JP2014012677A - 過敏症の治療のための免疫賦活性核酸パッケージ粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】過敏症、すなわち、アトピー性湿疹、喘息及びIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、特に花粉アレルギー及びハウスダストアレルギーの治療に特に有用な組成物の提供。
【解決手段】B及びT細胞応答を亢進することが知られている非メチル化CpG(cytosine−guanine dinucleotides)含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活核酸をナノ粒子,微小粒子,リポソーム等のウイルス様粒子(VLP)に封入または非共有結合などでパッケージ化された組成物。この組成物を使用する過敏症の治療において、特定の抗原又はアレルゲンの投与は必要とされない。
【選択図】なし
【解決手段】B及びT細胞応答を亢進することが知られている非メチル化CpG(cytosine−guanine dinucleotides)含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活核酸をナノ粒子,微小粒子,リポソーム等のウイルス様粒子(VLP)に封入または非共有結合などでパッケージ化された組成物。この組成物を使用する過敏症の治療において、特定の抗原又はアレルゲンの投与は必要とされない。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、免疫学の分野及び免疫学的に活性な組成物による過敏症の治療に関する。本発明の組成物は、免疫賦活性核酸がパッケージされた粒子、好ましくはウイルス様粒子、ナノ粒子、微小粒子(マイクロ粒子)又はリポソームを含有する。本発明の組成物は過敏症、好ましくはアレルギーで、アトピー性湿疹、喘息及びIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、特に花粉アレルギー(花粉症)のような疾患を含むものの治療において有用である。
本発明は、免疫学の分野及び免疫学的に活性な組成物による過敏症の治療に関する。本発明の組成物は、免疫賦活性核酸がパッケージされた粒子、好ましくはウイルス様粒子、ナノ粒子、微小粒子(マイクロ粒子)又はリポソームを含有する。本発明の組成物は過敏症、好ましくはアレルギーで、アトピー性湿疹、喘息及びIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、特に花粉アレルギー(花粉症)のような疾患を含むものの治療において有用である。
(発明の概要)
最初の側面では、本発明は医薬として使用される組成物であって、粒子と免疫賦活性核酸(ISS-NA)を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなり、該粒子が前記免疫賦活性核酸と共にパッケージされている組成物を提供する。
本発明の組成物が過敏症、好ましくはアレルギーの予防的及び治療的処置において有用であることが意外にも見出された。更なる側面では、よって本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は粒子と免疫賦活性核酸(ISS-NA)を含み、該粒子は前記ISS-NAと共にパッケージされている。特定の側面では、本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物はウイルス様粒子と非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み、該ウイルス様粒子は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと共にパッケージされている。好ましい実施態様では、前記過敏症はアレルギー、好ましくはIgE依存性喘息、アトピー性湿疹又はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)である。更に好ましい実施態様では、前記粒子はナノ粒子、微小粒子及びリポソームから選択される。更に好ましい実施態様では、前記粒子はVLP、好ましくはRNA-バクテリオファージのVLP、また好ましくはバクテリオファージQβのVLPである。更に好ましい実施態様では、前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合ヌクレオチド、最も好ましくはG10(配列番号27)のものから専らなる。
最初の側面では、本発明は医薬として使用される組成物であって、粒子と免疫賦活性核酸(ISS-NA)を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなり、該粒子が前記免疫賦活性核酸と共にパッケージされている組成物を提供する。
本発明の組成物が過敏症、好ましくはアレルギーの予防的及び治療的処置において有用であることが意外にも見出された。更なる側面では、よって本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は粒子と免疫賦活性核酸(ISS-NA)を含み、該粒子は前記ISS-NAと共にパッケージされている。特定の側面では、本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物はウイルス様粒子と非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み、該ウイルス様粒子は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと共にパッケージされている。好ましい実施態様では、前記過敏症はアレルギー、好ましくはIgE依存性喘息、アトピー性湿疹又はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)である。更に好ましい実施態様では、前記粒子はナノ粒子、微小粒子及びリポソームから選択される。更に好ましい実施態様では、前記粒子はVLP、好ましくはRNA-バクテリオファージのVLP、また好ましくはバクテリオファージQβのVLPである。更に好ましい実施態様では、前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合ヌクレオチド、最も好ましくはG10(配列番号27)のものから専らなる。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLP(a)を前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にインキュベートする工程と;(ii)リボヌクレアーゼを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLPをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と;(ii)前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLPをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と;(ii)前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLP(a)を分解する工程と;(ii)前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記VLPを再構築する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLPを前記VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートする工程と;(ii)前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含み、ここで好ましくは工程(i)の前記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLPを前記VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートする工程と;(ii)前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含み、ここで好ましくは工程(i)の前記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLPをアルカリ性条件、好ましくはNaOHの存在下、最も好ましくは約25mMのNaOHの存在下でインキュベートする工程と;(ii)前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLPを前記VLPを不安定化可能な溶液と共にインキュベートし、ここで前記VLPがバクテリオファージQβのVLPである工程と;(ii)前記溶液からコートタンパク質を精製する工程と;(iii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド及び酸化剤の存在下で前記コートタンパク質をVLPと再構築する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は(a)ウイルス様粒子と;(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;ここで、該ウイルス様粒子(a)は前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にパッケージされ、該方法は、(i)前記VLPを前記VLPを不安定化可能な溶液と共にインキュベートし、ここで前記VLPがバクテリオファージQβのVLPである工程と;(ii)前記溶液からコートタンパク質を精製する工程と;(iii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド及び酸化剤の存在下で前記コートタンパク質をVLPと再構築する工程を含む。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPを前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする工程と;(ii)リボヌクレアーゼを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPを分解する工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記VLPを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPを分解する工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記VLPを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、VLPを前記VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートする工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPを非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする工程と;(ii)リボヌクレアーゼを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドリボヌクレアーゼを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPを分解する工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記VLPを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPを非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする工程と;(ii)リボヌクレアーゼを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドリボヌクレアーゼを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、(i)VLPを分解する工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記VLPを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は、動物のアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを該VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートする工程と;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加える工程と;(iii)前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は本発明の組成物を含有する薬学的組成物を提供する。
更なる側面では、本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法を提供し、該方法は本発明の組成物を前記動物に導入することを含む。
本発明の更なる側面は、動物の過敏症の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明の薬学的組成物の使用であって、ここで、好ましくは前記過敏症はアレルギーであり、更に好ましくは前記アレルギーは、(a)IgE依存性喘息;(b)アトピー性湿疹;及び(c)IgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー又はハウスダストアレルギーからなる群から選択される。
更なる側面では、本発明は本発明の組成物を含有する薬学的組成物を提供する。
更なる側面では、本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法を提供し、該方法は本発明の組成物を前記動物に導入することを含む。
本発明の更なる側面は、動物の過敏症の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明の薬学的組成物の使用であって、ここで、好ましくは前記過敏症はアレルギーであり、更に好ましくは前記アレルギーは、(a)IgE依存性喘息;(b)アトピー性湿疹;及び(c)IgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー又はハウスダストアレルギーからなる群から選択される。
(発明の詳細な記載)
別段の定義をしない限り、ここで使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
別段の定義をしない限り、ここで使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
「過敏症」:本発明の文脈において、「過敏症」なる用語は、Johanssonら, 2001, Allergy 56:813-824に示唆されているように、正常な被験者が耐容性を示す用量の定まった刺激に暴露されることによって開始される任意の客観的に再現性がある症状又は徴候として理解されるものである。過敏症反応は、病歴、検査、又は症状と患者のその症状が起因する環境因子との間の関連の調査から合理的な証拠が存在するという意味で再現性がある。過敏症という用語は非アレルギー性過敏症とアレルギー性過敏症(アレルギー)を包含する。非アレルギー性過敏症は免疫系の関与を含まないか又は少なくとも免疫系の関与が検出できない任意の過敏症であり、アレルギー性過敏症は細胞性又は体液性免疫系の関与を常に含む。過敏症は好ましくは(a)喘息、(b)鼻炎、(c)結膜炎、(d)鼻結膜炎、(e)皮膚炎、(e)蕁麻疹、(e)食物過敏症、(e)薬物過敏症、(e)昆虫刺傷又は虫刺され過敏症、及び(e)アナフィラキシーからなる群から選択される疾患のアレルギー性及び非アレルギー性形態を意味する。
更に好ましくは、過敏症は、(a)喘息、(b)鼻炎、(c)結膜炎、(d)鼻結膜炎、(e)皮膚炎、(e)蕁麻疹、(e)食物過敏症、(e)薬物過敏症、(e)昆虫刺傷又は虫刺され過敏症、及び(e)アナフィラキシーからなる群から選択される疾患のアレルギー性形態を意味する。特に、過敏症はまた任意のタイプのアレルギーを含む。
更に好ましくは、過敏症は、(a)喘息、(b)鼻炎、(c)結膜炎、(d)鼻結膜炎、(e)皮膚炎、(e)蕁麻疹、(e)食物過敏症、(e)薬物過敏症、(e)昆虫刺傷又は虫刺され過敏症、及び(e)アナフィラキシーからなる群から選択される疾患のアレルギー性形態を意味する。特に、過敏症はまた任意のタイプのアレルギーを含む。
「アレルギー」:本発明の文脈において、「アレルギー」なる用語は「アレルギー性過敏症」の略であり、Johanssonら, 2001, Allergy 56:813-824及びJohanssonら, 2004, J. Allergy Clin. Immunol. 113(5) 832-835に示唆されているように理解される。別段示さない限り、本願はそこに記載されたアレルギーの命名法に従う。アレルギー又はアレルギー性過敏症は、しばしば遺伝的素因がある個体(アトピー)において、物質(アレルゲン)に反応して免疫学的機構によって開始される過敏症反応である。アレルギーは抗体又は細胞媒介性でありうる。殆どの患者では、典型的にアレルギー反応の原因となる抗体はIgEアイソタイプに属し(「抗体」を参照)、これらの患者はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)を被っていると言うことができる。IgE依存性アレルギー反応は必ずしもアトピー性患者において生じるものではないことに注意しなければならない。非IgE依存性アレルギーでは、抗体はIgGアイソタイプに属しうる。よって、本発明の意味において、「アレルギー」はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)と非IgE依存性アレルギーの双方を意味する。IgE依存性アレルギーが好ましくは本発明によって対処される。従って、本発明の文脈において、アレルギーは好ましくはIgE依存性アレルギーを指す。アレルギーは過敏性反応を誘発する抗原の供給源に従って分類される。一実施態様では、アレルギーは、(a)食物アレルギー、(b)薬物アレルギー、(c)ハウスダストアレルギー、(d)昆虫毒又は虫刺されアレルギー、及び(e)花粉アレルギーから選択される。あるいは、アレルギーは過敏症反応の主要な症状に基づいて分類される。よって、他の実施態様では、アレルギーは、(a)喘息、(b)鼻炎、(c)結膜炎、(d)鼻結膜炎、(e)皮膚炎、(f)蕁麻疹及び(g)アナフィラキシーの群から選択される疾患の任意のアレルギー性形態を指す。
「I型アレルギー」:「I型アレルギー」及び「IgE依存性アレルギー」なる用語は交換可能に使用され、アレルゲンに対するIgE依存性過敏症に関する。本発明の好ましい実施態様は、(a)花粉アレルギー(花粉症);(b)ハウスダストアレルギー;(c)食物アレルギー;(d)薬物アレルギー;(e)昆虫毒又は虫刺されアレルギー、好ましくは蜂毒アレルギー;及び(f)動物アレルギー、好ましくはネコアレルギーからなる群から選択されるIgE依存性アレルギーに関する。
「花粉症」:鼻炎、結膜炎及び/又は喘息を含みうる花粉に対するIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)の典型的な形態で、好ましくは喘息が花粉症の慢性形態で生じる。
「アトピー」、「アトピー性疾患」:アトピーは、低用量のアレルゲン、通常はタンパク質に応答してIgE抗体を作り出し、喘息、鼻結膜炎、又は湿疹/皮膚炎のような典型的な症状を発症する個人的な又は家族性傾向である。小児におけるアトピーの最初の症状はしばしばアレルギー性症状、例えば下痢、喘鳴、及び発疹であり、原因のIgE抗体は後になって検出できるのみである。典型的なアトピー性個体におけるアレルギー性症状はアトピー性と称されうる。本発明の一実施態様では、過敏症はアトピー性疾患、好ましくは(a)アトピー性喘息、(b)アトピー性IgE依存性アレルギー、好ましくは花粉アレルギー(花粉症)、ハウスダストアレルギー又はチリダニアレルギーからなる群から選択されるアトピー性疾患である。一実施態様では、本願は、前記IgE依存性アレルギーがアトピー性とみなされようと、非アトピー性アレルギーとみなされようと、一般にIgE依存性アレルギーに関する。しかしながら、本発明の特に好ましい実施態様はアトピー性アレルギー、好ましくはIgE依存性アトピー性アレルギーに関する。
「鼻炎」:「鼻炎」なる用語は、鼻からの過敏性症状、例えば痒み、くしゃみ、増加した鼻水分泌、及び鼻詰まりに関する。鼻炎は非アレルギー性並びにアレルギー性、つまり免疫学的に媒介される鼻炎に関する。本発明の好ましい実施態様は、アレルギー性鼻炎、好ましくはアレルギー性鼻炎のIgE依存性及び非IgE依存性形態に関する。特に好ましい実施態様は、IgE依存性アレルギー性鼻炎に関する。
「結膜炎」:結膜炎なる用語は、アレルギー性であり得、また非アレルギー性でありうる目の痒みに関し、アレルギー性結膜炎はIgE依存性及び非IgE依存性アレルギー性結膜炎を包含する。アレルギー性結膜炎、特にIgE依存性アレルギー性結膜炎は通常はアレルギー性鼻炎に付随し、よってこの疾患はアレルギー性鼻結膜炎と適切には呼ばれる。IgE依存性結膜炎の他に、TH1機構を含む接触性アレルギー性結膜炎が生じる。非アレルギー性結膜炎はまたしばしば非アレルギー性鼻炎を伴う。本発明の好ましい実施態様は、アレルギー性結膜炎のIgE依存性及び非IgE依存性形態を含むアレルギー性結膜炎に関する。特に好ましい実施態様は、IgE依存性アレルギー性結膜炎に関する。更に好ましい実施態様はIgE依存性アレルギー性鼻結膜炎に関する。
「喘息」:喘息又は気管支喘息は、肺の気道の炎症による慢性呼吸器疾患であり、気道の神経末端の感受性に影響を及ぼし、容易に刺激されるようになる。発作では、気道の内面が膨潤し気道を狭くし、肺に入り肺から出る空気の流れを減少させる。喘息は間欠形態(日中の間、一週間に2回以下の発作、夜に一ヶ月に2回以下の発作)、慢性形態(日中に持続的な発作、夜に頻繁な発作)及び任意の中間形態で起こりうる。本願の意味において、喘息なる用語は非アレルギー性並びにアレルギー性喘息に関する。本発明の好ましい実施態様は、喘息のIgE依存性及び非IgE依存性形態を含むアレルギー性喘息に関する。特に好ましい実施態様はIgE依存性アレルギー性喘息、最も好ましくはアトピー性喘息に関する。
「アトピー性喘息」:アトピー性湿疹及びIgE依存性アレルギー、例えば花粉アレルギー(花粉症)、ハウスダスト又はチリダニに関連してしばしば起こる遺伝的素因を持つ患者における喘息のIgE依存形態。
「皮膚炎」:「皮膚炎」なる用語は皮膚の局所的炎症に関し、とりわけ、「湿疹」及び「接触性皮膚炎」(以下の定義を参照)を包含する。本発明の好ましい実施態様は皮膚炎、好ましくは湿疹及び接触性皮膚炎に関する。
「湿疹」:「湿疹」なる用語は、遺伝的に決定された皮膚障壁欠陥を含むある種の臨床的特徴を共通に有する幾つかの皮膚疾患の集合を記述するアトピー性湿疹/皮膚炎症候群(AEDS)に関する。この遺伝的に決定された標的器官感受性が湿疹の基礎を構成する。アトピー性体質の小児及び若い成人において、根底にある炎症はIgE抗体関連反応によって支配されている(アトピー性湿疹)。慢性の症例では、炎症はIgE抗体によってあまり影響されないと思われ、組織診における支配細胞はリンパ球である。湿疹は非アレルギー性湿疹及びアレルギー性湿疹に関する。本発明の好ましい実施態様は湿疹、好ましくはアトピー性(IgE依存性)湿疹及び湿疹の非アトピー性形態を含むアレルギー性湿疹に関する。最も好ましくは、本発明はアトピー性(IgE依存性)湿疹に関する。
「接触性皮膚炎」:「接触性皮膚炎」なる用語は、低分子量化学薬品又は刺激物に密接な接触をすることにより引き起こされる皮膚における局所的炎症反応に関する。接触性皮膚炎はアレルギー性であり得、また非アレルギー性でありうる。アレルギー性接触性皮膚炎は免疫学的機構、主にTH1リンパ球によって媒介される。ハプテンとして作用し、アレルギー性接触性皮膚炎を引き起こす典型的なアレルゲンはニッケル、クロムイオン、香料、保存料、及び毒ツタウルシ植物からのウルシオールである。暴露は口からの取り込みから生じ得、いわゆる全身性アレルギー性接触性皮膚炎である。接触性皮膚炎のサブグループのタンパク接触性皮膚炎は、損傷を受けた皮膚からのタンパク質の吸収によって引き起こされるIgE関連反応である。本発明の好ましい実施態様は接触性皮膚炎、好ましくはアレルギー性接触性皮膚炎に関する。更に好ましい実施態様はタンパク接触性皮膚炎に関する。
「蕁麻疹」:「蕁麻疹」なる用語は刺激物又はアレルゲンによって引き起こされる皮膚の非炎症反応に関し、非アレルギー性蕁麻疹並びにアレルギー性蕁麻疹を含む。アレルギー性蕁麻疹は免疫学的機構によって媒介され、これは一般にはIgE依存性であるが、免疫複合体関連でもありうる。ラテックス手袋を着用したラテックスアレルギーのヒトの手や、イヌになめられたイヌアレルギーのヒトに起こるように、蕁麻疹はまたアレルゲンに局所的に接触した後に局所的に発症しうる。本発明の好ましい実施態様は、蕁麻疹、好ましくはアレルギー性蕁麻疹、最も好ましくはIgE依存性アレルギー性蕁麻疹に関する。
「食物過敏症」:「食物過敏症」なる用語は食物に対する有害反応に関し、これは非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る。アレルギー性食物過敏症はIgE依存性であり得、食物アレルギーと称される。食物に対する深刻な全身性のアレルギー性反応はアナフィラキシー(以下を参照)として分類できる。本発明の好ましい実施態様は食物アレルギー、好ましくはIgE依存性食物アレルギーに関する。
「薬物過敏症」:「薬物過敏症」なる用語は、非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る薬物に対する体の過敏反応に関する。抗体か媒介されようと細胞が媒介されようと、免疫学的機構が示された場合、反応は薬物アレルギーと呼ばれる。薬物アレルギーはIgEによって媒介されうる。本発明の好ましい実施態様は薬物過敏症、好ましくは薬物アレルギー、最も好ましくはIgE依存性薬物アレルギーに関する。
「昆虫刺傷過敏症」又は「虫刺され過敏症」:これらの用語は、非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る昆虫毒及び唾液に対する過敏反応に関する。免疫学的機構によって媒介される昆虫刺傷過敏症又は虫刺され過敏症は、蜂毒アレルギーにおけるように毒又は唾液アレルギーと称される。刺傷における多量の毒アレグゲンは吸入花粉アレルゲンの年と匹敵する。この高用量の感作は、おそらく、そのようなアレルギーを発症するための遺伝的素因がなぜ必要ではないかを説明する。本発明の好ましい実施態様は、毒アレルギー、好ましくはIgE依存性毒アレルギー、最も好ましくはIgE依存性蜂毒アレルギーに関する。
「アナフィラキシー」:「アナフィラキシー」なる用語は深刻な生命を脅かす汎発性又は全身性過敏反応を意味する。反応は通常は徐々に発症し、最も頻繁には歯茎/喉、手掌、又は足底の痒み、及び局所的蕁麻疹で始まり;低血圧及びショックに達する。低血圧及び深刻な気管支痙攣は、アナフィラキシーとして分類される反応に対して存在する必要はない。アナフィラキシーは、非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る。アレルギー性アナフィラキシーはIgG免疫複合体のような免疫学的機構、補体関連、又は免疫細胞媒介機構を含む。アナフィラキシーは好ましくはIgE抗体によって媒介されるアナフィラキシー反応(IgE依存性アナフィラキシー)、最も好ましくはピーナッツ誘発食物アナフィラキシー又は蜂毒誘発アナフィラキシーに関する。
「アレルゲン」:「アレルゲン」なる用語はアレルギーを引き起こす物質を意味する。好ましいアレルゲンは、全体の内容を出典明示によりここに援用するShough, Hら, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19版, (82章), Mack Publishing Company, Mack Publishing Group, Easton, Pennsylvania (1995))に開示されているアレルゲンである。アレルゲンは脊椎動物において抗原となる。ここで使用される「アレルゲン」なる用語は、「アレルゲン抽出物」及び「アレルゲンエピトープ」も意味する。非常に好ましいアレルゲンは、花粉(例えば、牧草、ブタクサ、カバノキ及びビャクシン);ハウスダスト及びチリダニ;哺乳動物表皮のアレルゲン及び動物の鱗屑;カビ及び真菌;昆虫体及び昆虫毒液;羽毛;食物;及び薬物(例えばペニシリン)からなる群から選択される。
「アレルゲン抽出物」/「誘発試験溶液」:アレルゲン抽出物は、結膜、鼻及び気管支誘発に使用される誘発試験溶液の成分である。かかるアレルゲン抽出物は市販されており、かかる抽出物を製造する方法はよく知られている。好ましいものは、(i)樹木種又は草種で、最も好ましくはハンの木、セイヨウトネリコ、カバノキ、ハシバミ、カモガヤ、ハッショウ草、ホソムギ、オオアワガエリ、ケンタッキーブルーグラス、ヒロハノウシノケグサ、ギョウギシバ、ブタクサ、ライムギ及びコムギからなる群から選択されるもの;(ii)異なった動物種の上皮、好ましくはネコ、イヌ及びウマからなる群から選択される動物種からの上皮;(iii)カビ、好ましくはコウジカビ、カンジダ、アルテルナリア、及びサッカロミセスからなる群から選択されるカビ;及び(iv)ダニ種、好ましくはコナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ及びアシブトコナダニからなる群から選択されるダニ種からなる群から選択される供給源から調製される単一のアレルゲン抽出物を含有する単一アレルゲン誘発溶液である。アレルゲン混合物を含むアレルゲン抽出物もまた誘発試験溶液に使用することができる。好ましいものは、カモガヤ、ハッショウ草、ホソムギ、オオアワガエリ、ケンタッキーブルーグラス及び/又はヒロハノウシノケグサの、異なった草のアレルゲン混合物である。更に好ましいものは、草、穀類、異なった樹木及び/又は獣毛のアレルゲン混合物である。誘発溶液は通常は生理食塩水中で調製され、0.4%のフェノールの添加により保存することができる。
「抗体」:ここで使用される場合、「抗体」なる用語はエピトープ又は抗原決定基に結合可能な免疫グロブリンのクラスに属する分子を意味する。
「抗原」:ここで使用される場合、「抗原」なる用語は、抗体又はMHC分子によって提示される場合はT細胞レセプター(TCR)が結合可能な分子を指す。ここで使用される「抗原」なる用語はまたT細胞エピトープも包含する。抗原は、免疫系が認識することができ、及び/又はB及び/又はTリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を誘導することができる。ここで使用される抗原はまた数種の個々の抗原の混合物であってもよい。しかしながら、「抗原」は本発明の組成物の成分の何れも包含しない。特に、「抗原」なる用語は本発明の粒子もISS-NAも意味するものではない。「抗原」なる用語はまた本発明の粒子を形成する任意の成分、例えばカプシドタンパク質を意味するものでもない。
エピトープ:ここで使用される場合、「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性又は免疫原性活性を有するポリペプチドの連続的又は非連続的部分を指す。エピトープはMHC分子においてそのT細胞レセプターを介して抗体又はT細胞により認識される。
「免疫応答」:ここで使用される場合、「免疫応答」なる用語は、Bリンパ球及び/又はTリンパ球及び/又は抗原提示細胞及び/又は自然免疫系他の細胞、例えばpDCの活性化又は増殖をもたらす体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を指す。あるいは、免疫応答は肥満細胞のようなエフェクター細胞の機能改変をまた生じうる。
「免疫応答を誘導する」:物質、好ましくはISS-NAは、細胞又は生物が該物質、好ましくは有効量の該物質に暴露されたときに、未処理のコントロールにおいては生じない免疫応答が該細胞又は動物において検出可能であるときに、免疫応答を誘導可能である。
「IFN-αの産生を刺激する」:特定の物質への暴露後に、細胞、好ましくは樹状細胞によってIFN-αが産生されることは、該物質の免疫賦活効果の強い指標である。従って、IFN-αの産生を誘導可能であるISS-NAが本発明においては好ましい。細胞によるIFN-αの産生は、当該分野で一般的に知られている方法、好ましくは(a)ELISA、最も好ましくは本質的には実施例14に記載されたようなELISA;(b)蛍光色素コンジュゲート抗体を使用し、好ましくは実施例14に記載されているようなフローサイトメトリー;及び(c)細胞壊死阻害バイオアッセイから選択される方法によって、決定することができる。典型的な細胞壊死阻害バイオアッセイは、過去にPestka, S. (1986)"Interferon Standards and General Abbreviations", Method in Enzymology, Academic Press, New York 119, 14-23に記載されているように、水疱性口内炎ウイルスで感染されたウシMDBK細胞に基づいている。本発明の文脈において、物質、好ましくは免疫賦活性核酸は、上述の方法の何れか一つ、好ましくはELISAにより、最も好ましくは実施例14に記載されているようにして検出して、細胞によるIFN-αの産生が、コントロール細胞と比較して前記細胞を前記物質へ暴露したときに有意に増大し、典型的には、また好ましくは、前記IFN-αの産生は少なくとも約2の因数、より好ましくは約3以上の因数だけ増加する場合、「IFN-αの産生を刺激する」とみなされる。
「免疫応答を亢進する」:免疫応答を亢進する物質とは、物質、好ましくはISS-NAであって、細胞又は動物の該物質への暴露時に該細胞又は該動物の免疫応答を強化し又は調節することができるものを指す。この観察は、免疫応答の指標であるとして当該分野で知られている任意のパラメータ、好ましくはサイトカインの形成及び細胞傷害性に関する。例えば、細胞傷害性T細胞の溶解活性を、物質、好ましくはISS-NAと共に、及び物質を伴わないで、例えば51Cr放出アッセイを使用して、測定することができる。CTL溶解活性が物質を伴わない場合のCTL溶解活性と比較して高いときの物質の量は免疫応答を亢進するのに十分な量と言われる。好ましい実施態様では、免疫応答は、少なくとも約2の因数、より好ましくは約3以上の因数だけ亢進される。分泌されるサイトカインの量とタイプはまた変わりうる。あるいは、誘導される抗体又はそのサブクラスの量は変わりうる。
「免疫賦活性核酸(ISS-NA)」:ここで使用される場合、免疫賦活性核酸なる用語は、免疫応答を誘導し、及び/又は亢進することができる核酸を指す。ここで使用されるISS-NAは、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含み、ここで、リボ核酸と、デオキシリボ核酸は双方とも二本鎖か一本鎖の何れかでありうる。好ましいISS-NAはデオキシリボ核酸であり、更に好ましくは該デオキシリボ核酸は一本鎖である。好ましくは、ISS-NAは、非メチル化Cを含む少なくとも一つのCpGモチーフを含む。非常に好ましいISS-NAは、少なくとも一つのCpGモチーフを含み、前記少なくとも一つのCpGモチーフが少なくとも一つ、好ましくは一つの、CGジヌクレオチドを含むか又は好ましくはそれからなり、該Cは非メチル化のものである。好ましくは、必ずしも必要ではないが、前記CGジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部である。上述のCpGモチーフを含まないISS-NAは、例を挙げると、CGジヌクレオチドを欠いた核酸、並びにメチル化CのCGジヌクレオチドを含む核酸を包含する。ここで使用される「免疫賦活性核酸」なる用語は、修飾塩基、好ましくは4-ブロモ-シトシンを含む核酸をまた指す。本発明の文脈で特に好ましいものは、樹状細胞におけるIFN-αの産生を刺激可能なISS-NAである。
「オリゴヌクレオチド」:ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、2個以上のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約6のヌクレオチドから約100000のヌクレオチド、より好ましくは約6から約2000のヌクレオチド、より好ましくは約6から約300のヌクレオチド、更により好ましくは約20から約300のヌクレオチド、更により好ましくは約20から約100のヌクレオチド、最も好ましくはから40のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。非常に好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約30のヌクレオチドを含み、より好ましくは正確に30のヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドなる用語はまた100を越え約2000までのヌクレオチド、好ましくは100を越え約1000までのヌクレオチド、より好ましくは100を越え約500までのヌクレオチドを含む核酸配列も指す。
オリゴヌクレオチドはポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドであり、好ましくは(a)非修飾RNA又はDNA、及び(b)修飾RNA又はDNAから選択される。該修飾は骨格又はヌクレオチド類似体を含みうる。オリゴヌクレオチドは、好ましくは(a)一本鎖及び二本鎖DNA、(b)一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA、(c)一本鎖及び二本鎖RNA、(d)一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNA、及び(e)一本鎖、又はより好ましくは二本鎖又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA及びRNAを含むハイブリッド分子からなる群から選択される。更なる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、RNA又はDNA、あるいはRNA及びDNAを含む三本鎖領域及びより高次の構造である。更なる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、合成、ゲノム又は組換えである。好ましいオリゴヌクレオチドはλ-DNA、コスミドDNA、人工細菌染色体、酵母菌人工染色体及び糸状ファージ、好ましくはM13からなる群から選択される。一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、(a)少なくとも一の修飾ヌクレオチド又は少なくとも一のヌクレオチド類似体を含むDNA又はRNA、又は(b)安定性又は他の理由で修飾された骨格を有するDNA又はRNAを意味する。好ましいヌクレオチド修飾体/類似体は、(a)ペプチド核酸、(b)イノシン、(c)トリチル化塩基、(d)ホスホロチオエート、(e)アルキルホスホロチオエート、(f)5-ニトロインドールデオキシリボフラノシル、(g)5-メチルデオキシシトシン、及び(h)5,6-ジヒドロ-5,6-ジヒドロキシデオキシチミジンからなる群から選択される。ホスホチオエート化ヌクレオチドは細胞又は生物中において分解から保護されており、よって好ましいヌクレオチド修飾である。更に好ましいものは、典型的には自然に見出されるようなポリペプチドの化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞に特有のDNA及びRNAの化学形態である。他のヌクレオチド類似体/修飾体は、当業者に明らかであろう。しかしながら、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる未修飾オリゴヌクレオチドは、典型的には、修飾ヌクレオチドよりもISS-NAとして活性があり、よって本発明においては一般的に好ましい。最も好ましいものは、専らホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。更に好ましいものは細胞、好ましくは樹状細胞においてIFN-αの産生を刺激可能なオリゴヌクレオチドである。細胞においてIFN-αの産生を刺激可能な非常に好ましいオリゴヌクレオチドはA型CpG及びC型CpGから選択される。
「CpGモチーフ」:ここで使用される場合、「CpGモチーフ」なる用語は、Cが、非メチル化で、中心CpG(の3’及び5’側)に隣接する少なくとも一つの塩基、好ましくは一又は二のヌクレオチドによって囲まれた非メチル化中心CpGを含むヌクレオチドのパターン、つまり非メチル化CpGジヌクレオチドを意味する。典型的には、また好ましくは、ここで使用されるCpGモチーフは非メチル化CpGジヌクレオチドとその5’及び3’端の二つのヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。理論によって束縛されるものではないが、CpGに隣り合う塩基はCpGオリゴヌクレオチドに対する活性の有意な部分をもたらす。
「CpG」/「非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド」:ここで用いる場合、「非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド」又は「CpG」なる用語は、少なくとも一のCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデスオキシヌクレオチドを意味する。よって、CpGは少なくとも一つの非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチドを含む。好ましいCpGは、脊椎動物骨髄由来細胞の分裂促進効果を刺激/活性化し、例えば有し、あるいは該細胞によるサイトカインの発現を誘導又は増大させる 例えば、CpGはB細胞、NK細胞及び抗原提示細胞、例えば樹状細胞、単球及びマクロファージの活性化に有用でありうる。好ましくは、CpGは、3’にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含むオリゴデスオキシヌクレオチド、好ましくは一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドを意味し、上記非メチル化シトシン及び上記グアノシンはホスフェート結合によって結合され、好ましくは該ホスフェート結合はホスホジエステル結合又はホスホチオエート結合であり、更に好ましくは上記ホスフェート結合はホスホジエステル結合である。CpGは、ヌクレオチド類似体、例えばホスホロチオエステル結合を含む類似体などを含むことができ、二本鎖又は一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はインビボにおいてより安定性がある一方、一本鎖分子は高い免疫活性を有する。好ましくは、ここで使用される場合、CpGは、少なくとも約10のヌクレオチド長で、少なくとも一つのCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドであり、更に好ましくは、上記CpGは10から60、より好ましくは15から60、更により好ましくは20から40,更により好ましくは約30、最も好ましくは正確に30のヌクレオチド長である。CpGは、メチル化及び/又は非メチル化ヌクレオチドからなり得、上記少なくとも一つのCpGモチーフは、Cが非メチル化の少なくとも一つのCGジヌクレオチドを含む。CpGはまたメチル化及び非メチル化配列ストレッチを含み得、上記少なくとも一つのCpGモチーフは、Cが非メチル化の少なくとも一つのCGジヌクレオチドを含む。非常に好ましいCpGは専ら非メチル化ヌクレオチドからなる。非常に好ましくは、CpGは、3’端にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含む一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシンと上記グアノシンはホスホジエステル結合によって結合している。更により好ましくは、CpGは、3’端にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含む一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシンと上記グアノシンがホスホジエステル結合によって結合し、上記CpGが専ら非メチル化ヌクレオチドからなる。最も好ましくは、CpGは、3’端にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含む約30のヌクレオチド長の一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシンと上記グアノシンがホスホジエステル結合によって結合し、上記CpGが専ら非メチル化ヌクレオチドからなる。CpGはホスホロチオエステル結合を含む類似体のようなヌクレオチド類似体を含み得、二本鎖又は一本鎖でありうる。一般に、ホスホジエステルCpGは以下に示すようにA型CpGであり、ホスホチオエステル安定化CpGはB型CpG又はC型CpGである。本発明において好ましいCpGオリゴヌクレオチドは、A型CpG及びC型CpGであり、最も好ましくはA型CpGである。
「A型CpG」:ここで使用される場合、「A型CpG」又は「D型CpG」は、少なくとも一つのCpGモチーフを有するオリゴデスオキシヌクレオチド(ODN)を意味する。A型CpGは優先的にT細胞の活性化及び樹状細胞の成熟を刺激し、IFN-α産生を刺激可能である。A型CpGでは、少なくとも一つのCpGモチーフのヌクレオチドが少なくとも一つのホスホジエステル結合によって結合している。A型CpGは、その5’端及び/又は好ましくはその3’端にホスホロチオエート結合ヌクレオチドが隣接しうる少なくとも一つのホスホジエステル結合CpGモチーフを含む。好ましくは、CpGモチーフ、よって好ましくはCGジヌクレオチドと少なくとも一つ、好ましくは二つのヌクレオチドを有するその直ぐ隣接する領域はホスホジエステルヌクレオチドからなる。好ましいA型CpGは専らホスホジエステル(PO)結合ヌクレオチドからなる。更に好ましいA型CpGはホスホチオエート結合を含んでいない。典型的には、また好ましくは、本明細書で使用される「A型CpG」又は「D型CpG」なる用語は、少なくとも一つのCpGモチーフと、5’及び/又は3’端にポリGモチーフを含むオリゴデスオキシヌクレオチド(ODN)を意味する。典型的には、また好ましくは、ポリGモチーフは、少なくとも一つ、好ましくは少なくとも3、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15のG(グアノシン)、最も好ましくは少なくとも10のGを含むか、あるいはこれらからなる。ある実施態様では、5’及び/又は3’端、典型的には、また好ましくは、5’及び/又は3’端のポリGモチーフの少なくとも一つのG、好ましくはポリGモチーフの少なくとも二つ、三つ又は四つ、更により好ましくは全てのGが、ホスホロチオエート修飾されている。しかしながら、非常に好ましい実施態様では、ポリGモチーフの全てのGはホスホジエステル結合によって結合している。好ましくは、本発明のA型CpGはパリンドローム配列を含むかあるいはそれからなる。典型的には、また好ましくは、CpGモチーフは上記パリンドローム配列の一部である。典型的には、また好ましくは、全てのヌクレオチド、しかしパリンドローム配列の少なくともCpGモチーフは、ホスホジエステルヌクレオチドからなる。典型的には、また好ましくは、パリンドローム配列は配列番号28である。非常に好ましいA型CpGは16から30ヌクレオチド長で、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、パリンドローム配列、好ましくは配列番号28のパリンドローム配列を含み、その5’端及びその3’端に3から10GからなるポリGモチーフが隣接している。
「B型CpG」:ここで使用される場合、「B型CpG」(K型)なる用語は、優先的に又は好ましくは専ら修飾ヌクレオチド、好ましくはホスホロチオエート修飾ヌクレオチドからなるCpGオリゴヌクレオチドに関する。B型CpGは優先的にB細胞を刺激し、ある程度はNK細胞活性化とサイトカイン産生を刺激する。
「C型CpG」:ここで使用される場合、「C型CpG」なる用語は、B型オリゴヌクレオチドのように、優先的に又は好ましくは専ら修飾ヌクレオチド、好ましくはホスホロチオエート修飾ヌクレオチドからなるCpGオリゴヌクレオチドに関する。C型CpGの例は国際公開第2005/042018A2号及びVollmer等 2004, Eur. J. Immunol. 43:351-262(これらは出典明示によりここに援用する)に記載されている。特に国際公開第2005/042018A2号の配列番号1から69が参照される。CpGs C型CpGはA型及びB型CpGの効果を併せ持ち、B細胞又はNK細胞の活性化とIFN-α産生、好ましくは樹状細胞におけるIFN-α産生を刺激する。IFN-α産生を好ましくは樹状細胞において刺激することができるC型CpGが本発明において一般に好ましい。A型CpGとは異なり、C型CpGは、典型的にはポリ-Gストレッチを含まない。C型CpGは好ましくはCpGモチーフを含むパリンドローム配列、好ましくは配列番号53から60に記載したようなパリンドローム配列を含むか、あるいはそれらからなる。更に好ましいC型CpGは、(a)TCGTCGTTTTA(配列番号61)、(b)CGGCGCCGTGCCG(配列番号62)及び(c)CGGCGTCGTGCCG(配列番号63)からなる群から選択される配列を含み、ここで、上記C型CpGの5’端は好ましくは配列番号61からなり、及び/又は上記C型CpGの3’端は好ましくは配列番号62及び配列番号63から選択されるヌクレオチド配列からなり、最も好ましくは上記C型CpGの3’端は配列番号63からなる。更に好ましいC型CpGは、(a)TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(配列番号64)及び(b)TCGTCGTTTTACGGCGTCGTGCCG(配列番号625)からなる群から選択され、好ましくは上記C型CpGの全核酸はホスホロチオエート結合している。更に好ましいC型CpGは、(a)TCpGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(配列番号64);(b)TCGTCGTTTTACpGGCpGCCpGTGCCG(配列番号64);(c)TCGTCGTTTTACpGGCGCCpGTGCCG(配列番号64);(d)TCGTCpGTTTTACpGGCGCCpGTGCCG(配列番号64)からなる群から選択され、ここで、pはホスホジエステル結合を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホロチオエート結合である。(a)TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(配列番号66);(b)TCGTCGTTTTCGACGGCCGTCG(配列番号67);(c)TCGTCGTTTTCCGGCGCGCCGG(配列番号68);(d)TCGTCGTTTTCGGCGCGCGTCG(配列番号69);(e)TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(配列番号70);(f)TTGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(配列番号71);(g)TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(配列番号72);(h)TCGTCGTTTTCGGCTTTTGCCG(配列番号73);(i)TCGTCGTTTTCGGCGTTTTTTT(配列番号74);及び(j)TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(配列番号75)からなる群から選択されるC型CpGは、IFN-α産生の強力なインデューサーであり(Vollmer等 2004, Eur. J. Immunol. 43:351-262, p. 253, その表1を参照)、よって本発明における特に好ましい免疫賦活性核酸である。
「パリンドローム配列」:パリンドローム配列は、規則的な塩基対(A/T;C/G)を有する二本鎖核酸の形態で存在する場合、5’−3’方向に同一の二つの一本鎖からなるヌクレオチド配列である。本発明の免疫賦活性核酸は好ましくは少なくとも6、好ましくは少なくとも7、8、9又は10、最も好ましくは正確に10のヌクレオチドからなるパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記パリンドローム配列は好ましくはCpGモチーフを含む。本発明において有用な免疫賦活性核酸のパリンドローム配列は、例えばYamamoto等 1992, J. Immunol. 148(12):4072-4076及びKuramoto等1992, Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131に記載されている。好ましいパリンドローム配列は、CpGモチーフを含み、(a)GACGTC(配列番号35)、(b)AGCGCT(配列番号36)、(c)AACGTT(配列番号37)、(d)ATCGAT(配列番号38);(e)CGATCG(配列番号39);(f)CGTACG(配列番号40);(g)CGCGCG(配列番号41);(h)GCGCGC(配列番号42);(i)TCGCGA(配列番号43);(j)ACGATCGT(配列番号44);(k)CGACGATCGTCG(配列番号45);(l)CGACGACGATCGTCGTCG(配列番号46);(m)GACGATCGTC(配列番号28)、(n)CGACGACGATCGTCGTCG(配列番号47);(o)AACGTT(配列番号48);(p)CAACGTTG(配列番号49);(q)ACAACGTTGT(配列番号50);(r)AACAACGTTGTT(配列番号51);(s)CAACAACGTTGTTG(配列番号52);(t)CGGCGCGCGCCG(配列番号53);(u)CGACGGCCGTCG(配列番号54);(v)CCGGCGCGCCGG(配列番号55);(w)CGCGCG(配列番号56),(x)CGGCGCGCGCCG(配列番号57);(y)GGCGCGCGCC(配列番号58);(z)CGGCCG(配列番号59);及び(aa)CGGCGGCCGCCG(配列番号60)からなる群から選択される。A型CpGは好ましくはパリンドローム配列(a)から(s)から選択されるパリンドローム配列を含む一方、C型CpGは好ましくはパリンドローム配列(t)から(aa)から選択されるパリンドローム配列を含む。
パッケージ化(packaged):ここで使用される「パッケージ化」なる用語は、粒子、特にVLPとの関係したISS-NA、特に非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの状態を意味する。ここで使用される「パッケージ化」なる用語は、共有結合、好ましくは化学カップリングによるものを意味する。より好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、非共有結合、好ましくはイオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合を意味する。共有結合は好ましくはエステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素-硫黄結合、及び炭素-リン結合からなる群から選択される。非常に好ましくは、ここで使用される「パッケージ化」なる用語は粒子内への上記ISS-NAの封入(enclosement)又は部分的な封入を意味する。例えば、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、共有結合も非共有結合もなく実際の結合がない状態で、あるいは非共有結合によって、VLPに封入されうる。
典型的には、また好ましくは、ISS-NAがパッケージ化された粒子は分解から、好ましくはDNエース又はRNエース加水分解から上記ISS-NAを保護する。従って、好ましい意味では、「パッケージ化」なる用語は、パッケージされた状態のISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがDNエース又はRNエース加水分解から隔絶されている。より好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがDNエース又はRNエース加水分解から隔絶され、更に好ましくはDNエースはDNエースI又はベンゾナーゼである。皿により好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがベンゾナーゼ加水分解から隔絶されている。
典型的には、また好ましくは、ISS-NAがパッケージ化された粒子は分解から、好ましくはDNエース又はRNエース加水分解から上記ISS-NAを保護する。従って、好ましい意味では、「パッケージ化」なる用語は、パッケージされた状態のISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがDNエース又はRNエース加水分解から隔絶されている。より好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがDNエース又はRNエース加水分解から隔絶され、更に好ましくはDNエースはDNエースI又はベンゾナーゼである。皿により好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがベンゾナーゼ加水分解から隔絶されている。
ISS-NA、特に非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのDNエース(例えばDNエースI又はベンゾナーゼ)への接近性は好ましくは国際公開第2003/024481A2号の実施例11−17(その111頁を参照)に記載されているようにしてアッセイされる。好ましい意味では、VLPは、ベンゾナーゼ(2mMのMgCl2,pH7.2を含むバッファー中の190Uベンゾナーゼ/mgカプシドタンパク質、20−25℃,18時間)での処理後に少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが上記VLP(例えば臭化エチジウム染色ゲル中において)から回収され得る場合、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。そのようなアッセイには、適切なコントロールが必要であり、VLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの特定の組合せに対して適合かする必要があるかも知れないことは当業者には明らかである。より好ましい意味では、RNAバクテリオファージのVLPは、ベンゾナーゼ(2mMのMgCl2,pH7.2を含むバッファー中の190Uベンゾナーゼ/mgカプシドタンパク質、20−25℃,18時間)での処理後に少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがRNAバクテリオファージの上記VLPから回収され得る場合、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。非常に好ましい意味では、RNAバクテリオファージのVLPは、ベンゾナーゼ(2mMのMgCl2,pH7.2を含むバッファー中の190Uベンゾナーゼ/mgカプシドタンパク質、20−25℃,18時間)での処理後に少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがRNAバクテリオファージの上記VLPから回収され得る場合、G10(配列番号27)オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。より特定の意味では、RNAバクテリオファージQβ、AP205、GA又はfrのVLPは、ベンゾナーゼ(2mMのMgCl2,pH7.2を含むバッファー中の190Uベンゾナーゼ/mgカプシドタンパク質、20−25℃,18時間)での処理後に少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがRNAバクテリオファージの上記VLPから回収され得る場合、G10(配列番号27)オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。非常に特定の意味では、RNAバクテリオファージQβのVLPは、ベンゾナーゼ(2mMのMgCl2,pH7.2を含むバッファー中の190Uベンゾナーゼ/mgカプシドタンパク質、20−25℃,18時間)での処理後に少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがRNAバクテリオファージQβの上記VLPから回収され得る場合、G10(配列番号27)オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。
あるいは、ISS-NA、特にDNエース又はRNエース加水分解の基質を構成しないISS-NAの粒子中へのパッケージ状態は、実施例4に記載したように、サイズ排除クロマトグラフィー又はSDS-PAGE及び続く分光学的分析によって評価することができる。ISS-NAがパッケージされた粒子のパッケージ状態を証明する更なる可能性は、例えば実施例1に記載した条件下での、粒子の透析又はタンジェンシャルフロー濾過であり、パッケージされた核酸が上記粒子に付随して残る一方、非パッケージ化核酸は除去される。
非常に好ましい意味では、粒子は、バクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージ、更に好ましくはRNAバクテリオファージQβのウイルス粒子又はウイルス様粒子、最も好ましくはRNAバクテリオファージQβのウイルス粒子であり、上記ISS-NAが非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、好ましくはA型CpG、更に好ましくは配列番号72である場合、「パッケージ化」なる用語は、上記ISS-NAがパッケージされた粒子が、上記バクテリオファージ、好ましくは上記RNAバクテリオファージ、更に好ましくは大腸菌中でのコートタンパク質の組換え発現により得られた上記RNAバクテリオファージQβのウイルス粒子と同じ保持時間で溶出することを示しており、好ましくは上記保持時間は、好ましくは本願の実施例4に記載されているようなサイズ排除クロマトグラフィーによって決定され、好ましくは本願の実施例4に記載されているようにして決定される上記ISS-NAを含む。
非常に好ましい意味では、粒子は、バクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージ、更に好ましくはRNAバクテリオファージQβのウイルス粒子又はウイルス様粒子、最も好ましくはRNAバクテリオファージQβのウイルス粒子であり、上記ISS-NAが非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、好ましくはA型CpG、更に好ましくは配列番号72である場合、「パッケージ化」なる用語は、上記ISS-NAがパッケージされた粒子が、上記バクテリオファージ、好ましくは上記RNAバクテリオファージ、更に好ましくは大腸菌中でのコートタンパク質の組換え発現により得られた上記RNAバクテリオファージQβのウイルス粒子と同じ保持時間で溶出することを示しており、好ましくは上記保持時間は、好ましくは本願の実施例4に記載されているようなサイズ排除クロマトグラフィーによって決定され、好ましくは本願の実施例4に記載されているようにして決定される上記ISS-NAを含む。
好ましい実施態様では、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、粒子、好ましくはVLPカプシド内に、最も好ましくは非共有的にパッケージされる。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたVLPの調製方法は先行技術、例えば国際公開第2003/024481A2号(その実施例2、3、7、8、10、11、12、13、14、15、16、及び17、特にその実施例14−17を参照)及び国際公開第2004/000351A1号に与えられている。両出願の開示を出典明示により本願に援用する。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたVLPの調製のための更なるプロトコルは本願の実施例1、3、5及び6に提供される。
上で特定したアッセイ条件下、特に国際公開第2003/024481A2号の実施例11−17のものでは、上記ISS-NAがパッケージされる幾つかの合成粒子は、ある限られた量のISS-NAを放出し得、該放出は典型的には二相又はより多相の動態に従い、該動態は速やかな初期のバースト放出相と少なくとも一つの遅い放出相を含みうる。例えば、合成粒子にパッケージされたISS-NAの合成粒子は、生理バッファー中でインビトロで37℃又は30℃にてインキュベートされた場合に、バースト放出相で放出されうる。この場合、バースト放出相には少なくとも一つの遅い放出相が続く。ある場合には、I第二の放出相がフラットであり、これは、その相では合成粒子からISS-NAが放出されないか非常に限られた量しか放出されないことを意味する。二以上の相が、合成粒子からのISS-NAの放出動態の試験によって特定される。典型的には、初期のバースト放出相は24時間まで続く場合があり、遅い放出相は2−3日から6日又はそれ以上続く場合がある。ある場合には、遅い放出相はほぼフラットであり、バースト放出相後にISS-NAは放出されないか殆ど放出されない。あるいは、初期バースト相が存在せず、むしろ一又は複数の遅い放出相が存在しうる。 バースト放出相はパッケージ化を評価するアッセイにおいてヌクレアーゼ又は血清曝露に付随しうるので、このあっせいで評価されるヌクレアーゼ又は血清による分解からの保護は完全でない場合がある。保護を試験するためのアッセイで使用される条件下におけるオリゴヌクレオチドの初期バースト放出相の場合では、遅い放出相に対応するアッセイの時間スパンの間、保護が評価される。よって、ウイルス粒子又はウイルス様粒子ではなく合成粒子である粒子に関して「パッケージ化」なる用語は、合成粒子とISS-NAを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる組成物をまた包含し、上記合成粒子による ISS-NAの放出が起こるが、但し、上記合成粒子にパッケージされたISS-NAの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%がアッセイの終わりに上記合成粒子に付随して残る。
上で特定したアッセイ条件下、特に国際公開第2003/024481A2号の実施例11−17のものでは、上記ISS-NAがパッケージされる幾つかの合成粒子は、ある限られた量のISS-NAを放出し得、該放出は典型的には二相又はより多相の動態に従い、該動態は速やかな初期のバースト放出相と少なくとも一つの遅い放出相を含みうる。例えば、合成粒子にパッケージされたISS-NAの合成粒子は、生理バッファー中でインビトロで37℃又は30℃にてインキュベートされた場合に、バースト放出相で放出されうる。この場合、バースト放出相には少なくとも一つの遅い放出相が続く。ある場合には、I第二の放出相がフラットであり、これは、その相では合成粒子からISS-NAが放出されないか非常に限られた量しか放出されないことを意味する。二以上の相が、合成粒子からのISS-NAの放出動態の試験によって特定される。典型的には、初期のバースト放出相は24時間まで続く場合があり、遅い放出相は2−3日から6日又はそれ以上続く場合がある。ある場合には、遅い放出相はほぼフラットであり、バースト放出相後にISS-NAは放出されないか殆ど放出されない。あるいは、初期バースト相が存在せず、むしろ一又は複数の遅い放出相が存在しうる。 バースト放出相はパッケージ化を評価するアッセイにおいてヌクレアーゼ又は血清曝露に付随しうるので、このあっせいで評価されるヌクレアーゼ又は血清による分解からの保護は完全でない場合がある。保護を試験するためのアッセイで使用される条件下におけるオリゴヌクレオチドの初期バースト放出相の場合では、遅い放出相に対応するアッセイの時間スパンの間、保護が評価される。よって、ウイルス粒子又はウイルス様粒子ではなく合成粒子である粒子に関して「パッケージ化」なる用語は、合成粒子とISS-NAを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる組成物をまた包含し、上記合成粒子による ISS-NAの放出が起こるが、但し、上記合成粒子にパッケージされたISS-NAの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%がアッセイの終わりに上記合成粒子に付随して残る。
「粒子」:本発明の粒子は、10から10000nm、好ましくは20から1000nm、より好ましくは20から500nm、更により好ましくは20から300nm、更により好ましくは20から200nm、最も好ましくは20から100nmの直径を有し、これらの粒子には好ましくはISS-NAがパッケージされる。本発明の粒子は、好ましくは、合成粒子及びVLPからなる群から選択される。本発明の非常に好ましい粒子はVLP、より好ましくはRNAファージのVLPである。
「粒子のサイズ」:球状又はほぼ球状の粒子のサイズは、粒子集団の平均直径として決定される;楕円状、細長い又は不規則に形成された粒子は粒子集団の最も長い軸の算術平均値を意味する。典型的には、また好ましくは、粒子、好ましくはナノ粒子又は微小粒子(マイクロ粒子)、最も好ましくはナノ粒子のサイズは動的光散乱(DLS)法(実施例13)によって決定される。
「合成粒子」:ここで使用される場合、「合成粒子」は、化学的又は物理的プロセス、好ましくはモノマーの重合、ポリマーの沈殿、巨大分子の結合組立、例えば凝集又は熱変性、該組み立てられた巨大分子の化学的架橋によって、形成される粒子を意味する。好ましい合成粒子は、リポソーム、微小粒子(マイクロ粒子)及びナノ粒子から選択される。更に好ましい粒子は、リポソーム、微小粒子、ナノ粒子、及びビロソームから選択される。非常に好ましい合成粒子はナノ粒子である。「合成粒子」なる用語はウイルスタンパク質の集合によって形成された粒子は意味しない。ウイルスコートタンパク質から形成される粒子は特にウイルス粒子又はウイルス様粒子と呼ばれる。ウイロイド、レトロトランスポゾン及び遺伝子的にコードされたウイルスタンパク質から形成される全ての粒子がまたウイルス粒子又はウイルス様粒子として理解される。
「リポソーム」:ここで使用される場合、「リポソーム」なる用語は、一又は複数、好ましくは一、二、又は三のリン脂質二重層膜を含むリン脂質小胞体を意味する。リポソームは、調製方法及び使用される脂質に応じて電荷とサイズが変化する。本発明のリポソームは中性、カチオン性、アニオン性、ステルス、又はカチオン性ステルスでありうる。好ましくは、本発明のリポソームはカチオン性リポソームである。リポソームは、100から800nm、好ましくは100から400nm、より好ましくは100から300nm、更により好ましくは100から200nm、最も好ましくは200nm未満の直径を有しうる。「リポソーム」なる用語は、ここで使用される場合、修飾リポソーム、好ましくはリポソームの表面が、DCへの結合を、例えば特定の糖部分(Fukasawa等, (1998), FEBS, 441, 353-356)又は抗体(Serre等 (1998), J. Immunol., 161, 6059-6067)を介して最適化するために特に修飾されている修飾リポソームをまた包含する。
「リポポリプレックス(lipopolyplex)」:リポポリプレックス粒子は、カチオン性脂質、ポリカチオン及びISS-NA又はDNAを含むか、又は好ましくは本質的にそれらからなるか、最も好ましくはそれらからなるリポソームであり、カチオン性脂質が、ポリカチオンとのISS-NA又はDNAの複合体を囲む更なる保護層を形成していると考えられる(Pelisek J.等 J Gene Med 2006; 8:186-197)。
「微小粒子(マイクロ粒子)」:ここで使用される場合、「微小粒子」はミクロンオーダー(つまり、>1μmで、<1000μm)に制御された寸法の合成粒子を意味する。好ましい微小粒子は1から10μm、好ましくは1から5μm、より好ましくは1から2μmのサイズを有している。
「ナノ粒子」:ここで使用される場合、「ナノ粒子」はナノメーターオーダーに制御された寸法の合成粒子を意味し、好ましくはISS-NAが該ナノ粒子に捕捉され、カプセル化され、非共有結合され、共有結合され、又は溶解される。ナノ粒子のサイズは、好ましくは1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100又は50m未満であり、更に好ましくは、上記ナノ粒子は約10、15、20、30、40、又は50nm以上である。好ましくは、ナノ粒子は50nm以上である。よっって、本発明のナノ粒子は、好ましくは10から500nm、より好ましくは20から400nm、更により好ましくは40から300nm、更により好ましくは50から200nm、最も好ましくは50から100nmのサイズである。本発明において好ましいものは、100から300nmのサイズのナノ粒子であり、より好ましいものは100から200nmのサイズのナノ粒子である。非常に好ましいものは50から200nmのサイズのナノ粒子である。ナノ粒子という用語は、 球状、楕円状、細長い形状又は不規則な構造の粒子を包含し、好ましくは少なくとも一つのポリマーを含むか又はそれからなる。ナノ粒子はまたナノカプセル及びポリプレックス粒子を包含する。ナノカプセルは貯蔵所(リザーバ)、例えば油貯蔵所を含むナノ粒子であり、上記貯蔵所はポリマー壁によって囲まれている(Maria J. Alonso, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p206)。ある種の材料のナノ粒子、例えばポリエステルナノ粒子は、該材料を含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、最も好ましくはそれからなるナノ粒子を意味する。本発明において、この処方例はナノ粒子中のISS-NAの存在を排除しない。
ナノカプセルを含むナノ粒子の製造に適したポリマーは、生物分解性ポリエステル(例えばポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸供重合体(PLA及びPLGAと称される)、ポリ-e-カプロタクトン(PECLと称される)、ポリ-(アルキルシアノアクリレート) (PACAと称される)、キトサン、アルギネート、架橋ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、シゾフィラン(Schizofyllan)、デキストランのことである。ナノ粒子は生物非分解性材料、例えばポリスチレン、コロイド状金、シリカ、又は金属クラスターから調製することもできる。また、親水性成分m例えばPEG、多糖類(Lemarchand C.等(Eur J Pharm Biopharm. 2004 Sep;58:327-41)、デキストラン、キトサン、ポリリジン、レシチン等をコポリマーとして又はナノ粒子の表面に被覆試薬として導入することもまたできる。錯化剤、例えばポリリジン(PLL)、ポリ(エチレンイミン)(PEI)、プロタミン、スペルミン又は正に荷電した構造化オリゴペプチドを、核酸と共にナノ粒子に導入し、核酸の導入のためにナノ粒子表面に結合させ、ナノ粒子上の反応性基に共有的に結合させ、又はナノ粒子中に重合プロセスの間に導入することができる。他の錯化剤には酢酸亜鉛のような金属塩が含まれる。
「ポリプレックス」:ポリプレックス粒子は、核酸、好ましくはISS-NAとの、ポリカチオンとも呼ばれるカチオン性ポリマー、例えばポリリジン(PLL)、ポリ(エチレンイミン)(PEI)等の直接的相互作用によって形成されるナノ粒子である。ポリプレックスはまた上記核酸、好ましくは上記ISS-NAと、PEG-PLL又は例えば分岐状PEIの直接的相互作用によって形成されうる。
「錯化剤」:錯化剤は、ISS-NAに非共有的に結合し、得られた錯体の有効電荷を中和又は少なくとも部分的に減少させる薬剤である。錯化剤の例は、ポリリジン(PLL)、スペルミン、プロタミン、ポリエチレンイミン(PEI)、分岐状PEI、リジンリッチな構造化オリゴペプチド、カチオン性脂質、例えばDOTAP等、及び酢酸亜鉛、塩化マグネシウム、カルシウム等のような塩によって提供される金属カチオンである。更なる錯体ポリマー、例えばポリ(エチレン)グリコール-ポリリジン(PEG-PLL)コポリマーもまた錯化剤として使用することもできる。
「生物分解性」:材料、好ましくは粒子、より好ましくは微小粒子又はナノ粒子は、それが通常の哺乳動物の生理学的条件下で分解性又は腐食性である場合、生物分解性と称される。粒子の分解は、例えば、粒子の溶解、酵素分解、好ましくは加水分解又は酸化によって、あるいは任意の他の化学的又は物理的プロセスによる粒子の脱安定化によって、生じうる。通常の哺乳動物の生理学的条件は、血清中の試料を37℃でインキュベートすることにより試験管内で再現できる。健常な志願者からのヒト血清中で37℃にて72時間インキュベーションしたときに、分解すれば、その微小粒子又はナノ粒子は生物分解性であると考えられる。この定義において、「分解」とは、その質量及び/又は平均ポリマー長の少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも50%を失うことを意味する。最も好ましくは、粒子はこれらの条件下で完全に分解する。逆に、微小粒子又はナノ粒子は、ヒト血清中で37℃にて72時間インキュベーションしたときに、その質量及び/又は平均ポリマー長の少なくとも5%も失わない場合には、生物非分解性と称される。非常に好ましいものは、低pH、好ましくは免疫細胞のエンドソーム中で見出されるpH、より好ましくは4.5から6のpH、最も好ましくは約5のpHで生物分解性である粒子である。
「コートタンパク質」:ここで使用される場合、「コートタンパク質」なる用語は、バクテリオファージ又はRNAファージのカプシド集合体内に取り込むことができるバクテリオファージ又はRNAファージのタンパク質を意味する。しかしながら、RNAファージのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、「CP」なる用語を使用する。例えば、RNAファージQβのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「QβCP」と呼ぶ一方、バクテリオファージQbの「コートタンパク質」は、「QβCP」並びにA1タンパク質を含む。バクテリオファージQβのカプシドは、主にQβCPと、少ない含量のA1タンパク質で構成される。同様に、VLPQβのコートタンパク質は、主にQβCPと、少ない含量のA1タンパク質を含む。
「組換えVLP」:「組換えVLP」なる用語は、ここで使用される場合、組換えDNA技術の少なくとも一工程を含む方法によって得られるVLPを指す。ここで用いる「組換え生産されるVLP」なる用語は、組換えDNA技術の少なくとも一工程を含む方法によって得られるVLPを指す。よって、「組換えVLP」及び「組換え生産されるVLP」なる用語はここでは交換可能に用いられ、同一の意味を有する。
「ウイルス粒子」:ここで使用される「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形態を指す。あるウイルスタイプでは、それはタンパク質カプシドによって囲まれるゲノムを含み;他のものは更なる構造(外被、テイル等)を有している。
「ウイルス様粒子(VLP)」は、ここで使用される場合、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指すか、又は非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造類似ウイルス粒子、好ましくはウイルスのカプシドを指す。ここで用いられる「非複製性」なる用語は、VLPに包含されるゲノムを複製することができないことを意味する。ここで用いられる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入することができないことを意味する。好ましくは、本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノム又はゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び/又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルスゲノムが物理的又は化学的に不活化され、分解及び組立により、又はVLPへの精製タンパク質の組立により除かれているウイルス粒子である。てんけいてきには、またより好ましくは、ウイルス粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の構成成分の全て又は一部を欠いている。本発明に係るウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明に係るウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージのウイルスカプシド等のウイルスカプシドである。「ウイルスカプシド」又は「カプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子集合体を指す。典型的には、60、120、180、240、300、360及び360以上のウイルスタンパク質サブユニットがある。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復組織を持つウイルスカプシド又はウイルスカプシド様構造が形成され、上記構造は典型的には球状又は管状である。例えば、RNAバクテリオファージのカプシド又はHBcAgは、正二十面体対称の球状形態を有している。ここで使用される「カプシド様構造」なる用語は、上記の定義の意味でカプシド形態に類似するが、十分な次数と繰り返しを維持しながら典型的な対称組立体からは逸脱するウイルスタンパク質サブユニットからなる巨大分子組立体を意味する。本発明はVLP、好ましくは正二十面体対称を含む非天然VLPを包含する。ウイルス粒子とウイルス様粒子の一つの共通な特徴はそのサブユニットのより高次の繰り返し配置である。
「RNAバクテリオファージのウイルス様粒子」:ここで使用される場合、「RNAバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、RNAバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又は好ましくは本質的にそれらからなるか、又はそれらからなるウイルス様粒子を指す。また、RNAバクテリオファージの構造に類似するRNAバクテリオファージのウイルス様粒子は非複製性及び/又は非感染性であり、RNAバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子も欠損する。しかしながら、この定義は、上述の遺伝子又は遺伝子群がなお存在しているが不活性であり、よってまたRNAバクテリオファージの非複製性及び/又は非感染性ウイルス粒子を生じるRNAバクテリオファージのウイルス様粒子をまた包含する。RNAバクテリオファージ由来の好ましいVLPは正二十面体対称を示し、180のサブユニットからなる。本明細書において、「サブユニット」及び「モノマー」なる用語は本テキスト中で交換可能で等価的に使用される。RNAバクテリオファージのウイルス粒子を非複製性及び/又は非感染性にするために好適な方法は物理的、化学的不活化、例えば紫外線照射、ホルムアルデヒド処理により、典型的かつ好ましくは遺伝子操作による。あるいは、個々のタンパク質は全ビリオンから単離され、インビトロでVLPに組み立てられうる。
「合成VLP」:自然に細胞内的に又はインビトロで組み立てられ得る非天然発生タンパク質又はペプチドから形成される粒子は合成VLPと呼ばれる。合成VLPの例は、出典明示によりここに援用される国際公開第04071493A1号に提供される。合成VLPはまた組立に対して核酸又は金属イオンを必要とする粒子を包含する。好ましい合成粒子は、10から1000nm、好ましくは10から300nm、より好ましくは10から150nm、最も好ましくは15から100nmの決まったサイズを有する。他の好ましい合成VLPは、二以上の決まったコンホメーション、例えば15nmと25nmで存在しうる。
「ビロソーム」:ここで使用される場合、ビロソームなる用語は、再構成されたウイルス外被、好ましくは再構成されたインフルエンザウイルス外被、より好ましくは再構成されたインフルエンザA型ウイルス外被、最も好ましくはインフルエンザA型/シンガポールウイルスの再構成された外被に関する。ビロソームは薬剤担体系として当該分野で知られている。ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜は典型的かつ好ましくは単層脂質二重層を含む。好ましい意味では、ビロソームなる用語は、再構成されたインフルエンザウイルス外被、好ましくは再構成されたインフルエンザA型ウイルス外被、最も好ましくは再構成されたインフルエンザA型/シンガポールウイルス外被に関し、上記再構成されたインフルエンザウイルス外被、好ましくは再構成されたインフルエンザA型ウイルス外被、最も好ましくは再構成されたインフルエンザA型/シンガポールウイルス外被は脂質膜を含み、上記脂質膜はインフルエンザ糖タンパク質を含み、好ましくは上記インフルエンザ糖タンパク質は赤血球凝集素HAとノイラミニダーゼNAから選択される。典型的かつ好ましくは、ビロソームはHAを介して標的細胞に付着する。非常に好ましいビロソームは脂質膜、好ましくは脂質二重層を含み、上記脂質膜又は上記脂質二重層は主にカチオン性脂質を含むか又は好ましくはそれらから主としてなる。その脂質膜中にカチオン性脂質を含むビロソームは、ISS-NA、特にオリゴヌクレオチドの送達のために特に適している。更に好ましいものは特異的ビロソームであり、これは脂質膜に含まれる抗体又はその断片によって標的細胞に付着する。よって、更に好ましい意味では、ビロソームなる用語は、脂質膜を含む特異的ビロソームに関し、上記脂質膜は特異的抗体又はその断片、好ましくはFab断片又はFab’断片を含み、好ましくは上記抗体又はその断片の特異性が、ビロソームを特異的標的細胞に向ける。典型的かつ好ましくは、ビロソームは、レセプター依存性エンドサイトーシスによって標的細胞に取り上げられる。
「有効量」:ここで使用される場合、「有効量」なる用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要な又は十分な量を指す。組成物、好ましくは薬学的組成物の有効量は、この選択された結果を得る量であり、かかる量は当業者により常套的に決定されうる。例えば、免疫系不全を治療するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露時に抗原特異的な免疫応答の進行をもたらすのに必要な量であろう。該用語は、「十分な量」とも同義である。任意の特定の適用例に対する有効量は、治療される疾患又は状態、投与される特定の組成物、患者の大きさ、及び/又は疾患又は状態の重篤度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者であれば、過度の実験を必要とせずに、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
「治療」:ここで使用される場合、「治療」、「治療する」、「治療した」又は「治療している」なる用語は、予防及び/又は治療を指す。例えばアトピー性疾患に対して使用される場合、該用語は、患者が罹っている疾患の症状の深刻度を評価するために一般的に使用される標準的方法によって評価して、治療される患者の症状スコアを減少させる治療的処置を意味する。該用語はまた例えば未処置の患者と比較して誘発剤への曝露時に患者が典型的に発症する症状を予防し又は寛解させるアトピー性疾患の予防的治療をも意味しうる。
「薬学的に許容可能な担体」:本発明の組成物は、場合によっては薬学的に許容可能な担体と組み合わせられうる。ここで使用される「薬学的に許容可能な担体」なる用語は、ヒト又は他の動物への投与に適している一又は複数の適合性のある固形又は液状フィラー、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。「担体」なる用語は、投与を容易にするために活性成分と組み合わされる天然又は合成の有機又は無機成分を示す。
「薬学的組成物」:ここで使用される場合、「薬学的組成物」なる用語は、本発明の組成物を含み、動物に投与可能である形態にある製剤を意味する。典型的かつ好ましくは、薬学的組成物は、本発明の組成物が懸濁させられ又は溶解される一般的な生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物は症状を予防し、寛解し、又はその他治療するために簡便に使用され得る。宿主への導入時には、薬学的組成物は、限定するものではないが、抗体及び/又はサイトカインの産生及び/又は細胞傷害性T細胞、抗原提示細胞、ヘルパーT細胞、樹状細胞及び/又は他の細胞性応答の活性化を含む免疫応答を誘発することができる。好ましい薬学的組成物はサイトカイン環境、典型的かつ好ましくはIFN-αの形成を誘導し、それがアレルギー及び/又は喘息の症状を減じる。場合によっては、薬学的組成物は本発明の組成物に対して少ない又は主要な割合で存在し得るアジュバントを更に含む。
「アジュバント」:ここで用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明の組成物と組み合わせると、より亢進した及び/又は長い免疫応答、好ましくはサイトカイン産生をもたらす貯蔵所の生成を宿主内において可能にする物質又は免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。様々なアジュバントが当該分野で知られており、本発明において有用である。好ましいアジュバントは、不完全フロイントアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、修飾ムラミルジペプチド、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、BCG (ウシ型弱毒結核菌ワクチン)、コリネバクテリウムパルバム、Toll様レセプター(TLR)のリガンドであって、限定しないがペプチドグリカン、リポ多糖類とその誘導体、ポリI:C、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、イミダゾキノリン、例えばレシキモド及びイミキモド、フラゲリン、モノホスホリル脂質免疫修飾物質、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、GPI-0100、CRL1005、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294、ビロソームアジュバント技術及びこれら物質の任意の混合物からなる群から選択される。本発明の目的のための非常に好ましいアジュバントはアルミニウム含有アジュバント、好ましくはアルミニウム含有鉱物性ゲル、最も好ましくはアルハイドロゲルである。非常に好ましい実施態様では、前記アジュバントはアルハイドロゲルである。アジュバントなる用語はまた上に列挙した物質の任意のものの混合物を包含する。本発明の粒子、好ましくはVLPは、一般にはアジュバントとして記載されている。しかしながら、本願の文脈内で使用される「アジュバント」なる用語は本発明の粒子ではなく、特に本発明の組成物に使用されるVLPではないアジュバントを意味する。それぞれの場合、アジュバントなる用語は前記粒子に加えて使用されるアジュバントを意味する。
「ポリペプチド」:ここで用いられる「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸残基、一般には天然のアミノ酸残基からなるポリマーを意味する。ポリペプチドは必ずしも大きさが限定されないが、ポリペプチドなる用語はおよそ10からおよそ50のアミノ酸の大きさのペプチドと関連してしばしば使用される。
「タンパク質」:ここで使用される場合、タンパク質なる用語は、20より多く、より好ましくは50より多いアミノ酸残基の大きさのポリペプチドを指す。必ずしも必要ではないが、タンパク質は、一般に、定まった三次元構造を有しており、定まった三次元構造を有しておらず、むしろ多数の異なる高次構造を採ることができ、折りたたまれていない(unfolded)と称されるペプチド及びポリペプチドに対して、しばしば折りたたまれた(folded)と称される。
「配列同一性」:ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、既知のコンピュータープログラム、例えばBestfitプログラムを使用して常套的に決定することができる。特定の配列が例えば参照アミノ酸配列に対して95%の同一性があるかどうかを決定するためにBestfit又は他の配列アライメントプログラム、好ましくはBestfitを用いる場合、同一性の割合が参照アミノ酸配列の完全長に対して算出され、ホモロジー内のギャップが参照配列のアミノ酸残基の総数の5%以下になるように、パラメーターを設定する。ポリペプチド間の同一性の割合を決定する際の上述の方法は、この発明で開示される全てのタンパク質、ポリペプチド又はその断片に適用される。
「配列相同性」:ヌクレオチド配列の相同性は、好ましくは、BLASTアルゴリズムの実行であるプログラムblastnによって、最も好ましくは該ソフトウェアのデフォルト設定を用いて、決定することができる。
ここで用いられる「タンパク質の断片」、特に組換えタンパク質又は組換えコートタンパク質の断片は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%の長さであり、好ましくはVLP形成能を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一つの内部欠損、少なくとも一つの切断又は少なくとも一つのその組合せによって得られる。「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」は、上で定義された「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」それぞれの少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子に組立て可能なポリペプチドを更に包含する。
「変異体コートタンパク質」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれから誘導されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、ここでアミノ酸配列は、野生型配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、95%、97%、又は99%同一であり、好ましくはVLPへの組立て能を保持している。
「動物」:ここで使用される「動物」なる用語は、任意の動物、好ましくは非脊椎動物、好ましくはクモ類及び昆虫、及び脊椎動物を含む、免疫系を有する任意の動物を指す。典型的には、また好ましくは、動物は脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに関する。よって、動物には例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ラット、マウス、トリ、爬虫類、魚類、昆虫及びクモ類が含まれる。
「One」、「a/an」:「one」、「a」、又は「an」なる用語が本明細書中で使用される場合、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一つ」又は「一又は複数」を意味する。
「約」:本願の意味では、約なる表現は+/−10%の意味を有している。例えば約100は90から110を意味する。
これまでに開示したように、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたVLPは、B及びT細胞応答を亢進し得る。アレルゲンと共にCpG含有オリゴヌクレオチドを適用することによりアレルギー反応が寛解されることがまたこれまでに観察された。本発明の粒子、好ましくはVLPとのアレルゲンの共有結合、カップリング又は混合が過敏症、好ましくはアレルギーの治療において効果を達成するために必要とはされないことが驚いたことに今見出された。更に驚いたことには、本発明の組成物を使用する過敏症、好ましくはアレルギーの治療において、特定の抗原又はアレルゲンの投与又は同時投与が必要とはされないことが見出された。更に、上記効果は非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたVLPには限定されず、免疫賦活性核酸(ISS-NA)がパッケージされた本発明の粒子に一般化することができる。
本出願人は、ISS-NAがパッケージされた粒子での治療によって過敏症を治癒できることを発見した。本出願人は適切なサイズの粒子が皮内又は皮下注射後に流入領域リンパ節まで直ぐに拡散し、そこでそれらが主として樹状細胞(DC)及びマクロファージによって取り上げられることをまた示した。形質細胞様樹状細胞(pDC)、単球由来及び好白球樹状細胞又はマクロファージを含む様々なDCが、Toll-9レセプターを経由して非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされた粒子、好ましくはVLPの取り込み時に活性化される。本出願人は、50から200nmのサイズのポリスチレンナノ粒子がまた流入領域リンパ節まで直ぐに拡散する一方、より大きな粒子(>500nm)が皮下注射後の同じ時間スパンの間に注射部位に残ることをまた発見した。PLGAナノ粒子は樹状細胞(DC)によって貪食されることが示された(Diwan等 J Drug Target. 2003;11:495-507)。更に、非メチル化CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドと抗原を同時に取り込んだPLGAナノ粒子をパルス添加したマウスDCが、抗原のみを含めたPLGAナノ粒子をパルス添加したDCと比較して、T細胞刺激アッセイにおいて抗原特異的T細胞活性化を亢進することが示された。従って、非メチル化CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドのようなISS-NAを導入したナノ粒子は取り込み時に樹状細胞を刺激することができ、これらの樹状細胞がその後T細胞を活性化する。ヒト樹状細胞において、Toll様レセプター9の発現は小サブセット、つまりいわゆる形質細胞様樹状細胞に限られている。我々は、約30nmのサイズを有するQβウイルス様粒子がヒト形質細胞様樹状細胞によって取り上げられ、よってISS-NAをこれら細胞に送達できることをここに示す。興味深いことには、マスト細胞もTLR-9を発現する。最近の報告は、アレルゲン誘発時にTh2細胞活性化を防止する際のCpG含有オリゴヌクレオチドの役割を示している(Hessel等 (2005) J. exp. Med. 11: 1563-73.)。従って、ISS-NAがパッケージされたナノ粒子又はVLPのような粒子の、形質細胞様樹状細胞又は抗原提示細胞、例えば伝統的な樹状細胞による取り込みはTh2細胞の活性化の阻害を生じ、よってアレルゲン誘発反応を阻害しうる。同じ報告はアレルギー応答に対する非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの抑制作用におけるマスト細胞に関連している。マスト細胞は食作用に活性であり、本発明の粒子、好ましくはナノ粒子又はVLPであって、該ナノ粒子又はVLP、好ましくは上記VLPにISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたものがマスト細胞の阻害を介してその効果を部分的に媒介し、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたVLP又はナノ粒子の他の代替的又は相補的に可能な作用機序をもたらすことができる。しかしながら、本発明の組成物の作用態様はこの機序に限定されるものではない。
上述した知見に基づいて、本発明は、動物における過敏症、好ましくはアレルギーの治療又は予防のための組成物、薬学的組成物及び方法を提供する。特に、本発明は動物における過敏症を治療するための方法に使用される組成物を提供し、該組成物は粒子とISS-NAを含有し、該粒子に上記ISS-NAがパッケージされている。本発明は、過敏症、好ましくはアレルギー、より好ましくはアトピー性湿疹、アトピー性喘息及びI型アレルギー、例えば花粉アレルギー(花粉症)を治療し、及び/又は予防するために特に有用である方法及び組成物を提供する。
この文脈において、粒子なる用語は、その化学的及び物理的特徴に対して、ISS-NAがパッケージされうる任意の構造を意味し、好ましくは該粒子は上記動物の体内において上記ISS-NAを分解から保護することができ、及び/又は該粒子は上記ISS-NAを免疫細胞に特異的に送達させ放出させることができる。よって、有効であるためには、本発明の粒子は、好ましくは(i)ISS-NAを収容し、(ii)上記ISS-NAを体内の免疫細胞に送達させ得る。従って、本発明の粒子は非常に広い意味で理解されなければならない。
好ましい実施態様では、上記分子は、合成分子、ウイルス粒子及びVLPからなる群から選択される。
好ましい実施態様では、上記分子は、合成分子、ウイルス粒子及びVLPからなる群から選択される。
本発明の分子は生物分解性又は生物非分解性でありうる。生物分解性粒子は上記動物の体内における上記粒子の蓄積を予防し、このような蓄積と関係しているかも知れない毒性効果を回避するために一般に好ましい。従って、好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子、最も好ましくは上記ナノ粒子は、生物分解性物質を含み、又は好ましくはそれから本質的になり、最も好ましくはそれからなる。更に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子、最も好ましくは上記ナノ粒子は、生物分解性である。非常に好ましい実施態様では、上記ISS-NAがパッケージされた上記合成粒子は生物分解性である。更なる実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子は、好ましくは標的細胞内、最も好ましくは標的細胞のエンドソーム中に、上記ISS-NAを放出する。更に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子は、プロテアーゼを含み、低pH、好ましくは約pH5を示す標的細胞のエンドソーム区画中で分解される。
本発明の一実施態様では、上記粒子は合成粒子、好ましくはリポソーム、微小粒子及びナノ粒子からなる群から選択される合成粒子であり、より好ましくは上記合成粒子はリポソーム又はナノ粒子であり、更により好ましくはナノ粒子である。本発明の更なる実施態様では、上記粒子は合成粒子、好ましくはリポソーム、微小粒子、ナノ粒子及びビロソームからなる群から選択される合成粒子である。本発明の合成粒子は、生物非分解性物質、生物分解性物質又はそれらの混合物を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなり、上記生物分解性物質は有機又は無機又は双方の組合せでありうる。
好ましい実施態様では、上記合成粒子は微小粒子又はナノ粒子、好ましくはナノ粒子であり、該合成粒子は、(a)ポリエステル類、好ましくはPLA、ポリ(グリコール酸)及びPECLから選択されるもの、(b)ポリエステル類のコポリマー、好ましくはPLGA、(c)ポリエステルとPEGのブロックコポリマー、(d)ポリオルトエステル、(e)ポリ(無水物)、(f)ポリ(セバシン酸)、(g)アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ無水物、(h)ポリ無水物エステル、(i)ポリホスファゼン、好ましくは加水分解に敏感なエステル基を含むポリホスファゼン(Andrianov AK及びPayne LG, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p127-147)、(j)ポリアミド、(k)好ましくはタンパク質から選択される巨大分子及び生物由来の変性巨大分子(例えばゼラチン、ヒト血清アルブミン)及び(l)多糖類(例えばデキストラン、キトサン、アルギネート、シゾフィラン(Schyzofyllan))、(m)好ましくはポリ(メチルメタクリレート)及びコポリマー、好ましくはPEG-メタクリレート又はPEG-ジメタクリレートから選択されるメタクリレート系物質、(n)好ましくはPEGベースコモノマー及びイオン性コモノマーから選択されるメチルメタクリレート系物質、(o)Bousquet Y等 Biomaterials. 1998 Jan-Feb;19:271-8及びBreton P等 Pharm Res. 1999;16:141-7に記載されているようなポリ(メチリデンマロネート2.1.2)、(p)コロイド状金、(q)ポリスチレン、(r)ポリエチレン、(s)ポリプロピレン、(t)ラテックス、(u)強磁性又は常磁性材料、(v)デキストラン、(w)ハイドロキシアパタイト、及び(x)上に挙げた材料の任意のものの混合物からなる群から選択される材料を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなる。
好ましい実施態様では、上記合成粒子は、微小粒子又はナノ粒子、好ましくはナノ粒子であり、ここで、上記合成粒子は、(a)コロイド状金、(b)ポリスチレン、(c)ポリエチレン、(d)ポリプロピレン、(e)ラテックス、(f)強磁性又は常磁性材料、(g)デキストラン及び(h)ハイドロキシアパタイトからなる群から選択される生物非分解性材料を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなる。
より好ましい実施態様では、上記合成粒子、好ましくは上記ナノ粒子は、(a)ポリエステル類、好ましくはPLA、ポリ(グリコール酸)及びPECLから選択されるもの、(b)ポリエステル類のコポリマー、好ましくはPLGA、(c)ポリエステルとPEGのブロックコポリマー、(d)ポリオルトエステル、(e)ポリ(無水物)、(f)ポリ(セバシン酸)、(g)アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ無水物、(h)ポリ無水物エステル、(i)ポリホスファゼン、好ましくは加水分解に敏感なエステル基を含むポリホスファゼン(Andrianov A.K.及びPayne LG, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p127-147)、(j)ポリアミド、(k)好ましくはタンパク質から選択される巨大分子及び生物由来の変性巨大分子(例えばゼラチン、ヒト血清アルブミン)及び多糖類(例えばデキストラン、キトサン、アルギン酸塩、シゾフィラン(Schyzofyllan))からなる群から選択される生物分解性材料を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなる。
より好ましい実施態様では、上記合成粒子、好ましくは上記ナノ粒子は、(a)ポリエステル類、好ましくはPLA、ポリ(グリコール酸)及びPECLから選択されるもの、(b)ポリエステル類のコポリマー、好ましくはPLGA、(c)ポリエステルとPEGのブロックコポリマー、(d)ポリオルトエステル、(e)ポリ(無水物)、(f)ポリ(セバシン酸)、(g)アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ無水物、(h)ポリ無水物エステル、(i)ポリホスファゼン、好ましくは加水分解に敏感なエステル基を含むポリホスファゼン(Andrianov A.K.及びPayne LG, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p127-147)、(j)ポリアミド、(k)好ましくはタンパク質から選択される巨大分子及び生物由来の変性巨大分子(例えばゼラチン、ヒト血清アルブミン)及び多糖類(例えばデキストラン、キトサン、アルギン酸塩、シゾフィラン(Schyzofyllan))からなる群から選択される生物分解性材料を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなる。
更により好ましい実施態様では、上記生物分解性材料は、(a)ポリエステル類、好ましくはPLA、ポリ(グリコール酸)及びPECLから選択されるもの、(b)ポリエステル類のコポリマー、好ましくはPLGA、(c)ポリエステルとPEGのブロックコポリマー、(d)ポリオルトエステル、(e)ポリ(無水物)、(f)ポリ(セバシン酸)、(g)アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ無水物、(h)ポリ無水物エステル、(i)ポリホスファゼン、好ましくは加水分解に敏感なエステル基を含むポリホスファゼン(Andrianov AK及びPayne LG, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p127-147)、及び(j)ポリアミドから選択される。
更により好ましい実施態様では、上記生物分解性材料は、(a)ポリエステル類、好ましくはPLA、ポリ(グリコール酸)及びPECLから選択されるもの、及び(b)ポリエステル類のコポリマー、好ましくはPLGAから選択される。
更に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子、最も好ましくは上記ナノ粒子は、少なくとも一、好ましくは正確に三、より好ましくは正確に二、最も好ましくは正確に一の生物分解性ポリマーを含むか、好ましくはそれらから本質的になり、好ましくは、上記ポリマーは生物分解性の非毒性ポリマーに分解し、更により好ましくは、上記生物分解性ポリマーはポリエステルである(Maria J. Alonso等, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p 203-242)。
更に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子、最も好ましくは上記ナノ粒子は、少なくとも一、好ましくは正確に三、より好ましくは正確に二、最も好ましくは正確に一の生物分解性ポリマーを含むか、好ましくはそれらから本質的になり、好ましくは、上記ポリマーは生物分解性の非毒性ポリマーに分解し、更により好ましくは、上記生物分解性ポリマーはポリエステルである(Maria J. Alonso等, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p 203-242)。
ナノ粒子は、化学的又は物理的方法、例えば、エマルジョンのナノ滴としてのモノマーの重合又は縮合、ポリマーの沈殿、巨大分子のコアセルベーション、例えば乳化方法によって、イオン相互作用によって、一緒にされた巨大分子の組立て、該組立てられた巨大分子の凝集、熱変性又は化学的架橋によって形成されうる。ナノ粒子は、ポリマーの疎水性コア層と他のポリマー、例えばポリ(エチレン)グリコール(PEG)の親水性外部シェル層を有するコア-シェル粒子のように、異なった性質の2以上の層を含む複合構造をまた有しうる。コア-シェルナノ粒子の他の例には、荷電ポリマー、例えばポリリジンがナノ粒子の表面に吸着されたナノ粒子が含まれる。あるいは、カチオン性部分を担持するコモノマーとPEG部分を担持するコモノマーが重合プロセスに含まれるより複合のナノ粒子が製造されてもよい。よって、好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は外部シェル層を含み、ここで好ましくは上記外部シェル層はPEGを含むか、あるいは本質的にそれからなる。非常に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はコア及びシェル層を含み、該コアはPEGを含むか、あるいは本質的にそれからなる。更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はコア及びシェル層を含み、該コアはポリアルキルシアノアクリレートを含むか、あるいは本質的にそれからなり、好ましくは上記シェル層はPEGを含むか、あるいは本質的にそれからなる。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は、コア-シェルナノ粒子であり、好ましくは、該コア-シェルナノ粒子のシェル層には上記ISS-NAがパッケージされる。好ましくは、上記コア-シェルナノ粒子の上記シェル層は正に荷電している。更に好ましくは、上記コア-シェルナノ粒子の上記シェル層はポリマーを含むか、あるいは本質的にそれからなり、好ましくは該ポリマーは、ポリリジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)及びポリエチレンイミンから選択される。あるいは、上記ISS-NAは、例えばCaP-PEG-PAAナノ粒子の、コア層に優先して随伴していてもよい。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はポリプレックス(polyplex)である。ポリプレックスナノ粒子は、PEI、PLL又はPEG-PLLのような錯化剤とISS-NAの直接の会合が、いわゆるポリプレックスを形成することによって、形成される(Boeckle S.等 J Gene Med 2004; 6:1102-1111;Wagner E.等 Adv Genet. 2005;53:333-54;Walker G.等 Mol Ther. 2005;11:418-25)。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はポリプレックス(polyplex)である。ポリプレックスナノ粒子は、PEI、PLL又はPEG-PLLのような錯化剤とISS-NAの直接の会合が、いわゆるポリプレックスを形成することによって、形成される(Boeckle S.等 J Gene Med 2004; 6:1102-1111;Wagner E.等 Adv Genet. 2005;53:333-54;Walker G.等 Mol Ther. 2005;11:418-25)。
ナノ粒子のサイズは、Alonso M.J.(Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p203-242)において概説されているように、走査型及び透過型電子顕微鏡法、又は光子相関分光法又は動的光散乱法のような既知の方法を用いて決定することができる。表面電荷、特にゼータ電位のような表面特性は、電気泳動移動度測定のような方法を使用して電場におけるナノ粒子の速度を決定することで測定することができる。レーザードップラー測風法又は電気泳動光散乱法が使用されてもよい。あるいは、交流電場に対する音波応答(電子音波振幅効果)も用いることもできる。測定は市販の装置で実施できる。ゼータ電位はナノ粒子の凝集挙動、又はその表面上の荷電成分を吸着するその能力を予想するために有益であり、よってナノ粒子の性質を最適にするのに役立つ。
好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は、ポリエステル類、好ましくは脂肪族ポリエステル類を含むか、あるいは本質的にそれからなる。脂肪族ポリエステル類は、生理学的に生じる代謝物への無作為の加水分解によって分解する。これらの材料は再吸収性縫合糸に使用されており、リュープロリド酢酸塩(ゴナドトロピン放出ホルモン類似体)の非経口注射用のポリエステルミクロスフィア製剤は市販品である。幾つかのポリマーを、本発明のナノ粒子の調製に用いることができ、開示されている:ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、又はPLAA及びPGAのコポリマー、PLGAと呼ばれる乳酸グリコール酸共重合体が特に適している。ラセミの非晶質形態が好ましい。これらのポリマーは市販されており、それらの合成は当該分野でよく知られている。それらの合成法は、例えばAvgoustakisK(Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)によって記載されている。ポリエステルミクロスフィア、特にPLGAの性質、並びにそれらを生産する方法は、Kissel T及びKoneberg R(Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen and Howard Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p. 51-87)に概説され、記載されている。これらの方法には、スプレードライ法、水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法及び相分離法が含まれる。好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は、PLGAを含むか、あるいは本質的にそれからなり、好ましくは、PLGAを構成するモノマーのモル比は50モル%LA及び50モル%GAである。モノマーの何れかの割合を増加させると、ポリマーの分解が遅くなる。例えば、85:15のLA:GAの比率を有するポリマーは、50:50の比率のものよりおよそ2.5倍遅い分解速度を有する。よって、PLGAポリマーの性質はモノマーの割合を変えることによって操作することができる。
ナノ粒子、特にポリエステル材料から作製されるナノ粒子の調製は、例えばAlonso MJ( Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p203-242)又はAvgoustakis K(Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)によって概説されている。ポリエステルナノ粒子を生産する方法は、またそこに記載されており、ポリマー沈殿法と集合的に呼ばれる方法を含む。これらの方法では、有機溶媒に溶解されたポリマーが安定化剤を含む水中で乳化される。有機溶媒は有機相から水性相中に拡散する。有機相からの溶媒の枯渇の結果はポリマーの沈殿であり、ナノ粒子の形成に至る。
これらの一つは溶媒抽出-蒸発法である。この方法では、塩化メチレン、酢酸エチル又はクロロホルムのような水溶解性が乏しい有機溶媒が使用される。しかしながら、溶媒は非常に過剰の水のために有機相から水相中に抽出され、これは溶媒の続く蒸発によって更に容易にされる方法である。溶媒抽出-蒸発法は、本質的には、含められる分子の疎水性に応じて、分子をナノ粒子に導入するために二つの一般的な方法で実施され得る。疎水性分子、又は水不溶性の複合体はポリマーと同じ有機溶媒に溶解させ又は懸濁させ、ついで、安定剤、典型的には界面活性剤、例えばポリ(ビニルアルコール)(PVA)、、ポロキサマー又は例えばデキストランを含む外部水相において乳化させることができ、乳化過程の間に形成されるナノ液滴が溶媒抽出及び蒸発の際にナノ粒子を形成する。好ましくは、エマルジョンは、高速又は高圧ホモジナイザー、微細流動化(microfluidization)又は超音波処理を使用して調製される。集中的な撹拌又はボルテックス化もまた適している。この方法はまた水中油溶媒抽出及び蒸発法と呼ばれる。
より親水性又は両親媒性化合物が、ポリマーを含む多量の有機溶媒中に水溶液として導入される。好ましくは、水溶液は、例えば高速又は高圧ホモジナイザー、微細流動化、超音波処理、ボルテックス又は集中撹拌を使用して、有機溶媒と乳化される。得られた油中水エマルジョン又は懸濁液は多量の水に更に乳化され、水中油中水エマルジョンを生じ、溶媒抽出及び蒸発の際にそこからナノ粒子が形成される。この方法はまた水中油中水溶媒蒸発法と呼ばれる。
溶媒抽出及び蒸発法は、例えば温度を増大させ、真空を形成し、又はイソプロパノール(例えば2%)のようなアルコールを外部水相に加えてその外部水相中における有機溶媒の溶解度を増加させることによって、更に加速させることができる。例えば、ロータリーエバポレーター(rotavapor)を用いて溶媒抽出及び蒸発を加速させることができる。
溶媒抽出及び蒸発法は、例えば温度を増大させ、真空を形成し、又はイソプロパノール(例えば2%)のようなアルコールを外部水相に加えてその外部水相中における有機溶媒の溶解度を増加させることによって、更に加速させることができる。例えば、ロータリーエバポレーター(rotavapor)を用いて溶媒抽出及び蒸発を加速させることができる。
製造プロセスにおいて使用されるある種の界面活性剤のような、動物又はヒトへの非経口注入と適合性がない幾つかの成分は、例えば水での洗浄工程によって、除去されなければならない場合がある。使用される精製方法は例えばタンジェンシャルフロー濾過、又は遠心分離である。ついで、ナノ粒子は典型的には凍結乾燥によって分離され、その場合、トレハロース又はグルコース等の糖のような凍結保護物質がナノ粒子の凝集を予防するために加えられる。
他のポリマー沈殿法は、溶媒置換又はナノ沈殿法である。それは、外部水相に完全に可溶性である有機溶媒の使用を伴う。ポリマーは、アセトン、エタノール又はメタノールに溶解させ、例えばポロキサマー188のような界面活性剤の水溶液中に撹拌しながら導入する際に沈殿する。
更なる高分子沈殿法は、塩析技術である。この方法では、ポリマーは例えばアセトンに溶解させられ、PVAの飽和水溶液を撹拌下で加えて、水中油エマルジョンを形成する。水を更に加え、アセトンが外部水相に拡散すると、ポリマーが沈殿してナノ粒子を形成する。
他のポリマー沈殿法は、溶媒置換又はナノ沈殿法である。それは、外部水相に完全に可溶性である有機溶媒の使用を伴う。ポリマーは、アセトン、エタノール又はメタノールに溶解させ、例えばポロキサマー188のような界面活性剤の水溶液中に撹拌しながら導入する際に沈殿する。
更なる高分子沈殿法は、塩析技術である。この方法では、ポリマーは例えばアセトンに溶解させられ、PVAの飽和水溶液を撹拌下で加えて、水中油エマルジョンを形成する。水を更に加え、アセトンが外部水相に拡散すると、ポリマーが沈殿してナノ粒子を形成する。
本発明の更なる実施態様では、上記ナノ粒子は、PEG-ポリエステルナノ粒子、例えばPEG-PLA又はPEG-PLGAナノ粒子である。PLA及びPLGA粒子はオプソニンのような血漿タンパク質を吸収し、補体系を活性化する。血漿タンパク質結合を最小にするために、コア-シェル粒子が製造されており、そこでは、親水性PEGの相のシェルが粒子のポリマーコアを囲み、血漿タンパク質又はオプソニンの疎水性ポリマー表面への付着を防止し又は低減させる。ポリ(エチレングリコール)でのナノ粒子、特にPLGAナノ粒子の被覆は、補体活性化を強く減少させ、血液循環時間を増大させることが示されている(Gref R等 Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p279-305;Hawley AE等 Pharm Res. 1997;14:657-61)。皮下注射時のリンパ節の富化は裸のPLGA粒子と比較してまた富化された(Hawley AE等 Pharm Res. 1997;14:657-61)。ポリスチレン又はPLGAナノ粒子をPLA-PEGコポリマーで被覆すると、より短いPEG鎖の最大のリンパ節富化が得られた(750 Da PEG、PLA:PEG 1.5:0.75;Hawley AE等 Pharm Res. 1997;14:657-61)。より長いPEG鎖は注射部位からのドレナージを増加させ、リンパ節レベルを減少させ、リンパ節マクロファージの効率の低い捕捉が示唆され、よって、長いPEG鎖の立体障害の増加の結果、全身性分布が増加する。PLA-PEG(PLA:PEG1.5:0.75)が沈殿プロセス中にPLGAナノ粒子に導入されると、中間の割合のPLA-PEG(35%)を有するナノ粒子で最も高いリンパ節富化が得られ、45%のPLA-PEGの粒子が、高血液及び肝臓レベルに反映されるように、全身性分布を増加させた。よって、PEG鎖長とナノ粒子に導入されるPEGコポリマーの割合の変動によりナノ粒子の薬物動態学的性質の操作が可能になる。
PEG-PLA及びPEG-PLGAナノ粒子の調製方法は、PLA及びPLGAナノ粒子の調製のために使用する方法と同様であり、Avgoustakis K (Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)及びGref R.等.(Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p279-305)に概説されている。これらの方法は、エマルジョン-溶媒蒸発法、溶媒置換法及び塩析法を含む。ナノカプセルの調製のための塩析法の使用もまたそこに記載されている。ブロックコポリマーを合成する方法は当該分野で知られている。オクタン酸第一スズにより触媒されるモノメトキシ-PEGへのモノマー(ラクチド、グリコリド、カプロラクトン又はそれらの混合物)の環開重合によりジブロックコポリマー(例えばPEG-PLA)を調製するための一方法、並びにナノ粒子の調製のための多ブロックコポリマーの調製と使用は、Avgoustakis K(Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)とそこの文献に記載され概説されている。
PLA/PEG及びPLGA/PEGの変動は、製造されるナノ粒子の構造を操作することを可能にする。 例えば、低比率はより動的なタイプの粒子を生成するが、より高い比率はより固体状の構造を生成する。より短いPLA又はPLGA鎖長(x≦30)はミセル形成過程を経てナノ粒子形成をもたらしうる一方、より長い鎖長では、集塊-沈殿過程が起こる、Avgoustakis K(Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)。
PLA/PEG及びPLGA/PEGの変動は、製造されるナノ粒子の構造を操作することを可能にする。 例えば、低比率はより動的なタイプの粒子を生成するが、より高い比率はより固体状の構造を生成する。より短いPLA又はPLGA鎖長(x≦30)はミセル形成過程を経てナノ粒子形成をもたらしうる一方、より長い鎖長では、集塊-沈殿過程が起こる、Avgoustakis K(Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)。
本発明の更なる実施態様では、ナノ粒子は、ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子である。ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子は、Fattal E.等(J. Contr. Release 1998; 53:137-143)によって記載されているように、乳化重合法を用いて調製することができる。ついで、ナノ粒子は、カチオン性疎水性試薬、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)で被覆され、ISS-NAがナノ粒子に吸着される。代替法では、Zobel等(Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997;7:483-493)に記載されているように、ナノ粒子が水性分散液重合法で製造される。使用される界面活性剤はDEAE-デキストランであり、これは静電的相互作用を介してナノ粒子の表面上にISS-NAを続いて吸着させる。約170−1000nmの範囲のサイズの粒子はZobel等によって得られている。
更なる実施態様では、ナノ粒子は、Li Y.等(Int J Pharm. 2003;259:93-101)に記載されているように、PEGコートポリシアノアクリレートナノ粒子であり、そこでは、ナノ粒子へのトランスフェリンの更なる共有結合が省略される。ナノ粒子は、ポリ(アミノポリ(エチレングリコール)-シアノアクリレート・ヘキサデシルシアノアクリレート共重合体)(ポリ(H2NPEGCA・HDCA共重合体)をポリマーとして使用して、水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法によって調製される。簡単に述べると、バッファー(例えばNaHCO3、pH8)に希釈したISS-NAを、超音波処理によってポリ(H2NPEGCA・HDCA共重合体を含むジクロロメタン/酢酸エチル(1:1)中で乳化させる。得られたエマルジョンを、1%w/vのPVA水溶液中に注ぎ、更に乳化する。PVAの割合は変動し得、特により高い割合(0.1MのNaHCO3中3%、pH8)はdsDNAに対する損傷を制限することが示されている(Li Y.等 (Int J Pharm. 2003;259:93-101)。ついで、得られた二重エマルジョンを、磁気撹拌下で0.3%のw/vPVA水溶液に希釈する。ついで、有機溶媒を37℃にてロータリーエバポレーターで減圧下で蒸発によって除去し、ナノ粒子を39000gでの遠心分離によって収集する。Li等によって得られた粒子サイズは約130から150nmの範囲であった。一実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。
エマルジョン-溶媒蒸発法又はスプレードライ法によって製造されるISS-NA、特に非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのパッケージ化は、ポリエステルナノ粒子の対して次に例示される。しかしながら、同様の手順がPACA及びPEG-PACAナノ粒子のために応用されうることは当業者には明らかである。PLA、PLGA、PECL、PEG-PLA、PEG-PLGA又はPEG-PECLナノ粒子のようなポリエステルナノ粒子内へのISS-NA、例えば非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのパッケージ化は幾つかの方法で実施することができる。一方法では、Aukunuru J.V.等(J. Pharm. Pharmacol. 2003; 55:1199-206)によって報告されているように、ISS-NAが水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法の初期の水相に加えられる。別の方法では、ISS-NAは超音波処理によって有機溶媒、例えばジクロロメタンに懸濁させられ、ついで噴霧乾燥されて、ISS-NAをパッケージ化したナノ粒子を生じる。ある実施態様では、ISS-NAをパッケージするナノ粒子の容量、特にODNは、錯化剤、例えばリジンリッチなオリゴペプチド(Emile C.等 Drug Deliv 1996; 3:187-195)、PLL、PEI、スペルミン又は酢酸亜鉛のような塩(Putney SD等 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999;9:451-8)を添加することによって増加させられる。ナノ粒子に導入することができる水溶液中において錯化剤及びISS-NAを混合することにより不溶性の複合体が得られる。理解されるように、ISS-NAに対する錯化剤の最適比、及び錯化剤がPEI又はPLLである場合のISS-NAに対するPLLの最適長、及び錯化剤がPEIである場合の分岐又は直鎖PEIの何れが選択されるかは、経験的に決定されなければならない。例えば、Emile C.等(Drug Deliv 1996; 3:187-195)に報告されているように、アセトン中のポリマー、錯化剤、例えばリジンリッチなペプチド、及びODNのようなISS-NAの溶液が水溶液に滴下して注がれる。ISS-NAと錯化剤の錯体がポリマーと共に沈殿して、ISS-NAがパッケージされたナノ粒子を形成する。一実施態様では、ISS-NAと錯化剤の錯体が有機溶媒、例えば塩化メチレンに懸濁され、スプレードライ法を使用してPLGAナノ粒子に導入されパッケージされる(Putney SD等 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999;9:451-8;Pamujula S等 J Pharm Phamracol 2004; 56:1119-25)。
更なる実施態様では、上記ナノ粒子はブロックコポリマー被覆リン酸カルシウムナノ粒子である(CaP-PEG-PAA;Kakizawa等(2004) J. Contr. Release 97:345-56)。これらはISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドをパッケージするのに適したコア-シェル粒子である。それらは、PEGの親水性係留層によって囲まれたCaPのナノ結晶のコアを含んでなる。ISS-NA及びPEG-ブロック-ポリ(アスパラギン酸)(PEG-PAA)の存在下でカルシウム及びリン酸塩含有溶液を混合すると、ISS-NAを組み込んでいるナノ粒子が自然に形成される。一実施態様では、ISS-NAは、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。PEG-PAAのPAAセグメントはCaPに対して高い結合親和性を有しており、非イオン性及び疎水性PEGは立体的安定化機能を有している。Kakizawa等 (2004) J. Contr. Release 97:345-56の図1に見られるように、粒子サイズは、PEG-PAA及びリン酸塩濃度を変化させることによって調節できる。得られる典型的なサイズは約100から約300nmの間である。臨界的に最小量のPEG-PAAがナノ粒子の凝集を防止するために必要とされる一方、より高いレベルになれば、CaP結合についてISS-NAと競合し始め、Kakizawa等によって教示されているようにして経験的に決定されなければならない。例えば1.5mMから3mMへのリン酸塩濃度の増加は、より高いODN結合能を生じる(Kakizawa等(2004) J. Contr. Release 97:345-56)。
PEG-PAAとナノ粒子の調製は詳細に記載されている(Kakizawa等 (2004) J. Contr. Release 97:345-56)。本質的には、CaCl2、トリス、低EDTA量及びISS-NAを含む溶液が、Hepes、リン酸水素二ナトリウム及びPEG-PAAを含む等容量の溶液に速やかに添加される。得られた混合物をボルテックスミキサーによって激しく撹拌し、37℃で24時間インキュベートする。Kakizawa等は、細胞質にsiRNAを送達させるためにCa-P-PEG-PAAナノ粒子を使用することを考察しており、そこでは、それらは、低Ca2+濃度と高いリン酸塩濃度のために細胞質においてCaPコアが速やかに溶解することが予想される。ナノ粒子にパッケージされる本発明のISS-NAは細胞質への送達を必要としていない。例えば、他のODNカチオン相互作用については、ODN放出はエンドソームのような低pHコンパートメントで起こり得る。
他の実施態様では、上記ナノ粒子は、アルギネート-PLLナノ粒子である。アルギン酸ナトリウムはその構成成分としてマンヌロン酸及びグルロン酸を有する天然の多糖類である。Aynie等(Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999;9:301-12)は、ODNが結合したPLLが架橋したアルギネートナノ粒子を記載している。該粒子の調製は二工程プロセスであり、最初のアルギネートプレゲルが磁気撹拌下で塩化カルシウムを添加することによって製造され、第二のPLLが添加されて、プレゲルの残りの自由電荷を持つ高分子電解質を形成する。ISS-NAはPLLと同時にプレゲルに添加されるか、ナノ粒子形成後に添加される。好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は分子量3900及び7900のポリリジンポリマーを含むかあるいは本質的にそれらからなり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。Aynie等は200−600nmの粒子サイズとおよそ10%のODN充填を報告している。しかしながら、アルギネートナノ粒子の充填容量はAynie等によって記載されている条件下では飽和に達しない一方、カプセル化効率は100%である。よって、アルギネート-PLLナノ粒子は高いODN充填容量を有しており、ODN又はISS-NAをパッケージするために本発明の実施態様において使用される。
更に好ましい実施態様では、ナノ粒子はキトサンナノ粒子である。キトサンは、キチンから脱アセチル化によって調製される正荷電多糖類ポリマーである。キトサンナノ粒子の調製は例えばRoy K.等(Nat Med. 1999;5:387-91)又はMao HQ等(J Control Release. 2001;70:399-421)によって記載されており、150−300nmサイズのナノ粒子が得られている。これらの著者はコアセルベーション法を使用しており、酢酸ナトリウム中のキトサン溶液を、55℃でボルテックスしながら硫酸ナトリウム中のISS-NA溶液に混合している。温度、pH、キトサン、硫酸ナトリウムの濃度、キトサン及びDNAの分子量を変えて最適なナノ粒子を得ることができる。ある実施態様では、キトサンナノ粒子はPEGのN-ヒドロキシ-スクシンイミド誘導体と更に反応させられる(Leong KW.等 J Control Release. 1998;53:183-193)。他の実施態様では、キトサンナノ粒子は、更にホモ二官能性架橋剤DSS(ビス-N-ヒドロキシ-スクシンイミド化合物)と同時に反応させられる(Leong KW.等 J Control Release. 1998;53:183-193)。一実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はカチオン化ゼラチンナノ粒子であり、好ましくは、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、好ましくはG10(配列番号27)である。カチオン化ゼラチンナノ粒子の調製は、Zwiorek K.等(J Pharm Pharmaceut Sci 2004; 7:22-28)又はZillies J及びCoester C (J Pharm Pharmaceut Sci 2004; 7:17-21)によって記載されており、180−280nmのサイズのナノ粒子が報告されている。二工程の脱溶媒和法が使用されてナノ粒子が生成され、pH4.5でのバッファーへの再懸濁後にEDCの存在下でコールアミンで更に誘導体化される。ついで、ISS-NAは、ナノ粒子をISS-NAの溶液に再懸濁させ、得られた混合物を更にインキュベートすることによってナノ粒子にパッケージされる。Zwiorek等は180−290nmの範囲のサイズの粒子を得た。ゼラチンナノ粒子を調製する際の更なるガイドはAzarmi S.等(J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2006; 9:124-132)によって与えられ、ナノ粒子の架橋に対してEDCの代わりにグルタールアルデヒドが使用されている。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はゼラチンナノ粒子であり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。ゼラチンナノ粒子は、低pHでNa2SO4でのコアセルベーション法によって、Truong-Le VL等 Hum Gene Ther.1998; 9:1709-1717によって記載されているようにして調製され、その粒子はEDCで架橋されるが反応混合物中のトランスフェリンを省く。サイズ300−600nmの粒子がTruong-Le等によって得られた。好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はゼラチン-コールアミンナノ粒子である。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はゼラチンナノ粒子であり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。ゼラチンナノ粒子は、低pHでNa2SO4でのコアセルベーション法によって、Truong-Le VL等 Hum Gene Ther.1998; 9:1709-1717によって記載されているようにして調製され、その粒子はEDCで架橋されるが反応混合物中のトランスフェリンを省く。サイズ300−600nmの粒子がTruong-Le等によって得られた。好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はゼラチン-コールアミンナノ粒子である。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はアルブミンナノ粒子であり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。アルブミンナノ粒子の調製は、例えばIrache JM等(Mini Rev Med Chem. 2005; 5:293-305)によって記載されており、250−300nmのサイズのナノ粒子が報告されている。非常に好ましい実施態様では、アルブミンナノ粒子はヒト血清アルブミンから作製される。アルブミンナノ粒子は、コアセルベーション法又は脱溶媒和法によって調製され、続いてグルタルアルデヒドでの架橋によって安定化される。一方法では、ISS-NAはアルブミン水溶液(2%w/v)と共にインキュベートされ、混合物はエタノールで脱溶媒和され、これがナノ粒子の形成を誘導する。ついで、これらはグルタルアルデヒドで架橋される。Wartlick等(J Control Release. 2004;96:483-495)によって記載されているように、ナノ粒子の安定性は、架橋工程中にグルタルアルデヒドの濃度を調節することによって最適化できる。更なる一実施態様では、アルブミンナノ粒子はプロタミン-アルブミン-ISS-NAナノ粒子である(Vogel V.等 J control release. 2005; 103: 99-11)。
更なる一実施態様では、アルブミンナノ粒子はプロタミン-アルブミン-ISS-NAナノ粒子である(Weyermann等 J control release. 2004; 100: 411-423;Vogel V.等 J control release. 2005; 103: 99-11;Mayer G.等 J control release 2005; 106:181-187)。本発明の実施に有用なナノ粒子はまたKumar MNVR (J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2000; 3:234-258)によって記載されたナノ粒子を含む。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はメタクリレート系ハイドロゲルナノ粒子である。このようなナノ粒子の調製並びにISS-NAの吸着は、Jain S.等(Biomacromolecules. 2005;6:2590-600)によって記載され、約500nmのサイズの粒子が得られている。これらのナノ粒子は、Jain S.等によって記載されたようにして、二相微小エマルジョン(miniemulsion)重合プロセスによって調製され、但し卵白アルブミンはプロセスに含まれていない。PEG-メタクリレート、メタクリル酸及びPEG-ジメタクリレートが撹拌下でプルロニック塩溶液に添加される。得られた溶液を40℃に加熱し、相分離及び乳化を生じさせ、重合が過硫酸アンモニウム及びメタ重亜硫酸ナトリウムの添加により開始される。ナノ粒子は遠心分離により単離され、ポリ(L-アルギニン)と続いてISS-NAが疎水性ナノ粒子上に吸着される。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はメタクリレート系ハイドロゲルナノ粒子である。このようなナノ粒子の調製並びにISS-NAの吸着は、Jain S.等(Biomacromolecules. 2005;6:2590-600)によって記載され、約500nmのサイズの粒子が得られている。これらのナノ粒子は、Jain S.等によって記載されたようにして、二相微小エマルジョン(miniemulsion)重合プロセスによって調製され、但し卵白アルブミンはプロセスに含まれていない。PEG-メタクリレート、メタクリル酸及びPEG-ジメタクリレートが撹拌下でプルロニック塩溶液に添加される。得られた溶液を40℃に加熱し、相分離及び乳化を生じさせ、重合が過硫酸アンモニウム及びメタ重亜硫酸ナトリウムの添加により開始される。ナノ粒子は遠心分離により単離され、ポリ(L-アルギニン)と続いてISS-NAが疎水性ナノ粒子上に吸着される。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はメチルメタクリレート系カチオン性ナノ粒子である。かかるナノ粒子の調製は、Tondelli L.等(J Biomater Sci Polymer Edn 2003; 14:1209-1227)によって記載されており、500−1000nmのナノ粒子が得られている。メチルメタクリレートは、PEG誘導体化メチルメタクリレート及び第四級アンモニウムイオンを含むメタクリルメタクリレート誘導体と、過硫酸カリウムで開始される乳化重合反応において混合される。ついで、ISS-NAがカチオン性ナノ粒子と共にインキュベートされる。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はPLL変性シリカナノ粒子である。ナノ粒子の調製は、Zhu SG.等(Biotechnol Appl Biochem 2004; 39:179-187)によって記載され、20nmのサイズのナノ粒子が得られている。ナノ粒子は、油中水マイクロエマルジョンを使用して調製され、テトラエトキシシランの加水分解及び縮合反応が水酸化アンモニウムで開始される。シリカナノ粒子が、PLLの添加前に炭酸塩バッファー中で活性化され、ISS-NAは洗浄されたPLL-シリカナノ粒子と共に更にインキュベートされる。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はPLL変性シリカナノ粒子である。ナノ粒子の調製は、Zhu SG.等(Biotechnol Appl Biochem 2004; 39:179-187)によって記載され、20nmのサイズのナノ粒子が得られている。ナノ粒子は、油中水マイクロエマルジョンを使用して調製され、テトラエトキシシランの加水分解及び縮合反応が水酸化アンモニウムで開始される。シリカナノ粒子が、PLLの添加前に炭酸塩バッファー中で活性化され、ISS-NAは洗浄されたPLL-シリカナノ粒子と共に更にインキュベートされる。
本発明の実施に適したナノ粒子は、実施例11に記載されるように、骨髄由来樹状細胞(BMDC)の活性化について試験することができる。あるいは、インターロイキン12(IL-12)の分泌に加えて、このアッセイ中のナノ粒子の活性を、上清中のインターロイキン6(IL-6)又はIFN-αを検出するか、又は蛍光標示式細胞分取によってナノ粒子のインキュベーション時のBMDC上のCD-86のアップレギュレーションを定量することによって、同定されうる。重要なことは、これらのアッセイが、凍結させることができる同一バッチのBMDCを使用する場合、再現可能であることである。従って、活性剤の比較は、同じバッチのBMDCで実施されるべきである。
好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子は、G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたQβと同様な形で実施例11に記載された細胞アッセイにおいてBMDCの活性化を誘導し、Qβ-VLP又は20−500nmサイズのポリスチレンビードと同様の動態でマウス足蹠中への皮下注射時にリンパ節に達する(実施例7及び9参照)。G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたQβと同様な形でのBMDCの活性化とは、ナノ粒子中のG10オリゴヌクレオチドパッケージの同一用量が、QβにパッケージされたG10オリゴヌクレオチドの同じ用量によって誘導される量の80%、好ましくは60%、より好ましくは50%、40%、30%内でIL-12分泌の最大半量をもたらすことを表すことを意味する。更に好ましい実施態様では、ナノ粒子は実施例に記載されたアレルギーの動物モデルにおいて保護性である。
好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子は、G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたQβと同様な形で実施例11に記載された細胞アッセイにおいてBMDCの活性化を誘導し、Qβ-VLP又は20−500nmサイズのポリスチレンビードと同様の動態でマウス足蹠中への皮下注射時にリンパ節に達する(実施例7及び9参照)。G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたQβと同様な形でのBMDCの活性化とは、ナノ粒子中のG10オリゴヌクレオチドパッケージの同一用量が、QβにパッケージされたG10オリゴヌクレオチドの同じ用量によって誘導される量の80%、好ましくは60%、より好ましくは50%、40%、30%内でIL-12分泌の最大半量をもたらすことを表すことを意味する。更に好ましい実施態様では、ナノ粒子は実施例に記載されたアレルギーの動物モデルにおいて保護性である。
好ましい実施態様では、本発明のナノ粒子には、該粒子の0.5から80%(w/w)、好ましくは0.5から40%(w/w)、より好ましくは2から40%(w/w)、更により好ましくは6から40%(w/w)、尚更により好ましくは10から40%(w/w)、更により好ましくは15から40%(w/w)、最も好ましくは18から30%(w/w)の量に達するISS−NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、最も好ましくはQβG10が、パッケージされる。
ナノ粒子の調製方法は、Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びH. Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996に概説されている。そこに記載されている微小粒子には、ポリエステル微小粒子、ペグ化ポリエステル微小粒子、ポリホスファゼン微小粒子、リポスフィア及びゼラチン微小粒子が含まれる。更なる微小粒子には、アルギネート微小粒子(Aggarwal N.等 Can J Vet Res. 1999;63:148-52)、(キトサン微小粒子(Aral C及びAkbuga J. J Pharm Pharm Sci. 2003;6:321-6;Xu W.等 Vaccine. 2004; 22:3603-12)が含まれる。当該分野でよく知られているように、得られた粒子サイズがナノ粒子の調製に使用されるエマルジョン内の液滴のサイズによって決まるナノ粒子の調製に使用される方法は、微小粒子の調製に容易に適合化させることができ、そこでは、混合、ボルテックス化、高速ホモジナイゼーション工程が、微小粒子が生産されるように変更される。またスプレードライ法が、微小粒子が作製されるように適合化されうる。本発明の実施に有用な微小粒子は、Kumar MNVR (J Pharm Pharmaceut Sci 2000; 3:234-258)に記載された微小粒子をまた含む。
ナノ粒子の調製方法は、Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びH. Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996に概説されている。そこに記載されている微小粒子には、ポリエステル微小粒子、ペグ化ポリエステル微小粒子、ポリホスファゼン微小粒子、リポスフィア及びゼラチン微小粒子が含まれる。更なる微小粒子には、アルギネート微小粒子(Aggarwal N.等 Can J Vet Res. 1999;63:148-52)、(キトサン微小粒子(Aral C及びAkbuga J. J Pharm Pharm Sci. 2003;6:321-6;Xu W.等 Vaccine. 2004; 22:3603-12)が含まれる。当該分野でよく知られているように、得られた粒子サイズがナノ粒子の調製に使用されるエマルジョン内の液滴のサイズによって決まるナノ粒子の調製に使用される方法は、微小粒子の調製に容易に適合化させることができ、そこでは、混合、ボルテックス化、高速ホモジナイゼーション工程が、微小粒子が生産されるように変更される。またスプレードライ法が、微小粒子が作製されるように適合化されうる。本発明の実施に有用な微小粒子は、Kumar MNVR (J Pharm Pharmaceut Sci 2000; 3:234-258)に記載された微小粒子をまた含む。
上述のナノ粒子へのISS-NAのパッケージ化の方法は、微小粒子にISS-NAをパッケージするために適合化され得、製造されたエマルジョンが微小粒子の生成を生じるように、ホモジナイゼーション又は混合工程が、当業者に知られているように変更される。スプレードライ法もまた、微小粒子が作製されるように適合化されうる。
ポリエステルミクロスフィア、特にPLGAミクロスフィアの性質、並びにそれらを製造する方法は、例えばKisselT及びKonebergR(Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びH. Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p.51-87)によって概説され記載されている。これらの方法には、スプレードライ法、水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法及び相分離法が含まれる。PLGAを構成するモノマーの好ましいモル比は50モル%LA及び50モル%GAである。モノマーの何れかの割合を増加させると、ポリマーの分解が遅くなる。例えば、85:15のLA:GAの比率を有するポリマーは、50:50の比率のものよりおよそ2.5倍遅い分解速度を有する。よって、PLGAポリマーの性質はモノマーの割合を変えることによって操作することができる。
ポリエステルミクロスフィア、特にPLGAミクロスフィアの性質、並びにそれらを製造する方法は、例えばKisselT及びKonebergR(Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びH. Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p.51-87)によって概説され記載されている。これらの方法には、スプレードライ法、水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法及び相分離法が含まれる。PLGAを構成するモノマーの好ましいモル比は50モル%LA及び50モル%GAである。モノマーの何れかの割合を増加させると、ポリマーの分解が遅くなる。例えば、85:15のLA:GAの比率を有するポリマーは、50:50の比率のものよりおよそ2.5倍遅い分解速度を有する。よって、PLGAポリマーの性質はモノマーの割合を変えることによって操作することができる。
一実施態様では、上記合成粒子はリポソームであり、上記リポソームは脂質二重層からなる脂質小胞体である。リポソームには、当該分野で知られている方法を使用してISS-NAがパッケージされ得る。本発明のリポソームは、中性リポソーム、アニオン性リポソーム、カチオン性リポソーム、ステルス(stealth)、又はカチオン性ステルスからなる群から選択されうる。好ましい実施態様では、リポソームはカチオン性リポソームである。リポソームは、100から800nm、好ましくは100から400nm、より好ましくは100から300nm、更により好ましくは100から200nm、最も好ましくは200nmの直径を有しうる。
好ましい実施態様では、リポソームは、標的細胞とのリポソームの相互作用を容易にするために正電荷を示す。ある実施態様では、リポソームは、カチオン性脂質、コリピド(colipid)、及び安定化添加剤を含む。他の実施態様では、リポソームは、ジメチルアミノエタン-カルバモール-コリステロール、及び/又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及び/又はポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンを含む。好ましい実施態様では、リポソームはホスファチジルコリン、及び/又はコレステロール、及び/又はDL-α-トコフェロール、好ましくはホスファチジルコリン、コレステロール、及びDL-α-トコフェロールを含む。このようなリポソームの作製は、例えばBangham等, (1965), J.Mol.Biol., 13, 238-252;Gursel等 (2001), J Immunol 167: 3324;又はLudewig等, (2000), Vaccine, 19, 23-32によく確立されており、その開示は出典明示によりその全体をここに援用する。
好ましい実施態様では、リポソームは、標的細胞とのリポソームの相互作用を容易にするために正電荷を示す。ある実施態様では、リポソームは、カチオン性脂質、コリピド(colipid)、及び安定化添加剤を含む。他の実施態様では、リポソームは、ジメチルアミノエタン-カルバモール-コリステロール、及び/又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及び/又はポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンを含む。好ましい実施態様では、リポソームはホスファチジルコリン、及び/又はコレステロール、及び/又はDL-α-トコフェロール、好ましくはホスファチジルコリン、コレステロール、及びDL-α-トコフェロールを含む。このようなリポソームの作製は、例えばBangham等, (1965), J.Mol.Biol., 13, 238-252;Gursel等 (2001), J Immunol 167: 3324;又はLudewig等, (2000), Vaccine, 19, 23-32によく確立されており、その開示は出典明示によりその全体をここに援用する。
好ましいリポソーム及びリポソーム中へのISS-NAのパッケージ化は、出典明示によりここに援用する国際公開第2005/014110号に記載されている。ISS-NAは、カチオン性脂質を含むか、又は好ましくはそれから本質的になるか、又は最も好ましくはそれからなる前もって形成された小胞体と混合され、カチオン性脂質と直接混合されて、リポプレックスを生じ、あるいは好ましい実施態様では、脂質二重層に封入された水性空間内にカプセル化される。更なる実施態様では、上記リポソームはリポポリプレックスである(Pelisek J.等 J Gene Med 2006; 8:186-197)。一実施態様では、リポソームは、Cohen S.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88:10440-10444によって記載されているように、アルギネート-PLLコート中の、マイクロカプセル化リポソームである。好ましい実施態様では、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、Semple S.C.等 Methods Enzymol. 2000;313:322-41によって記載されているように、好ましくはPEG-セラミド-C14を含む「安定化されたアンチセンス脂質粒子」内にパッケージされる。本発明の実施のための該方法の遂行において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはISS-NAに置き換えられ、特に非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドに置き換えられる。これらのリポソームは、生理学的pH以下でのみ荷電しているカチオン性脂質で調製される。よって、低pHでのリポソームの調製中にリポソームの外表面に結合したISS-NA又は非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、調製物が中性pHに戻された場合に、続いて解離され、アニオン交換クロマトグラフィーによって除去され得る。適切な更なるリポソーム、調製方法、並びにISS-NA、特にオリゴヌクレオチドのための方法は、Semple S.C.等 Methods Enzymol. 2000;313:322-41及びそこの文献に見出すことができる。リポソームの調製方法には、乾燥脂質水和法、逆相水和法、洗浄剤透析法、最小体積封入法が含まれる。ある実施態様では、ISS-NA、特に非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのパッケージ化は、C6−C30アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デスオキシコール酸塩、コレステロール、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、イソプレノイド、ステロイド、ビタミン、ビタミンE、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、トリグリセリドからなる群から選択される残基によって置換されたISS-NA又は非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを使用することによって、容易になる。
本発明の一側面では、リポソーム中のISS-NAはIFN-αの増大したレベルを前進的に誘導するために使用される。IFN-αのそのような増加したレベルは過敏症、好ましくはアレルギーにおいて治療的に活性があることが知られている。
更なる実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、好ましくは上記ビロソームはインフルエンザウイルスの再構成されたウイルス外被であり、更に好ましくは上記インフルエンザウイルスはインフルエンザAウイルスであり、また更に好ましくは上記インフルエンザAウイルスはインフルエンザA型/シンガポールウイルスである。カチオン性(正に荷電)脂質を含むビロソームが特に核酸を標的細胞に送達するのに適している。更なる実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、該ビロソームは脂質膜を含み、上記脂質膜はカチオン性脂質を含むか、好ましくはそれから本質的になる。非常に好ましい実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)であり、更に好ましくは、上記ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜はカチオン性脂質を含むか、好ましくはそれから本質的になる。更に好ましい実施態様では、上記ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜は抗体又はその断片を含み、好ましくは該抗体は標的細胞のレセプターと特異的に相互作用する。
本発明の合成粒子、好ましくは微小粒子及びナノ粒子、最も好ましくはナノ粒子は、皮下的、静脈内、皮内、腹腔内に注射され、鼻腔内、経口、経皮的、又は吸入投与されうる。
更なる実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、好ましくは上記ビロソームはインフルエンザウイルスの再構成されたウイルス外被であり、更に好ましくは上記インフルエンザウイルスはインフルエンザAウイルスであり、また更に好ましくは上記インフルエンザAウイルスはインフルエンザA型/シンガポールウイルスである。カチオン性(正に荷電)脂質を含むビロソームが特に核酸を標的細胞に送達するのに適している。更なる実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、該ビロソームは脂質膜を含み、上記脂質膜はカチオン性脂質を含むか、好ましくはそれから本質的になる。非常に好ましい実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)であり、更に好ましくは、上記ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜はカチオン性脂質を含むか、好ましくはそれから本質的になる。更に好ましい実施態様では、上記ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜は抗体又はその断片を含み、好ましくは該抗体は標的細胞のレセプターと特異的に相互作用する。
本発明の合成粒子、好ましくは微小粒子及びナノ粒子、最も好ましくはナノ粒子は、皮下的、静脈内、皮内、腹腔内に注射され、鼻腔内、経口、経皮的、又は吸入投与されうる。
非常に好ましい実施態様では、上記粒子はウイルス粒子又はウイルス様粒子(VLP)、好ましくはVLPである。当該分野で知られている任意のウイルスが本発明のVLP又はウイルス粒子として選択されうる。殆どの通常知られているウイルスの配列が決定されており、公的に直ぐに利用できる。ウイルスの分類学は当業者によく知られており、例えばH.V. Van Regenmortel等編, Virus Taxonomy: 7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/elsevier, Burlington Mass, USA)、レスター大学(英国)のウイルス分類学のウェブページ (http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups.html)及びTaxonomyBrowser of the National Center for BiotechnologyInformation (NCBI, Washington D.C., USA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/)によってまとめられている。ウイルスコートタンパク質をコードしている遺伝子は当業者によって同定され得、そのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から取得することができる。本発明において特に有用なウイルスは、"Artificial DNA - Methods and Applications", Yury Khudyakov及びHoward Fields編, CCR Press, 2003に一般に開示されている。
ウイルス粒子又はVLPはウイルス感染細胞培養物から産生され精製されうる。本発明の目的に対して、上記ウイルス粒子又はVLPは好ましくは非複製的又は非感染性、より好ましくは非複製的かつ非感染性である。紫外線照射、化学的処理、例えばホルムアルデヒド、β-プロピオン又はクロロホルムでの処理がウイルスを非活性化するために当業者に知られている一般的な方法である。あるいは、上記非複製的及び非感染性ウイルス粒子又は上記非複製的及び非感染性VLPは上記ウイルスのコアタンパク質の精製及び再構築によって産生することができる。
一実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLP、好ましくはVLPは、ウイルスのウイルス粒子又はVLP、好ましくはVLPであり、上記ウイルスは、DNA逆転写ウイルスを含むDNAウイルス又はRNAウイルスでありうる。好ましい実施態様では、上記ウイルスはDNAウイルスであり、該DNAウイルスは一本鎖DNAウイルスであり、該一本鎖DNAウイルスは、好ましくは、(a)パルボウイルス、好ましくはパルボウイルスB19、ブタパルボウイルス(PPV)又はイヌパルボウイルス(CPV)、(b)エリスロウイルス、(c)ディペンドウイルス、(d)ネコ汎血球減少症ウイルス(FPV)とCPVの組換え体(Saliki. T.J.等 (1992) J. Gen. Virol 73:369ff)、(e)アデノ随伴ウイルス2型(AAV-2)、(f)ミンク腸炎パルボウイルス(MEV)、(g)タイワンアヒルパルボウイルス(DPV)、(h)マウス微小ウイルス(MVM)、(i) アリューシャンミンク病パルボウイルス(ADV)、及び(j)ハチノスツヅリガデンソウイルス(GMDNV)からなる群から選択される。
一実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLP、好ましくはVLPは、ウイルスのウイルス粒子又はVLP、好ましくはVLPであり、上記ウイルスは、DNA逆転写ウイルスを含むDNAウイルス又はRNAウイルスでありうる。好ましい実施態様では、上記ウイルスはDNAウイルスであり、該DNAウイルスは一本鎖DNAウイルスであり、該一本鎖DNAウイルスは、好ましくは、(a)パルボウイルス、好ましくはパルボウイルスB19、ブタパルボウイルス(PPV)又はイヌパルボウイルス(CPV)、(b)エリスロウイルス、(c)ディペンドウイルス、(d)ネコ汎血球減少症ウイルス(FPV)とCPVの組換え体(Saliki. T.J.等 (1992) J. Gen. Virol 73:369ff)、(e)アデノ随伴ウイルス2型(AAV-2)、(f)ミンク腸炎パルボウイルス(MEV)、(g)タイワンアヒルパルボウイルス(DPV)、(h)マウス微小ウイルス(MVM)、(i) アリューシャンミンク病パルボウイルス(ADV)、及び(j)ハチノスツヅリガデンソウイルス(GMDNV)からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記DNAウイルスは、二本鎖DNA逆転写ウイルスを含む二本鎖DNAウイルスであり、該二本鎖DNAウイルスは、好ましくは、(a)核多核体病ウイルス、好ましくはAutograpa californica核多核体病ウイルス(AcMNPV)又はAcMNPVポリへドリンとイラクサギンウワバ顆粒病ウイルス(TnGV)のキメラ(Eason J.E.等 (1998), J Virol 72:6237ff)、(b)パピローマウイルス、好ましくは(i)ヒトパピローマウイルス(HPV、最も好ましくはHPV6、HPV11、HPV16、HPV18、又はHPV33)、(ii)ウシパピローマウイルス(BPV、好ましくはBPV1)、及び(iii)ワタウサギパピローマウイルス(CRPV)から選択されるもの、(c)ポリオーマウイルス、好ましくは(i)マウスポリオーマウイルス(好ましくはPy又はSV40)、(ii)セキセイインコヒナウイルス、(iii)ヒトポリオーマウイルスJC、(iv)ハムスターポリオーマウイルス(HaPV)、(v)サルB-リンパ球向性パポウイルス(papovirus)(LPV)、(vi)トリポリオーマウイルス(APV)及び(vii)組換えヒト及び非ヒトポリオーマウイルス(Sasnauskas K.等 (1999) Biol. Chem. 380, 381)から選択されるもの、(d)脾臓壊死性ウイルス(SNV, Jiang A. (1999) Hum. Gene Therapy 10(16): 2627-2636)、非常に好ましくは、(e)B型肝炎ウイルスからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルスはRNAウイルスであり、該RNAウイルスは一本鎖RNAウイルス又は二本鎖RNAウイルスでありうる。更なる実施態様では、上記RNAウイルスは一本鎖RNAウイルスであり、好ましくは該一本鎖RNAウイルスは一本鎖ポジティブセンスRNAウイルスであり、ここで好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスRNAウイルスは、(a)ブロモウイルス科、好ましくは(i)アルファモウイルス(例えばアルファルファ・モザイクウィルス(AlMV))、及び(ii)イラルウイルス(例えばプルヌス壊死性輪斑イラルウイルス(PNRSV、Pallas V. (1998) Arch. Virol. 144:797-803));プルン・ドワーフウィルス(PDV(Abou-Jawdah Y.等 (2004) J. Virological Methods 121:31-38)))、(iii)ブロモウイルス(例えばササゲクロロティックモットルウィルス(CCMV)又はブロム・モザイクウィルス(BMV))、(iv)ククモウイルス(例えばキュウリモザイクウイルス(Natilla A.等 Arch Virol 2004 149(1): 137-154))から選択されるもの、(b) トンブスウイルス科、好ましくは(i)トンブスウイルス、好ましくはトマトブッシースタントウィルス(TBSV(Joelson T.等 (1997) J. Gen. Virol. 78:1213-1217))、(ii)カーモウイルス、turnic crinkleウイルス(TCV(Qu F.及びMorris T.J. (1997) J. Virol. 71(2): 1428-1435))、(c) ポティウイルス、好ましくはジョンソングラスモザイク病ウイルス(JGMV)、及び、プラム痘瘡ポティウイルス(PPV(Fernandez-Fernandes M.R.等 (2002) J. Virol. 76(24): 12646-12653)、(d)タバコモザイクウィルス(タバコモザイクウィルス)、(e)コモウイルス、好ましくはササゲモザイクウイルス(CPMV)、(f)ジャガイモウイルスX(PVX(Marusic C.等 2001) J. Virol. 75(18): 8434-8439, (g) カルシウイルス、好ましくは(i)ノーウォークウイルス(NV), (ii)ノーウォーク様カルシウイルス、(iii)ヒトカルシウイルス、(iv) Lorsdaleカルシウイルス、(v) ウサギ出血病ウイルス(RHDV)、(vi) European brown hare syndromウイルス(EBHSV), (vii)トロントウイルス、(viii)ハワイウイルス、(ix)サッポロ様ウイルス、及び(x) Grimsbyネコカルシウイルスから選択されるもの、(h) RNAバクテリオファージ、(i) ルテオウイルス、好ましくはpotato leaf rollウイルス(PLRV), (j) flock houseウイルス、(k) retroidウイルス、好ましくは(i)腫瘍レトロウイルス、(ii) レンチウイルス、及び(iii) 酵母レトロトランスポゾンTy1、(l) ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV, Leibl H. (1998) Vaccine 16(4): 340-345)及び(m) トガウイルス、好ましくはアルファウイルス、最も好ましくはシンドビスウイルスから選択される。
更なる実施態様では、上記RNAウイルスは、(a)ブロモウイルス科、好ましくは(i)アルファモウイルス(例えばアルファルファ・モザイクウィルス(AlMV))、及び(ii)イラルウイルス(例えばプルヌス壊死性輪斑イラルウイルス(PNRSV、Pallas V. (1998) Arch. Virol. 144:797-803));プルン・ドワーフウィルス(PDV(Abou-Jawdah Y.等 (2004) J. Virological Methods 121:31-38)))、(iii)ブロモウイルス(例えばササゲクロロティックモットルウィルス(CCMV)又はブロム・モザイクウィルス(BMV))、(iv)ククモウイルス(例えばキュウリモザイクウイルス(Natilla A.等 Arch Virol 2004 149(1): 137-154))から選択されるもの、(b) トンブスウイルス科、好ましくは(i)トンブスウイルス、好ましくはトマトブッシースタントウィルス(TBSV(Joelson T.等 (1997) J. Gen. Virol. 78:1213-1217))、(ii)カーモウイルス、turnic crinkleウイルス(TCV(Qu F.及びMorris T.J. (1997) J. Virol. 71(2): 1428-1435))、(c) ポティウイルス、好ましくはジョンソングラスモザイク病ウイルス(JGMV)、及び、プラム痘瘡ポティウイルス(PPV(Fernandez-Fernandes M.R.等 (2002) J. Virol. 76(24): 12646-12653)、(d)タバコモザイクウィルス(タバコモザイクウィルス)、(e)コモウイルス、好ましくはササゲモザイクウイルス(CPMV)、(f)ジャガイモウイルスX(PVX(Marusic C.等 2001) J. Virol. 75(18): 8434-8439, (g) カルシウイルス、好ましくは(i)ノーウォークウイルス(NV), (ii)ノーウォーク様カルシウイルス、(iii)ヒトカルシウイルス、(iv) Lorsdaleカルシウイルス、(v) ウサギ出血病ウイルス(RHDV)、(vi) European brown hare syndromウイルス(EBHSV), (vii)トロントウイルス、(viii)ハワイウイルス、(ix)サッポロ様ウイルス、及び(x) Grimsbyネコカルシウイルスから選択されるもの、(h) RNAバクテリオファージ、(i) ルテオウイルス、好ましくはpotato leaf rollウイルス(PLRV), (j) flock houseウイルス、(k) retroidウイルス、好ましくは(i)腫瘍レトロウイルス、(ii) レンチウイルス、及び(iii) 酵母レトロトランスポゾンTy1、(l) ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV, Leibl H. (1998) Vaccine 16(4): 340-345)及び(m) トガウイルス、好ましくはアルファウイルス、最も好ましくはシンドビスウイルス、及び(n)ノダウイルス科、好ましくはアルファノダウイルス、最も好ましくはPariacotoウイルス(Johnson K.N.等 (2004) Journal of Virology 78:11371-11378)から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記RNAウイルスは二本鎖RNAウイルスであり、好ましくは上記二本鎖RNAウイルスは、(a)ビルナウイルス、(b)サイポウイルス、好ましくはカイコ細胞質多角体病ウイルス(BmCPV)、(c)オルビウイルス、好ましくはブルータングウイルス(BTV)又はアフリカ馬疫ウイルス(AHSV)、(d)ロタウイルス、非常に好ましくは(e)二本鎖RNAバクテリオファージ、好ましくは(i)バクテリオファージ8、(ii)バクテリオファージphi6、(iii)バクテリオファージphi12、及び(iv)バクテリオファージphi12から選択されるものから選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLPはウイルス粒子又はウイルスのVLPであり、上記ウイルスはバクテリオファージであり、上記バクテリオファージはDNAバクテリオファージ又はRNAバクテリオファージでありうる。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLPはウイルス粒子又はウイルスのVLPであり、上記ウイルスはバクテリオファージであり、上記バクテリオファージはDNAバクテリオファージ又はRNAバクテリオファージでありうる。
好ましい実施態様では、上記バクテリオファージはDNAバクテリオファージであり、該バクテリオファージは一本鎖DNAバクテリオファージ又は二本鎖バクテリオファージでありうる。好ましい実施態様では、上記DNAバクテリオファージは好ましくは、(a)ミクロウイルス科、好ましくはPhi X174、及び(b)イノウイルス科、好ましくはfd及びM13から選択される。更に好ましい実施態様では、上記DNAバクテリオファージは二本鎖DNAバクテリオファージであり、上記二本鎖DNAバクテリオファージは好ましくは、(a)ミオウイルス科、好ましくはT2、T4又はT6、(b)シホウイルス科、好ましくはバクテリオファージλ、T1、T5又はHK97、(c)ポドウイルス科、好ましくはT2、T7又はP22、(d)テクティウイルス科、好ましくはPRD1、(e)コルチコウイルス科、好ましくはPM2、(f)プラズマウイルス科、好ましくはマイコプラズマファージ、(g)リポスリクスウイルス科、好ましくはサーモプロテウスバクテリオファージTTV1及び(h)フセロウイルス科、好ましくはスルホロブスバクテリオファージ1からなる群から選択される。
より好ましい実施態様では、上記バクテリオファージはRNAバクテリオファージであり、上記RNAバクテリオファージは一本鎖RNAバクテリオファージ又は二本鎖RNAバクテリオファージでありうる。一実施態様では、上記RNAバクテリオファージはエンテロバクテリオファージであり、好ましくは上記エンテロバクテリオファージはレビウイルス科の代表例であり、好ましくは上記レビウイルス科の代表例は、(a)分類学的に割り当てられていないファミリーメンバーのアシネトバクター・ファージ205(AP205)、(b)レビウイルス、及び好ましくは(c)アロレビウイルスからなる群から選択される。
好ましい実施態様では、上記レビウイルス科の代表例は、レビウイルスであり、好ましくは上記レビウイルスは、(a)バクテリオファージBZ13、(b)バクテリオファージGA、(c)バクテリオファージJP34、(d)バクテリオファージKU1、(d)バクテリオファージTH1、(e)バクテリオファージMS2、(f)バクテリオファージf2、(g)バクテリオファージfr、(h)バクテリオファージJP501、(i)バクテリオファージM12、(j)バクテリオファージR17、及び(k)バクテリオファージPP7からなる群から選択される。
好ましい実施態様では、上記レビウイルス科の代表例は、レビウイルスであり、好ましくは上記レビウイルスは、(a)バクテリオファージBZ13、(b)バクテリオファージGA、(c)バクテリオファージJP34、(d)バクテリオファージKU1、(d)バクテリオファージTH1、(e)バクテリオファージMS2、(f)バクテリオファージf2、(g)バクテリオファージfr、(h)バクテリオファージJP501、(i)バクテリオファージM12、(j)バクテリオファージR17、及び(k)バクテリオファージPP7からなる群から選択される。
より好ましい実施態様では、上記レビウイルス科の代表例は、アロレビウイルスであり、好ましくは上記アロレビウイルスは、(a)バクテリオファージFI、(b)バクテリオファージID2、(c)バクテリオファージNL95、(d)バクテリオファージSP、(d)バクテリオファージTW28、(e)バクテリオファージQβ、(f)バクテリオファージM11、(g)バクテリオファージMX1、(h)バクテリオファージST、(i)バクテリオファージTW18、及び(j)バクテリオファージVKからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記RNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージBZ13、(b)バクテリオファージGA、(c)バクテリオファージJP34、(d)バクテリオファージKU1、(d)バクテリオファージTH1、(e)バクテリオファージMS2、(f)バクテリオファージf2、(g)バクテリオファージfr、(h)バクテリオファージJP501、(i)バクテリオファージM12、(j)バクテリオファージR17、(k)バクテリオファージPP7、(l)バクテリオファージFI、(m)バクテリオファージID2、(n)バクテリオファージNL95、(o)バクテリオファージSP、(p)バクテリオファージTW28、(q)バクテリオファージQβ、(r)バクテリオファージM11、(s)バクテリオファージMX1、(t)バクテリオファージST、(u)バクテリオファージTW18、及び(v)バクテリオファージVKからなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、上記RNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージQβ、(b)バクテリオファージR17、(c)バクテリオファージfr、(d)バクテリオファージGA、(e)バクテリオファージSP、(f)バクテリオファージMS2、(g)バクテリオファージM11、(h)バクテリオファージMX1、(i)バクテリオファージNL95、(k)バクテリオファージf2、(l)バクテリオファージPP7、及び(m)バクテリオファージAP205からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記RNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージBZ13、(b)バクテリオファージGA、(c)バクテリオファージJP34、(d)バクテリオファージKU1、(d)バクテリオファージTH1、(e)バクテリオファージMS2、(f)バクテリオファージf2、(g)バクテリオファージfr、(h)バクテリオファージJP501、(i)バクテリオファージM12、(j)バクテリオファージR17、(k)バクテリオファージPP7、(l)バクテリオファージFI、(m)バクテリオファージID2、(n)バクテリオファージNL95、(o)バクテリオファージSP、(p)バクテリオファージTW28、(q)バクテリオファージQβ、(r)バクテリオファージM11、(s)バクテリオファージMX1、(t)バクテリオファージST、(u)バクテリオファージTW18、及び(v)バクテリオファージVKからなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、上記RNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージQβ、(b)バクテリオファージR17、(c)バクテリオファージfr、(d)バクテリオファージGA、(e)バクテリオファージSP、(f)バクテリオファージMS2、(g)バクテリオファージM11、(h)バクテリオファージMX1、(i)バクテリオファージNL95、(k)バクテリオファージf2、(l)バクテリオファージPP7、及び(m)バクテリオファージAP205からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記RNAバクテリオファージは二本鎖RNAバクテリオファージであり、好ましくは上記二本鎖RNAバクテリオファージはシストウイルス科の代表例であり、より好ましくは上記シストウイルス科の代表例はシストウイルスであり、最も好ましくは上記シストウイルスはシュードモナスバクテリオファージPhi6である。
好ましい実施態様では、上記粒子はバクテリオファージのウイルス粒子であり、好ましくは上記バクテリオファージはRNAバクテリオファージであり、更に好ましくは上記RNAバクテリオファージは一本鎖ポジティブセンスRNAバクテリオファージであり、更により好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスRNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージQβ、(b)バクテリオファージfr、(c)バクテリオファージGA、及び(d)バクテリオファージAP205から選択される一本鎖ポジティブセンスRNAウイルスであり、最も好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスRNAバクテリオファージはQβである。
非常に好ましい実施態様では、上記粒子はVLP、好ましくはRNAウイルスのVLP、より好ましくは一本鎖ポジティブセンスRNAウイルスのVLP、最も好ましくはRNAバクテリオファージのVLPである。
更に好ましい実施態様では、上記粒子はバクテリオファージのVLP、より好ましくはエンテロバクテリオファージのVLP、更により好ましくはレビウイルス科の代表例のVLP,最も好ましくはレビウイルス又はアロレビウイルスのVLPである。非常に好ましい実施態様では、上記VLPはアロレビウイルスのVLPである。
好ましい実施態様では、上記粒子はバクテリオファージのウイルス粒子であり、好ましくは上記バクテリオファージはRNAバクテリオファージであり、更に好ましくは上記RNAバクテリオファージは一本鎖ポジティブセンスRNAバクテリオファージであり、更により好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスRNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージQβ、(b)バクテリオファージfr、(c)バクテリオファージGA、及び(d)バクテリオファージAP205から選択される一本鎖ポジティブセンスRNAウイルスであり、最も好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスRNAバクテリオファージはQβである。
非常に好ましい実施態様では、上記粒子はVLP、好ましくはRNAウイルスのVLP、より好ましくは一本鎖ポジティブセンスRNAウイルスのVLP、最も好ましくはRNAバクテリオファージのVLPである。
更に好ましい実施態様では、上記粒子はバクテリオファージのVLP、より好ましくはエンテロバクテリオファージのVLP、更により好ましくはレビウイルス科の代表例のVLP,最も好ましくはレビウイルス又はアロレビウイルスのVLPである。非常に好ましい実施態様では、上記VLPはアロレビウイルスのVLPである。
更なる実施態様では、上記粒子はウイルス粒子又はVLP、正二十面体ウイルスのVLPであり、上記正二十面体ウイルスは好ましくは植物感染性正二十面体ウイルスである。植物感染性正二十面体ウイルスのVLPは例えば出典明示によりここに援用される国際公開第2005/067478A2号に開示されている。好ましい実施態様では、上記正二十面体ウイルスは、(a)パピローマウイルス科、(b)トティウイルス科、(c)ディシストロウイルス科(Dcistroviridae)、(d)ヘパドナウイルス科、(e)トガウイルス科、(f)ポリオーマウイルス科、(g)ノダウイルス科、(h)テクティウイルス科、(i)レビウイルス科、(j)ミクロウイルス科、(k)サイフォウイルス科、(l)ピコルノウイルス科(Picornoviridae)、(m)パルボウイルス科、(n)カルシウイルス科、(o)テトラウイルス科、及び(p)サテライトウイルスからなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。好ましい実施態様では、上記正二十面体ウイルスは、植物感染性正二十面体であり、 上記植物感染性正二十面体ウイルスは、(a)ブニヤウイルス科、(b)レオウイルス科、(c)ラブドウイルス科、(d)ルテオウイルス科、(e)ナノウイルス科、(f)パルティティウイルス科、(g)セキウイルス科、(h)ティモウイルス科、(i)ウルミアウイルス科、(j)タバコネクロシスウイルスサテライト、(k)カリモウイルス科、(l)ジェミニウイルス科、(m)コモウイルス科、(n)ソベモウイルス、(o)トンブスウイルス科、及び(p)ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、(a)ルテオウイルス科、(b)ナノウイルス科、(c)パルティティウイルス科、(d)セキウイルス科、(e)ティモウイルス科、(f)ウルミアウイルス科、(g)タバコネクロシスウイルスサテライト、(h)カリモウイルス科、(i)ジェミニウイルス科、(j)コモウイルス科、(k)ソベモウイルス、(l)トンブスウイルス科、及び(m)ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、 上記植物感染性正二十面体ウイルスは、(a)カリモウイルス科、(b)ジェミニウイルス科、(c)コモウイルス科、(d)ソベモウイルス、(e)トンブスウイルス科、及び(f)ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、(a)コモウイルス科、(b)ソベモウイルス、(c)トンブスウイルス科、及び(d)ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、コモウイルス科及びブロモウイルス科から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。非常に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、ササゲモザイクウイルス又はササゲクロロティックモトルウイルスである。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、ブロモウイルス科の代表例、好ましくは、ブロモウイルス、ククモウイルス、イラルウイルス、又はアルファモ(Alfamo)ウイルスである。非常に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、ブロモモザイクウイルス、ササゲクロロティックモトルウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス及びアルファルファモザイクウイルス(AMV1及びAMV2を含むAMV)から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記VLPは合成VLPである。
更に好ましい実施態様では、VLPは組換えVLPである。宿主中においてコートタンパク質を組換え的に発現することによるVLPの調製は当業者の技術常識の範囲内である。そのコート又はカプシドタンパク質をVLPの調製に使用することができる例示的なDNA又はRNAウイルスは国際公開第2004/009124号の25頁10−21行、26頁11−28行、28頁4行から31頁4行に開示されている。これらの開示は出典明示によりここに援用する。
好適な一実施態様では、上記VLPは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、好ましくは上記ウイルスは上に列挙した任意のウイルスから選択される。非常に好ましい実施態様では、上記VLPは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、(a)RNAバクテリオファージ;(b)バクテリオファージ、(c)B型肝炎ウイルス、好ましくはそのカプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開第92/11291号)、(d)はしかウイルス(Warnes等, Gene 160:173-178 (1995))、(e)シンドビスウイルス;(f)ロタウイルス(米国特許第5071651号及び米国特許第5374426号)、(g)口蹄疫ウイルス(Twomey 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))、(h)ノーウォークウイルス(Jiang, X.等, Science 250:1580 1583 (1990);Matsui, S.M.等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))、(i)アルファウイルス属、(j)レトロウイルス、好ましくはそのGAGタンパク質(国際公開第96/30523号)、(k)レトロトランスポゾンTy、好ましくはタンパク質p1;(l)ヒトパピローマウイルス(国際公開第98/15631号)、(m)ポリオーマウイルス、(n)タバコモザイク病ウイルス、及び(o)Flockハウスウイルスからなる群から選択される。非常に好ましい実施態様では、上記VLPは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、(a)B型肝炎ウイルス、及び(b)ポリオーマウイルスからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、VLPは組換えVLPである。宿主中においてコートタンパク質を組換え的に発現することによるVLPの調製は当業者の技術常識の範囲内である。そのコート又はカプシドタンパク質をVLPの調製に使用することができる例示的なDNA又はRNAウイルスは国際公開第2004/009124号の25頁10−21行、26頁11−28行、28頁4行から31頁4行に開示されている。これらの開示は出典明示によりここに援用する。
好適な一実施態様では、上記VLPは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、好ましくは上記ウイルスは上に列挙した任意のウイルスから選択される。非常に好ましい実施態様では、上記VLPは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、(a)RNAバクテリオファージ;(b)バクテリオファージ、(c)B型肝炎ウイルス、好ましくはそのカプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開第92/11291号)、(d)はしかウイルス(Warnes等, Gene 160:173-178 (1995))、(e)シンドビスウイルス;(f)ロタウイルス(米国特許第5071651号及び米国特許第5374426号)、(g)口蹄疫ウイルス(Twomey 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))、(h)ノーウォークウイルス(Jiang, X.等, Science 250:1580 1583 (1990);Matsui, S.M.等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))、(i)アルファウイルス属、(j)レトロウイルス、好ましくはそのGAGタンパク質(国際公開第96/30523号)、(k)レトロトランスポゾンTy、好ましくはタンパク質p1;(l)ヒトパピローマウイルス(国際公開第98/15631号)、(m)ポリオーマウイルス、(n)タバコモザイク病ウイルス、及び(o)Flockハウスウイルスからなる群から選択される。非常に好ましい実施態様では、上記VLPは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、(a)B型肝炎ウイルス、及び(b)ポリオーマウイルスからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記VLPはウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、植物感染正二十面体ウイルスであり、好ましくは上記植物感染正二十面体ウイルスは、(a)コモウイルス科、(b)ソベモウイルス属、(c)トンブスウイルス科、及び(d)ブロモウイルス科からなる群から選択される。
好ましい一実施態様では、VLPは、組換えタンパク質、その変異体又は断片の一より多いアミノ酸配列、好ましくは二つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。一を越えるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるVLPは、本出願では、モザイクVLPと呼ばれる。
好ましい一実施態様では、VLPは、組換えタンパク質、その変異体又は断片の一より多いアミノ酸配列、好ましくは二つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。一を越えるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるVLPは、本出願では、モザイクVLPと呼ばれる。
ここで使用される「組換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%であり、好ましくはVLPを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、(i)少なくとも一、好ましくは正確に一の、内部欠失、(ii)少なくとも一、好ましくは正確に一の、切断、又は(iii)それらの少なくとも一、好ましくは正確に一の、組合せから得られる。更に好ましくは、断片は、最大5、4、3又は2の内部欠失、最大2の切断又はそれらの正確に一つの組合せにより得られる。更に好ましくは、断片は、最大5、4、3又は2の内部欠失によって得られ、更により好ましくは、上記欠失のそれぞれは1から5、好ましくは1から4、より好ましくは1から3、更により好ましくは1から2、最も好ましくは正確に1のアミノ酸を含む。
「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義された「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも80%、好ましくは90%、更により好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合化することができるポリペプチドを更に包含する。
「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義された「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも80%、好ましくは90%、更により好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合化することができるポリペプチドを更に包含する。
「変異体コートタンパク質」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、95%、97%又は99%の同一性であり、好ましくは集合してVLPを形成する能力を保持している。
好適な一実施態様では、本発明のVLPはB型肝炎ウイルスのVLPである。B型肝炎ウイルス様粒子の調製は、特に国際公開第00/32227号、同第01/85208号、同第01/056905号及び同第2004/000351号に開示されている。これら4つすべての文献は出典明示により明示的にここに援用される。本発明の実施に使用するのに適したHBcAgの他の変異体は、国際公開第01/056905号の34−39頁に開示されている。特に好ましいB型肝炎ウイルスVLPは国際公開第2004/000351号の43頁、12行から49頁、8行と、国際公開第2004/000351号の配列番号19−68、71及び97に記載されている。本発明の更に好ましい一実施態様では、リジン残基がHBcAgポリペプチドに導入される。好ましい実施態様では、本発明のVLP及び組成物は、配列番号1のアミノ酸1−144又は1−149、1−185を含むか、あるいはこれからなるHBcAgを用いて調製され、このアミノ酸は、79番目と80番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Gly(配列番号24)のアミノ酸配列を有するペプチドに置き換えられるように修飾されている。この修飾により配列番号1から配列番号2に変化する。更なる好ましい実施態様では、配列番号2の48番目と110番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは1−144又は1−149がセリンに変異される。本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するB型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を更に含む。本発明は、配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%又は99%の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるHBcAgポリペプチドを含む組成物及び薬学的組成物をそれぞれ含む。
好適な一実施態様では、本発明のVLPはB型肝炎ウイルスのVLPである。B型肝炎ウイルス様粒子の調製は、特に国際公開第00/32227号、同第01/85208号、同第01/056905号及び同第2004/000351号に開示されている。これら4つすべての文献は出典明示により明示的にここに援用される。本発明の実施に使用するのに適したHBcAgの他の変異体は、国際公開第01/056905号の34−39頁に開示されている。特に好ましいB型肝炎ウイルスVLPは国際公開第2004/000351号の43頁、12行から49頁、8行と、国際公開第2004/000351号の配列番号19−68、71及び97に記載されている。本発明の更に好ましい一実施態様では、リジン残基がHBcAgポリペプチドに導入される。好ましい実施態様では、本発明のVLP及び組成物は、配列番号1のアミノ酸1−144又は1−149、1−185を含むか、あるいはこれからなるHBcAgを用いて調製され、このアミノ酸は、79番目と80番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Gly(配列番号24)のアミノ酸配列を有するペプチドに置き換えられるように修飾されている。この修飾により配列番号1から配列番号2に変化する。更なる好ましい実施態様では、配列番号2の48番目と110番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは1−144又は1−149がセリンに変異される。本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するB型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を更に含む。本発明は、配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%又は99%の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるHBcAgポリペプチドを含む組成物及び薬学的組成物をそれぞれ含む。
本発明の好ましい一実施態様では、ウイルス様粒子は、RNAバクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好ましくは、RNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージBZ13、(b)バクテリオファージGA、(c)バクテリオファージJP34、(d)バクテリオファージKU1、(d)バクテリオファージTH1、(e)バクテリオファージMS2、(f)バクテリオファージf2、(g)バクテリオファージfr、(h)バクテリオファージJP501、(i)バクテリオファージM12、(j)バクテリオファージR17、(k)バクテリオファージPP7、(l)バクテリオファージFI、(m)バクテリオファージID2、(n)バクテリオファージNL95、(o)バクテリオファージSP、(p)バクテリオファージTW28、(q)バクテリオファージQβ、(r)バクテリオファージM11、(s)バクテリオファージMX1、(t)バクテリオファージST、(u)バクテリオファージTW18、及び(v)バクテリオファージVKからなる群から選択される。更に好ましくは、RNAバクテリオファージは、(a)バクテリオファージQβ、(b)バクテリオファージR17、(c)バクテリオファージfr、(d)バクテリオファージGA、(e)バクテリオファージSP、(f)バクテリオファージMS2、(g)バクテリオファージM11、(h)バクテリオファージMX1、(i)バクテリオファージNL95、(k)バクテリオファージf2、(l)バクテリオファージPP7、及び(m)バクテリオファージAP205からなる群から選択される。
本発明の好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、RNAバクテリオファージの少なくとも一のコートタンパク質、その変異体又は断片を含み、該コートタンパク質は(a)QβCPと称する配列番号3;(b)配列番号3及び配列番号4の混合物(QβA1タンパク質);(c)配列番号5(R17カプシドタンパク質);(d)配列番号6(frカプシドタンパク質);(e)配列番号7(GAカプシドタンパク質);(f)配列番号8(SPカプシドタンパク質);(g)配列番号8及び配列番号9の混合物;(h)配列番号10(MS2カプシドタンパク質);(i)配列番号11(M11カプシドタンパク質);(j)配列番号12(MX1カプシドタンパク質);(k)配列番号13(NL95カプシドタンパク質);(l)配列番号14(f2カプシドタンパク質);(m)配列番号15(PP7カプシドタンパク質);及び(n)配列番号21(AP205カプシドタンパク質)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。本発明の更に好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、(a)配列番号3;(b)配列番号3及び配列番号4の混合物;(c)配列番号6;(d)配列番号7;(e)配列番号21からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含む。本発明の更に非常に好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、(a)配列番号3;及び(b)配列番号3及び配列番号4の混合物からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含む。
本発明の更に非常に好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、配列番号3のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から本質的になるか、又は配列番号4のアミノ酸配列を有するコートタンパク質又はその変異体と配列番号3の混合物から本質的になる。
本発明の好適な一実施態様では、VLPは、RNAバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片の一を越えるアミノ酸配列、好ましくは2つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクVLPである。
一実施態様では、ウイルス粒子又はVLPはバクテリオファージfr又はGAのVLPである。組換えVLPの形態のfrコートタンパク質はPushko P等((1993) Prot Engin 6:883-891)によって記載されているようにして得ることができ、GA VLPは、例えば国際公開第2004/007538号に記載されているGAファージからpQb185への逆転写によって単離されたGAコートタンパク質cDNAをクローニングすることによって得ることができる。Fr及びGA VLPの分解は、0.1Mの濃度で酢酸が補填されていてもよい7Mの尿素中でVLPをインキュベートすることによって直ぐになすことができる。核酸は、核酸が保持されながらコートタンパク質の有意な量が流れるpHか、又はコートタンパク質がまたカラムに吸着され続いて塩勾配で溶離されるpHで、イオン交換クロマトグラフィーによってコートタンパク質から更に精製される。ISS-NAとのfr及びGAコートタンパク質の組立は、本質的には国際公開第2003/024481号に記載されているようにして、ゆっくりした透析によって実施され、ここで、上記ISS-NAは好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10(配列番号27)、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10(配列番号27)である。再構築反応の終わりに、再構築混合物は、例えばNETバッファー中の50%(v/v)グリセロール溶液に対する透析(国際公開第2003/024481号)によって濃縮され、例えばセファロースCL-4Bカラムでのゲル濾過法によって更に精製される。更なる精製法には、CsCl勾配又はスクロースクッションでの超遠心が含まれる。Fr及びGA VLPの分解及び組立のための更なるプロトコルは本願の実施例5及び6に開示されている。
本発明の好適な一実施態様では、VLPは、RNAバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片の一を越えるアミノ酸配列、好ましくは2つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクVLPである。
一実施態様では、ウイルス粒子又はVLPはバクテリオファージfr又はGAのVLPである。組換えVLPの形態のfrコートタンパク質はPushko P等((1993) Prot Engin 6:883-891)によって記載されているようにして得ることができ、GA VLPは、例えば国際公開第2004/007538号に記載されているGAファージからpQb185への逆転写によって単離されたGAコートタンパク質cDNAをクローニングすることによって得ることができる。Fr及びGA VLPの分解は、0.1Mの濃度で酢酸が補填されていてもよい7Mの尿素中でVLPをインキュベートすることによって直ぐになすことができる。核酸は、核酸が保持されながらコートタンパク質の有意な量が流れるpHか、又はコートタンパク質がまたカラムに吸着され続いて塩勾配で溶離されるpHで、イオン交換クロマトグラフィーによってコートタンパク質から更に精製される。ISS-NAとのfr及びGAコートタンパク質の組立は、本質的には国際公開第2003/024481号に記載されているようにして、ゆっくりした透析によって実施され、ここで、上記ISS-NAは好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10(配列番号27)、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10(配列番号27)である。再構築反応の終わりに、再構築混合物は、例えばNETバッファー中の50%(v/v)グリセロール溶液に対する透析(国際公開第2003/024481号)によって濃縮され、例えばセファロースCL-4Bカラムでのゲル濾過法によって更に精製される。更なる精製法には、CsCl勾配又はスクロースクッションでの超遠心が含まれる。Fr及びGA VLPの分解及び組立のための更なるプロトコルは本願の実施例5及び6に開示されている。
非常に好適な一実施態様では、VLPはRNAバクテリオファージの2つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該2つのコートタンパク質はCP Qβ(配列番号3)とCP Qβ A1(配列番号4)、又はCP SP(配列番号8)とCP SP A1(配列番号9)のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、RNA-バクテリオファージQβ、fr、AP205又はGAの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のVLPはRNAバクテリオファージQβのVLPである。Qβのカプシド又はウイルス様粒子は、直径25nmで、T=3の疑似対称体の、正二十面体ファージ様カプシド構造を示す。カプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性の五量体及び六量体で結合して(Golmohammadi, R等, Structure 4:543-5554(1996))、際だって安定したQβカプシドとなるコートタンパク質の180のコピーを含む。しかしながら、組換えQβコートタンパク質から作製されるカプシド又はVLPは、カプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、RNA-バクテリオファージQβ、fr、AP205又はGAの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のVLPはRNAバクテリオファージQβのVLPである。Qβのカプシド又はウイルス様粒子は、直径25nmで、T=3の疑似対称体の、正二十面体ファージ様カプシド構造を示す。カプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性の五量体及び六量体で結合して(Golmohammadi, R等, Structure 4:543-5554(1996))、際だって安定したQβカプシドとなるコートタンパク質の180のコピーを含む。しかしながら、組換えQβコートタンパク質から作製されるカプシド又はVLPは、カプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。
本発明に係る更に好ましいRNAバクテリオファージ、特にQβ及びfrのVLPは、国際公開第02/056905号に開示されており、この開示内容は出典明示によりここにその全体を援用する。特に、国際公開第02/056905号の実施例18にQβのVLP粒子の調製について詳しく記載されている。
他の好適な実施態様では、本発明のVLPは、RNAバクテリオファージAP205のVLPである。アミノ酸5のプロリンがスレオニンに置換しているAP205コートタンパク質を含む、AP205VLPの集合体コンピテント変異体型をまた本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好ましい実施態様となる。国際公開第2004/007538号の特に実施例1及び実施例2には、AP205コートタンパク質を含むVLPの取得方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開第2004/007538号は出典明示によってここに援用される。更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLPはRNAバクテリオファージAP205のウイルス粒子又はVLPであり、上記ISS-NAは好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10(配列番号27)、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10(配列番号27)である。
他の好適な実施態様では、本発明のVLPは、RNAバクテリオファージAP205のVLPである。アミノ酸5のプロリンがスレオニンに置換しているAP205コートタンパク質を含む、AP205VLPの集合体コンピテント変異体型をまた本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好ましい実施態様となる。国際公開第2004/007538号の特に実施例1及び実施例2には、AP205コートタンパク質を含むVLPの取得方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開第2004/007538号は出典明示によってここに援用される。更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLPはRNAバクテリオファージAP205のウイルス粒子又はVLPであり、上記ISS-NAは好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10(配列番号27)、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10(配列番号27)である。
露出したリジン残基がアルギニンに置き換えられているQβ変異体を本発明に用いることができる。よって、本発明の他の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、変異体Qβコートタンパク質を含むか、本質的にこれからなるか、あるいはこれからなる。好ましくは、これらの変異体コートタンパク質は、a)Qβ-240(配列番号16、配列番号3のLys13-Arg)、b)Qβ-243(配列番号17、配列番号3のAsn10-Lys);c)Qβ-250(配列番号18、配列番号3のLys2-Arg)、d)Qβ-251(配列番号19、配列番号3のLys16-Arg);及びe)Qβ-259(配列番号20、配列番号3のLys2-Arg、Lys16-Arg)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなる。上に示したQβ変異体コートタンパク質、変異体Qβコートタンパク質VLP及びカプシドの構築、発現及び精製はそれぞれ、国際公報第02/056905号に記載されている。特に上述の出願の実施例18がここで言及される。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLPはRNAバクテリオファージQβのウイルス粒子又はVLPであり、上記ISS-NAは好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10(配列番号27)、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10(配列番号27)である。QβVLPの分解及び組立は実施例1及び3に実証されている。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はVLPはRNAバクテリオファージQβのウイルス粒子又はVLPであり、上記ISS-NAは好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10(配列番号27)、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10(配列番号27)である。QβVLPの分解及び組立は実施例1及び3に実証されている。
本発明の他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、Qβの変異体コートタンパク質、又はその変異体又は断片、及び対応するA1タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、アミノ酸配列16、17、18、19又は20の配列番号を有する変異体コートタンパク質及び対応するA1タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
更にRNAバクテリオファージコートタンパク質はまた細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA.等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM.等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR.等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C.等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、GA (Ni, CZ.,等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及びfr (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。幾つかのRNAバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R.等, Structure 4:543-554 (1996))。
更にRNAバクテリオファージコートタンパク質はまた細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA.等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM.等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR.等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C.等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、GA (Ni, CZ.,等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及びfr (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。幾つかのRNAバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R.等, Structure 4:543-554 (1996))。
好ましい一実施態様では、ウイルス粒子又はVLPはササゲクロロティックモトルウイルス(CCMV)のVLP又はウイルス粒子である。大腸菌において発現されたコートタンパク質からのCCMVウイルスと核酸の組立は記載されている(Zhao X等(1995) Virology 207:486-494)。特に、RNAとのCCMVの再構築はRNA配列とは独立であることが示されている(Johnson JM等 (2004) J Mol Biol 335:455-464)。更に、ウイルスは、高NaCl濃度(1M;Johnson JE及びSpeir JA (1997) J Mol Biol 269:665-675)を加えることによって分解させることができる、ニクレアーゼ消化を受けやすい膨潤形態で存在している場合がある。核酸の存在下でのCCMVの再構築の方法もまたそこに記載されている。一実施態様では、よってCCMV粒子はISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと再構築される。非常に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)、より好ましくは凝集G10、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10である。更なる一実施態様では、天然CCMVウイルス粒子は、膨潤しており、ヌクレアーゼで処理され、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、更により好ましくはG10(配列番号27)が、ヌクレアーゼ除去後にヌクレアーゼ処理粒子に加えられる。更なる一実施態様では、CCMVカプシドは、例えばZlotnick等(2000) Virology 277:450-456に記載されているようにして、核酸なしで再構築され、場合によってはZlotnick等 ((2000) Virology 277:450-456)又はJohnson JE及びSpeir JA ((1997) J Mol Biol 269:665-675)に記載されているように、適切なpH及びイオン強度に溶液をもっていくことによって膨潤され、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10(配列番号27)が膨潤された空の粒子に加えられる。
更なる一実施態様では、ウイルス粒子又はVLPは、ブロモモザイクウイルス(BMV)のVLP又はウイルス粒子である。BMVの再構築は過去に記載されている(Choi YG及びRao LN (2000) Virology 275: 249-257、並びにそこの文献)。各ウイルスRNAの3’端のtRNA様構造(tls)がパッケージ化に必要であることが示され、約200ヌクレオチド長のヌクレオチド配列としてトランスで加えることができる(Choi YG等(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:655-660)。タバコモザイクウイルス(TMV)又はCMV、又は小麦胚芽tRNAのようなtRNAのような他のウイルスからのtls をまたトランスで加えて、再構築を容易にすることができるが、Choi等はBMVカプシド中へのtRNAのパッケージ化は検出しなかった(Choi YG等 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:655-660)。よって、更なる一実施態様では、BMVがISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはG10、更により好ましくは実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10であると再構築される。
本発明の組成物は免疫賦活性核酸(ISS-NA)を含有し、好ましくは上記ISS-NAは、細胞、好ましくは樹状細胞において、サイトカイン、好ましくはIFN-αの生産を誘導することができる。一実施態様では、上記ISS-NAは、(a)リボ核酸;(b)デスオキシリボ核酸、(c)キメラ核酸;及び(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つの核酸の任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記ISS-NAはリボ核酸であり、好ましくは上記リボ核酸は二本鎖リボ核酸、好ましくは(a)二本鎖ウイルスRNA、及び(b)合成二本鎖RNA、好ましくはポリ(A:U)又はポリ(I:C)、最も好ましくはポリ(I:C)からなる群から選択される二本鎖リボ核酸である。
自然免疫系は病原性微生物によって共有される不変の分子パターンを認識する能力を有している。最近の研究は、この認識が効果的な免疫応答を誘導する際の重要な工程であることを明らかにした。微生物産物が免疫応答を増強する主要な機構はAPC、特に樹状細胞を刺激して、炎症誘発性サイトカインをつくり出し、T細胞のための同時刺激分子を高レベルで発現することである。これらの活性化された樹状細胞は続いて一次T細胞応答を開始させ、T細胞媒介エフェクター機能のタイプを指示する。核酸の3つのクラス、つまり、(i)免疫賦活性配列を含む細菌DNA、特に特異的フランキング塩基内の非メチル化CpGジヌクレオチド(CpGモチーフと呼ぶ)、(ii)免疫応答を亢進する微生物成分の重要なメンバーを表す様々なタイプのウイルスによって合成される二本鎖RNA、及び(iii)一本鎖RNA。合成二本鎖(ds)RNA、例えばポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリI:C)は樹状細胞を誘導して炎症誘発性サイトカインをつくり出し、高レベルの同時刺激分子を発現することができる。Tokunaga及びYamamoto等による一連の研究は、細菌DNA又は合成オリゴデスオキシヌクレオチドがヒトPBMC及びマウス脾臓細胞を誘導してI型インターフェロン(IFN)を産生することを示した(Yamamoto等, Springer Semin Immunopathol. 22:11-19に概説)。ポリ(I:C)はI型IFNの強力なインデューサーとして元々は合成されたが、IL-12のような他のサイトカインをまた誘導する。好ましいリボ核酸にはポリイノシン酸-ポリシチジル酸二本鎖RNA(ポリI:C)が包含される。リボ核酸とその修飾並びにその生産方法はLevy, H.B (Methods Enzymol. 1981, 78:242-251)、DeClercq, E (Methods Enzymol. 1981, 78: 227-236)及びTorrence, P.F. (Methods Enzymol 1981;78:326-331)及びその中の文献に記載されている。更に好ましいリボ核酸は、二つのストランドが二本鎖RNAを形成するポリ(I:C)のようなイノシン酸及びシチジル酸のポリヌクレオチドを含む。リボ核酸は生物から単離することができる。リボ核酸はまた合成リボ核酸、ホスホジエステル骨格の修飾、特にホスホロチオエート修飾によってヌクレアーゼ耐性にされた合成ポリ(I:C)オリゴヌクレオチドを更に包含する。更なる実施態様では、ポリ(I:C)のリボース骨格はデスオキシリボースによって置き換えられる。当業者ならば合成オリゴヌクレオチドを如何にして合成するかの手順を知っているであろう。
更なる実施態様では、上記ISS-NAは一本鎖リボ核酸、好ましくはポリウリジル酸(ポリ-U、Westwood A. (2006), Vaccine 24:1736-1743)である。好ましい実施態様では、上記ISS-NAはデスオキシリボ核酸であり、好ましくは上記デスオキシリボ核酸は二本鎖デスオキシリボ核酸である。非常に好ましい実施態様では、上記ISS-NAはデスオキシリボ核酸であり、好ましくは上記デスオキシリボ核酸は一本鎖デスオキシリボ核酸、最も好ましくはオリゴデスオキシヌクレオチド(ODN)である。
他の実施態様では、上記ISS-NAはオリゴヌクレオチドであり、上記オリゴヌクレオチドは好ましくは、(a)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド;及び(b)非メチル化CpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。好ましくは、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。特異的フランキング塩基内の非メチル化CpG-ジヌクレオチド(CpGモチーフと呼ぶ)は免疫応答を亢進する微生物成分の重要なメンバーを表す。Toll様レセプター9(TLR9)は、細菌DNAによって、特に非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドによって活性化される。一般に、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、配列:5’X1X2CGX3X4 3’を含み、ここでX1、X2、X3及びX4は任意のヌクレオチドである。好ましい非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、更に、約6から約100000ヌクレオチド、より好ましくは、約6から約2000ヌクレオチド、更により好ましくは約20から約2000ヌクレオチド、更により好ましくは約20から約300のヌクレオチドを含む。更に好ましい非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、100から約2000ヌクレオチド、好ましくは100から約1000ヌクレオチド、より好ましくは100から約500ヌクレオチドを含む。本発明において、特に好ましいオリゴヌクレオチド、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは20から40、好ましくは26、27、28、29、30、31又は32ヌクレオチド、最も好ましくは30ヌクレオチドを含む。
他の実施態様では、上記ISS-NAはオリゴヌクレオチドであり、上記オリゴヌクレオチドは好ましくは、(a)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド;及び(b)非メチル化CpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。好ましくは、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。特異的フランキング塩基内の非メチル化CpG-ジヌクレオチド(CpGモチーフと呼ぶ)は免疫応答を亢進する微生物成分の重要なメンバーを表す。Toll様レセプター9(TLR9)は、細菌DNAによって、特に非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドによって活性化される。一般に、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、配列:5’X1X2CGX3X4 3’を含み、ここでX1、X2、X3及びX4は任意のヌクレオチドである。好ましい非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、更に、約6から約100000ヌクレオチド、より好ましくは、約6から約2000ヌクレオチド、更により好ましくは約20から約2000ヌクレオチド、更により好ましくは約20から約300のヌクレオチドを含む。更に好ましい非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、100から約2000ヌクレオチド、好ましくは100から約1000ヌクレオチド、より好ましくは100から約500ヌクレオチドを含む。本発明において、特に好ましいオリゴヌクレオチド、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは20から40、好ましくは26、27、28、29、30、31又は32ヌクレオチド、最も好ましくは30ヌクレオチドを含む。
CpG含有オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの安定性を亢進するためにホスフェート骨格の一又は複数のホスホチオエステル修飾を含みうる。例えば、一又は複数のホスフェート骨格の修飾を有するか、又は修飾されたホスフェート骨格の全てを有するCpG含有オリゴヌクレオチド及びヌクレオチドホスフェート骨格修飾の一つ、幾つか又は全てがホスホロチオエート修飾であるCpG含有オリゴヌクレオチドが本発明の範囲に含められる。好ましい実施態様では、上記ISS-NAはCpG含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記CpG含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合からなり、好ましくは非メチル化ヌクレオチドが本発明において好適である。
CpG含有オリゴヌクレオチドはまた組換え、ゲノム、合成、cDNA、プラスミド由来、及び一本鎖又は二本鎖でありうる。本発明での使用に対して、核酸は当該分野でよく知られている多くの手順の何れかを使用して新規合成することができる。例えば、b-シアノエチルホスホラミダイト法(Beaucage, S. L.,及びCaruthers, M. H., Tet. Let. 22:1859 (1981);ヌクレオシドH-ホスホネート法(Garegg等, Tet. Let. 27:4051-4054 (1986);Froehler等., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407 (1986);Garegg等, Tet. Let. 27:4055-4058 (1986), Gaffney等, Tet. Let. 29:2619-2622 (1988))である。これらの化学は市場で入手できる様々な自動オリゴヌクレオチド合成機によって実施することができる。あるいは、CpGは、患者への投与後にオリゴヌクレオチドに分解するプラスミド中で大規模に製造することができる(Sambrook, T.等 “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989参照)。オリゴヌクレオチドは、制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いるもののような既知の技術を使用して既存の核酸配列(例えばゲノム又はcDNA)から調製することができる。
CpG含有オリゴヌクレオチドはまた組換え、ゲノム、合成、cDNA、プラスミド由来、及び一本鎖又は二本鎖でありうる。本発明での使用に対して、核酸は当該分野でよく知られている多くの手順の何れかを使用して新規合成することができる。例えば、b-シアノエチルホスホラミダイト法(Beaucage, S. L.,及びCaruthers, M. H., Tet. Let. 22:1859 (1981);ヌクレオシドH-ホスホネート法(Garegg等, Tet. Let. 27:4051-4054 (1986);Froehler等., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407 (1986);Garegg等, Tet. Let. 27:4055-4058 (1986), Gaffney等, Tet. Let. 29:2619-2622 (1988))である。これらの化学は市場で入手できる様々な自動オリゴヌクレオチド合成機によって実施することができる。あるいは、CpGは、患者への投与後にオリゴヌクレオチドに分解するプラスミド中で大規模に製造することができる(Sambrook, T.等 “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989参照)。オリゴヌクレオチドは、制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いるもののような既知の技術を使用して既存の核酸配列(例えばゲノム又はcDNA)から調製することができる。
ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、組成物が動物の免疫応答を亢進する限り、当該分野で知られている任意の方法によって粒子に結合させることができる。例えば、ISS-NAは共有的に又は非共有的に結合させることができる。好ましくは、粒子、好ましくはVLPは、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを完全に又は部分的に封入する。非常に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記VLPには、上記ISS-NAがパッケージされ、更に好ましくは、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、最も好ましくはG10(配列番号27)である。
一実施態様では、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、粒子、好ましくは上記VLPに、結合部位、好ましくは(a)オリゴヌクレオチド結合部位(天然に生じるか又は非天然のもの)、(b)DNA結合部位、及び(c)RNA結合部位から選択される結合部位にて結合される。他の実施態様では、VLP結合部位はアルギニンリッチリピート又はリジンリッチリピートを含む。
一実施態様では、ISS-NA、好ましくは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、粒子、好ましくは上記VLPに、結合部位、好ましくは(a)オリゴヌクレオチド結合部位(天然に生じるか又は非天然のもの)、(b)DNA結合部位、及び(c)RNA結合部位から選択される結合部位にて結合される。他の実施態様では、VLP結合部位はアルギニンリッチリピート又はリジンリッチリピートを含む。
本発明の他の好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、好ましくは上記パリンドローム配列は、配列番号28及び配列番号35から60の何れか一から選択される。好ましくは、上記パリンドローム配列はGACGATCGTC(配列番号28)である。
好ましい実施態様では、上記ISS-NAはA型CpG又はC型CpGである。好ましくは、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはA型CpGであり、好ましくはヌクレオチドは専らホスホジエステル結合によって結合している。更に好ましい実施態様では、上記ISS-NAはパリンドローム配列を含むA型CpGであり、好ましくは上記パリンドローム配列は、(a)GACGTC(配列番号35)、(b)AGCGCT(配列番号36)、(c)AACGTT(配列番号37)、(d)ATCGAT(配列番号38);(e)CGATCG(配列番号39);(f)CGTACG(配列番号40);(g)CGCGCG(配列番号41);(h)GCGCGC(配列番号42);(i)TCGCGA(配列番号43);(j)ACGATCGT(配列番号44);(k)CGACGATCGTCG(配列番号45);(l)CGACGACGATCGTCGTCG(配列番号46);(m)GACGATCGTC(配列番号28),(n)CGACGACGATCGTCGTCG(配列番号47);(o)AACGTT(配列番号48);(p)CAACGTTG(配列番号49);(q)ACAACGTTGT(配列番号50);(r)AACAACGTTGTT(配列番号51);及び(s)CAACAACGTTGTTG(配列番号52)からなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、上記ISS-NAははパリンドローム配列を含むA型CpGであり、該パリンドローム配列は、GACGATCGTC(配列番号28)である。
好ましい実施態様では、上記ISS-NAはA型CpG又はC型CpGである。好ましくは、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはA型CpGであり、好ましくはヌクレオチドは専らホスホジエステル結合によって結合している。更に好ましい実施態様では、上記ISS-NAはパリンドローム配列を含むA型CpGであり、好ましくは上記パリンドローム配列は、(a)GACGTC(配列番号35)、(b)AGCGCT(配列番号36)、(c)AACGTT(配列番号37)、(d)ATCGAT(配列番号38);(e)CGATCG(配列番号39);(f)CGTACG(配列番号40);(g)CGCGCG(配列番号41);(h)GCGCGC(配列番号42);(i)TCGCGA(配列番号43);(j)ACGATCGT(配列番号44);(k)CGACGATCGTCG(配列番号45);(l)CGACGACGATCGTCGTCG(配列番号46);(m)GACGATCGTC(配列番号28),(n)CGACGACGATCGTCGTCG(配列番号47);(o)AACGTT(配列番号48);(p)CAACGTTG(配列番号49);(q)ACAACGTTGT(配列番号50);(r)AACAACGTTGTT(配列番号51);及び(s)CAACAACGTTGTTG(配列番号52)からなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、上記ISS-NAははパリンドローム配列を含むA型CpGであり、該パリンドローム配列は、GACGATCGTC(配列番号28)である。
好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その3’末端と5’末端にグアノシン体が隣接する。更に好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その5’末端に少なくとも3で多くとも25のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも3で多くとも25のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その5’末端に少なくとも3で多くとも15、好ましくは多くとも10のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも3で多くとも15、好ましくは多くとも10のグアノシン体が隣接している。他の好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その5’末端と3’末端に少なくとも3で多くとも15、好ましくは多くとも10のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、パリンドローム配列には、その5’末端に少なくとも3で多くとも15、好ましくは多くとも10のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも6で多くとも15、好ましくは多くとも10のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、パリンドローム配列は、その5’末端に少なくとも5で多くとも10のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも5で多くとも10のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、パリンドローム配列、好ましくは配列番号28は、その3’末端に少なくとも10、好ましくは正確に10のグアノシン体が隣接し、その5’末端に少なくとも10、好ましくは正確に10のグアノシン体が隣接している。非常に好ましい実施態様では、上記ISS-NAはパリンドローム配列を含むA型CpGであり、該パリンドローム配列は、その5’末端に3から10のグアノシン体が隣接し、その3’末端に3から10のグアノシン体が隣接している。更により好ましい実施態様では、上記ISS-NAはパリンドローム配列を含むA型CpGであり、該パリンドローム配列は配列番号28であり、該パリンドローム配列はその5’末端に3から10のグアノシン体が隣接し、該パリンドローム配列はその3’末端に3から10のグアノシン体が隣接している。これらの免疫賦活性物質は効率的にVLPにパッケージ化することができ、パッケージ化効率は、典型的には、5’及び/又は3’末端の隣接グアノシン体の数が増加するにつれて減少する。
本発明の非常に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);(b)「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号:26);又は(c)「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号27)からなる群から選択される配列を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。後者はインビトロにおいて血球細胞を刺激することができることが過去に見出されている(Kuramoto E.等, Japanese Journal Cancer Research 83, 1128-1131 (1992))。
特に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、「G10」(配列番号27)を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなり、好ましくは上記G10は専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは、上記G10は、実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10である。
更に特に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、「G9-9」(配列番号26)を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。更に特に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、「G8-8」(配列番号25)を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。
特に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、「G10」(配列番号27)を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなり、好ましくは上記G10は専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは、上記G10は、実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10である。
更に特に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、「G9-9」(配列番号26)を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。更に特に好ましい実施態様では、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、「G8-8」(配列番号25)を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。
更に好ましい実施態様では、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)“G3−6”GGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号29);(b)“G4−6”GGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号30);(c)“G5−6”GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号31);(d)「G6−6」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号32);and(e)「G7−7」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(配列番号33);(f)「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);(g)「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号26);及び(h)“G6”GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(配列番号34)から選択される核酸配列を含む。
本発明の更に好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列はGACGATCGTC(配列番号28)であり、該パリンドローム配列には、その5’末端に少なくとも4で多くとも9のグアノシン体が隣接し、また 該パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも6で多くとも9のグアノシン体が隣接する。
本発明の更に好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列はGACGATCGTC(配列番号28)であり、該パリンドローム配列には、その5’末端に少なくとも4で多くとも9のグアノシン体が隣接し、また 該パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも6で多くとも9のグアノシン体が隣接する。
本発明の他の好ましい実施態様では、免疫賦活性物質は非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)“G4−6”GGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号30);(b)“G5−6”GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号31);(c)「G6−6」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号32);(d)「G7−7」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(配列番号33);(e)「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);及び(f)「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号26)から選択される核酸配列を有する。
本発明の他の好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)“G4−6”GGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号30);(b)“G5−6”GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号31);(c)「G6−6」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号32);(d)「G7−7」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(配列番号33);(e)「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);及び(f)「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号26)から選択される核酸配列を有する。
本発明の他の好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)“G4−6”GGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号30);(b)“G5−6”GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号31);(c)「G6−6」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号32);(d)「G7−7」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(配列番号33);(e)「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);及び(f)「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号26)から選択される核酸配列を有する。
本発明の更に好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列はGACGATCGTC(配列番号28)であり、該パリンドローム配列には、その5’末端に少なくとも5で多くとも8のグアノシン体が隣接し、また 該パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも6で多くとも8のグアノシン体が隣接する。
実験データは、上記ISS-NA、好ましくはグアノシンが隣接したパリンドローム性の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであって、パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号28)で、該パリンドローム配列には、その3’末端と5’末端に10未満のグアノシン体が隣接したものを、粒子、好ましくはVLP中にパッケージする容易さが、パリンドローム配列に更に少ないグアノシン体が隣接する場合に増加することを示している。しかしながら、パリンドローム配列に隣接するグアノシン体の数を減少させると、インビトロでの血球細胞の刺激を減少させる。従って、パッケージ性は、示された発明の免疫賦活性物質の生物学的活性の減少によって賄われる。よって、好ましい実施態様はパッケージ性と生物学的活性の折衷である。
実験データは、上記ISS-NA、好ましくはグアノシンが隣接したパリンドローム性の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであって、パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号28)で、該パリンドローム配列には、その3’末端と5’末端に10未満のグアノシン体が隣接したものを、粒子、好ましくはVLP中にパッケージする容易さが、パリンドローム配列に更に少ないグアノシン体が隣接する場合に増加することを示している。しかしながら、パリンドローム配列に隣接するグアノシン体の数を減少させると、インビトロでの血球細胞の刺激を減少させる。従って、パッケージ性は、示された発明の免疫賦活性物質の生物学的活性の減少によって賄われる。よって、好ましい実施態様はパッケージ性と生物学的活性の折衷である。
本発明の他の好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが(a)“G5−6” GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号31);(b)「G6−6」 GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号32);(c)「G7−7」 GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(配列番号33);及び(d)「G8−8」 GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25)から選択される核酸配列を有している。
本発明の非常に好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号25(G8-8)の核酸配列を有している。
上で述べたように、VLP中へのパッケージ化に使用される最適な配列はパッケージ性と生物学的活性の折衷である。このことを考慮に入れると、G8-8免疫賦活性物質は、なお合理的に良好にパッケージ化されていながら生物学的に高い活性を有するので、本発明の更なる非常に好ましい実施態様である。
本発明の非常に好ましい実施態様では、ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフはパリンドローム配列の一部であり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号25(G8-8)の核酸配列を有している。
上で述べたように、VLP中へのパッケージ化に使用される最適な配列はパッケージ性と生物学的活性の折衷である。このことを考慮に入れると、G8-8免疫賦活性物質は、なお合理的に良好にパッケージ化されていながら生物学的に高い活性を有するので、本発明の更なる非常に好ましい実施態様である。
更に好ましい実施態様では、上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、細胞、好ましくはPBMC、脾臓細胞又はヒトpDCにおけるIFN-αの産生を誘導可能であり、更に好ましくは、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T(2006−PS,配列番号76);(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(2216−PO,配列番号77);(c)G*G*GGGACGATCGTC*G*G*G*G*G*G(2216−POコア,配列番号77);(d)GGTGCATCGATGCAGGGGGG(D19−PO,配列番号78);(e)G*G*TGCATCGATGCAG*G*G*G*G*G(D19−POコア,配列番号78);(f)GGGGACGATCGTCGGGGGG(G3−6,配列番号29);(g)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(G4−6,配列番号30);(h)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(G5−6,配列番号31);(i)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(G6−6,配列番号32);(j)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(G7−7,配列番号33);(k)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(G8−8,配列番号25);(l)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(G9−9,配列番号26);(m)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(G10,配列番号27);及び(n)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(G102x,配列番号79)から選択され、ここで、*はホスホロチオエート修飾を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。より好ましい実施態様では、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはヒトpDCにおいてIFN-αの産生を誘導可能であり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T(2006−PS,配列番号76)であり、ここで、*はホスホロチオエート修飾を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。更により好ましい実施態様では、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはPBMC又は脾臓細胞においてIFN-αの産生を誘導可能であり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(2216−PO,配列番号77);(b)G*G*GGGACGATCGTC*G*G*G*G*G*G(2216−POコア,配列番号77);(c)GGTGCATCGATGCAGGGGGG(D19−PO,配列番号78);(d)G*G*TGCATCGATGCAG*G*G*G*G*G(D19−POコア,配列番号78);(e)GGGGACGATCGTCGGGGGG(G3−6,配列番号29);(f)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(G4−6,配列番号30);(g)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(G5−6,配列番号31);(h)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(G6−6,配列番号32);(i)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(G7−7,配列番号33);(j)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(G8−8,配列番号25);(k)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(G9−9,配列番号26);(l)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(G10,配列番号27);and(m)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(G102x,配列番号79)からなる群から選択され、ここで、*はホスホロチオエート修飾を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。非常に好ましい実施態様では、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(G102x,配列番号79)であり、ここで好ましくは全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。
更に好ましい実施態様では、上記ISS-NAはC型CpGであり、好ましくは上記C型CpGはパリンドローム配列を含み、更に好ましくは上記パリンドローム配列は配列番号53から60に示された配列の何れか一つから選択される。更に好ましい実施態様では、上記C型CpGは配列番号64又は配列番号65であり、好ましくは上記C型CpGの全核酸はホスホロチオエート結合性である。更に好ましいC型CpGは、(a)TCpGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(配列番号64);(b)TCGTCGTTTTACpGGCpGCCpGTGCCG(配列番号64);(c)TCGTCGTTTTACpGGCGCCpGTGCCG(配列番号64);及び(d)TCGTCpGTTTTACpGGCGCCpGTGCCG(配列番号64)からなる群から選択され、ここでpはホスホジエステル結合を示し、全ての他のヌクレオチドはホスホロチオエート結合である。(a)TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(配列番号66);(b)TCGTCGTTTTCGACGGCCGTCG(配列番号67);(c)TCGTCGTTTTCCGGCGCGCCGG(配列番号68);(d)TCGTCGTTTTCGGCGCGCGTCG(配列番号69);(e)TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(配列番号70);(f)TTGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(配列番号71);(g)TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(配列番号72);(h)TCGTCGTTTTCGGCTTTTGCCG(配列番号73);(i)TCGTCGTTTTCGGCGTTTTTTT(配列番号74);及び(j)TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(配列番号75)からなる群から選択されるC型CpGは、IFN−αの産生の強力なインデューサーであり(Vollmer等 2004, Eur. J. Immunol. 43:351-262, p.253, その表1を参照のこと)、よって本発明において特に好ましいISS-NAである。
本発明の一実施態様は動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける過敏症を治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物は粒子と免疫賦活性核酸を含み、上記粒子に上記免疫賦活性核酸がパッケージされ、好ましくは上記過敏症はアレルギー性又は非アレルギー性過敏症である。本発明の組成物及び薬学的組成物は治療的並びに予防的処置において使用することができる。
好ましい実施態様では、上記過敏症は、(a)喘息、(b)鼻炎、(c)結膜炎、(d)骨結膜炎、(e)皮膚炎、(f)蕁麻疹、及び(g)アナフィラキシーからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記過敏症はアレルギーであり、上記アレルギーは好ましくはIgE依存性アレルギー及び非IgE依存性アレルギーから選択される。好ましい実施態様では、上記過敏症は喘息、好ましくはIgE依存性喘息であり、ここで、上記喘息は間欠又は慢性喘息でありうる。非常に好ましい実施態様では、上記過敏症はアトピー性喘息である。
更に好ましい実施態様では、上記過敏症は皮膚炎、好ましくは湿疹、最も好ましくはアトピー性湿疹である。
非常に好ましい実施態様では、上記過敏症はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)であり、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは天然に生じるアレルゲン、つまり花粉、獣皮、ハウスダスト、チリダニ等のような天然源に生じるアレルゲンに対するIgE依存性アレルギーである。
好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくはIgE依存性アレルギーは、(a)花粉アレルギー(花粉症)、(b)ハウスダストアレルギー、(c)食物アレルギー、(d)薬物アレルギー、(e)昆虫毒アレルギー、好ましくは蜂毒アレルギー、及び(f)動物アレルギー、好ましくはネコアレルギーからなる群から選択される。
好ましい実施態様では、上記過敏症は、(a)喘息、(b)鼻炎、(c)結膜炎、(d)骨結膜炎、(e)皮膚炎、(f)蕁麻疹、及び(g)アナフィラキシーからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記過敏症はアレルギーであり、上記アレルギーは好ましくはIgE依存性アレルギー及び非IgE依存性アレルギーから選択される。好ましい実施態様では、上記過敏症は喘息、好ましくはIgE依存性喘息であり、ここで、上記喘息は間欠又は慢性喘息でありうる。非常に好ましい実施態様では、上記過敏症はアトピー性喘息である。
更に好ましい実施態様では、上記過敏症は皮膚炎、好ましくは湿疹、最も好ましくはアトピー性湿疹である。
非常に好ましい実施態様では、上記過敏症はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)であり、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは天然に生じるアレルゲン、つまり花粉、獣皮、ハウスダスト、チリダニ等のような天然源に生じるアレルゲンに対するIgE依存性アレルギーである。
好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくはIgE依存性アレルギーは、(a)花粉アレルギー(花粉症)、(b)ハウスダストアレルギー、(c)食物アレルギー、(d)薬物アレルギー、(e)昆虫毒アレルギー、好ましくは蜂毒アレルギー、及び(f)動物アレルギー、好ましくはネコアレルギーからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、(a)花粉;(b)ダスト、好ましくはハウスダスト;(c)チリダニ;(d)真菌類、好ましくはコウジカビ;(e)哺乳動物の表皮、(f)鳥の羽毛;(g)昆虫、好ましくは蜂毒;(h)食物、好ましくはイチゴ、キーウィ、ピーナッツ、又は小麦タンパク質;(i)哺乳動物のフケ、好ましくはネコのフケ;(j)唾液;(k)血清;及び(l)尿からなる群から選択される供給源に生じるアレルゲンに対するアレルギーである。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、(a)樹木、(b)草、(c)動物産物、及び(d)植物産物からなる群から選択される供給源に生じるアレルゲンに対するアレルギーである。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、(a)蜂毒ホスホリパーゼA2;(b)ブタクサ花粉Amb a 1;(c)カバノキ花粉Bet v I;(d)白頭スズメバチ毒(white faced hornet venom)5Dol m V;(e)チリダニDer p 1;(f)チリダニDer f 2;(g)チリダニDerP 2;(h)チリダニLep d;(i)真菌アレルゲンAlt a 1;(j)真菌アレルゲンAsp f 1;(k)真菌アレルゲンAsp f 16;及び(l)ピーナッツアレルゲンからなる群から選択される抗原に対するアレルギーである。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、ネコアレルゲンに対するアレルギー、好ましくはFelD1抗原に対するアレルギーである。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、チリダニに対するアレルギーであり、好ましくは上記チリダニは、(a)ヤケヒョウヒダニ、(b)コナヒョウヒダニ、(c)デルマトフィルス・ミクロセラス(D. microceras)、(d)ユーログリファス・マイネイ(Euroglyphus maynei)、(e)Glycyphagus sp.、(f)キナコダニ、(g)ネッタイタマニクダニから選択される。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、花粉アレルギー(花粉症)である。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーはハウスダストアレルギー、好ましくはハウスダストに含まれるチリダニアレルゲンに対するIgE依存性アレルギーであり、上記チリダニアレルゲンは好ましくは(a)Der p 1;(b)Der f 2;及び(c)DerP 2からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、ネコアレルゲンに対するアレルギー、好ましくはFelD1抗原に対するアレルギーである。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、チリダニに対するアレルギーであり、好ましくは上記チリダニは、(a)ヤケヒョウヒダニ、(b)コナヒョウヒダニ、(c)デルマトフィルス・ミクロセラス(D. microceras)、(d)ユーログリファス・マイネイ(Euroglyphus maynei)、(e)Glycyphagus sp.、(f)キナコダニ、(g)ネッタイタマニクダニから選択される。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーは、花粉アレルギー(花粉症)である。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記IgE依存性アレルギーはハウスダストアレルギー、好ましくはハウスダストに含まれるチリダニアレルゲンに対するIgE依存性アレルギーであり、上記チリダニアレルゲンは好ましくは(a)Der p 1;(b)Der f 2;及び(c)DerP 2からなる群から選択される。
本発明は、とりわけ、粒子、好ましくはVLPに、ISS-NA、好ましくは非メチル化C及びGに富む一本鎖DNAオリゴヌクレオチド(CpG)をパッケージできるという知見に関する。
従って、本発明の好ましい実施態様は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける過敏症を治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有し、上記VLPに上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされている。
本発明の更に好ましい実施態様は、ヒトにおけるアレルギーを治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はRNAバクテリオファージのVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み、上記RNAバクテリオファージのVLPに上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがG10(配列番号27)である。
本発明の非常に好ましい実施態様は、ヒトにおけるアレルギーを治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はRNAバクテリオファージQβのVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)を含有し、上記RNAバクテリオファージQβのVLPに上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10がパッケージされている。
従って、本発明の好ましい実施態様は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける過敏症を治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有し、上記VLPに上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされている。
本発明の更に好ましい実施態様は、ヒトにおけるアレルギーを治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はRNAバクテリオファージのVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み、上記RNAバクテリオファージのVLPに上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがG10(配列番号27)である。
本発明の非常に好ましい実施態様は、ヒトにおけるアレルギーを治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はRNAバクテリオファージQβのVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)を含有し、上記RNAバクテリオファージQβのVLPに上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10がパッケージされている。
本発明の更なる実施態様は、本発明の組成物の製造方法及び上記組成物を使用して過敏症を治療する方法であり、好ましくは上記過敏症はアトピー性喘息、I型アレルギー又はアトピー性湿疹である。
本発明は、動物における過敏症の治療方法に使用される組成物を製造する方法を提供し、該組成物はVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有し、上記VLPには上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記方法は(i)上記VLP(a)を上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にインキュベートし、(ii)RNエースを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはRNエースAである。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPをRNエースと共にインキュベートし、(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはRNエースAである。
本発明は、動物における過敏症の治療方法に使用される組成物を製造する方法を提供し、該組成物はVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有し、上記VLPには上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記方法は(i)上記VLP(a)を上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)と共にインキュベートし、(ii)RNエースを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはRNエースAである。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPをRNエースと共にインキュベートし、(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはRNエースAである。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPを分解し;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記VLPを再構築する工程を含む。更なる実施態様では、上記方法は分解したVLPから核酸を除去する工程を更に含む。あるいは、上記方法は少なくとも部分的に分解されたVLPの核酸を除去し、及び/又は再構築後に組成物を精製する工程を更に含む。好ましい実施態様では、上記VLPは、細菌発現系において産生される。更に好ましい実施態様では、上記方法の工程(i)で言及された上記VLPは、RNAバクテリオファージのVLP、より好ましくは、(a)バクテリオファージQβ、(b)バクテリオファージAP205、(c)バクテリオファージGA、及び(d)バクテリオファージfrからなる群から選択されるRNAバクテリオファージのVLPである。非常に好ましい実施態様では、上記方法の工程(i)で言及された上記VLPは、RNAバクテリオファージのVLP、より好ましくはRNAバクテリオファージAP205又はQβ、最も好ましくはQβのVLPである。
更に好ましい実施態様では、上記方法の工程(ii)で言及された上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、5から60のヌクレオチド、好ましくは20から40のヌクレオチド、最も好ましくは約30のヌクレオチドからなる。非常に好ましい実施態様では、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはA型CpG、好ましくは5’及び/又は3’端にポリGモチーフを含むA型CpGである。更により好ましい実施態様では、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);(b)「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号26);又は(c)「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号27)、最も好ましくは配列番号27からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液中で上記VLPをインキュベートし;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含み、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共に上記VLPをインキュベートし;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含み、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液中で上記VLPをインキュベートし;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含み、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共に上記VLPをインキュベートし;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含み、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPを脱安定化可能な溶液と共に上記VLPをインキュベートし、(ii)上記溶液からコートタンパク質を精製し;及び(iii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの存在下で上記VLPを再構築する工程を含み、好ましくは上記VLPを脱安定化可能な上記溶液が塩化マグネシウムを含み、更に好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度が0.2から1.5M、より好ましくは0.4から1M、最も好ましくは約0.7Mであり;更により好ましくは上記VLPがバクテリオファージQβのVLPである。非常に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPを脱安定化可能な溶液と共に上記VLPをインキュベートし、(ii)上記溶液からコートタンパク質を精製し;及び(iii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの存在下で上記VLPを再構築する工程を含み、好ましくは上記VLPを脱安定化可能な上記溶液が塩化マグネシウムを含み、更に好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度が0.2から1.5M、より好ましくは0.4から1M、最も好ましくは約0.7Mであり;更により好ましくは上記VLPがバクテリオファージQβのVLPであり、更により好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがG10(配列番号27)であり、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10である。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPをアルカリ性条件下、好ましくはNaOHの存在下、最も好ましくは約25mMのNaOHの存在下でインキュベートし;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、(i)上記VLPをアルカリ性条件下、好ましくはNaOHの存在下、最も好ましくは約25mMのNaOHの存在下でインキュベートし;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む。
非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを、分解されたVLPに該オリゴヌクレオチドを加える前に、オリゴヌクレオチド凝集体の形成を支える条件下にすることによって、上記VLPの上記再構築の効率を改善することができ、また再構築したVLPの安定性を改善することができることが見出された。オリゴヌクレオチドの凝集状態を制御する条件は、Guschlbauer W., Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, ISSN 0739-1102, Volume 8, Issue Number 3 (1990). Title: Four-Stranded Nucleic Acid Structures 25 Yearsに記載されている。オリゴヌクレオチドの凝集は、例えばイオン条件、オリゴヌクレオチドの濃度、pH、温度条件及びインキュベーション時間によって影響される。更に、オリゴヌクレオチドの凝集が、その5’及び/又は3’端にポリGモチーフを含むA型オリゴヌクレオチド、最も好ましくはG10(配列番号27)に対して特に有利であることが見出された。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの凝集に対する好ましい条件は実施例2において例示している。最適な凝集条件は異なる非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの間で変動し、同じ非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの異なったバッチ間でさえも変動しうる。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの実際の凝集状態は、HPLCによって、好ましくは実施例2に記載の条件下で評価することができる。
よって、本発明の更なる実施態様では、本発明は、(i)上記VLPを分解し;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記VLPを再構築する工程を含む方法を提供し、ここで、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの上記添加の前に、該方法は、オリゴヌクレオチド凝集体の形成を支える条件下で上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドをインキュベートする更なる工程を含む。好ましい実施態様では、上記インキュベーションは、70から100℃の温度、好ましくは約85℃にて、好ましくはナトリウムイオンの存在下で実施される。更により好ましい実施態様では、上記インキュベーションは、100〜250μm、好ましくは約175μmの上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの濃度で、200から500mMのナトリウムイオンの存在下、好ましくは約250mMのナトリウムイオンの存在下で、好ましくは85℃で約10分間、実施され、更に好ましくは、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはその5’及び/又は3’端にポリGモチーフを含む。更により好ましい実施態様では、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、(a)「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);(b)「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号26);又は(c)「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号27)からなる群から選択され、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)であるい。更に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド凝集体の形成を支える上記条件は、凝集した非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、好ましくは凝集したG10(配列番号27)が得られるように選択され、上記凝集した非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、好ましくは上記凝集したG10(配列番号27)は、実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を示す。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は、(a)バクテリオファージQβのウイルス様粒子VLP、及び(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み;上記ウイルス様粒子(a)には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)がパッケージされ、上記方法は、(i)上記VLPを脱安定化可能な溶液と共に上記VLPをインキュベートし、(ii)上記溶液からコートタンパク質を精製し;及び(iii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと酸化剤の存在下でVLPに上記コートタンパク質を再構築する工程を含む。好ましい実施態様では、上記VLPを脱安定化可能な上記溶液は塩化マグネシウムと還元剤を含み、好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度は0.2から1.5M、より好ましくは0.4から1M、最も好ましくは約0.7Mであり;更に好ましくは上記還元剤はDTTであり、更により好ましくは上記DTTの濃度は1から100mM、好ましくは2から15mM、より好ましくは約10mM、最も好ましくは約10mMである。更に好ましい実施態様では、上記酸化剤はH2O2であり、更に好ましくは該H2O2の濃度は、1から50mM、好ましくは1から10mM、最も好ましくは約7mMである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質の上記再構築は、塩の存在下で実施され、ここで好ましくは上記塩はNaClであり、更に好ましくは該塩、好ましくは上記NaClの濃度が100mMから1M、より好ましくは100mMから500mM、最も好ましくは約250mMである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質のVLPへの上記再構築の前に、上記精製したコートタンパク質を、塩、還元剤及び非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有する溶液中でインキュベートし、ここで好ましくは(i)上記塩はNaClであり、更に好ましくは上記塩、好ましくは上記NaClの濃度は100mMから1M、より好ましくは100mMから500mM、最も好ましくは約250mMであり;(ii)上記尿素の濃度は100mMから7M、より好ましくは500mMから2M、最も好ましくは約1Mであり;(iii)上記還元剤はDTTであり、好ましくは上記DTTの濃度は1から10mM、好ましくは1から5mM、最も好ましくは2.5mMである。更に好ましい実施態様では、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)であり、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集したG10である。
本発明は動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を更に提供し、該組成物はここに開示された方法の何れか一つによって得ることができる。
上述の本発明の組成物の製造方法は上記VLPの代わりにウイルス粒子を使用して実施することもまたでき、該ウイルス粒子は、好ましくは、バクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージのウイルス粒子である。
特に、本発明は動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートし;(ii)RNエースを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはTNエースAである。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPをRNエースと共にインキュベートし;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはTNエースAである。
上述の本発明の組成物の製造方法は上記VLPの代わりにウイルス粒子を使用して実施することもまたでき、該ウイルス粒子は、好ましくは、バクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージのウイルス粒子である。
特に、本発明は動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートし;(ii)RNエースを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはTNエースAである。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPをRNエースと共にインキュベートし;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記RNエースはTNエースAである。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを分解し;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを添加し;及び(iii)上記VLPを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。更なる実施態様では、上記方法は分解されたVLPから核酸を除去する工程を更に含む。あるいは、上記方法は、少なくとも部分的に分解されたVLPの核酸を除去し、及び/又は再構築の後に組成物を精製する工程を更に含む。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを、該VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートし;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができ、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを、該VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートし;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができ、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)マグネシウム(Mg)イオン;及び(e)(a)、(b)、(c)及び/又は(d)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを、該VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートし;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができ、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)VLPを、該VLPの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートし;(ii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを添加し;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができ、好ましくは工程(i)の上記金属イオンは、(a)亜鉛(Zn)イオン;(b)銅(Cu)イオン;(c)鉄(Fe)イオン;(d)マグネシウム(Mg)イオン;及び(e)(a)、(b)、(c)及び/又は(d)の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記VLPは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)上記VLPを、該VLPを脱安定化可能な溶液と共にインキュベートし、ここで好ましくは該VLPはバクテリオファージQβのVLPであり;(ii)上記溶液からコートタンパク質を精製し;及び(iii)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド及び酸化剤の存在下で上記コートタンパク質をVLPに再構築する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記VLPを脱安定化可能な上記溶液は塩化マグネシウムと還元剤を含有し、好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度が0.2から1.5M、より好ましくは0.4から1M、最も好ましくは約0.7Mであり;更に好ましくは上記還元剤はDTTであり、更により好ましくは上記DTTの濃度は1から100mM、好ましくは2から15mM、より好ましくは約10mM、最も好ましくは約10mMである。更に好ましい実施態様では、上記酸化剤はH2O2であり、更に好ましくは該H2O2の濃度は、1から50mM、好ましくは1から10mM、最も好ましくは約7mMである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質のVLPへの上記再構築は、塩の存在下で実施され、ここで好ましくは上記塩はNaClであり、更に好ましくは該塩、好ましくは上記NaClの濃度が100mMから1M、より好ましくは100mMから500mM、最も好ましくは約250mMである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質のVLPへの上記再構築の前に、上記精製したコートタンパク質を、塩、還元剤及び非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有する溶液中でインキュベートし、ここで好ましくは(i)上記塩はNaClであり、更に好ましくは上記塩、好ましくは上記NaClの濃度は100mMから1M、より好ましくは100mMから500mM、最も好ましくは約250mMであり;(ii)上記尿素の濃度は100mMから7M、より好ましくは500mMから2M、最も好ましくは約1Mであり;及び(iii)上記還元剤はDTTであり、好ましくは上記DTTの濃度は1から10mM、好ましくは1から5mM、最も好ましくは2.5mMである。更に好ましい実施態様では、上記記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)であり、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは、実施例2に記載したHPLC条件下でQβカプシド標準に対して80から120%、最も好ましくは80から95%の保持時間を有する凝集G10である。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、(i)上記VLPをアルカリ性条件下、好ましくはNaOHの存在下、最も好ましくは約25mMのNaOHの存在下でインキュベートし;(ii)上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを加え;及び(iii)上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
本発明は更に医薬として使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物は粒子とISS-NAを含み、上記粒子には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記粒子は好ましくはRNAバクテリオファージ、最も好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号28のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)である。
本発明は更に動物における過敏症、好ましくはアレルギー、最も好ましくはアトピー性喘息、アトピー性湿疹、花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダニアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物は(a)VLPと(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み、上記ウイルス様粒子(a)には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)がパッケージされ、上記VLPは好ましくはRNAバクテリオファージ、最も好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号28のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)である。
本発明は更に医薬として使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物は粒子とISS-NAを含み、上記粒子には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記粒子は好ましくはRNAバクテリオファージ、最も好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号28のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)である。
本発明は更に動物における過敏症、好ましくはアレルギー、最も好ましくはアトピー性喘息、アトピー性湿疹、花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダニアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物は(a)VLPと(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み、上記ウイルス様粒子(a)には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)がパッケージされ、上記VLPは好ましくはRNAバクテリオファージ、最も好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号28のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)である。
本発明は更に動物における過敏症、好ましくはアレルギー、最も好ましくはアトピー性喘息、アトピー性湿疹、花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダニアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物はVLPと非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含み、上記ウイルス様粒子には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記VLPは好ましくはRNAバクテリオファージ、最も好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号28のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)である。
本発明はまた動物における過敏症を治療し、予防し及び/又は減弱する方法に使用される薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、免疫学的に有効な量の本発明組成物を薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤と共に含有し、あるいはそれらからなる。薬学的組成物はまたアジュバントを含有していてもよい。
更なる実施態様では、上記薬学的組成物は本発明の組成物の徐放製剤を含む。徐放製剤は当該分野でよく知られている。典型的で好ましい徐放製剤は、微小粒子、エマルジョン、及びゲルとして製剤された本発明の組成物である。
一実施態様では、本発明はアトピー性湿疹を治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。他の実施態様では、本発明は喘息を治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。他の実施態様では、本発明はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダストアレルギーを治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。
本発明はまた動物における過敏症を治療し、予防し及び/又は減弱する方法に使用される薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、免疫学的に有効な量の本発明組成物を薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤と共に含有し、あるいはそれらからなる。薬学的組成物はまたアジュバントを含有していてもよい。
更なる実施態様では、上記薬学的組成物は本発明の組成物の徐放製剤を含む。徐放製剤は当該分野でよく知られている。典型的で好ましい徐放製剤は、微小粒子、エマルジョン、及びゲルとして製剤された本発明の組成物である。
一実施態様では、本発明はアトピー性湿疹を治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。他の実施態様では、本発明は喘息を治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。他の実施態様では、本発明はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダストアレルギーを治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。
当業者には理解されるように、本発明の組成物が動物に投与される場合、それらは、塩、バッファー、アジュバント又は組成物の効能を改善するために望ましい他の物質を含む組成物の形態であってよい。薬学的組成物の調製に使用するのに適した物質の例は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol,A編, Mack Publishing Co., (1990))を含む多数の情報源に与えられている。
様々なアジュバントが宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され得、限定するものではないが、フロイント(完全及び不完全)、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCC(カルメット・ゲラン桿菌)及びコリネバクテリウム・パルバムが含まれる。このようなアジュバントはまた当該分野でよく知られている。 本発明の組成物と共に投与することができる更なるアジュバントには、限定されるものではないが、モノホスホリル脂質免疫調節物質、AdjuVax100a、QS−21、QS−18、CRL1005、アルミニウム塩(Alum)、MF−59、OM−174、OM−197、OM−294、イソマトリックス(isomatrix)、及びビロソームアジュバント技術が含まれる。アジュバントはまたこれらの物質の混合物を含みうる。
南アフリカの木Quillaja(キラヤ)Saponaria Molinaの樹皮から得られたアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン画分は当該分野で知られている。例えばQA21としても知られているQS21はQuillaja Saponaria Molinaの木からのHplc精製画分であり、その製造方法は(QA21として)米国特許第5057540号に開示されている。キラヤサポニンはまたScott等, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409によってアジュバントとして開示されている。モノホスホリル脂質Aとその誘導体は当該分野で知られている。好ましい誘導体は3デ-O-アシル化モノホスホリル脂質Aであり、英国特許第2220211号から知られている。更に好ましいアジュバントは、その開示を出典明示によりここに援用する国際公開第00/00462号に記載されている。
様々なアジュバントが宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され得、限定するものではないが、フロイント(完全及び不完全)、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCC(カルメット・ゲラン桿菌)及びコリネバクテリウム・パルバムが含まれる。このようなアジュバントはまた当該分野でよく知られている。 本発明の組成物と共に投与することができる更なるアジュバントには、限定されるものではないが、モノホスホリル脂質免疫調節物質、AdjuVax100a、QS−21、QS−18、CRL1005、アルミニウム塩(Alum)、MF−59、OM−174、OM−197、OM−294、イソマトリックス(isomatrix)、及びビロソームアジュバント技術が含まれる。アジュバントはまたこれらの物質の混合物を含みうる。
南アフリカの木Quillaja(キラヤ)Saponaria Molinaの樹皮から得られたアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン画分は当該分野で知られている。例えばQA21としても知られているQS21はQuillaja Saponaria Molinaの木からのHplc精製画分であり、その製造方法は(QA21として)米国特許第5057540号に開示されている。キラヤサポニンはまたScott等, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409によってアジュバントとして開示されている。モノホスホリル脂質Aとその誘導体は当該分野で知られている。好ましい誘導体は3デ-O-アシル化モノホスホリル脂質Aであり、英国特許第2220211号から知られている。更に好ましいアジュバントは、その開示を出典明示によりここに援用する国際公開第00/00462号に記載されている。
本発明の組成物は、その投与がレシピエント個体によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能である」と言える。更に、本発明の組成物は、「治療的に有効な量」(すなわち、所望の生理学的効果を生じる量)で投与される。
本発明の組成物は、当該分野で知られている様々な方法によって投与することができる。選択される特定の形式は、選択される特定の組成物、治療される症状の重篤度、及び治療効果に必要とされる用量に当然ながら依存する。本発明の方法は、一般的に述べると、臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生じる任意の形態を意味する、医学的に許容される投与形式の任意のものを使用して実施することができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、大槽内、膣内、腹膜内、局所(粉末、軟膏、滴下剤又は経皮パッチによって)、頬投与、あるいは経口又は点鼻薬としての投与がある。ここで使用される「非経口的」なる用語は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。微小粒子を含む組成物は好ましくは皮下、静脈内、皮内、腹腔内に注射され、鼻腔内、経口、経皮又は吸入投与される。
本発明の組成物は、当該分野で知られている様々な方法によって投与することができる。選択される特定の形式は、選択される特定の組成物、治療される症状の重篤度、及び治療効果に必要とされる用量に当然ながら依存する。本発明の方法は、一般的に述べると、臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生じる任意の形態を意味する、医学的に許容される投与形式の任意のものを使用して実施することができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、大槽内、膣内、腹膜内、局所(粉末、軟膏、滴下剤又は経皮パッチによって)、頬投与、あるいは経口又は点鼻薬としての投与がある。ここで使用される「非経口的」なる用語は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。微小粒子を含む組成物は好ましくは皮下、静脈内、皮内、腹腔内に注射され、鼻腔内、経口、経皮又は吸入投与される。
投与用の組成物の成分には、滅菌水溶液(例えば、生理食塩水)又は非水溶液及び懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
用量レベルは、投与形式、患者の性質、及び担体/アジュバント製剤の質に依存する。典型的な量は、患者当たり約0.001μgから約20mgの範囲内である。好ましい量は、一回の投与当たり50μgから1000μg、より好ましくは100μgから600μg、最も好ましくは300μgの本発明の組成物である。少なくとも約10μg〜約500μgである。被験者を免疫化するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。更に好ましい量は、一患者当たり少なくとも約50μgから約500μg、最も好ましくは一患者当たり300μgである。患者を治療するためには複数回の投与が好ましく、プロトコルは当該患者に適合させた当該分野で標準的なものである。上記組成物又は上記薬学的組成物の投与は、数回、好ましくは少なくとも3回から10回、最も好ましくは3回から5回、毎週、毎月又は毎年の間隔で、好ましくは約1週間から約1ヶ月、より好ましくは2週間に一回、最も好ましくは毎週の間隔で繰り返される。非常に好ましい実施態様では、上記組成物又は上記薬学的組成物の投与は毎週間隔で6回繰り返され、好ましくはそれぞれの場合に50μgから約500μg、最も好ましくは約300μgが投与される。
用量レベルは、投与形式、患者の性質、及び担体/アジュバント製剤の質に依存する。典型的な量は、患者当たり約0.001μgから約20mgの範囲内である。好ましい量は、一回の投与当たり50μgから1000μg、より好ましくは100μgから600μg、最も好ましくは300μgの本発明の組成物である。少なくとも約10μg〜約500μgである。被験者を免疫化するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。更に好ましい量は、一患者当たり少なくとも約50μgから約500μg、最も好ましくは一患者当たり300μgである。患者を治療するためには複数回の投与が好ましく、プロトコルは当該患者に適合させた当該分野で標準的なものである。上記組成物又は上記薬学的組成物の投与は、数回、好ましくは少なくとも3回から10回、最も好ましくは3回から5回、毎週、毎月又は毎年の間隔で、好ましくは約1週間から約1ヶ月、より好ましくは2週間に一回、最も好ましくは毎週の間隔で繰り返される。非常に好ましい実施態様では、上記組成物又は上記薬学的組成物の投与は毎週間隔で6回繰り返され、好ましくはそれぞれの場合に50μgから約500μg、最も好ましくは約300μgが投与される。
本発明の組成物は簡便には単位用量形態で提供することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。該方法は、本発明の組成物を、一又は複数の補助成分を構成する担体と組み合わせる工程を含む。一般に、該組成物は、本発明の組成物を均一かつ十分に液状担体、微細固形担体、又は両方と組合せ、ついで必要に応じて、生成物の形状を整えることによって調製される。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤又はトローチ剤などの、分離した単位として提供でき、それぞれが予め定まった量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性液体又は非水性液体に懸濁させた懸濁液、例えばシロップ、エリキシル剤又はエマルジョンなどがある。
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含みうる。このような系によって、上述の本発明の組成物の繰返し投与を避けることができ、患者及び医師に対する利便性が高まる。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤又はトローチ剤などの、分離した単位として提供でき、それぞれが予め定まった量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性液体又は非水性液体に懸濁させた懸濁液、例えばシロップ、エリキシル剤又はエマルジョンなどがある。
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含みうる。このような系によって、上述の本発明の組成物の繰返し投与を避けることができ、患者及び医師に対する利便性が高まる。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
本発明の更なる側面は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける、過敏症、好ましくはアトピー性湿疹、アトピー性喘息又はIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)を著領する方法であり、該方法は上記動物に(i)粒子とISS-NAを含む組成物であって、上記粒子に上記ISS-NAがパッケージされたもの又は(ii)組成物(i)の免疫学的に有効な量を薬学的に許容可能な希釈剤と共に含有する薬学的組成物を導入することを含み、好ましくは上記薬学的組成物(ii)は更にアジュバントを含む。好ましい実施態様では、上記組成物(i)又は上記薬学的組成物(ii)は上記動物に皮下的、筋肉内、静脈内、鼻腔内、又はリンパ節に直接、導入される。更に好ましい実施態様では、組成物(i)又は薬学的組成物(ii)の上記動物への上記導入は、1週間から3ヶ月、好ましくは1週間の間隔で、少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回、最も好ましくは少なくとも4回、繰り返される。更により好ましい実施態様では、組成物(i)又は薬学的組成物(ii)の上記動物への上記導入は、約1週間の間隔で6回繰り返され、好ましくは各回に約300μgの上記組成物(i)が導入される。
本発明の好ましい実施態様は、動物におけるアレルギーの治療方法であり、上記方法は、(a)VLP;及び(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有する組成物を上記動物に導入することを含み、上記ウイルス様粒子(a)には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)がパッケージされ、上記アレルギーが好ましくはアトピー性湿疹、喘息又はI型アレルギー、好ましくは花粉アレルギー(花粉症)であり、更に上記VLPはRNAバクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)は専らホスホジエステル結合ヌクレオチド、最も好ましくは配列番号27からなる。
本発明の好ましい実施態様は、動物におけるアレルギーの治療方法であり、上記方法は、(a)VLP;及び(b)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含有する組成物を上記動物に導入することを含み、上記ウイルス様粒子(a)には上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)がパッケージされ、上記アレルギーが好ましくはアトピー性湿疹、喘息又はI型アレルギー、好ましくは花粉アレルギー(花粉症)であり、更に上記VLPはRNAバクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(b)は専らホスホジエステル結合ヌクレオチド、最も好ましくは配列番号27からなる。
特定の疾患に対する本発明の治療の効果は、当該分野で知られている標準的な方法を使用して、上記疾患に関連する症状の重篤度を評価することによって評価することができる。一般的に、症状は、治療の開始前、つまり最初のワクチン接種の前、治療中の間隔において、及び最後の治療の1から3ヶ月後に直接スコア付けされる。アトピー性皮膚炎の症状は例えば、N. Engl. J. Med 1997, 337:816-21に記載されているようにしてスコア付けできる。喘息の症状は、Juniper等, Health Qual. Life Outcomes, 2005 Sep 16, 3:58に記載された質問状及びN. Engl. J. Med 2000, 343:1054-63に記載された質問状と肺機能のスパイトメトリー測定の組合せを含む様々な方法によってスコア付けされうる。これらの文献は出典明示によりここに援用される。花粉アレルギーは、とりわけ、鼻粘膜誘発試験を使用して評価することができ、他のアレルギー、例えばハウスダスト又はチリダニアレルギーは結膜誘発手順又は皮膚プリックテストを使用して評価することができる。これらの試験方法は実施例のセクションに詳細に記載する。
本発明の更なる側面は、動物における過敏症の治療のための医薬の製造における、本発明の組成物又は本発明の薬学的組成物の使用であり、上記過敏症はアレルギーであり、更に好ましくは上記アレルギーは、(a)アトピー性湿疹;(b)アトピー性喘息;及び(c)IgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー(花粉症)又はハウスダストアレルギーからなる群から選択される。
本発明の好ましい実施態様は、動物における過敏症の治療のための医薬の製造における、粒子とISS-NAを含有し、該粒子に上記ISS-NAがパッケージされた組成物の使用であり、過敏症は、(a)アトピー性湿疹;(b)アトピー性喘息;及び(c)IgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー(花粉症)からなる群から好ましくは選択され、更に好ましくは、上記粒子は、RNAバクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、より好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号28のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)である。
本発明の好ましい実施態様は、動物における過敏症の治療のための医薬の製造における、粒子とISS-NAを含有し、該粒子に上記ISS-NAがパッケージされた組成物の使用であり、過敏症は、(a)アトピー性湿疹;(b)アトピー性喘息;及び(c)IgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー(花粉症)からなる群から好ましくは選択され、更に好ましくは、上記粒子は、RNAバクテリオファージ、好ましくはRNAバクテリオファージQβのVLPであり、好ましくは上記ISS-NAは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、より好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは配列番号28のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはG10(配列番号27)である。
上記粒子がバクテリオファージQβのVLPである全ての側面と実施態様において、特に本発明の全ての組成物、方法、プロセス及び使用において、上記VLPは好ましくは本質的に配列番号3のアミノ酸配列を有するコートタンパク質からなる。上記ISS-NAが非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)である全ての側面と実施態様において、特に本発明の全ての組成物、方法、プロセス及び使用において、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる。
上記粒子がバクテリオファージQβのVLPであり、上記ISS-NAが非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)である全ての側面と実施態様において、特に本発明の全ての組成物、方法、プロセス及び使用において、バクテリオファージQβの上記VLPは好ましくは本質的に配列番号3のアミノ酸配列を有するコートタンパク質からなり、更に好ましくは、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる。
上記粒子がバクテリオファージQβのVLPであり、上記ISS-NAが非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)である全ての側面と実施態様において、特に本発明の全ての組成物、方法、プロセス及び使用において、バクテリオファージQβの上記VLPは好ましくは本質的に配列番号3のアミノ酸配列を有するコートタンパク質からなり、更に好ましくは、上記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる。
次の実施例は例示のためだけのものであり、特許請求の範囲によって定まる発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な変形と変更を本発明の方法においてなすことができることは当業者には明らかであろう。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲に入る限り、本発明の変形例と変更例及びその均等物をカバーすることが意図される。
特段の記載がない限り、実施例において使用したバクテリオファージQβのVLPは、配列番号3のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から本質的になるVLPである。更に、特段の記載がない限り、実施例において使用した非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)は専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)である。
ここで言及される全ての特許、特許出願及び文献は明示的に出典明示によりその全体を援用する。
ここで言及される全ての特許、特許出願及び文献は明示的に出典明示によりその全体を援用する。
(実施例1)
AP205VLP及びQbVLP中へのCpG-DNA1668のパッケージ化の実施例
細菌で産生させたVLPは、自己組織化に無作為にVLP中にパッケージ化された高レベルの一本鎖RNAを含んでおり、これは、RNA/DNA又はタンパク質の検出のために臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色された1%アガロースゲルで可視化できる。RNAは、RNエースAを用いた消化によって、CpG DNAのパッケージ化の前にVLPから除去されなければならない。従って、20mMのHEPES,pH7.4中の1mg/mlのVLPを300μgのRNエースAと共に37℃で3時間、インキュベートした。RNエースA(及び加水分解したRNA)の除去のために、VLPを、100'000又は300'000MWカットオフ膜を使用して20mMのHEPESに対して2−3日透析した。ついで、空になったVLPにCpG-オリゴヌクレオチド1668-CpG(TCCATGACGTTCCTGAATAAT,配列番号80)を補填し、これを100nmolのCpGを用いてホスホロチオエート骨格によって保護し(1mlのVLP(20mMのHEPES,pH7.4中に1mg/ml,2mMのMgCl2)、37℃で3時間のインキュベーション中に粒子内に自由拡散させた。CpGオリゴヌクレオチド含有VLPをVLPを、300'000MWカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過を介して未結合CpG-オリゴヌクレオチドから精製した。臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色された1%のアガロースゲルはRNAの除去に続くCpGのVLP中へのパッケージ化を可視化させ、未結合のCpGの除去を証明した。
AP205VLP及びQbVLP中へのCpG-DNA1668のパッケージ化の実施例
細菌で産生させたVLPは、自己組織化に無作為にVLP中にパッケージ化された高レベルの一本鎖RNAを含んでおり、これは、RNA/DNA又はタンパク質の検出のために臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色された1%アガロースゲルで可視化できる。RNAは、RNエースAを用いた消化によって、CpG DNAのパッケージ化の前にVLPから除去されなければならない。従って、20mMのHEPES,pH7.4中の1mg/mlのVLPを300μgのRNエースAと共に37℃で3時間、インキュベートした。RNエースA(及び加水分解したRNA)の除去のために、VLPを、100'000又は300'000MWカットオフ膜を使用して20mMのHEPESに対して2−3日透析した。ついで、空になったVLPにCpG-オリゴヌクレオチド1668-CpG(TCCATGACGTTCCTGAATAAT,配列番号80)を補填し、これを100nmolのCpGを用いてホスホロチオエート骨格によって保護し(1mlのVLP(20mMのHEPES,pH7.4中に1mg/ml,2mMのMgCl2)、37℃で3時間のインキュベーション中に粒子内に自由拡散させた。CpGオリゴヌクレオチド含有VLPをVLPを、300'000MWカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過を介して未結合CpG-オリゴヌクレオチドから精製した。臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色された1%のアガロースゲルはRNAの除去に続くCpGのVLP中へのパッケージ化を可視化させ、未結合のCpGの除去を証明した。
実施例2
オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)の脱凝集及び凝集と凝集状態の分析
脱凝集(10.0mlスケール,260μMのG10,25mMのNaOH,50℃,70分):
45.91mgのG10を15mlの試験管中に計量した。粉末を11.0mlの精製水(c=325.3μM;光度計で検出)に溶解させた。8.0mlのオリゴヌクレオチド溶液を、250μlの1MのNaOH及び1.75mlの精製水と15mlの試験管中において(260μMのG10,25mMのNaOH)混合した。水浴中にて混合物を50℃で70分間、脱凝縮させた。氷で溶液を冷却した後、0.5MのHClを用いてpHをpH5.31まで調節し;540μlの0.5MのHClと5μlの1MのNaOHを加えた。
オリゴヌクレオチドG10(配列番号27)の脱凝集及び凝集と凝集状態の分析
脱凝集(10.0mlスケール,260μMのG10,25mMのNaOH,50℃,70分):
45.91mgのG10を15mlの試験管中に計量した。粉末を11.0mlの精製水(c=325.3μM;光度計で検出)に溶解させた。8.0mlのオリゴヌクレオチド溶液を、250μlの1MのNaOH及び1.75mlの精製水と15mlの試験管中において(260μMのG10,25mMのNaOH)混合した。水浴中にて混合物を50℃で70分間、脱凝縮させた。氷で溶液を冷却した後、0.5MのHClを用いてpHをpH5.31まで調節し;540μlの0.5MのHClと5μlの1MのNaOHを加えた。
凝集(10.0mlスケール,175μMのG10,250mMのNaOH,85℃,9−24分):
7.1mlの脱凝縮G10溶液、2.13mlの精製水及び770μlの3MのNaClを15mlの試験管中で混合した(175μMオリゴ,250mMのNa+)。混合物を水浴中にて85℃で9分間、インキュベートした。溶液を氷/水浴で冷却し、使用するまで氷上に保存した。凝集オリゴヌクレオチド溶液は調製から3時間以内に使用されなければならない。
7.1mlの脱凝縮G10溶液、2.13mlの精製水及び770μlの3MのNaClを15mlの試験管中で混合した(175μMオリゴ,250mMのNa+)。混合物を水浴中にて85℃で9分間、インキュベートした。溶液を氷/水浴で冷却し、使用するまで氷上に保存した。凝集オリゴヌクレオチド溶液は調製から3時間以内に使用されなければならない。
G10の定量:
340nmでの吸収によって補正した260nmでの紫外線吸収によってG10を定量した。1A260−340=27.8μg/ml。
凝集状態の分析:
G10の凝集状態を、標準としてQβカプシドを使用し、次の条件を使用するHPLCによって分析した。
カラム: TSKge l5000PWXL 7.8mm×30.0cm
(ロット:5PWX06GNMH3304,Art:08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤: PBS pH7.2
注入体積: 40.0μl
流量: 0.8ml/分
勾配: 均一濃度
遂行時間: 20分
波長: 215,260及び280nm,
260nmでデータ評価
カラムオーブン温度: 25℃
オートサンプラー温度: 8℃
340nmでの吸収によって補正した260nmでの紫外線吸収によってG10を定量した。1A260−340=27.8μg/ml。
凝集状態の分析:
G10の凝集状態を、標準としてQβカプシドを使用し、次の条件を使用するHPLCによって分析した。
カラム: TSKge l5000PWXL 7.8mm×30.0cm
(ロット:5PWX06GNMH3304,Art:08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤: PBS pH7.2
注入体積: 40.0μl
流量: 0.8ml/分
勾配: 均一濃度
遂行時間: 20分
波長: 215,260及び280nm,
260nmでデータ評価
カラムオーブン温度: 25℃
オートサンプラー温度: 8℃
G10の相対保持時間X%は次のようにして計算した: X%=ピーク開始時間[分]/保持時間(Qβカプシド)[分]×100%。
脱凝集G10は138%の相対保持時間を示した(136.9−140.3%;n=5)。上に記載した脱凝集/凝集処理を受けていないG10調製物は同じ範囲での相対保持時間を示す。脱凝縮及び凝縮後、G10の相対保持時間は118%であることが分かった。
脱凝集G10は138%の相対保持時間を示した(136.9−140.3%;n=5)。上に記載した脱凝集/凝集処理を受けていないG10調製物は同じ範囲での相対保持時間を示す。脱凝縮及び凝縮後、G10の相対保持時間は118%であることが分かった。
実施例3
QβVLPの分解:
PBS(20mMのホスフェート,150mMのNaCl,pH7.5)中の45mgのQβVLP(2.5mg/ml,Bradford分析で定量)を、撹拌条件下で室温にて15分間、10mMのDTTで還元させた。ついで、塩化マグネシウムを0.7Mの最終濃度になるまで加え、インキュベーションを撹拌しながら室温で15分間継続させると、カプセル化宿主細胞RNAが沈殿し、同時にVLPの崩壊が生じた。その溶液を4℃にて4000rpmで10分間、遠心分離し(エッペンドルフ5810R,固定角度ロータA−4−62を次の全工程で使用)、溶液から沈殿したRNAを除去した。放出された二量体Qβコートタンパク質を含む上清をクロマトグラフィー精製工程に使用した。
QβVLPの分解:
PBS(20mMのホスフェート,150mMのNaCl,pH7.5)中の45mgのQβVLP(2.5mg/ml,Bradford分析で定量)を、撹拌条件下で室温にて15分間、10mMのDTTで還元させた。ついで、塩化マグネシウムを0.7Mの最終濃度になるまで加え、インキュベーションを撹拌しながら室温で15分間継続させると、カプセル化宿主細胞RNAが沈殿し、同時にVLPの崩壊が生じた。その溶液を4℃にて4000rpmで10分間、遠心分離し(エッペンドルフ5810R,固定角度ロータA−4−62を次の全工程で使用)、溶液から沈殿したRNAを除去した。放出された二量体Qβコートタンパク質を含む上清をクロマトグラフィー精製工程に使用した。
カチオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによるQβコートタンパク質の精製:
二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残留宿主細胞RNAを含む分解反応の上清をSP-セファロースFFカラム(xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience)に充填した。カラムを20mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH7)で平衡にし、試料を水に1:15で希釈し、カラムへのコートタンパク質の適切な結合を達成するために10mS/cm以下に伝導率を調節した。結合コートタンパク質の溶出は、20mMリン酸ナトリウム/500mM塩化ナトリウムの一ステップ勾配によって達成し、タンパク質をおよそ25mlの画分体積で収集した。全工程中においてクロマトグラフィーを5ml/分の流量で室温にて実施し、260nm及び280nmの吸光度をモニターした。第二の工程では、単離されたQβコートタンパク質(カチオン交換カラムからの溶出画分)を、20mMのリン酸ナトリウム/250mMの塩化ナトリウム、pH7.2で平衡にしたセファクリルS-100HRカラム(xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience)に充填した。クロマトグラフィーを2.5ml/分の流量で室温にて実施し、260nm及び280nmの吸光度をモニターした。5mlの画分を集めた。
二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残留宿主細胞RNAを含む分解反応の上清をSP-セファロースFFカラム(xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience)に充填した。カラムを20mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH7)で平衡にし、試料を水に1:15で希釈し、カラムへのコートタンパク質の適切な結合を達成するために10mS/cm以下に伝導率を調節した。結合コートタンパク質の溶出は、20mMリン酸ナトリウム/500mM塩化ナトリウムの一ステップ勾配によって達成し、タンパク質をおよそ25mlの画分体積で収集した。全工程中においてクロマトグラフィーを5ml/分の流量で室温にて実施し、260nm及び280nmの吸光度をモニターした。第二の工程では、単離されたQβコートタンパク質(カチオン交換カラムからの溶出画分)を、20mMのリン酸ナトリウム/250mMの塩化ナトリウム、pH7.2で平衡にしたセファクリルS-100HRカラム(xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience)に充填した。クロマトグラフィーを2.5ml/分の流量で室温にて実施し、260nm及び280nmの吸光度をモニターした。5mlの画分を集めた。
分析的サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Qβコートタンパク質の特徴付け:
精製したQβコートタンパク質の試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し(図1C)、i)インタクトなQβVLP (図1A)(これは、大腸菌可溶化液から精製し、精製手順に対するソース材料として使用した)、及びii)分解反応の上清(図1B)と比較した。コートタンパク質からのRNA分子の効果的な分離は、図1CにおいてRNA様ピーク(典型比A280/A260=0.5)がなく、独特のタンパク質様ピーク(典型比A280/A260=1.7)が存在することによって示されている。
精製したQβコートタンパク質の試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し(図1C)、i)インタクトなQβVLP (図1A)(これは、大腸菌可溶化液から精製し、精製手順に対するソース材料として使用した)、及びii)分解反応の上清(図1B)と比較した。コートタンパク質からのRNA分子の効果的な分離は、図1CにおいてRNA様ピーク(典型比A280/A260=0.5)がなく、独特のタンパク質様ピーク(典型比A280/A260=1.7)が存在することによって示されている。
ダイアフィルトレーションによるQβG10の構築:
精製されたコートタンパク質(20mMのリン酸ナトリウム、pH7.2、250mMのNaCl中)を水、尿素、NaCl、DTTの原液及び凝集G10オリゴヌクレオチド(本質的に実施例2に記載されたようにして調製したもの)と混合した。混合物の容積は50mlで、成分の最終濃度は、コートタンパク質1mg/ml、尿素1.0M、NaCl 250mM、DTT 2.5mM及びG10 0.24mg/mlであった。ついで、溶液を、30kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)及び10ml/分のクロスフロー流量及び2.5ml/分の透過流量を使用して、300mlの20mMリン酸ナトリウム、250mMのNaCl、pH7.2に対して室温で透析濾過した。H2O2を7mMの最終濃度になるまで加え、その溶液を室温で1時間インキュベートしてジスルフィド結合を生じさせた。ついで、その溶液を、300kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)及び10ml/分のクロスフロー流量及び2.5ml/分の透過流量を使用して、500mlの20mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.2に対して透析濾過し、構築されたQβG10産物から過剰のH2O2と非パッケージ化G10オリゴヌクレオチドを除去した。
精製されたコートタンパク質(20mMのリン酸ナトリウム、pH7.2、250mMのNaCl中)を水、尿素、NaCl、DTTの原液及び凝集G10オリゴヌクレオチド(本質的に実施例2に記載されたようにして調製したもの)と混合した。混合物の容積は50mlで、成分の最終濃度は、コートタンパク質1mg/ml、尿素1.0M、NaCl 250mM、DTT 2.5mM及びG10 0.24mg/mlであった。ついで、溶液を、30kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)及び10ml/分のクロスフロー流量及び2.5ml/分の透過流量を使用して、300mlの20mMリン酸ナトリウム、250mMのNaCl、pH7.2に対して室温で透析濾過した。H2O2を7mMの最終濃度になるまで加え、その溶液を室温で1時間インキュベートしてジスルフィド結合を生じさせた。ついで、その溶液を、300kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)及び10ml/分のクロスフロー流量及び2.5ml/分の透過流量を使用して、500mlの20mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.2に対して透析濾過し、構築されたQβG10産物から過剰のH2O2と非パッケージ化G10オリゴヌクレオチドを除去した。
実施例4
QβG10パッケージ化産物の分析とパッケージ化法の収率の決定
分析的サイズ排除クロマトグラフィーによるパッケージ化QβVLPの特徴付け:
パッケージ化QβVLPの試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し(図2)、大腸菌溶解化液から精製したインタクトなQβVLPと比較した。生成物中の正しく組み立てられたVLPの存在を、天然QβVLPを表すピークと同じ保持時間で移動するピークによって確認した。QβG10VLP(図2D)に対して観察されたピークは、260nmでの核酸の吸収係数がコートタンパク質の吸収係数より100倍以上高いため、VLPの核酸量によって占められている。精製されたQβG10VLPの比A260/A280は1.70(1.65−1.76;n=5)であることが見出され、これはG10(A260/A280=1.74)に特徴的であり、QβVLPの比A260/A280は1.87(1.85−1.90;n=10)であることが見出され、これはRNAに特徴的である。
QβG10パッケージ化産物の分析とパッケージ化法の収率の決定
分析的サイズ排除クロマトグラフィーによるパッケージ化QβVLPの特徴付け:
パッケージ化QβVLPの試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し(図2)、大腸菌溶解化液から精製したインタクトなQβVLPと比較した。生成物中の正しく組み立てられたVLPの存在を、天然QβVLPを表すピークと同じ保持時間で移動するピークによって確認した。QβG10VLP(図2D)に対して観察されたピークは、260nmでの核酸の吸収係数がコートタンパク質の吸収係数より100倍以上高いため、VLPの核酸量によって占められている。精製されたQβG10VLPの比A260/A280は1.70(1.65−1.76;n=5)であることが見出され、これはG10(A260/A280=1.74)に特徴的であり、QβVLPの比A260/A280は1.87(1.85−1.90;n=10)であることが見出され、これはRNAに特徴的である。
SDS-PAGE分析によるパッケージ化QβG10VLPの特徴付け:
パッケージされたQβG10の試料を非還元的SDS-PAGEにより分析し(図3)、大腸菌可溶化液から精製したインタクトなQβVLPと比較した。生成物中における正しく組み立てられたVLPの存在は、インビトロで組み立てられたQβG10VLP中のコートタンパク質の正確な構造的配置を示すインタクトなQβVLPと同様に、コートタンパク質のジスルフィド結合五量体及び六量体形態のバンドの生成によって確認された。
パッケージされたQβG10の試料を非還元的SDS-PAGEにより分析し(図3)、大腸菌可溶化液から精製したインタクトなQβVLPと比較した。生成物中における正しく組み立てられたVLPの存在は、インビトロで組み立てられたQβG10VLP中のコートタンパク質の正確な構造的配置を示すインタクトなQβVLPと同様に、コートタンパク質のジスルフィド結合五量体及び六量体形態のバンドの生成によって確認された。
パッケージ化オリゴヌクレオチドG10の定量:
QβG10VLP(PBS中0.25mg/ml)の試料を0.1mMのTCEPで処理し(室温で15分)、ジスルフィド結合を還元した。NaClを還元された試料(1Mの最終濃度)に加え、混合物を60℃で15分間インキュベートしてタンパク質成分を沈殿させた。遠心分離後、得られた上清を95℃で5分間インキュベートし、氷で1分冷却して、A260値を測定した。上清中のオリゴヌクレオチドG10の濃度を次の式に従って計算した:
c(G10)(mg/ml)=A260×1.12×9600/344580
ここで、
1.12=試料中の塩含量に対する修正因子
9600=オリゴヌクレオチドG10の分子量
344580=オリゴヌクレオチドG10の比モル吸収係数
典型的には、パッケージ化オリゴヌクレオチドG10の量はQβコートタンパク質1mg当たり0.2mgであった。
QβG10VLP(PBS中0.25mg/ml)の試料を0.1mMのTCEPで処理し(室温で15分)、ジスルフィド結合を還元した。NaClを還元された試料(1Mの最終濃度)に加え、混合物を60℃で15分間インキュベートしてタンパク質成分を沈殿させた。遠心分離後、得られた上清を95℃で5分間インキュベートし、氷で1分冷却して、A260値を測定した。上清中のオリゴヌクレオチドG10の濃度を次の式に従って計算した:
c(G10)(mg/ml)=A260×1.12×9600/344580
ここで、
1.12=試料中の塩含量に対する修正因子
9600=オリゴヌクレオチドG10の分子量
344580=オリゴヌクレオチドG10の比モル吸収係数
典型的には、パッケージ化オリゴヌクレオチドG10の量はQβコートタンパク質1mg当たり0.2mgであった。
QβG10VLPのG10含有量とパッケージ化反応の収率計算:
凝集したG10を、実施例3に記載されているようにしてVLPの組立/再構築によってQβVLP中にパッケージ化した。953mgのG10オリゴヌクレオチドを400mgの精製Qβ二量体との再構築のために導入した。反応は、100μgのタンパク質当たり20μgのG10オリゴヌクレオチドを含むQβG10を生じた(タンパク質量はBradford分析又はHPLCで定量した)。パッケージ化反応のG10収率は75%のタンパク質収率で63%であった。
凝集したG10を、実施例3に記載されているようにしてVLPの組立/再構築によってQβVLP中にパッケージ化した。953mgのG10オリゴヌクレオチドを400mgの精製Qβ二量体との再構築のために導入した。反応は、100μgのタンパク質当たり20μgのG10オリゴヌクレオチドを含むQβG10を生じた(タンパク質量はBradford分析又はHPLCで定量した)。パッケージ化反応のG10収率は75%のタンパク質収率で63%であった。
実施例5
分解/再構築によるAP205及びGA355VLPのパッケージ化
分解:
バッファーA(5mMのNaPO4、pH6.8、100mMのNaCl、2mMのMgCl2)中の50−100mgのAP205又はGA355VLP(Bradford分析によって定量)を、それぞれ1mg/ml及び5U/mlのRNエースA(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)と共に30℃で16時間インキュベートした。AP205VLPの場合は、内部ジスルフィド結合の脱酸素を、RNエースAとベンゾナーゼの添加に先立って実施した後、20mMのDTTを添加し、37℃で30分インキュベートした。1MのNaClの添加後、70℃で15分のインキュベーションによってウイルスコートタンパク質の沈殿が誘導された。沈殿したコートタンパク質を、4℃、27000gで10分間遠心分離して沈降させた。RNエースA、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を捨てた。ペレットをバッファーB(20mMのNaPO4、pH7.2,6Mの尿素)中に再懸濁させ、室温で10分間、インキュベートした。
分解/再構築によるAP205及びGA355VLPのパッケージ化
分解:
バッファーA(5mMのNaPO4、pH6.8、100mMのNaCl、2mMのMgCl2)中の50−100mgのAP205又はGA355VLP(Bradford分析によって定量)を、それぞれ1mg/ml及び5U/mlのRNエースA(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)と共に30℃で16時間インキュベートした。AP205VLPの場合は、内部ジスルフィド結合の脱酸素を、RNエースAとベンゾナーゼの添加に先立って実施した後、20mMのDTTを添加し、37℃で30分インキュベートした。1MのNaClの添加後、70℃で15分のインキュベーションによってウイルスコートタンパク質の沈殿が誘導された。沈殿したコートタンパク質を、4℃、27000gで10分間遠心分離して沈降させた。RNエースA、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を捨てた。ペレットをバッファーB(20mMのNaPO4、pH7.2,6Mの尿素)中に再懸濁させ、室温で10分間、インキュベートした。
カチオン交換クロマトグラフィーによるコートタンパク質の精製:
溶液を4℃、27000gで10分間遠心分離して透明にした。 無視できるペレットは捨てた。そして、再構築されたコートタンパク質を含む上清を、バッファーBで平衡にしたSPセファロースTM FFカラム(16/20, Amersham Biosciences)にかけた。通過物を捨てた。バッファーB(15CV)での十分な洗浄後に、カラムを、37.5CVの勾配長で、バッファーBからバッファーC(20mMのNaPO4 pH7.2,1Mの尿素)の線形勾配で調節した。254nm及び280nmでの充填、洗浄及び溶出の間の吸光度をモニターした。コートタンパク質は、バッファーD(20mMのNaPO4 pH6.5,1Mの尿素,300mMのNaCl)での一画分として溶出させ、LDS-PAGEと続くクーマーシー染色によって分析した。溶出タンパク質画分を「分解コートタンパク質」として4℃で保存した。タンパク質濃度はBradford分析によって定量した。
溶液を4℃、27000gで10分間遠心分離して透明にした。 無視できるペレットは捨てた。そして、再構築されたコートタンパク質を含む上清を、バッファーBで平衡にしたSPセファロースTM FFカラム(16/20, Amersham Biosciences)にかけた。通過物を捨てた。バッファーB(15CV)での十分な洗浄後に、カラムを、37.5CVの勾配長で、バッファーBからバッファーC(20mMのNaPO4 pH7.2,1Mの尿素)の線形勾配で調節した。254nm及び280nmでの充填、洗浄及び溶出の間の吸光度をモニターした。コートタンパク質は、バッファーD(20mMのNaPO4 pH6.5,1Mの尿素,300mMのNaCl)での一画分として溶出させ、LDS-PAGEと続くクーマーシー染色によって分析した。溶出タンパク質画分を「分解コートタンパク質」として4℃で保存した。タンパク質濃度はBradford分析によって定量した。
再構築:
精製したAP205又はGA355コートタンパク質をG10オリゴヌクレオチドに対して5倍の過剰量(w/w)で使用した。コートタンパク質を、1Mの尿素と2.5mMのDTTを含む再構築バッファー中のG10オリゴヌクレオチドと混合し、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、再構築混合物を、5リットルのPBSに対して24時間透析した。得られた懸濁液を27000g、4℃で10分間遠心分離した。無視できる沈降物を捨てた。上清は再構築されパッケージ化されたVLPを含んでいた。タンパク質濃度はBradford分析によって定量し、組み立てられパッケージされたVLPを遠心濾過装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)で濃縮した。
精製したAP205又はGA355コートタンパク質をG10オリゴヌクレオチドに対して5倍の過剰量(w/w)で使用した。コートタンパク質を、1Mの尿素と2.5mMのDTTを含む再構築バッファー中のG10オリゴヌクレオチドと混合し、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、再構築混合物を、5リットルのPBSに対して24時間透析した。得られた懸濁液を27000g、4℃で10分間遠心分離した。無視できる沈降物を捨てた。上清は再構築されパッケージ化されたVLPを含んでいた。タンパク質濃度はBradford分析によって定量し、組み立てられパッケージされたVLPを遠心濾過装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)で濃縮した。
再構築されパッケージ化されたVLPの精製:
PBSで平衡にされたセファロースTM CL-4B(26/60, Amersham Biosciences)上に25mgまでの全タンパク質を充填した。1.25ml/分の流量で室温にて平衡バッファーを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出の間、254nmと260nmの吸光度をモニターした。二つのピークが分離された。主要な高分子量のピークが低見かけ分子量の小さなピークの前にあった。主要なピークはSE-HPLCによって示された精製VLPと一致した見かけ分子量を明らかにしていた。G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたAP205又はGA355VLPの分析は、国際公開第03/024481号の実施例16(p.131ff)に本質的に示されているようにして実施される。
PBSで平衡にされたセファロースTM CL-4B(26/60, Amersham Biosciences)上に25mgまでの全タンパク質を充填した。1.25ml/分の流量で室温にて平衡バッファーを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出の間、254nmと260nmの吸光度をモニターした。二つのピークが分離された。主要な高分子量のピークが低見かけ分子量の小さなピークの前にあった。主要なピークはSE-HPLCによって示された精製VLPと一致した見かけ分子量を明らかにしていた。G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたAP205又はGA355VLPの分析は、国際公開第03/024481号の実施例16(p.131ff)に本質的に示されているようにして実施される。
実施例6
分解/再構築によるG10でのFRVLPのパッケージ化
分解:
バッファーA(5mMのNaPO4、pH6.8、100mMのNaCl、2mMのMgCl2)中の50−100mgのFRVLP(Bradford分析によって定量)を、それぞれ1mg/ml及び5U/mlのRNエースA(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)と共に30℃で16時間インキュベートした。1MのNaClの添加後、70℃で15分のインキュベーションによってFRコートタンパク質の沈殿が誘導された。沈殿したコートタンパク質を、4℃、27000gで10分間遠心分離して沈降させた。RNエースA、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を捨てた。ペレットをバッファーB(20mMのNaPO4、pH7.2,6Mの尿素)中に再懸濁させ、室温で10分間、インキュベートした。
分解/再構築によるG10でのFRVLPのパッケージ化
分解:
バッファーA(5mMのNaPO4、pH6.8、100mMのNaCl、2mMのMgCl2)中の50−100mgのFRVLP(Bradford分析によって定量)を、それぞれ1mg/ml及び5U/mlのRNエースA(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)と共に30℃で16時間インキュベートした。1MのNaClの添加後、70℃で15分のインキュベーションによってFRコートタンパク質の沈殿が誘導された。沈殿したコートタンパク質を、4℃、27000gで10分間遠心分離して沈降させた。RNエースA、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を捨てた。ペレットをバッファーB(20mMのNaPO4、pH7.2,6Mの尿素)中に再懸濁させ、室温で10分間、インキュベートした。
カチオン交換クロマトグラフィーによるFRコートタンパク質の精製:
溶液を4℃、27000gで10分間遠心分離して透明にした。 無視できるペレットは捨て、再構築されたコートタンパク質を含む上清を、バッファーBで平衡にしたSPセファロースTM FFカラム(16/20, Amersham Biosciences)にかけた。通過物を捨てた。バッファーB(15CV)での十分な洗浄後に、カラムを、37.5CVの勾配長で、バッファーBからバッファーC(20mMのNaPO4 pH7.2,1Mの尿素)の線形勾配で調節した。254nm及び280nmでの充填、洗浄及び溶出の間での吸光度をモニターした。FRコートタンパク質は、バッファーD(20mMのNaPO4 pH6.5,1Mの尿素,300mMのNaCl)での一画分として溶出させ、LDS-PAGEと続くクーマーシー染色によって分析した。溶出タンパク質画分を「分解コートタンパク質」として4℃で保存した。タンパク質濃度はBradford分析によって定量した。
溶液を4℃、27000gで10分間遠心分離して透明にした。 無視できるペレットは捨て、再構築されたコートタンパク質を含む上清を、バッファーBで平衡にしたSPセファロースTM FFカラム(16/20, Amersham Biosciences)にかけた。通過物を捨てた。バッファーB(15CV)での十分な洗浄後に、カラムを、37.5CVの勾配長で、バッファーBからバッファーC(20mMのNaPO4 pH7.2,1Mの尿素)の線形勾配で調節した。254nm及び280nmでの充填、洗浄及び溶出の間での吸光度をモニターした。FRコートタンパク質は、バッファーD(20mMのNaPO4 pH6.5,1Mの尿素,300mMのNaCl)での一画分として溶出させ、LDS-PAGEと続くクーマーシー染色によって分析した。溶出タンパク質画分を「分解コートタンパク質」として4℃で保存した。タンパク質濃度はBradford分析によって定量した。
再構築:
精製したFRコートタンパク質をG10オリゴヌクレオチドに対して5倍の過剰量(w/w)で使用した。FRコートタンパク質を、1Mの尿素と2.5mMのDTTを含む再構築バッファー中のG10オリゴヌクレオチドと混合し、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、再構築混合物を、5リットルのPBSに対して24時間透析した。得られた懸濁液を27000g、4℃で10分間遠心分離した。無視できる沈降物を捨てた。上清は再構築されパッケージ化されたFRVLPを含んでいた。タンパク質濃度はBradford分析によって定量し、組み立てられパッケージされたFRVLPを遠心濾過装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)で濃縮した。
精製したFRコートタンパク質をG10オリゴヌクレオチドに対して5倍の過剰量(w/w)で使用した。FRコートタンパク質を、1Mの尿素と2.5mMのDTTを含む再構築バッファー中のG10オリゴヌクレオチドと混合し、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、再構築混合物を、5リットルのPBSに対して24時間透析した。得られた懸濁液を27000g、4℃で10分間遠心分離した。無視できる沈降物を捨てた。上清は再構築されパッケージ化されたFRVLPを含んでいた。タンパク質濃度はBradford分析によって定量し、組み立てられパッケージされたFRVLPを遠心濾過装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)で濃縮した。
再構築されパッケージ化されたFRVLPの精製:
PBSで平衡にされたセファロースTM CL-4B(26/60, Amersham Biosciences)上に25mgまでの全タンパク質を充填した。1.25ml/分の流量で室温にて平衡バッファーを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出の間、254nmと260nmの吸光度をモニターした。二つのピークが分離された。主要な高分子量のピークが低見かけ分子量の小さなピークの前にあった。主要なピークはSE-HPLCによって示された精製FRVLPと一致した見かけ分子量を明らかにしていた。G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたFRVLPの分析は、国際公開第03/024481号の実施例16(p.131ff)に本質的に示されているようにして実施される。
PBSで平衡にされたセファロースTM CL-4B(26/60, Amersham Biosciences)上に25mgまでの全タンパク質を充填した。1.25ml/分の流量で室温にて平衡バッファーを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出の間、254nmと260nmの吸光度をモニターした。二つのピークが分離された。主要な高分子量のピークが低見かけ分子量の小さなピークの前にあった。主要なピークはSE-HPLCによって示された精製FRVLPと一致した見かけ分子量を明らかにしていた。G10オリゴヌクレオチドがパッケージされたFRVLPの分析は、国際公開第03/024481号の実施例16(p.131ff)に本質的に示されているようにして実施される。
実施例7
リンパ節へのナノ粒子のサイズ依存性輸送
リンパ節への粒子状抗原の輸送メカニズムを研究するために、20nmから2000nmの範囲のサイズの黄緑色の蛍光ポリスチレンナノ粒子(Molecular probes)を、C57BL/6マウスの足蹠に注射し(25μg/足蹠)、追跡した。バクテリオファージQβのVLPをタンパク質標識キット(Molecular probes)を使用してAlexa488にカップリングさせ、30nmの蛍光粒子として実験に含めた。48時間後に、ナノ粒子とVLPを膝窩流入領域リンパ節(LN)においてフローサイトメトリーによって追跡した。膝窩LNを単離し、1mg/mlのコラゲナーゼD(Boehringer)及び0.04mg/mlのDNエースI(Roche) で37℃にて30分間、消化させた。ナノ粒子を取り込む細胞集団を同定するために、LN細胞を抗CD11c-PE(BD)で染色した。フローサイトメトリー分析によって、注射から48時間後に、ナノ粒子とVLPは膝窩LNに到達し、樹状細胞(DC、表1)を含むLN細胞に異なったレベルで結合することが示された。LN細胞は大きな粒子(1000−2000nm)よりも小さな粒子(20−500)をより効率的に獲得した。VLP-Alexa488(30nm)は20nmと100nmの間のポリスチレンナノ粒子のLN取込み効果を示した。これらのデータは、ナノ粒子とVLPがサイズに依存した形で注射部位からLNまで輸送され、顕著な輸送が20から500nmの間のサイズの粒子で起こることを示唆している。
リンパ節へのナノ粒子のサイズ依存性輸送
リンパ節への粒子状抗原の輸送メカニズムを研究するために、20nmから2000nmの範囲のサイズの黄緑色の蛍光ポリスチレンナノ粒子(Molecular probes)を、C57BL/6マウスの足蹠に注射し(25μg/足蹠)、追跡した。バクテリオファージQβのVLPをタンパク質標識キット(Molecular probes)を使用してAlexa488にカップリングさせ、30nmの蛍光粒子として実験に含めた。48時間後に、ナノ粒子とVLPを膝窩流入領域リンパ節(LN)においてフローサイトメトリーによって追跡した。膝窩LNを単離し、1mg/mlのコラゲナーゼD(Boehringer)及び0.04mg/mlのDNエースI(Roche) で37℃にて30分間、消化させた。ナノ粒子を取り込む細胞集団を同定するために、LN細胞を抗CD11c-PE(BD)で染色した。フローサイトメトリー分析によって、注射から48時間後に、ナノ粒子とVLPは膝窩LNに到達し、樹状細胞(DC、表1)を含むLN細胞に異なったレベルで結合することが示された。LN細胞は大きな粒子(1000−2000nm)よりも小さな粒子(20−500)をより効率的に獲得した。VLP-Alexa488(30nm)は20nmと100nmの間のポリスチレンナノ粒子のLN取込み効果を示した。これらのデータは、ナノ粒子とVLPがサイズに依存した形で注射部位からLNまで輸送され、顕著な輸送が20から500nmの間のサイズの粒子で起こることを示唆している。
実施例8
LNへのVLPの輸送の動態
LN細胞中へのナノ粒子の取り込みの動態を研究するために、VLP-Alexa488(実施例7に記載したようにして調製した)をC57BL/6マウス(実施例7に記載したもの) に注射し、2時間後から96時間後まで追跡した。LN細胞は次の抗体の組合せで染色した:抗CD11c-PE、抗CD11b-APC、抗CD11c-ビオチン、抗CD19-APC、抗B220-PE、抗CD8-CyChr、抗CD40-APC及びストレプトアビジン-CyChr(全てBD由来)。フローサイトメトリー分析は、足蹠への注射の2時間後に、VLP-Alexa488が膝窩LNからの抗原提示細胞(APC)に結合したことを示している(表2)。皮膚由来の樹状細胞がVLP-Alexa488を取り込み2時間という短い間に流入領域LNに輸送することは全く起こりそうになかった。これらの結果は、VLP-Alexa488が無細胞の形でリンパ系を通って流入領域リンパ節に流入したことをむしろ示唆している。マクロファージ及びDCは VLP-Alexa488を取り込む最も顕著な集団であった。最も重要なことは、注射から2時間後に、1.9%のLN常在形質細胞様DCがまたVLP-Alexa488を獲得したことである。ヒトにおけるpDCは大体は二次リンパ系組織に見出され、TLR9を発現する唯一のDC集団である。従って、VLP-Alexa488のLNへ自由に流入する能力は、それらを、VLPにパッケージされたISS(例えばCpG)を同時に移送する可能性を持ち、pDCを標的とする非常に適切なベヒクルとする。
VLP-Alexa488の取り込みは、注射から24時間後にピークに達し(表2)、48時間までかなり安定したままで、96時間後に低下した。その後の時点でまた、皮膚由来DCが流入領域LNへのVLP-Alexa488の輸送に寄与する蓋然性が高い。確かに、VLP-Alexa488の取り込みの2時間(流入)と24時間(DC媒介輸送)の間の比は、LNにおいてもVLPを獲得する(図4)リンパ球(CD11c+CD40loCD8+) DCと比較して、骨髄(皮膚由来CD11c+CD40hiCD8-を含む)について低い。
LNへのVLPの輸送の動態
LN細胞中へのナノ粒子の取り込みの動態を研究するために、VLP-Alexa488(実施例7に記載したようにして調製した)をC57BL/6マウス(実施例7に記載したもの) に注射し、2時間後から96時間後まで追跡した。LN細胞は次の抗体の組合せで染色した:抗CD11c-PE、抗CD11b-APC、抗CD11c-ビオチン、抗CD19-APC、抗B220-PE、抗CD8-CyChr、抗CD40-APC及びストレプトアビジン-CyChr(全てBD由来)。フローサイトメトリー分析は、足蹠への注射の2時間後に、VLP-Alexa488が膝窩LNからの抗原提示細胞(APC)に結合したことを示している(表2)。皮膚由来の樹状細胞がVLP-Alexa488を取り込み2時間という短い間に流入領域LNに輸送することは全く起こりそうになかった。これらの結果は、VLP-Alexa488が無細胞の形でリンパ系を通って流入領域リンパ節に流入したことをむしろ示唆している。マクロファージ及びDCは VLP-Alexa488を取り込む最も顕著な集団であった。最も重要なことは、注射から2時間後に、1.9%のLN常在形質細胞様DCがまたVLP-Alexa488を獲得したことである。ヒトにおけるpDCは大体は二次リンパ系組織に見出され、TLR9を発現する唯一のDC集団である。従って、VLP-Alexa488のLNへ自由に流入する能力は、それらを、VLPにパッケージされたISS(例えばCpG)を同時に移送する可能性を持ち、pDCを標的とする非常に適切なベヒクルとする。
VLP-Alexa488の取り込みは、注射から24時間後にピークに達し(表2)、48時間までかなり安定したままで、96時間後に低下した。その後の時点でまた、皮膚由来DCが流入領域LNへのVLP-Alexa488の輸送に寄与する蓋然性が高い。確かに、VLP-Alexa488の取り込みの2時間(流入)と24時間(DC媒介輸送)の間の比は、LNにおいてもVLPを獲得する(図4)リンパ球(CD11c+CD40loCD8+) DCと比較して、骨髄(皮膚由来CD11c+CD40hiCD8-を含む)について低い。
実施例9
インビボ画像処理によるナノ粒子の輸送の動態
20及び500nmの蛍光ポリスチレンナノ粒子並びにVLP-Alexa488の輸送を、470/40nm励起フィルターと高解像度カメラ (KM_Dynax_5D)を装備したUV光ツール(LT-99D2-220, Lightools Research, CA)を使用して、インビボで調査した。実施例7に記載のようにマウスの足蹠に蛍光ナノ粒子を注射し、注射後2、24及び192時間に写真を撮った。フローサイトメトリーのデータ(表2)と一致して、注射2時間後に、VLP-Alexa488は、蛍光顕微鏡によって検出されているように、膝窩LNに達した。VLP(30nm)と同様、20nmのナノ粒子(表3)もまた検出されており、これは、小さいナノ粒子が無細胞の形でLNに流れることができることを示唆している。これとは対照的に、この初期の時点では500nmのナノ粒子は膝窩LNには検出されておらず(表3)、これは大きな粒子のLNへの遅い輸送動態を証明している。20又は500nmのナノ粒子の注射から2時間後にフローサイトメトリー分析を実施した。これらの結果は、光ツール画像処理での知見を確認している(表3)。500nmの粒子の遅い輸送動態に対する一つの可能性は、それが注射部位でのDC取り込みとLNへの輸送を介して部分的に起こることである。
インビボ画像処理によるナノ粒子の輸送の動態
20及び500nmの蛍光ポリスチレンナノ粒子並びにVLP-Alexa488の輸送を、470/40nm励起フィルターと高解像度カメラ (KM_Dynax_5D)を装備したUV光ツール(LT-99D2-220, Lightools Research, CA)を使用して、インビボで調査した。実施例7に記載のようにマウスの足蹠に蛍光ナノ粒子を注射し、注射後2、24及び192時間に写真を撮った。フローサイトメトリーのデータ(表2)と一致して、注射2時間後に、VLP-Alexa488は、蛍光顕微鏡によって検出されているように、膝窩LNに達した。VLP(30nm)と同様、20nmのナノ粒子(表3)もまた検出されており、これは、小さいナノ粒子が無細胞の形でLNに流れることができることを示唆している。これとは対照的に、この初期の時点では500nmのナノ粒子は膝窩LNには検出されておらず(表3)、これは大きな粒子のLNへの遅い輸送動態を証明している。20又は500nmのナノ粒子の注射から2時間後にフローサイトメトリー分析を実施した。これらの結果は、光ツール画像処理での知見を確認している(表3)。500nmの粒子の遅い輸送動態に対する一つの可能性は、それが注射部位でのDC取り込みとLNへの輸送を介して部分的に起こることである。
注射の24時間後に、500nmの粒子は蛍光顕微鏡で検出したところ流入領域LNに達したが、付随した蛍光は、20nm及びVLP-Alexa488ナノ粒子を注射したマウスのLNにおいてよりも定量的に少なかった。後の時点(192時間)では、VLP-Alexa488、20及び500nm粒子は注射部位と膝窩LNになおも存在しており、抗原の貯蔵所形成と連続的送達を示唆している。
併せると、これらのデータは、ナノ粒子のLNへの輸送のサイズ依存性メカニズムを示唆している。小粒子、例えば20nm及びVLP-Alexa488は無細胞の形で早い時点でLNまで流入する一方、大きな粒子(500nm)はDC媒介輸送の必要性のために遅い動態を示すことを示唆している。
併せると、これらのデータは、ナノ粒子のLNへの輸送のサイズ依存性メカニズムを示唆している。小粒子、例えば20nm及びVLP-Alexa488は無細胞の形で早い時点でLNまで流入する一方、大きな粒子(500nm)はDC媒介輸送の必要性のために遅い動態を示すことを示唆している。
実施例10
LNへのナノ粒子の送達のDC依存性
マクロファージは非遊走性細胞であると考えられ、よってマクロファージを担持する粒子はLNにおいて粒子を獲得したLN常在細胞であると思われる。これに対して、DCは注射部位で粒子を貪食し、流入領域LNまで遊走する能力を有している。ナノ粒子のサイズとLNへの輸送のメカニズムの間の関係を調査するために、20から2000nmの範囲の蛍光ナノ粒子を実施例7に記載したようにマウスの足蹠に注射し、ナノ粒子含有DCとマクロファージの間の比を計算した(図5)。注射した粒子が大きくなればなるほど(500−2000nm)、より多くのDCがLNにおけるその取り込みに関与する。より小さい粒子(20−200nm)は匹敵する割合のDC及びマクロファージで検出されており、細胞フリーの流入とLN常在APCとの結合が示唆される。
野生型マウス及びDCを条件枯渇させたマウス(CD11c-DTR-GFP mice, Jung S.等, 2002)におけるインビボ画像処理動態研究では、大きな粒子(500nm)はDCの存在下でのみ流入領域LNに達する一方、小さい(20nm)ナノ粒子はDC枯渇動物でもまた効果的に輸送されたことが示された。これらのデータは、小さいナノ粒子がリンパ節常在DC集団を標的とすることができることを示唆している。確かに、表4に示されるように、20nmの粒子とVLP(30nm)はリンパ節常在形質細胞様DC(PDCA-1+B220+)、B細胞(PDCA-1−B220+)及びリンパ様DC(CD11c+CD8+)に結合した。従って、小粒子はLN錠剤APCを標的とするのに有用である一方、大きな粒子は専ら注射部位でDCを標的とする。
LNへのナノ粒子の送達のDC依存性
マクロファージは非遊走性細胞であると考えられ、よってマクロファージを担持する粒子はLNにおいて粒子を獲得したLN常在細胞であると思われる。これに対して、DCは注射部位で粒子を貪食し、流入領域LNまで遊走する能力を有している。ナノ粒子のサイズとLNへの輸送のメカニズムの間の関係を調査するために、20から2000nmの範囲の蛍光ナノ粒子を実施例7に記載したようにマウスの足蹠に注射し、ナノ粒子含有DCとマクロファージの間の比を計算した(図5)。注射した粒子が大きくなればなるほど(500−2000nm)、より多くのDCがLNにおけるその取り込みに関与する。より小さい粒子(20−200nm)は匹敵する割合のDC及びマクロファージで検出されており、細胞フリーの流入とLN常在APCとの結合が示唆される。
野生型マウス及びDCを条件枯渇させたマウス(CD11c-DTR-GFP mice, Jung S.等, 2002)におけるインビボ画像処理動態研究では、大きな粒子(500nm)はDCの存在下でのみ流入領域LNに達する一方、小さい(20nm)ナノ粒子はDC枯渇動物でもまた効果的に輸送されたことが示された。これらのデータは、小さいナノ粒子がリンパ節常在DC集団を標的とすることができることを示唆している。確かに、表4に示されるように、20nmの粒子とVLP(30nm)はリンパ節常在形質細胞様DC(PDCA-1+B220+)、B細胞(PDCA-1−B220+)及びリンパ様DC(CD11c+CD8+)に結合した。従って、小粒子はLN錠剤APCを標的とするのに有用である一方、大きな粒子は専ら注射部位でDCを標的とする。
実施例11
骨髄由来樹状細胞(BMDC)の産生とQβG10バッチでの処理
LPS耐性(C3H/HeJ)及びLPS応答性(C3H/HeN)株由来の11週齢のマウスを屠殺し、大腿及び脛骨を単離し、PBS中に保った。肉を除去後、骨を両側から切断し、10%のFCS RPMIを満たしたシリンジを使用して骨髄を流し出した。放出された細胞を集め、70μmの細胞ストレーナーを通過させた。細胞を洗浄し、10ng/mlのマウスGM-CSF(R&D)を含む10%のFCS RPMI中に20×104細胞/mlで再懸濁させた。20×106細胞を6日間、10mlの培地中の細菌グレードのペトリ皿に蒔いた。CD11c及びCD11bの発現についてフローサイトメトリーによって細胞を分析することによって、BMDCの分化状態を6日目に確認した。分化の6日目に、BMDCをペトリ皿から回収し、一回洗浄し、5×104/ウェルで96ウェルのU底プレート(BD)に蒔いた。QβG10の6の希釈物(4倍)を別のプレートに調製し、20時間の間、BMDCに加えた。
骨髄由来樹状細胞(BMDC)の産生とQβG10バッチでの処理
LPS耐性(C3H/HeJ)及びLPS応答性(C3H/HeN)株由来の11週齢のマウスを屠殺し、大腿及び脛骨を単離し、PBS中に保った。肉を除去後、骨を両側から切断し、10%のFCS RPMIを満たしたシリンジを使用して骨髄を流し出した。放出された細胞を集め、70μmの細胞ストレーナーを通過させた。細胞を洗浄し、10ng/mlのマウスGM-CSF(R&D)を含む10%のFCS RPMI中に20×104細胞/mlで再懸濁させた。20×106細胞を6日間、10mlの培地中の細菌グレードのペトリ皿に蒔いた。CD11c及びCD11bの発現についてフローサイトメトリーによって細胞を分析することによって、BMDCの分化状態を6日目に確認した。分化の6日目に、BMDCをペトリ皿から回収し、一回洗浄し、5×104/ウェルで96ウェルのU底プレート(BD)に蒔いた。QβG10の6の希釈物(4倍)を別のプレートに調製し、20時間の間、BMDCに加えた。
IL-12の定量のためのELISA:
コーティングバッファー(0.1MのNaHCO3,pH9.6)中の2μg/mlのラット抗マウスIL-12(p40/p70モノクローナル抗体(mAb, Pharmingen)をマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)に一晩被覆した。洗浄(0.05%のTween20/PBS)及びブロッキング(2%のBSA/0.05%のTween20/PBS)後、BMDCの70μlの上清又は組み換えIL−12の2倍希釈物(20μg/mlから出発)を加え、室温(RT)で2時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ビオチン標識ラット抗マウスIL−12mAb(p40/p70,Pharmingen)を 1μg/mlで室温にて1時間加えた。プレートを洗浄し、室温で1時間、1μg/mlのストレプトアビジン−HRPO(Jackson laboratories)と共にインキュベートした。洗浄後、クエン酸バッファー(pH5)中のo−フェニレンジアミン(OPD, Fluka)を5分間加え、反応を5%のH2SO4で停止させた。490nmでの光学密度をELISAリーダー(Molecular Devices)で測定し、ソフトウェアSoft max Proを使用してデータを解析した。
コーティングバッファー(0.1MのNaHCO3,pH9.6)中の2μg/mlのラット抗マウスIL-12(p40/p70モノクローナル抗体(mAb, Pharmingen)をマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)に一晩被覆した。洗浄(0.05%のTween20/PBS)及びブロッキング(2%のBSA/0.05%のTween20/PBS)後、BMDCの70μlの上清又は組み換えIL−12の2倍希釈物(20μg/mlから出発)を加え、室温(RT)で2時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ビオチン標識ラット抗マウスIL−12mAb(p40/p70,Pharmingen)を 1μg/mlで室温にて1時間加えた。プレートを洗浄し、室温で1時間、1μg/mlのストレプトアビジン−HRPO(Jackson laboratories)と共にインキュベートした。洗浄後、クエン酸バッファー(pH5)中のo−フェニレンジアミン(OPD, Fluka)を5分間加え、反応を5%のH2SO4で停止させた。490nmでの光学密度をELISAリーダー(Molecular Devices)で測定し、ソフトウェアSoft max Proを使用してデータを解析した。
結果:
G10オリゴがパッケージされたQβによるBMDCの活性化は図6に示す。BMDCはQβG10によって活性化され、よって用量依存的な形でIL-12を分泌した(用量はQβVLP中にパッケージ化されたG10オリゴヌクレオチドの当量として与える)が、未処理のコントロール細胞はIL-12を分泌しなかった。従って、QβVLP中にパッケージ化されたG10オリゴヌクレオチドはBMDCを活性化させることができ、該粒子が細胞によって取り込まれ、続いてオリゴヌクレオチドがBMDCの刺激のために利用可能になることが実証された。
G10オリゴがパッケージされたQβによるBMDCの活性化は図6に示す。BMDCはQβG10によって活性化され、よって用量依存的な形でIL-12を分泌した(用量はQβVLP中にパッケージ化されたG10オリゴヌクレオチドの当量として与える)が、未処理のコントロール細胞はIL-12を分泌しなかった。従って、QβVLP中にパッケージ化されたG10オリゴヌクレオチドはBMDCを活性化させることができ、該粒子が細胞によって取り込まれ、続いてオリゴヌクレオチドがBMDCの刺激のために利用可能になることが実証された。
実施例12
BMDCはAP205G10での処理時にIL-12を放出する
C3H/HeJマウス由来のBMDCを実施例11に記載されているようにしてインビトロで産生した。細胞を96ウェルプレートに蒔き、モック又は標記した濃度のG10を組み込んだAP205(AP205G10)で刺激した。18時間後、上清を回収し、実施例11に記載されているようにサンドウィッチELISAによってIL-12を測定した。AP205G10はIL-12の用量依存的な分泌を誘導したが、未処理細胞は基底レベルでのみIL-12を放出した(表5)。これらの結果は、AP205G10がBMDCによって取り込まれ、それらを活性化してIL-12を放出させることを実証している。
BMDCはAP205G10での処理時にIL-12を放出する
C3H/HeJマウス由来のBMDCを実施例11に記載されているようにしてインビトロで産生した。細胞を96ウェルプレートに蒔き、モック又は標記した濃度のG10を組み込んだAP205(AP205G10)で刺激した。18時間後、上清を回収し、実施例11に記載されているようにサンドウィッチELISAによってIL-12を測定した。AP205G10はIL-12の用量依存的な分泌を誘導したが、未処理細胞は基底レベルでのみIL-12を放出した(表5)。これらの結果は、AP205G10がBMDCによって取り込まれ、それらを活性化してIL-12を放出させることを実証している。
実施例13
G10オリゴデスオキシヌクレオチド(G10-ODN)のためのデリバリー系としてのゼラチンナノ粒子の調製と特徴付け
二工程脱溶媒和によるプレーンなゼラチンナノ粒子(GNP)の調製:
使用した手順は、次のように(Coester等 2000)によって記載されたオリジナルなものである。1.25gのゼラチンA型 (Bloom175) を25mlの高度に精製した水(HPW)に、50℃まで穏やかに加熱しながら5%(w/w)になるまで溶解させた。最初の脱溶媒和工程は25mlのアセトンの添加によって開始した。沈殿したゼラチン画分を60秒間沈降させた後、分散したゼラチン並びに溶解したゼラチンからなる上清を捨てた。50℃への加熱下で25mlの水を加えて沈降物を再び溶解させ、pHを2.5に調整した。一定速度での撹拌(500rpm)下で50mlのアセトンを滴下して添加することによる第二の脱溶媒和の間にその場でゼラチンナノ粒子が形成された。10分後、175μlのグルタルアルデヒド(25%)を反応容器に加え、ナノ粒子を架橋させた。最後に、抽出器フード中で12時間撹拌した後、粒子を、3倍遠心分離(20000gで20分)とアセトン/水(30/70)中での再分散、HPW単独での最後の工程によって精製した。精製したナノ粒子は4−8℃でHPW(伝導率<0.04μs/cm)中の分散液として保存した。次の標準的プロセスパラメータはナノ粒子の調製に対して重要である:(a)第一及び第二脱溶媒和工程の前の温度:50℃;(b)撹拌速度:500−700rpm;(c)第一脱溶媒和工程後の沈殿時間:60秒;(d)アセトン添加の速度(第二脱溶媒和工程):3−5ml/分。
G10オリゴデスオキシヌクレオチド(G10-ODN)のためのデリバリー系としてのゼラチンナノ粒子の調製と特徴付け
二工程脱溶媒和によるプレーンなゼラチンナノ粒子(GNP)の調製:
使用した手順は、次のように(Coester等 2000)によって記載されたオリジナルなものである。1.25gのゼラチンA型 (Bloom175) を25mlの高度に精製した水(HPW)に、50℃まで穏やかに加熱しながら5%(w/w)になるまで溶解させた。最初の脱溶媒和工程は25mlのアセトンの添加によって開始した。沈殿したゼラチン画分を60秒間沈降させた後、分散したゼラチン並びに溶解したゼラチンからなる上清を捨てた。50℃への加熱下で25mlの水を加えて沈降物を再び溶解させ、pHを2.5に調整した。一定速度での撹拌(500rpm)下で50mlのアセトンを滴下して添加することによる第二の脱溶媒和の間にその場でゼラチンナノ粒子が形成された。10分後、175μlのグルタルアルデヒド(25%)を反応容器に加え、ナノ粒子を架橋させた。最後に、抽出器フード中で12時間撹拌した後、粒子を、3倍遠心分離(20000gで20分)とアセトン/水(30/70)中での再分散、HPW単独での最後の工程によって精製した。精製したナノ粒子は4−8℃でHPW(伝導率<0.04μs/cm)中の分散液として保存した。次の標準的プロセスパラメータはナノ粒子の調製に対して重要である:(a)第一及び第二脱溶媒和工程の前の温度:50℃;(b)撹拌速度:500−700rpm;(c)第一脱溶媒和工程後の沈殿時間:60秒;(d)アセトン添加の速度(第二脱溶媒和工程):3−5ml/分。
ナノ粒子サイズの決定:
粒子サイズは動的光散乱(DLS)法を用いて決定した。DLS実験は、173°の静的検出角でNIBS?技術(Non Invasive Back Scattering)を使用してZetasizer ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, England)で実施した。ナノ粒子を滅菌濾過し高度に精製した水に希釈し、30から100μg/mlの範囲の濃度で測定した。かかる低濃度のため、ナノ粒子は分散液の粘度には影響を与えず、よって、25℃で0.8872cPである純水の粘度を使用した。実験は25℃で実施した。
粒子サイズは動的光散乱(DLS)法を用いて決定した。DLS実験は、173°の静的検出角でNIBS?技術(Non Invasive Back Scattering)を使用してZetasizer ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, England)で実施した。ナノ粒子を滅菌濾過し高度に精製した水に希釈し、30から100μg/mlの範囲の濃度で測定した。かかる低濃度のため、ナノ粒子は分散液の粘度には影響を与えず、よって、25℃で0.8872cPである純水の粘度を使用した。実験は25℃で実施した。
プレーンなゼラチンナノ粒子のカチオン化:
塩化コールアミン塩酸塩を使用してCoester(2003)によって記載されたオリジナルな方法の新たな修正版を使用した。プレーンなナノ粒子の水性分散液をpH4.5に調節し、モル過剰量のカチオン化剤塩化コールアミン塩酸塩(例えば500mgのナノ粒子に対して50mg)を一定撹拌下で加えた。5分のインキュベーション後、50mgの1-エチル-3-(3-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を加えて、粒子上のフリーのカルボキシル基を活性化させ、塩化コールアミン塩酸塩と反応させた。カチオン化反応の間、塩化コールアミン塩酸塩の第1級アミノ基がナノ粒子表面上の二つの可能な官能基と反応することができる。最初の相互作用部位は、一官能だけの結合架橋試薬グルタルアルデヒドから誘導された残留アルデヒド基である。更に、第1級アミノ基はナノ粒子表面上の活性化されたカルボキシル基と反応可能である。反応は1時間後に停止され、ナノ粒子は、プレーンなナノ粒子の精製と同様に、3倍遠心分離と再分散によって精製した。最終の粒子を、動的光散乱を使用したサイズ決定とゼータ電位の測定によって、特徴付けした。各割り当てサイズと対応する多分散指数は10回の試行の平均とした。ゼータ電位は同じ機器を使用して決定し、PBS中での10回の個々の測定の平均として計算した。PBS中で5mV又はそれ以上の正電荷を示す粒子を充填に使用した。
塩化コールアミン塩酸塩を使用してCoester(2003)によって記載されたオリジナルな方法の新たな修正版を使用した。プレーンなナノ粒子の水性分散液をpH4.5に調節し、モル過剰量のカチオン化剤塩化コールアミン塩酸塩(例えば500mgのナノ粒子に対して50mg)を一定撹拌下で加えた。5分のインキュベーション後、50mgの1-エチル-3-(3-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を加えて、粒子上のフリーのカルボキシル基を活性化させ、塩化コールアミン塩酸塩と反応させた。カチオン化反応の間、塩化コールアミン塩酸塩の第1級アミノ基がナノ粒子表面上の二つの可能な官能基と反応することができる。最初の相互作用部位は、一官能だけの結合架橋試薬グルタルアルデヒドから誘導された残留アルデヒド基である。更に、第1級アミノ基はナノ粒子表面上の活性化されたカルボキシル基と反応可能である。反応は1時間後に停止され、ナノ粒子は、プレーンなナノ粒子の精製と同様に、3倍遠心分離と再分散によって精製した。最終の粒子を、動的光散乱を使用したサイズ決定とゼータ電位の測定によって、特徴付けした。各割り当てサイズと対応する多分散指数は10回の試行の平均とした。ゼータ電位は同じ機器を使用して決定し、PBS中での10回の個々の測定の平均として計算した。PBS中で5mV又はそれ以上の正電荷を示す粒子を充填に使用した。
カチオン化ゼラチンナノ粒子へのG10-ODNの充填:
G10-ODNを、精製水及びPBS中の凝集又は非凝集形態(実施例2のODN G10の調製プロトコルにおける凝集工程を省略)で用いた。以下に記載した細胞性アッセイに対して、含有量はGNPが1%、G10-ODNが0.1%であり、PBS中10%(w/w)の標的の充填が得られる。以下に記載するマウスモデルでの研究に対しては、0.25%のG10-ODN含量と2.5%のGNPをまた調製し、PBS中10%(w/w)とする。充填実験はPBS中のGNPに対して標的とする(所望される)10%(w/w)のG10-ODNの充填について例示して記載するが、同じ手順を、凝集又は非凝集G10-ODNを使用する他の標的充填割合に対して適合化させた。1.2mgのGNPを含む水性GNP分散液43.3μlを無菌条件下でエッペンドルフ(EppendorfTM)1.5mlキャップに移した。ついで、1086μlのPBSを加え、ピペットで同時に混合した。次の工程で、120μgの凝集G10を含む71.4μlのG10原液を、少なくとも20秒間、ピペットを素早くしかし穏やかに上下させることにより分散液に添加した。次に、調製された試料を22℃で1時間15分の間、インキュベートし、750rpmでThermomixerTM装置にかけた。
G10-ODNを、精製水及びPBS中の凝集又は非凝集形態(実施例2のODN G10の調製プロトコルにおける凝集工程を省略)で用いた。以下に記載した細胞性アッセイに対して、含有量はGNPが1%、G10-ODNが0.1%であり、PBS中10%(w/w)の標的の充填が得られる。以下に記載するマウスモデルでの研究に対しては、0.25%のG10-ODN含量と2.5%のGNPをまた調製し、PBS中10%(w/w)とする。充填実験はPBS中のGNPに対して標的とする(所望される)10%(w/w)のG10-ODNの充填について例示して記載するが、同じ手順を、凝集又は非凝集G10-ODNを使用する他の標的充填割合に対して適合化させた。1.2mgのGNPを含む水性GNP分散液43.3μlを無菌条件下でエッペンドルフ(EppendorfTM)1.5mlキャップに移した。ついで、1086μlのPBSを加え、ピペットで同時に混合した。次の工程で、120μgの凝集G10を含む71.4μlのG10原液を、少なくとも20秒間、ピペットを素早くしかし穏やかに上下させることにより分散液に添加した。次に、調製された試料を22℃で1時間15分の間、インキュベートし、750rpmでThermomixerTM装置にかけた。
G10-ODN充填効率の決定:
インキュベーション後、充填の成功が試験されるG10-ODN充填GNP試料を15000gで1時間遠心分離した。遠心分離後、上清を残りのペレットから注意深く分離させ、260nmの波長で分光測定によって分析した。同じ濃度(1mg/ml)の無充填GNP参照体と同じ濃度(100μg/ml)のG10-ODNの参照体を調製し、遠心分離した。G10-ODNの充填割合は、試料の結果から粒子参照体の測定吸収値を減じた後、G10-ODN参照体の測定吸収値でこの結果を除し、それに100を乗じることにより得られる、G10-ODNがない割合から計算した。最後に、充填効率は、100%からフリーG10-ODNパーセントを減じることによって計算した。
インキュベーション後、充填の成功が試験されるG10-ODN充填GNP試料を15000gで1時間遠心分離した。遠心分離後、上清を残りのペレットから注意深く分離させ、260nmの波長で分光測定によって分析した。同じ濃度(1mg/ml)の無充填GNP参照体と同じ濃度(100μg/ml)のG10-ODNの参照体を調製し、遠心分離した。G10-ODNの充填割合は、試料の結果から粒子参照体の測定吸収値を減じた後、G10-ODN参照体の測定吸収値でこの結果を除し、それに100を乗じることにより得られる、G10-ODNがない割合から計算した。最後に、充填効率は、100%からフリーG10-ODNパーセントを減じることによって計算した。
G10-ODN充填決定の結果:
充填効率の結果は様々なGNPバッチによって得られた。しかしながら、調製方法、特にカチオン化はそれぞれの場合で同じであった。よって、充填はまた異なった粒子サイズのバッチの間で比較することができる。割合で与えられる全ての結果は、G10-ODN及びGNPの用いられた質量で計算された質量パーセント(w/w)である。非凝集G10-ODNに対する表I−IIIと凝集G10-ODNに対する表IV−Vに示されるように、3−15%(非凝集G10-ODN)又は5−10%(凝集G10-ODN)の充填割合のG10-GNPが首尾良く得られた。最適な充填媒体はPBSであり、そこでは調製物に凝塊(フロキュレーション)が検出されなかった。非凝集G10-ODNの結果は、全体として十分な結合を示し、水中では5から10%、充填効率が減少する傾向があり、PBSではこの傾向はなかった。GNPへの15%のG10-ODNの充填は僅かだけ低い効率を示している。
充填効率の結果は様々なGNPバッチによって得られた。しかしながら、調製方法、特にカチオン化はそれぞれの場合で同じであった。よって、充填はまた異なった粒子サイズのバッチの間で比較することができる。割合で与えられる全ての結果は、G10-ODN及びGNPの用いられた質量で計算された質量パーセント(w/w)である。非凝集G10-ODNに対する表I−IIIと凝集G10-ODNに対する表IV−Vに示されるように、3−15%(非凝集G10-ODN)又は5−10%(凝集G10-ODN)の充填割合のG10-GNPが首尾良く得られた。最適な充填媒体はPBSであり、そこでは調製物に凝塊(フロキュレーション)が検出されなかった。非凝集G10-ODNの結果は、全体として十分な結合を示し、水中では5から10%、充填効率が減少する傾向があり、PBSではこの傾向はなかった。GNPへの15%のG10-ODNの充填は僅かだけ低い効率を示している。
G10充填ゼラチンナノ粒子(GNP-G10)はBMDCからIL-12の分泌を誘導する:
GNP-G10を上記のようにして調製した。未結合G10の効果を評価するために、一定量のGNP-G10調製物を4℃で1時間16000gで遠心分離し、上清を回収した(supGNP-G10)。実施例11に記載されているようにして、C3H/HeJマウス由来のBMDCをインビトロで産生した。細胞を96ウェルプレートに蒔き、モックか標記した濃度のGNP-G10又はsupGNP-G10(そのG10の濃度として与える)の何れかで刺激した。18時間後、細胞上清を回収し、IL-12を、実施例11に記載したように、サンドウィッチELISAによって測定した。GNP-G10は試験された全ての濃度でBMDCからのIL-12の分泌を誘導した(表VI)。これに対して、BMDCはsupGNP-G10での処理時には、有意な量のIL-12を放出しなかった。これらの結果は、GNP-G10はBMDCによって取り込まれ、IL-12の放出を惹起する。また、これらのデータは、G10は効率的にGNPに充填されたが、supGNP-G10はBMDCからのIL-12の分泌を誘導しなかったことを示している。GNPはG10がないとマウス樹状細胞においてIL-12の分泌を誘導しなかった。
GNP-G10を上記のようにして調製した。未結合G10の効果を評価するために、一定量のGNP-G10調製物を4℃で1時間16000gで遠心分離し、上清を回収した(supGNP-G10)。実施例11に記載されているようにして、C3H/HeJマウス由来のBMDCをインビトロで産生した。細胞を96ウェルプレートに蒔き、モックか標記した濃度のGNP-G10又はsupGNP-G10(そのG10の濃度として与える)の何れかで刺激した。18時間後、細胞上清を回収し、IL-12を、実施例11に記載したように、サンドウィッチELISAによって測定した。GNP-G10は試験された全ての濃度でBMDCからのIL-12の分泌を誘導した(表VI)。これに対して、BMDCはsupGNP-G10での処理時には、有意な量のIL-12を放出しなかった。これらの結果は、GNP-G10はBMDCによって取り込まれ、IL-12の放出を惹起する。また、これらのデータは、G10は効率的にGNPに充填されたが、supGNP-G10はBMDCからのIL-12の分泌を誘導しなかったことを示している。GNPはG10がないとマウス樹状細胞においてIL-12の分泌を誘導しなかった。
G10充填ゼラチンナノ粒子(GNP-G10)は喘息のマウスモデルにおいて保護性がある:
アレルギー性気道の実験的喘息モデル(Hessel EM等, J.Exp.Med. 2005, 202, 1563) を使用して、全IgEレベルに対するGNP-G10の効果を評価した。感作のために、4グループのマウス(グループB−E、1グループ当たりマウス5匹)に450μgのミョウバン(アルハイドロゲル2.0%Brenntag Biosector, Denmark)と混合した150μgのブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)花粉抽出物(RW, Greer)を0日目と3日目に腹腔内(i.p.) 注射した。一グループ(グループA)からのマウスはPBSだけでi.p.処理した。10日目に、グループCのマウスに300μgのQβG10(60μgのG10に等価)を、グループDのマウスに600μgのGNP-G10(60μgのG10に等価)を、グループEのマウスに600μgのGNP-G10凝集体(60μgのG10に等価)を、グループA及びBのマウスにPBSを皮下注射した。注射前に全ての動物から血液を採取する。17日目に、全ての動物を出血させ、全IgE力価を決定する。血中の全IgEレベルはELISAによって測定する。簡単に述べると、ELISAプレート(96ウェルMAXIsorp, NUNCイムノプレート#442404)に抗IgE(BD Pharmingen, # 553413)を、コーティングバッファー(0.1MのNaHCO3,pH9.6)中5μg/mlの濃度で4℃にて一晩被覆する。ついで、プレートを洗浄バッファー(PBS/0.05%のTween)で洗浄し、洗浄バッファー中2%のBSAを用いて37℃にて2時間ブロックする。ついで、プレートを十分に洗浄下後、1:20の希釈マウス血清又は連続希釈マウスIgE標準(BD Pharmingen, # 557079)と共にインキュベートする。そのプレートを室温で2時間インキュベートし、ついで洗浄バッファーで十分に洗浄する。ついで、結合した特異的マウス抗体を、HRPO標識のε鎖特異的ラット抗マウスIgE抗体(Southern Biotech #H021-NBB4C)との一時間のインキュベーションによって検出する。洗浄バッファーでの十分な洗浄後に、プレートを6分間OPD溶液(1OPD錠剤、25mlのOPDバッファー及び8μlのH2O2)で展開し、反応を5%のH2SO4溶液で停止させる。ついで、プレートをELISAリーダー(Biorad Benchmark)でOD450nmにて読み取る。血清中のIgE濃度は参照としてマウスIgE標準を使用してGraphPad Prism4で計算する。
アレルギー性気道の実験的喘息モデル(Hessel EM等, J.Exp.Med. 2005, 202, 1563) を使用して、全IgEレベルに対するGNP-G10の効果を評価した。感作のために、4グループのマウス(グループB−E、1グループ当たりマウス5匹)に450μgのミョウバン(アルハイドロゲル2.0%Brenntag Biosector, Denmark)と混合した150μgのブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)花粉抽出物(RW, Greer)を0日目と3日目に腹腔内(i.p.) 注射した。一グループ(グループA)からのマウスはPBSだけでi.p.処理した。10日目に、グループCのマウスに300μgのQβG10(60μgのG10に等価)を、グループDのマウスに600μgのGNP-G10(60μgのG10に等価)を、グループEのマウスに600μgのGNP-G10凝集体(60μgのG10に等価)を、グループA及びBのマウスにPBSを皮下注射した。注射前に全ての動物から血液を採取する。17日目に、全ての動物を出血させ、全IgE力価を決定する。血中の全IgEレベルはELISAによって測定する。簡単に述べると、ELISAプレート(96ウェルMAXIsorp, NUNCイムノプレート#442404)に抗IgE(BD Pharmingen, # 553413)を、コーティングバッファー(0.1MのNaHCO3,pH9.6)中5μg/mlの濃度で4℃にて一晩被覆する。ついで、プレートを洗浄バッファー(PBS/0.05%のTween)で洗浄し、洗浄バッファー中2%のBSAを用いて37℃にて2時間ブロックする。ついで、プレートを十分に洗浄下後、1:20の希釈マウス血清又は連続希釈マウスIgE標準(BD Pharmingen, # 557079)と共にインキュベートする。そのプレートを室温で2時間インキュベートし、ついで洗浄バッファーで十分に洗浄する。ついで、結合した特異的マウス抗体を、HRPO標識のε鎖特異的ラット抗マウスIgE抗体(Southern Biotech #H021-NBB4C)との一時間のインキュベーションによって検出する。洗浄バッファーでの十分な洗浄後に、プレートを6分間OPD溶液(1OPD錠剤、25mlのOPDバッファー及び8μlのH2O2)で展開し、反応を5%のH2SO4溶液で停止させる。ついで、プレートをELISAリーダー(Biorad Benchmark)でOD450nmにて読み取る。血清中のIgE濃度は参照としてマウスIgE標準を使用してGraphPad Prism4で計算する。
実施例13の文献:
Ahlers, Michael等 Biodegradable gelatin nanoparticles and procedure for their production. (Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess A.-G., Germany, assignee. Patent 102004041340. 20060223. (2005)。
Coester, C. J.等 "Gelatin nanoparticles by two step desolvation-a new preparation method, surface modifications and cell uptake." Journal of Microencapsulation 17.2 (2000): 187-93。
Coester, Conrad. Development of a new carrier system for oligonucleotides and plasmids based on gelatin nanoparticles. New Drugs [1], 14-17. 2003。
Zillies, Jan及びCoester, Conrad. Evaluating gelatin based nanoparticles as a carrier system for double stranded oligonucleotides. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 7[4], 17-21. 2004。
Zwiorek, Klaus, Kloeckner, Julia, Wagner, Ernst, and Coester, Conrad. Gelatin nanoparticles as a new and simple gene delivery system. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 7 [4], 22-28. 2004。
Ahlers, Michael等 Biodegradable gelatin nanoparticles and procedure for their production. (Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess A.-G., Germany, assignee. Patent 102004041340. 20060223. (2005)。
Coester, C. J.等 "Gelatin nanoparticles by two step desolvation-a new preparation method, surface modifications and cell uptake." Journal of Microencapsulation 17.2 (2000): 187-93。
Coester, Conrad. Development of a new carrier system for oligonucleotides and plasmids based on gelatin nanoparticles. New Drugs [1], 14-17. 2003。
Zillies, Jan及びCoester, Conrad. Evaluating gelatin based nanoparticles as a carrier system for double stranded oligonucleotides. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 7[4], 17-21. 2004。
Zwiorek, Klaus, Kloeckner, Julia, Wagner, Ernst, and Coester, Conrad. Gelatin nanoparticles as a new and simple gene delivery system. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 7 [4], 22-28. 2004。
実施例14
ELISAによる細胞中におけるIFN-α産生の検出
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をバフィーコートから単離し、10%の仔ウシ血清(FCS)を含むRPMI培地中の免疫賦活性核酸で18時間処理した。上清中のIFN-αを、PBL Biomedical Laboratoriesによって提供された抗体セットを使用して、サンドウィッチELISAによって測定した。簡単に述べると、ELISAプレートに5μg/mlの捕獲抗IFN-α抗体を被覆した。洗浄後、プレートを室温(RT)で1時間、0.5%BSAでブロックした。処理したPBMC及びコントロールPBMCからの上清並びに組換えIFN-αをプレートに加え、37℃で2時間インキュベートした。ウサギポリクローナル抗IFN-α血清を検出抗体として使用し、室温で1時間インキュベートした。室温で1時間、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ血清を続いてプレートに加えた。各インキュベーション後に洗浄工程を実施した。発色反応を酵素基質o-フェニレンジアミンを使用して起こさせ、ELISAリーダー装置において490nmで読み取った。データは、組換えIFN-αの標準曲線に従って分泌されたIFN-α(pg/ml)として表されている。
ELISAによる細胞中におけるIFN-α産生の検出
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をバフィーコートから単離し、10%の仔ウシ血清(FCS)を含むRPMI培地中の免疫賦活性核酸で18時間処理した。上清中のIFN-αを、PBL Biomedical Laboratoriesによって提供された抗体セットを使用して、サンドウィッチELISAによって測定した。簡単に述べると、ELISAプレートに5μg/mlの捕獲抗IFN-α抗体を被覆した。洗浄後、プレートを室温(RT)で1時間、0.5%BSAでブロックした。処理したPBMC及びコントロールPBMCからの上清並びに組換えIFN-αをプレートに加え、37℃で2時間インキュベートした。ウサギポリクローナル抗IFN-α血清を検出抗体として使用し、室温で1時間インキュベートした。室温で1時間、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ血清を続いてプレートに加えた。各インキュベーション後に洗浄工程を実施した。発色反応を酵素基質o-フェニレンジアミンを使用して起こさせ、ELISAリーダー装置において490nmで読み取った。データは、組換えIFN-αの標準曲線に従って分泌されたIFN-α(pg/ml)として表されている。
実施例15
蛍光色素コンジュゲート抗体を使用するフローサイトメトリー分析
PBMCを免疫賦活性核酸を用いて3−6時間刺激し、ついでブレフェルジンAと共に更に4時間インキュベートした。ついで、細胞をDC特異的表面マーカーで染色し、透過処理し、IFN-αに対して細胞内染色する。
蛍光色素コンジュゲート抗体を使用するフローサイトメトリー分析
PBMCを免疫賦活性核酸を用いて3−6時間刺激し、ついでブレフェルジンAと共に更に4時間インキュベートした。ついで、細胞をDC特異的表面マーカーで染色し、透過処理し、IFN-αに対して細胞内染色する。
実施例16
ブタクサ花粉での感作後及び11日目の一回の誘発後の好酸球増加症に対するQβG10の効果
アレルギー性気道の実験的喘息モデル(Hessel EM等, J.Exp.Med. 2005, 202, 1563) を使用して、喘息の病理的原因である好酸球増加症に対するQβG10の効果を評価した。感作のために、3グループのマウス(1グループ当たりマウス5匹)に450μgのミョウバン(アルハイドロゲル2.0%Brenntag Biosector, Denmark)と混合した150μgのブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)花粉抽出物(RW, Greer)を0日目と3日目に腹腔内(i.p.) 注射した。9日目に、グループBのマウスに375μgのQβG10を皮下(s.c.)投与した。10日目に、グループCのマウスに375μgのQβG10を皮下投与した。グループAのマウスにはコントロールとしてPBSを投与した。11日目に、全マウスにPBS中200μgのRWを鼻腔内(i.n.)負荷投与した。負荷投与から48時間後に、マウスを屠殺し、肺をPBSで洗浄した(表6)。気管支肺胞洗浄(BAL)に含まれている細胞をFACSによって分析した。好酸球は高CCR3(マウスCCR3フィコエリトリンMAb,R&D)発現によって同定した。表7に示されるように、BAL中の細胞の全量はPBSコントロールマウスと比較して処理されたQβG10において強く減少した。減少は、負荷投与の24時間前(52%)よりも負荷投与の48時間前(61%、p<0.05)にQβG10を与えた場合に、より顕著であった。表8に示されるように、好酸球の量は、PBSコントロールマウスと比較して処理されたQβG10において強く減少した。再び、減少は、負荷投与の24時間前(60%、p<0.05)よりも負荷投与の48時間前(70%、p<0.05)にQβG10を与えた場合に、より顕著であった。よって、QβG10処理は喘息のマウスモデルにおいて喘息の発症を予防する。
ブタクサ花粉での感作後及び11日目の一回の誘発後の好酸球増加症に対するQβG10の効果
アレルギー性気道の実験的喘息モデル(Hessel EM等, J.Exp.Med. 2005, 202, 1563) を使用して、喘息の病理的原因である好酸球増加症に対するQβG10の効果を評価した。感作のために、3グループのマウス(1グループ当たりマウス5匹)に450μgのミョウバン(アルハイドロゲル2.0%Brenntag Biosector, Denmark)と混合した150μgのブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)花粉抽出物(RW, Greer)を0日目と3日目に腹腔内(i.p.) 注射した。9日目に、グループBのマウスに375μgのQβG10を皮下(s.c.)投与した。10日目に、グループCのマウスに375μgのQβG10を皮下投与した。グループAのマウスにはコントロールとしてPBSを投与した。11日目に、全マウスにPBS中200μgのRWを鼻腔内(i.n.)負荷投与した。負荷投与から48時間後に、マウスを屠殺し、肺をPBSで洗浄した(表6)。気管支肺胞洗浄(BAL)に含まれている細胞をFACSによって分析した。好酸球は高CCR3(マウスCCR3フィコエリトリンMAb,R&D)発現によって同定した。表7に示されるように、BAL中の細胞の全量はPBSコントロールマウスと比較して処理されたQβG10において強く減少した。減少は、負荷投与の24時間前(52%)よりも負荷投与の48時間前(61%、p<0.05)にQβG10を与えた場合に、より顕著であった。表8に示されるように、好酸球の量は、PBSコントロールマウスと比較して処理されたQβG10において強く減少した。再び、減少は、負荷投与の24時間前(60%、p<0.05)よりも負荷投与の48時間前(70%、p<0.05)にQβG10を与えた場合に、より顕著であった。よって、QβG10処理は喘息のマウスモデルにおいて喘息の発症を予防する。
実施例17
ブタクサ花粉での感作後及び二回の誘発(11日目及び15日目)後の好酸球増加症に対するQβG10の効果
アレルギー性気道のより強い実験的喘息モデル(Hessel EM等., J. Exp. Med. 2005, 202, 1563の修正) をまた使用して好酸球増加症と血液中のIgE濃度に対するQβG10の効果を評価した。感作のために、2グループのマウス(1グループ当たりマウス5匹)に, 450μgのミョウバン中の150μgのRW花粉抽出物を0日目と3日目に腹腔内投与した。9日目と13日目に、グループBのマウスに375μgのQβG10を皮下注射した。AグループのマウスにはコントロールとしてPBSを投与した。11日目と15日目に、マウスにPBS中の200μgのRWを鼻腔内誘発投与した。誘発後48時間で、マウスを屠殺し、肺をPBSで洗浄した(表9)。BALに含まれている細胞を、実施例16に記載されているようにしてFACSによって分析した。表10及び11に示されるように、細胞の全量(51%、p<0.01)及び好酸球の量(62%,p<0.001)は、PBSコントロールマウスと比較して処理されたQβG10において強く減少した。よって、QβG10は喘息の強いマウスモデルにおいて喘息の発症を防止する。
ブタクサ花粉での感作後及び二回の誘発(11日目及び15日目)後の好酸球増加症に対するQβG10の効果
アレルギー性気道のより強い実験的喘息モデル(Hessel EM等., J. Exp. Med. 2005, 202, 1563の修正) をまた使用して好酸球増加症と血液中のIgE濃度に対するQβG10の効果を評価した。感作のために、2グループのマウス(1グループ当たりマウス5匹)に, 450μgのミョウバン中の150μgのRW花粉抽出物を0日目と3日目に腹腔内投与した。9日目と13日目に、グループBのマウスに375μgのQβG10を皮下注射した。AグループのマウスにはコントロールとしてPBSを投与した。11日目と15日目に、マウスにPBS中の200μgのRWを鼻腔内誘発投与した。誘発後48時間で、マウスを屠殺し、肺をPBSで洗浄した(表9)。BALに含まれている細胞を、実施例16に記載されているようにしてFACSによって分析した。表10及び11に示されるように、細胞の全量(51%、p<0.01)及び好酸球の量(62%,p<0.001)は、PBSコントロールマウスと比較して処理されたQβG10において強く減少した。よって、QβG10は喘息の強いマウスモデルにおいて喘息の発症を防止する。
血液中の全IgEレベルはELISAによって測定した。簡単に述べると、ELISAプレート(96ウェルMAXIsorp, NUNCイムノプレート#442404)に抗IgE(BD Pharmingen, #553413)を、コーティングバッファー(0.1MのNaHCO3,pH9.6)中5μg/mlの濃度で4℃にて一晩被覆した。ついで、プレートを洗浄バッファー(PBS/0.05%のTween)で洗浄し、洗浄バッファー中2%のBSAを用いて37℃にて2時間ブロックした。ついで、プレートを十分に洗浄下後、1:20の希釈マウス血清又は連続希釈マウスIgE標準(BD Pharmingen, # 557079)と共にインキュベートした。そのプレートを室温で2時間インキュベートし、ついで洗浄バッファーで十分に洗浄した。ついで、結合した特異的マウス抗体を、HRPO標識のε鎖特異的ラット抗マウスIgE抗体(Southern Biotech #H021-NBB4C)との一時間のインキュベーションによって検出した。洗浄バッファーでの十分な洗浄後に、プレートを6分間OPD溶液(1OPD錠剤、25mlのOPDバッファー及び8μlのH2O2)で展開し、反応を5%のH2SO4溶液で停止させた。ついで、プレートをELISAリーダー(Biorad Benchmark)でOD450nmにて読み取った。血清中のIgE濃度は標準に従ってGraphPad Prism4で計算した。表12に示すように、QβG10で処理されたマウス中の全IgEレベルは、未処理のマウスと比較して有意に(P<0.05)減少している。
実施例18
QβG10の効果の持続時間とRW抗原とのQβG10の相互作用
実施例16におけるようにミョウバンと混合したRWで0日目と3日目にマウスを感作した。10日目と12日目に、マウスにQβG10、RW(20μg)と混合したQβG10又はPBSを皮下投与した。処置の6日及び14日後に、マウスをRWで誘発した。誘発後48時間で、血清中のIgEレベルを分析した(表13)。データは、QβG10、又はRWと混合したQβG10におけるIgEレベルが、PBS処理コントロールと比較して有意に減少し(表14)、QβG10と、RWと混合したQβG10との間に明確な差が見られなかった。
QβG10の効果の持続時間とRW抗原とのQβG10の相互作用
実施例16におけるようにミョウバンと混合したRWで0日目と3日目にマウスを感作した。10日目と12日目に、マウスにQβG10、RW(20μg)と混合したQβG10又はPBSを皮下投与した。処置の6日及び14日後に、マウスをRWで誘発した。誘発後48時間で、血清中のIgEレベルを分析した(表13)。データは、QβG10、又はRWと混合したQβG10におけるIgEレベルが、PBS処理コントロールと比較して有意に減少し(表14)、QβG10と、RWと混合したQβG10との間に明確な差が見られなかった。
実施例19
QβG10の特異性
マウスを0日目と3日目にRWとFel d1(Cytos, Switzerland) で感作させた。10日目にマウスをPBS(グループA及びB)、又はQβG10(グループC及びD)、又はRWと混合したQβG10(グループE及びF)又はFel d1と混合したQβG10の何れかで処理した。12日目に、グループA、C、E及びGからのマウスにミョウバン混合ブタクサを負荷投与した。一方、グループB、D、F及びHからのマウスにはFel d1を負荷投与した。14日目に、全マウスが10日目と同じ処置を受けた。16日目に全マウスが12日目のように負荷投与を受けた。最後の負荷投与の48時間後に、BAL及び血液中のRW及びFel d1特異的IgEを測定し、BAL中の浸潤細胞を分析した(表15)。
QβG10の特異性
マウスを0日目と3日目にRWとFel d1(Cytos, Switzerland) で感作させた。10日目にマウスをPBS(グループA及びB)、又はQβG10(グループC及びD)、又はRWと混合したQβG10(グループE及びF)又はFel d1と混合したQβG10の何れかで処理した。12日目に、グループA、C、E及びGからのマウスにミョウバン混合ブタクサを負荷投与した。一方、グループB、D、F及びHからのマウスにはFel d1を負荷投与した。14日目に、全マウスが10日目と同じ処置を受けた。16日目に全マウスが12日目のように負荷投与を受けた。最後の負荷投与の48時間後に、BAL及び血液中のRW及びFel d1特異的IgEを測定し、BAL中の浸潤細胞を分析した(表15)。
実施例20
G10及びQβG10の比較
G10及びQβG10の効果をブタクサアレルギーモデルにおいて比較した。3グループのマウスを、ミョウバンを混合したブタクサの i.p.注射によって0日目と3日目に感作させた。10日目と12日目に、グループB及びCのマウスをそれぞれG10又はQβG10で処置した。グループAのマウスにはコントロールとしてPBSが投与された。全マウスに200μgのRWがi.n.投与によって誘発投与され、誘発の2日後に、マウスを屠殺した。浸潤細胞及びBAL中のIL-4濃度及び血液中のIgEレベルを分析した(表16)。
表17に示すように、BAL中の細胞の全量はG10処理マウスにおいて有意には変化しなかったが、PBSコントロールマウスと比較してQβG10処理マウスにおいて強く減少していた(32%、p<0.05)。同様に、好酸球の量はPBSコントロールマウスと比較してQβG10処理マウスにおいて強く減少しており(64.1%、p<0.01)、G10処理マウスにおける変化は有意ではなかった(表18)。よって、非パッケージ化G10はBAL中の浸潤細胞に有意な効果を示さないが、Qβにパッケージ化したG10は細胞が肺に浸潤するのを防止した。表19に示されているように、G10で処理されたマウス中のIgEレベルの変化は有意ではなかったが、QβG10処理マウスは、PBS処理マウスと比較して有意に(p<0.001)減少した血中IgEレベルを有していた。表20に示されているように、G10で処理されたマウスのBAL中のIL4レベルの変化は有意ではなかったが、QβG10処理マウスは、PBS処理マウスと比較して有意に(p<0.001)減少したBAL IL-4レベルを有していた。従って、G10をQβにパッケージ化した場合、それは喘息とアレルギーの病理マーカーを減少させた。
G10及びQβG10の比較
G10及びQβG10の効果をブタクサアレルギーモデルにおいて比較した。3グループのマウスを、ミョウバンを混合したブタクサの i.p.注射によって0日目と3日目に感作させた。10日目と12日目に、グループB及びCのマウスをそれぞれG10又はQβG10で処置した。グループAのマウスにはコントロールとしてPBSが投与された。全マウスに200μgのRWがi.n.投与によって誘発投与され、誘発の2日後に、マウスを屠殺した。浸潤細胞及びBAL中のIL-4濃度及び血液中のIgEレベルを分析した(表16)。
表17に示すように、BAL中の細胞の全量はG10処理マウスにおいて有意には変化しなかったが、PBSコントロールマウスと比較してQβG10処理マウスにおいて強く減少していた(32%、p<0.05)。同様に、好酸球の量はPBSコントロールマウスと比較してQβG10処理マウスにおいて強く減少しており(64.1%、p<0.01)、G10処理マウスにおける変化は有意ではなかった(表18)。よって、非パッケージ化G10はBAL中の浸潤細胞に有意な効果を示さないが、Qβにパッケージ化したG10は細胞が肺に浸潤するのを防止した。表19に示されているように、G10で処理されたマウス中のIgEレベルの変化は有意ではなかったが、QβG10処理マウスは、PBS処理マウスと比較して有意に(p<0.001)減少した血中IgEレベルを有していた。表20に示されているように、G10で処理されたマウスのBAL中のIL4レベルの変化は有意ではなかったが、QβG10処理マウスは、PBS処理マウスと比較して有意に(p<0.001)減少したBAL IL-4レベルを有していた。従って、G10をQβにパッケージ化した場合、それは喘息とアレルギーの病理マーカーを減少させた。
実施例21
QβG10でのネコアレルギーの治療
マウスを1日目と14日目に5μgのFel d1を腹腔内注射して感作させた後、28、29、30及び33日目に1μgのFel d1を鼻腔内に追加投与した。37日、39日及び41日目に、マウスに375μgのQβG10又はPBSを皮下注射した。43日目に、1μgのFel d1を鼻腔内に負荷投与し、マウスのコア温度を直腸プローブデジタル体温計を使用して直腸的に測定する。マスト細胞の脱顆粒をネコアレルギーモデルでモニターする。マウスに0日目と3日目に375μgのQβG10を皮下注射する。5日目に、マウスに、50μlの1:5の希釈ネコアレルギー血清又はその血清又はコントロール血清からの精製IgEを皮内注射した。4又は24時間後に、マウスに、10μgのFel d1プラスエバンスブルー線量を静脈内注射した。静脈内注射の30分後にマウスを屠殺し、ブルー染色反応を分析した。QβG10処理マウスは未処理マウスと比較してブルー染色が低減していた。
QβG10でのネコアレルギーの治療
マウスを1日目と14日目に5μgのFel d1を腹腔内注射して感作させた後、28、29、30及び33日目に1μgのFel d1を鼻腔内に追加投与した。37日、39日及び41日目に、マウスに375μgのQβG10又はPBSを皮下注射した。43日目に、1μgのFel d1を鼻腔内に負荷投与し、マウスのコア温度を直腸プローブデジタル体温計を使用して直腸的に測定する。マスト細胞の脱顆粒をネコアレルギーモデルでモニターする。マウスに0日目と3日目に375μgのQβG10を皮下注射する。5日目に、マウスに、50μlの1:5の希釈ネコアレルギー血清又はその血清又はコントロール血清からの精製IgEを皮内注射した。4又は24時間後に、マウスに、10μgのFel d1プラスエバンスブルー線量を静脈内注射した。静脈内注射の30分後にマウスを屠殺し、ブルー染色反応を分析した。QβG10処理マウスは未処理マウスと比較してブルー染色が低減していた。
実施例22
QβG10での蜂毒アレルギーの治療
雌の6から8週齢のCBA/JマウスをHarlan(Zeist, The Netherlands)から得た。1mgのミョウバンに吸着させた0.1μgのPLA2を腹側領域及び尾の基部にs.c.注射することにより、動物を隔週毎に感作した。二通りのプロトコルがQβG10療法に適用される。最初は、前もって感作させたマウスに6連続日にわたって375μgのQβG10のs.c.注射を行う。IgEレベルはQβG10の最後の注射の48時間後に測定する。第二は、未処置マウスに0日目と3日目に375μgのQβG10のs.c.注射を行う。最後のQβG10注射の2週間後に、マウスをミョウバン中のPLA2で感作させる。PLA2感作から7日後にIgEレベルを測定する。コントロールグループにはPBSか30μgの天然PLA2を投与する。アナフィラキシー応答の誘導には、動物にPBS中30μgの天然PLA2をi.p.注射し、直腸温度を較正デジタル体温計を用いてモニターする。未処理マウスと比較して、QβG10処理マウスにおける体温低下は顕著ではない。
QβG10での蜂毒アレルギーの治療
雌の6から8週齢のCBA/JマウスをHarlan(Zeist, The Netherlands)から得た。1mgのミョウバンに吸着させた0.1μgのPLA2を腹側領域及び尾の基部にs.c.注射することにより、動物を隔週毎に感作した。二通りのプロトコルがQβG10療法に適用される。最初は、前もって感作させたマウスに6連続日にわたって375μgのQβG10のs.c.注射を行う。IgEレベルはQβG10の最後の注射の48時間後に測定する。第二は、未処置マウスに0日目と3日目に375μgのQβG10のs.c.注射を行う。最後のQβG10注射の2週間後に、マウスをミョウバン中のPLA2で感作させる。PLA2感作から7日後にIgEレベルを測定する。コントロールグループにはPBSか30μgの天然PLA2を投与する。アナフィラキシー応答の誘導には、動物にPBS中30μgの天然PLA2をi.p.注射し、直腸温度を較正デジタル体温計を用いてモニターする。未処理マウスと比較して、QβG10処理マウスにおける体温低下は顕著ではない。
実施例23
QβG10でのチリダニアレルギーの治療
雄CBA/CaHマウスを 5μgの Der P1 + 1 mgのアルハイドロゲルの腹腔内注射で感作する。鼻腔内注入の場合は、5μgのDer P1又は滅菌生理食塩水を含む25μlの一定量を麻酔をかけたマウスの鼻に適用する。二通りのプロトコルがQβG10療法に適用される。 最初は、前もって感作させたマウスに6連続日にわたって375μgのQβG10のs.c.注射を行う。IgEレベルはQβG10の最後の注射の48時間後に測定する。第二は、未処置マウスに0日目と3日目に375μgのQβG10のs.c.注射を行う。最後のQβG10注射の2週間後に、マウスをミョウバン中のDer P1 で感作させる。Der P1 感作から7日後にIgEレベルを測定する。QβG10処理マウスは、未処理マウスより低いIgE濃度を示す。
QβG10でのチリダニアレルギーの治療
雄CBA/CaHマウスを 5μgの Der P1 + 1 mgのアルハイドロゲルの腹腔内注射で感作する。鼻腔内注入の場合は、5μgのDer P1又は滅菌生理食塩水を含む25μlの一定量を麻酔をかけたマウスの鼻に適用する。二通りのプロトコルがQβG10療法に適用される。 最初は、前もって感作させたマウスに6連続日にわたって375μgのQβG10のs.c.注射を行う。IgEレベルはQβG10の最後の注射の48時間後に測定する。第二は、未処置マウスに0日目と3日目に375μgのQβG10のs.c.注射を行う。最後のQβG10注射の2週間後に、マウスをミョウバン中のDer P1 で感作させる。Der P1 感作から7日後にIgEレベルを測定する。QβG10処理マウスは、未処理マウスより低いIgE濃度を示す。
実施例24
QβG10でのアトピー性皮膚炎を被っている患者の治療と効果の評価
24.1 アトピー性皮膚炎の症状の評価:
全身体関与を100から1000cm2の形状の使用で、又は身体部分のサイズをベースとして身体部分に標準的な測定値をあてがった9のルールによって推定する。全身体スコアは、紅斑、そう痒、滲痂皮(oozing crusting)、剥脱、及び、全ての関連した皮膚の苔癬化、非関連皮膚の乾燥、及び不眠に対する0から3のスケールの個々のスコアの合計である。研究者は、紅斑、そう痒、滲痂皮(oozing crusting)、剥脱、及び全ての関連した皮膚の苔癬化及び非関連皮膚の乾燥の深刻度に対して0から3のスケールで被験者の冒された皮膚領域にグレードを付ける。被験者は10cmの可視類似スケールで選択領域のそう痒にグレードを付け、下限を深刻とし、上限を無しとする;このグレードは解析のために0から3のスコアに転換される。効果の評価を一定にするために、全ての審査者がマニュアルを受け取り、当日参加し、集中訓練過程とオンサイト訓練を受ける。
24.2 QβG10での治療:
アトピー性皮膚炎を患っている被験者のグループを、300μgのQβG10(G10(配列番号27)をパッケージしたQβVLP)で1週間の間隔で少なくとも3回、処置し、匹敵する症状のコントロールグループはプラシーボで処置する。試験グループの平均症状スコアに応じて、試験グループの治療を、それぞれ300μgのQβG10の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
24.3 効果の評価:
最初の処置の前と研究の終わりに全身体関与を評価する。各患者に対して個々に選択された選択された皮膚領域の症状を、各処置前と最後の処置の3ヶ月後までの間隔で直接評価する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
QβG10でのアトピー性皮膚炎を被っている患者の治療と効果の評価
24.1 アトピー性皮膚炎の症状の評価:
全身体関与を100から1000cm2の形状の使用で、又は身体部分のサイズをベースとして身体部分に標準的な測定値をあてがった9のルールによって推定する。全身体スコアは、紅斑、そう痒、滲痂皮(oozing crusting)、剥脱、及び、全ての関連した皮膚の苔癬化、非関連皮膚の乾燥、及び不眠に対する0から3のスケールの個々のスコアの合計である。研究者は、紅斑、そう痒、滲痂皮(oozing crusting)、剥脱、及び全ての関連した皮膚の苔癬化及び非関連皮膚の乾燥の深刻度に対して0から3のスケールで被験者の冒された皮膚領域にグレードを付ける。被験者は10cmの可視類似スケールで選択領域のそう痒にグレードを付け、下限を深刻とし、上限を無しとする;このグレードは解析のために0から3のスコアに転換される。効果の評価を一定にするために、全ての審査者がマニュアルを受け取り、当日参加し、集中訓練過程とオンサイト訓練を受ける。
24.2 QβG10での治療:
アトピー性皮膚炎を患っている被験者のグループを、300μgのQβG10(G10(配列番号27)をパッケージしたQβVLP)で1週間の間隔で少なくとも3回、処置し、匹敵する症状のコントロールグループはプラシーボで処置する。試験グループの平均症状スコアに応じて、試験グループの治療を、それぞれ300μgのQβG10の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
24.3 効果の評価:
最初の処置の前と研究の終わりに全身体関与を評価する。各患者に対して個々に選択された選択された皮膚領域の症状を、各処置前と最後の処置の3ヶ月後までの間隔で直接評価する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例25
アトピー性皮膚炎の効果パラメータ
アトピー性皮膚炎(AD)の医師の総括的評価(PGA):
研究者は、表21に記載されたスケールを使用して全体の疾患重症度に評点を付ける。評点は、過去の評価を参照しないで、患者の現在の症状を考慮してあてがわれることになる。
湿疹面積及び重症度インデックス(EASI):
4つの身体表面領域に対する皮膚炎の程度と重症度を、湿疹面積及び重症度インデックス(EASI)を使用して計算する。4つの身体領域には比例した身体表面積(BSE)を、頭部と首部が合わさって10%BSAを構成し、胴体の前部と背部がそれぞれ15%BSAを構成し、各腕が10%BSAを構成し、各脚が20%BSAを構成するように、割り当てる。身体領域の各々に関連する面積の割合に0から6のスコアが与えられ、ここで、0=発疹なし、1=<10%、2=10%から29%、3=30%から49%、4=50%から69%、5=70%から89%、及び6=90%から100%である。評価されるアトピー性皮膚炎の4つの重要な症状は、紅斑、結節/浮腫、剥脱(引っ掻きによる皮膚の線状の擦過)、及び苔癬化である。これらの症状のそれぞれが0から3のスケールを使用して4つの身体領域のそれぞれで評点化され、半分の段階が許容され、ここで0=なし、1=穏やか、2=中程度、及び3=重症である。表22に概要を述べた定義が使用される。
各身体領域に対するスコアは4つの重要な症状の重症度スコアの合計に、身体領域に関連した面積の割合を乗じ、ついでその結果に特定の身体領域にあてがわれた一定の加重値を乗じることによって得られる(表23を参照)。EASIスコアは4つの身体領域スコアの合計である。
患者の痒みスコア評価:
研究のための来診の都度に、患者は表24に示した評点を使用して最後の来診以来の痒みの重症度を評価することを求められる。
アトピー性皮膚炎の効果パラメータ
アトピー性皮膚炎(AD)の医師の総括的評価(PGA):
研究者は、表21に記載されたスケールを使用して全体の疾患重症度に評点を付ける。評点は、過去の評価を参照しないで、患者の現在の症状を考慮してあてがわれることになる。
湿疹面積及び重症度インデックス(EASI):
4つの身体表面領域に対する皮膚炎の程度と重症度を、湿疹面積及び重症度インデックス(EASI)を使用して計算する。4つの身体領域には比例した身体表面積(BSE)を、頭部と首部が合わさって10%BSAを構成し、胴体の前部と背部がそれぞれ15%BSAを構成し、各腕が10%BSAを構成し、各脚が20%BSAを構成するように、割り当てる。身体領域の各々に関連する面積の割合に0から6のスコアが与えられ、ここで、0=発疹なし、1=<10%、2=10%から29%、3=30%から49%、4=50%から69%、5=70%から89%、及び6=90%から100%である。評価されるアトピー性皮膚炎の4つの重要な症状は、紅斑、結節/浮腫、剥脱(引っ掻きによる皮膚の線状の擦過)、及び苔癬化である。これらの症状のそれぞれが0から3のスケールを使用して4つの身体領域のそれぞれで評点化され、半分の段階が許容され、ここで0=なし、1=穏やか、2=中程度、及び3=重症である。表22に概要を述べた定義が使用される。
各身体領域に対するスコアは4つの重要な症状の重症度スコアの合計に、身体領域に関連した面積の割合を乗じ、ついでその結果に特定の身体領域にあてがわれた一定の加重値を乗じることによって得られる(表23を参照)。EASIスコアは4つの身体領域スコアの合計である。
患者の痒みスコア評価:
研究のための来診の都度に、患者は表24に示した評点を使用して最後の来診以来の痒みの重症度を評価することを求められる。
実施例26
アトピー性皮膚炎に罹っている被験者のQβG10での治療と効果の評価
QβG10での治療:
二重盲検平行グループ臨床試験をアトピー性皮膚炎の36名の患者で実施する。患者はそれぞれ18名の患者の二つのグループに無作為に割り当てられる。最初のグループは1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で処置する。第二のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価:
医師総括評価(PGA)、EASIスコア、及び患者の痒みの評価(実施例25を参照)を最初の処置の前と、治療期間中は隔週で、また治療後は最初の治療後24週目の研究の終了時点まで数回、実施する。
アトピー性皮膚炎に罹っている被験者のQβG10での治療と効果の評価
QβG10での治療:
二重盲検平行グループ臨床試験をアトピー性皮膚炎の36名の患者で実施する。患者はそれぞれ18名の患者の二つのグループに無作為に割り当てられる。最初のグループは1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で処置する。第二のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価:
医師総括評価(PGA)、EASIスコア、及び患者の痒みの評価(実施例25を参照)を最初の処置の前と、治療期間中は隔週で、また治療後は最初の治療後24週目の研究の終了時点まで数回、実施する。
実施例27
喘息に罹っている被験者のQβG10又はAP205G10での治療と標準化された喘息生活の質の質問状を使用する効果の評価
27.1 喘息症状の評価:
喘息の症状を、標準化された喘息生活の質の質問状を使用して評価する(AQLQ(S)又はAQLQ12+, Juniper等, Health Qual. Life Outcomes Sept. 2005 3:58)。
27.1 QβG10又はAP205G10での治療:
喘息を患っており、AQLQ(S)又はAQLQ12+の匹敵する症状スコアを示す二つの試験グループと一つのコントロールグループを、それぞれG10(配列番号27)がパッケージされたバクテリオファージQβのVLP、G10(配列番号27)がパッケージされたバクテリオファージAP205のVLP又はプラシーボで治療する。QβG10及びAP205G10は国際公開第03/024481号の実施例16及び17に従って又は好ましくはここの実施例に従って産生される。被験者は1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのQβG10又は300μgのAP205G10で治療される。試験グループの平均症状スコアに応じて、試験グループの治療を、それぞれ300μgのVLP-G10の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
27.3 効果の評価:
各治療の前直接と最後の治療後1ヶ月と3ヶ月目にAQLQ(S)又はAQLQ12+を使用して全被験者を評点付けする。CpGパッケージ化VLPで治療した二グループとコントロールグループにおける平均スコアの発生を比較する。
喘息に罹っている被験者のQβG10又はAP205G10での治療と標準化された喘息生活の質の質問状を使用する効果の評価
27.1 喘息症状の評価:
喘息の症状を、標準化された喘息生活の質の質問状を使用して評価する(AQLQ(S)又はAQLQ12+, Juniper等, Health Qual. Life Outcomes Sept. 2005 3:58)。
27.1 QβG10又はAP205G10での治療:
喘息を患っており、AQLQ(S)又はAQLQ12+の匹敵する症状スコアを示す二つの試験グループと一つのコントロールグループを、それぞれG10(配列番号27)がパッケージされたバクテリオファージQβのVLP、G10(配列番号27)がパッケージされたバクテリオファージAP205のVLP又はプラシーボで治療する。QβG10及びAP205G10は国際公開第03/024481号の実施例16及び17に従って又は好ましくはここの実施例に従って産生される。被験者は1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのQβG10又は300μgのAP205G10で治療される。試験グループの平均症状スコアに応じて、試験グループの治療を、それぞれ300μgのVLP-G10の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
27.3 効果の評価:
各治療の前直接と最後の治療後1ヶ月と3ヶ月目にAQLQ(S)又はAQLQ12+を使用して全被験者を評点付けする。CpGパッケージ化VLPで治療した二グループとコントロールグループにおける平均スコアの発生を比較する。
実施例28
喘息の症状の評価
喘息の症状の重症度は、次のプロトコルに従ってメタコリンの投与の前後でのスパイロメトリー測定によって評価することができる。
工程1:試験溶液の調製
− 試験の20分前に冷蔵庫から試験溶液(メタコリン)を取り除き、室温までもっていく;
− 試験溶液の有効期限をチェックする;
工程2:試験患者の準備
− 患者を部屋の気温に10分間、適応させる;
− 呼吸器スパイロメーター試験を実施する(アペンディクス11.4呼吸器スパイロメトリーを参照);
− メタコリン試験の禁忌者を除外する(関連の気道閉塞、急性感染、妊婦、β-ブロッカー又は抗コリン薬)(コリン作用薬又は抗コリン作用薬);
工程3:「線量計Mefar MB3」の準備
− 右側の二つの黄色のボタン(「ユニット」、「コンプレッサー」)を押してマシンのスイッチを入れ、圧が25kg/cm2に達するまで待つ;
− 灰色の05番のボタンを押して吸入時間を定め、ついでポーズの時間050と吸入時間(N.吸入)02を決め、「リセット」を押す
− 1.5mlのNaCl0.9%を吸入セットの下方プラスチック片中に満たすことによって吸入セットを準備し、同じ数で上方部分をねじ込み、ついで吸入機器をマシンに連結する連結及びマウスピース及びホースをつける
− 「エアータンク放出」のボタンを押す
工程4:ネガティブ制御及び患者の指示
− 患者に唇にマウスピースをつけさせ、深く息をするように指示することによって、NaCl0.9%でネガティブ制御を実施する;
− 深く息を吸い込みながら、ボタン「緊急マニュアルサーミスタ」を押す;
− 一回繰り返し(以下の投薬プロトコルを参照)、ついで「終了」及び「リセット02」を押す;
− 2分間待ち、ついで呼吸器スパイロメータ試験を繰り返す;
工程5:メタコリンでの吸入誘発
− 1.5mlのメタコリン濃度10mg/mlを吸入セットの下方プラスチック片中に満たし、セットをねじ込み、「エアータンク放出」を押す;
− 患者に唇にマウスピースをつけさせ、深く息をするように指示する。深く息を吸い込みながら、ボタン「緊急マニュアルサーミスタ」を押す;
− 一回繰り返し(以下の投薬プロトコルを参照、表25)、ついで「終了」及び「リセット02」を押す;
− 2分間待ち、ついで呼吸器スパイロメータ試験を繰り返す;
喘息の症状の評価
喘息の症状の重症度は、次のプロトコルに従ってメタコリンの投与の前後でのスパイロメトリー測定によって評価することができる。
工程1:試験溶液の調製
− 試験の20分前に冷蔵庫から試験溶液(メタコリン)を取り除き、室温までもっていく;
− 試験溶液の有効期限をチェックする;
工程2:試験患者の準備
− 患者を部屋の気温に10分間、適応させる;
− 呼吸器スパイロメーター試験を実施する(アペンディクス11.4呼吸器スパイロメトリーを参照);
− メタコリン試験の禁忌者を除外する(関連の気道閉塞、急性感染、妊婦、β-ブロッカー又は抗コリン薬)(コリン作用薬又は抗コリン作用薬);
工程3:「線量計Mefar MB3」の準備
− 右側の二つの黄色のボタン(「ユニット」、「コンプレッサー」)を押してマシンのスイッチを入れ、圧が25kg/cm2に達するまで待つ;
− 灰色の05番のボタンを押して吸入時間を定め、ついでポーズの時間050と吸入時間(N.吸入)02を決め、「リセット」を押す
− 1.5mlのNaCl0.9%を吸入セットの下方プラスチック片中に満たすことによって吸入セットを準備し、同じ数で上方部分をねじ込み、ついで吸入機器をマシンに連結する連結及びマウスピース及びホースをつける
− 「エアータンク放出」のボタンを押す
工程4:ネガティブ制御及び患者の指示
− 患者に唇にマウスピースをつけさせ、深く息をするように指示することによって、NaCl0.9%でネガティブ制御を実施する;
− 深く息を吸い込みながら、ボタン「緊急マニュアルサーミスタ」を押す;
− 一回繰り返し(以下の投薬プロトコルを参照)、ついで「終了」及び「リセット02」を押す;
− 2分間待ち、ついで呼吸器スパイロメータ試験を繰り返す;
工程5:メタコリンでの吸入誘発
− 1.5mlのメタコリン濃度10mg/mlを吸入セットの下方プラスチック片中に満たし、セットをねじ込み、「エアータンク放出」を押す;
− 患者に唇にマウスピースをつけさせ、深く息をするように指示する。深く息を吸い込みながら、ボタン「緊急マニュアルサーミスタ」を押す;
− 一回繰り返し(以下の投薬プロトコルを参照、表25)、ついで「終了」及び「リセット02」を押す;
− 2分間待ち、ついで呼吸器スパイロメータ試験を繰り返す;
呼吸器スパイロメトリー(RS)のフローチャート
工程1:準備
− 使用前に毎日スパイロメータを調整する
工程2:試験
− 被験者に直立位置で座って、普通に呼吸をするように依頼する;
− 被験者に息を大きく吸って、ついで全ての空気が吐き出されるまで、スパイロメータ中にできるだけ速やかにかつ完全に吐くよう指示する;
− 更に二回(全部で三回)繰り返す;
工程3:結果
− 最善の試みを定める(最大のFEV1/FVC比として定義)。最大のFEV1/FVC比が一回を越える試みにおいて見られる場合、最善の試みは最も高いFEV1のものである;
− 最大のFEV1/FVC比が正常の70%未満である場合、「関連気道閉塞」として分類し、除外基準を証明する。その他の場合は続ける;
− 測定されたFEV1から20%を差し引き、それをFEV1−20%として定義する;
− 測定されたFEV1、「FEV1−正常」及び計算されたFEV1−20%を準備されたシートに書き写す(「メタコリン-(気管支)誘発試験」)。
工程1:準備
− 使用前に毎日スパイロメータを調整する
工程2:試験
− 被験者に直立位置で座って、普通に呼吸をするように依頼する;
− 被験者に息を大きく吸って、ついで全ての空気が吐き出されるまで、スパイロメータ中にできるだけ速やかにかつ完全に吐くよう指示する;
− 更に二回(全部で三回)繰り返す;
工程3:結果
− 最善の試みを定める(最大のFEV1/FVC比として定義)。最大のFEV1/FVC比が一回を越える試みにおいて見られる場合、最善の試みは最も高いFEV1のものである;
− 最大のFEV1/FVC比が正常の70%未満である場合、「関連気道閉塞」として分類し、除外基準を証明する。その他の場合は続ける;
− 測定されたFEV1から20%を差し引き、それをFEV1−20%として定義する;
− 測定されたFEV1、「FEV1−正常」及び計算されたFEV1−20%を準備されたシートに書き写す(「メタコリン-(気管支)誘発試験」)。
実施例29
喘息を被っている被験者のQβG10又はAP205G10での治療とメタコリン誘発投与後にスパイロメトリーを使用した効果の評価
29.1 喘息症状の評価:
喘息の症状を、実施例28に従ってメタコリン投与の前後で得られた測定値を用いたスパイロメトリーによって評価する。定量したものは、パラメータFEV1及び予想値の割合として表された努力肺活量に対するFEV1の比である。加えて、被験者(又はその両親又は保護者)が日誌カードを治験を通して毎日つけ、喘息による夜の目覚め、最大流量メータによって測定した朝と夜の最大流量、医薬の使用、症状のためで運動誘発性気管支痙攣防止のための救出医薬(アルブテロール)の使用、プレゾニドンの使用、喘息による学校の欠席/仕事の欠勤、喘息及び症状の重症度のための診療所又は病院への通院を記録する。被験者は治験を通して自身の通常の医薬を使用する。
29.2 QβG10又はAP205G10での治療:
実施例27.2を参照のこと。
29.3 効果の評価:
全被験者のスパイロメトリーのデータを各治療前で直接取得し、毎日のデータを、最初の治療前1ヶ月から最後の治療から3ヶ月後まで毎日のペースで得る。分析するのは例えば毎月の夜の目覚めに関連した喘息の回数、エピソードのない日の数及び朝の最大流量である。CpGパッケージ化VLPで治療した二グループの平均データをプラシーボグループと比較する。
喘息を被っている被験者のQβG10又はAP205G10での治療とメタコリン誘発投与後にスパイロメトリーを使用した効果の評価
29.1 喘息症状の評価:
喘息の症状を、実施例28に従ってメタコリン投与の前後で得られた測定値を用いたスパイロメトリーによって評価する。定量したものは、パラメータFEV1及び予想値の割合として表された努力肺活量に対するFEV1の比である。加えて、被験者(又はその両親又は保護者)が日誌カードを治験を通して毎日つけ、喘息による夜の目覚め、最大流量メータによって測定した朝と夜の最大流量、医薬の使用、症状のためで運動誘発性気管支痙攣防止のための救出医薬(アルブテロール)の使用、プレゾニドンの使用、喘息による学校の欠席/仕事の欠勤、喘息及び症状の重症度のための診療所又は病院への通院を記録する。被験者は治験を通して自身の通常の医薬を使用する。
29.2 QβG10又はAP205G10での治療:
実施例27.2を参照のこと。
29.3 効果の評価:
全被験者のスパイロメトリーのデータを各治療前で直接取得し、毎日のデータを、最初の治療前1ヶ月から最後の治療から3ヶ月後まで毎日のペースで得る。分析するのは例えば毎月の夜の目覚めに関連した喘息の回数、エピソードのない日の数及び朝の最大流量である。CpGパッケージ化VLPで治療した二グループの平均データをプラシーボグループと比較する。
実施例30
皮膚プリックテスト
皮膚プリックテスト(SPT)は、被験者がある種のアレルゲンに対して過敏化を示すことを証明するために実施される。該テストは、花粉アレルゲン及びアトピーのスクリーニングに常套的に使用されるアレルゲンミックスを含む広範囲のアレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。該テストはチリダニアレルゲン(Der p及びDer f)に対する反応を試験するのに有用である。スクリーニングでは、このテストはCPTの前に実施されなければならない(実施例31)。皮膚プリックテスト及び皮内皮膚テストは過敏化の可視化を可能にする。皮膚テストの基本原理は、真皮中への少量のアレルゲンの導入である。放出されたメディエータが血管拡張を引き起こして血管透過性を増大させ、これがついで組織浮腫に至り、みみず腫れを生じさせる。ヒスタミンが軸索反射によってニューロメディエータのサブスタンスPの放出を惹起し、これが周りの皮膚の発赤を生じさせる。
アレルゲンの約30mlの連続希釈物の小液滴を前腕の手掌表面に配する。テスト部位は擬陽性反応を避けるために少なくとも2cm離さなければならない。いわゆるプリック針、つまり皮膚中に直角に穿刺され得る針を使用して、アレルゲン溶液を真皮中に「穿刺」し、高度に再現性のある結果を得る。ネガティブコントロールについては、アレルゲン溶液の希釈剤を使用する。ヒスタミンがポジティブコントロールとして使用され、医薬(主として抗ヒスタミン薬)による皮膚反応性の抑制を検出する。1mg/mlのヒスタミン溶液が直径2−7mmの範囲の腫れを誘発する。
腫れ及び発赤反応の面積を15分後に記録する。永久的な記録を得るために、腫れ並びに発赤のサイズをペンで皮膚の上に描き、セロハンテープ上にブロットし、ペーパー上に保存する。腫れと発赤の両面積を面積測定によって評価する。従って、反応がコンピュータによってスキャンされ、表面積が市販のソフトウェアを使用して測定される。7mm2以上の腫れサイズが陽性とみなされる。
ヒスタミンに対する皮膚の反応における個人間の変動がかなりあることを知った上で、反応をポジティブコントロールに対する割合でスコア付けする。限界希釈法の評価は平行線生物検定及び中央値傾きに基づく。
皮膚プリックテスト
皮膚プリックテスト(SPT)は、被験者がある種のアレルゲンに対して過敏化を示すことを証明するために実施される。該テストは、花粉アレルゲン及びアトピーのスクリーニングに常套的に使用されるアレルゲンミックスを含む広範囲のアレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。該テストはチリダニアレルゲン(Der p及びDer f)に対する反応を試験するのに有用である。スクリーニングでは、このテストはCPTの前に実施されなければならない(実施例31)。皮膚プリックテスト及び皮内皮膚テストは過敏化の可視化を可能にする。皮膚テストの基本原理は、真皮中への少量のアレルゲンの導入である。放出されたメディエータが血管拡張を引き起こして血管透過性を増大させ、これがついで組織浮腫に至り、みみず腫れを生じさせる。ヒスタミンが軸索反射によってニューロメディエータのサブスタンスPの放出を惹起し、これが周りの皮膚の発赤を生じさせる。
アレルゲンの約30mlの連続希釈物の小液滴を前腕の手掌表面に配する。テスト部位は擬陽性反応を避けるために少なくとも2cm離さなければならない。いわゆるプリック針、つまり皮膚中に直角に穿刺され得る針を使用して、アレルゲン溶液を真皮中に「穿刺」し、高度に再現性のある結果を得る。ネガティブコントロールについては、アレルゲン溶液の希釈剤を使用する。ヒスタミンがポジティブコントロールとして使用され、医薬(主として抗ヒスタミン薬)による皮膚反応性の抑制を検出する。1mg/mlのヒスタミン溶液が直径2−7mmの範囲の腫れを誘発する。
腫れ及び発赤反応の面積を15分後に記録する。永久的な記録を得るために、腫れ並びに発赤のサイズをペンで皮膚の上に描き、セロハンテープ上にブロットし、ペーパー上に保存する。腫れと発赤の両面積を面積測定によって評価する。従って、反応がコンピュータによってスキャンされ、表面積が市販のソフトウェアを使用して測定される。7mm2以上の腫れサイズが陽性とみなされる。
ヒスタミンに対する皮膚の反応における個人間の変動がかなりあることを知った上で、反応をポジティブコントロールに対する割合でスコア付けする。限界希釈法の評価は平行線生物検定及び中央値傾きに基づく。
皮膚プリックテスト(SPT)のフローチャート
工程1:準備
− 最近受けた投薬療法(コルチコステロイド、抗アレルギー療法、鎮静剤及び抗うつ薬療法)について質問し、SPTに対する禁忌者を除く;
− 試験溶液をチェックする(有効期間、管理温度、必要とされる体温);
− アルコールで試験部位(腕の掌側)を清浄化する。ペンを使用して、アレルゲンを穿刺する領域をマークする。これらの穿刺部位は少なくとも2cm離しておかなければならない;
− チリダニに使用される濃度は1:1000、1:100、1:10及び1:1である。
工程2:テスト
− アレルゲン溶液の一滴を皮膚の各マーク領域に配する。1mmポイントの殺菌プリックランセットを用いて皮膚に液滴を穿刺する。これは血が出ないようにしてする。アレルゲンのキャリーオーバーを防ぐために、ランセットは穿刺間がアルコールスワブで拭い取られる;
− ハウスダストのチリダニアレルゲンテストは、1:1000、1:100、1:10及び1:1のアレルゲン濃度で実施する;
− ポジティブ(ヒスタミン)及びネガティブコントロール(希釈剤)が含められなければならない;
− 1分後に、溶液をテスト部位にブロットし、拭い取ってはいけない;
− 30分待つ;
工程3:結果
− テスト部位をアルコールと、ついで創傷ベンジンで拭い、マーカーペンで紅斑及び浮腫の周りにラインを引く;
− テスト部位の透明なスコッチテープを貼り、ついで引き剥がし、ペーパーシートに貼り付ける;
− 紅斑及び浮腫の直径及び/又は面積を決定する。ソースドキュメントに測定値を記録し、症例報告用紙に書き写す;
− 痒いテスト部位は抗ヒスタミンゲルで局所的に処理することができる;
アレルギー反応は常にコントロール反応(希釈剤のみ)に対して評価される。典型的には、被験者は、少なくとも6mm直径の少なくとも一つの浮腫又は紅斑あるいは少なくとも7mm2の面積の少なくとも一つの浮腫又は紅斑を示す場合、アレルギーであると考えられる。
工程1:準備
− 最近受けた投薬療法(コルチコステロイド、抗アレルギー療法、鎮静剤及び抗うつ薬療法)について質問し、SPTに対する禁忌者を除く;
− 試験溶液をチェックする(有効期間、管理温度、必要とされる体温);
− アルコールで試験部位(腕の掌側)を清浄化する。ペンを使用して、アレルゲンを穿刺する領域をマークする。これらの穿刺部位は少なくとも2cm離しておかなければならない;
− チリダニに使用される濃度は1:1000、1:100、1:10及び1:1である。
工程2:テスト
− アレルゲン溶液の一滴を皮膚の各マーク領域に配する。1mmポイントの殺菌プリックランセットを用いて皮膚に液滴を穿刺する。これは血が出ないようにしてする。アレルゲンのキャリーオーバーを防ぐために、ランセットは穿刺間がアルコールスワブで拭い取られる;
− ハウスダストのチリダニアレルゲンテストは、1:1000、1:100、1:10及び1:1のアレルゲン濃度で実施する;
− ポジティブ(ヒスタミン)及びネガティブコントロール(希釈剤)が含められなければならない;
− 1分後に、溶液をテスト部位にブロットし、拭い取ってはいけない;
− 30分待つ;
工程3:結果
− テスト部位をアルコールと、ついで創傷ベンジンで拭い、マーカーペンで紅斑及び浮腫の周りにラインを引く;
− テスト部位の透明なスコッチテープを貼り、ついで引き剥がし、ペーパーシートに貼り付ける;
− 紅斑及び浮腫の直径及び/又は面積を決定する。ソースドキュメントに測定値を記録し、症例報告用紙に書き写す;
− 痒いテスト部位は抗ヒスタミンゲルで局所的に処理することができる;
アレルギー反応は常にコントロール反応(希釈剤のみ)に対して評価される。典型的には、被験者は、少なくとも6mm直径の少なくとも一つの浮腫又は紅斑あるいは少なくとも7mm2の面積の少なくとも一つの浮腫又は紅斑を示す場合、アレルギーであると考えられる。
実施例31
結膜誘発試験
アレルゲンに対する患者の応答は、次の手順に従って実施されるいわゆる結膜誘発試験を使用して評価することができる。該試験は、花粉アレルゲンを含む広範囲のアレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。該試験はチリダニアレルゲン(Der p及びDer f)に対する反応を試験するのに有用である。
結膜誘発試験
アレルゲンに対する患者の応答は、次の手順に従って実施されるいわゆる結膜誘発試験を使用して評価することができる。該試験は、花粉アレルゲンを含む広範囲のアレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。該試験はチリダニアレルゲン(Der p及びDer f)に対する反応を試験するのに有用である。
結膜誘発試験(CPT)のフローチャート:
工程1:準備
− 患者を10分間部屋の気候に適合させる;
− 試験溶液をチェックする(有効期間、管理温度、必要とされる体温);
− 誘発の最初の時点では眼に痒みがないことを確認する;
− CPTに対する禁忌者を除外する(あらゆる眼の疾患、但し屈折異常又はアレルギー性結膜炎を除く、コンタクトレンズ、抗アレルギー治療);
工程2:コントロール
− 左眼(コントロール眼)の下部結膜嚢中にアレルゲン内容物を除いたアレルゲン溶液と同一のコントロール溶液を50μl投与する;
工程3:アレルゲン濃度1での誘発
− コントロール溶液の適用直後に、右/反対眼(誘発眼)の下部結膜嚢中にアレルゲン溶液濃度1を50μl投与する;
− 患者に眼をこすらないように知らせる;
− 10分待った後、CPTに対する二つの症状スコアを記入する;
工程4:アレルゲンでの誘発に対する応答
− 陽性の場合は、抗ヒスタミンを局所投与しCPTを止める;
− 陰性の場合には、誘発眼に次に高いアレルゲン濃度で濃度4まで誘発を繰り返す(工程5を参照);
− 濃度4での誘発後に陰性の場合、陰性として分類して停止する;
工程5:次の高いアレルゲン濃度での誘発
− 反対眼(誘発眼)の下部結膜嚢中に次に高い濃度のアレルゲン溶液を50μl投与する;
− 患者に眼をこすらないように知らせる;
− 10分待った後、CPTに対する二つの症状スコアを記入する(工程4参照);
工程1:準備
− 患者を10分間部屋の気候に適合させる;
− 試験溶液をチェックする(有効期間、管理温度、必要とされる体温);
− 誘発の最初の時点では眼に痒みがないことを確認する;
− CPTに対する禁忌者を除外する(あらゆる眼の疾患、但し屈折異常又はアレルギー性結膜炎を除く、コンタクトレンズ、抗アレルギー治療);
工程2:コントロール
− 左眼(コントロール眼)の下部結膜嚢中にアレルゲン内容物を除いたアレルゲン溶液と同一のコントロール溶液を50μl投与する;
工程3:アレルゲン濃度1での誘発
− コントロール溶液の適用直後に、右/反対眼(誘発眼)の下部結膜嚢中にアレルゲン溶液濃度1を50μl投与する;
− 患者に眼をこすらないように知らせる;
− 10分待った後、CPTに対する二つの症状スコアを記入する;
工程4:アレルゲンでの誘発に対する応答
− 陽性の場合は、抗ヒスタミンを局所投与しCPTを止める;
− 陰性の場合には、誘発眼に次に高いアレルゲン濃度で濃度4まで誘発を繰り返す(工程5を参照);
− 濃度4での誘発後に陰性の場合、陰性として分類して停止する;
工程5:次の高いアレルゲン濃度での誘発
− 反対眼(誘発眼)の下部結膜嚢中に次に高い濃度のアレルゲン溶液を50μl投与する;
− 患者に眼をこすらないように知らせる;
− 10分待った後、CPTに対する二つの症状スコアを記入する(工程4参照);
CPTでのアレルゲンに対する応答の分類(段階基準)
0:主観的な又は可視可能な反応なし;
I:痒み、発赤、異物感;
II:段階Iに加えて、涙、結膜肉芽の血管拡張;
III:段階IIに加えて、結膜足根の血管拡張及び紅斑、眼瞼痙攣;
IV:段階IIIに加えて、結膜浮腫、眼瞼膨張;
段階は次の溶液(標準的なアレルゲン溶液の希釈係数)で決定される:ネガティブ溶液;濃度I:1:1000、濃度II:1:100;濃度III;1:10;及び濃度IV:1:1;CPTは応答が段階II以上の場合に陽性である。
症状は、5つの異なったパラメータに対して0から3のスコアを付与するCPTのスコアシート(表26)を使用してスコア付けがなされる。よって、最大のスコアは一回の誘発当たり15である。CPTは全応答が>10であれば陽性である。
0:主観的な又は可視可能な反応なし;
I:痒み、発赤、異物感;
II:段階Iに加えて、涙、結膜肉芽の血管拡張;
III:段階IIに加えて、結膜足根の血管拡張及び紅斑、眼瞼痙攣;
IV:段階IIIに加えて、結膜浮腫、眼瞼膨張;
段階は次の溶液(標準的なアレルゲン溶液の希釈係数)で決定される:ネガティブ溶液;濃度I:1:1000、濃度II:1:100;濃度III;1:10;及び濃度IV:1:1;CPTは応答が段階II以上の場合に陽性である。
症状は、5つの異なったパラメータに対して0から3のスコアを付与するCPTのスコアシート(表26)を使用してスコア付けがなされる。よって、最大のスコアは一回の誘発当たり15である。CPTは全応答が>10であれば陽性である。
実施例32
鼻粘膜誘発試験
鼻粘膜誘発試験は、広範囲のアレルゲン、特に花粉アレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。鼻はアレルゲンの誘発のためには理想的な部位を提供する。アレルゲンは高度の精確さをもって粘膜に適用できる。誘発手順は自然の暴露を反映するものでなければならない。高い再現性を有する定量測定は重要である(Andersson M, L. Greiff, C. Svensson及びC. Persson. Acta Otolaryngol. 115 (1995), pp.705-713)。最近、Bousquet (Bousquet J, P. van Cauwenberge及びN. Khaltaev. Aria Workshop Group; WHO, J. Allergy Clin. Immunol. 108 (2001), pp. S147-334.)及びARIAワークショップグループは、アレルギー性鼻炎とその喘息に対する影響に関する文献を提示し(Bousquet等, 2001)、適応、技術及び試験の評価に関して(Malm L, R. Gerth van Wijk及びC. Bachert. Rhinology 38 (2000), pp.1-6)鼻粘膜誘発試験のための「鼻気道の客観的評価についての国際委員会(International Committee on Objective Assessment of the Nasal Airways)」の小委員会からのガイドラインを提供している。また、アレルギー学及び臨床免疫学のための独国学会(German Society for Allergology and Clinical Immunology)は、独国耳鼻咽喉学会の臨床免疫学、アレルギー学及び環境医薬のワーキンググループ(Working Group for Clinical Immunology, Allergology and Environemental Medicine of the German Society for Ear, Nose and Throat)と共に方針説明書を作成した(Reichelmann等 Position statement. Allergo J (2002) 11:29-36.)。
アレルゲンの沈着及びアレルゲン投薬:鼻ポンプスプレーが鼻粘膜の広い領域に溶液を送達させるので、アレルゲンの溶液は定量ポンプスプレーから送達される。アレルゲン溶液は、中性pHの等張緩衝水溶液である。生理食塩水での1:3連続希釈物が試験の前に新たに調製される。正確なアレルゲン濃度は過去の研究で決定される。アレルゲン溶液は100μlの体積で適用される。
NPTの禁忌者:最近の4週間での鼻炎のエピソード;アレルギー疾患増悪;アナフィラキシー反応を引き起こしたことが知られているアレルゲンの使用;妊娠;最近の8週間での鼻の手術;併発している重症の全身病、特に心肺疾患;全身性アレルギー反応の治療を妨害しうる医薬での治療(例えばβブロッカー又はACE阻害剤);試験1週間前のワクチン接種。
鼻粘膜誘発試験を妨害することが知られている医薬の退薬期間:全身性抗ヒスタミン薬:その半減期に応じて48時間から1週間;経鼻抗ヒスタミン薬:1週間;ケトチフェン:2週間;DNCG、ネドクロミル:3日間;経鼻コルチコステロイド:1週間;全身性コルチコステロイド:1週間;局所用βアドレナリン作動薬:1日;非ステロイド系抗炎症薬(NSAID):1週間;降圧薬(例えばレセルピン、クロニジン):3週間;抗うつ薬(例えばイミプラミン、三環系):3日。
鼻粘膜誘発試験
鼻粘膜誘発試験は、広範囲のアレルゲン、特に花粉アレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。鼻はアレルゲンの誘発のためには理想的な部位を提供する。アレルゲンは高度の精確さをもって粘膜に適用できる。誘発手順は自然の暴露を反映するものでなければならない。高い再現性を有する定量測定は重要である(Andersson M, L. Greiff, C. Svensson及びC. Persson. Acta Otolaryngol. 115 (1995), pp.705-713)。最近、Bousquet (Bousquet J, P. van Cauwenberge及びN. Khaltaev. Aria Workshop Group; WHO, J. Allergy Clin. Immunol. 108 (2001), pp. S147-334.)及びARIAワークショップグループは、アレルギー性鼻炎とその喘息に対する影響に関する文献を提示し(Bousquet等, 2001)、適応、技術及び試験の評価に関して(Malm L, R. Gerth van Wijk及びC. Bachert. Rhinology 38 (2000), pp.1-6)鼻粘膜誘発試験のための「鼻気道の客観的評価についての国際委員会(International Committee on Objective Assessment of the Nasal Airways)」の小委員会からのガイドラインを提供している。また、アレルギー学及び臨床免疫学のための独国学会(German Society for Allergology and Clinical Immunology)は、独国耳鼻咽喉学会の臨床免疫学、アレルギー学及び環境医薬のワーキンググループ(Working Group for Clinical Immunology, Allergology and Environemental Medicine of the German Society for Ear, Nose and Throat)と共に方針説明書を作成した(Reichelmann等 Position statement. Allergo J (2002) 11:29-36.)。
アレルゲンの沈着及びアレルゲン投薬:鼻ポンプスプレーが鼻粘膜の広い領域に溶液を送達させるので、アレルゲンの溶液は定量ポンプスプレーから送達される。アレルゲン溶液は、中性pHの等張緩衝水溶液である。生理食塩水での1:3連続希釈物が試験の前に新たに調製される。正確なアレルゲン濃度は過去の研究で決定される。アレルゲン溶液は100μlの体積で適用される。
NPTの禁忌者:最近の4週間での鼻炎のエピソード;アレルギー疾患増悪;アナフィラキシー反応を引き起こしたことが知られているアレルゲンの使用;妊娠;最近の8週間での鼻の手術;併発している重症の全身病、特に心肺疾患;全身性アレルギー反応の治療を妨害しうる医薬での治療(例えばβブロッカー又はACE阻害剤);試験1週間前のワクチン接種。
鼻粘膜誘発試験を妨害することが知られている医薬の退薬期間:全身性抗ヒスタミン薬:その半減期に応じて48時間から1週間;経鼻抗ヒスタミン薬:1週間;ケトチフェン:2週間;DNCG、ネドクロミル:3日間;経鼻コルチコステロイド:1週間;全身性コルチコステロイド:1週間;局所用βアドレナリン作動薬:1日;非ステロイド系抗炎症薬(NSAID):1週間;降圧薬(例えばレセルピン、クロニジン):3週間;抗うつ薬(例えばイミプラミン、三環系):3日。
鼻粘膜誘発試験の技術と実施プロトコル
ベースライン条件を評価するためにNPTに先だって、前側又は後側鼻鏡検査、好ましくは前側鼻鏡検査を含む鼻鏡検査を実施する。鼻鏡検査によるベースライン評価及び臨床症状スコア、並びに鼻腔通気度検査の前の少なくとも15分、患者を室温に十分に適合させる。鼻の広い側が誘発に使用される。実際のアレルゲン溶液の投与前に、鼻の広い側の鼻粘膜に、非特定の応答性亢進のために100μlのアレルゲン希釈剤を誘発投与する。スコア及び鼻腔通気度検査の評価を10分後に繰り返して、臨床的症状又は鼻疎通性の客観的測定値の有意な変化をチェックする。有意な変化が生じていないならば、鼻の広い側について実際のアレルゲン誘発を実施する。送達装置のアプリケータを鼻前庭に挿入し、眼の内眼角に向けて上方かつ側方に向け、100μLのアレルゲン試験溶液を鼻内に噴霧するときに下及び中鼻甲粘膜にアレルゲンを付着させる。アレルゲン投与中、患者は下気道へのアレルゲンの吸入を避けるために息を止めなければならない。患者には投与前に吸い込み投与直後に吐くように指示する。
ベースライン条件を評価するためにNPTに先だって、前側又は後側鼻鏡検査、好ましくは前側鼻鏡検査を含む鼻鏡検査を実施する。鼻鏡検査によるベースライン評価及び臨床症状スコア、並びに鼻腔通気度検査の前の少なくとも15分、患者を室温に十分に適合させる。鼻の広い側が誘発に使用される。実際のアレルゲン溶液の投与前に、鼻の広い側の鼻粘膜に、非特定の応答性亢進のために100μlのアレルゲン希釈剤を誘発投与する。スコア及び鼻腔通気度検査の評価を10分後に繰り返して、臨床的症状又は鼻疎通性の客観的測定値の有意な変化をチェックする。有意な変化が生じていないならば、鼻の広い側について実際のアレルゲン誘発を実施する。送達装置のアプリケータを鼻前庭に挿入し、眼の内眼角に向けて上方かつ側方に向け、100μLのアレルゲン試験溶液を鼻内に噴霧するときに下及び中鼻甲粘膜にアレルゲンを付着させる。アレルゲン投与中、患者は下気道へのアレルゲンの吸入を避けるために息を止めなければならない。患者には投与前に吸い込み投与直後に吐くように指示する。
応答の測定
鼻の症状の記録を3つの一般的な方法に従って平行して実施する(Bachert C: Nasal provocation test: critical evaluation. Ring J, Behrendt HD編: New trends in allergy, IV, Berlin, 1997, Vieluf Springer-Verlag, p 277)。
スコア1:各鼻の症状の重症度を10cmの線形の可視アナログスケールに記録する。ついで、重症度を、希釈剤(ネガティブコントロール)及び各誘発用量で得られたスコア(軽度1−3cm;中程度4−7cm;重症8−10cm)に基づいて評価する。
スコア2:これらのパラメータの標準化された定量のための実際のスコアリング系で、独国アレルギー学及び臨床免疫学学会のENT部によって提案されたものを表27にまとめる(Reichelmann等 Position statement. Allergo J (2002) 11:29-36.)。
スコア3:このスコアはしばしば臨床研究と科学的研究の双方において使用される(Linder, 1988)。エンドポイントは13ポイントの最大スコアから5の全症状スコアをもたらす刺激薬の量と考える(表28)。
鼻漏:0=軽度、1=中程度、3=重症;くしゃみ:0=0−2回のくしゃみ;1ポイント=3−5回のくしゃみ;2ポイント=>5回のくしゃみ。他の症状は痒み又は涙(1ポイント)及び結膜炎、咳、蕁麻疹、又は呼吸困難(2ポイント)を含む。
エンドポイント:アレルゲン誘発後、患者がスコア2において3ポイントより多く取得するか、又は鼻流量の減少が150Paで>40%ならば、エンドポイントに達する。エンドポイントにはまた、スコア2の>2ポイントと関連して鼻流量の減少が150Paで>20%の場合に達する。
鼻疎通性の客観的測定:鼻の気道空間体積及び疎通性を前側鼻腔通気度検査によって評価する。経鼻圧に応じた時間に一鼻孔中における経鼻的気流を分析するように設計され、これは周期的呼吸中に反対側が評価される。鼻疎通性の完全な従来の評価では、この方法は、鼻孔内の断面積として鼻の形状を記録する音響鼻腔計測法と併用される。
前側鼻腔通気度検査及び音響鼻腔検査法の双方の結果が図解的に可視化され分析と文書化が容易にされる。NPT前後の測定は、各分析器によって計算される鼻流量(cm3/s)及び断面積(cm2)の正確な数と組み合わせてこれらのグラフを使用して容易に比較され正確に評価される。
鼻の症状の記録を3つの一般的な方法に従って平行して実施する(Bachert C: Nasal provocation test: critical evaluation. Ring J, Behrendt HD編: New trends in allergy, IV, Berlin, 1997, Vieluf Springer-Verlag, p 277)。
スコア1:各鼻の症状の重症度を10cmの線形の可視アナログスケールに記録する。ついで、重症度を、希釈剤(ネガティブコントロール)及び各誘発用量で得られたスコア(軽度1−3cm;中程度4−7cm;重症8−10cm)に基づいて評価する。
スコア2:これらのパラメータの標準化された定量のための実際のスコアリング系で、独国アレルギー学及び臨床免疫学学会のENT部によって提案されたものを表27にまとめる(Reichelmann等 Position statement. Allergo J (2002) 11:29-36.)。
スコア3:このスコアはしばしば臨床研究と科学的研究の双方において使用される(Linder, 1988)。エンドポイントは13ポイントの最大スコアから5の全症状スコアをもたらす刺激薬の量と考える(表28)。
鼻漏:0=軽度、1=中程度、3=重症;くしゃみ:0=0−2回のくしゃみ;1ポイント=3−5回のくしゃみ;2ポイント=>5回のくしゃみ。他の症状は痒み又は涙(1ポイント)及び結膜炎、咳、蕁麻疹、又は呼吸困難(2ポイント)を含む。
エンドポイント:アレルゲン誘発後、患者がスコア2において3ポイントより多く取得するか、又は鼻流量の減少が150Paで>40%ならば、エンドポイントに達する。エンドポイントにはまた、スコア2の>2ポイントと関連して鼻流量の減少が150Paで>20%の場合に達する。
鼻疎通性の客観的測定:鼻の気道空間体積及び疎通性を前側鼻腔通気度検査によって評価する。経鼻圧に応じた時間に一鼻孔中における経鼻的気流を分析するように設計され、これは周期的呼吸中に反対側が評価される。鼻疎通性の完全な従来の評価では、この方法は、鼻孔内の断面積として鼻の形状を記録する音響鼻腔計測法と併用される。
前側鼻腔通気度検査及び音響鼻腔検査法の双方の結果が図解的に可視化され分析と文書化が容易にされる。NPT前後の測定は、各分析器によって計算される鼻流量(cm3/s)及び断面積(cm2)の正確な数と組み合わせてこれらのグラフを使用して容易に比較され正確に評価される。
実施例33
花粉アレルギー及びアトピー性湿疹を煩っている被験者のQβG10での治療と鼻粘膜誘発試験を使用する効果の評価
花粉アレルギー及びアトピー性湿疹を煩っている個人を1週間の間隔で300μgのQβG10の皮下注射により4回治療した。実施例30に従う皮膚プリックテスト及び実施例32に従う鼻粘膜誘発試験をベースラインを決定するための最初の治療の前の日に実施した。鼻粘膜誘発試験は、1:1000、1:100、1:10及び1:1の希釈の花粉アレルゲンを含む市販の誘発剤を用いて実施し、第二の治療の1週間後(第三の治療の前直接)と第四の治療の1週間後に繰り返した。被験者の反応を実施例32に記載しているようにスコア2及びスコア3を使用して評点を付けた。加えて、くしゃみの回数を記録した(表31)。表29−31に示されるように、三つ全てのパラメータはアレルゲン誘発に対する被験者の反応の有意な減少を示している。加えて、初冬に症状が出る、典型的にアトピー性湿疹を被っている被験者は、晩秋に実施された試験後にアトピー性湿疹の症状が全くなくなったことが報告された。後者の知見はアトピー性湿疹に対する処置の予防効果を示すものである。
花粉アレルギー及びアトピー性湿疹を煩っている被験者のQβG10での治療と鼻粘膜誘発試験を使用する効果の評価
花粉アレルギー及びアトピー性湿疹を煩っている個人を1週間の間隔で300μgのQβG10の皮下注射により4回治療した。実施例30に従う皮膚プリックテスト及び実施例32に従う鼻粘膜誘発試験をベースラインを決定するための最初の治療の前の日に実施した。鼻粘膜誘発試験は、1:1000、1:100、1:10及び1:1の希釈の花粉アレルゲンを含む市販の誘発剤を用いて実施し、第二の治療の1週間後(第三の治療の前直接)と第四の治療の1週間後に繰り返した。被験者の反応を実施例32に記載しているようにスコア2及びスコア3を使用して評点を付けた。加えて、くしゃみの回数を記録した(表31)。表29−31に示されるように、三つ全てのパラメータはアレルゲン誘発に対する被験者の反応の有意な減少を示している。加えて、初冬に症状が出る、典型的にアトピー性湿疹を被っている被験者は、晩秋に実施された試験後にアトピー性湿疹の症状が全くなくなったことが報告された。後者の知見はアトピー性湿疹に対する処置の予防効果を示すものである。
実施例34
花粉アレルギーを煩っている被験者のQβG10及びQβG8−8での治療と鼻粘膜誘発試験を使用する効果の評価
34.1 QβG10 QβG8−8での治療:
皮膚プリック及び鼻粘膜誘発試験(実施例30及び32を参照)でのベースラインの決定後、花粉アレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)がパッケージされたQβVLP)で治療する。第二のグループはG8−8(配列番号25)がパッケージされた300μgのQβで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ300μgのQβG10又はQβG8−8の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
34.2 効果の評価:
各治療前と最後の治療後の3ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
花粉アレルギーを煩っている被験者のQβG10及びQβG8−8での治療と鼻粘膜誘発試験を使用する効果の評価
34.1 QβG10 QβG8−8での治療:
皮膚プリック及び鼻粘膜誘発試験(実施例30及び32を参照)でのベースラインの決定後、花粉アレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)がパッケージされたQβVLP)で治療する。第二のグループはG8−8(配列番号25)がパッケージされた300μgのQβで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ300μgのQβG10又はQβG8−8の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
34.2 効果の評価:
各治療前と最後の治療後の3ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例35
ハウスダストアレルギーを煩っている被験者のQβG10及びQβG8−8での治療と結膜誘発試験を使用する効果の評価
35.1 QβG10 QβG8−8での治療:
皮膚プリック及び結膜誘発試験(実施例30及び31を参照)でのベースラインの決定後、ハウスダストアレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)がパッケージされたQβVLP)で治療する。第二のグループはG8−8(配列番号25)がパッケージされた300μgのQβで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ300μgのQβG10又はQβG8−8の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
35.2 効果の評価:
各治療前と最後の治療後の3ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
ハウスダストアレルギーを煩っている被験者のQβG10及びQβG8−8での治療と結膜誘発試験を使用する効果の評価
35.1 QβG10 QβG8−8での治療:
皮膚プリック及び結膜誘発試験(実施例30及び31を参照)でのベースラインの決定後、ハウスダストアレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)がパッケージされたQβVLP)で治療する。第二のグループはG8−8(配列番号25)がパッケージされた300μgのQβで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ300μgのQβG10又はQβG8−8の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
35.2 効果の評価:
各治療前と最後の治療後の3ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例36
ハウスダストアレルギーを煩っている被験者のHBc及びHBcG8−8での治療と結膜誘発試験を使用する効果の評価
36.1 HBcG10 HBcG8−8での治療:
皮膚プリック及び結膜誘発試験(実施例30及び31を参照)でのベースラインの決定後、ハウスダストアレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのHBcG10(G10(配列番号27)がパッケージされたHBcVLP)で治療する。第二のグループはG8−8(配列番号25)がパッケージされた300μgのHBcで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ300μgのHBcG10又はHBcG8−8の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
36.2 効果の評価:
各治療前と最後の治療後の3ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
ハウスダストアレルギーを煩っている被験者のHBc及びHBcG8−8での治療と結膜誘発試験を使用する効果の評価
36.1 HBcG10 HBcG8−8での治療:
皮膚プリック及び結膜誘発試験(実施例30及び31を参照)でのベースラインの決定後、ハウスダストアレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは1週間の間隔で少なくとも3回、300μgのHBcG10(G10(配列番号27)がパッケージされたHBcVLP)で治療する。第二のグループはG8−8(配列番号25)がパッケージされた300μgのHBcで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ300μgのHBcG10又はHBcG8−8の全6から10のワクチン接種まで繰り返すことができる;コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
36.2 効果の評価:
各治療前と最後の治療後の3ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例37
花粉アレルギーを被っている被験者のQβG10での治療と鼻粘膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
QβG10での治療:
非盲検臨床試験を花粉にアレルギーのある患者で実施した。患者は、1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で治療した。
効果の評価:
標準化された花粉抽出物での鼻粘膜誘発試験(実施例32を参照)を、最初の処置の前と、最後の治療の2週間後に実施した。鼻粘膜誘発試験はまた最初の治療後6ヶ月目と12ヶ月目にも実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点において評価する。また様々な量の花粉アレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト(実施例30を参照)で効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療の後に最初の花粉シーズン中における症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。有効な患者の日誌はまた治療後の第二の花粉シーズンの間の症状と使用医薬を記録するためにも使用される。
鼻粘膜誘発試験:
300μgのQβG10の6回の毎週の注射によって治療した花粉アレルギーの5名の患者について治療前と治療後2週間目に鼻粘膜誘発試験(実施例32)を実施した。表32に示されるように、これらの患者は、治療前のその反応と比較して低下した症状スコアを示した。
花粉アレルギーを被っている被験者のQβG10での治療と鼻粘膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
QβG10での治療:
非盲検臨床試験を花粉にアレルギーのある患者で実施した。患者は、1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で治療した。
効果の評価:
標準化された花粉抽出物での鼻粘膜誘発試験(実施例32を参照)を、最初の処置の前と、最後の治療の2週間後に実施した。鼻粘膜誘発試験はまた最初の治療後6ヶ月目と12ヶ月目にも実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点において評価する。また様々な量の花粉アレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト(実施例30を参照)で効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療の後に最初の花粉シーズン中における症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。有効な患者の日誌はまた治療後の第二の花粉シーズンの間の症状と使用医薬を記録するためにも使用される。
鼻粘膜誘発試験:
300μgのQβG10の6回の毎週の注射によって治療した花粉アレルギーの5名の患者について治療前と治療後2週間目に鼻粘膜誘発試験(実施例32)を実施した。表32に示されるように、これらの患者は、治療前のその反応と比較して低下した症状スコアを示した。
実施例38
花粉アレルギーを被っている被験者のQβG10での治療と結膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
QβG10での治療:
二重盲検平行グループ臨床試験を花粉にアレルギーのある30名の患者で実施する。患者はそれぞれ10名の患者の三グループに無作為に割り当てられる。最初のグループは1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で処置する。第二のグループは1週間の間隔で6回、水酸化アルミニウムアジュバントと組み合わせた300μgのQβG10で処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価:
標準化された花粉抽出物での結膜誘発試験(実施例31を参照)を、最初の処置の前と、最後の治療の2週間後と、最初の治療後6ヶ月と12ヶ月で実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点においてグループ間で比較する。また様々な量の花粉アレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト(実施例30を参照)用いて効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療の後に最初の花粉シーズン中における症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。有効な患者の日誌はまた治療後の第二の花粉シーズンの間の症状と使用医薬を記録するためにも使用される。
花粉アレルギーを被っている被験者のQβG10での治療と結膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
QβG10での治療:
二重盲検平行グループ臨床試験を花粉にアレルギーのある30名の患者で実施する。患者はそれぞれ10名の患者の三グループに無作為に割り当てられる。最初のグループは1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で処置する。第二のグループは1週間の間隔で6回、水酸化アルミニウムアジュバントと組み合わせた300μgのQβG10で処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価:
標準化された花粉抽出物での結膜誘発試験(実施例31を参照)を、最初の処置の前と、最後の治療の2週間後と、最初の治療後6ヶ月と12ヶ月で実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点においてグループ間で比較する。また様々な量の花粉アレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト(実施例30を参照)用いて効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療の後に最初の花粉シーズン中における症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。有効な患者の日誌はまた治療後の第二の花粉シーズンの間の症状と使用医薬を記録するためにも使用される。
実施例39
チリダニアレルギーを被っている被験者のQβG10での治療と結膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
QβG10での治療:
二重盲検平行グループ臨床試験をチリダニにアレルギーのある20名の患者で実施する。患者はそれぞれ10名の患者の二つのグループに無作為に割り当てられる。最初のグループは1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で処置する。第二のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価:
標準化されたチリダニ抽出物での結膜誘発試験(実施例31を参照)を、最初の処置の前と、最後の治療の2週間後と、最初の治療後6ヶ月と12ヶ月で実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点においてグループ間で比較する。また様々な量のチリダニアレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト(実施例30を参照)用いて効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療前の連続14日間、治療後の2週間、及び最初の治療後の6ヶ月目及び12ヶ月目に症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。
チリダニアレルギーを被っている被験者のQβG10での治療と結膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
QβG10での治療:
二重盲検平行グループ臨床試験をチリダニにアレルギーのある20名の患者で実施する。患者はそれぞれ10名の患者の二つのグループに無作為に割り当てられる。最初のグループは1週間の間隔で6回、300μgのQβG10(G10(配列番号27)が満たされたQβVLP)で処置する。第二のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価:
標準化されたチリダニ抽出物での結膜誘発試験(実施例31を参照)を、最初の処置の前と、最後の治療の2週間後と、最初の治療後6ヶ月と12ヶ月で実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点においてグループ間で比較する。また様々な量のチリダニアレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト(実施例30を参照)用いて効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療前の連続14日間、治療後の2週間、及び最初の治療後の6ヶ月目及び12ヶ月目に症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。
Claims (79)
- 動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物において、前記組成物が、
(a)粒子と
(b)免疫賦活性核酸
を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなり、前記粒子が前記免疫賦活性核酸と共にパッケージされている組成物。 - 前記粒子が、
(a)ウイルス様粒子;
(b)ウイルス粒子;及び
(c)合成粒子
からなる群から選択される請求項1に記載の組成物。 - 前記粒子がウイルス様粒子である請求項1に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子がバクテリオファージのウイルス様粒子である請求項3に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子がRNAバクテリオファージのウイルス様粒子である請求項3に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、RNAバクテリオファージの、組換えタンパク質又はその断片を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなる請求項3から5の何れか一項に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、RNAバクテリオファージの、コートタンパク質又はその断片を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなる請求項3から5の何れか一項に記載の組成物。
- 前記RNAバクテリオファージが、
(a)バクテリオファージQβ;
(b)バクテリオファージR17;
(c)バクテリオファージfr;
(d)バクテリオファージGA;
(e)バクテリオファージSP;
(f)バクテリオファージMS2;
(g)バクテリオファージM11;
(h)バクテリオファージMX1;
(i)バクテリオファージNL95;
(j)バクテリオファージf2;
(k)バクテリオファージPP7;及び
(l)バクテリオファージAP205
からなる群から選択される請求項5から7の何れか一項に記載の組成物。 - 前記RNAバクテリオファージがQβである請求項5から7の何れか一項に記載の組成物。
- 前記RNAバクテリオファージがAP205である請求項5から7の何れか一項に記載の組成物。
- 前記RNAバクテリオファージがfrである請求項5から7の何れか一項に記載の組成物。
- 前記RNAバクテリオファージがGAである請求項5から7の何れか一項に記載の組成物。
- 前記粒子が合成粒子である請求項1に記載の組成物。
- 前記合成粒子が、
(a)ナノ粒子;
(b)微小粒子;
(c)リポソーム;及び
(d)ビロソーム
からなる群から選択される請求項13に記載の組成物。 - 前記粒子がナノ粒子である請求項1に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子が生分解性材料を含んでなる請求項15に記載の組成物。
- 前記生分解性材料が、
(a)ポリエステル;
(b)ポリエステルのコポリマー;
(c)ポリエステルとPEGのブロックコポリマー;
(d)ポリオルトエステル;
(e)ポリ酸無水物;
(f)ポリセバシン酸;
(g)アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ酸無水物;
(h)ポリ酸無水物エステル;
(i)ポリホスファゼン;及び
(j)ポリアミド
から選択される請求項16に記載の組成物。 - 前記粒子が、
(a)ペグ化ポリエステルナノ粒子;
(b)ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子;
(c)ペグ化ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子;
(d)アルギネート-PLLナノ粒子;
(e)キトサンナノ粒子;
(f)CaP-PAAナノ粒子
(g)ゼラチン-コールアミンナノ粒子;及び
(h)ヒト血清アルブミンナノ粒子
からなる群から選択されるナノ粒子である請求項15から17の何れか一項に記載の組成物。 - 前記粒子が生分解性である請求項1から18の何れか一項に記載の組成物。
- 前記免疫賦活性核酸が細胞中におけるIFN-αの産生を刺激可能である請求項1から19の何れか一項に記載の組成物。
- 前記免疫賦活性核酸が、
(a)デオキシリボ核酸;
(b)リボ核酸、
(c)キメラ核酸;及び
(d)(a)、(b)及び/又は(c)の少なくとも一つの核酸の任意の混合物
からなる群から選択される請求項1から20の何れか一項に記載の組成物。 - 前記免疫賦活性核酸が非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである請求項1から21の何れか一項に記載の組成物。
- 前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、
(a)A型CpG;及び
(b)C型CpG
からなる群から選択される請求項22に記載の組成物。 - 前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがA型CpGである請求項22に記載の組成物。
- 前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列を含んでなる請求項22から24の何れか一項に記載の組成物。
- 前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドのCpGモチーフがパリンドローム配列を含んでなる請求項22から24の何れか一項に記載の組成物。
- 前記パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号28)である請求項25又は26に記載の組成物。
- 前記パリンドローム配列には、その5’末端及びその3’末端にグアノシン単位が隣接している請求項25から27の何れか一項に記載の組成物。
- 前記パリンドローム配列には、その5’末端に少なくとも3で多くとも15のグアノシン単位が隣接し、前記パリンドローム配列には、その3’末端に少なくとも3で多くとも15のグアノシン単位が隣接している請求項25から27の何れか一項に記載の組成物。
- 前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、
(a)「G6−6」 GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号32);
(b)「G7−7」 GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(配列番号33);
(c)「G8−8」 GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(配列番号25);
(d)「G9−9」 GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(配列番号26);及び
(e)「G10」 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号27)
からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなる請求項22から29の何れか一項に記載の組成物。 - 前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、配列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号27)を含むか又はそれからなる請求項22から30の何れか一項に記載の組成物。
- 前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる請求項22から31の何れか一項に記載の組成物。
- 前記免疫賦活性核酸、好ましくは前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレアーゼ加水分解を受けない請求項1から32の何れか一項に記載の組成物。
- 前記免疫賦活性核酸が非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、ベンゾネース加水分解を受けない請求項1から33の何れか一項に記載の組成物。
- 前記免疫賦活性核酸が配列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号27)からなる非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる請求項1から34の何れか一項に記載の組成物。
- 前記免疫賦活性核酸が二本鎖リボ核酸であり、該二本鎖リボ核酸はポリ(I:C)又はその誘導体である請求項1から21の何れか一項に記載の組成物。
- 前記過敏症が
(a)アレルギー;及び
(b)非アレルギー性過敏症
からなる群から選択される請求項1から36の何れか一項に記載の組成物。 - 前記過敏症がアレルギーである請求項1から37の何れか一項に記載の組成物。
- 前記アレルギーがIgE依存性アレルギーである請求項38に記載の組成物。
- 前記過敏症が喘息である請求項1から38の何れか一項に記載の組成物。
- 前記喘息がIgE依存性喘息である請求項41に記載の組成物。
- 前記過敏症が皮膚炎である請求項1から38の何れか一項に記載の組成物。
- 前記皮膚炎がアトピー性湿疹である請求項42に記載の組成物。
- 前記過敏症がIgE依存性アレルギー(I型アレルギー)である請求項1から38の何れか一項に記載の組成物。
- 前記過敏症が天然に生じるアレルゲンに対するIgE依存性アレルギーである請求項1から38の何れか一項に記載の組成物。
- 前記IgE依存性アレルギーが、
(a)花粉アレルギー(花粉症);
(b)ハウスダストアレルギー;
(c)食物アレルギー;
(d)薬物アレルギー;
(e)昆虫毒アレルギー、好ましくは蜂毒アレルギー;及び
(f)動物アレルギー、好ましくはネコアレルギー
からなる群から選択される請求項44又は45に記載の組成物。 - 前記IgE依存性アレルギーが花粉アレルギー又はハウスダストアレルギーである請求項44又は45に記載の組成物。
- 前記動物がヒトである請求項1から47の何れか一項に記載の組成物。
- 前記組成物がアレルゲン又はアレルゲン抽出物を含まない請求項1から48の何れか一項に記載の組成物。
- (a)請求項1から49の何れか一項に記載の組成物;及び
(b)アジュバント、好ましくはアルミニウム含有アジュバント、最も好ましくはアルハイドロゲル
を含有し、これらから本質的になり、又はこれらからなる薬学的組成物。 - 動物の過敏症を治療する方法に使用される薬学的組成物において、
(a)請求項1から49の何れか一項に記載の組成物;及び
(b)アジュバント、好ましくはアルミニウム含有アジュバント、最も好ましくはアルハイドロゲル
を含有し、これらから本質的になり、又はこれらからなる薬学的組成物。 - 動物の過敏症を治療する方法であって、請求項1から49の何れか一項に記載の組成物を前記動物に導入することを含む方法。
- 前記組成物が前記動物に、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、又はリンパ節に直接に導入される請求項52に記載の方法。
- 前記動物が哺乳動物、好ましくはヒトである請求項52又は53に記載の方法。
- 前記動物への前記導入が、1週間から3ヶ月の間隔、好ましくは2週間の間隔で、少なくとも2回、好ましくは3回、繰り返される請求項52から54の何れか一項に記載の方法。
- 前記動物への前記導入が、毎週の間隔で6回繰り返され、好ましくはそれぞれの都度、50μgから約500μg、最も好ましくは約300μgの前記組成物が導入される請求項52から55の何れか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物のない前記動物に導入される請求項52から56の何れか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物の投与をしないで前記動物に導入される請求項52から57の何れか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物と関連した前記動物には導入されない請求項52から58の何れか一項に記載の方法。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の少なくとも一週間前と少なくとも一週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように、実施される請求項52から59の何れか一項に記載の方法。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の少なくとも4週間前と少なくとも4週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように、実施される請求項52から60の何れか一項に記載の方法。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の少なくとも8週間前と少なくとも8週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように、実施される請求項52から61の何れか一項に記載の方法。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に全く導入されないように、実施される請求項52から62の何れか一項に記載の方法。
- 動物の過敏症の治療のための医薬の製造における組成物の使用であって、前記組成物が、
(a)粒子と
(b)免疫賦活性核酸
を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなり、前記粒子が前記免疫賦活性核酸と共にパッケージされている使用。 - 前記組成物が請求項2から49の何れか一項に記載の通りである請求項64に記載の使用。
- 前記粒子がRNAバクテリオファージのウイルス様粒子である請求項64に記載の使用。
- 前記RNAバクテリオファージがQβである請求項66に記載の使用。
- 前記免疫賦活性核酸が非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである請求項64から67の何れか一項に記載の使用。
- 前記免疫賦活性核酸が配列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号27)からなる非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる請求項64から68の何れか一項に記載の使用。
- 前記過敏症がアレルギーである請求項64から69の何れか一項に記載の使用。
- 前記アレルギーが、
(a)IgE依存性喘息;
(b)アトピー性湿疹;及び
(c)IgE依存性アレルギー(I型アレルギー)、好ましくは花粉アレルギー又はハウスダストアレルギー
からなる群から選択される請求項70に記載の使用。 - 前記組成物がアレルゲン又はアレルゲン抽出物を含まない請求項64から71の何れか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物のない前記動物に導入される請求項64から72の何れか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物の投与をしないで前記動物に導入される請求項64から73の何れか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物と関連した前記動物には導入されない請求項64から74の何れか一項に記載の使用。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の少なくとも一週間前と少なくとも一週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように、実施される請求項64から75の何れか一項に記載の使用。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の少なくとも4週間前と少なくとも4週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように、実施される請求項64から76の何れか一項に記載の使用。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の少なくとも8週間前と少なくとも8週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように、実施される請求項64から77の何れか一項に記載の使用。
- 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に全く導入されないように、実施される請求項64から78の何れか一項に記載の使用。
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