드 단백질의 재조합 발현은 캡시드 단백질의 VLPs 속으로의 자발적인 자가결합을 유도할 수 있다. 노로바이러스 핵산 서열은 수율 또는 안정성을 향상시키거나 암호화된 항원의 항원 또는 면역 특성을 개선하기 위해 다양한 노로바이러스 균주 또는 변형된 합성 구조물을 포함하는 일치 서열일 수 있다. VLPs는 노로바이러스와 구조적으로 유사하나 바이러스 RNA 게놈이 없어서 감염성이 없다. 따라서, "노로바이러스"는 결핍 입자들을 포함하는 감염성 또는 비감염성 입자들일 수 있는 비리온을 포함한다.
노로바이러스의 비제한적인 예들은 놀워크 바이러스(NV, GenBank M87661, NP05682I), 사우스앰톤 바이러스(SHV, GenBank L07418), 사막방패바이러스(DSV, U04469), 헤세 바이러스(HSV), 치바 바이러스(CHV, GenBank AB042808), 하와이 바이이러스(HV, GenBank U07611), 설산 바이러스(SMV, GenBank U70059), 토론토 바이러스(TV, Leite et al, Arch. Virol. 141 :865-875), 브리스톨 바이러스(BV), 제나 바이러스(JV, AJ01099), 메릴랜드 바이러스(MV, AY032605), 세토 바이러스(SV, GenBank AB031013), 켑버웰 바이러스(CV, AF145896), 로드스달 바이러스(LV, GenBank X86557), 그림스비 바이러스(GrV, AJ004864), 멕시코 바이러스(MXV, GenBank U22498), 박서(AF538679), C59(AF435807), VAl 15(AY038598), BUDS (AY660568), 휴스턴 바이러스(HoV), 미네르바 균주(EF 126963.1), 라우렌 균주(EF 126966.1), MOH(AF397156), 패리스 아일랜드(PiV; AY652979), VA387(AY038600), VA207(AY038599), 및 오퍼레이션 이라키 프리덤(OIF, AY675554)을 포함한다. 핵산 및 이의 상응하는 아미노산 서열은 전체가 참조로 포함된다. 일부 실시예들에서, 암호문이 동정 목적을 위해 사용될 수 있고 구성된다: 바이러스가 분리된 숙주 종들/속 약어/종 약어/균주 이름/발생 연도/기원 국가((Green et al., Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1 841- 874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). 유전자군 I.1(놀워크 바이러스) 및 II.4(휴스톤 바이러스)와 같은 노로바이러스 유전자군의 조합 또는 다른 공통적으로 순환하는 균주 또는 조합 또는 이의 일부를 나타내는 합성 구조물이 일부 실시예에서 바람직하다. 노로바이러스의 새로운 균주들은 일상적으로 동정되고(Centers for Disease Control, Morbidity and Mortality Weekly Report, 56(33):842-846 (2007)) 둘 이상의 바이러스 균주의 일치 서열들은 노로바이러스 항원을 발현하는데 사용될 수 있다.
노로바이러스 항원은 펩타이드, 단백질 또는 바이러스-유사 입자들(VLPs)의 형태일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 노로바이러스 항원은 VLPs를 포함한다. 본 발명에서 사용된 대로, "바이러스-유사 입자(들) 또는 VLPs"는 바이러스-유사 입자(들), 단편(들), 응집체 또는 노로바이러스의 서열을 암호화하고 감염성 노로바이러스 입자들의 항원 특성(들)과 유사한 항원 특성(들)을 포함하는 캡시드 단백질로부터 생산된 이의 부분(들)을 의미한다.
노로바이러스 항원들은 캡시드 모노머, 캡시드 멀티머, 단백질 또는 VLPs의 펩타이드 단편 또는 응집체 또는 이의 혼합물 형태일 수 있다. 노로바이러스 항원 단백질 또는 펩타이드는 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 생산된 변형 형태일 수 있다.
노로바이러스 항원들은 본 발명의 VLPs 상에 또는 VLPs 안에 발현된 상기 캡시드 단백질 또는 이의 단편의 변형체들을 포함할 수 있다. 변형체들은 구성 단백질의 아미노산 서열에 변경을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드에 대해 "변형체"란 용어는 기준 서열에 대해 하나 이상의 아미노산이 바뀐 아미노산 서열을 의미한다. 변형체는 "보존성" 변화가 일어날 수 있는데, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는데, 예를 들어, 루신이 아이소루신에 의해 치환된다. 선택적으로, 변형체는 "비보존성" 변화가 일어날 수 있는데, 여기서 글리신이 트립토판으로 치환된다. 유사한 적은 변형은 아미노산 결실 또는 삽입 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 없애지 않고 어느 아미노산 잔기가 치환되고, 삽입되고 결실될 수 있는 지를 결정하는 길잡이는, 예를 들어, DNASTAR 소프트웨어와 같은 당업계에 주지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 발견될 수 있다.
복제, 돌연변이 등과 같이 본 발명에 적용할 수 있는 분자생물학적 기술들을 기술하는 일반적인 교과서는 Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 2000 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel")를 포함한다. 이런 교과서들은 돌연변이 유발, 벡터, 프로모터의 사용 및 노로바이러스의 캡시드 단백질의 복제 및 돌연변이에 관한 많은 다른 주제들을 기술한다. 다양한 형태의 돌연변이 유발이 단백질 분자들을 암호화하는 일치 서열을 포함하는 변형 핵산들을 생산 및/또는 분리하는데 사용될 수 있고 본 발명의 VLPs 안의 또는 상의 단백질들을 추가로 변형/돌연 변이시키는데 사용될 수 있다. 돌연변이 유발은 특정 부위, 랜덤 포인트 돌연변이 유발, 주형을 함유하는 우라실을 사용하는 균질 재조합(DNA 셔플링) 돌연변이 유발, 특정 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이 유발, 갈라진 두 가닥 DNA를 사용하는 돌연변이 유발 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 적절한 방법은 점 불일치 교정, 교정-결함 숙주 균주를 사용하는 돌연변이 유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이 유발, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, 이중가닥 파괴 교정 등을 포함한다.
본 발명의 VLPs는 VP1 및/또는 VP2와 같은 전장 노로바이러스 캡시드 단백질 또는 단백질 또는 당업계의 표준 방법을 사용하는 특정 VP1 또는 VP2 유도체로 형성될 수 있다. 선택적으로, VLP를 형성하는데 사용된 캡시드 단백질은 절단된 캡시드 단백질이다. 일부 실시예들에서, 예를 들어, VLPs의 적어도 하나는 절단된 VP1 단백질을 포함한다. 다른 실시예들에서, 모든 VLPs는 절단된 VP1 캡시드를 포함한다. 절단은 N-또는 C-말단 절단일 수 있다. 절단된 캡시드 단백질들은 적절한 기능성 캡시드 단백질 유도체들이다. 기능성 캡시드 단백질 유도체들은 면역반응이 전장 캡시드 단백질로 이루어진 VLP에 의해 일어나는 것과 동일한 방식으로 면역반응(필요한 경우, 적절하게 도움이 될 때)을 일으킬 수 있다.
VLPs는 중요한 VP1 단백질 및/또는 중요하지 않은 VP2 단백질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 각 VLP는 단가 VLP를 생산하는 단지 하나의 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2 단백질을 함유한다. 본 발명에서 사용된 대로, "단가"라는 용어는 항원 단백질들이 단일 노로바이러스 유전자군으로부터 유도된다는 것을 의미한다. 예를 들어, VLPs는 유전자군 I(예를 들어, 놀워크 바이러스로부터의 VP1 및 VP2)의 바이러스 균주로부터의 VP1 및/또는 VP2를 함유한다. 바람직하게는, VLP는 주로 VP1 단백질로 구성된다. 본 발명의 한 실시예에서, 항원은 1가 VLPs의 혼합물이고 여기서 조성물은 여러 바이러스 균주(예를 들어, 놀워크 바이러스 및 휴스톤 바이러스)로부터 얻은 다른 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2로 구성된 VLPs와 혼합된 단일 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및 VP2로 구성된 VLPs를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 노로바이러스 유전자군 II의 하나 이상의 균주로부터의 단가 VLPs와 함께 노로바이러스 유전자군 I의 하나 이상의 균주로부터의 단가 VLPs를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 노로바이러스 VLP 혼합물은 놀워크 및 휴스톤 노로바이러스의 균주들로 구성된다.
그러나, 본 발명의 다른 실시예에서, VLPs는, 예를 들어, 제 2 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2와 상호혼합된 하나의 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2 단백질을 포함하는 다가 VLPs일 수 있고, 여기서 다른 VP1 및 VP2 단백질은 키메릭 VP1 및 VP2 단백질이 아니나, 동일한 캡시드 구조 내에 함께 결합되어 면역성 VLPs를 형성한다. 본 발명에서 사용된 대로, "다가"라는 용어는 항원 단백질들이 노로바이러스 둘 이상의 유전자군으로부터 유도된다는 것을 의미한다. 다가 VLPs는 둘 이상의 바이러스 균주로부터 얻은 VLP 항원을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 노로바이러스 유전자군 II의 하나 이상의 균주로부터의 캡시드 모노머 또는 멀티머와 함께 노로바이러스 유전자군 I의 하나 이상의 균주로부터의 캡시드 모노머 또는 멀티머로 구성된 다가 VLPs를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 다가 VLPs는 놀워크 및 휴스톤 노로바이러스의 균주들로부터의 캡시드 단백질들을 함유한다.
조성물 내에서 단가 또는 다가 VLPs의 조합은 각각의 VLP 형태의 면역원성을 차단하지 않은 것이 바람직하다. 특히 본 발명의 조합에서 노로바이러스 VLPs 사이에 간섭이 없는 것이 바람직하며, 본 발명의 결합된 VLP 조성물은 백신에서 나타낸 각 노로바이러스 유전자형에 의해 감염에 대해 면역성을 유발할 수 있다. 적합하게는 조합에서 소정의 VLP 형태에 대한 면역 반응은 개별적으로 측정될 때 동일한 VLP 형태의 면역 반응의 적어도 50%, 바람직하게는 100% 또는 실질적으로 100%이다. 면역 반응은 실시예들에서 기술된 대로 항체 반응에 의해 적절하게 측정될 수 있다.
다가 VLPs는 개별 캡시드 단백질의 개별 발현에 의해 생산될 수 있고 조합에 의해 VLPs를 형성한다. 선택적으로 다가 캡시드 단백질들은 하나 이상의 DNA 구조물로부터 동일한 세포 내에 발현될 수 있다. 예를 들어, 다가 DNA 구조물들은 숙주 세포들 속으로 트랜스폼 또는 트랜스펙트될 수 있고, 각 벡터는 다른 캡시드 단백질을 암호화한다. 선택적으로 공유된 프로모터 또는 다가 개별 프로모터에 의해 제어될 수 있는 다가 캡시드 유전자를 가진 단일 벡터가 사용될 수 있다. 적절한 경우, IRES 요소들은 벡터 속에 혼합될 수 있다. 이런 발현 전략들을 사용하여, 공동 발현된 캡시드 단백질들은 뒤이은 VLP 형성을 위해 공동 정제될 수 있거나 자연적으로 다가 VLPs를 형성할 수 있고 이후 정제될 수 있다.
다가 VLP 생산을 위한 바람직한 방법은 다른 노로바이러스 유전자형으로부터 VLP 캡시드 단백질 또는 VP1 및/또는 VP2 단백질과 같은 유도체를 제조하는 단계, 단백질들을 혼합하는 단계 및 단백질을 결합하여 다가 VLPs를 생산하는 단계를 포함한다. 캡시드 단백질들은 미정제 추출물의 형태일 수 있고, 혼합 이전에 부분적으로 정제되거나 정제될 수 있다. 다른 유전자군의 결합된 단가 VLPs는 분해될 수 있고, 함께 혼합되어 다가 VLPs 속에 재결합될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 또는 VLPs는 결합하기 전에 적어도 부분적으로 정제된다. 선택적으로, 다가 VLPs의 추가 정제는 결합 후 수행될 수 있다.
적합하게는 본 발명의 VLPs는 VLPs의 분해 및 재결합에 의해 제조되어, 균질 및 순수 VLPs를 제공한다. 한 실시예에서 다가 VLPs는 둘 이상의 VLPs의 분해, 뒤이어 재결합하기 이전에 임의의 적절한 시점에서 분해된 VLP의 조합에 의해 제조될 수 있다. 이런 방법은, 예를 들어, 일부 효모 균주에서 발생하는 것과 같이, VLPs가 발현된 VP1 단백질로부터 자연적으로 형성될 때 적합하다. VP1 단백질의 발현이 자연적인 VLP 형성으로 유도되지 않는 경우, VP1 단백질 또는 캡소머의 제제들은 VLPs 속에 모이기 전에 결합될 수 있다.
다가 VLPs가 사용되는 경우, 바람직하게는 VLPs의 성분들은 이들이 최종 혼합된 VLP에 있는 것이 바람직한 비율로 혼합된다. 예를 들어, 놀워크 및 휴스톤 바이러스(또는 다른 노로바이러스 균주)로부터의 부분적으로 정제된 VP1 단백질의 동일한 양의 혼합물은 다가 VLP에 대략 동일한 양의 각 단백질을 제공한다.
다가 VLPs를 포함하는 조성물들은 본 발명에 참조로 포함된 WO 98/44944, WO0045841의 용액들과 같이 당업계에 공지된 용액들에 의해 안정화될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 VP1 및 VP2 단백질 또는 유도체 이외에 다른 단백질 또는 단백질 단편을 포함할 수 있다. 다른 단백질 또는 펩타이드는 본 발명의 조성물과 공동 투여될 수 있다. 선택적으로 조성물은 비-노로바이러스 항원으로 제제화될 수 있거나 공동 투여될 수 있다. 이런 항원들은 다른 질환들에 대한 보호를 제공하는 것이 적절하다.
VP1 단백질 또는 기능성 단백질 유도체는 VLP를 형성할 수 있고, VLP 제제는 전자현미경 및 동적 레이저광 산란과 같은 표준 기술들로 분석될 수 있다.
항원 제조
본 발명의 항원 분자들은 유기체들로부터의 분리 및 정제에 의해 제조되며 여기서 항원 분자들은 자연적으로 발생하거나 재조합 기술들에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 비록 대장균 또는 S. cerevisiae , S. pombe , Pichia pastori와 같은 효모 세포들 또는 다른 피키아 발현 시스템, CHO 또는 HEK 시스템과 같은 포유류 세포 발현과 같은 임의의 적절한 세포들이 사용될 수 있지만, 노로바이러스 VLP 항원들은 Sf9 또는 H5 세포들과 같은 곤충 세포들로 제조된다. 재조합 방법 또는 합성에 의해 제조될 때, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 또는 치환이 이루어질 수 있다. 상기 항원들의 각각은 실질적으로 순수한 상태로 사용되는 것이 바람직하다.
곤충 세포 배양액에 노로바이러스 VLPs의 생산 방법은 전문이 참조로 포함된 미국특허 제 6,942,865호에 이미 개시되어 있다. 간단히, 바이러스 캡시드 유전자(OFR2) 및 중요하지 않은 구조 유전자(ORF3)를 함유하는 게놈의 3' 말단으로부터의 cDNA가 복제되었다. 바이러스 캡시드 유전자들을 운반하는 재조합 바큘로바이러스들은 복제된 cDNAs로부터 제조되었다. 노로바이러스 VLPs는 Sf9 또는 H5 곤충 세포 배양액에서 생산되었다.
항원보강제
본 발명은 노로바이러스 항원과 사용하기 위한 항원보강제를 포함하는 조성물을 제공한다. 대부분의 항원보강제는 빠른 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 설계된 물질, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일 및 단백질로부터 유도된 백일해(Bordatella pertussis) 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 같은 면역반응의 자극제를 함유한다. 적절한 항원보강제들은 구입할 수 있고, 예를 들어, 프레운드 불완전 항원보강제 및 완전 항원보강제(Pifco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 항원보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ.); 수산화알루미늄 겔(알룸)과 같은 알루미늄 염 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 과당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 미세구; 및 퀼 A이다.
또한 적절한 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트, 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 박테리아 내독소와 같은 내독소 및 리포솜을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 항원보강제는 박테리아로 유도되지 않은 엑소톡신이다. 바람직한 항원보강제는 3DMPL 또는 QS21과 같은 Th1 형태 반응을 자극하는 것들이다.
살모넬라로부터의 지질 A의 비독성 유도체인 모노포스포릴 지질 A(MPL)는 백신 항원보강제로 개발된 강력한 TLR-4 효현제이다(Evans et al. 2003). 임상전 설치류 연구에서, 비강 MPL은 전신, 체액 반응뿐만 아니라 분비 반응을 향상시키는 것으로 나타났다(Baldridge et al. 2000; Yang et al. 2002). 120,000 이상의 환자들의 임상 연구에서 백신 항원보강제로서 안정하고 효과적인 것으로 증명되었다(Baldrick et al, 2002; 2004). MPL은 TLR-4 수용체를 통해 선천성 면역성의 유도를 자극하고 따라서 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 바이러스, 및 기생충을 포함하는 매우 넓은 범위의 감염성 병원균에 대해 비특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다(Baldrick et al. 2004; Persing et al. 2002). 비강 제제에 MPL을 포함하면 선천성 반응을 빠르게 유도하여, 바이러스 면역성 검사로부터 비특이적 면역반응을 유발하는 반면 백신의 항원 성분들에 의해 발생한 특이적 반응을 향상시킨다.
따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 후천성 및 선천성 면역성의 인핸서로서 모노포스포릴 지질(MPL®) 또는 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL®)를 포함하는 조성물을 제공한다. 화학적으로 3D-MPL®은 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6개 아실화 사슬의 혼합물이다. 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽특허 0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)에 개시되며, 참조로 본 발명에 포함된다. 다른 실시예에서, 본 발명은 BioMira's PET 지질 A 또는 TLR-4 효현제와 같이 작용하도록 설계된 합성 유도체와 같은 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체를 포함하는 조성물을 제공한다.
"유효량의 항원보강제"는 당업자가 잘 이해할 것이고, 투여된 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 하나 이상의 항원보강제의 양, 즉, 비강 세척에서 IgA 수준, 혈청 IgG 또는 IgM 수준 또는 B 및 T-세포 증식의 면에서 측정된 대로, 투여된 항원 조성물의 면역 반응을 증가시키는 양을 포함한다. 면역글로불린 수준의 적절하게 효과적인 증가는 임의의 항원보강제 없는 동일한 항원 조성물과 비교해서 5%이상, 바람직하게는 25%이상 및 특히 50%이상을 포함한다.
전달 물질
또한 본 발명은 숙주 점막폴리사카라이드의 부분 탈수의 단일 또는 결합 효과에 의한 증가된 유체 점도, 전달 물질의 물리적 특성을 기초로 또는 전달 물질 및 저장소 효과를 제공하는 노출 부위에서 숙주 조직들 사이의 이온 상호작용을 통해 항원 흡수를 증가시키는 작용을 하는 전달 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 선택적으로, 전달 물질은 전달 부위에서 항원 잔류 시간을 증가시킨다(예를 들어, 항원의 지연 배제). 이런 전달 물질은 생체접착성 물질일 수 있다. 특히, 생체접착제는 글리코사미노글리칸(예를 들어, 콘드로이틴, 설페이트, 데르마탄 셀페이트 콘드로이틴, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 하이알우로난), 탄화수소 폴리머(예를 들어, 펙틴, 알지네이트, 글리코겐, 아밀라제, 아밀로펙틴, 셀룰로오스, 키틴, 스타키로스, 우눌린, 덱스트린, 덱스트란), 폴리(아크릴산)의 가교 유도체, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐 파이롤리돈, 폴리사카라이드(뮤신 및 다른 점막폴리사카라이드 포함) 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스), 단백질(예를 들어, 렉틴, 섬모 단백질) 및 데옥시리보핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 점막접착제일 수 있다. 바람직하게는, 점막접착제는 키토산 또는 키토산 염 또는 키토산 염기(예를 들어, 키토산 글루타메이트)와 같은 폴리사카라이드이다.
갑각류의 껍질에 있는 키틴으로부터 유도된 양전하 직선형 폴리사카라이드인 키토산은 상피 세포들 및 이들의 덮개 점막층에 대한 생체접착제이다. 키토산에 의한 항원 제제는 비강 점막과의 접촉 시간을 증가시켜, 저장소 효과에 의해 흡수를 증가시킨다(Ilium et al. 2001; 2003; Davis et al. 1999; Bacon et al. 2000; van der Lubben et al. 2001; 2001; Lim et al. 2001). 키토산은 동물 모델과 인간에서 독감, 백일해 및 디프테리아를 포함하는 여러 백신들에 대한 비강 전달 시스템으로 검사하였다(Ilium et al. 2001; 2003; Bacon et al. 2000; Jabbal-Gill et al. 1998; Mills et al. 2003; McNeela et al. 2004). 이런 검사들에서, 키토산은 비경구 백신접종과 동일한 수준으로 전신 면역반응을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, 현저한 항원-특이적 IgA 수준이 점막 분비액에서 측정되었다. 따라서, 키토산은 비강 백신 효과를 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 이의 물리적 특성들 때문에, 키토산은 분말로 제제화된 비강 백신으로 특히 적합하다(van der Lubben et al. 2001; Mikszta et al. 2005 ; Huang et al. 2004).
따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 비강 투여에 적합한 항원 또는 백신 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 항원 및 선택적으로 유효량의 항원보강제를 포함한다. 바람직한 실시예들에서, 본 발명은 키토산과 같은 적어도 하나의 전달 물질 및 MPL®, CPGs, 이미퀴모드(imiquimod), 가디퀴모드(gardiquimod), 또는 합성 지질 A 또는 지질 A 모방체 또는 유사체와 같은 적어도 하나의 항원보강제와 함께 노로바이러스 VLP와 같은 노로바이러스 항원을 포함하는 항원 또는 백신 조성물을 제공한다.
키토산의 분자량은 10kDa 내지 800kDa, 바람직하게는 100kDa 내지 700kDa 및 더욱 바람직하게는 200kDa 내지 600kDa이다. 조성물에서 키토산의 농도는 통상적으로 약 80%(w/w)까지, 예를 들어, 5%, 10%, 30%, 50%, 70% 또는 80%일 것이다. 키토산은 적어도 75% 탈아세틸화, 예를 들어, 80-90%, 더욱 바람직하게는 82-88% 탈아세틸화, 특히 83%, 84%, 85%, 86% 및 87% 탈아세틸화된 것이다.
백신 및 항원 제제
본 발명의 조성물들은 백신 또는 항원 제제로서 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "백신"이란 용어는 상기한 대로 본 발명의 노로바이러스 VLPs 또는 다른 노로바이러스 항원을 함유하는 제제를 의미하고, 척추동물에게 투여될 수 있는 형태이고 감염을 완화 및/또는 VLPs 또는 감염의 적어도 하나의 증상을 감소 및/또는 항원의 다른 복용량의 효과를 향상시키기에 충분한 면역 반응을 유도하기 위해 치료 면역성을 유도하기에 충분한 면역반응을 유도한다. 본 발명에서 사용된 "항원 제제" 또는 "항원 조성물"이란 용어는 척추동물, 예를 들어, 포유류에게 투여될 때, 면역반응을 유도할 제제를 의미한다. 본 발명에서 사용된 "면역반응"이란 용어는 체액 면역반응 및 세포-매개 면역반응 모두를 의미한다. 체액 면역반응은, 예를 들어, 감염성 물질을 중성화하고, 감염성 물질이 세포에 들어가는 것을 막고, 상기 감염성 물질의 복제를 막고 및/또는 숙주 세포가 감염되고 파괴되는 것을 보호하는 B 림프구에 의한 항체들의 생산의 자극을 포함한다. 세포-매개 면역반응은 감염을 예방하거나 완화하거나 이의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 감염성 물질에 대한 T-림프구 및/또는 매크로파아지와 같은 다른 세포에 의해 매개되는 면역반응을 의미한다. 백신 제제는 일반적으로 백신 설계에서 개시된다(("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 경구, 위장관 및 호흡기(예를 들어, 코) 점막의 하나 이상에 전달하기 위해 제제화될 수 있다.
조성물이 호흡기(예를 들어, 코) 점막에 전달하기 위한 것인 경우, 통상적으로 에어로졸 또는 비액과 같은 투여용 수용액 또는 선택적으로, 비강 내에서 빠른 침적을 위한 건조 분말로 제제화된다.
비액으로 투여하기 위한 조성물은 방부제, 점도 조절제, 긴장 조절제, 완충제 등과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 형태의 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 점도 조절제는 미세결정 셀룰로오스, 키토산, 전분, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 건조 분말로 투여하기 위한 조성물은 점막 접착제, 증량제 및 적절한 분말 흐름 및 크기 특성을 전달하기 위한 물질과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 증량제 및 분말 흐름 및 크기 물질은 만니톨, 수크로오스, 트레할로스 및 자일리톨을 함유할 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 노로바이러스 백신 또는 항원 제제는 면역원으로 하나 이상의 노로바이러스 유전자군 항원(들), MPL®과 같은 항원보강제, 점막표면에 대한 접착력을 향상시키는 키토산과 같은 생고분자 및 만니톨과 수크로오스와 같은 증량제를 함유하는 건조 분말로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 노로바이러스 백신은 하나 이상의 노로바이러스 유전자군 항원(들)(예를 들어, 놀워크 바이러스, 휴스톤 바이러스, 설산 바이러스), MPL® 항원보강제, 키토산 점막접착제 및 적절한 흐름 특성을 제공하는 증량제로서 만니톨과 수크로오스를 함유하는 10mg의 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 상기 제제는 약 7.0mg(25 내지 90% w/w 범위) 키토산, 약 1.5mg 만니톨(0 내지 50% w/w 범위), 약 1.5mg 수크로오스(0 내지 50% w/w 범위), 약 25㎍ MPL®(0.1 내지 5% w/w 범위), 및 약 100㎍ 노로바이러스 항원(0.05 내지 5% w/w 범위)을 포함할 수 있다.
노로바이러스 항원은 약 0.01%(w/w) 내지 약 80%(w/w)의 농도로 존재할 수 있다. 한 실시예에서, 노로바이러스 항원은 양쪽 콧구멍 속에 투여하기 위해 10mg 건조 분말 제제 당 약 5㎍, 약 15㎍ 및 약 50㎍(0.025, 0.075 및 0.25% w/w) 또는 한쪽 콧구멍 속에 투여하기 위해 약 10㎍, 약 30㎍ 및 약 100㎍(0.1, 0.3 및 1.0% w/w)의 복용량으로 제제화될 수 있다. 상기 제제는 각 투여하는 동안 콧구멍 하나 또는 콧구멍 두 개에 제공될 수 있다. 첫 번째 투여 1 내지 12 주 후 면역반응을 향상시키기 위해 추가 투여(booster administration)가 있을 수 있다. 백신과 항원 제제에서 노로바이러스 항원의 함량은 1㎍ 내지 100mg, 바람직하게는 1-500㎍, 더욱 바람직하게는 5-200㎍, 가장 통상적으로 10-100㎍의 범위일 수 있다. 각 복용시 투여된 전체 노로바이러스 항원은 두 콧구멍에 투여될 때 전체 20mg 건조 분말에서 또는 한 콧구멍에 투여될 때 10mg 건조 분말에서 약 10㎍, 약 30㎍ 또는 약 100㎍일 것이다. 건조 분말 특성들은 입자들의 10% 미만이 지름이 10㎛ 미만이게 된다. 평균 입자 크기는 지름이 10 내지 500㎛이다.
다른 실시예에서, 항원 및 백신 조성물은 피험자에게 연속적으로 투여하기 위한 액체로 제제화될 수 있다. 비강 투여를 위한 액체 제제는 노로바이러스 유전자군 항원(들), 항원보강제, 및 키토산과 같은 전달 물질을 포함할 수 있다. 근육내(i.m.) 또는 경구 투여용 액체 제제는 전달 물질(예를 들어, 키토산) 없이 노로바이러스 유전자군 항원(들), 항원보강제 및 버퍼를 포함할 수 있다.
바람직하게는 항원 및 백신 조성물은 동결건조되어 사용될 때까지 무수 상태로 저장되며, 액체 제제에서 사용되는 경우 사용시점에 희석제로 재구성된다. 선택적으로, 본 발명의 다른 성분들은 키트 또는 장치(어떤 성분 또는 모든 성분이 동결건조됨)에 개별적으로 저장될 수 있다. 성분들은 건조 제제를 위해 동결건조 형태로 존재하거나 액체 제제를 위해 재구성될 수 있고 사용하기 이전에 혼합되거나 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다. 건조 분말 투여의 경우, 백신 또는 항원 제제는 비강 전달 장치 또는 국소(예를 들어, 피부) 전달 패치 속에 미리 채워 사용시까지 저장될 수 있다. 바람직하게는, 이런 전달 장치 및 관련 포장은 이의 내용물의 안정성을 보호하고 지킬 수 있다.
항원 제제 및 백신의 동결건조는 당업계에 주지되어 있다. 통상적으로 액체 항원은 동결건조되는 동안 항원을 보호하고 원하는 특성들을 가진 분말을 생산하기 위해 물질들의 존재하에서 동결건조된다. 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 락토오스(10-200mg/mL의 초기 농도로 존재)와 같은 과당이 단백질 항원을 냉동 보호 및 동결 보호하고 원하는 특성들을 가진 동결건조 덩어리 또는 분말을 생산하기 위해 통상적으로 사용된다. 동결건조된 조성물은 이론적으로 더 안정하다. 분사 건조 또는 분사 동결 건조와 같은 다른 건조 기술들이 사용될 수 있다. 대부분의 제제화 방법의 목표는 단백질 응집과 분해를 최소화하는 것이지만, 본 발명자들은 응집된 항원들이 존재하면 노로바이러스 VLPs에 대한 면역반응을 향상시키는 것을 증명하였다(실시예 3 및 4의 동물 모델 참조). 따라서, 본 발명자들은 항원의 응집률이 동물 모델들에서 최대 면역 반응을 유도하기 위해 응집된 항원 대 응집되지 않은 항원의 최적 비율을 만드는 동결건조 과정 동안 제어될 수 있는 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명은 (a) 노로바이러스 항원, 수크로오스 및 키토산을 포함하는 선-동결건조 용액을 제조하는 단계, 여기서 수크로오스 대 키토산의 질량비는 약 0:1 내지 약 10:1이다; (b) 용액을 동결하는 단계; 및 (c) 30-72시간 동안 동결된 용액을 동결건조하는 단계를 포함하며, 여기서 최종 동결건조된 생성물은 응집된 형태의 상기 노로바이러스 항원의 비율을 함유하는 노로바이러스 항원 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 동결건조는 주위 온도, 감소된 온도에서 일어날 수 있거나 다양한 온도에서 주기적으로 진행될 수 있다. 단지 설명을 위해서, 동결건조는 일련의 단계에 걸쳐 일어날 수 있는데, 예를 들어, 한 주기는 -69℃에서 시작하여, 점진적으로 3시간 걸쳐 -24℃로 조절되고, 18시간 동안 이 온도를 유지하고, 점진적으로 1시간 동안 -16℃로 조절되고, 6시간 동안 이 온도를 유지하고, 점진적으로 3시간 동안 +34℃로 조절되고 최종적으로 9시간 동안 이 온도를 유지된다. 한 실시예에서, 선-동결건조 용액은 증량제를 더 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 증량제는 만니톨이다.
바람직한 비율의 응집을 얻기 위한 수크로오스 및 키토산의 적절한 비율은 다음 안내를 따라 측정될 수 있다. 약 2:1 내지 약 10:1의 범위로 수크로오스 대 키토산 선-동결건조 혼합물은 선-동결건조 용액 농도(실시예 13 참조)에 따라 약 50% 내지 100% 응집되지 않은 노로바이러스 항원(즉, 0% 내지 50% 응집된 항원) 후-동결건조의 범위를 나타낼 것이다. 0:1의 수크로오스 대 키토산의 질량 비율은 30% 미만의 응집되지 않은 노로바이러스 항원을 생산할 것이다(즉, 70% 이상 응집된 항원). 수크로오스 및 키토산을 사용하지 않고 만니톨과 같은 증량제만을 사용하면 10% 미만의 응집되지 않은 항원을 생산할 것이다(즉, 선-동결건조 용액 농도에 따라 90% 이상의 응집된 항원). 이런 지침들을 사용하여, 당업자는 최적의 면역반응을 생산하는데 필요한 응집의 원하는 양을 얻기 위해서 수크로오스를 선-동결건조 혼합물에서 키토산 질량비와 농도를 조절할 수 있다.
또한, 선-동결건조 용액에 수크로오스, 키토산 및 만니톨을 포함하면 시간에 걸쳐 응집되지 않은 노로바이러스 항원의 안정성에 나쁜 효과를 갖지 않은데, 즉, 제제에서 응집된 항원/응집되지 않은 항원의 비율은 약 12달 이상의 기간 동안 건조 분말로 저장될 때 증가하지 않는다(실시예 10 참조). 따라서, 이 동결건조 방법은 응집된 노로바이러스 항원 대 응집되지 않은 노로바이러스 항원의 예상가능하고 제어가능한 비율로 안정한 제제를 얻게 한다.
면역반응 자극 방법
각 항원 또는 백신 제제에서 항원의 양은 현저한 부작용 없이 강한 면역반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이런 양은 특이적 항원(들)이 사용되고, 투여 경로 및 사용된 항원보강제에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 내용에서 환자에게 투여된 복용량은 시간이 지남에 따라 환자에서 유익한 치료 반응을 일으키거나 항원-특이적 항체들의 생산을 유도하는데 충분해야 한다. 따라서, 조성물은 특이적 항원에 대한 면역반응을 유발 및/또는 질환 또는 감염으로부터의 증상 및/또는 합병증을 완화, 감소 또는 치료하는데 충분한 양으로 환자에게 투여되어야 한다. 이것을 이루지는데 적합한 양은 "치료적으로 유효한 복용량"으로 정의된다.
실질적으로 순수한 형태의 노로바이러스 항원의 경우, 각 복용량은 제제에서 각 노로바이러스 항원의 경우 약 1㎍ 내지 10mg, 바람직하게는 약 2-50㎍을 포함할 것이다. 본 발명의 항원 제제를 사용하는 전형적인 면역 방법에서, 제제들은 여러 번(예를 들어 1-4) 투여될 수 있고, 각 복용량은 1-100㎍의 각 항원을 함유한다. 복용량은 생산된 조성물의 면역 활성 및 환자의 상태뿐만 아니라 치료할 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 복용량의 크기는 특정 환자에서 특정 조성물의 투여와 동반할 수 있는 부작용들의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 항원 및 백신 제제는 비-점막 또는 점막 경로를 통해 투여될 수 있다. 이런 투여는 비경구 주사(예를 들어, 정맥, 피하 및 근육내) 또는 볼/설하, 직장, 경구, 비강, 국부(경피 및 눈), 질, 폐, 동맥내, 복강, 안구내 또는 비강 경로 또는 특정 조직에 직접과 같은 다른 전통적인 직접 경로를 통한 인비보 투여를 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 백신은 경구, 국부, 피하, 점막, 정맥, 근육내, 비강, 설하, 경피, 피하, 피내, 및 좌약과 같은 여러 경로 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다. 투여는 패치, 바늘, 카테테르 또는 관련 장치를 사용하여, 1회 또는 수회 직접 투여함으로써 간단하게 이루어질 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항원 및 백신 제제들은 점막 표면에 투여된다. 점막 표면을 통한 면역화는 면역화의 다른 경로들을 통해 여러 가능한 장점들을 제공한다. 가장 뚜렷한 이점들은 1) 점막 면역화는 투여를 위해 바늘 또는 숙련자를 필요로 하지 않으며 2) 면역반응이 병원균 침투 부위(들) 뿐만 아니라 전신에서 일어난다(Isaka et al 1999; Kozlowski et al. 1997; Mestecky et al. 1997; Wu et al. 1997)는 것이다.
다른 태양에서, 본 발명은 환자의 점막 표면(바람직하게는 비강 또는 경구)에 하나 이상의 노로바이러스 항원, 적어도 하나의 유효 항원보강제 및/또는 적어도 하나의 전달 물질을 포함하는 항원 또는 백신 조성물을 투여하여 IgA 점막 면역반응 및 IgG 전신 면역반응을 유발하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명에서 정의된 노로바이러스 항원들 및 적어도 하나의 항원보강제 또는 본 발명에서 정의된 적어도 하나의 전달 물질의 비강 제제를 분산하기 위한 수단을 제공하는 것을 고려한다. 예를 들어, 분산 장치는 에어로졸 전달 시스템 형태를 가지며 단지 1회 복용량 또는 다수 복용량을 분산하도록 준비될 수 있다. 이런 장치는 백신 또는 항원 제제의 계량된 복용량을 비강으로 전달할 것이다. 적절한 장치들의 다른 예는 드롭퍼, 면봉, 에어로졸화기, 취입기(예를 들어, Valois Monopowder Nasal Administration Device, Bespak UniDose DP), 연무기 및 흡입기를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 장치들은 피험자가 제제를 비강 속으로 흡입하는 것을 필요로 하는 수동적 수단에 의해 항원 또는 백신 제제를 전달할 수 있다. 선택적으로, 장치는 복용량을 비강으로 투입하거나 분사함으로써 제제를 능동적으로 전달할 수 있다. 투여는 피험자 당(콧구멍 당 한 장치) 두 개의 장치를 포함한다. 활성 성분(노로바이러스 항원)의 실제 복용량은 약 5-1000㎍일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 항원 또는 백신 제제는 비강 속에 가깝게 유지되거나 삽입된 제제를 함유하는 장치로부터 비강 내로 빠른 침적에 의해 비강 점막으로 투여된다.
또한 본 발명은 하나 이상의 노로바이러스 항원에 대해 항체들을 발생하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기한 대로 본 발명의 백신 또는 항원 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 이런 항체들은 당업계에서 통상의 방법에 의해 분리될 수 있고 정제될 수 있다. 노로바이러스 항원들에 대해 특이적인 분리된 항체들은 진단 면역분석법의 개발에서 사용될 수 있다. 이런 분석법은 임상적 샘플에서 노로바이러스를 탐지하고 감염을 일으키는 특정 바이러스(예를 들어, 놀워크, 휴스톤, 설산 등)를 동정하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 분리된 항체들은 수동 또는 단기 면역성을 제공하는 노로바이러스 감염에 약한 피험자들에게 투여될 수 있다.
상기한 대로, 본 발명의 백신 제제들은 노로바이러스 감염의 증상들을 치료하기 위해 피험자에게 투여될 수 있다. 노로바이러스 감염의 증상들은 당업계에 주지되어 있고 구역질, 구토, 설사 및 위 경련을 포함한다. 또한, 노로바이러스 감염된 환자는 낮은 등급 열, 두통, 한기, 근육통 및 피로를 가질 수 있다. 본 발명은 피험자에게 본 발명의 백신 제제를 투여함으로써 노로바이러스 감염을 앓고 있는 피험자의 면역반응을 유도하는 방법을 포함하며 노로바이러스 감염과 관련된 적어도 하나의 한 증상은 완화 및/또는 감소된다. 증상의 감소는, 예를 들어, 피험자에 의한 자가평가, 의사의 평가 또는 삶의 질 평가, 노로바이러스 감염 또는 다른 증상들의 느린 진행, 노로바이러스 증상의 심각성 감소를 포함하는 적절한 분석 또는 측정(예를 들어, 체온) 또는 적절한 분석(예를 들어, 항체 역가 및/또는 T-세포 활성화 분석)을 수행함으로써 주관적으로 또는 객관적으로 측정될 수 있다. 객관적 평가는 동물 및 인간 평가를 모두 포함한다.
도 1은 10㎍ VLP로 인비보 비강 면역화 후 설치류 경부 림프절 세포의 인비트로 항원-특이적 증식 분석법을 도시한다.
도 2는 10㎍ VLP로 인비보 비강 면역화 후 비장세포의 인비트로 항원-특이적 증식 분석법을 도시한다.
도 3은 25㎍ VLP로 인비보 경피 면역화 후 비장세포의 인비트로 항원-특이적 증식 분석법을 도시한다.
도 4는 ELISPOT 분석법에 의해 측정된 항체 분비 세포(ASCs)로부터 VLP-특이적 IgG 또는 IgA를 도시한다.
도 5는 ELISA로 측정된 VLP-특이적 IgG 또는 IgA를 도시한다.
도 6은 놀워크 VLPs에 대한 혈청 IgG 반응에 대한 역가검증의 결과를 도시한다.
도 7은 항원의 액체 제제 또는 건조 분말로 재구성된 제제로 면역된 생쥐에서 놀워크 VLPs에 대한 혈청 IgG 반응을 포함하는 역가검증의 결과를 도시한다. 그래프는 다른 제제에서 놀워크 VLPs의 효능 대 농도를 도시한다.
도 8은 노로바이러스 VLP 백신의 다른 제제의 투여 후 21일(왼쪽 패널) 및 42일(오른쪽 패널)에 토끼에서 혈청 IgG 반응을 도시한다.
도 9는 놀워크 VLPs의 액체 제제 또는 건조 분말 제제로 비강으로 면역된 토끼에서 혈청 IgG 반응을 도시한다.
도 10은 정량 SDS-PAGE 분석 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정된 대로 건조 분말 제제의 안정성을 도시한다. 회귀 분석은 1년 동안 10mg 건조 분말당 전체 또는 응집되지 않은 ㎍ VLP에서 통계적 경향을 나타내지 않았다. 응집된 비율은 정량적 SDS-PAGE에 의해 전체 VLP 단백질과 비교된, SEC에 의해 탐지되지 않은 VLP 단백질은 응집되지 않는다는 것을 추측하는 계산 결과이다.
도 11은 여러 노로바이러스 항원으로 복강내로 면역된 생쥐에서 항-노로바이러스 항체 반응의 ELISA 분석법의 결과를 도시한다. 얇은 화살표는 단지 놀워크 VLPs를 함유하는 제제에 의한 보강 주사를 나타낸다. 두꺼운 화살표는 놀워크 및 g휴스톤 VLPs를 함유하는 제제에 의한 보강 주사를 나타낸다.
도 12는 놀워크 VLPs, 또는 놀워크 및 휴스톤 VLPs로 복강내로 면역된 항-노로바이러스 항체 반응의 ELISA 분석법의 결과를 도시한다.
도 13은 생쥐를 놀워크 VLPs로 비강 면역화 후 114일에 생쥐의 비장세포(A), 경부 림프절(B) 및 골수(C)에서 놀워크 VLP-특이적 장수 혈장 세포들의 존재를 나타낸다.
도 14는 놀워크 VLPs로 비강으로 면역된 생쥐의 비장세포에서 놀워크 특이적 기억 B 세포 반응을 나타낸다. 패널 A는 놀워크 VLPs로 배양하고 0일(왼쪽 그래프) 및 4일(오른쪽 그래프)에 IgA 항체 분비 세포들을 도시한다. 패널 B는 놀워크 VLPs로 배양하고 0일(왼쪽 그래프) 및 4일(오른쪽 그래프)에 IgG 항체 분비 세포들을 도시한다. 0일 내지 4일 사이에 세포들의 수의 차이는 기억 B 세포 팽창과 분화의 수준을 나타낸다.
도 15는 놀워크 VLP 백신 제제로 비강으로 면역된 토끼들로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포들의 ELISPOT 분석 결과를 도시한다. 왼쪽 패널은 0일(조직 배양일)에 놀워크 VLP-특이적 항원 분비 세포들(ASCs)의 수를 나타내는 반면, 오른쪽 패널은 놀워크 VLPs로 배양하고 4일 후 놀워크 VLP-특이적 ASCs의 수를 나타낸다. 0일 내지 4일 사이에 세포들의 수의 차이는 기억 B 세포 반응을 나타낸다.
도 16은 놀워크 VLP 백신 제제로 비강으로 면역된 토끼들로부터 분리된 비장세포들의 ELISPOT 분석 결과를 도시한다. 왼쪽 패널은 0일(조직 배양일)에 놀워크 VLP-특이적 항원 분비 세포들(ASCs)의 수를 나타내는 반면, 오른쪽 패널은 놀워크 VLPs로 배양하고 4일 후 놀워크 VLP-특이적 ASCs의 수를 나타낸다. 0일 내지 4일 사이에 세포들의 수의 차이는 기억 B 세포 반응을 나타낸다.
도 17은 놀워크 VLP 백신 제제로 비강으로 면역된 토끼들로부터 분리된 골수 세포들의 ELISPOT 분석 결과를 도시한다. 왼쪽 패널은 0일(조직 배양일)에 놀워크 VLP-특이적 항원 분비 세포들(ASCs)의 수를 나타내는 반면, 오른쪽 패널은 놀워크 VLPs로 배양하고 4일 후 놀워크 VLP-특이적 ASCs의 수를 나타낸다. 0일에 ASCs의 존재는 장수 혈장 세포들의 존재를 나타낸다. 0일 내지 4일 사이에 세포들의 수의 차이는 기억 B 세포 반응을 나타낸다.
도 18은 놀워크 VLP 백신 제제로 비강으로 면역된 토끼들로부터 분리된 장간막 림프절 세포들의 ELISPOT 분석 결과를 도시한다. 패널 A는 놀워크 VLPs에 특이적인 IgG 양성 항체 분비 세포들(ASCs)을 나타낸다. 패널 B는 놀워크 VLPs에 특이적인 IgA 양성 ASCs를 도시한다. 왼쪽 패널은 0일(조직 배양일)에 놀워크 VLP-특이적 세포들(ASCs)의 수를 나타내는 반면, 오른쪽 패널은 놀워크 VLPs로 배양하고 4일 후 놀워크 VLP-특이적 ASCs의 수를 나타낸다. 0일 내지 4일 사이에 세포들의 수의 차이는 기억 B 세포 팽창과 분화의 수준을 나타낸다.
도 19는 토끼에 인비보 비강 면역화 후 인비트로 항원-특이적 증식 분석법을 도시한다. 왼쪽 패널은 놀워크 VLPs에 의한 재자극 후 T 세포 증식을 나타내는 반 면에, 오른쪽 패널은 놀워크 VLPs에 의한 재자극 후 CD4+T 세포 증식을 나타낸다.
본 발명은 다음 실시예들에서 개시된 특정 실시예들을 참조하여 더욱 상세하게 설명될 것이다. 실시예들은 본 발명의 순수하게 설명하기 위한 것이고 어떤 경우에도 이의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예
1. 다른
노로바이러스
항원 형태에 대한 면역반응 연구
백신 제제의 효과를 연구하기 위해, 생쥐들을 미세피펫에 의해 액체 현탁액 백신 제제로 비강으로(i.n.) 면역시켰다. 생쥐들은 단지 1회 백신 복용량(프라임)을 제공받았다.
실험을 위해서, 세 개 백신 제제를 제조하였다. 100% 응집체로 불리는 제 1 제제를 VLP의 고유 구조를 분리하고 응집을 유도하는 조건하에서 VLPs의 동결건조시켜 제조하였다. 100% 응집되지 않은 제 2 제제를 동결건조되지 않은 VLP 원료로부터 100% 고유 단분산 VLPs를 섞은 재수화된 동결건조 위약으로 제조하였다. 50/50 Mix인 제 3 제제를 1:1의 비율로 상기 두 제제를 혼합하거나 ~50% 응집되지 않은 VLPs 및 50% 응집된 VLPs를 생산하는 조건하에서 동결건조함으로써 제조하였다. 응집되지 않은 고유 VLP의 구조적 상태와 농도는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC) 및 자외선(UV) 흡수도에 의해 분석하였다. 제제들의 전체 단백질 농도(응집체 포함)는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)-재용해 단백질의 정량적 염색에 의해 측정하였다. 응집된/응집되지 않은 비율은 응집되지 않은 고유 VLP 대 전체 단백질의 비율로 계산하였다.
| 그룹 번호 | 키토산 (mg/mL) | 만니톨 (mg/mL) | 수크로오스 (mg/mL) | MPL (mg/mL) | 놀워크 VLP (mg/mL) |
| 1 | 3.5 | 0.750 | 0.750 | 1.0 | 1.0 |
| 2 | 3.5 | 0.750 | 0.750 | 1.0 | 1.0 |
| 3 | 3.5 | 0.750 | 0.750 | 1.0 | 1.0 |
| 4 | 3.5 | 0.750 | 0.750 | 1.0 | 0 |
| 표1. 실험 605.125(생쥐 i.n.)을 위한 프라임 값은 제제들의 최종 농도를 나타낸다. | |||||
복용량: 생쥐 당 20μL, 콧구멍 당 10μL.
그룹 1, 100% Agg: 재수화된 100% 응집 VLP.
그룹 2, 100% Intact: 비-동결건조 VLP 원료로부터의 100% 응집되지 않은 VLPs로 섞인 재수화된 동결건조 위약.
그룹 3, 50/50 mix: 그룹 1 및 2의 용액들의 1:1 혼합물.
그룹 4, 나이브(Naive): 재수화된 동결건조 위약.
이 실험은 다른 노로바이러스 VLP 제제들에 대한 생쥐의 면역반응을 측정한다. 생쥐의 그룹들(그룹당 5 마리)을 표 1에 도시된 재수화된 건조 분말 제제로 1회 비강으로(i.n.) 백신접종 하였다. VLP-함유 제제들로 백신 접종된 동물들은 동일한 양의 전체 단백질을 제공받았다. 100% Agg(100% 응집된 VLP 단백질); 100% Intact(100% 고유한, 단분산 VLPs); 50/50 Mix(단분산 및 응집된 VLP의 1:1 혼합물); 나이브(VLP 단백질 없음). i.n. 면역화 후 14일에, 생쥐들을 안락사시켰고, 경부 림프절 및 비장을 채취하고 인비트로 항원-특이적 세포 증식 분석을 위해 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 이런 분석에서 경부 림프절 세포들 또는 비장세포들의 반응은 인비보 면역화 후 항원에 대한 면역반응을 측정하기 위해 평가되었다. 경부 림프절 세포들 또는 비장세포들을 고유 단분산 VLPs(고유 VLP, 검은 막대) 또는 열-변형 VLP 단백질(△VLP, 흰색 막대)로 다시 자극하고 각 항원 형태(100% Agg, 100% Intact, 50/50 Mix 또는 naive)로부터의 세포 증식의 정도는 세로 좌표축(CPM)에 나타낸 대로 삼중수소화 티미딘 포함에 의해 측정하였다(도 1, 경부 림프절 세포; 도 2, 비장세포).
실시예
2.
인비트로
항원-특이적 증식 분석
백신 제제들의 효과를 더 연구하기 위해서, 생쥐들을 액체 현탁액 백신 제제로 복강내로(i.p.) 면역시켰다. 생쥐들은 단지 1회 백신 복용량(프라임)을 제공받았다.
실시예 1과 유사하게, 생쥐의 그룹들(그룹당 5마리)을 백신접종 하였고, 표 2에 도시된 재수화된 건조 분말 제제들로, 이번에는 1회 복강내로(i.p.) 백신접종 하였다. 다시, VLP-함유 제제들로 백신 접종된 동물들은 동일한 양의 전체 단백질을 제공받았다. 100% Agg(100% 응집된 VLP 단백질); 100% Intact(100% 고유한, 응집되지 않은 VLPs); 50/50 Mix(응집되지 않은 및 응집된 VLP의 1:1 혼합물); 나이브(VLP 단백질 없음).
| 그룹 번호 | 키토산 (mg/mL) | 만니톨 (mg/mL) | 수크로오스 (mg/mL) | MPL (mg/mL) | 놀워크 VLP (mg/mL) |
| 1 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 2 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 3 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 4 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0 |
| 실험 605.127(생쥐 i.p.)을 위한 프라임 값은 제제들의 최종 농도를 나타내고 1회 10mg 전달 장치와 동일하다. | |||||
복용량: 생쥐 i.p. 당 1mL.
그룹 1, 100% Agg: 재수화된 100% 응집 VLP.
그룹 2, 100% Intact: 비-동결건조 VLP 원료로부터의 100% 응집되지 않은 VLPs로 섞인 재수화된 동결건조 위약.
그룹 3, 50/50 mix: 동결건조된 50/50 응집되지 않은 VLP/응집체로부터 재수화.
그룹 4, 나이브: 재수화된 동결건조 위약.
이 분석에서, 인비보 면역화 이후 다른 설치류 세포들 대 VLPs의 반응을 측정하였다. 면역화 후 14일에, 생쥐들을 안락사시켰고, 비장을 채취하고 1회 세포 현탁액을 제조하였다. 비장세포들을 응집되지 않은 고유 VLPs(고유 VLP, 점선 막대) 또는 열-변형 VLP 단백질(△VLP, 흰색 막대)로 다시 자극하고 각 항원 형태(100% Agg, 100% Intact, 50/50 Mix 또는 naive)로부터의 세포 증식의 정도는 세로 좌표축(CPM)에 나타낸 대로 삼중수소화 티미딘 포함에 의해 측정하였다(도 3). 이런 데이터는 백신 제제들로 제조된 VLPs의 다른 생물물리학적 형태가 필적할만한 T 세포 반응들을 유도하는 것을 나타낸다.
실시예
3.
VLP
-특이적
ELISPOT
분석
VLP-특이적 항체-분비 세포(ASC) 반응들은 실시예 2에 개시된 다른 NV-VLP 제제로 복강내로 면역된 생쥐들로부터 측정하였다. 생쥐의 그룹(그룹당 5마리)을 표 2(실시예 2)에 도시된 재수화된 건조 분말 제제로 1회 복강으로(i.P.) 백신접종 하였다. VLP-함유 제제들로 백신 접종된 동물들은 동일한 양의 전체 단백질을 제공받았다. 100% Agg(100% 응집된 VLP 단백질); 100% Intact(100% 고유한, 응집되지 않은 VLPs); 50/50 Mix(응집되지 않은 및 응집된 VLP의 1:1 혼합물); 나이브(VLP 단백질 없음). 14일에, 생쥐를 안락사시키고 경부 림프절을 채취하였다. 경부 림프절 세포들을 고유한, 응집되지 않은 VLP-코팅 ELISPOT 플레이트 상에서 밤새 배양하였고 적절한 HRP-접합 2차 항체를 사용하여 IgG 또는 IgA-특이적 ELISPOTS를 위해 성장시켰다(도 4). 이런 데이터는 3개 VLP 항원 제제는 모두 항원-특이적 B 세포 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. 100% Agg VLPs로 면역된 그룹은 최대 면역반응을 나타내었다.
실시예
4.
VLP
-특이적
ELISA
VLP-특이적 항체-분비 세포(ASC) 반응들은 실시예 2에 개시된 다른 NV-VLP 제제로 복강내로 면역된 생쥐들로부터 측정하였다. 생쥐의 그룹(그룹당 5마리)을 표 2(실시예 2)에 도시된 재수화된 건조 분말 제제로 1회 복강으로(i.P.) 백신접종 하였다. VLP-함유 제제들로 백신 접종된 동물들은 동일한 양의 전체 단백질을 제공받았다. 100% Agg(100% 응집된 VLP 단백질); 100% Intact(100% 고유한, 응집되지 않은 VLPs); 50/50 Mix(응집되지 않은 및 응집된 VLP의 1:1 혼합물); 나이브(VLP 단백질 없음). 14일에, 혈청은 수집하고 항-VLP-특이적 혈청 IgG에 대해 ELISA로 분석하였다(도 5). 이런 데이터는 실시예 3에 도시된 결과와 관련이 있고, 3개 VLP 항원 제제는 모두 항원-특이적 B 세포 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. 다시, 100% Agg VLPs로 면역된 그룹은 최대 면역반응을 나타내었다.
실시예
5. 토끼의 백신 제제.
제제들을 발로이스 모노파워 비강 투여 장치를 사용하여 토끼에 비강(i.n.)으로 투여하였다. 건조 분말 제제들은 표 3 및 4에 도시된다.
| 그룹 번호 | 키토산 (mg/10mgDP) | 만니톨 (mg/10mg) | 수크로오스 (mg/10mg) | MPL (mg/10mg) | 놀워크 VLP (mg/10mg) |
| 1 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 2 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 3 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 4 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0 |
| 값들은 전체 복용량의 1/2인 단일 장치(10mg DP)를 기초로 한 제제들의 최종 농도를 나타낸다. | |||||
복용량: 동물당 20mg DP, 콧구멍 당 10mg.
그룹 1, 100% Agg: 응집된 동결건조 VLP.
그룹 2, 100% Intact: 100% 응집되지 않은 동결건조 VLP
그룹 3, 50/50 mix: 50/50 응집되지 않은 VLP/응집된 동결건조 VLP(1 & 2의 혼합물 아님)
그룹 4, 나이브: 위약.
| 그룹 번호 | 키토산 (mg/10mgDP) | 만니톨 (mg/10mg) | 수크로오스 (mg/10mg) | MPL (mg/10mg) | 놀워크 VLP (mg/10mg) |
| 1 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 2 | 7 | 0 | 2.95 | 0.025 | 0.025 |
| 3 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0.025 |
| 4 | 7 | 1.475 | 1.475 | 0.025 | 0 |
| 값들은 전체 복용량의 1/2인 단일 장치(10mg DP)를 기초로 한 제제들의 최종 농도를 나타낸다. | |||||
복용량: 동물당 20mg DP, 콧구멍 당 10mg.
그룹 1, 100% Agg: 100% 응집된 동결건조 VLP.
그룹 2, 100% Intact: 100% 응집되지 않은** VLP*
그룹 3, 50/50 mix: 50/50 응집되지 않은 VLP/응집된 동결건조 VLP(1 & 2의 혼합물 아님)
그룹 4, 나이브: 동결건조 위약.
*응집되지 않은 VLP 동결건조 후의 양을 증가시키기 위해 만니톨 없이 제제화하였다.
**제제는 단지 ~80% 응집되지 않은 VLP를 생산하였다.
실시예
6.
생쥐에서
노로바이러스
백신 제제의 효능 분석
암컷 C57B16 생쥐들을 재조합된 놀워크 VLP 건조 분말 백신(놀워크 VLP, MPL 및 키토산 함유)의 다른 용액으로 0일에 복강내(i.p.)로 면역시켰다. 각 동물을 나타낸 100μL의 제제로 주사하였다. 혈청을 주마다 수집하고 혈청 항-VLP IgG를 ELISA로 측정하였다. 면역화 후 3주에 수집한 혈청들에 대한 값들은 도 6에 도시된다.
각 개별 생쥐에 대한 값은 그룹 평균을 나타내는 막대로 나타내어진다. 혈청 항-VLP IgG 값들은 나타낸 백신들의 복용량과 상관관계가 있다. 이런 실험 설계는 개선되었고 인간 임상 실험을 위한 GMP 제조된 백신들의 방출을 위해 필요한 효능 분석법으로 개발되었다(도 6).
실시예
7.
생쥐에서
액체
vs
. 재조합
노로바이러스
제제의 효능
암컷 C57B16 생쥐들을 키토산, 만니톨, MPL 및 100μL의 부피의 다양한 농도의 놀워크 VLP(표 5)를 함유한 제제로 0일에 i.p.로 면역시켰다. 내부 표준 곡선을 정제수에 10mg/mL의 건조 분말 기질(만니톨, MPL, 및 키토산)을 용해시키고 특정량의 액체 놀워크 VLP를 첨가하여 생성되었다(그룹 1-5). 반대로, GMP VLP 로트는 미리 동결건조하였고 1.0ml의 정제수에 용해시켰다(그룹 608). 혈청을 14일, 21일 및 30일에 생쥐로부터 수집하였고 혈청 항-놀워크 VLP IgG를 ELISA에 의해 측정하였다.
| 그룹 | 치료 | 95% Cl | 계산된 효능 | ||
| 효능 | 최소 | 최대 | |||
| 1 | 위약에 5㎍ VLP | 0.173 | 58.0 | 39.0 | 86.3 |
| 2 | 위약에 2.5㎍ VLP | 0.192 | 23.3 | 15.0 | 36.3 |
| 3 | 위약에 1.25㎍ VLP | 0.182 | 11.2 | 7.4 | 17.0 |
| 4 | 위약에 0.63㎍ VLP | 0.287 | 5.4 | 2.8 | 10.4 |
| 5 | 위약에 0.31㎍ VLP | 0.114 | 3.8 | 2.9 | 4.9 |
| 6 | 2.5㎍ GMP 로트 | 0.276 | 11.3 | 6.0 | 21.3 |
| 7 | 7.5㎍ GMP 로트 | 0.221 | 96.8 | 58.2 | 161.0 |
| 8 | 25㎍ GMP 로트 | 0.147 | 113.6 | 80.9 | 159.5 |
각 제제에 대한 상대 효능은 다음 식을 사용하여 계산한다: Inv Log(평균- Y 절편/기울기). 효능은 제제에서 VLP 농도에 대해 표시하고 기질 백그라운드 속에 섞인 공지된 양의 VLP를 사용하여 생산된 표준 곡선에 관해 보고되었다. 도시된 결과들은 3개의 개별 혈청 수집 시간 지점을 나타낸다. 이런 데이터는 건조 분말 놀워크 VLP 제제는 액체 제제보다 전체적으로 더 높은 효능을 가진다.
실시예
8.
토끼에서
건조 분말 제제의 효능
43마리 암컷 뉴질랜드 흰색 토끼를 건조 분말 속에 제제화된 5㎍(낮음) 또는 25㎍(높음)의 놀워크 VLPs±MPL 및±키토산으로 발로이스 모노파워 비강 투여 장치를 사용하여 비강(i.n.)으로 면역시켰다. 한 그룹은 액체로 제제화된 높은 복용량의 VLPs 및 MPL을 제공받았고 근육내(i.m)로 투여하였다. 토끼들을 0일 및 21일에 백신접종하였다. 사용할 때 MPL은 VLPs와 같은 복용량(즉, 5㎍ 놀워크 VLPs 및 5㎍ MPL)으로 사용하였다. 사용할 때 키토산은 7mg/dose이었다.
놀워크 VLPs에 특이적인 혈청 IgG(ELISA에 의해 측정)는 도 8에 도시된다. 각 치료 그룹에 대한 평균값들은 21일(추가 면역화 직전에 수집된 왼쪽 패널) 및 42일(오른쪽 패널)에 대해 도시된다. 값들을 U/mL의 VLP-특이적 IgG에 나타내었고, 1U는 대략 1㎍이다. 표준편차는 막대로 나타낸다. 음성 대조군(3마리 토끼) 및 근육내 면역된 그룹(4마리 동물)을 제외하고, 모든 치료 그룹들은 6마리 동물을 가졌다. 이런 데이터는 일반적으로 VLP가 높으면 높을수록 더 큰 혈청 항-VLP IgG 수준을 발생시킨다는 것을 보여준다. 특히 키토산은 비강 백신에 대한 반응들을 향상시킨다. i.m. 면역된 그룹은 최대의 반응들을 보여주었다. 그러나, 비강으로 면역된 그룹들에서 VLP-특이적 IgG 수준도 매우 강했다.
실시예
9.
토끼에서
비강으로 제공된 액체
vs
. 건조
노로바이러스
제제의 효능
암컷 뉴질랜드 흰색 토끼들을 건조 분말 또는 액체 속에 제제화된 50㎍의 놀워크 VLPs + 50㎍ MPL + 14mg 키토산을 가진 발로이스 모노파워 비강 투여 장치를 사용하여 비강으로 면역시켰다. 백신 함량은 물리적 상태를 제외하고 동일하였다. 최초 백신 이후에 3주 및 다시 6주에 추가 면역화 이전에 수집한 혈청으로 0일 및 21일(0주 및 3주)에 면역화하였다. 놀워크 VLPs에 특이적인 혈청 IgG를 ELISA로 측정하였고 결과는 도 9에 도시된다.
그룹 평균이 표시되며, 막대들은 표준 편차를 나타낸다. 건조 분말 면역화 그룹은 6마리 토끼를 가지며 액체 면역화 그룹은 10마리 토끼를 가진다. 8마리 음성 대조군 토끼를 나타내었다. 3주에 액체 및 건조 분말 면역화 그룹 사이에 약간의 차이가 보였다; 그러나, 최초 면역 이후 6주에, 건조 분말 제제로 면역된 토끼들은 액체 면역화 그룹과 비교해서 뛰어난 항체 항-VLP IgG 반응을 가졌다.
실시예
10.
노로바이러스
건조 분말 제제의 안정성
건조 분말 VLP 제제의 안정성을 조사하기 위해서, 다량의 약품을 25㎍ MPL, 700㎍ 키토산 글루타메이트, 1.475mg 만니톨 및 1.475mg 수크로오스를 가진 용액에 (10mg 약품당) 25㎍의 유전자 그룹 I VLP를 혼합함으로써 제조하였다. 용액을 동결건조하고, 추가로 6.3mg 키토산 글루타메이트(10mg 약품당)와 혼합하고, 아주 적은 10mg의 건조 분말로 베스파크 1회 복용 장치에 채우고 건조 캡슐로 밀봉된 호일 주머니에 저장하였다. 전체 VLP 함량은 임페리얼 스태인드 SDS-PAGE(Imperial stained SDS- PAGE)를 사용하여 측정하였고 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 응집되지 않은 VLP 함량을 정량하였다. 이런 측정값들은 실험 오차 내에서, 전체 또는 응집되지 않은 VLP의 변화가 12달 동안에 걸쳐 탐지되지 않았다는 것을 나타내었다(도 10). SDS-PAGE 결과와 비교했을 때, SEC에 의한 더 낮은 VLP 단백질 회수율은 응집 때문이며, 계산된 % 응집체는 시간이 지남에 따라 증가하지 않았으나 12달의 저장기간 동안 일정하거나 감소하였다. 단백질에 관한 더욱 일반적인 안정성 문제 중 하나는 저장에 의해 응집이 증가하는 것이다. 도 10에서 이런 결과를 기초로하여, 제제는 안정적인 비율의 응집되지 않은 VLPs를 만들어 생성물을 제조하고 적어도 1년 동안 사용하게 한다.
실시예
11. 여러
노로바이러스
항원
8마리 C57B1/6 생쥐(암컷, 9주)들을 0.7mg 키토산 2.5㎍ MPL 및 0.3mg 만니톨로 제제화하고 물로 0.1mL를 만든 2.5㎍ 놀워크 VLP로 0일 및 14일에 복강내(IP)로 면역시켰다. 2마리 대조군 생쥐를 함염물로 면역시켰다. 28일 및 49일에, 0.7mg 키토산 2.5㎍ MPL 및 0.3mg 만니톨로 제제화하고 물로 0.1mL를 만든 2.5㎍ 놀워크 VLP + 2.5㎍ 휴스턴 VLP으로 IP로 다시 면역시켰다. 대조군 생쥐들에 함염수를 제공하였다. 혈청 샘플들을 5주(35일)를 시작으로 매주 채취하였고 놀워크 VLPs 또는 휴스톤 VLPs에 의한 반응성을 ELISA로 분석하였다. 놀워크 만의 혼합물에 의한 추가 면역화의 시간은 얇은 화살표로 나타내고 놀워크 + 휴스톤 VLP 혼합물은 두꺼운 화살표로 나타낸다. U/mL(1U는 대략 1㎍의 IgG)으로 놀워크 VLPs(상부 패널) 또는 휴스턴 VLPs(바닥 패널)에 특이적인 개별 혈청 IgG 반응들이 도시된다. 평균은 막대로 나타낸다. 항-놀워크 반응들은 0일 및 14일(0 및 2주)에서 2개의 이전 면역화 때문에 훨씬 더 강하기 때문에 Y-축 값은 다르다는 것을 유의해야 한다. 그러나, 휴스톤 VLPs에 대한 반응들은 매우 강하고, 추가 면역화 후 2주에 큰 증가가 나타났다. 이런 데이터는 특이적 면역 반응들은 동일한 면역 혼합물에서 다른 항원 균주의 노로바이러스 VLPs에 대해 발생할 수 있다는 것을 증명한다(도 11).
실시예
12. 다른
노로바이러스
항원들에 대한 면역 반응
암컷 C57B16 생쥐들을 25㎍ 놀워크 VLP, 25㎍ 휴스턴 VLP, 또는 25㎍의 놀워크 및 휴스턴 VLP의 조합으로 0일 및 14일에 비강(IP)으로 면역시켰다. 혈청을 매주 채취하였고 혈청 항-VLP IgG를 ELISA로 측정하였다. 면역화 후 4주에 수집된 혈청에 대한 값들은 도 12에 도시하였다.
면역화의 VLP의 함량은 X축에 나타내었다. 각 생쥐에 대한 값을 나타내었고, 막대는 그룹 평균을 나타낸다. 항체 수준은 U/mL로 나타내었고, 1U는 대략 1㎍의 혈청 IgG이다. 왼쪽 패널의 값은 포획 물질로서 놀워크 VLPs를 사용하여 측정하였고, 휴스턴 VLPs는 오른쪽 패널 상의 값을 측정하기 위해서 ELISA 플레이트를 코팅하는데 사용하였다. 이런 데이터는 놀워크 VLP에 의한 면역화는 휴스턴 VLPs를 인식할 수 있는 혈청 항체들을 유도하지 않을 수 있거나 그 반대라는 것을 나타낸다.
실시예
13. 수크로오스 및 키토산의 혼합물은 건조 분말 제제에서
노로바이
러스
VLP
구조를 보존한다
다음 실험들은 동결건조하는 동안 고유 놀워크 VLP 4차 구조에 대한 선-동결건조 용액에서 수크로오스, 키토산, 및 만니톨 단독 또는 조합의 효과를 검사하였다. 표 6은 관심 성분의 선-동결건조 용액의 농도를 나타내는 여러 실험들의 혼합이다. 모든 용액들은 수동으로 교반하고 부드럽게 환류시켜 균질화한 후, 액체 질소에서 껍질을 동결하고 약 30 내지 60시간 동안 사이드-암 용기를 사용하여 유닛에 대해 외부를 동결건조하였다.
| 실험 및 샘플 | 성분 선-동결건조의 용액 농도(mg/mL) | 전체 부피 (mL) | 질량 해당량 S = 수크로오스 C = 키토산 M = 만니톨 | |||||
| 수크로오스 | 키토산 | 만니톨 | VLP(단백질) | S | C | M | ||
| LE1 | 0 | 0 | 100 | 0.83 | 0.30 | 0 | 0 | 1 |
| LE2 | 0 | 0 | 75.0 | 0.62 | 0.40 | |||
| LE3 | 0 | 0 | 50.0 | 0.42 | 0.60 | |||
| LE4 | 0 | 0 | 25.0 | 0.21 | 1.20 | |||
| LE5 | 0 | 0 | 10.0 | 0.08 | 3.00 | |||
| LG1-LG3 | 0 | 7.83 | 0 | 0.20 | 1.28 | 0 | 1 | 0 |
| LG4-LG6 | 0 | 5.06 | 0 | 0.13 | 1.98 | |||
| LG7-LG9 | 0 | 2.09 | 0 | 0.05 | 4.78 | |||
| LG10 | 19.32 | 1.93 | 0 | 0.05 | 5.18 | 10 | 1 | 0 |
| LG11 | 10.05 | 2.01 | 0 | 0.05 | 4.98 | 5 | 1 | |
| LG12 | 5.13 | 2.05 | 0 | 0.05 | 4.88 | 2.5 | 1 | |
| LG13 | 9.52 | 0.00 | 0 | 0.09 | 2.63 | 1 | 0 | |
| LJ1-LJ2 | 5.29 | 2.51 | 0 | 0.09 | 2.79 | 2 | 1 | 0 |
| LJ3-LJ4 | 4.17 | 1.98 | 0 | 0.07 | 3.54 | |||
| LJ5-LJ6 | 3.65 | 1.73 | 0 | 0.06 | 4.04 | |||
| LJ7-LJ8 | 2.93 | 1.39 | 0 | 0.05 | 5.04 | |||
| LJ9-LJ10 | 5.25 | 2.49 | 0 | 0.09 | 2.81 | |||
| LJ11-LJ12 | 4.14 | 1.97 | 0 | 0.07 | 3.56 | |||
| LJ13-LJ14 | 3.63 | 1.72 | 0 | 0.06 | 4.06 | |||
| LIG1d-Sa | 2.98 | 1.42 | 0.00 | 1.12 | 4.94 | 2 | 1 | 0 |
| LIG1d-S1 | 12.89 | 6.12 | 0.00 | 1.12 | 2.29 | 2 | 1 | 0 |
| LIG1d-S2 | 12.26 | 5.82 | 12.26 | 0.67 | 2.41 | 1 | 0.5 | 1 |
| LIG1d-Sb | 2.95 | 1.40 | 2.95 | 0.67 | 5.00 | 1 | 0.5 | 1 |
| LIG1d-S3 | 29.32 | 0.00 | 29.32 | 0.83 | 1.01 | 0 | 0 | 1 |
표 7은 표 6에 나타낸 동결건조 샘플들의 크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC) 분석의 결과를 나타낸다. 동결건조 샘플들은 물로 재구성되고 SE-HPLC로 분석하였다. 동시에 분석한 가공되지 않은 NV-VLPs는 재구성 검사 샘플들의 NV-VLP 함량을 정량하기 위한 참조 표준으로 사용되었다. 정량화를 위해 UV 및 형광 탐지기를 사용하였다(도시된 데이터는 형광 탐지기로부터 얻었다). 10mM 인산 나트륨, 10mM 시트르산, pH 5 및 500mM NaCl로 이루어진 이동상으로, 0.5mL/min의 유속에서 슈퍼로스TM 6 10-300 컬럼을 사용하여 SE-HPLC를 수행하였다. 단백질 농도를 용출 피크의 적분 면적을 사용하여 정량화하였다. "VLP"는 컬럼으로부터 약 15분에 용출된 피크이고 참조 기준 NV-VLP의 대략 용출 시간 원도우 내의 임의의 앞선 숄더 및/또는 피크 테일도 동시에 분석하였다. 약 32분에서 컬럼으로부터 용출된 VLP 단편은 VLP의 불안정화 및 결과적인 분해로부터 발생한 매우 안정한 단일 종들이다. 중간 및 소형 단편들은 발견되지 않았다.
결과들은 수크로오스와 키토산의 조합이 최고(대략 100% 회수율) 후-동결건조(샘플 LG10-LG12)를 포함하는 넓은 범위의 고유 단분산 NV-VLP 회수율을 만들었다. 또한, 이런 샘플들로부터의 NV-VLP는 용출 피크 모양들은 고유 구조의 높은 보존을 나타내는 미가공된 NV-VLP 참조 표준과 동일하였다. 수크로오스만을 함유하는 샘플들은 참조 표준과 유사한 피크 모양을 나타내었으나, NV-VLP 회수율은 낮았다(대략 60% 회수율(샘플 LG13)). 만니톨만을 함유했던 샘플들은 거의 완전히 응집된 VLPs를 생산하였다(샘플 LE1-LE6 및 LIG1d-S3). NV-VLP 구조에 대한 만니톨의 해로운 효과들은 키토산과 수크로오스의 존재에 의해 반대로 작용하였다(샘플 LIG1d - S2 및 LIG 1d-SB).
| 실험 및 샘플 | 이론적 VLP 농도(mg/mL) | N | 측정된 SE-HPLC 평균 단백질 농도 및 피크 용출 시간 | 이론적 비율로서 인식된 단백질의 평균 비율 값 | 질량 해당량 S = 수크로오스 C = 키토산 M = 만니톨 | ||||
| "VLP" ~15분 (mg/mL) | VLP 단편 ~32분 (mg/mL) | 전체 단백질 (%) | "VLP" (%) | ||||||
| S | C | M | |||||||
| LE1-LE5 | 0.25 | 5 | 0.02 | 0.12 | 56.0 | 6.3 | 0 | 0 | 1 |
| LG1-LG9 | 0.25 | 9 | 0.06 | 0.00 | 24.0 | 24.0 | 0 | 1 | 0 |
| LG10 | 0.25 | 1 | 0.25 | 0.00 | 101 | 101 | 10 | 1 | 0 |
| LG11 | 0.25 | 1 | 0.25 | 0.00 | 101 | 101 | 5 | 1 | 0 |
| LG12 | 0.25 | 1 | 0.25 | 0.00 | 100 | 100 | 2.5 | 1 | 0 |
| LG13 | 0.25 | 1 | 0.16 | 0.00 | 65 | 65 | 1 | 0 | 0 |
| LJ1-LJ14 | 0.25 | 14 | 0.22 | 0 | 85.4 | 85.4 | 2 | 1 | 0 |
| LIG1d-S1 | 0.25 | 1 | 0.21 | 0 | 88 | 88 | 2 | 1 | 0 |
| LIG1d-Sa | 0.25 | 1 | 0.12 | 0 | 50 | 50 | 2 | 1 | 0 |
| LIG1d-S2 | 0.25 | 1 | 92 | 0 | 92 | 92 | 1 | 0.5 | 1 |
| LIG1d-Sb | 0.25 | 1 | 60 | 0 | 60 | 60 | 1 | 0.5 | 1 |
| LIG1d-S3 | 0.25 | 1 | <1 | <1 | <1 | <1 | 0 | 0 | 1 |
실시예
14. 비강으로 면역된 생쥐들에서
노로바이러스
-특이적 장수 혈장 세포 및 기억 B 세포의 유도
A. 놀워크 VLP-특이적 장수 혈장 세포들
BALB/c 생쥐들을 노로바이러스 VLPs 및 항원보강제로 비강으로 면역시켰다. 나이브 대조군들은 항원보강제만을 투여하였다. 면역화 후 114일에, 비장, 경부 림프절 및 골수를 두 그룹들의 생쥐로부터 채취하였다. 조직들을 채취하는 날(0일), 항원-특이적 항체-분비 세포들(ASCs)의 존재를 대해 ELISPOT 분석법을 사용하여 세포들을 분석하였다. 결과들은 다른 조직들에 대한 도 13A-C에 제공된다. 이런 조직들에서 면역글로불린(IgG, IgA 및 IgM)의 탐지는 노로바이러스-특이적 장수 혈장 세포들의 존재를 나타낸다.
B. 놀워크 VLP-특이적 기억 B 세포들
인비트로 분석법은 놀워크 VLPs로 비강으로 면역된 생쥐들로부터의 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포들의 존재를 탐지하기 위해 개발하였다. 여러 림프 조직 또는 전혈(말초 혈액 단핵 세포, 비장세포, 림프절 세포 등)은 이런 분석법을 사용하여 기억 B-세포들의 존재를 분석할 수 있는 세포들의 원료로 사용될 수 있다.
이 실험에서, 비장을 면역된 및 면역되지 않은 동물(대조군)로부터 채취하고 가공하였고, 비장세포들은 놀워크 VLPs(20㎍/ml)의 존재 또는 부존재(대조군)하에서 4일 동안 배양하였다. 최초 VLP-특이적 ELISPOT 분석법을 ASCs의 백그라운드 레벨을 설정하기 위해 조직 채취하는 날(0일) 수행하였다(상기 섹션 A 참조). 배양 4일 후, 세포들을 채취하고 VLP-특이적 ASCs의 수를 정량하기 위해 ELISPOT 분석법으로 다시 분석하였다. 분석 0일 내지 4일 사이의 VLP-특이적 ASC 수의 차이는 항원-특이적 기억 B-세포 집단을 나타낸다. 이런 실험의 결과들은 도 14a 및 b에 도시된다.
실시예
15. 토끼들에서
노로바이러스
기억 B 세포 반응들
2마리의 암컷 뉴질랜드 흰색 토끼를 발로이스 마크 4 비강 전달 장치에 채운 10mg의 건조 분말당 25㎍ 놀워크, 25㎍ MPL, 1.5mg 만니톨, 1.5mg 수크로오스 및 7.0mg 키토산으로 이루어진 건조 분말 제제로 비강으로 면역시켰다. 2마리 토끼들을 14일 간격으로 전체 3회 면역화하였다. 이런 실험들의 경우, 면역되지 않은 암컷 토끼는 나이브 대조군으로 사용하였다.
A. 토끼 조직들의 수집 및 가공
말초 혈액 단핵 세포(PBMCs): 전혈(~50mL)은 응집을 막기 위해 EDTA를 함유하는 수집 튜브로 토끼들로부터 얻었다. 전혈을 살균 D-PBS로 1:3으로 희석하고 ~35mL의 희석된 전혈을 살균 50mL 원심분리 튜브로 15mL의 림프구 분리 매질 위에 층을 이루게 하였다. 튜브를 실온에서 20분 동안 800 x g에서 원심분리하였다. PBMCs를 함유하는 황갈색 코팅층을 살균 5mL 피펫을 사용하여 조심스럽게 제거하고 세포들을 D-PBS로 2회 세척하였다. 필요한 경우, 오염시키는 적혈구 세포들은 ACK 용해로 제거하였다. 세포들을 RPMI-1640-10% FBS(1640-C)에 재현탁하고 트립판 배제 방법을 사용하여 혈구계산기로 계수하였다.
장간막 림프절 세포들: 림프절들은 안락사 후 각 토끼로부터 개별적으로 무균상태로 얻었다. 조직들을 ~10mL의 RPMI-1640-No 혈청(1640-NS)을 함유하는 살균 플라스틱 페트리 접시에 놓았다. 림프절들을 살균 막자를 사용하여 살균 메시 스키린을 통과하도록 압축시켜 조직을 분산시키고 림프절 세포들의 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포들을 수집히고, 1640-NS로 2회 세척하고 마지막으로 살균된 70㎛ 필터를 통과시켜 여과하여 세균 덩어리와 잔해를 제거하였다. 세포들을 1640-C에 재현탁하고 트립판 블루 배제 방법을 사용하여 혈구계산기에서 계수하였다.
비장세포: 비장을 안락사 후 각 토끼로부터 개별적으로 무균상태로 얻었다. 비장을 대략 10mL의 1640-NS를 함유하는 살균 페트리 접시에 놓았다. 살균 22-게이지 바늘과 주사기를 사용하여 매질을 조직에 반복해서 주사하여 비장 피막을 파괴시켜 세포들을 동화시켰다. 살균 핀셋을 사용하여 잔존하는 조직 단편들을 가늘게 찢었다. 페트리 접시의 내용물을 살균 원심분리 튜브에 옮기고 세포 현탁액과 파괴된 혈장 조직을 6-8분 동안 큰 조직 단편이 침전되도록 가만히 두었다. 단 세포 현탁액을 제 2 살균 원심분리 튜브에 옮기고 세포들을 1640-NS로 1회 세척하였다. 비장세포 조제액 속의 적혈구 세포들을 ACK 용해(8mL ACK 버퍼, 8분, 실온)에 의해 제거하고 세포들을 세척하고 마지막으로 살균된 70㎛ 필터를 통과시켜 여과하여 세균 덩어리와 잔해를 제거하였다. 최종 세포 펠렛을 1640-C에 재현탁하고 트립판 블루 배제 방법을 사용하여 혈구계산기에서 계수하였다.
골수 세포들: 뒷다리의 경골 벼를 안락사 후 개별 토끼로부터 제거하였다. 골수 세포들을 제거하기 위해 뼈들의 단부를 뼈 톱을 사용하여 살균상태로 제거하고 뼈의 내용물을 1640-NS 매질을 반복해서 주사하여 씻었다. 골수 세포들을 끊어질 때까지 반복해서 피펫으로 들었다 놓고 세포들의 덩어리를 분산시켰다. 세포들을 1640-NS로 1회 세척하였고; 적혈구 세포들을 ACK로 용해하고 세포들을 1640-NS로 1회 이상 세척하였다. 마지막으로, 세포들을 살균된 70㎛ 필터를 통과시켜 여과하여 세균 덩어리와 잔해를 제거하였다. 최종 세포 펠렛을 1640-C에 재현탁하고 트립판 블루 배제 방법을 사용하여 혈구계산기에서 계수하였다.
B. ELISPOT 분석법
미리 적시고 세척한 후, 96-웰 밀리포어 PVDF 필터 플레이트들을 50㎕/well의 최종 부피로 40㎍/ml의 농도로 고유 놀워크 VLPs의 살균 용액으로 코팅하였다. 플레이트들을 4℃에서 밤새 배양하고 D-PBS로 세척하고 1640-C를 첨가하여 봉쇄하였다. 면역된 토끼들 및 나이브 대조군 토끼들로부터의 장간막 림프절 세포들, 비장 세포들 및 골수 세포들을 다양한 농도(1x106, 5x105, 2x105 및 1x105cells/well)로 웰에 첨가하고 플레이트들을 37℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트들을 PBS-트윈으로 완전히 세척하고 IgG 및 IgA에 특이적인 보조 시약들을 웰들에 첨가하고 실온에서 추가로 2시간 동안 배양하였다. 깨끗이 세척한 후, 플레이트를 DAB 크로마겐/기질로 현상하고 ELISPOT 플레이트 리더로 읽었다. 나이브 대조군 동물들로부터 웰들 상에 나타난 점들을 실험 그룹들로부터 배제하였다. 데이터는 놀워크 VLP-특이적 항체-분비 세포(ASCs)로 표시되며 1x106 세포당 정상화된다.
C. 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포 분석
상기한 다양한 조직들로부터 분리된 림프구 세포들을 mL당 5x106 세포들의 밀도로 놀워크 VLPs(10㎍/mL)의 존재하에서 1640-C 매질에 재현탁하였다. 세포들을 37℃에서 4일 동안 1mL 부피로 24-웰 플레이트에서 배양하였다. VLP-특이적 ELISPOT 분석법을 배양과 동시에 이런 세포들에 수행하였다. 4일 동안 배양한 후 세포들을 채취하고, 1640-NS 매질로 2회 세척하고, 1640-C에 재현탁하고 트립판 블루 배제 방법을 사용하여 혈구계수기에서 계수하였다. 세포들을 놀워크 VLP-특이적 ELISPOT 분석법으로 다시 한 번 검사하였다. 조직 채취일에 수행된 ELISPOT 분석법으로부터 얻은 데이터는 0일(백그라운드)ASC 활성으로 부른다. 0일에 탐지된 임의의 점들은 활성적으로-분비된 혈장 세포 또는 장수 혈장 세포(LLPCs)인 것으로 생각된다. 4일 배양된 세포에 대해 수행된 ELISPOT 분석법으로부터 얻은 데이터는 4일 ASC 활성으로 부르고, 기억 B-세포 활성은 4일 ASC 활성 내지 0일 ASC 활성 사이의 차이로 나타난다.
D. 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포들은 비강으로 면역된 토끼들의 말초 혈액에 존재한다
전혈을 상기한 대로 놀워크 VLPs를 함유하는 건조 분말 제제 백신으로 최종 3회 비강 면역화 이후 141일에 2마리 면역된 토끼(RB735, RB1411)로부터 얻었다. 면역되지 않은 나이브 토끼로부터 혈액을 얻었다. 혈액을 가공하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 얻었고 PBMCs를 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포 분석법으로 분석하였다(상기 섹션 C). 결과들은 도 15에 도시된다. 왼쪽 패널은 조직 채취 시간(0일 ASCs)에 최초 ELISPOT 분석법의 결과를 도시한다. 오른쪽 패널은 놀워크 VLPs로 배양하고 4일 후(4일 ASCs) ELISPOT 분석법의 결과를 도시한다.
0일 ELISPOT 결과(도 15, 왼쪽 패널)는 놀워크 VLP 건조 분말 백신으로 최종 추가 면역화 후 대략 140일에 말초 혈액에 잔존하는 VLP-특이적 혈장 세포들이 없다는 것을 나타낸다. 도 15의 오른쪽 패널은 ELISPOT 분석은 놀워크 VLPs로 인비트로 4일 동안 배양한 PBMCs로부터 얻는다는 것을 보여준다. 2마리 면역된 토끼에서, 기억 B-세포들의 부차 집단인 현저한 수의 PBMCs는 활성 IgG-분비 놀워크 VLP-특이적 혈장 세포들 속에서 성숙되었다. 비록 IgA-분비 기억 B-세포들에 대한 분석법을 수행하였지만, 단지 IgG-분비 기억 B-세포들만 PBMC 집단에서 탐지하였다. 예상대로, 나이브 동물은 항원-특이적 기억 B-세포들을 나타내지 않았다. 따라서, VLP-특이적 기억 B-세포들은 최종 3회 비강 면역화 이후 140+일에 토끼들의 말초 순환에서 발견되었다.
E. 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포들은 비강으로 면역된 토끼들의 비장에 존재한다
비장 세포들을 2마리 백신 면역된 토끼와 면역되지 않은 대조군 토끼의 비장으로부터 얻었다. 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포 분석법(상기함)을 이런 세포들에 대해 수행하였고 결과는 도 16에 도시된다. PBMC 집단에 대해 관찰함에 따라 0일 ELISPOT 분석은 비장에 존재하는 항원-특이적 혈장 세포들이 없다는 것을 보여준다(도 16, 왼쪽 패널). 그러나, 놀워크 VLPs에 의한 인비트로 배양 4일 후, IgG-분비 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포들은 비장 세포 집단에서 확실히 보인다. 따라서, 비장은 비강 면역화 이후 기억 B-세포들의 이동을 위한 한 부위를 나타낸다.
F. 놀워크 VLP-특이적 장수 혈장 세포들의 집단은 골수에서 발견되나 기억 B-세포들은 존재하지 않는다
골수 세포들은 실험 토끼들의 경골로부터 얻었고 장수 혈장 세포들과 기억 B-세포들의 존재에 대해 분석하였다. 결과는 도 17에 제공된다. 도 17의 왼쪽 패널은 토끼 1411은 골수에 항원-특이적 혈장 세포들의 상당한 집단을 갖는 것으로 나타난다. 골수로 이동하여 면역화 이후 상당 기간 동안 머무는 혈장 세포들은 장수 혈장 세포들(LLPCs)로 부른다. 토끼 735는 많은 수의 LLPCs를 나타내지 않는다. LLPCs는 나이브 토끼의 골수에서 발견되지 않았다. 골수 세포들은 기억 B-세포 분석법으로 배양되고 기억 B-세포들의 존재를 위해 재검사되었다. 도 17의 오른쪽 패널은 골수에 존재하는 항원-특이적 기억 B-세포들이 필수적으로 없다는 것을 보여준다. 따라서, 장수 혈장 세포들은 골수로 이동하나 그곳에서 기억 B-세포들이 발견되지 않는다.
G. IgG-분비 및 IgA-분비 놀워크 VLP-특이적 기억 B-세포들은 비강으로 면역된 토끼들의 장간막 림프절에 존재한다
장간막 림프절은 모든 실험 토끼로부터 얻었고 분리된 세포들은 LLPCs과 기억 B-세포들에 대해 분석하였다. 이런 분석에 의한 결과는 도 18a에 도시된다. 골수를 제외하고 분석된 대부분의 림프 조직과 함께, LLPCs(도 18a 왼쪽 패널)이 장간막절에서 발견되었다. 놀워크 VLPs에 의한 인비트로 배양 후, 매우 많은 수의 IgG-분비 VLP-특이적 기억 B-세포들은 장간막 림프절 집단에서 명백하였다(도 18a, 오른쪽 패널). 장간막 림프절에서 관찰된 기억 B-세포들의 수는 분석된 다른 림프 조직들에 대해 관찰된 수보다 현저하게 많았다.
여러 연구들이 비강 또는 장과 같은 점막 유도 부위에서의 면역화는 소위 점막 면역반응을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다. 이런 반응은 일반적으로 점막 림프 조직에 국소화된 IgA+ B-세포 및 IgA-분비 혈장 세포들의 존재에 의해 특징화되었다. 이런 이유로, 장간막 림프절 세포들은 IgA-분비 LLPCs 또는 기억 B-세포들의 존재에 대해 분석되었다. 이런 분석의 결과는 도 18b에 도시된다. 다시 한번, IgA + LLPCs는 장간막 림프절 집단에서 발견되지 않았다(도 18b, 왼쪽 패널). 그러나, 건조 분말 놀워크 VLP 백신 제제에 의한 비강 면역화는 IgG + 및 IgA + 항원-특이적 기억 B-세포들이 장-관련 림프 조직으로 이동하여 발생하는 점막 면역반응을 유도하였다. 놀워크 백신 제제에 의한 면역화에 의해 유도된 항원-특이적 기억 B-세포들의 집단은 백신 효과의 가능한 지표이다. 기억 B 세포들의 존재는 장기간 지속하는 면역성의 한 지표이다.
H. VLP-특이적 CD4 + 기억 T 세포들
면역된 토끼들로부터 채취한 비장세포들은 응집되지 않은 놀워크 VLPs로 재자극하였고 세포 증식의 정도는 세로 좌표(CPM)에 나타낸 삼중수소화 티미딘 포함으로 측정하였다(도 19). 왼쪽 패널은 비장세포들의 미분획 집단의 세포 증식을 보여주며 오른쪽 패널은 CD4+ T 세포들의 세포 증식을 보여준다.
본 발명은 본 발명의 개별 태양의 한 설명인 특정 실시예들에 의해 범위가 제한되지 않으며 기능적으로 균등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명에서 도시되고 개시된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 일상적인 실험들을 사용하여 상기 설명과 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이런 변형과 균등물은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당할 것이다.
본 명세서에서 언급한 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 공보, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 같이 어느 정도 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명에서 참조문헌의 인용 또는 언급은 이런 문헌이 본 발명에 대한 종래기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
참조문헌
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음.
Claims (53)
- 적어도 하나의 노로바이러스 항원 및 적어도 하나의 항원보강제를 포함하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 노로바이러스 항원은 펩타이드, 단백질 노로바이러스 바이러스-유사 입자들(VLPs), 변형 LVPs, 캡시드 모노머, 캡시드 멀티머, 응집체 또는 이의 혼합물을 포함하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서,상기 노로바이러스 항원은 노로바이러스 유전자군 I 및 유전자군 II 바이러스 균주로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제 2 항에 있어서,상기 노로바이러스 VLPs는 노로바이러스 핵산 서열을 사용하여 발현 시스템에서 생산된 재조합 VLPs인 조성물.
- 제 4 항에 있어서,상기 핵산 서열은 캡시드 단백질을 암호화하는 조성물.
- 제 5 항에 있어서,상기 캡시드 단백질은 VP1 및 VP2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제 4 항에 있어서,상기 VLPs는 단가 VLPs인 조성물.
- 제 4 항에 있어서,상기 VLPs는 다가 VLPs인 조성물.
- 제 8 항에 있어서,상기 다가 VLPs는 노로바이러스 유전자군 I 및 유전자군 II 노로바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제 4 항에 있어서,상기 발현 시스템은 재조합 세포 발현 시스템 또는 바큘로바이러스-감염 세로 발현 시스템인 조성물.
- 제 10 항에 있어서,상기 세포 발현 시스템은 효모, 박테리아, 곤충 및 포유류 발현 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제 1 항에 있어서,제 2 노로바이러스 항원을 더 포함하는 조성물.
- 제 12 항에 있어서,상기 제 1 및 제 2 노로바이러스 항원은 다른 유전자군으로부터의 단가 VLPs인 조성물.
- 제 1 항에 있어서,전달 물질을 더 포함하는 조성물.
- 제 14 항에 있어서,상기 전달 물질은 항원 흡수를 향상시키고, 저장 효과를 제공하거나 전달 부위에서 항원 잔류 시간을 증가시키는 작용을 하는 조성물.
- 제 14 항에 있어서,상기 전달 물질은 생체접착제인 조성물.
- 제 16 항에 있어서,상기 생체접착제는 점막접착제인 조성물.
- 제 17 항에 있어서,상기 점막접착제는 글리코사미노글리칸(예를 들어, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 셀페이트 콘드로이틴, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 하이알우로난), 탄화수소 폴리머(예를 들어, 펙틴, 알지네이트, 글리코겐, 아밀라제, 아밀로펙틴, 셀룰로오스, 키틴, 스타키로스, 우눌린, 덱스트린, 덱스트란), 폴리(아크릴산)의 가교 유도체, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐 파이롤리돈, 폴리사카라이드(뮤신 및 다른 점막폴리사카라이드 포함) 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스), 단백질(예를 들어, 렉틴, 섬모 단백질) 및 데옥시리보핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제 18 항에 있어서,상기 점막접착제는 폴리사카라이드인 조성물.
- 제 19 항에 있어서,상기 폴리사카라이드는 키토산, 키토산 염 또는 키토산 염기인 조성물.
- 제 14 항에 있어서,상기 노로바이러스 항원은 노로바이러스 VLP이고, 상기 항원보강제는 MPL이고 상기 전달 물질은 키토산, 키토산 염 또는 키토산 염기인 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트, 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 및 리포솜으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제 22 항에 있어서,상기 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제인 조성물.
- 제 22 항에 있어서,상기 항원보강제는 MPL인 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 항원보강제는 독소 항원보강제가 아닌 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 조성물은 액체 제제인 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 조성물은 분말 제제인 조성물.
- 제 27 항에 있어서,상기 조성물은 지름이 약 10 내지 500 마이크로미터의 입자 크기를 가진 조성물.
- 상기 조성물의 1회 이상의 복용량을 투여하기 위해 하나 이상의 장치들과 결합된 제 27 항의 건조 분말 조성물.
- 제 29 항에 있어서,상기 1회 이상의 복용량은 단위 복용량인 건조 분말 조성물.
- 제 29 항에 있어서,상기 장치는 1회용 비강 투여 장치인 건조 분말 조성물.
- 제 29 항에 있어서,상기 조성물은 상기 장치에 저장되는 건조 분말 조성물.
- 제 1 항의 조성물을 포함하는 항원 제제.
- 제 1 항의 조성물을 포함하는 백신 제제.
- 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,상기 제제는 점막, 근육내, 정맥, 피하(subcutaneous), 피내, 피하(subdermal) 및 경피 투여 경로로 피험자에게 투여되는 제제.
- 제 35 항에 있어서,상기 투여 경로는 근육내인 제제.
- 제 35 항에 있어서,상기 점막 투여 경로는 비강, 경구, 또는 질인 제제.
- 제 37 항에 있어서,상기 제제는 코 스프레이, 비액 또는 건조 분말의 형태인 제제.
- 제 38 항에 있어서,상기 제제는 비강에 가깝게 고정되거나 삽입된 제제의 장치로부터 비강 내에서 빠른 침적에 의해 비강 점막으로 투여되는 제제.
- 제 39 항에 있어서,상기 제제는 콧구멍 하나 또는 모두에 투여되는 제제.
- 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,상기 노로바이러스 항원은 약 0.01%(w/w) 내지 약 80%(w/w)의 농도로 존재하는 조성물.
- 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,노로바이러스 항원의 복용량은 복용 당 약 1㎍ 내지 약 100mg의 양으로 존재하는 조성물.
- 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,노로바이러스 항원의 복용량은 복용 당 약 1㎍ 내지 약 1mg의 양으로 존재하는 조성물.
- 제 42 항에 있어서,노로바이러스 항원의 복용량은 복용 당 약 1㎍ 내지 약 500㎍의 양으로 존재 하는 조성물.
- 제 42 항에 있어서,노로바이러스 항원의 복용량은 복용 당 약 1㎍ 내지 약 100㎍의 양으로 존재하는 조성물.
- 피험자에게 제 33 항의 항원 제제를 투여하는 단계를 포함하여 노로바이러스 항원에 대한 항체를 생산하는 방법.
- 피험자에게 제 34 항의 백신 제제를 투여하는 단계를 포함하여 노로바이러스에 감염된 피험자에서 치료 효과가 있는 면역반응을 유도하는 방법.
- (a) 노로바이러스 항원, 수크로오스 및 키토산을 포함하는 선-동결건조 용액을 제조하는 단계(수크로오스 대 키토산의 질량비는 약 0:1 내지 약 10:1이다);(b) 용액을 동결하는 단계; 및(c) 30-72시간 동안 동결된 용액을 동결건조하는 단계(최종 동결건조된 생성물은 응집된 형태의 상기 노로바이러스 항원 부분을 함유한다)를 포함하여 노로바이러스 항원 제제를 제조하는 방법.
- 제 48 항에 있어서,상기 선-동결건조 용액은 증량제를 더 포함하는 노로바이러스 항원 제제를 제조하는 방법.
- 제 49 항에 있어서,상기 증량제는 만니톨인 노로바이러스 항원 제제를 제조하는 방법.
- 제 50 항에 있어서,상기 선-동결건조 용액은 만니톨과 노로바이러스 항원으로 이루어지고 상기 응집된 노로바이러스 항원의 비율은 90%보다 큰 노로바이러스 항원 제제를 제조하는 방법.
- 제 48 항에 있어서,상기 수크로오스 대 키토산의 질량비는 약 2:1 내지 약 10:1이고 상기 응집된 노로바이러스 항원의 비율은 약 0% 내지 약 50%인 노로바이러스 항원 제제를 제조하는 방법.
- 제 48 항에 있어서,상기 수크로오스 대 키토산의 질량비는 약 0:1이고 상기 응집된 노로바이러스 항원의 비율은 70% 보다 큰 노로바이러스 항원 제제를 제조하는 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84791206P | 2006-09-29 | 2006-09-29 | |
| US60/847,912 | 2006-09-29 | ||
| US97339207P | 2007-09-18 | 2007-09-18 | |
| US60/973,392 | 2007-09-18 | ||
| PCT/US2007/079929 WO2008042789A1 (en) | 2006-09-29 | 2007-09-28 | Norovirus vaccine formulations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090079912A true KR20090079912A (ko) | 2009-07-22 |
| KR101515489B1 KR101515489B1 (ko) | 2015-04-30 |
Family
ID=39268804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020097008725A KR101515489B1 (ko) | 2006-09-29 | 2007-09-28 | 노로바이러스 백신 제제 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (8) | US7955603B2 (ko) |
| EP (4) | EP2601970B1 (ko) |
| JP (3) | JP5476544B2 (ko) |
| KR (1) | KR101515489B1 (ko) |
| AU (1) | AU2007303608B2 (ko) |
| CA (1) | CA2664157C (ko) |
| CY (1) | CY1118492T1 (ko) |
| DK (3) | DK2601970T3 (ko) |
| ES (3) | ES2618885T3 (ko) |
| HK (1) | HK1184057A1 (ko) |
| HU (2) | HUE028978T2 (ko) |
| LT (1) | LT2601970T (ko) |
| PL (2) | PL2601970T3 (ko) |
| PT (1) | PT2601970T (ko) |
| SG (3) | SG10202012986SA (ko) |
| SI (1) | SI2601970T1 (ko) |
| WO (1) | WO2008042789A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140066160A (ko) * | 2011-07-11 | 2014-05-30 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 비경구 노로바이러스 백신 제제 |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2664157C (en) | 2006-09-29 | 2015-12-01 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Norovirus vaccine formulations |
| KR20150098681A (ko) | 2007-03-14 | 2015-08-28 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| US20100266636A1 (en) * | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| JP2010539192A (ja) * | 2007-09-18 | 2010-12-16 | リゴサイト ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド | ノロウイルスに対して防御免疫応答を付与する方法 |
| ES2668836T3 (es) * | 2008-08-08 | 2018-05-22 | Takeda Vaccines, Inc. | Partículas similivíricas que comprenden secuencias de aminoácidos de la cápside compuestas para reactividad cruzada potenciada |
| WO2010111586A2 (en) * | 2009-03-27 | 2010-09-30 | Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Mucosal immunization |
| US20110070260A1 (en) * | 2009-09-09 | 2011-03-24 | Baric Ralph S | Multivalent Immunogenic Compositions Against Noroviruses and Methods of Use |
| WO2011079260A2 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Stabilized virus like particles having enhanced mucosal immunogenicity |
| US8980275B2 (en) | 2010-01-21 | 2015-03-17 | Takeda Vaccines, Inc. | Targeted heterologous antigen presentation on calicivirus virus-like particles |
| AU2012244074B2 (en) * | 2010-04-15 | 2015-01-15 | Km Biologics Co., Ltd. | Methods and compositions for intranasal delivery |
| EP2558120A4 (en) * | 2010-04-15 | 2013-08-28 | Shin Nippon Biomedical Lab Ltd | METHOD AND COMPOSITION FOR INTRANASAL ADMINISTRATION |
| JOP20130186B1 (ar) * | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
| US20140017257A1 (en) * | 2012-07-11 | 2014-01-16 | Xi Jiang | IgY From Norovirus P Particles And Their Derivatives |
| SI2939025T1 (sl) * | 2012-12-28 | 2018-09-28 | Cellestis Limited | Preizkus celično posredovanega imunskega odziva |
| WO2014145245A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for norovirus blockade epitopes |
| US9975923B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-22 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for norovirus blockade epitopes |
| JP2015015931A (ja) | 2013-07-12 | 2015-01-29 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法 |
| JP2015017065A (ja) * | 2013-07-12 | 2015-01-29 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ノロウイルスのウイルス様粒子を含む医薬組成物 |
| JP6479305B2 (ja) | 2013-07-12 | 2019-03-06 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ウイルス様粒子の精製方法 |
| WO2015009796A1 (en) | 2013-07-17 | 2015-01-22 | Dow Global Technologies Llc | Composition for application to a mucosa comprising a methylcellulose |
| KR102474663B1 (ko) | 2013-10-03 | 2022-12-07 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 세포주로부터 랍도바이러스를 탐지 및 제거하는 방법 |
| JP6556632B2 (ja) * | 2013-12-16 | 2019-08-07 | 武田薬品工業株式会社 | マイクロニードル |
| JP7033534B2 (ja) * | 2015-08-28 | 2022-03-10 | オロジー バイオサーヴィシズ、インク． | ノロウイルスワクチン |
| KR101915740B1 (ko) * | 2016-03-18 | 2018-11-06 | (주)인테라 | 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질 |
| CN107184970A (zh) * | 2017-02-16 | 2017-09-22 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 口服诺如病毒亚单位疫苗及lt作为该疫苗佐剂的用途 |
| WO2018182983A1 (en) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | Children's Hospital Medical Center | Norovirus s particle based vaccines and methods of making and using same |
| KR20200092363A (ko) | 2017-11-30 | 2020-08-03 | 메디카고 인코포레이티드 | 변형된 노로바이러스 vp1 단백질 및 변형된 노로바이러스 vp1 단백질을 포함하는 vlp |
| WO2019158653A1 (en) | 2018-02-15 | 2019-08-22 | Icon Genetics Gmbh | Immunogenic composition and vaccine for generating an immune response to norovirus |
| JP6713013B2 (ja) * | 2018-03-06 | 2020-06-24 | 株式会社イーダブルニュートリション・ジャパン | 貝類のノロウイルス不活化方法 |
| WO2020010428A1 (en) | 2018-07-13 | 2020-01-16 | Medicago Inc. | Modified norovirus vp1 proteins and vlps comprising modified norovirus vp1 proteins |
| US20210308249A1 (en) | 2018-08-20 | 2021-10-07 | Takeda Vaccines, Inc. | Vlp formulations |
| US11523988B2 (en) | 2018-11-29 | 2022-12-13 | Catalent U.K. Swindon Zydis Limited | Oral dispersible vaccine comprising virosomes |
| EP3698773A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-26 | Università degli Studi di Parma | Composition and manufacturing of powders containing nanoadjuvants for mucosal vaccination |
| JP2022522891A (ja) | 2019-03-12 | 2022-04-20 | アイコン ジェネティクス ゲーエムベーハー | 安定性が改善されたノロウイルス様粒子 |
| WO2021030582A2 (en) * | 2019-08-13 | 2021-02-18 | Altimmune, Inc. | Therapeutic agent effectiveness and its route of administration |
| EP4340874A1 (en) | 2021-05-21 | 2024-03-27 | Takeda Vaccines, Inc. | Solid composition, freeze-drying method and glass vial |
| CN117330750A (zh) * | 2023-12-01 | 2024-01-02 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种筛选新冠病毒早期毒种的方法和制造疫苗的方法 |
Family Cites Families (61)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6572862B1 (en) * | 1989-11-08 | 2003-06-03 | Baylor College Of Medicine | Methods and reagents to detect and characterize Norwalk and related viruses |
| AU1893592A (en) * | 1991-03-25 | 1992-10-21 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Norwalk virus human gastroenteritis agent and molecular cloning of corresponding cdnas |
| JPH07509122A (ja) | 1992-04-08 | 1995-10-12 | ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ，アズ レプリゼンテッド バイ ザ セクレター，デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | 野生型麻疹ウイルス糖タンパク質：ワクチンおよびその検出方法 |
| JP4028593B2 (ja) | 1993-03-23 | 2007-12-26 | グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム | ３−ｏ脱アシル化モノホスホリルリピドａ含有ワクチン組成物 |
| US5788970A (en) | 1994-03-29 | 1998-08-04 | The University Of Maryland College Park | Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon |
| PT757717E (pt) | 1994-05-16 | 2006-09-29 | Merck & Co Inc | Vacinas de papilomavirus |
| US5645051A (en) * | 1995-04-21 | 1997-07-08 | Dura Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose dry powder inhaler |
| US5861241A (en) * | 1995-08-16 | 1999-01-19 | University Of Massachusetts | Monoclonal antibodies for detecting Norwalk virus |
| GB9525083D0 (en) * | 1995-12-07 | 1996-02-07 | Danbiosyst Uk | Vaccine compositions |
| US5834015A (en) | 1996-09-11 | 1998-11-10 | Albany Medical College | Protein-lipid vesicles and autogenous vaccine comprising the same |
| US5953727A (en) | 1996-10-10 | 1999-09-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Project-based full-length biomolecular sequence database |
| US6491919B2 (en) * | 1997-04-01 | 2002-12-10 | Corixa Corporation | Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A |
| ATE261734T1 (de) | 1997-04-08 | 2004-04-15 | Merck & Co Inc | Stabilisierte humane papillomaviruszusammensetzungen |
| JP2002508748A (ja) | 1997-05-01 | 2002-03-19 | カイロン コーポレイション | アジュバントとしてのウイルス様粒子の使用 |
| US20040265377A1 (en) * | 1997-10-27 | 2004-12-30 | Harry Seager | Solid dispersing vaccine composition for oral delivery |
| BR9913026A (pt) * | 1998-08-14 | 2001-09-25 | Merck & Co Inc | Processo de purificação de partìculas semelhantes a vìrus (vlps) de papilomavìrus recombinante, e, processo de preparação de um produto de vlp de papilomavìrus humano purificado adequado para uso em uma vacina para humano |
| ES2262359T3 (es) | 1998-12-17 | 2006-11-16 | MERCK & CO., INC. | Particulas tipo virus sinteticas con epitores heterologos. |
| JP4841726B2 (ja) | 1999-02-05 | 2011-12-21 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | ヒトパピローマウイルスワクチン製剤 |
| WO2000079280A1 (fr) * | 1999-06-22 | 2000-12-28 | Japan As Represented By Director-General National Institute Of Infectious Diseases | Materiel de detection de srsv |
| WO2003068933A2 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Novavax, Inc. | Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells |
| GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| GB0206359D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| CA2849556A1 (en) | 2002-04-11 | 2003-10-23 | Vu Truong-Le | Preservation of bioactive materials by freeze dried foam |
| GB0302218D0 (en) | 2003-01-30 | 2003-03-05 | Chiron Sri | Vaccine formulation & Mucosal delivery |
| JP2006507800A (ja) | 2002-06-07 | 2006-03-09 | ラージ・スケール・バイオロジー・コーポレイション | 可撓性ワクチンアセンブリおよびワクチン送達プラットフォーム |
| WO2004000351A1 (en) | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Cytos Biotechnology Ag | Packaged virus-like particles for use as adjuvants: method of preparation and use |
| EP1594536B1 (en) | 2003-01-30 | 2009-03-25 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Adjuvanted influenza vaccine |
| US20040213745A1 (en) | 2003-02-20 | 2004-10-28 | Vincent Sullivan | Powder formulations of rSEB for improved vaccination |
| US8592197B2 (en) | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
| WO2005032457A2 (en) | 2003-07-21 | 2005-04-14 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Vectors and methods for immunization against norwalk virus using transgenic plants |
| EP1670824A2 (en) * | 2003-09-24 | 2006-06-21 | Montana State University | Norovirus monoclonal antibodies and peptides |
| WO2005037223A2 (en) * | 2003-10-15 | 2005-04-28 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for immunomodulation |
| US20050215501A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-09-29 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods and products for enhancing epitope spreading |
| FR2863890B1 (fr) | 2003-12-19 | 2006-03-24 | Aventis Pasteur | Composition immunostimulante |
| US7481997B1 (en) * | 2004-02-12 | 2009-01-27 | Montana State University | Snow mountain virus genome sequence, virus-like particles and methods of use |
| US20050260225A1 (en) * | 2004-05-18 | 2005-11-24 | Goldberg Joanna B | Intranasal recombinant Salmonella vaccine encoding heterologous polysaccharide antigens |
| CU23496A1 (es) | 2004-09-03 | 2010-02-23 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Composición vacunal contra el virus de la hepatitis c |
| KR101501162B1 (ko) | 2004-10-20 | 2015-03-16 | 사노피 파스테르 바이오로직스, 엘엘씨 | 일본 뇌염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스에 대한 백신 |
| GB0428394D0 (en) | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
| CN101128216A (zh) | 2005-01-05 | 2008-02-20 | 费城健康和教育公司 | 输送载体、生物活性物质和病毒疫苗 |
| US8168771B2 (en) | 2005-01-31 | 2012-05-01 | The Johns Hopkins University | Use of consensus sequence as vaccine antigen to enhance recognition of virulent viral variants |
| NZ599345A (en) | 2005-02-18 | 2013-07-26 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogens from uropathogenic Escherichia Coli |
| AU2006224529B2 (en) | 2005-03-18 | 2012-05-24 | Cytos Biotechnology Ag | Cat allergen fusion proteins and uses thereof |
| BRPI0611336A2 (pt) | 2005-06-01 | 2010-08-31 | Dow Global Technologies Inc | método para produzir uma partìcula multivalente semelhante a vìrus, partìcula multivalente semelhante a vìrus, método de aumentar a solubilidade de uma partìcula multivalente semelhante a vìrus e vacina |
| EP1736538A1 (en) | 2005-06-21 | 2006-12-27 | Cytos Biotechnology AG | Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs) |
| EP1969001A2 (en) | 2005-11-22 | 2008-09-17 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Norovirus and sapovirus antigens |
| JP2007145775A (ja) | 2005-11-29 | 2007-06-14 | Falco Life Science:Kk | ノロウイルスｇｉの高感度検出方法 |
| CA2664157C (en) | 2006-09-29 | 2015-12-01 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Norovirus vaccine formulations |
| JP2011506264A (ja) | 2006-12-06 | 2011-03-03 | ノバルティス アーゲー | インフルエンザウイルスの４つの株に由来する抗原を含むワクチン |
| KR20150098681A (ko) | 2007-03-14 | 2015-08-28 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| US8474614B2 (en) * | 2007-03-14 | 2013-07-02 | BBY Solutions | Protective container for a flat screen monitor |
| JP2010539192A (ja) | 2007-09-18 | 2010-12-16 | リゴサイト ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド | ノロウイルスに対して防御免疫応答を付与する方法 |
| US20100266636A1 (en) | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| ES2668836T3 (es) | 2008-08-08 | 2018-05-22 | Takeda Vaccines, Inc. | Partículas similivíricas que comprenden secuencias de aminoácidos de la cápside compuestas para reactividad cruzada potenciada |
| WO2010084298A1 (en) | 2009-01-22 | 2010-07-29 | Pharmathene Uk Limited | Stable vaccine compositions and methods of use |
| EA201171032A1 (ru) | 2009-02-10 | 2012-02-28 | Новартис Аг | Схемы лечения с помощью вакцины против гриппа, связанного с пандемическими штаммами |
| US20110070260A1 (en) | 2009-09-09 | 2011-03-24 | Baric Ralph S | Multivalent Immunogenic Compositions Against Noroviruses and Methods of Use |
| US8980275B2 (en) | 2010-01-21 | 2015-03-17 | Takeda Vaccines, Inc. | Targeted heterologous antigen presentation on calicivirus virus-like particles |
| JP6367554B2 (ja) | 2010-05-26 | 2018-08-01 | セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＳｅｌｅｃｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． | アジュバント化合成ナノキャリアの投与量選択 |
| CA2841356C (en) | 2011-07-11 | 2022-03-01 | Takeda Vaccines, Inc. | Parenteral norovirus vaccine formulations |
| JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
-
2007
- 2007-09-28 CA CA2664157A patent/CA2664157C/en active Active
- 2007-09-28 PT PT131575730T patent/PT2601970T/pt unknown
- 2007-09-28 HU HUE13157572A patent/HUE028978T2/en unknown
- 2007-09-28 EP EP13157573.0A patent/EP2601970B1/en not_active Revoked
- 2007-09-28 LT LTEP13157573.0T patent/LT2601970T/lt unknown
- 2007-09-28 JP JP2009530639A patent/JP5476544B2/ja active Active
- 2007-09-28 EP EP07853688.5A patent/EP2066354B1/en active Active
- 2007-09-28 SI SI200731885A patent/SI2601970T1/sl unknown
- 2007-09-28 ES ES13157573.0T patent/ES2618885T3/es active Active
- 2007-09-28 KR KR1020097008725A patent/KR101515489B1/ko active IP Right Grant
- 2007-09-28 ES ES13157572.2T patent/ES2577833T3/es active Active
- 2007-09-28 SG SG10202012986SA patent/SG10202012986SA/en unknown
- 2007-09-28 SG SG2011071123A patent/SG174845A1/en unknown
- 2007-09-28 PL PL13157573T patent/PL2601970T3/pl unknown
- 2007-09-28 SG SG10201502490YA patent/SG10201502490YA/en unknown
- 2007-09-28 EP EP13173005.3A patent/EP2641613A1/en not_active Withdrawn
- 2007-09-28 PL PL13157572.2T patent/PL2601969T3/pl unknown
- 2007-09-28 HU HUE13157573A patent/HUE032422T2/en unknown
- 2007-09-28 US US12/093,921 patent/US7955603B2/en active Active
- 2007-09-28 AU AU2007303608A patent/AU2007303608B2/en active Active
- 2007-09-28 EP EP13157572.2A patent/EP2601969B1/en active Active
- 2007-09-28 DK DK13157573.0T patent/DK2601970T3/en active
- 2007-09-28 WO PCT/US2007/079929 patent/WO2008042789A1/en active Application Filing
- 2007-09-28 ES ES07853688T patent/ES2420136T3/es active Active
- 2007-09-28 DK DK13157572.2T patent/DK2601969T3/en active
- 2007-09-28 DK DK07853688.5T patent/DK2066354T3/da active
-
2010
- 2010-06-16 US US12/816,495 patent/US8431116B2/en active Active
-
2011
- 2011-12-20 US US13/330,854 patent/US20120093861A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-03-15 US US13/836,446 patent/US10010599B2/en active Active
- 2013-03-15 US US13/837,653 patent/US9308249B2/en active Active
- 2013-03-15 US US13/837,885 patent/US9272028B2/en active Active
- 2013-06-24 JP JP2013131559A patent/JP5898133B2/ja active Active
- 2013-10-14 HK HK13111536.3A patent/HK1184057A1/zh unknown
-
2015
- 2015-07-10 US US14/796,714 patent/US9861691B2/en active Active
- 2015-10-05 JP JP2015197633A patent/JP6134364B2/ja active Active
-
2017
- 2017-01-25 CY CY20171100109T patent/CY1118492T1/el unknown
-
2018
- 2018-05-31 US US15/994,887 patent/US10512682B2/en active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140066160A (ko) * | 2011-07-11 | 2014-05-30 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 비경구 노로바이러스 백신 제제 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20090079912A (ko) | 노로바이러스 백신 제제 | |
| KR101793161B1 (ko) | 강화된 교차 반응성을 가진 복합체 캡시드 아미노산 서열들을 포함하는 바이러스-유사 입자들 | |
| KR20140066160A (ko) | 비경구 노로바이러스 백신 제제 | |
| CN113453711A (zh) | 诺如病毒疫苗配制品及方法 | |
| JP5735121B2 (ja) | インフルエンザウィルスの組換えヘマグルチニン蛋白質及びそれを含むワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |