DE69935599T2

DE69935599T2 - Modifizierte hcv peptid-impfstoffe

Info

Publication number: DE69935599T2
Application number: DE69935599T
Authority: DE
Inventors: Jay A. Bethesda BERZOFSKY; Pablo Sarobe; Stephen M. Washington FEINSTONE; Marian E. Washington MAJOR
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-08-21
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2019-08-18
Also published as: US7074410B2; EP1105496B1; WO2000011186A1; US6685944B1; ATE357526T1; DE69935599D1; US20050129705A1; AU5776799A; US20060275322A1; WO2000011186A9; EP1105496A1; US7341726B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der viralen Impfstoffe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Modifikation immunogener Epitope des Hepatitis-C-Virus-(HCV)-Core-Proteins, um eine verstärkte Immunantwort gegen HCV hervorzurufen.
Stand der Technik
Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein einzelsträngiges RNA-Virus, das für die meisten non-A-non-B-Hepatitis-Fälle verantwortlich ist (1). Die Infektion mit HCV wird häufig chronisch und führt in vielen Fallen zu Leberzirrhose und Leberzellkarzinomen (2). Die zelluläre Immunantwort soll verantwortlich sein für die virale Clearance bei vielen viralen Infektionen (3-7) und im Fall von HCV ist eine cytotoxische T-Lymphozyten-(CTL)-Antwort bei akut und chronisch infizierten Patienten vorhanden (8-14), aber ihre Rolle bei der viralen Clearance wurde bis jetzt nicht aufgeklärt. CTL-Antworten wurden nachgewiesen in peripheren einkernigen Blutzellen (PBMC) und in intrahepatischem Lymphozyteninfiltrat bei Patienten mit chronischer Hepatitis (15) und in der Leber von infizierten Schimpansen (16), was darauf hindeutet, dass in diesen Fallen der Virus trotz dieser Immunantwort überleben kann (17). Die Gründe für die nicht angemessene Immunantwort bei chronisch infizierten Patienten sind nicht bekannt (18).
CD8⁺CTL erkennen Antigene als Peptide, die durch Klasse-I-Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Diese Peptide haben gewöhnlich eine Länge von 8 bis 10 Aminosäuren und werden nach Prozessierung intrazellulärer Antigene erzeugt (3, 19-21). Die Analyse der Peptide, die von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, hat zur Definition verschiedener Sequenzmuster oder Motive (22-24) für Peptide geführt, die an das jeweilige MHC-Allel oder eine Gruppe von Allelen (Supermotiv) (25) binden. Diese Motive basieren auf der Gegenwart verschiedener Aminosäuren (agretopische Reste), die Ankerreste genannt werden (22, 26), an spezifischen Positionen in der Peptidsequenz, die für Wechselwirkungen zwischen Peptid und MHC-Molekül verantwortlich sind, ebenso wie andere sekundäre Positionen, die dazu beitragen können, diese Wechselwirkungen zu stabilisieren (27-29). Die Verwendung dieser Motive, um Peptide zu identifizieren, die an MHC-Moleküle binden können, zusammen mit der Entwicklung von MHC-Peptidbindungsassays, hat zur Charakterisierung vieler CTL-Epitope im HCV-Polypeptid geführt, die durch verschiedene MHC-Moleküle präsentiert werden (9, 10, 12, 30). Zu den am besten untersuchten Motiven gehört HLA-A2.1, das in einem hohen Prozentanteil der Bevölkerung vorherrschend ist (31). Verschiedene Berichte beschreiben das Bindungsmotiv für dieses Allel und weisen auf die Bedeutung als Anker ebenso wie auf die Bedeutung der sekundären Reste hin. Die MHC-Bindung wurde auch mit der Immunogenizität in verschiedenen Maus- und Humansystemen korreliert (30, 32-37).
Trotz der Gegenwart typischer Ankerreste kann die Bindungsfähigkeit eines Peptidepitops jedoch variieren, abhängig von den anderen sekundären Resten. Somit kann die Gegenwart bestimmter Aminosäuren in sekundären Positionen eine Bindungsfähigkeit des Peptids verbessern oder stören (28, 38, 39). Andere Aminosäuren (Epitopreste) sind verantwortlich für die Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TCR). Somit wird die T-Zellantwort durch Wechselwirkungen des trimolekularen Komplexes angeschaltet: MHC-antigenes Peptid-TCR, zusammen mit anderen costimulatorischen Molekülen (40, 41). Diese Wechselwirkungen treten zwischen dem antigenen Peptid und Taschen in der Struktur sowohl der MHC- als auch TCR-Moleküle auf und Veränderungen in der Aminosäuresequenz des Peptids können diese Grenzflächen beeinflussen.
Wegen der nicht angemessenen Immunantwort bei mit HCV infizierten Personen besteht ein großer Bedarf, die Immunantwort auf immunogene Epitope von HCV zu verbessern, ohne die MHC-Bindungsaffinität oder T-Zellerkennung zu stören. Die vorliegende Erfindung überwindet die bisherigen Beschränkungen und Nachteile im Stand der Technik, indem immunogene Peptide des HCV-Core-Proteins bereitgestellt werden, die eine verbesserte Immunantwort hervorrufen, Verfahren, um diese Peptide herzustellen, und Verfahren zur Verwendung dieser Peptide für eine Vielzahl therapeutischer, diagnostischer und prognostischer Anwendungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B. Bindung von C7A2-Alanin (A) und Nicht-Alanin (B) substituierten Peptiden an TAP-defizientes HLA-A2.1. T2-Zellen wurden über Nacht in einer 96-Napf-Platte in CTM mit 10 μg/ml Human-β2-Mikroglobulin und verschiedenen Peptidkonzentrationen inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen gewaschen und die HLA-A2.1-Expression mit Durchflusscytometrie untersucht unter Verwendung von monoklonalen Anti-HLA-A2-BB7.2-Antikörpern und FITC-markiertem Ziege-Antimaus-Ig. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als Fluoreszenzindex (FI), berechnet gemäß der Formel: (mittlere Fluoreszenz mit Peptid – mittlere Fluoreszenz ohne Peptid)/mittlere Fluoreszenz ohne Peptid. Die Hintergrundfluoreszenz ohne BB7.2 wurde für jeden einzelnen Wert abgezogen. FI_0,5 bedeutet solche Peptidkonzentrationen, die die HLA-A2.1-Expression um 50% erhöhen gegenüber der Kontrolle ohne Peptid und wurden berechnet aus den Titrationskurven für jedes einzelne Peptid.
2A und 2B. Erkennung von C7A2-Alanin-(A)- und Nicht-Alanin-(B)-substituierten Peptiden durch die menschliche CTL-Linie ViT2, die für C7A2-Peptid spezifisch ist, das von HLA-A2.1 präsentiert wird. C1R.A2.1-Zielzellen wurden 2 Stunden mit ⁵¹Cr inkubiert, dreimal gewaschen und mit 3.000 Zellen/Napf in 96-Napf-Platten mit runden Boden plattiert mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen. Nach 2 Stunden wurden Effektorzellen zugegeben (E/T-Verhältnis: 5/1) und die Platten wurden 4 Stunden lang inkubiert.
3A bis D. Erkennung von C7A2-Alanin-(A,C)- und Nicht-Alanin-(B,D)-substituierten Peptiden durch transgene AAD-Maus-CTL-Linien AAD.10 (A, B) und AAD.1 (C, D) nach 10 bis 12 in-vitro-Stimulierungen. C1R.AAD-Zielzellen wurden 2 Stunden mit ⁵¹Cr inkubiert, dreimal gewaschen und mit 3.000 Zellen/Napf in 96-Napf-Platten mit rundem Boden mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen plattiert. Nach 2 Stunden wurden Effektorzellen zugegeben (E/T-Verhältnis: 10/1) und die Platten wurden 4 Stunden lang inkubiert.
4. Immunogenizität von C7A2-substituierten Peptiden bei AAD-transgenen Mäusen. Mäuse wurde mit 50 nmol CTL-Epitop plus 50 nmol HBVc 128-140 Helferepitop und GM-CSF und IL-12 in IFA immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse geboostert und 10 bis 14 Tage nach der Boosterimpfung wurden Milzzellen entnommen und in vitro mit dem CTL-Epitop stimuliert. Nach einer Woche in-vitro-Stimulierung wurde ein CTL-Test mit Zielzellen (AAD Con A Blast) mit oder ohne 10 μM CTL-Peptid durchgeführt. CTL aus jeder Gruppe wurden nur mit dem Peptid getestet, das zur Immunisierung dieser Mäuse verwendet wurde. Es sind nur die Ergebnisse für mit Peptid gepulste Zielzellen gezeigt. In allen Fallen war der Prozentanteil der spezifischen Lyse gegenüber nicht mit Peptid gepulsten Zielzellen unter 5%.
5A und 5B. Induktion einer CTL-Immunantwort gegen C7A2-WT in AAD-transgenen Mäusen unter Verwendung verschiedener C7A2-Peptidvarianten. Mäuse wurden mit 50 oder 15 nmol CTL-Epitop C7A2-WT (A) oder 8A (B) plus 50 nmol HBVc-128-140-Helferepitop und GM-CSF und IL-12 in IFA immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse unter den gleichen Bedingungen geboostert und 10 bis 14 Tage nach der Booster-Impfung wurden Milzzellen entnommen und in vitro mit 10 μM CTL-Peptid-gepulsten Milzzellen stimuliert. Nach zwei Wochen in-vitro-Stimulierung wurde ein CTL-Test mit Zielzellen (AAD Con A Blast), die mit oder ohne 10 μM Peptid inkubiert worden waren, durchgeführt. Die Zahlen 50.1 und 50.2 bzw. 15.1 und 15.2 bezeichnen verschiedene Mäuse, die mit 50 oder 15 nmol CTL-Epitop immunisiert worden waren. (E/T-Verhältnis im Test: 90/1).
6. Induktion einer CTL-Immunantwort gegen C7A2-WT in A2Kb-transgenen Mäusen unter Verwendung verschiedener C7A2-Peptidvarianten. Mäuse wurden mit 50 nmol CTL-Epitop C7A2-WT oder 8A plus 50 nmol HBVc-128-140-Helferepitop in IFA immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse unter den gleichen Bedingungen geboostert und 10 bis 14 Tage nach der Booster-Impfung wurden Milzzellen entnommen und in vitro mit 10 μM CTL-Peptid-gepulsten Milzzellen stimuliert. Nach zwei Wochen in-vitro-Stimulierung wurde ein CTL-Test durchgeführt mit Zielzellen (A2Kb Con A Blast), die mit oder ohne 10 μM Peptid inkubiert worden waren. WT.1 und WT.2 bzw. 8A.1 und 8A.2 bezeichnen verschiedene Mäuse, die mit C7A2-WT bzw. 8A-CTL-Epitop immunisiert wurden. (E/T-Verhältnis im Test: 120/1 für WT.1 und WT.2; 70/1 für 8A.1 und 8A.2).
7. Avidität kurzzeitiger CTL-Linien, die durch C7A2-WT und C7A2-8A induziert wurden. Transgene AAD-Mäuse wurden, wie hier beschrieben, mit 50 nmol CTL-Epitop C7A2-WT (durchgezogene Linien) oder C7A2-8A (gepunktete Linien) plus 50 nmol HBVc-128-140-Helferepitop und GM-CSF und IL-12 in IFA immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse unter den gleichen Bedingungen geboostert und 10 bis 14 Tage nach der Booster-Impfung wurden Milzzellen entnommen und in vitro mit 10 μM CTL-Peptidgepulsten Milzzellen stimuliert. Nach 3 bis 4 in-vitro-Stimulierungszyklen wurde ein CTL-Test mit Zielzellen (C1R.AAD), die mit verschiedenen Peptidkonzentrationen, wie angegeben, inkubiert worden waren (Kreise: Ziele mit C7A2-WT-Peptid; Quadrate: Ziele mit C7A2-8A-Peptid) in einem E:T-Verhältnis von 10:1 durchgeführt.
8A und 8B. Erkennung von von C7A2 abgeleiteten Peptiden aus verschiedenen HCV-Genotypen durch CTL, die induziert wurden nach Immunisierung mit Peptid 8A. AAD (A) und A2Kb (B) transgene Mäuse wurden mit 50 nmol CTL-Epitop 8A plus 50 nmol HBVc-128-140-Helferepitop in IFA immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse unter den gleichen Bedingungen geboostert und 10 bis 14 Tage nach der Booster-Impfung wurden Milzzellen entnommen und in vitro mit 10 μM CTL-Peptid-gepulsten Milzzellen stimuliert. Nach zwei Wochen in-vitro-Stimulierung wurde ein CTL-Test mit Zielzellen (Con A Blast) durchgeführt, die mit verschiedenen Peptiden mit 10 μM inkubiert worden waren. C7A2-WT hat eine Sequenz aus HCV-Genotypen 1a, 1b und 3a, wohingegen Peptid C7A2-8V eine Sequenz aus den Genotypen 2a und 2b hat.
9. Vergleich der CTL-Aktivität nach vier Wochen zwischen AC7 30 μg und AC7-8A 30 μg Immunisierung bei AAD-Mäusen. Ziel (T) = 3000.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert 1) ein isoliertes Peptid mit der Aminosäuresequenz DLMGYIPAV (SEQ ID Nr. 1); 2) ein isoliertes HCV-Core-Polypeptid, das eine L→A-Substitution an Aminosäureposition 139 aufweist; 3) ein isoliertes HCV-Core-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 und 4) ein Fragment eines HCV-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als das gesamte HCV-Core-Polypeptid und mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1. Bereitgestellt werden auch Nucleinsäuren, die Peptide und Polypeptide der Erfindung codieren, und Vektoren, die die Nucleinsäuren der Erfindung enthalten. Diese Zusammensetzungen können in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorhanden sein, der auch ein geeignetes Adjuvans enthalten kann.
Außerdem liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines HCV-Core-Peptids mit verbesserter Immunogenizität, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren des Peptids mit der Aminosäuresequenz DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3) substituiert oder ersetzt sind und bei denen eine verbesserte Immunogenizität des substituierten Peptids im Vergleich zu der Immunogenizität eines Kontrollpeptids mit der Aminosäuresequenz DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3) nachgewiesen wird, wobei ein substituiertes Peptid mit größerer Immunogenizität als das Kontrollpeptid ein HCV-Core-Peptid mit verbesserter Immunogenizität ist.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Individuum und zur Behandlung oder Verhütung einer HCV-Infektion bei einem Individuum, die umfassen, dass dem Individuum oder einer Zelle des Individuums irgendeine der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten, das umfasst, dass die Lymphozyten mit irgendeinem der Peptide oder Polypeptide der Erfindung in Gegenwart eines Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküls in Kontakt gebracht werden, und liefert auch eine Zusammensetzung, die cytotoxische T-Lymphozyten enthält, die durch Kontakt mit den Peptiden oder Polypeptiden der Erfindung in Gegenwart eines Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküls aktiviert wurden.
Bereitgestellt werden auch Methoden zum Nachweis der Gegenwart eines HCV-Core-Polypeptids in einer Zelle, die umfassen, dass die Zelle mit den aktivierten cytotoxischen T-Lymphozyten der Erfindung in Kontakt gebracht wird unter solchen Bedingungen, unter denen Cytolyse der Zielzellen auftreten kann oder Cytokinproduktion der Lymphozyten auftreten kann und die Cytolyse der Zielzellen oder die Cytokinproduktion der Lymphozyten nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytolyse von Zielzellen oder der Cytokinproduktion der Lymphozyten die Gegenwart von HCV-Core-Polypeptid in der Zelle anzeigt.
Außerdem liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Hepatitis-C-Virus in einer Probe, das umfasst, dass: a) die Probe mit einer Zelle in Kontakt gebracht wird, die für eine Infektion durch Hepatitis-C-Virus empfindlich ist, unter solchen Bedingungen, unter denen die Zelle durch Hepatitis-C-Virus in der Probe infiziert werden kann; b) die Zelle von Stufe a) mit den cytolytischen T-Lymphozyten der Erfindung in Kontakt gebracht wird unter solchen Bedingungen, unter denen die Cytolyse von Zielzellen oder Cytokinproduktion der Lymphozyten auftreten kann und c) die Cytolyse der Zielzellen oder Cytokinproduktion der Lymphozyten nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytolyse von Zielzellen oder der Cytokinproduktion der Lymphozyten die Gegenwart von Hepatitis-C-Virus in der Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer HCV-Infektion bei einem Individuum, das umfasst, dass cytotoxische T-Lymphozyten des Individuums mit den Peptiden oder Polypeptiden der Erfindung in Gegenwart eines Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküls unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen Cytolyse der Zielzellen oder Cytokinproduktion der Lymphozyten auftreten kann, und die Cytolyse der Zielzellen oder Cytokinproduktion der Lymphozyten nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytolyse von Zielzellen oder der Cytokinproduktion der Lymphozyten die Diagnose einer HCV-Infektion bei dem Individuum anzeigt.
Weiterhin bereitgestellt werden Verfahren bzw. Methoden zur Bestimmung der viralen Belastung mit HCV bei einem Individuum, die umfassen, dass a) eine biologische Probe von dem Individuum, die Hepatitis-C-Virus enthält, seriell verdünnt wird; b) jede seriell verdünnte Probe mit einer Zelle in Kontakt gebracht wird, die für eine Infektion mit Hepatitis-C-Virus empfindlich ist unter solchen Bedingungen, unter denen die Zelle mit Hepatitis-C-Virus in der Probe infiziert werden kann; c) die Zelle von Stufe b) mit den aktivierten cytolytischen T-Lymphozyten der Erfindung in Kontakt gebracht wird unter solchen Bedingungen, unter denen Cytolyse der Zielzellen oder Cytokinproduktion in den Lymphozyten auftreten kann; der Anteil an Cytolyse der Zielzellen oder Cytokinproduktion in den Lymphozyten bestimmt wird; der Anteil an Cytolyse der Zielzellen oder Cytokinproduktion in den Lymphozyten verglichen wird mit dem Anteil an Cytolyse der Zielzellen oder Cytokinproduktion durch aktivierte cytotoxische T-Lymphozyten, die mit den Zellen in Kontakt gebracht wurden, die mit seriell verdünnten Kontrollproben infiziert wurden, die eine bekannte Menge an Hepatitis-C-Virus enthielten, und die virale Belastung mit Hepatitis-C-Virus in dem Individuum aus dem Vergleich der Proben mit bekannter Menge bestimmt wird.
Schließlich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Prognose für ein Individuum, bei dem Hepatitis-C-Virus-Infektion diagnostiziert wurde, das umfasst, dass die virale Belastung für das Individuum mit einer der erfindungsgemäßen Methoden bestimmt wird, wobei eine hohe virale Belastung auf eine schlechte Prognose deutet und eine geringe virale Belastung auf eine gute Prognose hindeutet.
Verschiedene weitere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Ausdrücke "ein", "eine" und "einer" können jeweils ein oder mehrere bedeuten. Z.B. kann "eine" Zelle eine Zelle oder mehr als eine Zelle bedeuten.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten und überraschenden Erkenntnis eines HCV-Core-Peptids mit der Aminosäuresequenz DLMGYIPAV (SEQ ID Nr. 1), das durch den Prozess der Epitopverbesserung eine verbesserte HLA-A2-Bindungsaffinität und CTL-Erkennung in vitro und eine verbesserte Immunogenizität in vivo im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden Peptid DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3) an den Positionen 132-140 in dem HCV-Core-Polypeptid hat. Somit liefert die vorliegende Erfindung ein isoliertes Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein isoliertes HCV-Core-Polypeptid mit einer L→A-Substitution an Aminosäureposition 139. Somit kann das HCV-Core-Polypeptid der Erfindung die Aminosäuresequenz irgendeiner der Varianten von HCV haben, die nun bekannt sind oder in der Zukunft gefunden werden und die weiterhin eine L→A-Substitution an der Aminosäureposition 139 aufweisen (siehe z.B. Ref. 87). Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein isoliertes HCV-Core-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.
Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein Polypeptidfragment des HCV-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als das HCV-Core-Polypeptid und mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1. Somit kann das Polypeptidfragment der Erfindung eine ausreichende Anzahl aufeinander folgender Aminosäuren enthalten, um als ein Polypeptidfragment des HCV-Core-Polypeptids identifiziert zu werden und einschließlich der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, enthält jedoch nicht alle Aminosäuren des HCV-Core-Polypeptids. Z.B. hat das gesamte HCV-Core-Polypeptid (SEQ ID Nr. 4) 191 Aminosäuren. Somit kann das Polypeptidfragment der Erfindung irgendeine Anzahl von Aminosäuren haben, die geringer ist als 191 Aminosäuren (z.B. 191-1, 191-5, 191-10, 191-50, 191-100, 191-130, 191-180 etc.) und hat mindestens drei Aminosäuren, die aufeinander folgende bzw. benachbarte Aminosäuren des HCV-Core-Polypeptids sind und von einem Fachmann auf diesem Gebiet als aufeinander folgende Aminosäuren des HCV-Core-Polypeptids mit Standardmethoden zur Identifizierung von Polypeptiden erkannt würde und würde auch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 einschließen. Die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 kann in dem Polypeptidfragment der Erfindung einmal oder mehrmals vorhanden sein und kann an jeder Position (z.B. N-Ende, C-Ende, intern) bezogen auf die weitere Aminosäuresequenz des Fragments enthalten sein.
"Isoliert", wie es hier verwendet wird, bedeutet, dass das Peptid oder Polypeptid der Erfindung ausreichend frei von Kontaminanten oder Zellkomponenten ist, mit denen Peptide oder Polypeptide normalerweise zusammen vorkommen und in einer solchen Konzentration vorhanden ist, dass es das einzige signifikante Peptid oder Polypeptid in der Probe ist. "Isoliert" bedeutet nicht, dass das Präparat technisch rein (homogen) ist, sondern ausreichend rein, damit das Peptid oder Polypeptid in einer Form ist, in der es therapeutisch verwendet werden kann.
"Epitop", wie es hier verwendet wird, bedeutet eine spezifische Aminosäuresequenz begrenzter Länge, die, wenn sie in der richtigen Konformation vorhanden ist, eine reaktive Stelle für einen Antikörper oder einen T-Zellrezeptor liefert. Die Identifizierung von Epitopen auf Antigenen kann mit Immunologieprotokollen durchgeführt werden, die im Stand der Technik Standard sind (79).
Die Ausdrücke Peptid und Polypeptid, wie sie hier verwendet werden, sollen eine Kette von Aminosäuren beschreiben, die denen entspricht, die durch eine Nucleinsäure codiert werden. Ein Peptid beschreibt gewöhnlich eine Kette von Aminosäuren von zwei bis etwa 30 Aminosäuren und ein Polypeptid beschreibt gewöhnlich eine Kette von Aminosäuren mit mehr als 30 Aminosäuren. Der Ausdruck Polypeptid kann sich auf eine lineare Kette von Aminosäuren beziehen oder er kann sich auf eine Kette von Aminosäuren beziehen, die prozessiert und zu einem funktionellen Protein gefaltet worden ist. Es versteht sich jedoch, dass 30 eine zufällige Zahl ist im Hinblick auf die Unterscheidung von Peptiden und Polypeptiden und die Ausdrücke können austauschbar verwendet werden für eine Kette von Aminosäuren von etwa 30. Die Peptide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden durch Isolierung und Reinigung der Peptide und Polypeptide aus Zellen erhalten, wo sie natürlicherweise erzeugt werden, oder durch Expression einer exogenen Nucleinsäure, die das Peptid oder Polypeptid codiert. Die Peptide und Polypeptide der Erfindung können durch chemische Synthese, durch proteolytische Spaltung eines Polypeptids und/oder Synthese aus einer Nucleinsäure, die das Peptid oder Polypeptid codiert, erhalten werden.
Die Haupterkenntnis der Erfindung ist ein Peptid oder Polypeptid mit Aminosäuresubstitutionen, die die Immunogenizität verbessern. Solche Substitutionen können bei Peptiden und Polypeptiden der Erfindung mit Methoden, die im Stand der Technik Standard sind und hier ausgeführt sind, durchgeführt werden und eine verbesserte Immunogenizität kann mit den in den Beispielen gelieferten Methoden bestimmt werden. Es versteht sich auch, dass die Peptide und Polypeptide der Erfindung auch konservative Substitutionen enthalten können, wo eine natürlich vorkommende Aminosäure durch eine andere mit gleichen Eigenschaften ersetzt wird und die die Funktion des Polypeptids nicht verändern. Solche konservativen Substitutionen sind im Stand der Technik wohl bekannt. So versteht es sich, dass wo erwünscht, Modifikationen und Veränderungen, die sich von den Substitutionen, die die Immunogenizität verbessern, unterscheiden, in der Nucleinsäure und/oder Aminosäuresequenz der Peptide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung gemacht werden können und immer noch ein Peptid oder Polypeptid erhalten wird mit den gleichen oder in anderer Weise erwünschten Eigenschaften. Solche Veränderungen können in natürlichen Isolaten auftreten oder können synthetisch eingeführt werden unter Verwendung einer punktspezifischen Mutagenese, wofür Verfahren, wie Mismatch-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im Stand der Technik wohl bekannt sind.
Außerdem liefert die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäuren, die jedes der folgenden codieren: 1) das Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1; 2) das HCV-Core-Polypeptid mit der Aminosäurese quenz von SEQ ID Nr. 2; 3) das HCV-Core-Polypeptid mit einer L→A-Substitution an Aminosäureposition 139 und 4) ein Fragment des HCV-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als das gesamte HCV-Core-Polypeptid, das das Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 enthält.
"Nucleinsäure" bezieht sich, so wie es hier verwendet wird, auf einzel- oder doppelsträngige Moleküle, die DNA sein können, die aufgebaut ist aus den Nucleotidbasen A, T, C und G, oder RNA sein können, die aufgebaut ist aus den Basen A, U (Ersatz für T), C und G. Die Nucleinsäure kann einen codierenden Strang darstellen oder das Komplement. Nucleinsäuren können in der Sequenz identisch sein mit der Sequenz, die natürlich vorkommt, oder können alternative Codons enthalten, die die gleiche Aminosäure codieren, wie die, die in der natürlich vorkommenden Sequenz zu finden ist. Weiterhin können Nucleinsäuren Codons enthalten, die konservative Substitutionen von Aminosäuren bedeuten, die im Stand der Technik wohl bekannt sind.
Der Ausdruck "isolierte Nucleinsäure", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Nucleinsäure, die getrennt oder im Wesentlichen frei von mindestens einigen der anderen Komponenten des natürlich vorkommenden Organismus ist, z.B. den Zellstrukturkomponenten, die allgemein assoziiert mit Nucleinsäuren in der Zellumgebung gefunden werden und/oder andere Nucleinsäuren. Die Isolierung von Nucleinsäuren kann daher mit Techniken erreicht werden, wie Zelllyse und anschließend Phenol- plus Chloroformextraktion, gefolgt von einer Ethanolausfällung der Nucleinsäuren (80). Die Nucleinsäuren der Erfindung können aus Zellen isoliert werden mit im Stand der Technik wohl bekannten Methoden zur Isolierung von Nucleinsäuren. Alternativ können Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung gemäß Standardprotokollen synthetisiert werden, die in der Literatur zur Synthese von Nucleinsäuren wohl beschrieben sind. Modifikationen der Nucleinsäuren der Erfindung werden auch in Betracht gezogen, vorausgesetzt, dass die wesentliche Struktur und Funktion des Peptids oder Polypeptids, das von der Nucleinsäure codiert wird, erhalten bleibt.
Die Nucleinsäure, die das Peptid oder Polypeptid der Erfindung codiert, kann Teil eines rekombinanten Nucleinsäurekonstrukts sein, das irgendeine Kombination von Restriktionsstellen und/oder funktionellen Elementen, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, enthält, die das molekulare Klonieren und andere rekombinante DNA-Manipulationen erleichtern. So liefert die vorliegende Erfindung weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäurekonstrukt, das eine Nucleinsäure enthält, die ein Peptid und/oder Polypeptid der Erfindung codiert.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Vektor, der eine Nucleinsäure enthält, die ein Peptid und/oder Polypeptid der Erfindung codiert. Der Vektor kann ein Expressionsvektor sein, der alle genetischen Komponenten enthält, die zur Expression der Nucleinsäure in Zellen erforderlich sind, in die der Vektor eingeführt worden ist, wie es im Stand der Technik wohl bekannt ist. Der Expressionsvektor kann ein kom merzieller Expressionsvektor sein oder er kann im Labor nach Standardprotokollen der Molekularbiologie konstruiert worden sein. Der Expressionsvektor kann eine virale Nucleinsäure enthalten, was Vaccinia-Virus- , Adenovirus-, Retrovirus- und/oder adenoassoziierte Virusnucleinsäure einschließt, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Nucleinsäure oder der Vektor der Erfindung können auch in einem Liposom oder einem Transportvehikel sein, das von einer Zelle durch Rezeptor vermittelte oder eine andere Art von Endocytose aufgenommen werden kann.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann in einer Zelle sein, die eine Zelle sein kann, die die Nucleinsäure exprimiert, wodurch ein Peptid und/oder Polypeptid der Erfindung in der Zelle erzeugt wird. Außerdem kann der erfindungsgemäße Vektor in einer Zelle sein, die eine Zelle sein kann, die die Nucleinsäure des Vektors exprimiert, wodurch ein Peptid und/oder Polypeptid der Erfindung in der Zelle erzeugt wird. Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Nucleinsäuren und/oder Vektoren der Erfindung in einem Wirtstier (z.B. einem transgenen Tier) vorhanden sein können, das die Nucleinsäuren der Erfindung exprimiert und die Peptide und/oder Polypeptide der Erfindung erzeugt.
Die Nucleinsäure, die die Peptide und Polypeptide der Erfindung codiert, kann irgendeine Nucleinsäure sein, die die Peptide und Polypeptide der Erfindung funktionell codiert. Um die Peptide und Polypeptide funktionell zu codieren (d.h. zulassen, dass die Nucleinsäure exprimiert wird), kann die Nucleinsäure der Erfindung z.B. Expressionskontrollsequenzen, z.B. einen Replikationsursprung, einen Promotor, einen Enhancer und notwendige Information zu Prozessierungsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminatorsequenzen enthalten.
Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Promotoren, die von Metallothioneingenen, Actingenen, Immunglobulingenen, CMV, SV40, Adenovirus, Rinderpapillomavirus etc. stammen. Eine Nucleinsäure, die ein ausgewähltes Peptid oder Polypeptid codiert, kann leicht bestimmt werden basierend auf dem genetischen Code für die Aminosäuresequenz des ausgewählten Peptids oder Polypeptids und viele Nucleinsäuren werden irgendein ausgewähltes Peptid oder Polypeptid codieren. Modifikationen in der Nucleinsäuresequenz, die das Peptid oder Polypeptid codiert, werden auch in Betracht gezogen. Modifikationen, die nützlich sein können, sind Modifikationen der Sequenzen, die die Expression des Peptids oder Polypeptids kontrollieren, um die Erzeugung des Peptids oder Polypeptids induzierbar oder reprimierbar zu machen, was durch geeignete Induktoren oder Repressoren kontrolliert wird. Solche Methoden sind Standard im Stand der Technik (81). Die Nucleinsäure der Erfindung kann mit Mitteln, die im Stand der Technik Standard sind, erzeugt werden, z.B. durch rekombinante Nucleinsäuretechniken und synthetische Nucleinsäuresynthese oder enzymatische in-vitro-Synthese.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung eines HCV-Core-Peptids mit verbesserter Immunogenizität, das umfasst, dass eine oder mehrere Aminosäuren des Peptids mit der Aminosäuresequenz DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3) ersetzt werden und die verbesserte Immunogenizität des substituierten Peptids nachgewiesen wird im Vergleich zu der Immunogenizität eines Kontrollpeptids mit der Aminosäuresequenz DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3), wobei ein substituiertes Peptid mit einer höheren Immunogenizität als das Kontrollpeptid ein HCV-Core-Peptid mit verbesserter Immunogenizität ist. Die Immunogenizität des substituierten und des Kontrollpeptids werden mit Methoden bestimmt, die in den hier angegebenen Beispielen ausgeführt sind. Die Erzeugung des Peptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 und der substituierten Peptide der Erfindung kann mit Methoden durchgeführt werden, die im Stand der Technik zur Peptidsynthese Standard sind. Alternativ kann eine Nucleinsäure, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 codiert oder ein substituiertes Peptid, das von Interesse ist, codiert, mit Standardprotokollen zur Nucleinsäuresynthese synthetisiert werden und die Nucleinsäure kann mit Methoden, die zur Expression der Nucleinsäure wohl bekannt sind, exprimiert werden. Das entstehende Peptid kann aus dem Expressionssystem durch Standardisolierungs- und Reinigungsverfahren entfernt werden und auf Immunogenizität getestet werden, wie hier angegeben.
Auf Basis der Erkenntnis dieser Erfindung kann die Substitution einer Aminosäure oder von Aminosäuren des Peptids DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3) zur Erzeugung eines Peptids der Erfindung mit verbesserter Immunogenizität, wie mit den erfindungsgemäßen Methoden bestimmt, durchgeführt werden durch einen systematischen Ansatz, der den Ersatz irgendwelcher Aminosäuren des Peptids aufeinander folgend, ausgehend vom Aminoende des Peptids, beinhaltet. Peptide mit einer einzigen Aminosäuresubstitution, die verbesserte Immunogenizität mit den hier beschriebenen Methoden zeigen, können aufgefunden werden und eine zweite Aminosäuresubstitution kann in der Aminosäuresequenz des einzeln substituierten Peptids aufeinander folgend eingeführt werden, beginnend am Aminoende des einzeln substituierten Peptids. Diese doppelt substituierten Peptide können dann auf verbesserte Immunogenizität getestet werden und an denen, die eine solche Verbesserung zeigen, können weitere Aminosäuresubstitutionen vorgenommen werden mit der hier beschriebenen systematischen sequenziellen Methode. So kann irgendeine Kombination von Substitutionen für eine verbesserte Immunogenizität in systematischer Art und Weise getestet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden und Polypeptiden der Erfindung, das umfasst, dass die Zellen der Erfindung, die die Nucleinsäuren oder Vektoren der Erfindung als exogene Nucleinsäure enthalten, erzeugt werden; die Zellen unter solchen Bedingungen gezüchtet werden, unter denen die exogene Nucleinsäure in der Zelle exprimiert werden kann und das codierte Peptid und/oder Polypeptid erzeugt werden kann und das Peptid und/oder Polypeptid aus der Zelle isoliert wird. Somit wird davon ausgegangen, dass die Peptide und Polypeptide der Erfindung in vitro entweder in proka ryotischen oder eukaryotischen Expressionssystemen, wie es im Stand der Technik wohl bekannt ist, in Mengen erzeugt werden können.
Zur Expression in einem prokaryotischen System gibt es zahlreiche E.-coli-(Escherichia coli)-Expressionsvektoren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind als nützlich zur Expression von Nucleinsäuren, die Peptide oder Polypeptide codieren. Andere mikrobielle Wirte, die zur Verwendung geeignet sind, schließen Bacilli, wie Bacillus subtilis, und andere Enterobakterien, wie Salmonella, Serratia, ebenso wie verschiedene Pseudomonas-Arten ein. Diese prokaryotischen Wirte können Expressionsvektoren unterstützen, die typischerweise Expressionskontrollsequenzen enthalten, die mit der Wirtszelle kompatibel sind (z.B. einem Replikationsursprung). Außerdem ist irgendeine Anzahl aus einer Vielzahl wohl bekannter Promotoren vorhanden, z.B. das Lactosepromotorsystem, ein Tryptophan-(Trp)-promotorsystem, ein β-Lactamasepromotorsystem oder ein Promotorsystem aus dem Phagen λ. Die Promotoren kontrollieren typischerweise die Expression, gegebenenfalls mit einer Operatorsequenz und haben Ribosomenbindungsstellensequenzen, z.B. um die Transkription und Translation zu starten und zu vervollständigen. Falls notwendig, kann ein Amino-terminales Methionin vorgesehen werden durch Insertion eines Met-Codons 5' und im Leserahmen mit dem Polypeptid. Auch kann die Carboxy-terminale Verlängerung des Polypeptids entfernt werden unter Verwendung von Standardverfahren zur Oligonucleotidmutagenese.
Die Nucleinsäuresequenzen können in Wirten exprimiert werden, nachdem die Sequenzen so angeordnet worden sind, dass ein Funktionieren einer Expressionskontrollsequenz sichergestellt ist. Diese Expressionsvektoren sind typischerweise in Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als integraler Teil der Wirtschromosomen-DNA replizierbar. Allgemein können Expressionsvektoren Selektionsmarker, z.B. Tetracyclinresistenz oder Hygromycinresistenz, enthalten, um einen Nachweis und/oder die Selektion solcher Zellen, die mit den gewünschten Nucleinsäuresequenzen transformiert sind, zuzulassen (82).
Für die Expression in einem eukaryotischen System kann ein Hefeexpressionssystem verwendet werden. Es gibt zahlreiche Vorteile in Bezug auf Hefeexpressionssysteme. Als Erstes bestehen Hinweise, dass Polypeptide, die in einem Hefeexpressionssystem erzeugt werden, die korrekte Disulfidpaarung aufweisen. Als Zweites wird die posttranslationale Glycosilierung durch Hefeexpressionssysteme effizient durchgeführt. Die Präpro-alpha-Faktor-Leaderregion von Saccharomyces cerevisiae (codiert von dem MFα-1-Gen) wird routinemäßig verwendet, um die Proteinsekretion aus Hefe zu steuern (83). Die Leaderregion des Prä-pro-alpha-Faktors enthält ein Signalpeptid und ein Prosegment, das eine Erkennungssequenz für eine Hefeprotease einschließt, die durch das KEX2-Gen codiert wird. Dieses Enzym spaltet das Vorläuferprotein auf der Carboxylseite einer Lys-Arg-Dipeptidspaltungs-Signalsequenz. Die das Polypeptid codierende Sequenz kann im Leserahmen mit der Prä-pro-alpha-Faktor-Leaderregion fusioniert sein. Dieses Konstrukt wird dann unter die Kontrolle eines starken Transkriptionspromotors gebracht, z.B. des Alkoholdehydrogenase-1-Promotors oder eines glycolytischen Promotors. An die codierende Sequenz schließt sich ein Translationsterminationscodon an, woran sich Transkriptionsterminationssignale anschließen. Alternativ kann die interessierende codierende Sequenz an eine zweite ein Polypeptid codierende Sequenz fusioniert sein, z.B. Sj26 oder β-Galactosidase, die verwendet werden, um die Reinigung des entstehenden Fusionspolypeptids mit Affinitätschromatographie zu erleichtern. Die Insertion von Proteasespaltstellen, um die Komponenten des Fusionspolypeptids zu trennen, ist anwendbar für Konstrukte, die zur Expression in Hefe verwendet werden.
Eine effiziente posttranslationale Glycosilierung und Expression von rekombinanten Polypeptiden kann auch erreicht werden in Baculovirus-Systemen in Insektenzellen, die ebenfalls im Stand der Technik wohl bekannt sind.
Die Peptide und Polypeptide der Erfindung können auch in Säugetierzellen exprimiert werden. Säugetierzellen lassen die Expression von Peptiden und Polypeptiden in einer Umgebung zu, die wichtige posttranslationale Modifikationen, wie Faltung und Cysteinpaarung, Zufügung komplexer Kohlenhydratstrukturen und Ausscheidung des aktiven Proteins favorisieren. Vektoren, die zur Expression von Peptiden und Polypeptiden in Säugetierzellen geeignet sind, sind gekennzeichnet durch Insertion der codierenden Sequenz zwischen einen starken viralen Promotor und ein Polyadenylierungssignal. Die Vektoren können Gene enthalten, die entweder Gentamicin- oder Methotrexatresistenz beitragen zur Verwendung als selektierbare Marker. Z.B. kann die codierende Sequenz in eine Zelllinie aus dem Eierstock des Chinesischen Hamsters (CHO) eingeführt werden unter Verwendung eines Methotrexatresistenz codierenden Vektors. Die Gegenwart von Vektor-RNA in transformierten Zellen kann bestätigt werden durch Northern-Blot-Analyse und Erzeugung einer cDNA oder einer Gegenstrang-RNA, die der das Peptid oder Polypeptid codierenden Sequenz entspricht, die bestätigt werden kann durch Southern- bzw. Northern-Blot-Analyse. Eine Anzahl anderer geeigneter Wirtszelllinien, die exogene Peptide und Polypeptide erzeugen können, wurden im Stand der Technik entwickelt und schließen die CHO-Zelllinien, HeLa-Zellen, Myelomzelllinien, Jurkatzellen und dgl. ein. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen einschließen, wie oben beschrieben.
Die Nucleinsäuren und/oder Vektoren der Erfindung können in die Wirtszelle mit wohl bekannten Methoden überführt werden, die abhängig von der Art der Wirtszelle variieren. Z.B. wird die Calciumchloridtransfektion üblicherweise verwendet für prokaryotische Zellen, wohingegen eine Calciumphosphatbehandlung oder Elektroporation für andere Wirtszellen verwendet werden kann.
Die Peptide, Polypeptide, Nucleinsäuren, Vektoren und Zellen der Erfindung können in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorhanden sein. So liefert die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die 1) ein Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1; 2) ein HCV-Core-Polypeptid, das eine L→A-Substitution an Aminosäureposition 139 aufweist; 3) ein HCV-Core-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweist; 4) ein Fragment eines HCV-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als das gesamte HCV-Core-Polypeptid und mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1; 5) eine Nucleinsäure, die eines der Peptide oder Polypeptide dieser Erfindung codiert; 6) einen Vektor, der irgendeine der Nucleinsäuren dieser Erfindung enthält und/oder 7) eine Zelle, die irgendeine der Nucleinsäuren und/oder Vektoren der Erfindung, in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Unter "pharmazeutisch annehmbar" wird ein Material verstanden, das nicht biologisch oder in anderer Weise unerwünscht ist, d.h. das Material kann an ein Individuum zusammen mit dem ausgewählten Peptid, Polypeptid, der Nucleinsäure, dem Vektor oder der Zelle verabreicht werden, ohne wesentliche schädliche biologische Wirkungen zu verursachen oder in schädlicher Weise mit irgendeiner der anderen Komponenten der Zusammensetzung eine Wechselwirkung einzugehen, in der es enthalten ist.
Weiterhin kann jede der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein geeignetes Adjuvans enthalten. Der Ausdruck "geeignetes Adjuvans", wie er hier verwendet wird, beschreibt ein Adjuvans, das mit dem Peptid oder Polypeptid der Erfindung kombiniert werden kann, um eine Immunantwort weiter zu verstärken, ohne eine schädliche Wirkung auf das Individuum oder die Zelle des Individuums auszuüben. Ein geeignetes Adjuvans kann MONTANIDE ISA51 (Seppic, Inc., Fairfield, NJ), SYNTEX Adjuvans Formulierung 1 (SAF-1), aufgebaut aus 5% (G/V) Squalen (DASF, Parsipanny, NJ), 2,5% Pluronic, L121-Polymer (Aldrich Chemical, Milwaukee) und 0,2% Polysorbat (Tween 80, Sigma) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung sein, ohne darauf beschränkt zu sein. Andere geeignete Adjuvantien sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen QS-21, Freund's Adjuvans (komplett und inkomplett), Alaun, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, bezeichnet als nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamin (CGP 19835A, bezeichnet als MTP-PE) und RIBI, das drei Komponenten enthält, die aus Bakterien isoliert wurden, Monophosphoryllipid A, Trealosedimycolat und Zellwandskelett (MPL + TDM + CWS) in 2% Squalen/Tween-80-Emulsion, ein.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch weitere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Verdünnungsmittel, immunstimulierende Cytokine etc. enthalten. Aktuelle Methoden zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder ergeben sich für den Fachmann auf diesem Gebiet (84).
Es wird davon ausgegangen, dass die oben beschriebenen Zusammensetzungen der Erfindung an ein Individuum oder eine Zelle eines Individuums verabreicht werden können, um therapeutischen Nutzen zu schaffen. Somit liefert die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren, um eine Immunantwort in einer Immunzelle eines Individuums zu erzeugen, das umfasst, dass die Zelle mit 1) einem Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1; 2) einem HCV-Core-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2; 3) einem HCV-Core-Polypeptid, das eine L→A-Substitution an Aminosäureposition 139 aufweist; 4) einem Fragment des HCV-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als das komplette HCV-Core-Polypeptid, das die SEQ ID Nr. 1 enthält, 5) eine Nucleinsäure, die eines der Peptide oder Polypeptide der Erfindung codiert und/oder 6) einem Vektor, der irgendeine der Nucleinsäuren der Erfindung enthält, in Kontakt gebracht wird. Die Zelle kann in vivo oder ex vivo sein und kann, ohne darauf beschränkt zu sein, ein CD8+ T-Lymphozyt (z.B. ein cytotoxischer T-Lymphozyt) oder eine MHCl exprimierende Antigen präsentierende Zelle, wie z.B. eine dendritische Zelle, ein Makrophage oder ein Monozyt sein.
Die vorliegende Erfindung schafft darüber hinaus ein Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort bei einem Individuum, indem dem Individuum irgendeine der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verabreicht wird, einschließlich einer Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und 1) ein Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1; 2) ein HCV-Core-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2; 3) ein HCV-Core-Polypeptid, das eine L→A-Substitution an Aminosäureposition 139 aufweist; 4) ein Fragment des HCV-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als ein vollständiges HCV-Core-Polypeptid, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 enthält, 5) eine Nucleinsäure, die irgendeines der erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide codiert und/oder 6) ein Vektor, der irgendeine der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren enthält, enthält. Die Zusammensetzung kann weiterhin ein geeignetes Adjuvans, wie vorher angegeben, enthalten.
Der Nachweis einer Immunantwort in dem Individuum oder in den Zellen des Individuums kann mit Methoden durchgeführt werden, die in den hier angeführten Beispielen angegeben sind, z.B. durch Nachweis der Gegenwart von cytotoxischen T-Zellen, die durch die Peptide oder Polypeptide dieser Erfindung aktiviert wurden.
Zusätzlich schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer HCV-Infektion bei einem Individuum, das umfasst, dass eine Immunzelle des Individuums mit irgendeinem Peptid, Polypeptid, Fragment, einer Nucleinsäure, einem Vektor und/oder Zellen der Erfindung in Kontakt gebracht wird. Die Zelle kann in vivo oder ex vivo sein und kann eine CD8⁺-T-Zelle sein, die mit dem Peptid oder Polypeptid der Erfindung in Gegenwart eines Klasse-I-MHC-Moleküls in Kontakt gebracht wird, das ein lösliches Molekül sein kann oder es kann auf der Oberfläche einer Zelle vorhanden sein, die Klasse-I-MCH-Moleküle exprimiert. Die Zelle kann auch eine Antigen präsentierende Zelle oder eine andere Klasse-I-MHC exprimierende Zelle sein, die mit den Nucleinsäuren und/oder Vektoren der Erfindung unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht werden kann, unter denen die Nucleinsäure oder der Vektor in die Zelle eingeführt wird mit Standardmethoden zur Aufnahme von Nucleinsäuren und Vektoren. Die Nucleinsäure, die das Peptid oder Polypeptid der Erfindung codiert, wird dann exprimiert und das Peptid oder Polypeptidprodukt wird prozessiert innerhalb der Antigen präsentierenden Zelle oder einer anderen MHCl exprimierenden Zelle und auf der Zelloberfläche als MHCl/Antigenkomplex präsentiert. Die Antigen präsentierende Zelle oder andere Klasse-I-MHC exprimierende Zelle wird dann mit einer Immunzelle des Individuums in Kontakt gebracht, die den Klasse-I-MHC/Antigenkomplex bindet und eine Immunantwort hervorruft, die die HCV-Infektion in dem Individuum behandelt oder verhütet.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer HCV-Infektion bei einem Individuum, das umfasst, dass dem Individuum irgendeine der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verabreicht wird, einschließlich einer Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und 1) ein Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1; 2) ein HCV-Core-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2; 3) ein HCV-Core-Polypeptid, das eine L→A-Substitution an Aminosäureposition 139 aufweist; 4) ein Fragment des HCV-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als dem vollständigen HCV-Core-Polypeptid, das eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 enthält; 5) eine Nucleinsäure, die irgendeines der erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide codiert und/oder 6) ein Vektor, der irgendeine der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren enthält, enthält.
Wie oben ausgeführt, wird davon ausgegangen, dass bei den Verfahren, bei denen erfindungsgemäße Zusammensetzungen an ein Individuum oder eine Zelle eines Individuums verabreicht werden, solche Verfahren weiterhin die Stufe beinhalten können, dass ein geeignetes Adjuvans dem Individuum oder einer Zelle des Individuums verabreicht wird. Das Adjuvans kann in der Zusammensetzung der Erfindung sein oder das Adjuvans kann in einer getrennten Zusammensetzung sein, die das geeignete Adjuvans und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Das Adjuvans kann vor, gleichzeitig mit oder nach Verabreichung der Zusammensetzung, die irgendeines der Peptide, Polypeptide, Nucleinsäuren und/oder Vektoren der Erfindung enthält, verabreicht werden. Z.B. kann QS-21, ähnlich wie Alaun, komplettes Freund's Adjuvans, SAF etc. innerhalb von Stunden (vor oder nach) der Verabreichung des Peptids verabreicht werden. Die Wirksamkeit eines Adjuvans kann bestimmt werden, indem die gegen das Peptid oder Polypeptid der Erfindung gerichtete Immunantwort mit und ohne Adjuvans gemessen wird unter Verwendung von Standardverfahren, wie sie in den Beispielen hier beschrieben werden.
Gegenstand der Erfindung kann irgendein Individuum sein, das eine Immunantwort gemäß der Erfindung benötigt und/oder die Behandlung oder Verhütung einer HCV-Infektion benötigt. Symptome einer HCV-Infektion können niedriges Fieber, Unwohlsein und Anorexie einschließen. Die Erhöhung der Serumieberenzyme, wie SGOT und SGPT findet sich auch typischerweise. Die Diagnose einer HCV-Infektion, kann erfolgen, indem HCV-Antikörper im Serum des Individuums nachgewiesen werden. Die Bestätigung der Diagno se kann mit PCR-Test auf HCV-RNA im Blut des Individuums erfolgen. Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet auch wohl verständlich, dass viele Individuen, die mit HCV infiziert sind, asymptomatisch sind.
Allgemeine Infektionsquellen schließen Bluttransfusionen, infizierte Sexualpartner und kontaminierte Nadeln ein. Weiterhin können Individuen, die für eine Blutkrankheit empfänglich sind, ein Risiko für eine HCV-Infektion haben. So kann jemand, für den die Methoden dieser Erfindung indiziert wären, um eine HCV-Infektion zu verhüten, ein Individuum sein, das eine Bluttransfusion erhalten hat, einen infizierten Sexualpartner hat, kontaminierte Nadeln für intravenösen Drogenmissbrauch teilt oder zufällig mit einer kontaminierten Nadel gestochen worden ist oder mit HCV-kontaminierten Geweben oder Körperflüssigkeiten ausgesetzt war (z.B. Mitarbeiter im Gesundheitssystem).
Die Peptide und Polypeptide der Erfindung können an eine Zelle eines Individuums entweder in vivo oder ex vivo verabreicht werden. Zur Verabreichung in eine Zelle des Individuums in vivo ebenso wie zur Verabreichung an das Individuum können die Peptide und Polypeptide der Erfindung oral, parenteral (z.B. intravenös), durch intramuskuläre Injektion, durch intraperitoneale Injektion, subcutane Injektion, transdermal, extrakorporal, topisch oder dgl. verabreicht werden. Das Peptid oder Polypeptid der Erfindung kann auch auf dendritische Zellen pulsartig abgegeben werden, die aus Patientenzellen isoliert oder gezüchtet wurden, mit Methoden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, oder auf Massen von PBMC oder verschiedenen Zellunterfraktionen davon aus einem Patienten.
Die genaue Menge des Peptids oder Polypeptids, die erforderlich ist, variiert von Patient zu Patient, abhängig von der Art, dem Alter, dem Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Individuums, dem jeweils verwendeten Peptid oder Polypeptid, der Verabreichungsart und dgl. Somit ist es nicht möglich, eine genaue Menge für jedes Peptid oder Polypeptid spezifisch anzugeben. Eine geeignete Menge kann jedoch von einem Fachmann auf diesem Gebiet unter Verwendung von Routineversuchen, die durch die hier gezeigte Lehre angegeben werden (84), bestimmt werden.
Als ein Beispiel kann an ein Individuum, bei dem eine HCV-Infektion diagnostiziert wurde oder von dem bekannt ist, dass ein Risiko dafür besteht, mit HCV infiziert zu werden, zwischen etwa 50 und 1000 nM und bevorzugter zwischen etwa 100 und 500 nM eines Peptids und/oder Polypeptids der Erfindung und gegebenenfalls in einem Adjuvans subcutan verabreicht werden in Intervallen von 1 bis 3 Wochen etwa 12 Wochen lang oder bis die Auswertung der klinischen Parameter des Individuums (Symptome, Leberenzympegel, HCV-RNA-Pegel) zeigen, dass das Individuum nicht mit HCV infiziert ist. Alternativ kann ein Peptid und/oder Polypeptid der Erfindung auf dendritische Zellen in einer Konzentration zwischen etwa 10 und 100 μM pulsartig abgegeben werden und die dendritischen Zellen können dem Individuum intravenös in den gleichen Zeitintervallen verabreicht werden. Die Behandlung kann fortgesetzt werden oder wieder aufge nommen werden, wenn die klinischen Parameter des Individuums zeigen, dass die HCV-Infektion noch vorhanden ist und können aufrechterhalten werden, bis die Infektion nicht mehr mit diesen Parametern nachgewiesen werden kann.
Wenn ex-vivo-Methoden angewendet werden, können Zellen oder Gewebe entnommen werden und außerhalb des Körpers des Individuums erhalten werden gemäß Standardprotokollen, die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Die Peptide oder Polypeptide der Erfindung können in die Zellen über bekannte Mechanismen zur Aufnahme von Peptiden und Polypeptiden in Zellen eingeführt werden (z.B. Phagozytose, pulsartiges Abgeben auf Klasse-I-MHC exprimierende Zellen, Liposomen etc.). Die Zellen können dann infundiert werden (z.B. in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger) oder rücktransplantiert werden in das Individuum mit Standardmethoden für Zellen oder Gewebe. Standardmethoden sind bekannt zur Transplantation oder Infusion verschiedener Zellen in ein Individuum.
Die Nucleinsäuren und Vektoren der Erfindung können auch an eine Zelle des Individuums entweder in vivo oder ex vivo verabreicht werden. Die Zelle kann irgendeine Zelle sein, die exogene Nucleinsäuren aufnehmen und exprimieren kann und die Peptide und Polypeptide der Erfindung erzeugen kann. So können die Peptide und Polypeptide der Erfindung durch eine Zelle erzeugt werden, die sie ausscheidet, wodurch das Peptid oder Polypeptid erzeugt und ausgeschieden wird und dann aufgenommen und anschließend prozessiert wird durch eine Antigen präsentierende Zelle oder eine andere Klasse-I-MHC exprimierende Zelle und dem Immunsystem präsentiert wird zur Induktion einer Immunantwort. Alternativ können die Peptide und Polypeptide der Erfindung direkt in einer Antigen präsentierenden Zelle oder einer anderen Klasse-I-MHC exprimierenden Zelle erzeugt werden, in der das Peptid oder Polypeptid erzeugt und direkt prozessiert werden kann und dem Immunsystem auf der Zelloberfläche präsentiert werden kann.
Die Nucleinsäuren und Vektoren der Erfindung können oral, parenteral (z.B. intravenös), durch intramuskuläre Injektion, durch intraperitoneale Injektion, transdermal, extrakorporal, topisch oder dgl. verabreicht werden. Bei den hier beschriebenen Methoden, die die Verabreichung und Aufnahme von exogener DNA in die Zellen eines Individuums einschließen (z.B. Gentransduktion oder –transfektion) können die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung in Form nackter DNA sein oder die Nucleinsäuren können in einem Vektor zur Abgabe der Nucleinsäuren an die Zellen zur Expression der Peptide oder Polypeptide der Erfindung sein. Der Vektor kann ein im Handel erhältliches Präparat sein oder kann im Labor mit im Stand der Technik wohl bekannten Methoden konstruiert werden.
Die Abgabe der Nucleinsäure oder des Vektors an Zellen kann über eine Vielzahl von Mechanismen erfolgen. Als ein Beispiel kann die Abgabe über ein Liposom erfolgen, wobei im Handel erhältliche Liposomenpräparate, wie LIPOFECTIN, LIPOFECTAMIN (GIBCO BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc., Hilden, Deutschland) und TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI) ebenso wie andere Liposomen, die mit Verfahren, die im Stand der Technik Standard sind, entwickelt wurden, verwendet werden können. Außerdem kann die Nucleinsäure oder der Vektor der Erfindung in vivo durch Elektroporation abgegeben werden, wofür die Technologie von Genetronics, Inc. (San Diego, CA) erhältlich ist, ebenso wie mithilfe eines SONOPORATION-Geräts (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).
Als ein Beispiel kann die Vektorabgabe über ein virales System erfolgen, z.B. ein Retrovirusvektorsystem, das ein rekombinantes retrovirales Genom verpacken kann (siehe z.B. 70, 71). Der rekombinante Retrovirus kann dann verwendet werden, um zu infizieren und dadurch an die infizierten Zellen Nucleinsäure, die das Peptid oder Polypeptid codiert, abzugeben. Die genaue Methode des Einführens der exogenen Nucleinsäure in Säugetierzellen ist natürlich nicht auf die Verwendung von retroviralen Vektoren beschränkt. Andere Techniken, die breit verfügbar sind für dieses Verfahren, schließen die Verwendung von Adenovirusvektoren (72), adenoassoziierten viralen (AAV) Vektoren (73), Lentivirusvektoren (74), Pseudoretrovirusvektoren (75) und Vacciniavirusvektoren (85) ebenso wie irgendwelche anderen viralen Vektoren, die jetzt bekannt sind oder in der Zukunft entwickelt werden, ein. Die Techniken zur physikalischen Transduktion können auch verwendet werden, z.B. Liposomenabgabe und rezeptorvermittelte und andere Endozytosemechanismen (siehe z.B. 76). Die Erfindung kann zusammen mit irgendeiner von diesen oder anderen allgemein verwendeten Gentransfermethoden angewendet werden.
Als ein Beispiel kann dann, wenn die Nucleinsäure der Erfindung an die Zellen eines Individuums in einem Adenovirusvektor abgegeben wird, die Dosierung zur Verabreichung des Adenovirus an Menschen in einem Bereich von etwa 10⁷ bis 10⁹ Plaque bildenden Einheiten (pfu) pro Injektion sein, kann aber auch bis zu 10¹² pfu pro Injektion sein (77, 78). Idealerweise erhält ein Individuum eine einzelne Injektion. Falls zusätzliche Injektionen notwendig sind, können sie in Intervallen von 6 Monaten über einen unbegrenzten Zeitraum wiederholt werden und/oder bis sich die Wirksamkeit der Behandlung etabliert hat. Wie vorher angegeben, kann die Wirksamkeit der Behandlung bestimmt werden, indem die hier beschriebenen klinischen Parameter ausgewertet werden.
Die genaue Menge der Nucleinsäure oder des Vektors, die erforderlich ist, variiert von Individuum zu Individuum abhängig von der Art, dem Alter, dem Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Individuums, der jeweilig verwendeten Nucleinsäure oder des jeweilig verwendeten Vektors, der Verabreichungsart und dgl. Somit ist es nicht möglich, eine genaue Menge für jede Nucleinsäure oder jeden Vektor spezifisch anzugeben. Jedoch kann eine geeignete Menge von einem Fachmann auf diesem Gebiet unter Verwendung von Routineversuchen, die in der hier beschriebenen Lehre angegeben sind, bestimmt werden (84).
Wenn ex-vivo-Methoden angewendet werden, können Zellen oder Gewebe entnommen werden und außerhalb des Körpers gemäß im Stand der Technik wohl bekannten Standardprotokollen aufrechterhalten werden. Die Nucleinsäuren und Vektoren der Erfindung können in die Zellen über irgendeinen Gentransfermechanismus eingeführt werden, z.B. einen virusvermittelten Gentransport, calciumphosphatvermittelten Gentransport, Elektroporation, Mikroinjektion oder Proteoliposomen. Die transduzierten Zellen können dann infundiert werden (z.B. in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger) oder in das Individuum mit Standardmethoden für diese Zell- oder Gewebeart rücktransplantiert werden. Standardmethoden sind bekannt für die Transplantation oder Infusion verschiedener Zellen in ein Individuum.
Die parenterale Verabreichung der Peptide, Polypeptide, Nucleinsäuren und/oder Vektoren der vorliegenden Erfindung ist allgemein, falls verwendet, durch Injektion gekennzeichnet. Injizierbare Präparate können in üblichen Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Auflösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen. Der Ausdruck "parenterale Verabreichung", wie er hier verwendet wird, schließt intradermale, subcutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse und intratracheale Wege ein. Ein kürzlich überarbeiteter Ansatz für die parenterale Verabreichung beinhaltet die Verwendung eines Systems mit langsamer Freisetzung oder verzögerter Freisetzung, so dass eine konstante Dosierung aufrechterhalten wird. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 3 610 795, das hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird.
Die Wirksamkeit der Behandlung oder Verhütung einer HCV-Infektion mit den Methoden der vorliegenden Erfindung kann bestimmt werden, indem eine klinische Verbesserung der Symptome des Patienten nachgewiesen wird, wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt ist. Außerdem kann eine Abnahme der Serumpegel der Leberenzyme, wie SGOT und SGPT, ebenso wie eine Abnahme der viralen RNA, was mit einem PCR-Test bestimmt wird, objektive Hinweise auf die Wirksamkeit dieser Methoden liefern.
Die vorliegende Erfindung liefert zusätzlich ein Verfahren, um cytotoxische T-Lymphozyten zu aktivieren, das umfasst, dass der Lymphozyt mit irgendeinem der Peptide und/oder Polypeptide der Erfindung in Gegenwart eines Klasse-I-MHC-Moleküls in Kontakt gebracht wird. Das Klasse-I-MHC-Molekül kann in löslicher Form erzeugt werden gemäß Methoden, die im Stand der Technik Standard sind oder kann an der Oberfläche einer Zelle sein, die Klasse-I-MHC exprimiert. Die Bedingungen, unter denen die CTL mit den Peptiden und/oder Polypeptiden in Gegenwart des Klasse-I-MHC-Moleküls in Kontakt gebracht werden, um die CTL zu aktivieren, sind im Stand der Technik wohl bekannt und werden in den hier angegebenen Beispielen beschrieben. Beispiele für Zellen, die Klasse-I-MHC-Moleküle exprimieren, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, dendritische Zellen, Monozyten, Makrophagen, Fibroblasten, B-Lymphozyten und T-Lymphozyten ein. Cytotoxische T-Lymphozytenzelllinien können mit Methoden erhalten werden, die in den Beispielen hier angegeben sind. Die Aktivierung der CTL kann bestimmt werden mit Methoden, die in den hier angegebenen Beispielen ausgeführt sind.
Somit liefert die vorliegende Erfindung weiterhin eine Zusammensetzung, die cytotoxische T-Lymphozyten enthält, die aktiviert wurden durch Kontakt mit irgendeinem der Peptide und/oder Polypeptide der Erfindung in Gegenwart eines Klasse-I-MCH-Moleküls. Es versteht sich, dass die Zusammensetzung eine Population von PBMC enthalten kann, die aktivierte CTL einschließen oder die Zusammensetzung kann eine CTL-Linie enthalten, wie in den hier angegebenen Beispielen beschrieben.
Es wird weiterhin in Betracht gezogen, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für diagnostische und therapeutische Anwendungen verwendet werden können. So liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptids in einer Zelle, das umfasst, dass die Zelle mit den aktivierten cytotoxischen T-Lymphozyten dieser Erfindung in Kontakt gebracht wird unter solchen Bedingungen, unter denen eine Cytolyse der Zielzellen auftreten kann und die Cytolyse der Zielzellen nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytolyse von Zielzellen auf die Gegenwart von Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptid in der Zelle hinweist. Die Zelle kann irgendeine Zelle sein, die eine Infektion durch HCV aufrechterhält und durch die aktivierten CTL dieser Erfindung erkannt wird.
Ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptid in einer Zelle wird auch angegeben, das umfasst, dass die Zelle mit den aktivierten cytotoxischen T-Lymphozyten der Erfindung unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, unter denen eine Cytokinproduktion in den Lymphozyten auftreten kann, und die Cytokinproduktion in den Lymphozyten nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytokinproduktion in den Lymphozyten auf die Gegenwart von Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptid in der Zelle hinweist. Die Zelle kann irgendeine Zelle sein, die eine Infektion durch HCV aufrechterhalten kann und durch die aktivierten CTL der Erfindung erkannt werden kann.
Angegeben ist hier auch ein Verfahren zum Nachweis von Hepatitis-C-Virus in einer Probe, das umfasst, dass a) die Probe mit einer Zelle in Kontakt gebracht wird, die für eine Infektion mit Hepatitis-C-Virus empfänglich ist unter Bedingungen, unter denen die Zelle mit Hepatitis-C-Virus in der Probe infiziert werden kann; b) die Zelle von Stufe (a) mit den cytolytischen T-Lymphozyten der Erfindung in Kontakt gebracht wird unter solchen Bedingungen, unter denen die Cytolyse von Zielzellen erfolgen kann und c) die Cytolyse der Zielzellen nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytolyse von Zielzellen auf eine Diagnose einer Hepatitis-C-Virusinfektion bei dem Individuum hindeutet.
Die Probe dieser Erfindung kann irgendeine Probe sein, in der infektiöse HCV vorhanden sind. Z.B. kann die Probe eine Probe sein, die einem Individuum entnommen wurde, z.B. eine Körperflüssigkeit, Zellen oder Gewebe, die infektiöse HCV-Partikel enthalten können.
Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Hepatitis-C-Virus in einer Probe, das umfasst: dass a) die Probe mit einer Zelle in Kontakt gebracht wird, die für eine Infektion durch Hepatitis-C-Virus empfänglich ist unter Bedingungen, unter denen die Zelle mit Hepatitis-C-Virus in der Probe infiziert werden kann; b) die Zelle von Stufe a) mit den cytolytischen T-Lymphozyten dieser Erfindung unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, unter denen Cytokinproduktion in den Lymphozyten auftreten kann und c) die Cytokinproduktion in den Lymphozyten nachgewiesen wird, wobei der Nachweis einer Cytokinproduktion in den Lymphozyten die Gegenwart von Hepatitis-C-Virus in der Probe anzeigt.
Zusätzlich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Hepatitis-C-Virusinfektionen bei einem Individuum, das umfasst, dass cytotoxische T-Lymphozyten des Individuums mit einem der Peptide oder Polypeptide der Erfindung in Gegenwart eines Klasse-I-MHC-Moleküls in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, unter denen Cytolyse der Zielzellen auftreten kann und die Cytolyse der Zielzellen nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytolyse von Zielzellen auf eine Diagnose von Hepatitis-C-Virusinfektion in dem Individuum hinweist.
Ein Verfahren zur Diagnostizierung einer Hepatitis-C-Virusinfektion bei einem Individuum wird weiterhin bereitgestellt, das umfasst, dass cytotoxische T-Lymphozyten des Individuums mit einem der Peptide oder Polypeptide der Erfindung unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen eine Cytokinproduktion in den CTL auftreten kann und die Cytokinproduktion in den CTL nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytokinproduktion in den CTL eine Diagnose einer Hepatitis-C-Virusinfektion in dem Individuum ergibt.
Cytotoxische T-Lymphozyten können von dem Individuum erhalten werden, wie in den Beispielen ausgeführt. Der Gegenstand der Erfindung kann irgendein Tier sein, das für eine Infektion mit HCV empfänglich ist. Z.B. kann Gegenstand ein Schimpanse sein und in einer bevorzugten Ausführungsform ist der Gegenstand ein Mensch.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Bestimmung der Virenlast mit Hepatitis-C-Virus bei einem Individuum, das umfasst, dass a) eine biologische Probe von dem Individuum, das das Hepatitis-C-Virus enthält, seriell verdünnt wird; b) jede seriell verdünnte Probe mit einer Zelle, die für eine Infektion mit Hepatitis-C-Virus empfänglich ist, unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, unter denen die Zelle mit Hepatitis-C-Virus in der Probe infiziert werden kann; c) die Zelle von Stufe (b) mit den cytolytischen T-Lymphozyten der Erfindung unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, unter denen eine Cytokinproduktion in den CTL auftreten kann; d) der Anteil an Cytokinproduktion in den CTL bestimmt wird; e) der Anteil an Cytokinproduktion in den CTL von Stufe c) mit dem Anteil der Cytokinproduktion in aktivierten CTL, die mit Zellen in Kontakt gebracht worden sind, die mit seriell verdünnten Kontrollproben infiziert worden sind, die eine bekannte Menge an Hepatitis-C-Virus enthalten, verglichen wird und f) die Virenlast an Hepatitis-C-Virus in dem Individuum durch Vergleich von Stufe e) bestimmt wird.
Eine weitere Methode wird bereitgestellt zur Bestimmung der Virenlast an Hepatitis-C-Virus in einem Individuum, das umfasst, dass a) eine biologische Probe von dem Individuum, das das Hepatitis-C-Virus enthält, seriell verdünnt wird; b) jede seriell verdünnte Probe mit einer Zelle in Kontakt gebracht wird, die für eine Infektion mit Hepatitis-C-Virus empfindlich ist unter Bedingungen, unter denen die Zelle mit Hepatitis-C-Virus in der Probe infiziert werden kann; c) die Zelle von Stufe (b) mit den cytolytischen T-Lymphozyten der Erfindung unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, unter denen eine Cytolyse von Zielzellen auftreten kann; d) der Anteil an Cytolyse der Zielzellen bestimmt wird; e) der Anteil an Cytolyse der Zielzellen von Stufe d) mit dem Anteil an Cytolyse von Zielzellen durch aktivierte cytotoxische T-Lymphozyten, die mit Zellen, die mit seriell verdünnten Kontrollproben infiziert worden sind, die eine bekannte Menge an Hepatitis-C-Virus enthalten, in Kontakt gebracht worden sind, verglichen wird und f) die Virenlast an Hepatitis-C-Virus in dem Individuum durch Vergleich von Stufe e) bestimmt wird.
Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Virenlast an HCV an einem Individuum bestimmt werden kann, indem a) HCV-infizierte Zellen (z.B. Leberzellen, PBMC) mit den cytolytischen T-Lymphozyten der Erfindung in Kontakt gebracht werden; b) der Anteil an Cytolyse der Zielzellen oder die Cytokinproduktion in den CTL bestimmt wird; c) der Anteil an Cytolyse der Zielzellen oder an Cytokinproduktion in den CTL von Stufe b) mit dem Anteil an Cytolyse von Zielzellen oder Cytokinproduktion in aktivierten CTL, die mit Zellen in Kontakt gebracht worden sind, die mit seriell verdünnten Kontrollproben infiziert worden sind, die eine bekannte Menge an Hepatitis-C-Virus enthalten, verglichen wird und d) die Virenlast an Hepatitis-C-Virus in dem Individuum durch Vergleich von Stufe (c) bestimmt wird.
Die Probe von dem Individuum, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann irgendeine Probe sein, die infektiöse HCV enthalten kann, was Serum, Plasma, Lebergewebe und PBMC einschließt, ohne darauf beschränkt zu sein.
Auf Basis der mit den obigen Methoden gelieferten Information kann eine Berechnung der HCV-Virenlast in einem Individuum durchgeführt werden mit Methoden, die im Stand der Technik Standard sind zur Bestimmung einer Virenlast (88).
Schließlich liefert die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung der Prognose bei einem Individuum, bei dem Hepatitis-C-Virusinfektion diagnostiziert worden ist, das umfasst, dass eine Virenlast für das Individuum mit den erfindungsgemäßen Methoden bestimmt wird, wobei eine hohe Virenlast auf eine schlechte Prognose hindeuten kann und eine niedrige Virenlast auf eine gute Prognose hindeutet.
Der Wert der HCV-Virenlast, der eine "hohe" Virenlast an HCV wäre und eine Korrelation mit einer hohen Virenlast mit der Prognose bei einem Patienten kann bestimmt werden mit Methoden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Z.B. kann eine hohe Virenlast, wie sie mit den erfindungsgemäßen Methoden bestimmt worden ist, einen Patienten identifizieren, bei dem die Krankheit zu einem fortgeschrittenen Zustand fortschreitet oder bei dem dies wahrscheinlich ist, ebenso wie sie einen vorhersagenden Indikator für die Antwort des Patenten auf eine Behandlung, z.B. eine Interferontherapie liefert (88, 89, 90).
Für die erfindungsgemäßen Methoden, bei denen Cytolyse von Zielzellen nachgewiesen wird, kann der Nachweis der Cytolyse der Zielzellen gemäß irgendeiner Methode zum Nachweis der Cytolyse von Zielzellen erfolgen, die bereits bekannt ist oder die noch entwickelt wird. Z.B. werden die Erzeugung von ⁵¹Cr-markierten Zielzellen und ein Test, mit dem die Cytolyse von Zielzellen nachgewiesen werden kann durch Freisetzung von ⁵¹Cr aus einer Zielzelle, in den hier bereitgestellten Beispielen beschrieben. Weitere Methoden zum Nachweis der Cytolyse können auch bei diesen Methoden verwendet werden, z.B. die Freisetzung von Europium oder von verschiedenen Farbstoffen aus in geeigneter Weise markierten Zielzellen, die Aufnahme von Farbstoffen in Zellen oder der Nachweis der Apoptose von Zielzellen mit Standardmethoden des Standes der Technik.
Für die erfindungsgemäßen Methoden, bei denen die Erzeugung eines Cytokins in einem aktivierten cytolytischen T-Lymphozyten nachgewiesen wird, kann das Cytokin, ohne darauf beschränkt zu sein, Interleukin-2, Interferon-γ, Granulozyten/Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor, Interleukin-10, Interleukin-4, Interleukin-5 und/oder Interleukin-3 sein. Der Nachweis der Cytokinproduktion kann mit irgendeiner Methode erfolgen, die im Stand der Technik bekannt ist, z.B. mit im Handel erhältlichen Tests oder mit irgendeiner anderen Methode, die später zum Nachweis der Gegenwart eines Cytokins entwickelt wird (86).
Die vorliegende Erfindung wird genauer in den folgenden Beispielen beschrieben, die nur erläuternd sein sollen, da zahlreiche Modifikationen und Variationen sich für den Fachmann daraus ergeben.
Beispiele
Synthetische Peptide
Es wurden Peptide hergestellt in einem Mehrfachpeptidsyntheseautomaten (Symphony; Protein Technologies, Inc.) unter Verwendung der Fmoc-Chemie. Die Peptide wurden mit Reverse-Phase-HPLC gereinigt und die Aminosäuresequenz jedes der Peptide wurde bestätigt mit einem Sequenzautomaten von Applied Biosystems 477A.
Zellen
Die T2-Zelllinie ist defizient bezüglich der TAP1- und TAP2-Transporterproteine und exprimiert niedrige Anteile an HLA-A2.1 (50, 51). Die Human-B-Lymphoblastoidzelllinie HMYCIR wurde transfiziert mit HLA-A2.1 (C1R.A2.1). Die Zelllinie C1R.AAD (HMYC1R transfiziert mit dem chimären HLA-Molekül, das die α1- und α2-Domänen aus Human-HLA-A.21 und α3 aus Maus-H-2D^d enthält) wurden bereits beschrieben (48). Die Zelllinien wurden in komplettem T-Zellmedium (CTM; 1:1-Mischung von RPMI:EHAA (Life Technologies; Grand Island, NY), das 10% fötales Rinderserum (FBS), 4 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 50 μM 2-Mercaptoethanol enthielt) aufrechterhalten.
Menschliche Individuen
Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden von einem Patienten mit chronischer HCV-Infektion isoliert. Der Patient hatte Anti-HCV-spezifische Antikörper, wie mit einem im Handel erhältlichen Test nachgewiesen wurden (Ortho Diagnostics, Raritan, NJ) und war HCV-RNA-positiv gemäß PCR.
Mäuse
Transgene A2Kb-Mäuse (Scripps Research Inst.) und transgene AAD-Mäuse (University of Virginia) wurden in Kolonie bei BioCon Inc. (Rockville, MD) gezüchtet. Diese Tiere wurden bereits beschrieben (48, 52) und sie exprimieren α1- und α2-Domänen aus menschlichem HLA-A2.1-Molekülen und die α3-Domäne ausα Maus-H-2K^b- bzw. -H-2D^d-Molekülen.
Bindungstests
Die Peptidbindung an HLA-Moleküle wurde gemessen unter Verwendung der T2-Mutantenzelllinie gemäß einem bereits beschriebenen Protokoll (53). T2-Zellen (3 × 10⁵/Napf) wurden über Nacht in 96-Napf-Platten mit Kulturmedium (1:1-Mischung von RPMI 1640:EHAA, das 2,5% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin enthielt) mit 10 μg/ml β2-Mikroglobulin (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) und unterschiedlichen Peptidkonzentrationen inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit kaltem PBS, das 2% FBS enthielt, gewaschen und 30 Minuten bei 4°C mit Anti-HLA-A2.1-BB7.2-monoklonalem Antikörper inkubiert (1:80-Verdünnung aus Hybridomaüberstand) und 5 μg/ml FITC-markiertem Ziege-Antimaus-Ig (Pharmingen; San Diego, CA). Die Zellen wurden nach jeder Inkubation zweimal gewaschen und die HLA-A2.1-Expression wurde mit Durchflusscytometrie an einem FACScan (Becton Dickinson) gemessen. Die HLA-A2.1-Expression wurde quantitativ ausgewertet als Fluoreszenzindex (FI) gemäß der Formel: FI = (mittlere Fluoreszenz mit Peptid – mittlere Fluoreszenz ohne Peptid)/mittlere Fluoreszenz ohne Peptid. Die Hintergrundfluoreszenz ohne BB7.2-Antikörper wurde von jedem einzelnen Wert abgezogen. Um die unterschiedlichen Peptide zu vergleichen, wurde FI_0,5, die Peptidkonzentration, die die HLA-A2.1-Expression um 50% erhöht gegenüber einem Peptidkontrollhintergrund, aus der Titrationskurve für jedes Peptid berechnet.
Erzeugung von menschlichen CTL
Cytotoxische T-Lymphozyten-(CTL)-Linien wurden erzeugt gemäß dem bereits beschriebenen Protokoll (12, 14). PBMC von einem Patienten, der chronisch mit HCV infiziert war, wurden durch Ficoll-Hypaque abgetrennt und 10⁶ Zellen wurden stimuliert in 400 μl CTM in 48-Napf-Platten mit 2 × 10⁶ autologen Zellen, die vorher 3 Stunden mit 10 μM Peptid in CTM gepulst worden waren. Nach 3 Tagen wurde das gleiche Volumen an CTM mit IL-2 (10% V/V) jedem Napf zugefügt und die Zellen wurden am Tag 6 weiter expandiert mit CTM, das IL-2 enthielt. Dieser Zyklus wurde alle 10 Tage wiederholt. Für die ersten drei Zyklen wurden 2 × 10⁶ peptidgepulste, bestrahlte (3000 rad) autologe PBMC als Antigen präsentierende Zellen (APC) in nachfolgenden Zyklen verwendet, CTL wurden mit 3 × 10⁵ peptidgepulsten, bestrahlten (3000 rad) autologen Con-A-Blasts und 1,5 × 10⁶ bestrahlten allogenen PBMC stimuliert. Con-A-Blasts wurden erhalten, indem PBMC mit 10 μg/ml Concanavalin A stimuliert wurden und mit CTM, das 50 U/ml IL-2 und 1 U/ml IL-6 enthielt, expandiert wurden. Con-A-Blasts wurden mit Con A alle 8 bis 10 Tage stimuliert. Die Stimulierung von PBMC mit Peptid führt zur Expansion von Peptidantigen-spezifischen CTL, während nichtspezifische Zellen, die nicht stimuliert wurden, aussterben, was zu einer CTL-Linie fahrt, die spezifisch für das Peptid ist. Diese Anreicherung, die zu einer im Wesentlichen homogenen Population von Peptidantigen-spezifischen CTL führt, erfolgt nach etwa 3 bis 5 Zyklen Stimulation. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde eine CTL-Linie, ViT2, von einem Patienten mit chronischer aktiver HCV-Infektion gezogen.
Erzeugung von Maus-CTL
8 bis 12 Wochen alte Mäuse wurden subcutan (s.c.) an der Schwanzbasis mit 100 μl einer Emulsion, die 1:1 inkomplettes Freund's Adjuvans (IFA) und PBS-Lösung mit Peptiden (Antigenen) und Cytokinen (50 nmol CTL-Epitop, 50 nmol HBV core (aa) 128-140-Helperepitop, 3 μg IL-12 und 3 μg GM-CSF) (54) enthielt, immunisiert. Die Mäuse wurden zwei Wochen später geboostert und die Milz 10 bis 14 Tage nach der Booster-Impfung entnommen. Immunmilzzellen (2,5 × 10⁶/Napf) wurden in 24-Napf-Platten mit autologen Milzzellen (5 × 10⁶/Napf), die 2 Stunden mit 10 μM CTL-Epitoppeptid in CTM mit 10% T-STIM (Collaborative Biomedical Products, Redford, MA) gepulst worden waren, stimuliert. Nach einer weiteren in-vitro-Stimulierung mit peptidgepulsten syngenen Milzzellen wurden CTL-Linien erzeugt und durch wöchentliche Restimulierung von 10⁶ CTL/Napf mit 2 × 10⁵ peptidgepulsten bestrahlten (10.000 rad) C1R.AAD-Zellen und 4 × 10⁶ C57/B16-bestrahlten (3.000 rad) Milzzellen als Feeder-Zellen erhalten.
Cytotoxizitätstest
Die CTL-Aktivität wurde gemessen unter Verwendung eines 4-Stunden-Tests mit ⁵¹Cr-markierten Zielzellen. Die Zielzellen (10⁶) wurden in 100 μl CTM mit oder ohne 10 μM Peptid und 150 μCi ⁵¹Cr 2 Stunden lang gepulst, dreimal gewaschen und Platten zugegeben, die verschiedene Mengen an CTL-(Effektor)-Zellen enthielten in einem Endvolumen von 200 μl CTM. In Peptidtitrierungstests wurden Zielzellen mit ⁵¹Cr 2 Stunden lang gepulst, dreimal gewaschen und Platten zugefügt mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen. Die Effektorzellen wurden 2 Stunden später zugegeben und die Überstände wurden geerntet und nach weiteren 4 Stunden Inkubation gezählt. Der Prozentanteil der spezifischen ⁵¹Cr-Freisetzung wurde berechnet als: 100 × (Versuchsfreisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung). Die spontane Freisetzung wurde bei Zielzellen bestimmt, die ohne Effektorzellen inkubiert worden waren und die maximale Freisetzung wurde bestimmt in Gegenwart von 5% Triton X-100. C1R.A2.1 und C1R.AAD-Linien und AAD und A2Kb-Con-A-Blasts wurden als Zielzellen verwendet. Con-A-Blasts wurden hergestellt, indem 3 × 10⁶ Milzzellen in 2 ml CTM in Gegenwart von 2 μg/ml Con A in 24-Napf-Kulturplatten gezüchtet wurden. Nach 2 Tagen wurden die Zellen geerntet und zur Markierung wie beschrieben prozessiert.
C7A2-Ala-substituierte Peptide, die an HLA-A2.1-Moleküle binden
Die Bindungsaffinität des Wildtyp-C7A2-Peptids (C7A2-WT) wurde ausgewertet in einem T2-Bindungstest (53), der die Zelloberflächenstabilisierung von HLA-A2.1-Molekülen nach Inkubation mit dem Peptid misst. Um die unterschiedlichen Peptide zu vergleichen, wurde ein Fluoreszenzindexwert von 0,5 (FI_0,5), d.h. die Peptidkonzentration, die die HLA-A2.1-Expression um 50% erhöht, ausgewählt als Weg, um Titrationen der Peptide und die relative Affinität für MHC-Moleküle zu vergleichen. Unter Verwendung dieser Methode wurde für C7A2-WT eine FI_0,5 von 10 μM berechnet.
In einer ersten Reihe von Versuchen zur Definition der funktionellen Schlüsselreste wurden Peptide mit Alaninsubstitutionen an jeder der Positionen synthetisiert und in Bindungstests getestet (Tabelle I). C7A2-WT hat das typische Motiv zur Bindung an HLA-A2.1 mit L und V an den Positionen 2 bzw. 9 (22, 23). Bindungsversuche mit diesen alaninsubstituierten Peptiden zeigten (1A), dass Peptid 2A seine Bindungsfähigkeit verloren hatte entsprechend der Ankereigenschaft dieser Position und auch 9A die Bindung gestört hatte, wenn auch nicht so viel wie 2A, da Ala als schwacher Anker an Position 9 wirken kann. Andere Substitutionen, die die Bindung verringerten, waren 6A und 7A, was auf die Bedeutung dieser Reste als sekundäre Ankerpositionen deutet. Die Peptide 4A und 8A hatten eine höhere Affinität mit einer FI_0,5 von etwa 2 μM. Substitutionen an den Positionen 1, 3 und 5 hatten keine Wirkung auf die Peptidbindung.
Bindung von Peptiden mit Substitutionen an Position 1
C7A2-WT hat Asparaginsäure, einen negativ geladenen Rest, an Position 1 (28). Die Substitution durch Ala an dieser Position verbesserte die Bindung nicht, obwohl sie den geladenen Rest ersetzte, so dass das Original D durch andere Reste ersetzt wurde. Peptide mit aromatischen Aminosäuren an dieser Position (F und H), ebenso wie N (bei dem die negative Ladung entfernt ist, aber die Größe bewahrt bleibt) oder S und T, kleine polare Aminosäuren, die Wasserstoffbindungen bilden können, wurden synthetisiert.
Die Peptide 1N, 1H und 1T hatten eine verbesserte Bindungsaffinität, wohingegen 1F eine FI_0,5 hatte, die größer war als die von C7A2-WT, was auf eine geringere Affinität hindeutet. Löslichkeitsprobleme mit 1F könnten der Grund für die verschlechterte Bindungsfähigkeit in diesem Fall sein.
Bindung von Peptiden mit Substitutionen an anderen Positionen
Die Substitution durch A an Position 7 lieferte ein Peptid mit gestörter Bindungsfähigkeit. Die natürliche Aminosäure an dieser Position ist P, von dem bekannt ist, dass es zu Schleifen in den Peptidketten führt. Um zu bestimmen, ob der Ersatz durch A die Struktur der Peptidkette veränderte oder die Seitenkette eliminierte, die für die Wechselwirkung mit HLA-A2.1 verantwortlich ist, wurde 7G synthetisiert, bei dem eine Aminosäure eingeführt wurde, die auch zu β-Schleifen beiträgt, wie es P tut, dem aber die Seitenkette fehlt. 7V wurde auch synthetisiert mit einer aliphatischen Seitenkette, die sperriger ist als A. Keines dieser Peptide band an HLA-A2.1 (1B), was die spezifische Rolle der P-Seitenkette für die Bindung an HLA-A2.1 zeigt.
Position 3 wurde durch W ersetzt und durch K, L, I und V, die geladen sind und aliphatische Reste sind. Die Bindung wurde mit 3W verbessert (1B), ging aber vollständig verloren bei 3K. Peptid 3V hatte eine gestörte Bindung, wohingegen 3L und 3I gleich waren wie C7A2-WT.
Der Ersatz der Position 8L durch V führte einen aliphatischen Rest ein, wie A und L (Aminosäure, die in C7A2-WT vorhanden ist), aber mit einer Größe, die zwischen beiden liegt. Peptid 8V ist eine der wenigen Sequenzvariationen, die innerhalb dieses Epitops gefunden werden können und ist Virenisolaten gemeinsam, die zu den HCV-Genotypen 2a und 2b gehören (56, 57). Peptid 8V hatte eine FI_0,5 von 15 μM, was im Bereich von C7A2-WT lag.
Erkennung von bezüglich C7A2-variierenden Peptiden durch Human-CTL
Um Reste zu identifizieren, die an der CTL-Erkennung beteiligt sind, wurde eine CTL-Linie etabliert, die spezifisch für C7A2 war, wie hier für PBMC aus einem mit HCV infizierten Patienten nach mehreren Runden der C7A2-WT-Peptidstimulierung beschrieben. Die lytische Aktivität dieser CTL wurde mit Zielzellen getestet, die mit verschiedenen Konzentrationen jedes Peptids inkubiert wurden, um die Erkennung der verschiedenen Peptidvarianten zu untersuchen und die T-Zellavidität zu titrieren. Die Ala-substituierten Peptide 2A und 9A wurden nicht erkannt (2A), entsprechend der Ankereigenschaft dieser Positionen. Auch 3A wurde nicht erkannt, trotz einer guten HLA-A2.1-Bindung, was auf den Epitopcharakter dieser Position hindeutet. Die Peptide 4A, 5A, 6A und 7A zeigten, obwohl sie in höchsten Konzentrationen erkannt wurden, eine schlechtere Erkennung als C7A2-WT, in einigen Fallen als Konsequenz einer schlechteren MHC-Bindung (6A und 7A) oder einer in anderer Weise gestörten T-Zellerkennung (4A und 5A). Die Peptide 1A und 8A zeigten einen höheren Lysegrad als C7A2-WT und titrierten mit zehnfach geringeren Konzentrationen.
Von den Nicht-Ala-substituierten Peptiden (2B) wurde keines von den CTL in den getesteten Konzentrationen erkannt (einschließlich solcher mit hoher Bindungsaffinität, wie 1N oder 1T) mit Ausnahme von 8V, was sich ähnlich wie C7A2-WT verhielt, und 1H, das eine marginale Lyse bei der höchsten getesteten Konzentration induzierte.
Erkennung von variierenden C7A2-Peptiden durch CTL von HLA-A2.1-transgenen Mäusen
AAD-transgene Mäuse exprimieren α1- und α2-Domänen aus dem Human-HLA-A2.1-Molekül und die α3-Domäne aus dem Maus-D^d-Molekül (48). Transgene Mäuse, die Human-HLA-A2.1-Moleküle exprimieren, wurden als Modell der Präsentation und Erkennung verschiedener HLA-A2.1-beschränkter Antigene beschrieben (9, 37, 47, 58-60) und lassen ein Testen der Immunogenizität im Zusammenhang mit einem menschlichen HLA-Molekül vor der Immunisierung von Menschen zu. Um die Peptidantigene in diesem Modell zu verwenden, wurde die Erkennung verschiedener C7A2-Peptidvarianten durch Maus-CTL in vitro vor dem Testen der Immunogenizität der verschiedenen Peptide in vivo untersucht.
Die CTL-Linien AAD.10 und AAD.1 wurden induziert durch Immunisierung mit dem Peptid C7A2-WT zusammen mit einem Helferepitop, das von H-2^b-Klasse-II-MHC-Molekülen dieses Mausstamms präsentiert wird, und mit GM-CSF und IL-12 gemäß der Methode von Ahlers et al. (54), wie hier beschrieben. Nach 10 bis 12 in-vitro-Stimulierungen mit C7A2-WT wurden diese Zelllinien gegen die gesamte Reihe von C7A2-substituierten Peptiden in einem Lysetest getestet, um die Erkennung der verschiedenen Peptide mit der durch die Human-CTL-Linie zu vergleichen.
Von den Ala-substituierten Peptiden (3A und 3C) konnten 1A und 8A Zielzellen in einem Konzentrationsbereich sensibilisieren, etwa wie C7A2-WT, wobei 1A wirksamer war als 8A für beide Linien. Die anderen Peptide titrierten mit Konzentrationen, die um das mehrfach Zehnfache höher waren. Peptide 5A, 7A und 2A erforderten die höchsten Konzentrationen, um eine signifikante Lyse zu induzieren, wohingegen 3A, 6A, 4A und 9A mit mittleren Konzentrationen titrierten. Es konnte deutlich gezeigt werden, dass Position 5 ein Epitoprest war und fast keine signifikante Lyse wurde mit Zielzellen erhalten, die mit Peptid 5A sensibilisiert worden waren, wie es für Position 3 in der Human-CTL-Linie beobachtet worden war. Peptid 3A titrierte in geringer Konzentration, was darauf hindeutet, dass im Fall der Maus-HLA-A2.1-beschränkten CTL-Linie in Position 3 an der TCR-Bindung nicht beteiligt ist so eindeutig wie bei der Humanlinie. Schließlich wurden Peptide mit Substitutionen an Positionen 4 und 6 erkannt wie im Fall der Human-CTL-Linie.
Peptide mit Substitutionen durch andere Aminosäuren und positiver Bindung an HLA-A2.1 wurden auch getestet auf die Erkennung durch AAD-Maus-CTL-Linien (3B und 3D). Diese Peptide enthielten hauptsächlich Substitutionen an Position 1 außer die Peptide 8V und 3W. Überraschenderweise wurden mit Ausnahme von 1S, das eine höhere Peptidkonzentration erforderte, um Zielzellen zu sensibilisieren, alle Peptide mit Substitutionen an Position 1 durch AAD-Maus-CTL-Linien erkannt in einem Konzentrationsbereich, der ähnlich war dem, der für C7A2-WT beobachtet wurde und einige Peptide, wie 1F, induzierten eine stärkere Antwort bei der Linie AAD.10. Peptid 8V wurde in höheren Konzentrationen erkannt als es für C7A2-WT bestimmt wurde, wohingegen Peptid 3W bei keiner der getesteten Konzentrationen erkannt wurde.
In-vivo-Immunogenizität von von C7A2-abgeleiteten Peptiden in HLA-A2.1-transgenen Mäusen
Nach Untersuchung der Erkennung von von C7A2 abgeleiteten Peptiden durch transgene Human- und AAD-Maus-CTL wurde die in-vivo-Immunogenizität dieser Peptide in dem transgenen AAD-Mausmodell unter sucht. Verschiedene Gruppen von Tieren wurden mit den substituierten CTL-Peptiden (Epitopen) zusammen mit einem Helferepitop und Cytokinen, wie oben beschrieben, immunisiert und die Fähigkeit, eine Immunantwort zu induzieren, wurde in CTL-Cytotoxizitätstests getestet. In diesen Tests enthalten waren einige der Peptide mit positiver Bindung, die von AAD-Maus-CTL-Linien erkannt wurden. Wie in 4 gezeigt, konnten die Peptide C7A2-WT und 8A eindeutige CTL-Antworten induzieren, wohingegen 1A nur eine marginale Antwort induzieren konnte. Im Gegensatz dazu konnten die Peptide 1N und 1F keine messbare CTL-Antwort induzieren.
Induktion der CTL-Immunantwort gegen C7A2-WT durch C7A2-WT- und 8A-Peptide in transgenen HLA-A2.1-Mäusen
Von den in Bindungstests mit HLA-A2.1 und zur Erkennung durch humane und transgene Maus-CTL getesteten Peptiden war Peptid 8A am Vielversprechendsten. Dieses Peptid konnte bei geringeren Konzentrationen als C7A2-WT binden, sensibilisierte menschliche und Mauszielzellen im gleichen Bereich oder sogar bei geringeren Konzentrationen wie C7A2-WT, und in Immunisierungsversuchen induzierte es einen höheren Lysegrad. Daher wurde die Fähigkeit von 8A, eine CTL-Immunantwort gegen C7A2-WT zu induzieren, in der nächsten Versuchsreihe getestet.
Jedes Peptid wurde verwendet, um zwei Gruppen von Tieren zu immunisieren, mit 50 oder 15 nmol CTL-Epitoppeptid, wie hier beschrieben. Nach zwei Immunisierungen wurden Milzzellen entnommen und in vitro mit dem gleichen Peptid, das für die Immunisierung verwendet wurde, stimuliert und die lytische Aktivität gegenüber C7A2-WT (und 8A bei den mit 8A immunisierten Gruppen) wurde getestet. Wie in 5 gezeigt, konnten zwei der vier Tiere, die mit C7A2-WT immunisiert worden waren, auf dieses Peptid ansprechen. Bei den mit 8A immunisierten Tieren konnten starke Antworten auf C7A2-WT nachgewiesen werden zusammen mit positiven Antworten gegen 8A selbst, sogar in der Gruppe von Mäusen, die mit 15 nmol Peptid immunisiert worden war (5B).
In einer zweiten Gruppe von Versuchen wurden A2Kb-transgene Mäuse, die ein chimäres HLA-Molekül mit α1- und α2-Domänen von Human-HLA-A2.1 und der α3-Domäne aus Maus-K^b exprimieren, mit 50 nmol C7A2-WT oder 8A-Peptid immunisiert und die Fähigkeit dieser Peptide, eine CTL-Immunantwort zu induzieren, die C7A2-WT erkennt, wurde getestet. 6 zeigt, dass wie bei den AAD-Mäusen zu erkennen, C7A2-WT eine geringe Antwort induzierte, wohingegen die Immunisierung mit 8A ein höheres Maß an Reaktion durch CTL, die sowohl C7A2-WT als auch 8A erkannten, induzierte, sogar mit einem geringeren E/T-Verhältnis im CTL-Test (70:1 gegenüber 120:1).
Es wurde gezeigt, dass die CTL-Avidität für einen Zielpeptid-MHC-Komplex, definiert als Empfindlichkeit zum Nachweis geringer Dichten an Peptid-MHC-Komplex auf der Oberfläche von Ziel- oder Stimulatorzellen, einen wesentlichen Unterschied in der Fähigkeit der CTL ausmacht, eine Virusinfektion in vivo abzuklären, in beiden Mausmodellsystemen (61, 62). Um daher zu bestimmen, ob die CTL, die gegen das modifizierte Peptid 8A erzeugt worden waren, eine hohe Avidität gegenüber Zielen hatten, die das Wildtyppeptid präsentieren, wie es CTL würden, die gegen das Wildtyppeptid selbst gezüchtet worden waren, wurde C7A2-WT mit Zielzellen titriert und die (Lyse)-Abtötung durch kurzzeitige CTL-Linien (die 3 bis 4 Zyklen in-vitro-Stimulierung mit Peptid erhielten), die gegen dieses Peptid oder gegen 8A gezüchtet worden waren, wurden verglichen (7). Die gegen 8A gezüchteten CTL töteten Ziele, die C7A2-WT exprimierten, in Konzentrationen ab, die mehr als 100-fach geringer waren als die, die erforderlich waren, um vergleichbare Abtötungsgrade durch CTL zu erhalten, die gegen C7A2-WT selbst gezüchtet worden waren. Somit erhöht die Verwendung des modifizierten Peptids in diesem Fall nicht nur die Immunogenizität, sondern auch die Avidität der CTL, die erzeugt wurden, als zusätzlicher Vorteil für die potenzielle Wirksamkeit eines Impfstoffs.
Erkennung von Peptid 8V durch CTL aus transgenen HLA-A2.1-Mäusen, die mit 8A immunisiert worden sind
Wie oben erwähnt, ist eines der Peptide, die sowohl von Human- als auch Maus-C7A2-WT-spezifischen CTL-Linien erkannt werden, Peptid 8V. Dieses Peptid ist Virenisolaten aus den HCV-Genotypen 2a und 2b gemeinsam (56, 57). Da 8A eine Veränderung an der gleichen Position hat, war es ein interessanter Punkt zu wissen, ob CTL, die durch Immunisierung mit 8A induziert worden waren, kreuzreaktiv nicht nur mit C7A2-WT waren, was viralen Sequenzen aus den Genotypen 1a, 1b und 3a entspricht, sondern auch mit Peptid 8V, das zu Virensequenzen aus Genotyp 2 gehört. Die Ergebnisse in den 8A und 8B zeigen, dass CTL, die durch Immunisierung mit 8A induziert worden sind, Peptid 8V sowohl bei AAD-Mäusen (8A) als auch A2Kb-Mäusen (8B) auf gleiche Weise erkennen wie die Erkennung von C7A2-WT.
Verbessertes Epitop C7A2-8A in einem DNA-Impfstoff gegen HCV
Um einen DNA-Impfstoff zu erzeugen, der das verbesserte Epitop dieser Erfindung codiert, wurde zuerst ein DNA-Plasmid-Impfstoff, der HCV-Core-Protein exprimiert, hergestellt. Der Vektor AC7, der die gesamte Nucleocapsid-(Core)-Region von HCV-H-(1a)-Stamm (91) (Aminosäuren 1-191) codiert, wurde konstruiert. Die Sequenz wurde mit Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und in die Hind-III- und Bam-HI-Stellen des eukaryotischen Expressionsvektors pWRG7020 unter der Transkriptionskontrolle des frühen Cytomegalovirus-Promotors insertiert (Agracetus Inc., Middleton, WI). Die direkte Sequenzierung der insertierten DNA unter Verwendung der Fluorescent Dye Terminator Cycle Methode an einem Sequenzautomaten ABI 310 (Applied Biosystems, Forester City, CA) zeigte die erwartete Sequenz im Leserahmen. Plasmid AC7 wurde in Escherichia coli amplifiziert unter Verwendung des Quiagen-Reinigungskits (Quiagen Inc., Chatsworth, CA) gereinigt und bis zur Verwendung auf -20°C gehalten.
Eine vorübergehende Expression von HCV-Core-Protein in Zellkultur wurde für Human-293-Zellen bestätigt, wie vorher beschrieben (92). Kurz gesagt wurde das Plasmid in 293-Zellen transfiziert unter Verwendung von Lipofectamin (GIBCO/BRL) und die Proteinexpression wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung und durch Immunblotting unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Hausantikörpers, der HCV-Core erkennt (6G7; Stanford University, Palo Alto VA Medical Center, Palo Alto, CA; Ref 93) analysiert. Zur Immunisierung wurde AC7 mit 3 M Natriumacetat und Ethanol ausgefällt und wieder in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgelöst.
Eine Variante dieses Plasmids wurde dann konstruiert mit der Substitution eines Ala-Codons für ein Leu-Codon an der Aminosäurerestposition 8 des Epitops C7A2. Das Codon mit den Nucleotiden 756 bis 758 in dem Kern der HCV-Genomregion wurde verändert von CTC (Leu) zu GCG (Ala) durch PCR-Amplifikation. Vorwärts-(8AF: TCATGGGGTACATACCGGCGGTC nt. 739 bis 761) (SEQ ID Nr. 5) und Rückwärts-(8AR: TCCAAGAGGGGCGCCGACCGCCG nt. 776 bis 754) (SEQ ID Nr. 6) Primer wurden synthetisiert, die die 8A-Sequenz an diesem Ort enthielten. Zwei überlappende PCR-Produkte wurden erzeugt unter Verwendung der Primer 243F (AAGACTGCTAGCCGAGTAGTG nt. 243 bis 263) (SEQ ID Nr. 7) und 8AR oder 8AF und 980R (CACAATACTCGAGTTAGGGC nt. 980 bis 961) (SEQ ID Nr. 8). Nach Gelisolierung der PCR-Produkte wurde eine Assembly-PCR durchgeführt unter Verwendung von 100 ng jedes der Fragmente und Primer, um die Core-Sequenz voller Länge mit Hind-III- und Not-I-Restriktionsstellen, die am 5'- bzw. 3'-Ende gentechnisch eingeführt worden waren, zu erzeugen. Dieses Produkt wurde in den Vektor WRG7020 kloniert und die Sequenz mit der Fluorescent Dye Terminator Cycle Methode, wie oben beschrieben, verifiziert.
AAD-Mäuse, die transgen für das Human-HLA-Molekül HLA-A2.1 mit der α3-Domäne von H-2D^d waren, wurden i.m. in den Quadrizeps major an den Tagen 0, 14 und 28 mit 100-, 30- oder 10-μg-Dosen von AC7 oder AC7-8A oder 100 μg pWRG7020 (Plasmid ohne das HCV-Core-Geninsert, als Kontrollblindimpfstoff) gelöst in PBS-Lösung immunisiert. 4 Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Milzzellen aus mit AC7 immunisierten Mäusen in vitro mit C7A2-Peptid stimuliert und solche aus AC7-8A-immunisierten Mäusen wurden in vitro mit C7A2-8A-Peptid stimuliert und alle wurden auf CTL-Aktivität gegen C1R-AAD-Ziele, die mit C7A2-Peptid beschichtet waren, getestet. Die C1R-AAD-Zellen exprimieren nur das chimäre HLA-A2.1-Klasse-I-Molekül und keine Klasse-II-MHC-Moleküle, so dass die CTL-Aktivität auf Klasse-I-HLA-A2.1 beschränkt war. Wie in 9 gezeigt, hatten bei der 30-μg-Dosis alle drei Mäuse, die mit dem AC7-8A-DNA-Impfstoff immunisiert worden waren, eine wesentlich höhere CTL-Aktivität als die drei Mäuse, die mit dem unmodifizierten AC7-DNA-Impfstoff immunisiert worden waren. Die gleiche Wirkung war bei den 100- und 10-μg-Dosen zu sehen, aber die Größenordnung des Unterschieds war geringer.
Um die Wirksamkeit zur Bekämpfung einer Vireninfektion zu testen, wurden AAD-Mäuse, die transgen für das Human-HLA-A2.1-Molekül waren mit der α3-Domäne von H-2D^d, die mit Maus-CD8 kompatibel ist, mit einem rekombinanten Vacciniavirus infiziert, der das gesamte HCV-Core-Protein exprimierte. Dieses Core-Proteingen enthielt nicht die 8A-Modifikation, sondern war stattdessen repräsentativ für Wildtyp-HCV. Vacciniavirus repliziert bevorzugt in den Eierstöcken und der Titer an Vaccinia in den Eierstöcken (pfu/Eierstock) wurde verwendet als Maß der Fähigkeit des Impfstoffs, das Ausmaß der Vireninfektion zu reduzieren. Die Mäuse wurden an den Tagen 0, 14 und 28, wie oben, immunisiert und 2 Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse intraperitoneal mit 1 × 10⁷ pfu von rVV-Core (rekombinanter Vacciniavirus, der HCV-Core exprimiert) beaufschlagt. Die Mäuse wurden zur Entnahme der Eierstöcke 5 Tage nach der Beaufschlagung getötet. Einige Mäuse wurden 7, 6, 5 und 4 Tage vor der Tötung mit 0,5 mg Anti-CD8-Antikörper intraperitoneal behandelt, um die Abhängigkeit des Schutzes von CD8⁺-Zellen zu bestimmen. Die Eierstöcke (wo dieses Vacciniavirus bevorzugt repliziert; 61, 95) wurden entnommen, homogenisiert, beschallt und der rVV-Core-Titer getestet, indem 10-fach-Verdünnungen auf BSC-1-Indikatorzellen ausplattiert wurden und mit 0,075 G/V-% Kristallviolett angefärbt wurden. Die minimal nachweisbare Menge an Virus war 100 pfu/Eierstock. Drei Mäuse wurden pro Gruppe verwendet.
Wie in Tabelle I gezeigt, reduzierte bei der optimalen Dosis von 30 μg Impfstoff AC7 unmodifizierter Core-Impfstoff den Titer nicht ganz um 5 log im Vergleich zu Kontrollmäusen, die mit Blindimpfstoff immunisiert worden waren (Mäuse #1 bis 3, mit Titer von 3 bis 4 × 10³, im Vergleich zu Mäusen #13 bis 15, mit Titer von 1,6 bis 2,8 × 10⁸). Die Mäuse #7 bis 9, die mit dem modifizierten DNA-Impfstoff AC7-8A immunisiert worden waren, hatten jedoch Titer, die auf nicht nachweisbare Pegel reduziert waren. Bei beiden DNA-Impfstoffen ging durch die Behandlung der Mäuse mit Anti-CD8-Antikörper der Schutz vollständig verloren (Mäuse #4 bis 6 und #10 bis 12), was darauf hindeutet, dass der Schutz vollständig abhängig ist von CD8⁺-Zellen (CTL). Somit ist der modifizierte HCV-Core-DNA-Impfstoff mit dem 8A-modifizierten Epitop viel wirksamer als der Wildtyp-HCV-Core-DNA-Impfstoff bei der Induzierung von CD8⁺-CTL, beschränkt auf das menschliche HLA-A2-Molekül, und bei der Induktion eines CD8⁺-Schutzes gegen einen Surrogatvirus, der das HCV-Core-Protein exprimiert.
Obwohl das vorliegende Verfahren beschrieben wurde unter Bezugnahme auf spezifische Details bestimmter Ausführungsformen ist nicht vorgesehen, dass diese Details als Beschränkungen des Schutzbereichs der Erfindung anzusehen sind, außer insoweit und in dem Ausmaß, wie sie in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind.
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Tabelle I
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptid mit einer L→A-Substitution an Aminosäureposition 139.
Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.
Fragment eines Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptids mit weniger Aminosäuren als das vollständige Heptatitis-C-Virus-Core-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 enthält.
Isolierte Nucleinsäure, die das Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Vektor enthaltend die Nucleinsäure von Anspruch 5.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids des Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptids mit verbesserter Immunogenizität, das umfasst, dass: a) eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3) ersetzt werden und b) eine verbesserte Immunogenizität des substituierten Peptids im Vergleich zur Immunogenizität eines Kontrollpeptids mit der Aminosäuresequenz DLMGYIPLV (SEQ ID Nr. 3) nachgewiesen wird, wobei ein substituiertes Peptid mit größerer Immunogenizität als das Kontrollpeptid ein Peptid des Hepatitis-C-Virus-Core-Polypeptids mit verbesserter Immunogenizität ist.
Verwendung des Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Erzeugung einer Immunantwort in einer Immunzelle eines Individuums.
Verwendung der Nucleinsäure von Anspruch 5 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Erzeugung einer Immunantwort in einer Immunzelle eines Individuums.
Verfahren zur Aktivierung eines cytotoxischen T-Lymphozyten ex vivo, wobei der Lymphozyt ex vivo mit einem Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Gegenwart eines Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküls in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zur Aktivierung eines cytotoxischen T-Lymphozyten ex vivo, wobei der Lymphozyt ex vivo mit einer Klasse-I-MHC exprimierenden Zelle in Kontakt gebracht wird, an die ein Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 gebunden ist.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose einer Hepatitis-C-Virusinfektion, bei dem a) cytotoxische T-Lymphozyten eines Individuums mit dem Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Gegenwart eines Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküls unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen eine Zytolyse von Zielzellen auftreten kann und b) die Zytolyse von Zielzellen nachgewiesen wird, wobei die Zytolyse von Zielzellen eine Diagnose der Hepatitis-C-Virusinfektion liefert.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose einer Hepatitis-C-Virusinfektion, bei dem a) cytotoxische T-Lymphozyten eines Individuums mit dem Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Gegenwart eines Klasse-I-Haupthistokompatibilitäts komplexmoleküls unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen die Cytokinproduktion in den Lymphozyten auftreten kann und b) die Cytokinproduktion in den Lymphozyten nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Cytokinproduktion in den Lymphozyten eine Diagnose der Hepatitis-C-Virusinfektion liefert.
Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten in einem Individuum, das dies benötigt.
Verwendung einer Klasse-I-MHC exprimierenden Zelle, an die ein Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 gebunden ist, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten bei einem Individuum, das dies benötigt.