KR100388131B1

KR100388131B1 - 항바이러스 활성을 보이는 클론 ｃｄ8 세포주 및 이들을분리하는 방법

Info

Publication number: KR100388131B1
Application number: KR10-2001-7006623A
Authority: KR
Inventors: 다니피. 보로게네시; 친-호 첸; 마이클엘. 그렌베르그; 켄트 바인홀트
Original assignee: 듀크 유니버시티
Priority date: 1993-03-29
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 2003-06-25
Also published as: JPH08509120A; CA2159595A1; KR100358213B1; KR960701216A; US5627023A; NZ265177A; AU6553794A; AU687050B2; EP0692032A1; EP0692032A4; WO1994023058A1

Abstract

본 발명은 항바이러스 활성을 보이는 클론 CD8 세포주 및 이들 분리하는 방법에 관한다. 여기에서, 클론 세포주는 CD8 억제물질분자를 클론하는데 사용한다.

Description

항바이러스 활성을 보이는 클론 ＣＤ8 세포주 및 이들을 분리하는 방법{CLONAL CD8 CELL LINES WITH ANTIVIRAL ACTIVITY AND THE METHOD ISOLATING THEM}

1. 개요

본 발명은 생활성분자(여기에서, CD8 억제물질분자)에 관계하는데, 이는 사람 T 임파세포 아종에 의해 생산되고 바이러스 전사의 저해없이 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 복제를 억제한다. 본 발명은 항바이러스 활성을 생산하는 클론성 CD8 세포주의 분리에 관계한다. 여기에서 상술한 클론성 세포주는 CD8 억제물질분자를 정제, 특징화, 클론하는데 이용할 수 있다. CD8 억제물질분자는 HIV 감염과 관계된 질병의 치료를 위한 요법에 응용할 수도 있다.

2. 발명의 배경

타입-1 사람 면역결핍 바이러스(HIV-1)는 AIDS라 칭하는 면역시스템의 서행 퇴행성 질환의 주요원인이 된다(Barre-Sinoussi, F. et al., 1983 Science 220:868-70; Gallo, R. et al. 1984, Science 224:500-3). T-임파세포의 CD+4 아종의 HIV-1 바이러스 감염은 선택성 감염, 신경성 질환, 신조직 형성과 죽음을 유도하는 필수적인 임파세포 아종의 결핍을 유도한다. HIV-1 감염과 HIV-1 관련된 질병은 중요한 건강상 문제를 나타내고 현재 효과적인 치료를 위해서는 상당히 주의를 요한다.

HIV-1은 레트로바이러스의 렌티바이러스족이다(Teich, N. et al., 1984 In RNA Tumor Viruses ed. R. Weiss, N. Teich, H. Varmus, J. Coffin CSH Press, pp. 949-56). HIV-1의 라이프사이클은 바이러스의 활성복제를 따르는 프로바이러스 휴면주기를 특징으로 한다. 감염성 HIV-1 바이러스에 대한 주요세포표적은 사람 T-임파세포의 CD4 아종이다. 세포의 CD4 아종에 대한 바이러스의 표적은 CD4 세포표면 단백질이 HIV-1 바이러스에 대한 세포 수용체로써 작용하기 때문이다(Dalgleish, A. et al., 2984, Nature 312:763-67; Klatzmann et al. 1984, Nature 312:767-68; Maddon et al. 1986 Cell 47:333-48).

세포표면에 결합후에 HIV-1 비리온은 내화되고, 세포내에서 바이러스 라이프사이클은 RNA 게놈의 직선 DNA 분자로의 전환에 의해 개시된다. 이 과정은 바이러스 인코드된 역전사효소의 작용에 따라 달라진다. 바이러스 게놈복제후에 DNA 분자는 바이러스 인테그라제 단백질의 작용을 통하여 숙주게놈으로 통합되어 HIV-1 프로비루스형이 만들어진다.

프로비루스 발현의 초기상동안에 바이러스 게놈의 전사는 Tat, Nef, Rev와 같은 규칙적인 단백질의 발현을 유도한다. 프로바이러스 DNA의 전사활성은 비루스 5'LTR 서열을 통하여 중개된다. 바이러스 전사의 초기 낮은 수준은 HIV 인코드된단백질 tat에 의해 급격히 증가된다(Cullen, B.R. et al. 1989, Cell 58:423-26). Rev 단백질은 조절단백질의 초기발현에서 구조단백질의 후기발현으로의 전이를 촉진한다. 새로 합성된 단백질의 합체는 세포막에서 바이러스 입자의 버딩에 의해 이루어지고, 이는 새로운 세포로 바이러스가 감염되게 한다.

HIV-1 바이러스는 장시간동안 감염 휴면기를 유지할 수 있다. HIV 감염된 개체는 상당기간 임상적으로 건강하게 되고, 주요 HIV 감염과 AIDS로의 진행 및 바이러스 복제증가되는 무증후기간은 약 8 내지 10년이다. 이와 같은 휴면기 동안에 낮은 수준의 바이러스 복제를 유지할 수 있는 것은 몇가지 가능성으로 설명된다. 일반적으로 HIV-1에 대한 체내 면역반응이 질병의 진전에 대해 충분히 보호적이지 않고, 따라서 T-임파세포 집단이 직접적으로 HIV-1 복제를 저해할 가능성이 높다는 것에 주의해야한다.

최근에, 상당한 집단에서 T-임파세포 CD+8 아종이 시험관내에서 HIV-1 복제를 저해시킬 능력을 가지는 것을 볼 수 있다(Walker, C.M. et al., 1989, Cellular Immunology 119:470-475; Kannagi, M. et al. 1990. J. Virology 64:3399-3406; Walker, C.M. et al., 1991 J. Virology 65: 5921-5927). 가령, 자연적 HIV-1 감염된 CD4 세포배양물에 CD8 세포의 첨가는 약량의존방식으로 감염된 배양물에서 HIV-1 복제를 저해시킬 수 있음을 볼 수 있다. 또한, 저해효과는 반투막을 통해 나타나므로 세포-세포접촉성이 아니며, 이는 CD8 억제활성이 HIV-1 복제 가용성 저해물질임을 나타내는 것이다(Ref. supra). 아직까지 CD8 억제물질분자의 분자확인 또는 인자의 복합 또는 항바이러스 효과를 나타내는 기작은 정의되지 못하고 있다.

3. 발명의 요약

본 발명은 T-임파세포의 DC8 아종에 의해 분비되는 가용성 분자와 HIV 바이러스 증식을 상당히 저해시킬 수 있는 상기 분자의 능력에 관계한다. 또한 본 발명은 억제분자가 발휘하는 기작에 의해 이의 항바이러스 활성이 바이러스 LTR 프로모터에서 바이러스 유전자 발현의 저해 수준인 지를 관찰하는 것이다.

주요 구체예에서, 본 발명은 HIV 저해활성을 감지하는데 사용되는 검사시스템에 관계하는데, 여기서 HIV LTR 서열이 CAT 유전자와 같은 보고 유전자(reporter gene)에 인접하게 클론된다. 이와 같은 검사시스템에서 억제물질분자의 존재는 보고유전자 생성물의 수준을 측정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명은 소요의 항바이러스 활성을 생산하는 CD+8 세포클론의 특징과 분리에 관계한다. 이와 같은 세포클론은 억제물질분자의 클로닝에 사용될 수 있는 cDNA 라이브러리의 구조를 위한 mRNA 공급원 및/또는 억제물질분자의 특징화와 대량분리에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 HIV-감염 치료에서 이와 같은 억제물질분자의 이용에 관계한다.

제 1도는 HIV-1 혈청 양성 개체로부터의 CD8 세포가 바이러스 생산을 억제하는 것을 보여준다.

제 2도는 HIV-1 LTR 전사검사에 사용된 플라스미드 구조체를 보여준다.

제 3도는 HIV-1에 감염된 개체로부터의 CD8 세포가 HIV-1 LTR 전사를 억제한다는 것을 보여준다. 데이터는 자기유래 CD4 세포를 포함하는 동일 전이감염체에서 유도한 배양물에서 측정한 활성과 비교하여, 자기유래 CD8 세포를 포함하는 배양물에서의 CAT 활성을 보여준다.

제 4도는 CD8 세포가 타유래 CD4 세포에서 Tat-중개된 전사를 억제한다는 것을 보여준다. 데이터는 자기유래 CD4 세포를 포함하는 동일한 감염체에서 유도된 배양물에서 측정한 활성과 비교하여, 자기유래 또는 타유래 CD8 세포를 포함하는 배양물에서의 CAT활성을 보여준다.

제 5도는 CD8 세포로부터의 가용성인자가 Tat-중개된 전사를 억제한다는 것을 보여준다. CAT 활성은 자기유래 CD4 세포를 포함하는 배양물, 자기유래 CD8 세포를 포함하는 배양물, 그리고 자기유래 CD8 세포 조건화 배지를 포함하는 배양물에서 측정한다. 개체별로 나타낸 각 데이터는 하나의 전이감염에서 유도된 것이다. CAT 활성은 전환 %로 나타내고, 각 검사는 5 ×10⁶전이감염된 CD4 세포에 기초한 것이다.

제 6도는 HIV전사 저해가 주로 CD8 세포클론에 의해 나타난다는 것을 보여준다.

5. 발명의 설명

본 발명은 HIV 바이러스 복제를 저해시킬 수 있는 T-임파세포의 CD8 아종에 의해 생산되는 단백질에 관계한다. 또한 본 발명은 항바이러스 활성의 감지를 위한 검사시스템에도 관계하는데, 이때 보고유전자는 HIV 바이러스 LTR 서열에 인접하여 클론된다. 검사시스템의 개발은 HIV LTR 프로모터 서열에 연결된 유전자의 전사를 억제물질분자가 저해하는지를 관찰하는 것에 기초한다. 또한 본 발명은 항바이러스 활성을 발현하는 클론된 CD8 세포의 분리에 관계한다. 이와 같은 세포주는 CD8 세포 억제물질분자의 클로닝 또는 CD8 억제분자의 특징화와 정제에 유익하게 사용할 수도 있다. CD8 억제물질분자는 HIV-복제를 저해시키기 위한 치료요법에 사용할 수도 있다.

5.1. CD8+ 억제물질분자는 HIV-1 바이러스 전사를 저해한다

HIV-1 복제에 CD8 세포의 효과는 면역친화성 기술에 의해 HIV-1 감염개체로부터 준비한 CD8 세포와 바이러스성 감염된 CD4+ 세포를 2:1 비율로 혼합한 실험을 실시하여 조사하였다. HIV-1 바이러스 복제 저해는 HIV-1 감염된 세포에서 역전사 효소활성의 양을 결정함으로써 측정할 수 있다. 도면 1에서 설명한 것과 같이, 바이러스 복제의 저해는 CD8 세포존재하에 실제 완벽하다.

CD8+ 억제분자가 바이러스 복제를 저해하는 기작이 바이러스 유전자 전자의 저해를 통해서 일어나는지를 테스트하는 실험을 실시하였다. 재조합 발현벡터는 CAT 리포터 유전자에 인접하여 클로닝된 HIV-1 LTR 프로모터 서열로 구성되도록 만들어졌다(도면 2). 이 구조는 바이러스 전사에 요구되는 바이러스 Tat 유전자의 생성물을 발현하는 제 2 구조와 함께 친화성 정제된 CD4+ 세포로 공전이감염시킨다. 컨트롤러는 사이토메갈로 바이러스 즉시 초기 프로모터(CMV-IE, 도면 2)에 인접하여 클론된 CAT 유전자로 구성된 구성체를 사용한다(도면 2). 도면 3에서 나타낸 것과 같이 자기 유래 CD8+ 세포존재하에 CAT 활성의 양이 감소했음을 볼 수 있는데, 이는 자기유래 CD4+ 감염된 세포에서 HIV-1 LTR과 Tat-중개된 HIV-1 LTR 전사의 저해를 나타내는 것이다. 타유래 CD8 세포를 이용한 유사실험을 실행하였다. 이들 세포를 전이감염된 CD4 세포와 혼합하였을 때 CAT 활성이 감소되었음을 볼 수 있는데(도면 4), 이는 주요조직 적합성 복합체(major histocompatability locus; MHC)에서의 적합성이 HIV-1 억제활성에서는 요구되지 않음을 나타낸다. 또한, CD8 세포배양물에서 유도된 상층액이 저해활성을 나타내는데, 이는 항바이러스 활성이 CD8+ 세포에 의해 분비된 가용성 인자임을 나타내는 것이다(도면 5).

또한, 사람과 동물기원의 다른 바이러스는 HIV에서 발견되는 것과 같은 동일한 또는 유사한 프로모터를 포함하는데, 이는 CD8 억제분자가 CMV, HIV-2, HTLV-2, HTLV-1, FeLV 등의 다른 바이러스 감염치료에도 가치가 있음을 나타낸다.

5.2. CD8+ 세포의 부분집합이 항-바이러스 활성을 발현한다

항바이러스 활성을 발현하는 CD8 세포클론의 이용성은 이와 같은 활성을 생성하는 세포의 포괄적인 표면표식 표현형을 허용한다. 이들 세포의 표현형 구별이 정립되면, 이들 세포를 정제하기 위해 개량된 면역친화성 기술을 개발할 수 있다. 이들 세포가 HIV 감염동안에 무증후증 상태를 유지하는데 역할을 한다면, 이들 표식들은 a) 감염된 개체의 임상적인 형태, b) 질병진행시에 항바이러스 요법의 효과 모니터, c) 면역학적/생물학적 반응변형자와의 요법 효과모니터, 그리고 d) 백신 반응의 모니터등에 유용할 수 있다.

이와 같은 세포주는 5.3.에서 상술하는 방법과 기술을 사용하여 억제물질분자의 정제와 특징화에 사용할 수도 있다. 세포주는 5.4.에서 상술하는 cDNA 라이브러리를 만드는 RNA 원료로도 사용될 수 있다.

여기에서 상술한 특이적 구체예에서 CD8 세포는 HIV 감염된 환자의 혈액으로부터 면역친화성 정제하고, 정제된 CD8 세포들은 제한된 희석 클로닝을 받게 된다. 생성된 CD8 주요세포클론은 tat-중개된 HIV LTR 전사를 저해시키는 능력에 대해 평가받는다. 도면 6에서는 3가지 CD8 주요세포 클론에서 관찰한 CAT 저해수준을 나타내었다. 도면에서 나타낸 것과 같이, 클론들은 다양한 정도의 전사저해를 나타낸다. 클론 2(DU. HL-1)는 클론 4(DU. HL-4)가 활성을 저해하지 않는 동안 CAT 활성의 최대 저해를 나타낸다.

5.3. CD8+ 저해분자의 정제와 특징화

CD8+ 억제물질분자는 CD8+ 세포에 의해 분비된다. 또한 항바이러스 활성을 발현하는 주요세포클론을 분리할 수 있다(5.2.). CD8+ 항바이러스 활성은 이와 같은 세포의 조건화 배지로부터 분리할 수 있고, 높은 특이활성을 가지도록 정제할 수 있다. CD8 억제물질분자의 정제는 크로마토그래피(가령 역상 액상 크로마토그래피, 겔침투, 액체교환, 이온교환, 크기분리, 친화성), 원심분리, 전기영동과정, 분별용해 또는 단백질의 정제를 위한 다른 표준기술들을 포함한 공지의 다양한 기술과 방법에 의해 이루어질 수 있는데, 여기에 나열된 방법에 국한시키지는 않는다.

임의의 단백질 정제공정 동안에, 공정의 성공은 소요 단백질의 존재를 측정하는 신뢰성있는 검사시스템의 이용성에 달려있다. 발명의 구체예에서 HIV-1 LTR 또는 Tat 의존성 HIV 전사의 저해는 CD8 억제물질분자의 지시자로써 이용된다. 가령, 재조합 발현벡터는 보고유전자에 인접하여 클론된 HIV LTR 프로모터 서열을 포함하도록 제조하고 억제활성은 보고유전자 활성을 검사함으로써 측정할 수 있다. 사용되는 보고유전자에는 클로람페니콜아세틸트란스퍼라제(CAT), 루시퍼라제 또는 사람성장 호르몬이 포함되나 이에 국한시키지 않는다. 여기에서 상술한 검사시스템에서 LTR/보고유전자 구조를 인산칼슘 공감염, DEAE-덱스크란전이감염, 에렉트로포레이션 또는 리포좀-중개된 전이감염과 같은 전이감염을 사용하여 적절한 세포주내로 공-전이감염시킬 수 있다. 전이감염된 세포는 항바이러스 활성의 존재를 테스트하는데 사용할 수도 있다. 여기에서 상술한 특이적 구체예에서, HIV-LTR 서열은 CAT 유전자에 인접하게 클론되고, 구조체는 감염된 CD4 세포내로 전이감염되고, CD8 항바이러스 활성의 존재는 CAT활성을 측정함으로써 결정할 수 있다(도면 3 과 4).

상기 전술한 단백질 정제와 검사시스템의 표준기술을 사용하여, CD8 억제물질 단백질은 균질하게 정제할 수 있다. 일단 정제되면, CD8+ 단백질은 아미노산 서열을 결정하기 위해 본 기술에 숙지된 자에 의해 익숙해진 기술을 사용하여 마이크로서열분석을 받게된다(See, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Publishing Associates and Wiley Intersciences, N.Y.). CD8 억제물질분자는 아미노 단부에서 차단되는 경우, 단백질은 정제되거나 서열화된 펩티드 단편을 생산하기 위해 화학적으로 절단되거나 또는 부분적으로 효소적 절단될 수도 있다.

정제된 CD8+ 단백질은 CD8+ 단백질의 에피토프에 대한 항체생산을 위해 이용될 수도 있다. 이와 같은 항체에는 다클론과 단클론 항체가 포함되나 이에 국한시키지 않는다. 항체 생산을 위해 다양한 숙주동물 가령, 토끼, 쥐, 새앙쥐등을 포함하나 이에 한정되지 않은 동물에 CD8+ 단백질을 주사하여 면역화시킨다. 숙주 종에 따라 면역반응을 증가시키는데 다양한 보조액이 사용될 수도 있는데, 여기에는 플루언츠(컴플리트와 인컴플리트), 알루미늄 하이드록시드와 같은 미네랄 겔, 리졸레시틴, 플로닌 폴리올, 폴리안이온, 펩티드, 오일유액, 키롤 림프 헤모시아닌, 디니트로페놀과 같은 미네랄 겔, BCG(bacilli Calmette-Guerin)와 코리네박테리움 파르붐과 같은 유용한 사람 어쥬번트등이 포함되나 이에 한정하지는 않는다.

CD8 억제물질분자에 대한 단클론 항체는 연속 세포주 배양에 의한 항체분자의 생산을 제공하는 기술을 사용하여 준비할 수도 있다. 여기에는 Kohler and Milstein, (Nature, 1975, 256:495-497에서 상술된 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마기술(Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72: Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030)과 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)이 포함되나 이에 국한시키지 않는다. 또한 적절한 생물학적 활성의 사람항체분자의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 쥐항체분자를 절단함으로써 "키메라 항체"(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)의 생산을 위해 개발된 기술들이 사용될 수 있다.

CD8 억제물질분자의 특이적 결합부위를 포함하는 항체단편은 공지기술을 사용하여 만들 수도 있다. 가령, 이와 같은 단편에는 항체분자의 펩신절단에 의해 생산된 F(ab')2 단편과 F(ab')2 단편의 이황화결합의 환원에 의해 발생되는 Fab 단편이 포함되나 이에 국한시키지 않는다.

또는 Fab 발현 라이브러리는 CD8 억제물질분자에 소요의 특이성이 있는 단클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 위해 만들어질 수도 있다(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281).

5.4. CD8+ 억제물질분자의 클로닝

본 발명은 CD8 억제물질분자의 클로닝을 위한 방법에 관계한다. 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 재조합 cDNA 라이브러리는 CD8 억제분자를 발현시키기 위해 공지의 세포에서 준비된 RNA를 이용하여 만들 수 있다. cDNA 라이브러리는 박테리오파지 벡터, 플라스미드 벡터 또는 포유류 발현벡터와 같은 다양한 벡터시스템을 사용하여 만들 수 있다(See, for example, the techniques described in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, N.Y. and Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Intersciences, N.Y.).

재조합 cDNA 라이브러리는 상이한 기술을 사용하여 스크린할 수 있다. 가령, 변성 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼합물은 CD8 억제분자 단백질의 단백질 서열화에서 유도된 정보를 이용하여 고안할 수 있다(5.3.). 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 서열에 유사한 서열이 있는 삽입체를 포함하는 클론의 cDNA 라이브러리를 선별하는데 직접 사용할 수 있다. 또는 올리고뉴클레오티드는 중합효소 사슬반응에 프라이머로써 이용될 수 있다. 반응에 대한 주형은 억제물질 활성을 발현시키기 위해 공지의 세포에서 준비된 mRNA의 역전사에 의해 수득된 cDNA이다. 증폭된 DNA 단편은 라벨되고 전체길이클론의 분리를 위한 라이브러리를 선별하는데 이용된다. 또 다른 실시예에서, 발현 라이브러리는 CD8 억제물질분자에 대한 다클론 또는 단클론 항체를 사용하여 면역학적으로 선별할 수 있다. 또 다른 발명의 구체예에서, cDNA 라이브러리는 포유류 발현벡터로 만들고 적절한 포유류 세포주내로 전이감염에 의해 선별하고 조직배양물 상층액에 항 HIV 억제물질 활성을 검사한다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 빼낸 cDNA 라이브러리는 발현성 또는 비-발현성 클론 CD8 세포에서 준비된 RNA를 사용하여 만들어질 수 있다. 추출한 라이브러리는 LTR/보고 유전자 검사시스템을 사용하여 선별할 수 있다. 추출된 cDNA 라이브러리에는 제 2 세포형에는 없는([-] 세포형) 하나의 세포형([+] 세포형)에 있는 mRNA에 상응하는 cDNA 클론이 포함된다. 이와 같은 형태의 라이브러리에는 소요의 cDNA 클론이 풍부하고, 이는 특정 mRAN에 상응하는 cDNA 클론의 삽입에 사용될 수 있으며 선별 과정은 특이적 DNA 서열 또는 항체를 이용할 수 없기 때문에 선별과정은 매우 힘이 든다.

본 발명의 구체예에서 공제 라이브러리는 발현[+]과 비발현[-] 클론 CD8 세포주에서 준비한 mRNA로 만들어질 수 있다(5.2.). [+]cDNA는 항바이러스 활성을 나타내는 세포에서 준비하고, 올리고뉴클레오티드 링커들은 cDNA 단편의 단부에 연결되어 cDNA 단편의 각 단부에 있는 엔도뉴클라아제 인지부위가 된다. [-]cDNA는블런트 단부로 만들어지고, 이는 [-] cDNA단편을 작은 블런트 단부가 있는 단편으로 감소시키는 제한 엔도뉴클레아제로 절단한다. [+] cDNA는 단편화된 [-] cDNA 50배 이상의 양으로 혼합하고, DNA는 이중가닥 DNA가 서로 떨어지도록 가열하고, 단일가닥의 DNA는 합쳐지게 한다. 각 단부에 제한 엔도뉴클라아제 제한부위가 있는 이중 가닥 단편을 만들기 위한 유일한 [+] cDNA는 상보적인 [-] 단편이 없는 서열이 된다. 서냉복원된 단편들은 상보적인 접착말단을 가지는 발현 벡터내에서 연결된다. 생성된 cDNA 라이브러리는 LTR/CAT 발현 시스템을 사용하여 선별될 수도 있다.

5.5. CD8+ 억제물질분자의 이용

HIV 감염과 AIDS 에 대한 최근에 승인된 치료는 바이러스 역전사효소를 표적으로 하는 디데옥시뉴클레오시드(즉 AZT, ddl, ddC)와 같은 제약학적 물질이다. 이들 약물에 대한 일부 유익한 점에도 불구하고, 약물 저항성 바이러스 돌연변이가 이들의 이용성에 제한을 가한다. 또한, 이들 물질들은 처음 감염에 대해서만 효과가 있고, 만성적 감염 또는 휴면성 감염된 세포에 대해서는 항바이러스 효과를 발휘할 수 없다. HIV 감염과 AIDS에 대한 좀더 효과적인 치료가 필요하다.

T-임파세포의 CD8 아종은 HIV 복제를 저해하는 분자를 생성하는데, 이는 HIV 감염과 AIDS의 치료요법에 이 분자의 잠재적 유용성을 제공한다. 이미 감염된 세포에서 바이러스 생산을 저해시키는 CD8+ 분자의 능력 때문에 모체에서 태아로의 수직감염 또는 HIV에 급성노출과 같은 예방적인 용도에 유용하다. 분자는 HIV 감염된 개체에서 무증후증 상태를 유지시키는 역할을 하기 때문에 질병진행의 임상적인 단계와, 면역 또는 생물학적 반응 수정요법의 효과를 모니터하고 특정 백신 프로토콜의 효과를 측정하는데 유용할 수 있다.

6. 실시예 : CD8 억제분자활성은 HIV-1 복제를 저해한다

6.1. 물질과 방법

6.1.1. 역전사효소 검사

말초혈액 단핵세포(PBMC)는 표준 피콜-하이펙 농도분리법에 의해 새로 취한 항-응고된 혈액으로부터 준비한다. CD4와 CD8 임파세포는 제조업자가 권하는 조건에 따라 항-CD4와 항-CD8 마이크로콜렉터 플라스크(Applied Immune Sciences)에 부착시키고, 세척하고, RPMI 1640, 20% v/v 태아 송아지혈청, 50U/㎖ 재조합 IL-2(Hoffman LaRoche, Inc.), 50 ㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트와 3 ㎍/㎖ 피토헤모글루티닌(PHA, Sigma, Inc.)을 포함하는 배지에서 3일간 배양시킨다. 세포는 마이크로콜렉터 플라스크에서 떼낸후, CD4와 CD8 현탁액 한방울을 FACS 분석에 의한 상대적인 순도와 생염색 배제에 의한 세포생존능에 대해 분석하였다. 나머지 세포 현탁액은 전술한 동일배지에서 단 PHA는 없이 추가 24시간 배양시켰다. CD4 세포는 2 ×10⁵세포/㎖로 조정하고 100㎕액을 100㎕ 새로운 배지 또는 100㎕ 자기유래 CD8 세포(4×10⁶세포/㎖로 조정된)의 96-웰 미량적정판에 이중 또는 삼중으로 배양시키고, 배양물은 가습 CO₂배양기내에서 37℃로 배양시킨다. 24시간 간격으로 배양 상층액 100㎕를 취하여 1% 트리톤 X-100으로 조정하고 아래와 같이 RT 활성을 검사하거나 검사할 때까지 -70℃에서 냉각시킨다. 배양물에는 매시간 100㎕의 새로운 배지를 공급하고 상층액은 수득한다. RT 활성은 Goff et al.,과 Willey et al. 방법에 따라 검사한다. 10㎕ 트리톤 용해물은 50mM 트리스-HCl, pH 7.8, 75mM KCl, 2mM DTT, 5mM MgCl₂, 5㎍/㎖ Poly A, 1.5μ/㎖ Oligo-dT_12-18, 0.05% NP-40, 10μCi/㎖ 32P-TTP를 포함하는 반응액 50㎕에 혼합하고 90분간 37℃에서 배양시킨다. 반응혼합물 40-50㎕는 DE-81 페이퍼(Whatmann) 또는 다양한 샘플여과에 NA-45막(Schleicher Schuell)위에 스팟시키고, 막 또는 종이는 2X SSC(0.3M NaCl, 0.03M 시트레이트 나트륨)과 브롬페니콜 블루를 포함하는 2X SSC로 수회 세척한다. 자가방사사진을 실행하고, 막 또는 DE-81은 Packard Matrix 9600 Direct Beta Counter를 이용하여 헤아린다. 결과는 이중 또는 삼중 웰의 평균을 나타낸다.

6.1.2. HIV-1 LTR CAT 구조

이 연구에 사용된 플라스미드는 다음과 같다: 1) pLTR18, PTZ19R의 Hind Ⅲ 부위에(United States Biochemical)pU3RⅢ의 단편을 포함하는 Xhol-BamHI LTR-CAT를 삽입하여 블런트 단부연결에 의해 만든다. 이 벡터에서 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제(CAT) 보고유전자의 발현은 HIV-1 LTR; 2) CMV-IE 프로모터의 제어하의 tat 발현벡터, pgtat(Malim MH., Hauber J., Fenrick R., Cullen BR., 1988); 3) pCMVCAT(Kindly provided by Dr. B. Cullen, Duke University Medical Center) 제어하에 있고, 이 벡터에서 CAT 보고유전자의 발현은 patat 벡터에 있는 동일한CMV-IE 프로모터의 제어하에 있다.

6.1.3. 형질감염과 CAT 검사

CD4와 CD8 임파세포의 정제된 집단은 6.1.1.에서 상술한 새로이 취한 응고안된 혈액에서 준비할 수 있는데 단, 정제된 CD4 와 CD8 세포는 형질감염 세팅전에 2-5일간 배양을 시킨다. HIV-1 LTR 또는 CMV-IE 전사 활성에 대한 CD8 세포들의 효과를 평가하기 위해 CD4 임파세포(20 ×10⁶세포)는 Bio-Rad Gene Pulser를 사용하여 에렉트로포레이션에 의해 10㎍ 플라스미드(pLTR 18 또는 pCMVCAT)로 형질감염시킨다. tat-중개된 HIV-1 LTRR 전사에 대한 효과를 측정하기 위해 20×10⁶CD4 임파세포는 2㎍ pgtat와 10㎍ pLTR 18로 일렉트로포레이션에 의해 형질감염시킨다. 형질감염에 사용되는 과정은 Cann에서 상술되었다. 에렉트로포레이션에 사용된 세팅은 한 펄스에 960μF, 250V이다. 하나의 형질감염에서 새로운 배지(1.25×10⁶세포/㎖)에 CD4 세포 4㎖를 자기유래 CD4 세포 조건화배지 동량 또는 10×10⁶비-형질감염된 자가유래 CD4 세포를 포함하는 자가유래 CD4 세포동량, 자가유래 CD8 세포 조건화배지 동량 또는 10 ×10⁶자가유래 CD8 세포를 포함하는 자가유래 CD8 세포 조건화배지 동량을 포함하는 4개 플라스크내로 넣는다. 각 플라스크의 용적은 새로운 배지(RPMI 1640, 10% 열 비활성화된 태아 송아지 혈청, 5% IL-2(Cellular Products, Inc.)와 1% 펜-스트렙(Gibco))의 복합된 10㎖로 조정한다. 그리고 각 최종 조건화 배지농도는 50%이다. 배양물은 가습 CO2 배양기에서 37℃ 48hr 동안배양하였다. 배양물을 수득하고, CAT 활성은 Ballard에 의해 상술한 것과 같이 결정하는데 단, 1% 트리톤 X-100은 100mM 트리스-HCl, pH 7.8을 포함하는 세포 파괴 완충액에 첨가한다. CAT 활성은 1% 트리톤 X-100 존재에 의해 영향을 받지 않는다. 데이터는 자가유래 CD4 세포를 포함하는 동일 형질감염에서 유도된 배양물에서 측정한 활성과 비교하여, 자가유래 CD8 세포를 포함하는 배양물에서의 CAT 활성을 나타낸 것이다. 수평라인은 각 집단의 평균을 나타낸 것이다. 타유래 CD4 세포에서 tat-중개된 전사를 테스트하기 위해 각 형질감염에서 타유래 CD8 세포 조건화배지와 10×10⁶타유래 CD8 세포를 포함하는 플라스크로 대체한다. 데이터는 자가유래 CD4 세포를 포함하는 동일 형질감염에서 유도된 배양물에서 측정한 활성과 비교하여, 자가유래 또는 타유래 CD8 세포를 포함하는 배양물에서의 CAT 활성에 대해 나타낸다.

CAT 활성은 자가유래 CD4 세포를 포함하는 배양물, 자가유래 CD8 세포를 포함하는 배양물과 자가유래 CD8 세포를 포함하는 배양물에서 제거된 조건화배지에서 측정한다. 개별개체로부터의 각 데이터는 하나의 형질감염에서 유도된 것이다. CAT 활성은 전환 %로 나타내고, 각 검사는 5×10⁶전이감염된 CD4 세포를 기초한다.

6.2. 결과

6.2.1. CD4 HIV 감염된 세포에서 CD8 세포는 HIV-1 복제를 저해한다.

PHA 촉진된 그리고 면역 친화성 기술에 의해 HIV-1 감염된 개체로부터 준비된 CD8 세포는 자가유래 감염된 CD4 세포에서 HIV-1복제를 저해한다. 항바이러스효과능은 상당한 것이다. CD8 세포를 CD4 세포와 2:1의 비율로 배양한 경우 바이러스 복제저해는 역전사효소에 의해 측정한 것과 같이 실제 완벽하였다(도면 1).

CD8 항바이러스 활성의 기작을 조사하기 위해 HIV-1 전사에 대한 CD8 세포의 효과를 검사하였다. 자가유래와 타유래 PBMC-유도된 CD4 세포는 tat 유전자 생성물을 발현시킬 수 있는 구조체와 HIV-1 LTR CAT 구조체로 에렉트로포레이션에 의해 형질감염시킨다. CAT 활성은 도면 3과 4에서 설명한 것과 같이 CD8 세포존재하에 측정하고, HIV-1 감염된 개체로부터 CD8 세포는 자가유래와 타유래 CD4 세포에서 tat 중개된 HIV-1 LTR 전사를 저해하였다. CD8 세포배양에서 유도된 상층액으로 실행한 실험에서는 상층액에서 저해활성의 중요한 부분이 발견되는데, 이는 저해활성이 CD8 세포에 의해 분비됨을 나타내는 것이다(도면 5).

7. 실시예 : 항-HIV-1 억제물질분자를 발현하는 CD8 클론세포의 분리

7.1. 물질과 방법

7.1.1. CD8+ 세포클론의 정립

말초혈액 단핵세포(PBMC)는 표준 피콜-하이펙 농도 분리에 의해 새로 취한 항-응고된 혈액에서 준비한다. 2천만 세척된 PBMC는 RPMI 1640 + 1% FCS에서 비드:세포의 비율이 10:1로 하여 항-CD8+ 결합된 자성 마이크로구로(Dynal, Inc)배양하였다. 5℃에서 45초 배양후(중간에 재현탁), CD8 세포/마이크로구 공액체는 희귀토 자성에 의해 포획되고 2회 세척후 재포획한다. 공액체는 10㎖ RPMI 1640, 20% v/v 태아 송아지 혈청, 3㎎/㎖ 피토헤마글루티닌(PHA: Sigma, Inc.)과 50/㎖재조합 인터루킨 2(IL-2; Hoffman LaRoche, Inc.)를 포함하는 T-25 조직배양 플라스크로 옮긴다. 마이크로구는 자석 포획에 의해 제거한 후, 공액체는 48시간동안 5% CO2 37℃에서 배양시킨다. 현탁액에서 나머지 CD8+ 세포는 FACS 분석에 의한 상대적인 순도를 분석하고 생염색 배제에 의해 세포 생존능을 결정한다. 10²생존 CD8+ 세포현탁액은 다음과 같은 제한된 희석 클로닝을 하게 된다. 하나의 96-웰 밑둥근 플레이트에 모든 웰은 웰당 10개의 세포를 수용하고, 두 개 96-웰 플레이트는 1세포/웰로 접종하고, 5개 96웰 플레이트는 0.1 세포/웰로 접종한다. 모든 8개 플레이트의 웰은 결과적으로 200ng/㎖ 항-CD3 단클론항체(12F6)와 1000/㎖ IL-2 존재하에 2×10⁵조사된(6000R) 타유래 PMBC 공급자를 수용하게 된다. 세포증식의 거시적 증가를 나타내는 웰은 48-웰과 24-웰플레이트 그리고 궁극적으로 T-25 와 T-75 플라스크내로 단계별 연장하여 선택한다. 14d 재-자극 사이클은 CD8+ 세포의 클론성 집단의 연장을 통하여 이용한다. 주기적인 FACS 분석은 광범위한 표식판넬을 이용하여 실행할 수 있다. 건사하기 전에 24시간동안 죽은 공급세포는 피콜-하이팍 침전에 의해 제거된다.

7.1.2. CD8 세포클론에서 전사 저해 활성의 검사

CD8 세포클론은 다음과 같이 pgtat와 pLTR로 형질감염된 자가유래 B 임파세포주(BLCL)에서 tat 중개된 HIV-1 LTR 전사를 저해시키는 능력에 대해 평가하였다. 자가유래 B 임파세포주는 다음과 같이 준비한다. 말초혈액은 HIV-1 감염된 개체에서 얻고, PBMC는 피콜-하이펙 농도 경사분리에 의해 준비된다. T-25 플라스크(Coaster)상의 4㎖ 세포배양배지(CCM: RPMI 1640, 20% v/v 태아 송아지 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신)에 7백만 내지 천만세포를 넣는다. 원숭이 세포주(B95-8:ATCC)에서 수득한 EBV 상층액 1㎖과 10㎍ 사이클로스포린 A를 세포현탁액에 첨가한다. 플라스크는 3-6주간 가습 CO2 배양기에서 3%에서 흔들리지 않게 배양한다. 일단 안정한 형질전환된 BLCL이 정립되면 3×10⁵세포/㎖ 농도에서 CCM에 재현탁시킨다. 지속적인 세포배양물은 매 2-3일 간격으로 원심분리와 새로운 CCM에 재현탁시킴으로써 유지시킨다. 이 방식으로 세포생존율이 85-90% 정도의 상당한 성장이 얻어질 수 있다. 자가유래 BLCL은 도면 2에서 상술한 것과 같이 0.1㎍ pgtat/10⁶BLCL과 0.5 ㎍ pLTR 18/10⁶BLCL로 공동형질감염시킨다. 형질감염된 BLCL 조건화배지, 3×10⁶자가유래 CD8 세포와 50% 자가유래 CD8 세포 조건화배지(실험 1) 또는 3×10⁶타유래 CD8 세포와 50% 타유래 CD8 세포조건화배지(실험 2) 또는 3×10⁶자가유래 CD8 클론 2세포와 50% 클론 2 세포조건화배지 또는 3×10⁶자가유래 CD8 클론 29세포와 50% 클론 29 세포조건화배지를 포함하는 플라스크내로 넣는다(1.5×10⁶세포). 각 배양물의 최종용적은 10㎖로 조정하고 배양물은 가습 CO2 배양기에서 7℃로 48시간 배양한다. 배양물을 수득하고 CAT 활성은 도면 2에서 상술한 것과 같이 검사한다. 데이터는 형질감염된 BLCL만을 포함하는 배양물과 비교하여, CD8 세포 또는 CD8 클론을 포함하는 배양물에 있는 CAT 활성을 나타낸다.

7.2. 결과

7.2.1. HIV-1 억제물질분자를 발현하는 CD8 세포클론의 정립

PBMC는 HIV-1 감염된 혈액에서 준비한다. CD8 세포는 환자의 혈액으로부터 면역친화성 정제하고, 정제된 세포는 희석클로닝하게 된다. 생성된 세포클론은 HIV-1 LTR CAT와 tat 인코딩 구조로 형질감염된 자가유래 B-임파세포주에서 HIV-1 LTR 전사를 저해하는 능력에 대해 검사하였다. 도면 5에서 설명한 것과 같이, 세포클론(클론 2,4 와 29)은 CAT 활성을 저해하는 이들의 능력이 다양하였다. 클론 2(DU. HL-2)는 최대의 저해활성을 나타내고, 클론 4(DU. HL-4)는 상당한 정도의 CAT 저해활성이 없었다.

8. 미생물 기탁

다음의 미생물은 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁되었다.

미생물 기탁일 기탁번호

DU. HL-2 1993. 3. 26 CRL 11310

DU. HL-4 1993. 3. 26 CRL 11309

본 발명은 기탁된 미생물에 한정하지 않고 그 이유는 구체예는 본 발명의 하나의 예를 든 것이며 기능적 등가의 미생물도 본 발명의 영역내에 포함된다.

본 발명은 본 발명의 하나의 예시한 구체예에 한정시키지 않고, 기능적 등가의 클론, DNA 또는 아미노산 서열도 본 발명의 영역에 속한다. 또한 여기의 설명에 추가하여 본 발명의 다양한 수정이 전술한 설명과 첨부도면으로부터 본 기술에 숙지된 자에게 명백할 것이다. 이와 같은 수정은 청구범위 영역에 속한다.

뉴클레오티드에서 모든 염기쌍 크기를 대략적인 것으로 설명을 위해 사용되었음을 인지할 것이다.

본 발명은 항바이러스 활성을 보이는 클론 CD8 세포주 및 이들 세포주를 분리하는 방법에 관한다. 상기와 같은 분리방법에 의해 분리된 CD8 세포주는 억제물질분자의 클로닝에 사용할 수 있는 cDNA 라이브러리의 구조체를 위한 mRNA 공급원 및/또는 억제물질분자의 특징화와 대량분리에 활용될 수 있다. 또한, 상기 억제물질분자는 HIV-복제를 저해시키기 위한 치료요법에 활용할 수 있다.

Claims

세포표면에서 CD8 단백질을 발현하고 HIV 복제를 저해하는 CD8 억제물질 분자를 발현하는 것을 특징으로 하는 임파세포 클론.
제 1항에 있어서, 기탁번호 CRL 11310으로 ATCC에 기탁된 것을 특징으로 하는 임파세포 클론.
세포표면에서 CD8 단백질을 발현하지만 CD8 억제물질분자는 발현하지 않는 임파세포 클론.
제 3항에 있어서, 기탁번호 CRL 11309로 ATCC에 기탁된 것을 특징으로 하는 임파세포 클론.
HIV 복제를 저해하는 CD8 억제물질분자를 인코드하는 재조합 cDNA 클론을 분리하는 방법에 있어서,

(a) CD8 억제물질분자를 발현하는 CD8 임파세포로부터 준비된 mRNA를 사용하여 cDNA 발현 라이브러리를 만들고;

(b) 하기와 같이 cDNA 생성물을 선별하는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) 재조합 DNA 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포주를 배양하고,여기서 리포터 유전자는 HIV LTR 프로모터 서열과 연결하여

작동하고;

(ii)리포터 유전자 활성의 저해를 측정하고, 여기서 리포터

유전자 활성의 저해는 항-HIV 활성과 연관한다.
HIV 복제를 저해하는 CD8 억제물질분자를 인코드하는 재조합 cDNA 클론을 분리하는 방법에 있어서,

(a) CD8 억제물질분자를 발현하는 CD8 임파세포로부터 준비된 mRNA를 사용하여 cDNA 발현 라이브러리를 만들고;

(b) CD8 억제물질분자를 발현하지 않는 임파세포의 mRNA로부터 준비된 cDNA와 하이브리드형성하는 클론을 제거함으로써 cDNA 라이브러리를 강화(enrichment)하고;

(c) 하기와 같이 강화된 cDNA 생성물을 선별하는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) 재조합 DNA 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포주를 배양하고, 여기서 리포터 유전자는 HIV LTR 프로모터 서열과 연결하여

작동하고;

(ii)강화된 CD8 세포 또는 CD8 세포의 배양물로 구성되는 샘플과

세포주를 접촉시키고;

(iii)리포터 유전자 활성의 저해를 측정하고, 여기서 리포터

유전자 활성의 저해는 항-HIV 활성과 연관한다.
제 5항에 있어서, CD8 임파세포는 ATCC 기탁번호가 CRL 11310인 임파세포 클론인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, CD8 임파세포는 ATCC 기탁번호가 CRL 11310인 임파세포 클론인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, CD8 억제물질분자를 발현하지 않는 임파세포는 ATCC 기탁번호가 CRL 11309인 임파세포 클론인 것을 특징으로 하는 방법.